CN1561395A - 特征在于检测g－csf外显子3缺失的癌症诊断方法 - Google Patents

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Abstract

公开了基于检测G－CSF基因外显子3区域缺失或具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G－CSF蛋白水平来诊断和预诊癌症的方法、组合物、微阵列、抗体和试剂盒，其中G－CSF基因外显子3区域的缺失用作癌症生物标志物。

Description

特征在于检测G-CSF外显子3缺失的癌症诊断方法
技术领域
本发明涉及一种基于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)mRNA或蛋白的修饰特征来诊断癌症的方法。更具体地说，本发明涉及一种基于在mRNA或蛋白水平上G-CSF基因外显子3区域缺失的癌症诊断和预诊方法，其中G-CSF外显子3的缺失可用作癌症诊断标志物。
背景技术
在发达国家，癌症是导致死亡的主要原因。因此，癌症治疗的主要兴趣是开发用于早期诊断和治疗癌症的方法。典型地，晚期癌症几乎不可治愈，而在早期，可能更有效地治疗癌症，而且早期癌症的治疗方法比较简单。因此，迫切需要开发一种用于精确快速诊断癌症的方法。
目前，癌症诊断通常是通过用显微镜，例如光学显微镜或电子显微镜进行形态分析，免疫组化检测癌组织中特异表达的蛋白(Iran.Biomed.J.3(3 & 4)：99-101，1999；和Lancet 2：483-6，1986)，或对癌组织中发现的异常生物分子，例如异常基因进行分子分析来实现。与分子诊断相比较，形态诊断和免疫组化诊断需要更长的时间和更高的费用。由于分子诊断包括相对简单的流程，并可在短时间内产生结果，因此它成为开发新型癌症诊断方法的焦点。最近，中国，上海，Health Digital有限公司开发了用于诊断各种癌症的蛋白芯片系统，并从中国药品管理局(CSDA)获得进行临床实验的批准。这种批准在世界上是首次的(www.health-digit.com)。但该蛋白芯片系统并不是仅用一种生物标志物来诊断各种癌症，而是使用10种或更多的蛋白。
为了有效地应用这种诊断方法进行癌症诊断，最重要的是选择能够更精确更容易发现癌症的癌症诊断标志物。已报道有几个基因(Steve M.等，J.Clin.Oncology 20：3165-3175，2002；和Sridlhar R.et al，J.Clin.Oncology 20：1932-1941，2002)和蛋白(Goessl等，Urology 58：335-338，2001；Zhou等，Breast Cancer Res Treat 66：217-224，2001；和CK Kim等，Korea Pat.Publication No.2001-0061173)可用作癌症诊断标志物，它们中有一些已用于临床癌症诊断。如下所述的常规癌症生物标志物不能检测各种癌症。已知具有较低器官特异性的癌症标志物，例如CEA、BFP、TPA和IAP也具有较低的敏感性，因此产生假阳性数据。同样，具有高器官特异性的标志物，例如AFP、PIVKA II、酯酶I、CA19-9、CA50、Span-1抗原、CA15-3和BCA 225仅用于靶器官。因此，迫切需要开发一种可诊断各种癌症的新型标志物，用于进行精确、经济、简便的癌症诊断。
发明内容
本发明人对能够检测各种癌症的标志物进行全面和深入研究，发现在癌症患者中G-CSF基因转录过程中外显子3发生缺失，从而得到本发明，并用G-CSF mRNA片段或蛋白作为癌症诊断标志物可以实现对各种癌症进行诊断，其中所进行的诊断是简便快速经济的。
本发明的一个方面提供了具有外显子3区域缺失的G-CSF mRNA片段作为癌症诊断标志物。
本发明的另一个方面提供了具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白作为癌症诊断标志物。
本发明的另一个方面提供了包括(a)相应于G-CSF基因外显子3的DNA片段，和(b)至少一个相应于所述G-CSF基因外显子1、2、4和5的DNA片段的微阵列或膜用于癌症诊断。
本发明的另一个方面提供了包含抗具有相应于所述G-CSF蛋白外显子3区域的氨基酸序列的缺失的突变G-CSF蛋白的抗体的癌症诊断试剂。
本发明的另一个方面提供了包含抗具有相应于所述G-CSF蛋白外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的抗体的癌症诊断试剂盒。
本发明的另一个方面提供了包含抗具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的抗体的微阵列或膜用于癌症诊断。
本发明的另一个方面提供了一种癌症诊断方法，包括步骤：(a)从哺乳动物组织或细胞中获得G-CSF核酸样品；(b)从获得的核酸样品中扩增G-CSF区；(c)在扩增的样品检测所述G-CSF基因外显子3的缺失。
本发明的另一个方面提供了一种癌症诊断方法，包括步骤：(a)从哺乳动物组织或细胞中获得G-CSF蛋白样品；(b)在G-CSF蛋白样品中检测相应于G-CSF基因外显子3的氨基酸序列缺失。
本发明的另一个方面提供了从哺乳动物组织或细胞中获得的G-CSF核酸样品中扩增G-CSF基因所用的引物。
附图的简要描述
结合附图从以下详细描述可以更清楚地理解本发明的上述和其它目标、特征和优势。其中
图1是人G-CSF基因的正常转录、剪接和翻译过程；
图2所示的是PCR中所用的引物在包含5个外显子的人G-CSF基因结构图谱中的位置；
图3A是在琼脂糖凝胶中分离的PCR1产物的照片(M：大小标记，泳道1：正常细胞系，泳道2：YCC-7，泳道3：AGS，泳道4：SNU-1，泳道5：MDA-MB-231，泳道6：MCF-7，泳道7：SK-BR-3，泳道8：HT-1080，泳道9：HCT-116，和泳道10：COLO205)；
图3B是在琼脂糖凝胶中分离的PCR1产物的照片(M：大小标记，泳道1：正常细胞系，泳道2：DLD-1，泳道3：HT-29，泳道4：A549，泳道5：NCI-H460，泳道6：HeLa，泳道7：C-33A，泳道8：B16，泳道9：U-87MG)；
图4所示的是来源于正常细胞的人G-CSF基因的核苷酸序列分析结果；
图5所示的是来源于肿瘤细胞的人G-CSF基因的核苷酸序列分析结果；
图6A是在琼脂糖凝胶中分离的PCR2产物的照片(每个泳道与图3A是同样的细胞系)；
图6B是在琼脂糖凝胶中分离的PCR2产物的照片(每个泳道与图3B是同样的细胞系)；
图7A是在琼脂糖凝胶中分离的PCR3产物的照片(每个泳道与图3A是同样的细胞系)；
图7B是在琼脂糖凝胶中分离的PCR3产物的照片(每个泳道与图3B是同样的细胞系)；
图8所示的是固定在尼龙膜上的外显子2 DNA和外显子3 DNA与来源于肿瘤细胞的靶分子的杂交结果(A：YCC-7，B：AGC，C：HT-29，D：A549，E：MCF-7，和F：U-87MG)；
图9所示的是通过DNA芯片进行的G-CSF基因外显子3缺失的分析结果；
图10所示的是具有相应于外显子3区的氨基酸序列缺失的纯化重组突变G-CSF蛋白的SDS-PAGE结果；
图11是显示在正常人和癌症患者中具有相应于外显子3区氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白水平图，用抗突变G-CSF蛋白的抗体进行测定；
图12是质粒p19CSF的构建过程；和
图13是表达具有相应于外显子3的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的重组质粒pED-CSF4BLIIE的构建过程。
