CN1216991C - 人鸟苷酸单磷酸还原酶及其编码序列、和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的人鸟苷酸单磷酸还原酶HGMPR2。本发明提供了该新鸟苷酸单磷酸还原酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽，以及利用重组技术生产所述的新的人溶菌酶的方法。本发明还提供了这种新人鸟苷酸单磷酸还原酶的应用。

Description

人鸟苷酸单磷酸还原酶及其编码序列、和制备方法

本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说、本发明的多肽被推断鉴定为人鸟苷酸单磷酸还原酶。

鸟苷酸单磷酸还原酶(GMPR)(EC 1.6.6.8)催化鸟苷酸(GMP)在依赖于还原性辅酶II的条件下还原脱胺，生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)。

              

该酶广泛存在于包括人类在内的各种生物中(1991 Hum.Genet.88：219-224)。鸟苷酸单磷酸还原酶与肌苷酸脱氢酶(IMPDH)关系密切，因为IMPDH催化由IMP从无到有途径合成GMP，是GTP从无到有生物合成的限速酶，而GMPR则催化相反的反应，即由GMP变为IMP，从而两者构成一个循环。

已知IMPDH活力的增加与细胞增殖、转化等有关(1975 Nature 256：331-333)。研究已发现，在分化细胞中IMPDH和GMPR的活性相互作用，这提示两者对于控制细胞分化时胞内鸟嘌呤、腺嘌呤核苷酸的平衡有重要作用(1992 Leukemia.Res.16：561-564)，影响细胞分化。

另外，鸟苷酸单磷酸还原酶受抑制时会使鸟苷酸增加，而鸟苷酸的增加又带来一些影响。例如，细胞生长受到抑制(1983 Blood 62：162A)。另一方面，核苷酸的增加会导致脱氧核苷酸的增加及产生与之相关的效应，比如，由dGTP引起的细胞毒性(1983 The metabolic basis of inherited disease.p1157)。

关于鸟苷酸单磷酸还原酶的研究还开展得不够深入。目前只有一些酶动力学、基因定位、生物代谢方面的研究结果，而且迄今为止只有少数物种的鸟苷酸单磷酸还原酶基因已被克隆：大肠杆菌K12鸟苷酸单磷酸还原酶、人蛔虫鸟苷酸单磷酸还原酶(1988  Biochem.J.255：35-43；1992  Mol.Biochem.Parastiol.52：271-274)。有关人的鸟苷酸单磷酸还原酶(GMPR)基因克隆方面的报道也已有文献公布(1991  Hum.Genet.88：219-224)。

但在本发明之前，没有公开或发表过本申请所涉及的这种鸟苷酸单磷酸还原酶。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种新的人鸟苷酸单磷酸还原酶，本发明新的人鸟苷酸单磷酸还原酶基因被命名为HGMPR2.

本发明的另一个目的是提供一种新的人鸟苷酸单磷酸还原酶，该酶被命名为HGMPR2蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人鸟苷酸单磷酸还原酶的方法。

本发明还涉及这种新的人鸟苷酸单磷酸还原酶HGMPR2基因和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人HGMPR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列是SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的HGMPR2蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽，

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人HGMPR2蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有HGMPR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HGMPR2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HGMPR2蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HGMPR2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HGMPR2蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为583个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于39-1091位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“HGMPR2蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人HGMPR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中39-1091位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框39-1091位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中39-1091位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人HGMPR2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)，纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“HGMPR2蛋白多肽”指具有HGMPR2蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人鸟苷酸单磷酸还原酶相同功能的、SEQID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HGMPR2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与HGMPR2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗HGMPR2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含HGMPR2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了HGMPR2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有HGMPR2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供HGMPR2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然HGMPR2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术，类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“HGMPR2保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                           表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu

Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

本发明还包括HGMPR2多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内HGMPR2的表达。

本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有HGMPR2核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码HGMPR2的核酸分子。

