JP4413611B2 - G−csf遺伝子におけるエキソン3の領域の欠失について測定することを特徴とするガンの診断方法 - Google Patents
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Description
他の観点で、本発明は、ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質を提供する。
また他の観点で、本発明は、(a)G−CSF遺伝子のエキソン3DNA断片及び(b)G−CSF遺伝子のエキソン1、2、4及び5DNA断片のうちの一つ以上の断片が結合したガン診断用マイクロアレイ又はメンブレンを提供する。
また他の観点で、本発明は、エキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質に対する抗体を含むガン診断用キットを提供する。
また他の観点で、本発明は、エキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質に対する抗体が結合したガン診断用マイクロアレイ又はメンブレンを提供する。
また他の観点で、本発明は(a)哺乳類の組織又は細胞試料を得る段階及び(b)得られた組織又は細胞試料中のエキソン3の領域のアミノ酸の欠失したG−CSF変異タンパク質を確認する段階を含むことを特徴とするG−CSF変異タンパク質の確認方法を提供する。
また他の観点で、本発明は、哺乳類の組織又は細胞試料から得られたG−CSF核酸試料を増幅するために用いられるプライマーを提供する。
単球性大食細胞(macrophage)、T−細胞及び繊維芽細胞のような細胞から生産されることが知られているコロニー刺激因子(colony stimulating factor, CSF)は正常に生体内で広範囲に分布されている。CSFは大きく顆粒性白血球のコロニー刺激因子(G−CSF)、単球性大食細胞のコロニー刺激因子及び顆粒性白血球−単球性大食細胞のコロニー刺激因子の3つに分けれ、このうち、G−CSFは、造血性肝細胞が増殖及び分化して生じるいろいろな血球生成に非常に重要な役割をするタンパク質である。これの主な作用は顆粒球、特に外部感染から生体を保護するのに重要な役割をする好中球(neutrophile)の数的増加を促進させることである。増殖性腫瘍に対して最近広く用いられている化学的治療法は、腫瘍の成長を抑制すると同時に、好中球前駆体の成長も抑制するので、患者から好中球による保護作用の減少現象を起こして深刻な副作用を誘発する。G−CSFはこのような薬物治療患者に投与したときに好中球の数的増加を促進させて感染性疾患を予防し、治療するのに効果があると知られている。1986年、人間由来のG−CSF遺伝子がNagata等によりその塩基配列がはじめて明らかになり、これのCOS細胞内における発現が報告された(参考:Nagata et al., Nature 319:415〜418, 1986)。
本発明者らは、ヒトのG−CSF遺伝子をクローニングしてこの遺伝子を生産するために研究を行う途中、ガン細胞から由来したG−CSF cDNAでエキソン3の部分(108bp)が 正確に欠失されていることを確認することができた。このような特定のエキソンの欠失はG−CSF以外の他の遺伝子では少なくなく報告されていたが、人間由来のG−CSF遺伝子においてはまだ報告されたことがなかった。ヒトのG−CSF遺伝子は、エキソン2末端の3つのアミノ酸がある場合とない場合があり、これら2つの場合はともに同じ活性を有していると報告されたことがある(参考:Nagata et al., EMBO J. 5:575〜581, 1986)。従って、G−CSF遺伝子のエキソン3の欠失について測定してガンを診断する方法はG−CSFのすべての亜型に同一の原理により適用されることができる。また、他の哺乳動物から由来したG−CSFもほとんど同一の活性をあらわしているものと知られているので、当業者は本発明によるG−CSF遺伝子のエキソン3の欠失について測定してガンを診断する方法が他の動物から由来したG−CSFにも同一の原理により適用することができることを理解するだろう。
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2);
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5);
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6);
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(配列番号9);
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2);
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5);
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6);
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2);
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5);及び
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6)。
上記核酸断片は、G−CSF遺伝子のエキソン3の領域を含まなくてもエキソン2又はエキソン4の領域に該当するプライマーを用いてエキソン3の領域の欠失を確認することができる核酸断片を含む。