实施本发明的最佳方式
本发明通常涉及通过分析RNA或蛋白水平上G-CSF基因存在或不存在外显子3缺失来诊断和预诊癌症的方法，其中G-CSF外显子3缺失可用作癌症诊断标志物。
由巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞产生的集落刺激因子(CSF)在正常机体中广泛分布。CSF大致上可分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其中，G-CSF在造血干细胞增殖和分化期间产生几种血细胞的过程中起到重要作用。G-CSF的主要作用是增加粒细胞的数量，特别是嗜中性粒细胞功能以保护机体抵抗外源病原体。近来广泛使用的用于增殖性肿瘤的化疗，其具有抑制肿瘤细胞生长的作用，其在抑制嗜中性粒前体细胞的分裂和成熟方面是不利的，因此降低了患者对感染应答的免疫保护能力。当对接受这种化疗的患者给药时，已知G-CSF将有效刺激嗜中性粒细胞增殖，因此保护和治疗感染性疾病。1986年，Nagata等报道了人G-CSF基因的核酸序列及其在COS细胞中的表达(Nagata等，Nature319：415-418，1986)。
人G-CSF(hG-CSF)是一个包含30个氨基酸的分泌信号肽和174个氨基酸的糖蛋白，并包含5个半胱氨酸残基。在5个半胱氨酸中，其中4个形成两个二硫键(Cys36-Cys42，Cys64-Cys74)，在hG-CSF蛋白的折叠和生物活性中起重要作用(Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167-5171，1993)。参照图1，hG-CSF基因由5个外显子和4个内含子组成。成熟的hG-CSF mRNA通过对基因组DNA转录得到的hG-CSF mRNA转录物进行剪切除去4个内含子而产生。成熟的hG-CSF mRNA翻译成包含204个氨基酸的hG-CSF前体蛋白，N末端30个氨基酸的分泌信号肽从前体蛋白中除去，从而产生包含174个氨基酸的生物活性hG-CSF蛋白(Nagata等，EMBOJ.5：575-581，1986；Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167-5171，1993)。
本发明人在克隆hG-CSF基因及产生其翻译产物的研究中发现，来源于肿瘤细胞的G-CSF cDNA具有整个外显子3区(108bp)缺失。虽然在不包括G-CSF基因在内的多种基因中已报道了这种特定外显子的缺失，但直到目前为止还不了解在hG-CSF基因中的这种缺失。已知hG-CSF蛋白以具有或不具有相应于外显子2的3’端的3个氨基酸的形式存在，而且两种形式均具有生物活性(Nagata等，EMBO J.5：575-581，1986)。因此，根据同源性原理，基于G-CSF基因外显子3缺失的癌症诊断方法可应用于所有G-CSF亚型。另外，由于已知其他哺乳动物来源的G-CSF蛋白与hG-CSF蛋白具有几乎相同的生物活性，所以本领域中的技术人员可以理解，根据同源性原理，本发明中的基于检测G-CSF基因外显子3缺失的癌症诊断方法可应用于其他哺乳动物来源的G-CSF蛋白。
肿瘤细胞中特异表达或抑制的基因和遗传突变均可通过常规分子生物学方法进行检测，例如通过(a)聚合酶链反应(PCR)(Bottema，C.D.，Mutat Res.233：93-102，1993；Nelson，D.L.，Curr.Opin.Genet.Dev.1：62-68，1991；Pourzand，C.和Cerutti，P.，Mutat.Res.288：113-121，1993；和Holland PM等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 8：7276-7280，1991)，(b)单链构象多态(SSCP)(Glavac D.，Hum.Mutat.19：384-394，2002；Strippoli，P.等，Int.J.Mol.Med 8：567-572，2001；和Methods Mol Biol 187：151-63，2002)，(c)DNA测序分析(Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA74：5463-5467，1997)，(d)蛋白质平截试验(PTT)(Hardy，C.A.，MethodsMol.Biol.187：87-108，2002)，(e)自动核苷酸序列分析(Boutin P.等，Hum.Mutat.15(2)：201-203，2000)，(f)杂合性丢失研究(LOH)(Yang Q.等，Clin.Cancer Res.8：2890-2893，2002)，(g)微卫星不稳定性研究(MSI)(Furlan，D.等，J Pathol 197：603-609，2002)，(h)通过MALDI-TOF进行基因分析(Leushner J.，Expert Rev.Mol.Diagn.1：11-18，2001)，(i)通过杂交进行基因分析(Wetmur，J.G.，Critical Reviews in Biochem.Mol.Biol.26：227-259，1991)，(j)通过DNA芯片进行基因分析(Goessl等，Urology58：335-338，2001；Zhou等，Breast Cancer Res.Treat.66：217-224，2001；和CK Kim等，韩国专利公开号2001-0061173)及(k)通过蛋白质芯片进行分析(Pharmacogenomics 1：385-393，2000)。本领域中技术人员可以理解，G-CSF基因或蛋白外显子3区域的缺失可通过包括以上所述例子在内的常规分子生物学方法很容易地进行检测。用于检测G-CSF基因或蛋白外显子3区域缺失的优选分子生物学方法包括PCR、杂交、DNA芯片、蛋白芯片和酶联免疫吸附分析(ELISA)。
根据本发明进行癌症诊断，首先应从组织样本或细胞中获得G-CSF基因或蛋白样品。由于从正常组织或细胞获得特异基因的DNA样品数量很少，因此应通过PCR对特定基因进行扩增，为了进行这种扩增，需要设计合适的引物。在本发明中，需要用作PCR引物的核酸片段以扩增G-CSF基因外显子3的部分或整个区域，以检测外显子3的缺失。即，此处所用的引物是指能够扩增包括外显子3的部分或整个区域的G-CSF基因核苷酸序列的寡核苷酸。本领域的技术人员能够很容易地设计这种引物。因此，所有本领域的技术人员设计的能够扩增包含外显子3部分或整个区域的G-CSF基因的引物均在本发明的范围内。引物的实例包括：命名为SEQ IDNOs.1和2的寡核苷酸，其能够扩增从hG-CSF基因部分外显子2到外显子5的区域(Thr1-Pro174)，命名为SEQ ID NOs.3和5的寡核苷酸，其能够扩增从hG-CSF基因的部分外显子2到外显子3的区域(Ile24-Leu71)，及命名为SEQ ID NOs.4和6的寡核苷酸，其能够扩增从hG-CSF基因外显子3到部分外显子4的区域(Cys36-Ser80)。本发明人对8个正常组织和17个肿瘤细胞系中获得的mRNA和cDNA样品调查了G-CSF基因和G-CSF基因中外显子3的存在或缺失。
根据本发明，提供了通过扩增G-CSF基因的外显子3区来检测外显子3缺失过程中用作引物组的核酸片段，其包括但不限于，下述各组，每组包括正义引物和反义引物：
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′(SEQ ID NO.9)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；和
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6).
