KR100206061B1 - 엠씨에이 28에이 32에 의해 인식되는 항원,씨티에이에이28에이32 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 모노클로날 항체 28A32에 의해 인식되는 에피토프, 본 발명인이 동정, 분리 및 특성을 구명한 상기 에피토프를 포함하는 사람 종양항원, 및 사람 MCA 28A32에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암치료를 모니터하고 진단하기 위한 상기 에피토크를 포함하는 항원에 의해 유발되는 항체를 사용하는 방법 및 상기 에피토프를 포함하는 종양세포에 대해 수득되는 것과 유사한 면역반응을 유도하기 위한 백신의 제조에 상기 항원을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
엠씨에이 28에이 32(MCA 28A32)에 의해 인식되는 항원, 씨티에이에이 28에이 32(CTAA 28A32)
[발명의 배경]
결장직장암은 미국내 남녀 모두에게 두번째로 우세한 암이다. 최근까지, 이질환의 유일한 치료방법은 외과수술이었고 이것은 종양의 경벽 확장 및 국소적으로 림프절로의 전이 단계인 환자들에게는 좋지 않은 예후(豫後)를 나타낸다. 최근 보고된 무작위적인 단계 Ⅱ-활성 특이적 면역 요법의 시도는 급격히 개선된 예후를 나타냈고, 타이스 비씨쥐(Tice Bacillus Calmette Guerin; 이후에는 Tice BCG라 명명됨)(결핵연구소, 일리노이즈, 시카고)와 혼합된 자가 유래의 종양세포를 사용한 환자들의 면역법이 피부 과민성 응답 반응을 크게 지연시키고, 4년 이상 동안 재발 및 사망률을 크게 감소시킨다는 것을 보여주었다(3).
결장 암-관련 항원들의 동정을 기술하는 많은 문헌들이 있다(4-9). 이들 항원 대부분은 마우스를 결장종양의 임의의 형태(추출물, 분리세포, 막제조물 등)또는 결장종양 세포주들로 면역화하므로써 생성되는 모노클로날 항체를 사용하여 동정된 것이다. 이러한 마우스 항체들은 상기 마우스내에서 항원성인 일련의 항원들을 동정한다. 상기 연구외에도, 종양물질에 특이적인 반응성을 나타내는 사람의 모노클로날 항체들에 대해 여러가지가 보고되어 있다.
면역 요법 프로토콜중에 자가유래의 종양세포와 BCG 로 능동 면역화된 결장직장 환자들로부터 말초 혈액 B-세포를 사용하여, 본 발명자들은 사람 항-종양 모노클로날 항체를 제조하는 전략을 성공적으로 개발했다(11). CEA와 같은, 건강한 개체들 중에서도 발견되는 조직 성분을 종종 인식하는 사람의 결장암에 대하여 생성되는 마우스 모노클로날 항체와는 달리, 본원의 사람 모노클로날 항체는 CEA, 혈액형 결정인자 또는 조직적합성 항원과 어떤 반응성도 나타내지 않았고, 이것은 상기 항체들이 자가유래의 숙주내에서 면역원성으로서 인식외는 에피토프들에 한정된 특이성을 특징으로 함을 나타낸다.
본 발명자들은 종양 항원들을 동정하기 위한 프로브로서 상기 사람의 모노클로날 항체를 사용했다. 본 발명자들은 결장 종양, 결장종양 세포주의 추출물 및 털이 없는 마우스내에서 생성되는 사람의 종양 이종조직 이식편내 에서 특정항원을 동정했다. 그 목적 항원은 모든 결장직장 종양의 약 70% 내에서 검출되는 사람의 모노클로날 항체(엠씨에이) 28A32(이후에는 MCA 28A32로 명명됨)에 의해 인식되는 에피토프를 함유함을 특징으로 한다.