本发明还包括检测HGMPR2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于HGMPR2多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对HGMPR2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HGMPR2基因产物或片段。较佳地，指那些能与HGMPR2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制HGMPR2蛋白的分子，也包括那些并不影响HGMPR2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HGMPR2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HGMPR2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HGMPR2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)，本发明的抗体包括能阻断HGMPR2功能的抗体以及不影响HGMPR2功能的抗体，本发明的各类抗体可以利用HGMPR2基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与HGMPR2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人HGMPR2核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

在本发明的一个实施方案中，本发明获得的多核苷酸全长为1300个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于39-1091位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A1：5′-GAGCCCTCAGATTCATCGCTACC-3′和反向引物B1：5′-TTGCTTCCTTGCTTCCTCCCCAG-3′进行PCR，获得1300bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。

根据同源比较的结果，本发明的HGMPR2核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与不同来源的鸟苷酸单磷酸还原酶显示了显著的同源性，因此，这表明它是一个新的鸟苷酸单磷酸还原酶，并且具有鸟苷酸单磷酸还原酶的一些重要功能。

研究表明，本发明HGMPR2可能影响细胞的分化。由于已知IMPDH活力的增加与细胞增殖、转化等有关(1975 Nature 256：331-333)。而且发现在分化细胞中，IMPDH和GMPR的活性相互作用，前者活性降低，后者活性提高，所以这提示两者对于控制细胞分化时胞内鸟嘌呤、腺嘌呤核苷酸的平衡有重要作用(1992Leukemia.Res.16：561-564)，影响细胞分化。

另外，抑制本发明HGMPR2能使鸟苷酸增加，而鸟苷酸的增加又带来一些影响。例如，淋巴细胞中GTP的积累会导致细胞周期停止在S期，细胞生长受到抑制。

在附图中，

图1为本发明的人HGMPR2与人鸟苷酸单磷酸还原酶(HGMPR)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

图2为本发明的人HGMPR2与蛔虫鸟苷酸单磷酸还原酶(subjct)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

HGMPR2的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgtl1cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-GAGCCCTCAGATTCATCGCTACC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-TTGCTTCCTTGCTTCCTCCCCAG-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、70℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断为1300bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1300bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于39-1091位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出HGMPR2的氨基酸序列，共350个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。

实施例2

同源比较

用本发明的HGMPR2的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与其他鸟苷酸单磷酸还原酶显示了较高的同源性。其中，它与人鸟苷酸单磷酸还原酶(sp|P36959)在蛋白水平上显示了73％的同一性和83％的相似性(图1)；又如，它与蛔虫鸟苷酸单磷酸还原酶(sp|P27442)在蛋白水平上显示了65％的同一性和79％的相似性(图2)。

特别是在本发明的HGMPR2的氨基酸序列中存在由13个氨基酸组成的被认为是鸟苷酸单磷酸还原酶和肌苷酸脱氢酶的特征性序列：

——(L/I/V/M)(R/K)(L/I/V/M)G(L/I/V/M)GXGS(L/I/V/M)CXT

[注：该序列中X为任意氨基酸，“(L/I/V/M)”表示从这4个氨基酸中任选一个氨基酸](鸟苷酸单磷酸还原酶和肌苷酸脱氢酶的顺序有许多相同的区域(1988Biochem.J.255：35-43))。

在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是：IKVGIGPGSVCTT(SEQ IDNO.4中178-190位)，因此，这更确定了本发明的HGMPR2也是鸟苷酸单磷酸还原酶，并且具有鸟苷酸单磷酸还原酶的相关功能。

研究表明，鸟苷酸单磷酸还原酶(GMPR)催化鸟苷酸(GMP)在依赖于还原性辅酶II的条件下还原脱胺，生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)。鸟苷酸单磷酸还原酶与肌苷酸脱氢酶(IMPDH)关系密切，因为IMPDH催化由IMP从无到有途径合成GMP，是GTP从无到有生物合成的限速酶，而GMPR则催化相反的反应，由GMP到IMP，从而两者构成一个循环。