尽管不包含相应于外显子3区域的核苷酸序列，核酸片段包括能够检测G-CSF基因外显子3缺失的寡核苷酸，其中寡核苷酸可以包含相应于G-CSF基因外显子2或外显子4的核苷酸序列。
根据本发明的一个方面，提供了一种固定了包含G-CSF基因外显子3的部分或整个区域的DNA片段的基因微阵列或膜，其用于癌症诊断。该基因微阵列包括通过杂交有效检测相应于探针的基因的DNA芯片，所述杂交包括将寡核苷酸探针施用到用特定化学试剂处理的载玻片的表面上。在杂交中可用来代替载玻片的膜的非限定实例包括所有可固定DNA片段的膜，优选地是尼龙膜和硝酸纤维素膜。
根据本发明，将相应于G-CSF基因外显子3的核酸片段附着在微阵列表面，同时附着选自相应于G-CSF基因外显子1、2、4和5的核酸片段的1个或多个核酸片段，其中每个用作探针的核酸片段可以包括其相应外显子的部分或整个区域。本发明中用作探针的相应于外显子3区域的核酸片段的非限定实例包括寡核苷酸，其具有命名为SEQ ID NO.14：
TGTGCCACCTACAAGCTGTG的核苷酸序列，命名为SEQ ID NO.15：
GAGCTGGTGCTGCTCGGACA的核苷酸序列，命名为SEQ ID NO.16：
GGACACTCTCTGGGCATCCC的核苷酸序列以及命名为SEQ ID NO.17：
CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA的核苷酸序列。用作对照探针的相应于外显子1、2、4和/或5的核酸片段的非限定实例包括寡核苷酸，其具有命名为SEQ ID NO.10：CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC的核苷酸序列，命名为SEQ ID NO.12：AGAAGCTGTGGTGCCAC的核苷酸序列，命名为SEQID NO.13：TGAGTGAGTGTGCCAC的核苷酸序列，命名为SEQ ID NO.18：GCAGGCTGCTTGAGCCAA的核苷酸序列，命名为SEQ ID NO.19：AGAAGCTGGCAGGCTG的核苷酸序列以及命名为SEQ ID NO.20：TCAGTGAGGCAGGCTG的核苷酸序列。
可通过本领域中普通的常规技术很容易地将探针点在载玻片和膜表面。另外，探针的制备、杂交和剥离根据本领域中常规技术进行。
本发明的另一个方面，包括用于诊断癌症的组合物，其包含一种DNA片段和诊断用载体，所述DNA片段包含G-CSF基因外显子3区域的部分或整个区域。本发明的另一个方面，包括一种癌症诊断方法，其使用一种具有相应于G-CSF基因外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白，及抗该突变G-CSF蛋白的多克隆或单克隆抗体。此处所用的术语“一种具有相应于G-CSF基因外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白”指的是通过在表达G-CSF基因时缺失从外显子1到5区域而产生的突变G-CSF蛋白，实质上包括外显子3的缺失。本发明的另一个方面，包括一种诊断试剂盒，其包含一种DNA片段及使用该DNA片段的DNA微阵列，所述DNA片段包含G-CSF基因外显子3的部分或整个区域。本发明的另一个方面，包括一种诊断试剂盒，其包含一种突变的G-CSF蛋白及使用抗该突变G-CSF蛋白的多克隆或单克隆抗体的蛋白微阵列，所述突变的G-CSF蛋白具有相应于G-CSF基因外显子3区域的氨基酸序列缺失。
根据本发明，具有相应于G-CSF基因外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白和抗该突变G-CSF蛋白的多克隆或单克隆抗体可通过本领域普通的常规方法产生(Harlow，E.和Lane，D.，Antibodies.ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory，1988；和Wilson，L.和Matsudaira，P.编辑.Antibodies in Cell Biology(Methods in Cell Biology，37卷).New York：Academic Press，1933)。
在本发明的一个实施方案中，当从获自17个肿瘤细胞系的mRNA和eDNA样品中扩增G-CSF基因的外显子3区域并分析产物的核苷酸序列时发现，在来源于各种肿瘤细胞系，包括胃癌细胞、乳腺癌细胞、肉瘤细胞、肠癌细胞、肺癌细胞、子宫颈癌细胞及恶性黑色素瘤细胞的hG-CSF cDNA中缺失外显子3区域(108bp)(见图2和3)。当用来源于17个肿瘤细胞系的hG-CSF cDNA作为模板并用根据本发明的引物组进行PCR时，发现来源于16个肿瘤细胞系的PCR产物大小比来源于正常细胞系的产物小，通过PCR产物的核苷酸序列分析，确定缺失正常G-CSF基因5个外显子中的外显子3区域。
可通过杂交来检测G-CSF cDNA中外显子3区域的缺失。例如，通过将正常hG-CSF基因用作模板进行PCR获得相应于外显子3的DNA片段和相应于外显子2的DNA片段后，将这两个DNA片段固定在尼龙膜上，将尼龙膜与来源于肿瘤细胞系的cDNA靶分子进行杂交，通过检测探针与固定在膜上的外显子3DNA片段的结合来确定外显子3区域的缺失。
可用DNA芯片来检测G-CSF cDNA中外显子3区域的缺失，其通过在载玻片上固定相应于G-CSF基因每个外显子的寡核苷酸，用hG-CSF基因的外显子作为模板通过PCR制备探针，然后将探针与寡核苷酸进行反应。
另外，通过使用具有外显子3区域缺失的突变G-CSF核苷酸序列制备重组G-CSF蛋白，制备抗该重组突变G-CSF蛋白的多克隆或单克隆抗体，并用该抗体进行ELISA反应比较正常个体和癌症患者中突变G-CSF蛋白水平，可以容易地检测G-CSF外显子3区域的缺失，。
在另一个方面，本发明包括免疫层析检测法。该检测法的代表性实例是横向流动免疫检测。用于横向流动免疫检测的诊断试剂盒包含一个装载样本的样品垫、一个包被以作为探针的抗体的释放垫、一个对样品进行显色的膜(主要为硝酸纤维素膜)或条带，在其中样品迁移并被分离，并发生抗体-抗原反应，以及一个用于驱动样本连续迁移的吸收垫。用作探针的抗体通过被固定在例如胶体金颗粒上进行标记。除了胶体金颗粒，也可使用胶乳珠或碳颗粒。典型地，用于横向流动免疫检测的诊断试剂盒设计为以三明治形式检测分析物。将包含在样本中的分析物上样到样品垫上，迁移并与包被在释放垫上的抗体反应，形成抗原-抗体复合物，形成的复合物进一步迁移并被固定在膜上的用于显色的附加抗体捕获，从而产生三明治形式的三联体。也就是说，由于附加的抗体固定在用于显色的膜上，三联体在固定附加抗体的膜表面积累。由于蛋白是肉眼不可见的，三联体的形成及其数量通过与包含在三联体中的抗体相缀合的金颗粒数目来确定。
根据本发明的另一个方面，提供一种基于检测G-CSF基因外显子3区域缺失来诊断癌症的方法。详细地，根据本发明，癌症的诊断可通过以下步骤来实现：从动物组织或细胞中获得核酸样品，并用分子方法检测核酸样品中G-CSF基因外显子3区域的缺失。作为核酸样品来源的人的组织或细胞作为包括生物流体样品、活体解剖样本、固相组织样品例如组织培养物或组织来源的细胞，及子代细胞。另外，样品来源包括化学试剂处理的，可溶性样品、培养的细胞、细胞培养上清和细胞裂解物。更详细地，根据本发明的目标，人的组织或细胞包括肿瘤组织或被视为致瘤的(neoplastic)组织，和可通过本领域普通的常规方法例如外科切除术、活体解剖或抽吸而获得。可通过本领域已知的常规方法从人的组织或细胞中获得核酸样品。
如上所述，根据本发明，可通过G-CSF基因的核苷酸序列分析，及通过使用对相应于G-CSF基因外显子3区域的区域的特异探针，例如通过使用对具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白特异的抗体，来实现基于检测G-CSF基因外显子3缺失的癌症检测方法。
本发明的癌症诊断方法可用于诊断各种癌症，包括胃癌、乳腺癌、肉瘤、肠癌、肺癌、子宫颈癌、肝癌、前列腺癌、舌癌、喉癌、咽癌、口腔癌、甲状腺癌、结肠癌、食道癌及睾丸癌。
参照下述实施例及结合附图，将更详细地解释本发明。然而，提供下述实施例仅用于举例说明本发明，本发明不限于此。
实施例1：从肿瘤细胞系中制备mRNA和cDNA
从8个正常细胞系和组织及17个肿瘤细胞系制备mRNA和cDNA样品。本发明的实施例中所用的正常细胞系和肿瘤细胞系示于下表。
                              表1