[발명의 개요]
본 발명은 사람의 모노클로날 항체 28A32 에 의해 인식되는 에피토프 및 이 에피토프를 함유하는 씨티에이에이 28A32(이후에는 CTAA 28A32로 명명됨)로 표기되는 사람 종양 항원을 포함하고, 본 발명자들은 이를 동정, 분리하고 특성을 규정하였다. 사람의 모노클로날 항체 28A32를 생산하는 세포주는 ATCC 수탁번호 HB9380 으로서 1987. 4. 15 일자로 출원된 공계류중인 출원 USSN 07/038,811에 청구되어 있다. 본 발명은 또한 암을 진단하고 치료를 모니터하기 위한 상기 에피토프 함유 항원에 대한 항체들의 사용법 및 상기 에피토프를 함유하는 종양 세포에 대하여 수득되는 것과 유사한 면역반응을 유도하기 위해 백신의 제조 과정중에 상기 항원을 사용하는 방법에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 CTAA 28A32의 겔 여과 크로마토그래피를 설명한다.
제2도는 상기 항원을 겔 여과 크로마토그래피한후 50K 및 46K 분획, 즉 수집물 2 및 3의 음이온 교환 크로마토그래피를 나타낸 것이다.
제3도는 제1도의 수집물 4로부터 36K 및 32K 항원을 양이온 교환 크로마토그래피한 것을 나타낸 것이다.
제4도는 부틸 프락토겔 컬럼으로부터 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 46K 및 50K 단백질을 정제한 것을 나타낸 것이다. 상기 항원의 순도는 제5도와 제6도에 각각 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 HPLC 에 의해 증명된다. 제7도는 항원 각각의 단백질 서열 데이타를 제시한 것이다.
[바람직한 구체예의 태양]
본 발명자들은 조사한 결장종양들의 약 70% 내에서 사람의 MCA 28A32로 인식되는 에피토프를 함유하는 항원을 발견했다(11). 또한 결장 암 세포주 HT-29, SW1463, SW948, SW403(각각의 ATCC 수탁번호 HB38, CCL234, CCL237, CCL230), LS174, LoVo(ATCC 수탁번호 CCL229) 및 WiDr(ATCC, Rockville, MD)이 동일 항원을 함유함을 발견했다. 부합하는 정상 결장 조직과 사람의 MCA 20A32 는 반응성이 낮기 때문에, 상기 항원은 결장 종양 세포내에서 우선적으로 발현된다는 것을 입증한다.
상기 항원의 정제는 염 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 수득된다. CTAA 28A32의 각각 정제된 성분은 환원 조건하의 변성 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단일 단백질로서 이동했다.
겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, 항원의 특징을 나타내는 천연 단백질의 분자량은 SDS-PAGE로 수득한 것과 동일하다. 이들은 MCA 28A32로 인지되는 4가지 항원 단백질로서 약 50K, 46K, 36K 및 32K 이다.
세포 성분들의 미정제 분획화에 의하여 36K 단백질은 막과 결합되어 있고 50K, 46K 및 32K 단백질은 세포의 세포질내에서 발견될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
부분적인 단백질 서열의 정보를 CTAA 28A32 의 모든 단백질에 대해 수득했다. NBRF 프로테인 데이타 베이스의 컴퓨터 조사를 기초로 할 때, 50K, 36K 및 32K 단백질에 대해서 어떤 상동성도 나타나지 않았다. 46K 단백질은 인간의 α-에놀라제와 강한 상동성을 나타내나 약간의 아미노산 서열이 다르고, 이것은 상기 효소의 변형된 형태를 나타낼 수 있는 유일한 단백질이라는 것을 나타낸다.
본 발명인들은 28A32 사람 모노클로날 항체와의 반응성에 의해 상기 종양 관련 항원을 분리했다. 클로닝된 T-세포를 자극하는 작용 뿐만 아니라, 다양한 결장암내 상기 항원의 존재에 의거하여, 상기 항원은 진단용 및 백신 개발 용으로서 중요하다. CTAA 28A32 는 사람의 MCA 28A32 와의 면역반응성, 분자량 특성 및 부분적인 단백질 서열 정보에 의해 규정짓고 명백히 동정한다.