本发明HGMPR2可能影响细胞的分化。由于已知IMPDH活力的增加与细胞增殖、转化等有关(1975 Nature 256：331-333)。虽然对GMPR这方面的作用研究得不够深入，但确实发现在分化细胞中，IMPDH和GMPR的活性相互作用，前者活性降低，后者活性提高，提示两者对于控制细胞分化时胞内鸟嘌呤、腺嘌呤核苷酸的平衡有重要作用(1992 Leukemia.Res.16：561-564)，影响细胞分化。研究表明，本发明的HGMPR2很可能在鸟嘌呤、腺嘌呤核苷酸的平衡有重要作用中也起重要作用。

本发明HGMPR2在抗病毒、抗细菌、抗肿瘤等方面有潜在的用途。已知嘌呤类似物3-脱氮-鸟苷在抗病毒、抗细菌、抗肿瘤等方面表现出不同的活性(1983 J.Med.Chem.26：286；1982 Antimcrob.Agents.Chemother.21：66：1980 Biochem.Pharmacol.29：1791)，它的毒性的基础很可能是抑制DNA的合成(1979 Proc.Am.Asoc.Cancer.Res.20：222)。通过研究不同的嘌呤化合物在3-脱氮-鸟苷存在时对细胞生长的影响，以及这些细胞中被标记的嘌呤前体的代谢，可以了解3-脱氮-鸟苷的作用机制。有报道，在动物细胞系中，3-脱氮-鸟苷抑制IMPDH的活性(1981Biochem.Pharmacol.30：2347)，在研究3-脱氮-鸟苷对人肿瘤细胞系的影响时，发现在增殖受抑制的细胞中，GMPR的活性受到抑制(1985 Cancer.Chemther.Pharmacol.15：59-62)，这一重要的发现提示鸟苷酸单磷酸还原酶可能作为3-脱氮-鸟苷发挥毒性过程中作为一个作用环节，参与该物质毒性的发挥，这暗示，本发明HGMPR2在抗病毒、抗细菌、抗肿瘤等方面也有类似的运用前景。

另外，本发明HGMPR2还可能与细胞生长及细胞毒性有关。因为鸟苷酸单磷酸还原酶的抑制能使鸟苷酸增加，而鸟苷酸的增加又带来一些影响。例如，用嘌呤核苷磷酸化酶的抑制剂8-氨基鸟苷处理淋巴细胞后GTP积累，进而导致细胞周期停止在S期，细胞生长受到抑制(1983  Blood 62：162A)，另一方面，核苷酸的增加会导致脱氧核苷酸的增加及产生与之相关的影响。比如，dGTP具有细胞毒性，在由嘌呤核苷磷酸化酶缺乏引起的T细胞缺乏中发挥毒性(1983  The metabolic basis of inherited disease.p1157)。

本发明的人HGMPR2除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人HGMPR2还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人HGMPR2的N端与人或蛔虫的GMPR的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人HGMPR2的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，如HGMPR)。

此外，本发明人HGMPR2核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人HGMPR2的表达水平或者抑制人HGMPR2的过度表达，本发明的人HGMPR2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人HGMPR2缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

HGMPR2在大肠杆菌中的表达

编码HGMPR2的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中的PCR扩增长物为模板进行扩增，从而获得插入片段。

5′寡核苷酸引物序列为

5′-CCTTGTCGACATGCCTCATATTGACAACG-3′(SEQ ID NO.5)，

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的HGMPR2编码序列的19个核苷酸；

3’寡核苷酸引物序列为

5’-GACAAAGCTTCTAGCACGCCTCACTGAAG-3’(SEQ ID NO.6)，

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和HGMPR2的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth.CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalI和HindIII消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明HGMPR2的cDNA插入片段已正确装入载体。

过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的HGMPR2。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱HGMPR2。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为39KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例4