本発明によるマイクロアレイの表面にはプローブとして、G−CSF遺伝子のエキソン3の領域に該当する核酸断片とともにエキソン1、2、4及び5からなる群から選択された一つ以上の核酸断片が取り付けられる。ここで、核酸断片プローブは、各エキソンの全体又は一部分の両方が可能である。本発明においてプローブとして使用されるエキソン3の領域の核酸断片としては、これらに限定されるのではないが、TGTGCCACCTACAAGCTGTG(配列番号14)、GAGCTGGTGCTGCTCGGACA(配列番号15)、GGACACTCTCTGGGCATCCC(配列番号16)及びCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAが含まれる。エキソン1、2、4及び/又は5の核酸断片は対照用プローブとして使用され、この例としては、これらに限定されるのではないが、CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC(配列番号10)、AGAAGCTGTGGTGCCAC(配列番号12)、TGAGTGAGTGTGCCAC(配列番号13)、GCAGGCTGCTTGAGCCAA(配列番号18)、AGAAGCTGGCAGGCTG(配列番号19)及びTGAGTGAGGCAGGCTG(配列番号20)が含まれる。
スライドガラス、メンブレンの表面にプローブをスポティングすることは、当分野の公知の技術により容易に実施することができる。又、標的の準備及びハイブリダイゼーションとストリッピングも通常の技術により実施することができる。
本発明によるエキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異体及びこれに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、当分野の常法により生産することができる(参考:Harlow, E. and Lane, D., Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York:ColdSpring HarborLaboratory, 1988; Wilson, L. and Matsudaira, P. eds. Antibodies in Cell Biology (Methods in Cell Biology, Vol. 37), New York: Academic Press, 1933)。
また、ハイブリダイゼーションを用いてG−CSF cDNAのエキソン3の欠失について確認することができる。例えば、正常のhG−CSF遺伝子を鋳型にしてPCRを行うことによりエキソン3の部位のDNA断片とエキソン2の領域のDNA断片を獲得し、これをナイロンメンブレンに固定化した後、ガン細胞株のcDNA標的とハイブリダイズさせた後、標的とエキソン3DNA断片との結合関係を確認してエキソン3の欠失を容易に確認することができる。
また、エキソン3の領域の欠失が生じる変異塩基配列から変異G−CSFに対する組換えタンパク質を作り、これに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を製作し、酵素免疫測定法により正常人と多様な患者間のG−CSF変異タンパク質の数値を測定することによって、エキソン3の領域の欠失を容易に確認することができる。
他の様態で、本発明は免疫クロマトグラフィー分析を含む。これの代表的なこととしてラテラルフローアッセイ(lateral flow assay)がある。このラテラルフローアッセイ型のキット構造を考察すると、試料が適用されるサンプルパッド(sample pad)、探知用抗体がコーティングされている放出パッド(releasing pad)、試料が移動して分離されて、抗体抗原反応が生じる展開用膜(主にニトロセルロース)又はストリップ、及び試料が続けて移動するための吸収パッド(absorption pad)からなっている。探知用抗体は、探知を表示するために、例えばコロイド性金粒子に固定されている。金粒子の代わりにラテックスビーズ(latex bead)又は炭素粒子を用いることもある。ラテラルフローアッセイの診断キッドはほとんどサンドイッチの形態で分析物を探知するように考案されている。試料内に入っている分析物がサンプルパッドに適用されて移動し始めながら、まず、放出パッドにコーティングされ、探知用抗体と反応して抗原−抗体結合体の形態で続けて展開される。移動しながら展開膜に固定されている捕獲抗体ともう一回反応してサンドイッチ形態の複合体を作る。捕獲抗体は展開膜に固定されているので、抗原−抗体反応が続けて生じると、複合体が捕獲抗体の固定面で蓄積される。タンパク質は肉眼では透明であるので、複合体の生成と相対的な量を、取り付けられている金粒子の量で判断する。
本発明のガンの診断方法の対象ガンとしては、胃ガン、乳房ガン、肉腫、腸ガン、肺ガン、子宮頸部ガン、肝ガン、前立腺ガン、舌ガン、喉頭ガン、咽頭ガン、口腔ガン、甲状腺ガン、大腸ガン、食道ガン、睾丸ガン等を診断するのに有用に用いることができる。
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示することで、本発明の内容が実施例により限定されるのではない。
8種の正常細胞及び組織と17種のガン細胞株からmRNA及びcDNAを製造した。本発明の実施例で用いた正常細胞株とガン細胞株は下記の表1に示した通りである。
それぞれのガン細胞で正常のhG−CSF遺伝子の発現を確認するために、前記実施例1で製造したそれぞれのcDNAを鋳型(template DNA)にしてポリメレース連鎖反応(PCR)を行った。PCRは図2に示したように、hG−CSF遺伝子のエキソン2の一部からエキソン5まで(Thr1−Pro174)を増幅したPCR1反応、エキソン2の一部からエキソン3まで(Ile24−Leu71)を増幅したPCR2反応及びエキソン3からエキソン4の一部分(Cys36−Ser80)を増幅したPCR3反応を行った。
ハイブリダイゼーション法によりガン細胞株でのG−CSF cDNAのエキソン3の欠失を確認した。正常細胞株から由来したG−CSF遺伝子を鋳型にし、プライマー対5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(センス、配列番号4)と5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(アンチセンス、配列番号5)を用いてPCRを行い、G−CSF遺伝子のエキソン3の部位のDNA断片(108bp)を得た。