[사람의 MCA 28A32 에 의해 인식되는 CTAA28A32 의 추출 및 정제]
MCA 28A32 항체의 반응성은 7 가지 사람의 결장 종양 세포주, 8 가지 초기 결장 종양으로부터 효소적으로 분리된 세포들 및 4가지 결장 종양 이종조직 이식편으로 부터 효소적으로 분리된 종양세포들로 평가했고, 상기 세포들은 모두 공기-건조된 시토스핀(cytospin)제법으로 제조한 것이다. 7가지 결장 종양 세포주에 있어서, 사람의 IgM 모노클로날 항체 28A32 는 슬라이드당 300 ng 의 농도로 사용되었다. 상기 항체는 결장 종양 이종조직 이식편 제조물 뿐만 아니라 8 가지 초기 종양 세포 제조물상에서도 시험했다. 3명의 환자들로부터 포르말린-고정, 파라핀-매립된 결장 종양 조직 및 상응하는 정상 결장을 또한 상기 간접 방법을 사용하여 시험했다.
[세포주]
사람의 결장 선암 세포주 HT-29, SW-1463, SW-948, SW-403, LS-174, LoVo 및 WiDr 는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)로 부터 수득하였다. 상기 세포들은 10% 태내 송아지 혈청(FBS)으로 보강된 추천 배양 배지내에서 배양했다. 모든 세포들은 37℃ 및 5% CO2대기에서 배양했다.
[모노클로날 항체]
사람의 모노클로날 항체 MCA 28A32를 생산하는 헤테로하이브리도마 세포주를 FBS로 보강된 RPMI1640 의 존재하에 공동섬유 카트리지 내에서 증식시켰다. 사람 면역글로블린-M(IgM) 항체가 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제되었다.
[MCA 28A32 와의 간접 면역조직화학법]
MCA 28A32와 대조용 사람 IgM의 비오틴 표지화를 120 : 1의 비오틴 : 항체의 초기 몰당 비율로 디메틸포름아미드내에 용해된 비오틴-N-히드록시 숙신이 미드 (Calbiochem)를 포함한 생리 완충액내에서 실시했다. 실온에서 15분 후, 상기 반응혼합물을 PBS에 대하여 투석하여 유리 비오틴을 제거한다. 비오틴화된 항체를 포르말린-고정된 파라핀 매립된 결장종양 및 수술시 절제된 결장의 가장자리로부터 취한 무관한 정상 결장과 반응시킨다. ABC 퍼옥시다제 방법 (Vector Laboratories)을 반응서의 가시화에 이용했다. 상기 항체를 항체 40㎍/ml 이하의 다양한 농도로 적정했다.
비오틴화된 항체의 반응성을 또한 다른 정상 조직에 대하여 조사했다. 전흉부, 식도, 복부, 담낭, 신장 및 허파로부터 정상조직의 포르말린-고정된 파라핀 매립된 절단 단편을 사용하여 상기 항체의 특이성을 확인했다.
모든 7가지 결장 종양 세포주는 간접적인 퍼옥시다제 방법을 사용했을 때 28A32 와 반응적이었다. 상기 항체는 또한 4 가지 모든 이종조직 이식편 제조물뿐만 아니라 8가지중 7가지 초기 결장 종양과도 또한 반응적이었다. 이 데이타를 표1에 요약했다.
비오틴으로 직접 표지된 MCA 28A32 를 포르말린-고정, 파라핀 매립된 결장 종양 및 자가유래의 무관련 결장 7 쌍과 반응시켰다. 이런 다양한 조직 절단단편들로부터 수득된 결과들을 표 2에 나타낼 수 있다. 사용된 항체의 가장 높은 농도(40㎍/ml)와 보다 낮은 농도에서 정상 경장에 대해 종양조직에서 우수한 특이성을 나타냈다.
비오틴화된 항체 MCA 28A32 는 또한 다양한 포르마린-고정, 파라핀 매립된 정상 조직상에서 시험 되었다. 2명이 개체로부터의 과립백혈구, 연성 조직, 및 정상 전흉부조직의 모든 부위들은 음성이었다. 정상식도에 있어서도, 한 개체는 시험된 가장 높은 항체 농도(80㎍/ml)에서 정상 상피 조직에 대해 중간 내지 강한 염색을 나타냈고, 보다 낮은 농도에서는 감소된 염색정도를 나타냈다. 두번째 환자에 있어서, 식도는 40㎍/ml 항체 농도에서 염색되지 않았고 80㎍/ml의 보다 높은 항체농도에서 약한 염색정도를 관찰할 수 있었다. 정상 복부 조직에 있어서 2명의 환자는 염색을 전혀 나타내지 않았다. 담낭에 있어서는, 상피에 약한 염색정도를 나타냈다. 신장에 있어서, 집합세관의 상피는 상기 항체와 반응하나 사구체와는 어떤 반응성도 나타내지 않았다. 간장에 있어서, 세관 및 관의 상피는 약한 염색성을 나타냈으나, 실질(實質)은 어떤 염색성도 나타내지 않았다. 허파에 있어서, 페포나 기관지 상피는 어떤 염색성도 나타내지 않았다. 상기 데이타를 표3 에 요약한다.
