JP3385408B2 - 新規蛋白質とその抗体、並びにその新規蛋白質の製造方法 - Google Patents
新規蛋白質とその抗体、並びにその新規蛋白質の製造方法Info
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- C07K16/1253—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】 本発明は、新規蛋白質とその抗
体、並びにその新規蛋白質の製造方法、とりわけ癌転移
促進活性を有する新規蛋白質とその抗体、並びにその新
規蛋白質の製造方法に関する。
体、並びにその新規蛋白質の製造方法、とりわけ癌転移
促進活性を有する新規蛋白質とその抗体、並びにその新
規蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】 癌の治療方法は、主に外科的手術、化
学療法、放射線療法などが行われている。しかしなが
ら、これらの方法によって大部分の治療はできるもの
の、一部の生き残った癌細胞を撒き散らしてより重篤な
癌転移を促進し、かえって寿命を縮めることすらあると
言われている。
学療法、放射線療法などが行われている。しかしなが
ら、これらの方法によって大部分の治療はできるもの
の、一部の生き残った癌細胞を撒き散らしてより重篤な
癌転移を促進し、かえって寿命を縮めることすらあると
言われている。
【０００３】この癌転移が抑制できるなら、癌患者の苦
痛を和らげ、余命を大幅に延ばすことが可能であると考
えられ、癌転移研究の進展が強く望まれている。しかし
ながら癌転移は、（１）原発巣からの転移性細胞の遊
離、（２）血管内への転移性細胞の浸潤、（３）血管内
皮細胞への接着、（４）転移先臓器への浸潤、（５）転
移先臓器での増殖、等の複雑な過程を経て成立すると考
えられており、この複雑さゆえに癌転移に関する研究は
困難を極めているのが現状である。本発明者らは癌転移
について多年研究を行っており、ヒト大腸癌由来の培養
株化細胞であるＲＰＭＩ ４７８８細胞（微工研条寄第
２４２９号）の細胞表面に転移に関係する抗原が存在す
ることを発見し、１９９０年アメリカ癌学会で報告した
「プロシーディングズ・オブ・ジ・アメリカン・アソシ
エイション・フォー・キャンサー・リサーチ（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）第３１巻、第２９８頁（１９９０年）」。一
方、シー・シュミットハウザー（Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｈａ
ｕｓｅｒ）らは、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ）属に属する微生物が癌細胞の浸潤性を高めると報告
した「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第９５巻、
第４９９〜５０６頁（１９９０年）」が、その実態は明
らかにされておらず、その解明が待たれている。
痛を和らげ、余命を大幅に延ばすことが可能であると考
えられ、癌転移研究の進展が強く望まれている。しかし
ながら癌転移は、（１）原発巣からの転移性細胞の遊
離、（２）血管内への転移性細胞の浸潤、（３）血管内
皮細胞への接着、（４）転移先臓器への浸潤、（５）転
移先臓器での増殖、等の複雑な過程を経て成立すると考
えられており、この複雑さゆえに癌転移に関する研究は
困難を極めているのが現状である。本発明者らは癌転移
について多年研究を行っており、ヒト大腸癌由来の培養
株化細胞であるＲＰＭＩ ４７８８細胞（微工研条寄第
２４２９号）の細胞表面に転移に関係する抗原が存在す
ることを発見し、１９９０年アメリカ癌学会で報告した
「プロシーディングズ・オブ・ジ・アメリカン・アソシ
エイション・フォー・キャンサー・リサーチ（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）第３１巻、第２９８頁（１９９０年）」。一
方、シー・シュミットハウザー（Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｈａ
ｕｓｅｒ）らは、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ）属に属する微生物が癌細胞の浸潤性を高めると報告
した「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第９５巻、
第４９９〜５０６頁（１９９０年）」が、その実態は明
らかにされておらず、その解明が待たれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のように癌転移研
究の進展が強く望まれている。本発明は、癌転移促進活
性を有する癌転移促進物質、その抗体、および癌転移促
進物質の製造方法を確立することにより、癌転移のメカ
ニズムを探る上での有用な手段を与えるものである。さ
らに、本発明の新規蛋白質、あるいはその部分アミノ酸
構造を認識する抗体を、癌転移診断剤並びに癌転移抑制
剤へ利用することも大いに期待できる。
究の進展が強く望まれている。本発明は、癌転移促進活
性を有する癌転移促進物質、その抗体、および癌転移促
進物質の製造方法を確立することにより、癌転移のメカ
ニズムを探る上での有用な手段を与えるものである。さ
らに、本発明の新規蛋白質、あるいはその部分アミノ酸
構造を認識する抗体を、癌転移診断剤並びに癌転移抑制
剤へ利用することも大いに期待できる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、マイコプ
ラズマを感染させた転移性を有するヒト大腸癌由来株化