HGMPR2在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码HGMPR2的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中的PCR扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-CCTTAAGCTTATGCCTCATATTGACAACG-3′(SEQ ID NO.7)，

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的HGMPR2编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-ATCGGGTACCCTAGCACGCCTCACTGAAG-3’(SEQ ID NO.8)

该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和HGMPR2的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII、KpnI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明HGMPR2的cDNA插入片段已正确装入载体。

质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆，48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为39KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

对于该表达蛋白的还原GMP的活性，按Yoshida.A.所述的方法(1991Hum.Genet.88：219-224)进行测试。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀HGMPR2基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                        序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：复旦大学

(ii)发明名称：人鸟苷酸单磷酸还原酶及其编码序列、和制备方法

(iii)序列数目：8

(2)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：

GAGCCCTCAG ATTCATCGCT ACC                                      23

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

TTGCTTCCTT GCTTCCTCCC CAG                                       23

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1300bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

GAGCCCTCAG ATTCATCGCT ACCCCGAGGC TAAGCGCCAT GCCTCATATT GACAACGATG 60

TGAAACTGGA CTTCAAGGAT GTCCTTTTGA GGCCCAAACG CAGTACCCTT AAGTCTCGAA 120

GTGAGGTGGA TCTCACAAGA TCCTTTTCAT TTCGGAACTC AAAGCAGACA TACTCTGGGG 180

TTCCCATCAT TGCTGCCAAT ATGGATACTG TGGGCACCTT TGAGATGGCC AAGGTTCTCT 240

GTAAGTTCTC TCTCTTCACT GCTGTCCATA AGCACTATAG CCTCGTTCAG TGGCAAGAGT 300

TTGCTGGCCA GAATCCTGAA CTGTCCTTGA GCATCTGGCT GCCAGCTCAG GCACAGGCTC 360

TTCTGACTTT GAGCAGCTGG AACAGATCCT GGAAGCTATT CCCCAGGTGG AAGTATATAT 420

GCCTGGATGT GGCAAAATGG GCTAATCTGG AAAACTTTGT TGAATTTGTA AAAGATGTAC 480

GGAAGCGCTT CCCCCAGCAC ACCATCATGG CAGGGAATGT GGTAACAGGA GAGATGGTAG 540

AAGAGCTCAT CCTTTCTGGG GCTGACATCA TCAAAGTGGG AATTGGGCCA GGCTCTGTGT 600

GTACTACTCG GAAGAAAACT GGAGTGGGGT ATCCACAGCT CAGCGCAGTG ATGGAGTGTG 660

CAGATGCTGC TCATGGCCTC AAAGGCACGA TCATTTCAGA TGGAGGTTGC AGCTGTCCTG 720

GGGATGTGGC CAAGGCTTTT GGGGCAGGAG CTGACTTCGT GATGCTGGGT GGCATGCTGG 780

CTGGGCACAG TGAGTCAGGT GGTGAGCTCA TCGAGAGGGA TGGCAAGAAG TACAAGCTCT 840

TCTATGGAAT GAGTTCTGAA ATGGCCATGA AGAAGTATGC TGGGGGCGTG GCTGAGTACA 900

GAGCCTCAGA GGGAAAGACA GTGGAAGTTC CTTTTAAAGG AGATGTGGAA CATACCATCC 960

GAGACATCCT AGGAGGGATC CGCTCTACGT GTACCTATGT GGGAGCAGCT AAGCTCAAAG 1020

AGTTGAGCAG GAGAACTACC TTCATCCGAG TCACCCAGCA GGTGAATCCA ATCTTCAGTG 1080

AGGCGTGCTA GACCTGAGCA GTTCTACCCT CCCAAGGCAC CAGTACTCTA CCATGGGGCA 1140

TCCCAAGTGG GGTCCTCACC CATCCCAGCT ACTGCAGCTC TGTATTACTT TGTCATTTCC 1200

TGTTGTCTCA CTCCTGAGGG CTCCTGCAGT AACTCTGTAC TTCTCTATCT GCACACACAA 1260

AATGCCCAAG GCACTCACTG GGGAGGAAGC AAGGAAGCAA

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：350个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