[항원 추출]
HT-29 또는 WiDr 세포를 1.0 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리하여 수거한다. 상기 세포들을 침전시킨 후 세포 세정액인 상청액을 상기 세포와는 별도로 모아둔다. CTAA 28A32 의 50K 및 46K단백질에 있어서, 세포 세정액은 세포자체내에 존재하는 양만큼의 항원을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 세포 세정물에는 상기 항원들 이외의 불순물이 본래세포의 추출물보다 더 적기 때문에 상기 2가지 단백질을 분리하는데 우수한 재료로서 제공될 수 있다. CTAA 28A32의 36K 및 32K 단백질은 동결세포를 50mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5.0mM EDTA, 1.0mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 및 0.5% Nonidet P-40을 포함하는 용균 완충액으로 처리함으로써 생성되는 추출물로 부터 수득되었다.
상기 세포를 4℃ 에서 60분 동안 교반한 다음 100,000 × g 에서 30분 동안 초원심 분리하여 청징화 했다. 세포세정물도 또한 상기 절차에 의해 청징화 되었다.
[CTAA 28A32 의 염침전]
추출 세포나 세포세정물로부터 청징화된 상청액 4℃에 보관하고 고체 황산 암모늄을 첨가하여 30% 포화시켰다. 상기 혼합물은 4℃에서 적어도 60분 동안 교반한 다음 40,000 × g 에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 분리하여 고체 황산 암모늄을 첨가함으로써 80% 이하의 포화도로 포화시킨 후, 4℃에서 적어도 60분 동안 교반한 다음, 40,000 × g 에서 30분 동안 다시 원심분리 시킨다. 50K 및 46K 단백질을 함유하는 세포 세정물로부터의 황산암모늄 펠렛은 소량의 PBS 에 용해하고, 36K 및 32K 단백질을 함유하는 용균된 세포로부터의 펠렛은 소량의 50mM Tris(pH 8.0)에 용해시켰다.
[겔 여과 크로마토그래피]
1.5ml/분의 유속의 PBS로 예비-평형화된 세파크릴 S-200(5.0×90cm)컬럼상에서 CTAA 28A32 단백질을 크로마토그래피한다. 추출물은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 분석하고 적당한 피크를 모아 추가의 단계에서 사용한다.
[CTAA 28A32의 정제]
CTAA 28A32의 50K 및 46K 단백질은 세포 세정액내에 많은 반면, 36K와 32K 단백질은 세포용균물내에 많고, 상기 재료 모두 정제 항원의 생성에 사용된다. 2가지 항원 제조물을 황산 암모늄 침전 후 겔여과로 크로마토그래피했을 때, 동일한 크로마토그래피 패턴을 나타냈다. 제1도에 도시한 바와 같이, 크로마토그래피 후 여러개의 피크를 수득한다. 50K 및 46K 단백질에 있어서, 수집물 2 와 3을 합하여 추가의 단계에 사용했다. 제1도에 기술하는 바와 같이, 세파크릴 S-200컬럼상에서 분자크기에 따른 우수한 분리능이 수득되었고 항원의 정제 우수성도 이단계에 의해 취득될 수 있다.
[이온 교환 크로마토그래피]
세파크릴 S-200 컬럼으로부터 50K 및 46K 단백질을 포함하는 수집물을 20mM Tris/HCL(pH 7.4)를 함유하는 완충액에 대해 투석했다. 이 수집물을 상기 동일한 완충액으로 예비 평형화된 모노 Q 컬럼(Pharmacia, Inc.)상에 부하한다. 제2도에 나타낸 바와 같이, 사용된 조건하에서 상기 컬럼의 물질을 통한 흐름은 50K 와 46K 단백질을 포함했다. 대다수의 단백질은 상기 컬럼에 결합되어 직선형염 구배로 용출되었다.