細胞であるＲＰＭＩ ４７８８細胞（微工研条寄第２４
２９号）を用いて、癌転移に関与する新規物質を検索す
べく鋭意研究を続けてきた。その結果、該細胞を抗原と
して免疫することにより転移促進物質に対するモノクロ
ーナル抗体を作出した。このモノクローナル抗体を固定
化したゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー
により、該細胞の可溶化物から癌転移促進物質を精製、
採取し、その理化学的性質を調べたところ、本物質は癌
転移促進活性を有する新規蛋白質であることが判明し、
その製造方法、並びにその新規蛋白質を認識するモノク
ローナル抗体を確立して本発明を完成した。すなわち本
発明の新規蛋白質は、以下の理化学的性質を有する。
ラズマを感染させた転移性を有するヒト大腸癌由来株化
細胞であるＲＰＭＩ ４７８８細胞（微工研条寄第２４
２９号）を用いて、癌転移に関与する新規物質を検索す
べく鋭意研究を続けてきた。その結果、該細胞を抗原と
して免疫することにより転移促進物質に対するモノクロ
ーナル抗体を作出した。このモノクローナル抗体を固定
化したゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー
により、該細胞の可溶化物から癌転移促進物質を精製、
採取し、その理化学的性質を調べたところ、本物質は癌
転移促進活性を有する新規蛋白質であることが判明し、
その製造方法、並びにその新規蛋白質を認識するモノク
ローナル抗体を確立して本発明を完成した。すなわち本
発明の新規蛋白質は、以下の理化学的性質を有する。
【０００６】（１）分子量
４５，０００±５，０００
【０００７】（２）等電点
ｐＩ＝６．０±１．０
【０００８】（３）部分アミノ酸配列
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙおよび
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓを有す
る。
【０００９】（４）紫外線吸収スペクトル
２８０ｎｍ付近に最大吸収を示す。
【００１０】（５）溶剤に対する溶解性
水、生理食塩水またはリン酸緩衝液に可溶。
【００１１】（６）癌転移促進活性
ヒト大腸癌由来の培養株化細胞であるＲＰＭＩ ４７８
８細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を促進させる
活性を有する。
８細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を促進させる
活性を有する。
【００１２】（７）癌転移促進活性の安定性
水溶液（ｐＨ７．２）で１００℃、１０分間の条件によ
り失活する。水溶液（ｐＨ７．２）で４℃、一ケ月間の
条件で安定。
り失活する。水溶液（ｐＨ７．２）で４℃、一ケ月間の
条件で安定。
【００１３】以下、本発明を実験で詳細に説明する。
【００１４】
【実験１】癌転移促進物質に対する抗体の調製
【００１５】ＲＰＭＩ ４７８８細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２４２９）のシード培養物にマイコプラズマ・アルギ
ニーニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、以
下Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉと記す）ＩＦＯ １４４７６を
細胞約２×１０ ７ 個当り約１×１０ ５ コロニー形成単位
加え、細胞をマイコプラズマに感染させた。このように
して得られたマイコプラズマを感染させた高転移性ＲＰ
ＭＩ ４７８８細胞を、公知の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で増殖させ、約３×１０６個をマウスの腹腔内に２週間
間隔で４回注射して免疫した。このマウスから脾臓を摘
出し、細切分散して得られる脾臓細胞と、マウス骨髄腫
細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（フローラボラトリーズ社、
アメリカ）とを、血清不含有Ｅａｇｌｅ最少基本培地で
調製した５０％ポリエチレングリコールー１０００溶液
にそれぞれ１０４個／ｍｌとなるように浮遊させて、３
７℃で５分間処理を行った。次いで前記基本培地で２０
倍に希釈し、ダビソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）などがソマ
ティック・セル・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｅ Ｃ
ｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２巻、第１６５〜１７
６頁（１９７６年）に報告している方法に準じてヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン添加培養液で増殖
しうる融合細胞を採取し、この融合細胞から免疫源とし
て用いたＲＰＭＩ ４７８８細胞と特異的に反応する抗
体を産生する融合細胞を選択した。得られた融合細胞を
マウス腹腔内に１匹当たり約１０６個移植して約２週間
飼育した後、腹水、血液をあつめ遠心分離し、得られた
上清を、プロテインＧセファロースカラム（ファルマシ
ア社、スウェーデン）を用いてアフィニティークロマト
グラフィーを行い精製モノクローナル抗体標品を得た。
本モノクローナル抗体標品は、マイコプラズマを感染さ
せたＲＰＭＩ ４７８８細胞の転移に対し、著しい抑制
効果を示した。
−２４２９）のシード培養物にマイコプラズマ・アルギ
ニーニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、以
下Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉと記す）ＩＦＯ １４４７６を
細胞約２×１０ ７ 個当り約１×１０ ５ コロニー形成単位
加え、細胞をマイコプラズマに感染させた。このように
して得られたマイコプラズマを感染させた高転移性ＲＰ
ＭＩ ４７８８細胞を、公知の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で増殖させ、約３×１０６個をマウスの腹腔内に２週間
間隔で４回注射して免疫した。このマウスから脾臓を摘
出し、細切分散して得られる脾臓細胞と、マウス骨髄腫
細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（フローラボラトリーズ社、
アメリカ）とを、血清不含有Ｅａｇｌｅ最少基本培地で
調製した５０％ポリエチレングリコールー１０００溶液
にそれぞれ１０４個／ｍｌとなるように浮遊させて、３
７℃で５分間処理を行った。次いで前記基本培地で２０
倍に希釈し、ダビソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）などがソマ
ティック・セル・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｅ Ｃ
ｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２巻、第１６５〜１７
６頁（１９７６年）に報告している方法に準じてヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン添加培養液で増殖
しうる融合細胞を採取し、この融合細胞から免疫源とし
て用いたＲＰＭＩ ４７８８細胞と特異的に反応する抗
体を産生する融合細胞を選択した。得られた融合細胞を
マウス腹腔内に１匹当たり約１０６個移植して約２週間
飼育した後、腹水、血液をあつめ遠心分離し、得られた
上清を、プロテインＧセファロースカラム（ファルマシ
ア社、スウェーデン）を用いてアフィニティークロマト
グラフィーを行い精製モノクローナル抗体標品を得た。
本モノクローナル抗体標品は、マイコプラズマを感染さ
せたＲＰＭＩ ４７８８細胞の転移に対し、著しい抑制
効果を示した。
【００１６】
【実験２】癌転移促進活性を有する蛋白質の調製と、そ
の理化学的性質
の理化学的性質
【００１７】マイコプラズマを感染させたＲＰＭＩ ４
７８８細胞を、公知の方法で培養用フラスコ内で増殖さ
せた後、ラバー・ポリスマンを用いて物理的に剥がし遠
心洗浄した。得られた細胞に８０ｍＭになるようにオク
チルグルコシド（株式会社同仁化学研究所、熊本）を加
え４℃で一晩撹拌して細胞を可溶化した後瀘過し、得ら
れた濾液を、実験１の方法で調製したモノクローナル抗
体を固定化したゲルを用いてアフィニティークロマトグ
ラフィーにかけ、癌転移促進活性を有する蛋白質を調製
した。３０Ｌの培養液より約１ｍｇの精製蛋白質を得
た。
７８８細胞を、公知の方法で培養用フラスコ内で増殖さ
せた後、ラバー・ポリスマンを用いて物理的に剥がし遠
心洗浄した。得られた細胞に８０ｍＭになるようにオク
チルグルコシド（株式会社同仁化学研究所、熊本）を加
え４℃で一晩撹拌して細胞を可溶化した後瀘過し、得ら
れた濾液を、実験１の方法で調製したモノクローナル抗
体を固定化したゲルを用いてアフィニティークロマトグ
ラフィーにかけ、癌転移促進活性を有する蛋白質を調製
した。３０Ｌの培養液より約１ｍｇの精製蛋白質を得
た。
【００１８】本品を用いて、理化学的性質を調べた。
【００１９】（１）分子量
レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法「ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、第２２７巻、６８０〜６８５頁（１９７０
年）」に準じたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、分子量マー
カーとの相対的易動度により分子量を測定した。その結
果、分子量は４５，０００±５，０００であった。
ｕｒｅ）、第２２７巻、６８０〜６８５頁（１９７０
年）」に準じたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、分子量マー
カーとの相対的易動度により分子量を測定した。その結
果、分子量は４５，０００±５，０００であった。
【００２０】（２）等電点
ファルマシア（スウェーデン）製等電点電気泳動用ゲ
ル、商品名アンフォライン・パグプレート（ＡＭＰＨＯ
ＬＩＮＥ ＰＡＧＰＬＡＴＥ、ｐＨ３．５〜９．５）を
用いて分析した結果、等電点は６．０±１．０の範囲に
あった。
ル、商品名アンフォライン・パグプレート（ＡＭＰＨＯ
ＬＩＮＥ ＰＡＧＰＬＡＴＥ、ｐＨ３．５〜９．５）を
用いて分析した結果、等電点は６．０±１．０の範囲に
あった。
【００２１】（３）部分アミノ酸配列
本品をＴＰＣＫ−トリプシン（シグマ社、アメリカ）に
より消化後、Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ−３１８カラム（バ
イオラッド社、アメリカ）を用いた逆相クロマトグラフ
ィーを行ってペプチド断片を分取した。得られたペプチ
ド断片のうちの２つを４７０Ａ型アミノ酸シークエンサ
ー（アプライドバイオシステム社、アメリカ）により分
析した。その結果、部分アミノ酸配列として、Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、および、Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓが確認された。