また、正常細胞株から由来したG−CSF遺伝子を鋳型にし、プライマー対5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(センス、配列番号1)と5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(アンチセンス、配列番号9)を用いてPCRを行うことによって、G−CSF遺伝子のエキソン2の部位のDNA断片(105bp)を得た。
ナイロンメンブレン(Boehringer Mannheim GmbH製)にそれぞれの分離精製した各DNA断片50ng/μlをスポッティング(spotting)した後、80℃で2時間置いてから固定化した。
G−CSFのエキソン3の部分の欠失を確認するための道具として、DNAチップを適用可能であるかを調査するためにガラス上に固定化すべきDNA断片のプローブを製作した。
プローブは、G−CSFのエキソン2の部分で一つのプローブを、エキソン3の部分に互いに重ならないように4つのプローブを、エキソン4の部分で一つのプローブを20個のオリゴヌクレオチドで構成するようにデザインした。また、エキソン2からエキソン3にわたって一つのプローブを、エキソン3からエキソン4にわたって一つのプローブを、エキソン2からエキソン4にわたって一つのプローブを各エキソンの塩基配列を8つずつ有するようにデザインした。G−CSFのエキソン2の部分は選択的スプライシング(alternative splicing)機作により二つの種類(ヒトのG−CSFa、ヒトのG−CSFb)を有しているので(参考:Tshuchiya M. et al., EMBO J 5:575〜581, 1986)、エキソン2の部分でデザインしたプローブはそれぞれ二つの種類をすべてデザインした。
DNAプローブを固定化するためにすべてのDNA断片のプローブを合成するとき、3’一番目の位置にアミノリンカーカラム(aminolinker column、Cruachem Ltd.製, Glasgrow, Scotland)を用いてアミン基(amino group)を有する塩基を挿入し、スライドガラス(slide glass)はアルデヒド基(aldehyde group)でコーディングされているもの(CEL Associates, Inc.製, Huston, Taxas, USA)を購入した。プローブを3×SSC(0.45M NaCl、15mM C6H5Na3O7、pH7.0)の緩衝溶液に溶解させた状態で、本実験室自体で製作したマイクロアレイヤ(microarrayer)を用いて(参考:Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10:21〜26, 2000)集積した後、55%程度の湿度が維持される条件で1時間以上化学反応を誘導し、6時間以上放置してDNAプローブを固定化した。菌検索用プローブは、100μMの濃度で全体プローブを275μmの間隔で順序通り集積してマイクロアレイを製作した。
それぞれの細胞株から抽出したG−CSF遺伝子を鋳型にしてアシンメトリックPCR(Asymmetric PCR)を行って断片遺伝子を製作し、これをガラス板上に固定すべきプローブとして用いた。断片遺伝子は、プライマー対5'-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3'(センス、配列番号10)と5'-FITC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3'(アンチセンス、配列番号11)の添加比率を1:5に差別化することによって、一回のポリメレース連鎖反応で得た。スライドガラス上に固定化したプローブは、下記の表2に収録されている。
この結果により、前記提示したプライマーとプローブを用いてG−CSFのエキソン3の部分の欠失を検索することができるDNAチップの開発が可能であることが分かった。
組換え大腸菌を用いてG−CSF変異タンパク質を多量生産するために、組換えプラスミドpED−CSF4BLIIEを有しているE.coli BL21(DE3)(Novagen Inc.製, USA)の流加式発酵を行った。pED−CSF4BLIIEはプラスミドpET21c(Novagen Inc.製)にエキソン3の領域の塩基配列が欠失したG−CSF変異体に対する塩基配列をクローニングしたものである。製造方法は次の通りである。まず、ヒトの乳房ガンcDNAライブラリ(library)を鋳型にしてEcoRI部位を有しているフォーワードプライマー(Primer 1)5'-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3'とBamHI部位を有しているリバースプライマー(Primer 2)5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3'を用いてポリメレース連鎖反応を実施した後、反応物にEcoRIとBamHIの制限酵素で処理し、まず、pUC19(Stratagene製, USA)にクローニングしてp19CSFプラスミドを作製した(図12参照)。pUC19内にクローニングされたCSF遺伝子はエキソン3の領域がない状態である。