S-200 컬럼의 수집물 4(세포추출물로부터 유래됨)를 50mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5)에 대하여 투석하고 동일 완충액으로 예비 평형화한 S-세파로오즈 양이온 교환 컬럼(Pharmacia, Inc.)위에 부하한다. 0.05M 단계별 증가치로써 아세테이트 완충액의 염화나트륨 농도를 증가시키면서 상기 컬럼을 용출시킨다. 제3도에 나타낸 바와 같이, 수집물 3은 36K 단백질을 포함하고, 수집물 5는 CTAA 28A32의 32K 단백질을 포함하여 이는 SDS-PAGE 와 웨스턴 블롯 분석으로 결정된 것이다.
[소수성 크로마토그래피]
46K 단백질로부터 50K 단백질을 분리하기 위해, 수집물을 음이온 교환 컬럼을 통해 통과시킨 유체를 30% 황산 암모늄 농도로 조정하고 그 다음 30% 황산 암모늄을 함유하는 20mM Tris(pH 7.0)로 예비 평형화된 부틸 프락토겔(Toyohaus)의 소수성 컬럼에 적용한다. 상기 컬럼위에 단계별 용출을 3% 증가치로 황산암모늄 농도를 감소시키면서 실시하여, 상기 Tris 완충액내 황산 암모늄의 농도를 21%로 감소시킨다. 그 다음 상기 컬럼을 20mM Tris/HCl (pH 7.4)로 세정한다. 이 컬럼의 유속은 1.0 ml/분이다. 이 용출과정으로 수득된 프로파일을 제4도에 나타낸다. 46K 단백질은 27% 황산 암모늄 농도에서 용출되고, 50K 단백질은 24% 황산 암모늄 농도에서 용출된다. 상기 최종 단계 후에 상기 항원은 둘다 거의 균질했다. 상기 컬럼으로부터의 각 수집물을 0.1 M 아세트산 암모늄 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석한 다음 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 분석한다. CTAA 28A32 의 36K 및 32K 단백질은 음이온 교환 컬럼 후에 거의 균질했고 추가의 정제 단계를 필요로 하지 않았다.
[순도의 기준]
CTAA 28A32 의 분리 단백질의 순도를 평가하기 위해, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 각 단백질에 대해 실시한다. 제5도에 나타낸바와 같이 상기 판단 기준에 의해 상기 단백질들은 거의 균질한 것으로 보여진다.
천연의 비-변성된 단백질의 순도를 크리 분리 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 평가한다. 제6도에 설명한 바와 같이, 모든 단백질은 이 방법을 사용할때 95% 이상의 순도를 나타낸다.
[아미노산 분석]
아미노산 분석은 워터스 피코-태그(Waters Pico-Tag) 방법을 사용함으로써 실시한다. 이 방법은 진공하에서 단백질을 가수분해한 다음 얻어지는 아미노산을 페닐이소티오시아네이트를 사용하여 유도체화하는 것을 포함한다. 다음 유도체화된 아미노산을 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리 및 정량한다.
각 정제된 단백질을 가수분해한 뒤 페닐이소티오시아네이트로 유도체화하고 역상 HPLC 로 분리한다. 이 분석 결과를 표 4에 기술한다. 그 값은 단백질 몰당 각 아미노산의 잔기수로서 표현된다. 각 값은 적어도 4회 분리 결정치의 평균값은 나타낸다. 이 표에 나타낸 바와 같이 각 단백질들은 아미노산 조성이 서로 다르다.
[단백질 서열 분석]
에드만 분해 방법에 의거하여 자동 기체상 단백질 서열 결정기(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 단백질의 N-말단 부위로부터 서열을 결정한다. N-말단 아미노산이 차단되고, 이로써 이 위치에서 단백질의 서열결정이 저해된 단백질들에 있어서는 단백질의 절단과 펩티드의 분리가 실시된다. 표준 방법은 시아노겐 브로마이드나 단백질 분해효소를 사용하여 절단한 다음 생성된 펩티드를 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 것이다. 이 방법으로 분리된 개개의 펩티드를 상술한 바와 같이 N-말단 단백질 서열 결정을 한다.