より消化後、Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ−３１８カラム（バ
イオラッド社、アメリカ）を用いた逆相クロマトグラフ
ィーを行ってペプチド断片を分取した。得られたペプチ
ド断片のうちの２つを４７０Ａ型アミノ酸シークエンサ
ー（アプライドバイオシステム社、アメリカ）により分
析した。その結果、部分アミノ酸配列として、Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、および、Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓが確認された。
【００２２】（４）紫外線吸収スペクトル
ＵＶ２５０型分光光度計（島津製作所、京都）を用いて
紫外部での吸収スペクトルを調べた結果、２８０ｎｍ付
近に最大吸収を示した。
紫外部での吸収スペクトルを調べた結果、２８０ｎｍ付
近に最大吸収を示した。
【００２３】（５）溶剤に対する溶解性
本品は、水、生理食塩水またはリン酸緩衝液に可溶であ
った。
った。
【００２４】（６）癌転移促進活性
癌転移促進活性は、猶本らの報告「ジャーナル・オブ・
キャンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第１１３
巻、第５４４〜５４９頁（１９８７年）」に準じ、マイ
コプラズマ非感染のＲＰＭＩ ４７８８細胞を用いてヌ
ードマウスに肺転移を起こさせる転移モデルで調べた。
試験群（体重約２０ｇ、６〜８週齢のヌードマウス ５匹
以上）では、まず本品を含むリン酸緩衝液０．２ｍｌ
を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの尾静脈より、細胞移植
の２４時間前、および３時間前の計２回、注射した。次
いで、本品を含むリン酸緩衝液０．２ｍｌに浮遊させた
マイコプラズマ非感染ＲＰＭＩ ４７８８細胞２×１０
６個を同様に注射した。さらにＲＰＭＩ ４７８８細胞
移植の２４時間後に、もう１度本品を含むリン酸緩衝液
０．２ｍｌを同様に注射した。対照群に対しては、本品
不含のリン酸緩衝液を用いて同様の処置を行った。細胞
移植後２１目にヌードマウスを屠殺後肺表面の転移巣を
肉眼的に数えた。対照群の平均転移数が５０個以上認め
られた場合に、この平均転移数を２倍以上に増加させ、
かつその増加が統計学的に有意と判定された場合には、
転移促進活性があると判断した。本品を１５０μｇ／ｍ
ｌの濃度で含むリン酸緩衝液を用いて、上記の方法で転
移促進活性を調べた結果、対照群（匹数５匹）での転移
数が１００±５３個であったのに対し、本品投与群で
は、実験に使用した５匹すべてにおいて１０００個以上
の転移が観察され、明かな転移促進活性が認められた。
またこの促進活性は統計学的に有意であった。
キャンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第１１３
巻、第５４４〜５４９頁（１９８７年）」に準じ、マイ
コプラズマ非感染のＲＰＭＩ ４７８８細胞を用いてヌ
ードマウスに肺転移を起こさせる転移モデルで調べた。
試験群（体重約２０ｇ、６〜８週齢のヌードマウス ５匹
以上）では、まず本品を含むリン酸緩衝液０．２ｍｌ
を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの尾静脈より、細胞移植
の２４時間前、および３時間前の計２回、注射した。次
いで、本品を含むリン酸緩衝液０．２ｍｌに浮遊させた
マイコプラズマ非感染ＲＰＭＩ ４７８８細胞２×１０
６個を同様に注射した。さらにＲＰＭＩ ４７８８細胞
移植の２４時間後に、もう１度本品を含むリン酸緩衝液
０．２ｍｌを同様に注射した。対照群に対しては、本品
不含のリン酸緩衝液を用いて同様の処置を行った。細胞
移植後２１目にヌードマウスを屠殺後肺表面の転移巣を
肉眼的に数えた。対照群の平均転移数が５０個以上認め
られた場合に、この平均転移数を２倍以上に増加させ、
かつその増加が統計学的に有意と判定された場合には、
転移促進活性があると判断した。本品を１５０μｇ／ｍ
ｌの濃度で含むリン酸緩衝液を用いて、上記の方法で転
移促進活性を調べた結果、対照群（匹数５匹）での転移
数が１００±５３個であったのに対し、本品投与群で
は、実験に使用した５匹すべてにおいて１０００個以上
の転移が観察され、明かな転移促進活性が認められた。
またこの促進活性は統計学的に有意であった。
【００２５】
さらに、本品を１５０μｇ／ｍｌの濃度で
含むリン酸緩衝液に実験１の方法で調製した精製モノク
ローナル抗体標品を１２５０μｇ／ｍｌとなるように添
加した後、室温で２時間静置して本品と特異的に反応さ
せて得た抗体処理標品を含有する溶液を用いて、上記方
法によりその転移促進活性を調べたところ、この抗体処
理標品投与群（匹数５匹）での転移数は、３３５±１３
９個であった。また、精製モノクローナル抗体標品のみ
を１２５０μｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝液を投与
した対照群（匹数５匹）での転移数は２３０±６４個で
あった。前記抗体処理標品投与群と対照群との間に統計
学的な差異は認められなかった。
含むリン酸緩衝液に実験１の方法で調製した精製モノク
ローナル抗体標品を１２５０μｇ／ｍｌとなるように添
加した後、室温で２時間静置して本品と特異的に反応さ
せて得た抗体処理標品を含有する溶液を用いて、上記方
法によりその転移促進活性を調べたところ、この抗体処
理標品投与群（匹数５匹）での転移数は、３３５±１３
９個であった。また、精製モノクローナル抗体標品のみ
を１２５０μｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝液を投与