                本发明中所用的正常和肿瘤细胞系
              细胞类型            细胞保藏中心
肿瘤细胞系 YCC-7 胃癌细胞系 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
  AGS 胃癌细胞系     ATCC CRL-1739
SNU-1 胃癌细胞系     韩国细胞系研究基金会(KCLRF)，汉城国立大学
  MDA-MB-231 乳腺癌细胞系 ATCC HTB-26
  MCF-7 乳腺癌细胞系     ATCC HTB-22
  SK-BR-3 乳腺癌细胞系     ATCC HTB-30
  HT-1080 肉瘤细胞系     ATCC CCL-121
  HCT-116 结肠癌细胞系     ATCC CCL-247
  COLO205 结肠癌细胞系     ATCC CCL-222
  DLD-1 结肠癌细胞系     ATCC CCL-221
  HT-29 结肠癌细胞系     ATCC HTB-38
  A549 肺癌细胞系     ATCC CCL-185
  NCI-H460 肺癌细胞系     ATCC HTB-177
HeLa 子宫颈癌细胞系 ATCC CCL-2
C-33A 子宫颈癌细胞系 ATCC HTB-31
B16 恶性黑素瘤细胞系 ATCC CRL-6322
  U-87MG 脑癌细胞系     ATCC HTB-14
正常细胞系 293 人肾胚胎细胞系 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品1 人淋巴细胞 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品2 人单核细胞 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
  样品3 人表皮组织 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品4 人真皮组织 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品5 人毛囊(hairpollicle)细胞 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品6 人脂肪细胞 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
样品7 人肌肉细胞 Yonsei大学医学院，癌症转移研究中心
表1中列出的肿瘤细胞系可从列于表1中的细胞保藏中心获得。另外，人正常细胞系，淋巴细胞、单核细胞、表皮细胞、真皮细胞、毛囊细胞、脂肪细胞和肌肉细胞可从Yonsei大学医学院的癌症转移研究中心获得。从癌症细胞转移研究中心获得的肿瘤细胞系YCC-7按如下所述制备。从晚期癌症病人中无菌获取腹水，以10个单位/ml的量补加肝素以防止细胞聚集。400×g离心10分钟后，将沉淀的细胞在25cm3的培养瓶中培养。如果含有大量红细胞，则在800×g进行Ficoll-hypaque密度梯度离心，使单核细胞从红细胞中分离，将获得的单核细胞相在37℃，5％CO2中进行培养。培养16-18小时后，培养基在400×g离心10分钟，将沉淀的细胞在25cm3的新培养瓶中培养。在培养过程中，在相差显微镜下对细胞进行观察，培养基每周更换两到三次。当形成肿瘤细胞克隆时，通过胰蛋白酶-EDTA处理或用刮刀获得肿瘤细胞簇，将包含肿瘤细胞的流体离心除去正常细胞。得到的纯肿瘤细胞根据其传代细胞贮存在冷冻条件下。
用Tri-试剂(Gibco-BRL，美国)从每个肿瘤细胞系、正常细胞系和正常组织中提取总RNA。用液氮快速冷冻组织样品，研磨后，加入1mlTrizol试剂，接着室温下温育5分钟。得到的组织样品补加0.2ml氯仿，剧烈混和15秒，室温下温育5分钟。12,000×g，4℃离心15分钟后，将得到的水相转移到一个新管中。向管中加入等体积的异丙醇，并将管在4℃放置10分钟。12,000×g，4℃离心10分钟后，仔细除去上清，沉淀用70％乙醇洗涤并接着在7,500×g，4℃离心5分钟。干燥后，将RNA沉淀溶解在无RNA酶的水中。
为了从分离自每个细胞系和人源肿瘤和正常细胞系的mRNA合成cDNA，如下进行RT-PCR。将2μg总RNA与1μl寡聚(dT)16-引物混和，并加入无RNA酶的水至终体积为11μl。该该混合物在90℃加热5分钟，加热后立即放在冰上。在另一个管中加入4μl反应缓冲液，2μl 10mMdNTPs、1μl RNA酶抑制剂和2μl反转录酶，然后向预混和的管中加入8.5μl RNA混合物，室温下温育10分钟。反应混合物在42℃温育90分钟，然后95℃15分钟。混合物在95℃温育后立即放在冰上以中止反应，从而得到cDNA样品。
实施例2：通过PCR检测hG-CSF基因
为了在每个肿瘤细胞系中检测正常hG-CSF基因的表达，用实施例1中制备的cDNA为模板进行PCR。如图2所示，根据其扩增产物大小，PCR反应可分为如下三种类型：扩增从hG-CSF基因部分外显子2到外显子5的区域(Thr1-Pro174)的PCR1；扩增hG-CSF基因部分外显子2到外显子3的区域(Ile24-Leu71)的PCR2；及扩增hG-CSF基因外显子3到部分外显子4的区域(Cys36-Ser80)的PCR3。
用来自每个肿瘤细胞系的cDNA样品为模板进行PCR1，引物组中的正义引物命名为SEQ ID NO.：1(5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′)，反义引物命名为SEQ ID NO.：2(5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′)。用来自每个肿瘤细胞系的cDNA样品为模板进行PCR2，引物组中的正义引物命名为SEQ ID NO.：3(5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′)，反义引物命名为SEQ ID NO.：5(5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′)。用来自每个肿瘤细胞系的cDNA样品为模板进行PCR3，引物组中的正义引物命名为SEQID NO.：4(5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′)，反义引物命名为SEQID NO.：6(5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′)。PCR使用高保真PCR体系(Boehringer Mannheim Co.，德国)，在以下条件下进行。PCR条件包括：94℃变性7min，94℃变性40sec，56℃退火40sec，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃延伸7min。
将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行分离。作为电泳结果，对PCR1而言，除了从U-87MG得到的PCR产物与正常G-CSF基因大小相等外，从肿瘤细胞系中得到的PCR产物大小比正常G-CSF基因小(见图3A，其中M：大小标记，泳道1：正常细胞系，泳道2：YCC-7，泳道3：AGS，泳道4：SNU-1，泳道5：MDA-MB-231，泳道6：MCF-7，泳道7：SK-BR-3，泳道8：HT-1080，泳道9：HCT-116及，泳道10：COLO205；图3B，其中M：大小标记，泳道1：正常细胞系，泳道2：DLD-1，泳道3：HT-29，泳道4：A549，泳道5：NCI-H460，泳道6：HeLa，泳道7：C-33A，泳道8：B16及泳道9：U-87MG)。对PCR2和PCR3而言，仅从U-87MG细胞中获得了PCR产物，而在其它肿瘤细胞系中没有得到PCR产物(参加图6和7)。另外，PCR2和PCR3产生的U-87MG细胞的PCR产物与正常细胞的PCR产物大小相等。
通过DNA自动测序仪(ABI Prism model 377，Perkin Elmer Co.，美国)分析PCR1产物的核苷酸序列。作为核苷酸序列分析的结果，发现从U-87MG细胞获得的PCR产物与正常细胞的G-CSF基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.：7)相同。相反，从其它肿瘤细胞系获得的PCR产物与正常细胞的G-CSF核苷酸序列相比较，发现其具有一个108bp缺失的核苷酸序列(SEQ ID NO.：8)(参见图4和5)。当将缺失的108bp与G-CSF的核苷酸序列相比较时，发现该缺失的108bp相应于5个外显子中的外显子3区域。