本実施例では、組換えG−CSF変異体を大腸菌(E.coli)から得た後に、抗ウサギ変異のヒトのG−CSFを得るための抗原として用いた。抗原特異的ポリクローナル抗体を生成するために、1mg/mLの濃度でリン酸緩衝溶液中に溶解された突然変異ヒトのG−CSF精製溶液400μlを同量のフロイントアジュバント(Freund’s adjuvant, BRL社で市販)で乳化した後、10週のウサギに11日の間隔で4回筋肉に注射した。4回筋肉注射した10日後に心臓穿孔法で血液を採取した。採取した血液を常温で30分間、また、4℃で一晩放置して完全凝固させた後、2,500rpmで30分間遠心分離して上澄液を取ることにより血清を得た。これに最終濃度が40%となるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿させ、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に一晩透析した後、DEAE Affi−Gel Blue gel(Bio-Rad社で市販)で抗体を精製した(参考:Smith, C. P., Jensen, D., Allen, T. and Kreger, M. (Eds.) Information Resources for Adjuvants and Antibody Production. U. S.Dept. of Agriculture, 1997; Hanly W. C. et al., ILAR Journal 37:93〜118, 1995)。
1mg/mL濃度の精製されたヒトのG−CSF変異タンパク質100μlを同量のフロイントアジュバントで乳化した後、生後6〜8週のBALB/cマウスに2週の間隔で3回腹腔内に注入した。最後の注入後、抗G−CSF変異タンパク質に対する抗体の生成を確認し、2週後に100μgのヒトのG−CSF変異タンパク質で最後に免疫させ、3日後にマウスから脾臓細胞を抽出し、Sp2/0−Ag14骨髄腫(myeloma)細胞と10:1の比率で混合し、この混合液を50%ポリエチレングリコール1500の溶液に3分間放置して細胞融合を実行した。これを1,200rpmで8分間遠心分離して細胞沈殿物を得た後、10%ウシ胎児血清(fetal calf serum)を含むHAT RPMI−1640培地で1mL当り3.5×106細胞となるように浮遊させて96−ウェルプレート(96−well plate)にウェル当り0.1mLずつ分注し、37℃、5%CO2の培養器で培養した。3日後、10%ウシ胎児血清を含むHAT RPMI−1640培地をウェル当り0.1mLずつ添加し、4日毎に培地の半分を新鮮な培地に取り替えた(参考:Amyx, H. L., JAVMA 191:1287〜1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589〜2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989)。
上記で免疫で用いた組換えG−CSF変異体に対する抗ウサギ変異のヒトのG−CSF又は抗マウス変異のヒトのG−CSFを、セルロプラスミンを0.01M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.6)で10μg/ウェルで希釈して入れ、4℃で一晩コーティングした。その後、PBST(0.15%Tween20)で4回洗浄し、0.1%アルブミンで37℃で1時間反応(blocking)させた。同じ方法で洗浄した後、標準希釈緩衝液(standard diluent buffer)50μlとサンプルを入れ、徐々に混ぜながら、37℃で2時間反応させた後にPBSTで4回洗浄した。ペルオキシダーゼ(peroxidase)が付している2次抗体である抗免疫グロブリン抗体(Peroxidaseconjugated anti-human immunoglobulin antibody)を2.5μg/ウェルとなるように、0.15N NaClが入っている10mMリン酸(Phosphate)緩衝液に希釈した後に各ウェルに入れ、30分間室温で反応させた。再度PBSTで4回洗浄した。酵素反応用基質としてはTMB溶液を各ウェルに50μlずつ入れ、室温で暗反応させた後に2.5N硫酸で反応を停止させ、450nm波長でELISAリーダーで吸光度を測定した。
図11から分かるように、ヒトのG−CSF変異タンパク質の数値はガン患者において非常に上昇する結果を示した。各ガン患者別に数値を比較したとき、特に乳房ガンの場合、ヒトのG−CSF変異タンパク質の数値が非常に上昇することが分かった。
また、本発明者らが発明したエキソン3の領域のアミノ酸が欠失したG−CSF変異体に対する抗体としてG−CSF変異体タンパク質を測定することにより正常人とガン患者を容易に区分することができる。これもまた、G−CSF変異体に関する確認のみで正確にガンを診断することができることを示唆しており、一度に多数の臨床検体を適用することができ、ひいてはタンパク質アレイに関する技術にも大きく貢献するようになるだろう。
Claims (8)
- ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン3領域が欠失したG−CSF mRNA変異断片またはG−CSF cDNA変異断片。
- ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン3領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質。
- (a)G−CSF遺伝子のエキソン3DNA断片及び(b)G−CSF遺伝子のエキソン1、2、4及び5DNA断片のうちの一つ以上の断片が結合したガン診断用マイクロアレイ。
- エキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質に対する抗体を有するガン診断剤。
- エキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質に対する抗体を有するガン診断用キット。
- エキソン3の領域のアミノ酸配列が欠失したG−CSF変異タンパク質に対する抗体が結合したガン診断用マイクロアレイ。
- (a)哺乳類の組織又は細胞試料からG−CSF核酸試料を得る段階、(b)得られたG−CSF核酸試料を増幅する段階及び(c)増幅した試料からG−CSF遺伝子のエキソン3の欠失を確認する段階を含むことを特徴とするエキソン3欠失G−CSF遺伝子の確認方法。
- 哺乳類由来の組織又は細胞試料中から、G−CSF遺伝子のエキソン3に対応するアミノ酸配列の欠失を確認する段階を含むことを特徴とするG−CSF変異タンパク質の確認方法。
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