した対照群（匹数５匹）での転移数は２３０±６４個で
あった。前記抗体処理標品投与群と対照群との間に統計
学的な差異は認められなかった。
【００２６】これらの結果から、実験１の方法で得られ
た精製モノクローナル抗体標品は、癌転移促進活性を有
する蛋白質を特異的に中和する抗体であることが判っ
た。
た精製モノクローナル抗体標品は、癌転移促進活性を有
する蛋白質を特異的に中和する抗体であることが判っ
た。
【００２７】
（７）転移促進活性の安定性
本品をｐＨ７．２、１００℃、１０分間の条件で処理し
た後上記の方法により転移促進活性を調べたが、その活
性は認められなかった。一方、本品をｐＨ７．２で４
℃、一ケ月間保存した後活性を調べたところ、その活性
に低下は認められなかった。
た後上記の方法により転移促進活性を調べたが、その活
性は認められなかった。一方、本品をｐＨ７．２で４
℃、一ケ月間保存した後活性を調べたところ、その活性
に低下は認められなかった。
【００２８】
【実験３】癌転移促進活性を有する蛋白質の由来の同定
【００２９】
以下の実験に使用した方法は、ティー・マ
ニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの「モレキュラ
ー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー （Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）出版、１９８９
年」、あるいは「ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實
編、丸善、１９８８年」などの実験書に記載されている
一般的な方法を使用した。
ニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの「モレキュラ
ー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー （Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）出版、１９８９
年」、あるいは「ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實
編、丸善、１９８８年」などの実験書に記載されている
一般的な方法を使用した。
【００３０】
（１）標識ＤＮＡプローブの作成
【００３１】
実験２（３）で得られた部分アミノ酸配列
よりＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
の配列を選択し、このアミノ酸配列より予想される塩基
配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステ
ム社、アメリカ）を用いて合成した。標識は、［γ−
３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て常法どおり行い、得られた６４種の塩基配列を表１に
まとめた。
よりＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
の配列を選択し、このアミノ酸配列より予想される塩基
配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステ
ム社、アメリカ）を用いて合成した。標識は、［γ−
３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て常法どおり行い、得られた６４種の塩基配列を表１に
まとめた。
【００３２】
【表１】
【００３３】これらを標識ＤＮＡプローブとして、下記
の実験（３）に使用した。
の実験（３）に使用した。
【００３４】
（２）Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体ＤＮ
Ａの調製
Ａの調製
【００３５】
Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ ＩＦＯ １４４７
６を、ＰＰＬＯブロス ｗ／ｏ ＣＶ（ディフコ社、ア
メリカ）に１５ｖ／ｖ％馬血清（フローラボラトリーズ
社、アメリカ）、および０．０５ｗ／ｖ％酵母エキス
（ディフコ社、アメリカ）となるようそれぞれ添加した
培地１Ｌで３７℃、３週間静置培養した。培養液を遠心
分離し、得られたＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉから常法に従っ
てＤＮＡを調製した。
６を、ＰＰＬＯブロス ｗ／ｏ ＣＶ（ディフコ社、ア
メリカ）に１５ｖ／ｖ％馬血清（フローラボラトリーズ
社、アメリカ）、および０．０５ｗ／ｖ％酵母エキス
（ディフコ社、アメリカ）となるようそれぞれ添加した
培地１Ｌで３７℃、３週間静置培養した。培養液を遠心
分離し、得られたＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉから常法に従っ
てＤＮＡを調製した。
【００３６】
（３）標識ＤＮＡプローブを用いたサザン
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション
【００３７】
（２）で調製したＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造、京都）により消
化し、アガロース電気泳動を行った後、分離したＤＮＡ
断片をブロッティング操作によりニトロセルロース膜に
移した。次に、非特異的結合を防止するためにサケ精子
ＤＮＡ（シグマ社、アメリカ）を用いてプレハイブリダ
イゼーションを行った後、（１）で調製した標識ＤＮＡ