为了调查正常个体组织是否表现出与获自正常细胞系相同的PCR结果，当用从正常个体的淋巴细胞、单核细胞、表皮组织、真皮组织、毛囊、脂肪细胞和肌肉细胞分离的RNA进行RT-PCR时，并用RT-PCR获得的cDNA进行PCR，在来源于正常个体的细胞和组织中没有发现外显子3的缺失(见图11)，这表明在肿瘤细胞系的PCR产物中发现的外显子3缺失并不是PCR错误而诱导产生的。另外，由具有外显子3缺失的G-CSF cDNA表达的突变G-CSF蛋白极可能已丧失活性位点功能，而且具有与正常G-CSF蛋白不同的构型。因此，我们认为肿瘤细胞中表达的G-CSF蛋白不表现出正常功能。
实施例3：通过杂交检测G-CSF基因
通过杂交检测来源于肿瘤细胞系的G-CSF cDNA外显子3的缺失。
用来源于正常细胞系的G-CSF基因为模板进行PCR，所用的引物组是命名为SEQ ID NO.：4(5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′)的正义引物和命名为SEQ ID NO.：5(5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′)的反义引物。获得了相应于G-CSF基因外显子3区域的108bp DNA片段。
单独地，用来源于正常细胞系的G-CSF基因为模板进行PCR，所用的引物组是命名为SEQ ID NO.：1(5’-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′)的正义引物和命名为SEQ ID NO.：9(5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′)的反义引物。获得了相应于G-CSF基因外显子2区域的105bp的DNA片段。
纯化后，将每个DNA片段(50ng/μl)点在尼龙膜上(BoehringerMannheim，德国)，80℃温育2小时以将其固定在膜上。
通过RT-PCR制备固定在膜上、作为杂交相应于外显子2和外显子3的DNA片段的靶探针。RT-PCR根据如下条件进行。首先，反应混合物A(2μg总RNA，1μl寡聚(dT)16-引物，总体积：15μl)在94℃温育2min，使RNA变性，然后在约20分钟内缓慢冷却到42℃。另一个反应混合物B(每种dATP、dGTP和dCTP各333μM，1×反转录酶缓冲液，20μCi[α-32P]dCTP(2,000-3,000Ci/mmol)，50U AMV反转录酶，总体积：30μl)加入到混合物A中，在42℃反转录2小时。然后，将不参与聚合反应的dNTP，包括[α-32P]dCTP，用QIAquick核苷酸去除试剂盒(Qiagen，美国)除去。
用cDNA探针，在已固定相应于G-CSF外显子2和3DNA片段的尼龙膜上进行杂交。首先，用2×SSPE缓冲液(1×SSPE：0.18M NaCl，10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH7.7)将尼龙膜浸泡5分钟，然后用2ml预热到65℃的杂交液(5×SSPE，2％SDS，1×Denhardt的试剂，超声的和100μg/ml变性的鲑鱼精DNA)进行处理，其中膜封闭在乙烯袋中。65℃温育1小时后，向浸泡膜的杂交液中加入由10μl cDNA探针与0.5ml杂交液混和并将混合物煮沸10分钟而制备的变性cDNA探针，然后在65℃温育18小时进行杂交。随后，将膜用洗涤液(0.5xSSPE，0.2％SDS)洗涤三次，于65℃进行30分钟。通过曝光膜或X-射线胶片并对胶片进行显影来检测放射性。
如图8所示，对用来自肿瘤细胞系YCC-7、AGS、HT-29、A549和MCF-7的总RNA制备的探针而言，发现探针与外显子2的DNA片段结合，而不与外显子3的DNA片段结合(见图8A、8B、8C、8D和8E)。相反，发现使用来自己知含有正常G-CSF基因的U-87MG细胞的总RNA制备的探针可与外显子2和3的两个DNA片段结合(见图8F)。如上所述，证实可通过杂交很容易地检测G-CSF外显子3的缺失。杂交方法可适用于利用最近开发的DNA微阵列的检测方法。因此，认为能够可以很容易地开发各种利用杂交方法的检测方法，从而用该检测方法可容易并精确地进行癌症诊断。
实施例4：利用用于检测G-CSF的外显子3缺失的DNA芯片来检测G-CSF基因
为了调查DNA芯片是否能用作检测G-CSF mRNA或cDNA的外显子3的缺失的工具，如下制备各种可固定在玻璃板上的DNA片段探针。
设计一个相应于G-CSF部分外显子2的探针，四个相应于外显子3的非重叠探针和一个相应于部分外显子4的探针，每个包含20个核苷酸。另外，设计一个相应于连续地从部分外显子2至部分外显子3的区域的探针，一个相应于连续地从部分外显子3到部分外显子4的区域的探针，和一个相应于连续地从部分外显子2到部分外显子4的区域的探针，每个外显子有8个核苷酸。由于在外显子2区域的选择性剪接(Tshuchiya M.等，EMBO J5：575-581，1986)而产生两种不同的G-CSF mRNA(人G-CSFa和人G-CSFbmRNA)，根据这两种不同的G-CSF mRNA制备了两类包含相应于外显子2的区域的探针。
为了给予被固定在玻璃板上的能力，当合成所有DNA片段探针时，利用氨基连接臂柱(Cruachem，Glasgrow，苏格兰)将具有氨基的碱基插入到每个探针的3’端，并使用用醛残基(CEL Associates，Inc.，Huston，Taxas，美国)包被的载玻片。在3×SSC(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH7.0)中溶解后，使用由本发明人制造的微阵列仪(Yoon等，J.Microbiol.Biotechnol.10：21-26，2000)通过积累DNA探针而将DNA探针固定在载玻片上，并在约55％的湿度下反应1小时以上，然后将载玻片在室温下放置6小时。此处，探针在载玻片上以275μm的间距排列，点样量是100μM，从而得到微阵列。
通过SYBRO green II(Molecular Probe，Inc.，Leiden，荷兰)染色来评估通过探针的氨基与玻璃上的醛基反应进行的探针固定。
通过利用从每种细胞系中提取的G-CSF基因进行不对称PCR来制备固定在玻璃上作为探针的基因片段，所用的引物组为命名为SEQ ID NO.：10(5′-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3′)的正义引物和命名为SEQ IDNO.：11(5′-FTTC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3′)的反义引物，其比例是1∶5，其中通过进行一次PCR获得基因片段。表2给出了固定在载玻片上的探针信息。
                  表2
核苷酸序列 在hG-CSF基因上相应的区域 SEQ ID NOs.
  CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC   外显子2     10
AGAAGCTGTGGTGCCAC   外显子2到3(hG-CSFa) 12
TGAGTGAGTGTGCCAC   外显子2到3(hG-CSFb) 13
  TGTGCCACCTACAAGCTGTG   外显子3     14
  GAGCTGGTGCTGCTCGGACA   外显子3     15
  GGACACTCTCTGGGCATCCC   外显子3     16
  CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA   外显子3     17
  GCAGGCTGCTTGAGCCAA   外显子4     18
AGAAGCTGGCAGGCTG   外显子2到4(hG-CSFa) 19
TGAGTGAGGCAGGCTG   外显子2到4(hG-CSFb) 20