각 단백질의 서열 데이타를 수득하기 위한 초기 시도는 차단되어 있지 않은 36K 단백질을 제외하고는 성공을 거두지 못하였다. 50K, 46K 및 32K 단백질의 N-말단 아미노산은 차단되어 있고 그러므로 이 위치에서 서열을 결정할 수 없었다. 차단된 단백질에 대한 단백질 서열 정보를 수득하기 위하여 각 정제 단백지을 단편화하고 그 단편들을 분석하므로써 단백질 서열 정보를 수득하기로 하였다.
50K 와 46K 단백질을 시아노겐 브로마이드 절단으로 단편화하였고, 이것은 상기 단백질내에 메티오닌 잔기의 카르복시 말단 부위에 절단 특이성을 가지고 있다. 32K 단백질은 상기 단백질내에 리신 잔기들의 카르복시 말단 절단에 특이성을 가진 Lys C로 효소분해시켜 단편화한다. 단백질 절단으로부터 수득되는 펩티드들을 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분리한다. 동일한 절단방법을 사용하여 상기 항원들 각각을 비교하는 펩티드 지도는 각 단백질에 대해 여러 펩티드 지도를 나타냈다. 가장 우세하고 재현가능하게 분리할 수 있는 단편인 것으로 나타나는 각 단백질의 절단으로 수득되는 단편을 사용하여 특정 단백질에 대한 단백질 서열 정보를 수득했다.
제7도는 기술된 데이타는 CTAA 28A32 의 50K, 46K, 36K 및 32K 단백질의 단백절 서열 정보는 나타낸 것이다. 이 서열들을 기존의 단백질 데이타베이스에 대하여 체크했을 때, 사람 α-에놀라아제와 상동성을 가진 46K 단백질을 제외하고는 공지된 어떤 단백질과도 현저한 상동성을 갖지 않았다. 이 상동성은 약 75% 내지 80% 였고 이것은 상기 단백질이 종양 세포내에서 생성되는 α-에놀라아제의 변형임을 나타낸다. 그외 다른 단백질들도 단백질 데이타베이스내에 등록된 임의의 다른 서열들과 현저한 상동성을 갖지 않았다.
[사람 T-세포클론의 CTAA 28A32 생성 및 분석에 대한 사람 T-세포 반응성]
사람의 T-세포크론을 5명의 개체들로부터 사람 결장암의 종양침투성 임파세포로부터 분리하고 분리된 CTAA 28A32 정제 단백질에 대한 아세포 발샐 반응을 시험했다. 10 유니트 인터류킨-2(IL-2)/ml, 20% 사람 AB 혈청, L-글루타민, 피루브산 나트륨, 비-필수 아미노산, HEPES 완충액, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및 평기존으로 보강된 RPMI-1640 기본 배지에 촉진제 로서 104자가 유래의 X선 조사된 종양세포를 포함하는 96 웰 평판내에 콜라게나아제 분리된 사람 결장 종양 세포를 한계 희석하여 도말함으로써 클로닝한다. T-세포 클론을 동일 배지내에서 증식시키고 자가유래의 종양으로 매 7 내지 14일 마다 자극시켜 그들의 항-종양 반응성 및 특이성을 유지시킨다.
T-세포 아군 분석을 CD4(T-헬퍼)와 CD8(T세포 독성) 세포 표면 표지 인자에 대해 플로오레세인 결합된 뮤린 모노클로날 항체로 표지된 세포의 유동 세포분석법(flow cytometric analysis)으로 실시한다. CD4 양성 T- 세포클론들의 아세포형성 반응을 미량역가 측정법을 사용하여 결정하며 여기에서 클로닝된 105T-세포는 IL-2/ml 1유니트 첨가된 상기 증식배지내의 5 × 105자가 유래의 엡스타인 바르 바이러스 형질전환된 B 세포(항원 발현을 위해), 니트로셀룰로오즈 위에 고정된 시험 항원이나 대조용 항원 10㎍/ml 와 함께 96-웰 미량역가 평판의 각 웰에서 37℃에서 6일 동안 배양한다. 세포에 18시간 동안 1.0μCi [3H]-메틸 티미딘을 펄스 적용시킥 섬유 유리 필터위에 수거한 뒤 신틸레이샨 계수기로 계수하여 결합된 [3H]의 양을 항원에 의한 특이적인 자극에 대한 반응인 세포 증식의 척도로써 결정한다. 자극 지수(SI)는 시험 항원으로 처리된 세포의 분당 계수치(CPM)를 대조용 항원으로 처리된 세포의 CPM 으로 나눔으로써 계산한다. 2.0 이상의 SI 는 중요한 것으로 간주된다.