プローブを用いたサザンハイブリダイゼーショシを行っ
た。サザンハイブリダイゼーション後のニトロセルロー
ス膜をＸ線フィルムと密着させオートラジオグラフィー
を行い、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体ＤＮＡ断片と、
標識ＤＮＡプローブとの結合の有無を調べることにより
Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体中に癌転移促進活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ配列があるか否かを調べ
た。その結果、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体ＤＮＡ断
片と、標識ＤＮＡプローブとの結合を意味する明確なバ
ンドが認められたことより、本発明の癌転移促進活性を
有する新規蛋白質はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ由来であるこ
とが明らかとなった。
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造、京都）により消
化し、アガロース電気泳動を行った後、分離したＤＮＡ
断片をブロッティング操作によりニトロセルロース膜に
移した。次に、非特異的結合を防止するためにサケ精子
ＤＮＡ（シグマ社、アメリカ）を用いてプレハイブリダ
イゼーションを行った後、（１）で調製した標識ＤＮＡ
プローブを用いたサザンハイブリダイゼーショシを行っ
た。サザンハイブリダイゼーション後のニトロセルロー
ス膜をＸ線フィルムと密着させオートラジオグラフィー
を行い、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体ＤＮＡ断片と、
標識ＤＮＡプローブとの結合の有無を調べることにより
Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体中に癌転移促進活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ配列があるか否かを調べ
た。その結果、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉの染色体ＤＮＡ断
片と、標識ＤＮＡプローブとの結合を意味する明確なバ
ンドが認められたことより、本発明の癌転移促進活性を
有する新規蛋白質はＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ由来であるこ
とが明らかとなった。
【００３８】
以下、本発明の２〜３の実施例を述べる。
【００３９】
【実施例１】Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉからの製造
【００４０】
Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ ＩＦＯ １４４７
６を、実験３（２）記載の方法と同様に培養し、この培
養液を遠心分離後Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉを採取した。こ
れを冷却しつつ超音波破砕した後瀘過し、得られた瀘液
を、癌転移促進活性を有する蛋白質を認識するモノクロ
ーナル抗体を固定化したゲルを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを行い、癌転移促進活性を有する蛋白
質を得た。その収量は、培養液１Ｌ当たり約０．２ｍｇ
であった。本品は、実験２記載のマイコプラズマ感染Ｒ
ＰＭＩ ４７８８より調製した癌転移促進活性を有する
新規蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
６を、実験３（２）記載の方法と同様に培養し、この培
養液を遠心分離後Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉを採取した。こ
れを冷却しつつ超音波破砕した後瀘過し、得られた瀘液
を、癌転移促進活性を有する蛋白質を認識するモノクロ
ーナル抗体を固定化したゲルを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを行い、癌転移促進活性を有する蛋白
質を得た。その収量は、培養液１Ｌ当たり約０．２ｍｇ
であった。本品は、実験２記載のマイコプラズマ感染Ｒ
ＰＭＩ ４７８８より調製した癌転移促進活性を有する
新規蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
【００４１】
【実施例２】Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉを感染させたＬｏＶ
ｏ細胞からの製造
ｏ細胞からの製造
【００４２】
ヒト大腸癌由来株化細胞であるＬｏＶｏ細
胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２９にＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ
ＩＦＯ １４４７６を実験１の方法に準じて感染させた
後、ＬｏＶｏ細胞を公知の方法で培養用フラスコ内で増
殖させた。培養後実験２の方法に準じて細胞を可溶化し
た後瀘過し、得られた瀘液を、癌転移促進活性を有する
蛋白質を認識するモノクローナル抗体を固定化したゲル
を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、癌
転移促進活性を有する蛋白質を得た。その収量は、培養
液３０Ｌ当たり約２ｍｇであった。本品は、実験２記載