不对称PCR按以下条件进行：94℃变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30see，进行10个循环，然后94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸30sec，进行30个循环，最后在72℃延伸7min。
将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行分离。电泳结果表明，在每个PCR样品中均产生双链DNA和单链DNA片段。使用携带外显子3缺失的G-CSF基因的质粒和携带不缺失外显子3的G-CSF基因的质粒，通过不对称PCR扩增G-CSF基因后，用DNA芯片分析这两个扩增产物。杂交液(6×SSPE，20％(v/v)甲酰胺)加入到15μl扩增产物中，至终体积为200μl。将混合物上样到具有固定探针的载玻片上，载玻片用探针夹(probe-clip)压封的温育隔室(Sigma Co.，St.Louis，MO.)覆盖，然后在振荡温育箱中30℃温育6小时诱导探针与扩增产物的结合。随后，载玻片用3×SSPE(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH7.0)、2×SSPE(0.3M NaCl，10mM C6H5Na3O7，pH7.0)和然后1×SSPE(0.15M NaCl，5mM C6H5Na3O7，pH7.0)洗涤5分钟以上，并用scanarray 5000(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA.)进行扫描。
如图9所示，对携带不缺失外显子3的G-CSF基因的质粒而言，对所有探针均检测到信号。相反，对含外显子3缺失的G-CSF的质粒而言，在外显子2和外显子4区域检测到信号，其中质粒具有相应于G-CSF a-型RNA的核苷酸序列。
这些结果表明，可用以上所述的引物和探针来开发能检测G-CSFmRNA或cDNA中外显子3区域缺失的DNA芯片。
实施例5：生产重组突变G-CSF蛋白
为了通过重组大肠杆菌大规模生产突变G-CSF蛋白，对携带重组质粒pED-CSF4BLIIE的大肠杆菌B21(DE3)(Novagen Inc.，美国)进行分批进料发酵。如下通过将相应于具有外显子3区域缺失的突变G-CSF蛋白的核苷酸序列克隆到质粒pET21c(Novagen Inc.，美国)中来制备pED-CSF4BLIIE质粒。首先，以人乳腺癌cDNA文库为模板进行PCR，所用引物组为包含EcoRI位点的引物1(正义引物)：5′-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3′和包含BamHI位点的引物2(反义引物)：5′-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3′。
用EcoRI和BamHI处理PCR产物，并将其克隆到pUC19(Stratagene，美国)中，从而得到质粒p19CSF(见图12)。克隆到pUC19中的G-CSF基因不包含外显子3区域。
以质粒p19CSF为模板，进行PCR，所用引物组是引物4(正义引物)：5′-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCA GC-3′和引物2(反义引物)：5′-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3′，
用NdeI和BamHI处理PCR产物，并将其克隆到质粒pET21c中。为了更改相应于第一个氨基酸的密码子为细菌翻译系统最适密码子，用引物：5′-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3′代替引物4：5′-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3′作为正义引物再次进行PCR，产生的DNA片段用NdeI和BamHI处理，并克隆到质粒pET21c中，从而得到质粒pED-CSF4BLIIE(见图13)。用于分批进料发酵的营养成分和附加物质在以下表3中列出。
                        表3
培养基 附加补充的溶液
营养成分 浓度(g/L) 物质 浓度(g/L)
(NH2)2HPO4 3.0 葡萄糖 700.0
KH2PO4 7.0 MgSO4·7H2O 15.0
MgSO4·7H2O 1.0 酵母提取物 50.0
柠檬酸 0.8
酵母提取物 2.0
葡萄糖 20.0
痕量金属溶液 3(ml)
用质粒pED-CSF4BLIIE转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在250ml培养瓶中、37℃搅拌培养8小时。将200ml培养物接种到包含在5L发酵罐(NBS发酵罐)的1.8L培养基中，在37℃进行培养，其中培养基的pH恒定维持在6.8。用28％NH4OH溶液维持pH。任选地提供纯氧。附加物质的提供通过pH-stat进行控制。也就是说，当pH增加到6.88时，自动添加2-3g葡萄糖、0.3g酵母提取物及0.1g MgSO4·7H2O。在培养过程中，葡萄糖浓度维持在低于5g/L。当OD600达到30时，向培养基中加入1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)以诱导细菌高浓度生长，从而得到OD600值为90的高浓度细菌培养物。使用比重计通过测定蛋白条带的密度，从而评估生产的突变G-CSF蛋白的量(见图10)。正常成熟G-CSF蛋白的分子量约为18.7kDa，而从外显子3缺失的G-CSF cDNA翻译的突变G-CSF蛋白的分子量约为13kDa。
实施例6：制备特异于突变G-CSF蛋白的多克隆抗体
以获自实施例5中重组大肠杆菌的突变G-CSF蛋白为抗原，如下制备特异于突变G-CSF蛋白的多克隆抗体。用等体积弗氏佐剂(BRL)乳化400μl以1mg/ml的浓度溶解在磷酸盐缓冲液中的纯化的突变hG-CSF蛋白后，将乳剂肌肉注射到兔(10周龄)中，注射4次，间隔时间是11天。在第四次注射10天后，通过心脏穿刺从免疫兔中采血。将收集的血液室温温育30分钟，然后4℃放置过夜，使血液完全凝聚。在2,500rpm离心30分钟后，得到上清，即血清。将硫酸铵加到血清中，至终浓度为40％以沉淀蛋白。在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中透析过夜后，使用DEAE Affi-Gel Blue胶(Bio-Rad Inc.)纯化抗体(Smith，C.P.，Jensen，D.，Allen，T.和Kreger，M.(编辑)Information Resources for Adjuvants and Antibody Production.U.S.Dept.of Agriculture，1997；和Hanly W.C.等，ILAR Journal 37：93-118，1995)。
实施例7：制备特异于突变G-CSF蛋白的单克隆抗体
用等体积弗氏佐剂(BRL)乳化100μl纯化的hG-CSF蛋白(1mg/ml)后，将得到的乳剂腹膜注射BALB/c小鼠(6-8周龄)，注射3次，间隔时间是2周。第三次注射后，发现产生了抗突变G-CSF蛋白的抗体。再过2周后，小鼠用100μg纯化的突变hG-CSF蛋白再次注射。注射3天后，从免疫小鼠中获得脾细胞，并与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞以10∶1比例混合，通过向细胞混合物中加入50％聚乙二醇1500溶液诱导融合，然后温育3分钟。1,200rpm离心8分钟后，将细胞沉淀以3.5×106细胞/ml的密度悬浮在包含10％胎牛血清(FCS)的HAT RPMI-1640培养基中。然后将0.1ml细胞悬液放置在96孔板的每个孔中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养。3天后，向培养板的各孔中加入0.1ml包含10％FCS的HAT RPMI-1640培养基，而且每4天用新鲜培养基代替一半的原培养基(Amyx，H.L.，JAVMA 191：1287-1289，1987；Akerstrom，B.等，J Immunol 135：2589-2592，1985；和Anon，VetHealth Inspectorate 6页.Rijswijk，The Netherlands，1989)。