분리된 대부분의 클론들은 T-헬퍼(CD4) 표현형을 나타낸다. CTAA 28A32 단백질에 대한 반응성을 평가할 때, 2명의 환자(WOR 과 KEH)로부터의 클론들은 46K 단백질에 반응했다(표 5). WOR 로부터의 2 가지 클론, #15 와 #16, 및 KEH 로부터의 한 클론 #11 은 46K 단백질에 반응하여 증식했으나, CTAA 28A32의 다른 단백질과는 전혀 반응 하지 않았다. 상기 46K 단백질은 일반적인 T-세포 촉진제는 아니며, 다른 환자들로부터의 클론들은 반응하지 않았다(표 5 참고, ROBC63).
T-세포 면역성은 사람과 동물의 종양 퇴화에 중요 인자이기 때문에, 종양 관련 항원에 대한 종양 함유 환자들로부터의 T-세포 반응성은 사람 결장암의 백신으로서 상기 항원의 적합성을 나타내는 지표일 것이다. CTAA 28A32 의 50K, 36K 및 32K 단백질에 대해 음성 반응이 수득된다는 사실은 상기 단백질들이 백신으로서 적합하지 않음을 결정하기 위해 많은 수의 클론이 시험되어야만 할 것이므로 중요하지 않다. 46K 단백질의 반응성은 이 항원이 백신으로서 사용하기에 적합함을 나타내는 3가지 별도의 반응성 T-세포 클론을 동정하였으므로 중요한 것이다.
aWOR, KEH 및 ROB 환자로부터의 105세포/웰로 클로닝된 T-세포를 5×105X 선 조사된 자가유래의 EBV-형질 전환된 B-세포, 1U IL-2/ml 및 10 ㎍ 니트로셀룰로오즈 고정된 시험 항원/ml 과 6 일 동안 항온 배양하고 1 μCi[3H]-TdR 로 펄스 작용시킨 뒤, 수거, 계수한다.
bCPM 은 3 반복 측정치의 분당 평균 계수치이다; S.I 는 시험 항원의 존재하에서 세포의 C.P.M.을 대조용 니트로셀룰로오즈 존재하의 세포의 C.P.M. 으로 나눈 값으로 결정된 자극 지수이다.
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Claims (4)

  1. ATCC 수탁 번호 HB38, CCL234, CCL237, CCL230 및 CCL229 인 결장암 세포주 HT-29, SW1463, SW948, SW403, 및 LoVo, 그리고 미합중국, 펜실베니아, 필라델피아에 소재하는 위스타 연구소(Wistar Institute)로부터 입수 용이한 WiDr 가 공유하고 있는 종양 관련 항원상에서 발견되는, ATCC 수탁번호 HB9380 인 사람 모노클로날 항체 28A32 와 면역반응성인 본질적으로 정제된 사람 종양 세포 에피토프.
  2. SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동에 의해 측정된 분자량이 50K, 46K, 36K, 또는 32K 이며, 제1항의 사람 종양 세포 에피토프를 함유하는 본질적으로 정제된 사람 종양세포 항원, 및 사람 모노클로날 항체 28A32 와 면역 반응성인 그것의 단편.
  3. 제1항의 에피토프를 포함하는 면역원으로 동물을 면역시키고, 상기 에피토프에 대한 항체를 생산하는 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 무한 증식시키므로써 생성되는 항체.
  4. 결장 종양의 치료를 위한 백신의 제조에 제2항의 항원을 이용하는 방법.
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