のマイコプラズマ感染ＲＰＭＩ ４７８８細胞より調製
した癌転移促進活性を有する新規蛋白質と同一の理化学
的性質を有していた。
胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２９にＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉ
ＩＦＯ １４４７６を実験１の方法に準じて感染させた
後、ＬｏＶｏ細胞を公知の方法で培養用フラスコ内で増
殖させた。培養後実験２の方法に準じて細胞を可溶化し
た後瀘過し、得られた瀘液を、癌転移促進活性を有する
蛋白質を認識するモノクローナル抗体を固定化したゲル
を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、癌
転移促進活性を有する蛋白質を得た。その収量は、培養
液３０Ｌ当たり約２ｍｇであった。本品は、実験２記載
のマイコプラズマ感染ＲＰＭＩ ４７８８細胞より調製
した癌転移促進活性を有する新規蛋白質と同一の理化学
的性質を有していた。
【００４３】
【実施例３】癌転移促進活性を有する蛋白質に対する抗
体の調製
体の調製
【００４４】
実験２の方法により調製した癌転移促進活
性を有する蛋白質０．１ｍｇをマウスの腹腔内に２週間
間隔で４回注射して免疫した。次いで、このマウスから
脾臓を摘出し細切分散し、得られた脾臓細胞とマウス骨
髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（大日本製薬、大阪）と
を、実験１記載の方法と同様に融合させた後、得られた
融合細胞から、免疫源として用いた癌転移促進活性を有
する蛋白質と特異的に反応し、その活性を抑制する抗体
を産生する融合細胞を選択した。本融合細胞は、培養液
１ｍｌ当たり１０μｇの癌転移促進活性を有する蛋白質
と特異的に反応する抗体を産生していた。また本融合細
胞の産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｉ
ｇＧ２ａであった。
性を有する蛋白質０．１ｍｇをマウスの腹腔内に２週間
間隔で４回注射して免疫した。次いで、このマウスから
脾臓を摘出し細切分散し、得られた脾臓細胞とマウス骨
髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（大日本製薬、大阪）と
を、実験１記載の方法と同様に融合させた後、得られた
融合細胞から、免疫源として用いた癌転移促進活性を有
する蛋白質と特異的に反応し、その活性を抑制する抗体
を産生する融合細胞を選択した。本融合細胞は、培養液
１ｍｌ当たり１０μｇの癌転移促進活性を有する蛋白質
と特異的に反応する抗体を産生していた。また本融合細
胞の産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｉ
ｇＧ２ａであった。
【００４５】
本モノクローナル抗体は、癌転移促進活性
を有する蛋白質を精製する際に使用する、モノクローナ
ル抗体固定化ゲル調製用の抗体として使用できる。また
本モノクローナル抗体は、癌転移診断剤並びに癌転移抑
制剤として有利に利用できる。本モノクローナル抗体の
癌転移診断剤への利用例としては、例えば、癌転移が懸
念される癌患者の血液、尿、汗、血清、血漿、浸出液、
または腹水を採取し、その中に含まれている癌転移促進
物質の有無、あるいはその量を、例えば、本モノクロー
ナルの抗体を用いる抗原抗体反応、放射免疫検定（ＲＩ
Ａ）、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）などの免疫
学的な方法により測定し、その癌患者に癌転移の危険性
があるか否かを診断することができる。また、癌患者に
本願発明の抗体を投与し、癌患者体内に存在する癌転移
促進物質を特異的に中和することにより、癌転移を抑制
することができる。
を有する蛋白質を精製する際に使用する、モノクローナ
ル抗体固定化ゲル調製用の抗体として使用できる。また
本モノクローナル抗体は、癌転移診断剤並びに癌転移抑
制剤として有利に利用できる。本モノクローナル抗体の
癌転移診断剤への利用例としては、例えば、癌転移が懸
念される癌患者の血液、尿、汗、血清、血漿、浸出液、
または腹水を採取し、その中に含まれている癌転移促進
物質の有無、あるいはその量を、例えば、本モノクロー
ナルの抗体を用いる抗原抗体反応、放射免疫検定（ＲＩ
Ａ）、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）などの免疫
学的な方法により測定し、その癌患者に癌転移の危険性
があるか否かを診断することができる。また、癌患者に
本願発明の抗体を投与し、癌患者体内に存在する癌転移
促進物質を特異的に中和することにより、癌転移を抑制
することができる。
【００４６】
【発明の効果】本発明の新規蛋白質は癌転移を促進させ
る活性を有する。前述のように癌転移は複雑な過程を経
て成立すると考えられており、本発明の新規蛋白質は癌
転移研究の上で大きな利用価値を有するものといえる。
また、本発明の新規蛋白質、あるいはその部分アミノ酸
構造を認識する抗体は、癌転移診断剤並びに癌転移抑制
剤として有利に利用できる。
る活性を有する。前述のように癌転移は複雑な過程を経
て成立すると考えられており、本発明の新規蛋白質は癌
転移研究の上で大きな利用価値を有するものといえる。
また、本発明の新規蛋白質、あるいはその部分アミノ酸
構造を認識する抗体は、癌転移診断剤並びに癌転移抑制
剤として有利に利用できる。
フロントページの続き
(56)参考文献 欧州特許出願公開308265（ＥＰ，Ａ
１)
ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｖｏｌ.
