JPH06205671A - 形質転換細胞の抽出および培養ならびにそれらに対する抗体の製造 - Google Patents

形質転換細胞の抽出および培養ならびにそれらに対する抗体の製造

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JPH06205671A
JPH06205671A JP5211352A JP21135293A JPH06205671A JP H06205671 A JPH06205671 A JP H06205671A JP 5211352 A JP5211352 A JP 5211352A JP 21135293 A JP21135293 A JP 21135293A JP H06205671 A JPH06205671 A JP H06205671A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 人間または動物の個体から得られた血流中を
循環する形質転換細胞を簡単かつ安全な手段によって抽
出し、さらには、かくして得られた細胞を培養して複製
させ、細胞表面に存在する抗原に対する単クローン性抗
体を製造し、それを診断および／または治療の目的に使
用しうるようにする。 【構成】 個体の血流中を循環する形質転換細胞を単
離、培養する方法であって、特定の状況のもとではなお
も白血球および／またはリンパ球を含み、かつ形質転換
細胞を多く含む細胞画分を抽出し、その形質転換細胞を
増殖させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、人間または動物の個体
の血流から形質転換細胞を抽出する方法、そのような方
法によって得られた細胞を培養する方法ならびにそれら
の細胞に対する単クローン性抗体の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】血流中を循環して転移を形成する形質転
換細胞の重大性に関しては、A. J. Salsburyが、「Sign
ificance of Circulating Cancer Cells」（William He
inemann Medical Books, New Aspects of Breast Canse
r, Vol. 3, pages 245 et seq., 1977）において、血流
中を循環するこれらの癌細胞は、例えば特定の外科手術
的治療手段によって放出されたのち５〜６時間までの期
間中には転移を形成することができないことを報告して
いる。多量の癌細胞が存在するだけでは転移の出現には
十分ではなく、癌細胞がまず導管域を離れなければなら
ないであろう。それにもかかわらず、一方では、転移形
成の出発点としてのトロンビンの形成を血流から妨げ、
他方では、形質転換細胞を殺す薬剤の使用が提案されて
いる。
【０００３】しかし、より最近の知識（P. M. Gullino,
Dev. Oncol., 49, 251-271 (1986)）は、循環する腫瘍
細胞は、たいていの場合、原発腫瘍を臨床的に証明する
ことができるよりもずっと前に血流中に出現することを
明らかにしている。形質転換細胞のすべてが転移を誘発
することができるわけではないにしても、循環する腫瘍
細胞の増殖、ひいては転移の成長を可能な限り早期に止
める必要がある。末梢の血液中の形質転換細胞の数と転
移形成の誘発との間に明確な相関関係が現在まで立証さ
れていない理由は、かなりの程度まで、血流中の形質転
換細胞を証明することが困難であることによる。
【０００４】さらに、充実性腫瘍を触診するなどの従来
の診断方法を使用するとき、特に、生検的治療および外
科手術的治療の場合に、形質転換腫瘍細胞の放出が明ら
かに増し、それが転移形成の増大を招くおそれがあるこ
とが公知である。
【０００５】リンパ系および／または循環系を介する転
移の形成における充実性腫瘍の挙動は、現在まで、手術
の際に開いた血管において生体内で研究されてきただけ
である。循環する腫瘍細胞は、診断または治療に利用し
うる量においては得られなかった。したがって、循環系
において転移を形成する際の充実性腫瘍の挙動は、動物
実験または病理学者による人体の検死解剖においてしか
研究することができなかった。
【０００６】形質転換細胞を血液から抽出する方法が数
多く知られている。例えば、非形質転換細胞の化学的ま
たは酵素的な溶菌、赤血球沈降の加速、浮上、遠心法お
よび磁気分離法などである。J. A. Fleming およびJ.
W. Stewart による概説、Journal of Clinical Patholo
gy, 20, 145-151（1967）ならびにJ. T. WestおよびR.