在HAT培养基中选择培养后，如下通过ELISA筛选产生抗突变G-CSF蛋白抗体的融合细胞。首先，将免疫小鼠所用的突变hG-CSF蛋白在0.01M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释至浓度为0.1μg/ml，将50μl得到的稀释液加入到培养板的各孔中，然后在4℃放置过夜，使蛋白与各孔的底部结合。培养板用PBST(磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.15％Tween 20)洗涤4次，并用白蛋白在37℃温育30分钟进行封闭，随后，将50μl细胞培养物上清加到各孔中，将培养板在室温温育2小时，然后用PBST洗涤4次。在0.1％BSA-PBST中稀释作为第二抗体的生物素缀合的抗小鼠免疫球蛋白抗体，使其浓度为1μg/ml后，将50μl稀释液加到各孔中，然后37℃温育1小时。用PBST洗涤4次后，各孔中加入50μl 1∶1000稀释的链亲和素-辣根过氧化物酶，37℃温育30分钟，然后用PBST洗涤4次。向各孔中加入50μl四甲基联苯胺(TMB)溶液，室温下进行温育，其中TMB用作过氧化物酶的底物。用2N硫酸盐终止反应后，使用ELISA读数仪在450nm测定光密度。从ELISA阳性孔中获得的细胞通过有限稀释亚克隆3次，其中细胞稀释为每孔0.3个细胞，从而获得产生抗突变体hG-CSF蛋白单克隆抗体的融合瘤(hydridoma)细胞。可从稳定的hydridoma细胞获得抗突变体hG-CSF蛋白的单克隆抗体(Amyx，H.L.，JAVMA 191：1287-1289，1987；Akerstrom，B.等，J Immunol 135：2589-2592，1985；和Anon，Vet HealthInspectorate 6页.Rijswijk，The Netherlands，1989)。
实施例8：通过ELISA检测突变的G-CSF蛋白水平
在0.01M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释后，将抗兔和抗小鼠突变的hG-CSF蛋白的抗体加入到培养板的各孔中，同时加入血浆铜蓝蛋白，将板在4℃温育过夜，使抗体结合到各孔底部。用PBST(0.15％Tween 20)洗涤2次后，用0.1％白蛋白在37℃将培养板封闭1小时。用PBST洗涤2次后，向培养板中加入50μl标准稀释缓冲液和来源于正常个体和癌症患者的每个样本并仔细混合，将培养板在37℃温育2小时，随后用PBST洗涤4次。在包含0.15M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液中稀释后，将作为第二抗体的2.5μg过氧化物酶缀合的抗人免疫球蛋白抗体加到各孔中，将培养板在室温下温育30分钟，然后用PBST洗涤4次。向各孔中加入50μl四甲基联苯胺(TMB)溶液，避光条件下室温温育，其中TMB是过氧化物酶的底物。用2.5N硫酸盐终止反应后，通过ELISA读数仪在450nm测定光密度。
如图11所示，发现在癌症患者中突变的hG-CSF蛋白水平比正常个体中的高很多。当互相比较癌症患者中突变的hG-CSF蛋白水平时，乳腺癌患者表现最高水平的突变的hG-CSF蛋白。
如以上实施例详细解释，通过PCR或使用DNA芯片检测G-CSF外显子3的缺失，或通过ELISA检测突变的G-CSF蛋白可以容易地进行癌症诊断。如下所述，常规的癌症生物标志物不能检测所有癌症。已知的具有低器官特异性的癌症标志物，例如CEA、BFP、TPA和IAP，具有低的灵敏度，从而产生假阳性数据。同样，具有高器官特异性的生物标志物，例如AFP、PIVKA II、脂酶I，CA19-9，CA50、Span-1抗原，CA15-3和BCA 225，仅用于靶器官。由本发明人发现的基于检测G-CSF外显子3区缺失的诊断性癌症标志物可通过免疫化学方法和分子方法用于简便地检测癌症。开发和使用这种癌症标志物可有利于促进癌症的早期发现，从而极大地有助于癌症的有效治疗。
工业实用性
如上所述，本发明提供一种基于检测G-CSF基因外显子3区域缺失来诊断癌症的方法。该癌症诊断方法可用于诊断广泛范围的癌症，不仅是特定的癌症，并具有通过分子方法，例如PCR、杂交或使用DNA芯片，或相对简单的免疫化学检测，例如ELISA来容易地诊断癌症的有效性。另外，用于检测G-CSF外显子3区域缺失的DNA芯片的优势是能够以比常规癌症诊断方法更简单、更快、更精确地的方式来诊断各种癌症，并能够同时处理大量临床样本，从而导致发展和提高人类的医疗水平并改善公益，以及促进DNA芯片技术的发展。
另外，由本发明人发明的具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白，及抗该突变G-CSF蛋白的抗体，可促进区分正常个体和癌症患者。这个事实表明仅检测G-CSF突变体即可以精确诊断癌症并适用于大量临床样本，从而促进蛋白芯片技术的发展。
                              序列表
[序列表]
<110>医学基因公司
     李相烨
     丁基峻
     郑贤哲
     柳来春
     琴基昌
     刘元敏
<120>特征在于检测G-CSF外显子3缺失的癌症诊断方法
<160>20
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
acccccctgg gccctgcc                                                      18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
tcagggctgg gcaaggtg                                                      18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
atccagggcg atggcgcagc g                                                  21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
tgtgccacct acaagctgtg c                                                  21
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
cagctgcagg gcctggct                                                      18
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cgctatggag ttggctcaag c                                                  21
<210>7
<211>525
<212>DNA
<213>人
<221>基因
<222>(1)..(523)
<223>G-CSF
<400>7
acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa    60
gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag    120
ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc    180
ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc    240
ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt    300
cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag    360
atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc    420
gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc    480
ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga                    525
<210>8
<211>417