７，Ｎｏ．12（1988），ｐ．3963−3970
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．95，Ｎｏ．３
（1990），ｐ．499−506
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/30
C12P 21/00 - 21/08
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 理化学的性質が、 （１）分子量 ４５，０００±５，０００ （２）等電点 ｐＩ＝６．０±１．０ （３）部分アミノ酸配列 Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙおよび Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓを有する （４）紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収を示す （５）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸緩衝液に可溶 （６）癌転移促進活性 ヒト大腸癌由来の培養株化細胞であるＲＰＭＩ ４７８
８細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を促進させる
活性を有する （７）癌転移促進活性の安定性 水溶液（ｐＨ７．２）で１００℃、１０分間の条件によ
り失活する 水溶液（ｐＨ７．２）で４℃、一ヶ月の条件で安定 であるマイコプラズマ属アルギニーニ由来の蛋白質。 - 【請求項２】 請求項１記載の蛋白質を認識する抗体。
- 【請求項３】 マイコプラズマ属アルギニーニを培養す
るか、マイコプラズマ属アルギニーニを感染させた培養
株化細胞を培養し、その培養物から下記の理化学的性質
を有する蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製
造方法； （１）分子量 ４５，０００±５，０００ （２）等電点 ｐＩ＝６．０±１．０ （３）部分アミノ酸配列 Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙおよび Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓを有する （４）紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収を示す （５）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸緩衝液に可溶 （６）癌転移促進活性 ヒト大腸癌由来の培養株化細胞であるＲＰＭＩ ４７８
８細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を促進させる
活性を有する （７）癌転移促進活性の安定性 水溶液（ｐＨ７．２）で１００℃、１０分間の条件によ
り失活する 水溶液（ｐＨ７．２）で４℃、一ヶ月の条件で安定。 - 【請求項４】 請求項２記載の抗体を用いる工程を含む
ことを特徴とする請求項３記載の蛋白質の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16665992A JP3385408B2 (ja) | 1992-05-14 | 1992-05-14 | 新規蛋白質とその抗体、並びにその新規蛋白質の製造方法 |
| TW082103726A TW240233B (ja) | 1992-05-14 | 1993-05-12 | |
| KR1019930008219A KR940005672A (ko) | 1992-05-14 | 1993-05-13 | 신규 단백질과 그 항체 및 신규 단백질의 제조방법 |
| EP19930303758 EP0578356A3 (en) | 1992-05-14 | 1993-05-14 | Mycoplasma protein promoting metastases and antibodies directed against it. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16665992A JP3385408B2 (ja) | 1992-05-14 | 1992-05-14 | 新規蛋白質とその抗体、並びにその新規蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05310798A JPH05310798A (ja) | 1993-11-22 |
| JP3385408B2 true JP3385408B2 (ja) | 2003-03-10 |
Family
ID=15835362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16665992A Expired - Fee Related JP3385408B2 (ja) | 1992-05-14 | 1992-05-14 | 新規蛋白質とその抗体、並びにその新規蛋白質の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0578356A3 (ja) |
| JP (1) | JP3385408B2 (ja) |
| KR (1) | KR940005672A (ja) |
| TW (1) | TW240233B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6294171B2 (en) * | 1999-09-14 | 2001-09-25 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies |
| JP2007282630A (ja) * | 2006-03-22 | 2007-11-01 | Glycomedics Inc | オリゴ糖鎖合成方法 |
| CN101119630B (zh) * | 2006-07-31 | 2010-08-25 | 日立电线株式会社 | 电磁波屏蔽过滤器 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3854160D1 (de) * | 1987-09-16 | 1995-08-17 | Int Genetic Eng | Mit regressionsassoziierten antigenen in zusammenhangstehende methoden und verbindungen. |
-
1992
- 1992-05-14 JP JP16665992A patent/JP3385408B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-05-12 TW TW082103726A patent/TW240233B/zh active
- 1993-05-13 KR KR1019930008219A patent/KR940005672A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-05-14 EP EP19930303758 patent/EP0578356A3/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１２（１９８８），ｐ．３９６３−３９７０ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．３（１９９０），ｐ．４９９−５０６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0578356A2 (en) | 1994-01-12 |
| TW240233B (ja) | 1995-02-11 |
| JPH05310798A (ja) | 1993-11-22 |
| KR940005672A (ko) | 1994-03-22 |
| EP0578356A3 (en) | 1994-11-23 |
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