Met Pro His Ile Asp Asn Asp Val Lys Leu Asp Phe Lys Asp Val 15

Leu Leu Arg Pro Lys Arg Ser Thr Leu Lys Ser Arg Ser Glu Val 30

Asp Leu Thr Arg Ser Phe Ser Phe Arg Asn Ser Lys Gln Thr Tyr 45

Ser Gly Val Pro Ile Ile Ala Ala Asn Met Asp Thr Val Gly Thr 60

Phe Glu Met Ala Lys Val Leu Cys Lys Phe Ser Leu Phe Thr Ala 75

Val His Lys His Tyr Ser Leu Val Gln Trp Gln Glu Phe Ala Gly 90

Gln Asn Pro Glu Leu Ser Leu Ser Ile Trp Leu Pro Ala Gln Ala 105

Gln Ala Leu Leu Thr Leu Ser Ser Trp Asn Arg Ser Trp Lys Leu 120

Phe Pro Arg Trp Lys Tyr Ile Cys Leu Asp Val Ala Lys Trp Ala 135

Asn Leu Glu Asn Phe Val Glu Phe Val Lys Asp Val Arg Lys Arg 150

Phe Pro Gln His Thr Ile Met Ala Gly Asn Val Val Thr Gly Glu 165

Met Val Glu Glu Leu Ile Leu Ser Gly Ala Asp Ile Ile Lys Val 180

Gly Ile Gly Pro Gly Ser Val Cys Thr Thr Arg Lys Lys Thr Gly 195

Val Gly Tyr Pro Gln Leu Ser Ala Val Met Glu Cys Ala Asp Ala 210

Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ile Ile Ser Asp Gly Gly Cys Ser 225

Cys Pro Gly Asp Val Ala Lys Ala Phe Gly Ala Gly Ala Asp Phe 240

Val Met Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly His Ser Glu Ser Gly Gly 255

Glu Leu Ile Glu Arg Asp Gly Lys Lys Tyr Lys Leu Phe Tyr Gly 270

Met Ser Ser Glu Met Ala Met Lys Lys Tyr Ala Gly Gly Val Ala 285

Glu Tyr Arg Ala Ser Glu Gly Lys Thr Val Glu Val Pro Phe Lys 300

Gly Asp Val Glu His Thr Ile Arg Asp Ile Leu Gly Gly Ile Arg 315

Ser Thr Cys Thr Tyr Val Gly Ala Ala Lys Leu Lys Glu Leu Ser 330

Arg Arg Thr Thr Phe Ile Arg Val Thr Gln Gln Val Asn Pro Ile 345

Phe Ser Glu Ala Cys

(2)SEQ ID NO.5的信息

(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.5：

CCTTGTCGAC ATGCCTCATA TTGACAACG                              29

(2)SEQ ID NO.6的信息

(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.6：

GACAAAGCTT CTAGCACGCC TCACTGAAG                              29

(2)SEQ ID NO.7的信息

(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.7：

CCTTAAGCTT ATGCCTCATA TTGACAACG                              29

(2)SEQ ID NO.8的信息

(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.8：

ATCGGGTACC CTAGCACGCC TCACTGAAG                              29

Claims (13)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子编码具有SEQ IDNO.4所示序列的蛋白。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子具有SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子具有SEQ IDNO.3中从核苷酸39-1091位的核苷酸序列。

4.一种分离的HGMPR2蛋白多肽，其特征在于，它含有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生具有HGMPR2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有HGMPR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HGMPR2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.4所示序列的蛋白；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HGMPR2蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HGMPR2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HGMPR2蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸39-1091位。

12.一种能与权利要求4所述的HGMPR2蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。