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>基因
<222>(1)..(417)
<223>外显子3缺失G-CSF
<400>8
acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa    60
gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc    120
caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc    180
cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc    240
atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc    300
atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat    360
ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga           417
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
cagcttctcc tggagcgc                                                      18
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物和探针
<400>10
ctgcagctgc tgctgtggca c                                                  21
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
ctgctgccag atggtggt                                                      18
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
agaagctgtg gtgccac                                                       17
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
tgagtgagtg tgccac                                                        16
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
tgtgccacct acaagctgtg                                                    20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
gagctggtgc tgctcggaca                                                    20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>16
ggacactctc tgggcatccc                                                    20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>17
ctgagcagct gccccagcca                                                    20
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
gcaggctgct tgagccaa                                                      18
<210>19
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>19
agaagctggc aggctg                                                        16
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>20
tgagtgaggc aggctg

Claims (14)

1.一种用作癌症诊断标志物的具有外显子3区域缺失的突变的G-CSFmRNA或cDNA片段。
2.一种用作癌症诊断标志物的具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变的G-CSF蛋白。
3.一种用于诊断癌症的微阵列，其包含结合(a)一个相应于G-CSF基因外显子3的DNA片段，和(b)至少一个相应于所述G-CSF基因的外显子1、2、4和5的DNA片段。
4.一种用于癌症的诊断试剂，其包含一种抗具有相应于所述G-CSF蛋白的外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的抗体。
5.一种用于癌症的诊断试剂盒，其包含一种抗具有相应于所述G-CSF蛋白的外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的抗体。
6.一种用于诊断癌症的微阵列，其包含一种抗具有相应于所述G-CSF蛋白的外显子3区域的氨基酸序列缺失的突变G-CSF蛋白的抗体。
7.一种引物，其用于在获自哺乳动物组织或细胞的G-CSF核酸样品中扩增G-CSF基因。
8.权利要求7的引物，其中所述引物选自下述核苷酸序列对：
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；
正义：5′-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3′(SEQ ID NO.1)和
反义：5′-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3′(SEQ ID NO.9)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；
正义：5′-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3′(SEQ ID NO.3)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)；
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3′(SEQ ID NO.2)；
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3′(SEQ ID NO.5)；和
正义：5′-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3′(SEQ ID NO.4)和
反义：5′-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3′(SEQ ID NO.6)。
9.一种突变的G-CSF蛋白，其具有相应于外显子3区域的氨基酸序列缺失。
10.一种与权利要求9的突变的G-CSF蛋白特异结合的抗体。
11.权利要求10的抗体，其中所述抗体是一种多克隆抗体。
12.权利要求10的抗体，其中所述抗体是一种单克隆抗体。
13.一种用于癌症的诊断方法，其包含步骤：(a)从哺乳动物组织或细胞中获得G-CSF核酸样品；(b)从所述获得的核酸样品扩增G-CSF区域；(c)在所述扩增样品中检测所述G-CSF基因的外显子3的缺失。
14.一种诊断癌症的方法，其包含步骤：(a)从哺乳动物组织或细胞中获得G-CSF蛋白样品；(b)在所述G-CSF蛋白样品中检测相应于G-CSF基因的外显子3的氨基酸序列的缺失。
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