H. HumeによるProgress in Clinical Pathology, Vol.
3, Chap. 11, 362-382（1970）を参照すること。これら
公知の方法は普通、小さな収量にしか至らず、特に、末
梢循環系から得られた形質転換細胞が抽出された時点で
生きていたかどうかを判断することができないという欠
点を示す。それにもかかわらず、今日までこれらの方法
に頼ってきた。
【０００７】したがって、形質転換細胞は、例えばFico
ll（登録商標）ケイ素におけるリンパ球の単離に通常使
用されているような密度勾配遠心法、すなわちアルブミ
ン勾配によって抽出することができる。しかし、このた
めには多量の血液が必要であり、これが患者に対する大
きな負担となる。さらに、装置の高額な費用にもかかわ
らず、少数の形質転換細胞に基づく収量はきわめて低
く、さらに、これらの形質転換細胞は、従来の遠心法に
よって損傷を受けやすく、不純になりやすい。したがっ
て、密度勾配遠心法は、多量の形質転換細胞を抽出する
ための慣用法として使用することはできない。他の血液
成分、例えば血漿および赤血球を患者に再循環する方法
は、勾配物質によって生じる不純物のため、実施するこ
とはできない。遠心法は、患者に対する臨床的応用には
適していない。
【０００８】したがって、今日まで、おそらくは末梢循
環系中を循環している形質転換した転移細胞を非外科手
術的手段によって抽出して、それらを体外で培養し、さ
らなる調査および他の用途に使用することを可能にす
る、再現性があって簡便に実行しうる方法が存在しなか
った。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、人間または
動物の個体から得られた血流中を循環する形質転換細胞
を簡単かつ安全な手段によって抽出することができる方
法を利用しうるようにする目的に基づいている。
【００１０】これに関連して、そのような方法によって
得られた細胞を培養して複製させ、そのような細胞の表
面にある抗原に対する単クローン性抗体を製造し、それ
を診断および／または治療の目的に使用しうるようにす
ることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、この目的に適
した瀉血（apheretic)装置において全血を分離する場
合、特定の状況のもとでは白血球および／またはリンパ
球をも含む画分に生きた形質転換細胞が多く含まれると
いう認識に基づいている。
【００１２】このように、この目的は、血液を各成分に
分離するのに適した瀉血装置により、血液から、形質転
換細胞を多く含み、ある種の状況のもとでは白血球およ
び／またはリンパ球をも含む画分を回収し、形質転換細
胞を複製させるということにおいて、血流中を循環する
形質転換細胞を単離、培養する方法によって達成され
る。
【００１３】腫瘍抗原に対する個体特異的な抗体を製造
するためには、培養した形質転換細胞をＢリンパ球と接
触させて、形質転換細胞上の腫瘍抗原に対する抗体の製
造を刺激し、そのような抗体を不死化し、複製させ、刺
激を受けたＢリンパ球を選択し、不死化したＢリンパ球
培養物から抗体を単離し、そのような抗体を精製する。
このようにして得られた抗体は、多クローン性であって
もよいが、単クローン性であることが好ましい。
【００１４】原則的に、有機体は、それ自体が、その免
疫系により、いわゆる「薬」、すなわち抗体を製造する
ことができる。しかし、血流中を循環する形質転換細胞
の数、ひいては相当する抗原の数は、一般に、診断およ
び治療にとって重要である初期段階においては非常に少
なく、十分な免疫反応を誘発することはできない。他
方、本発明による方法は、多量の腫瘍特異的な抗原を形
質転換細胞の培養物の形態で提供し、それらを望むまま
に複製させることができる。
【００１５】血液をその成分に分離するためには、この
目的に適した装置、例えばいわゆる瀉血法（apherese p
rocess）に使用されるものを使用する。多量の全血を患
者から採取し、遠心法を使用して画分に分離する通常の
分離法とは対照的に、瀉血法においては、分離装置がラ
インによって直接患者の血流に接続されている。このよ
うに、この方法は原則的にはむしろ透析法に似ている。
このようにして、患者から採取した血液から望みの画分
のみを分離し、次いでただちに他の血液成分を患者に戻
すことが可能になる。したがって、瀉血法は、患者に負
担をかけることなく、所定の血液画分を多量に準連続的
に採取することを可能にする。したがって、血漿の瀉血
的捕集を「プラズマフェレシス（plasmapheresis）」と
呼び、白血球の捕集を「ルーカフェレシス（leukaphere
sis)」などと呼ぶ（米国特許第５，１１２，２９８号、
米国特許第５，１４７，２９０号）。
【００１６】現在まで、それ自体公知である瀉血法のみ
が、循環系の中をいずれの場合にも絶えず末梢まで循環
する白血球と、比較的多量に存在する他の血液成分とを
分離することに適したものであると考えられてきた。今
や、本発明者は、原発腫瘍から抽出された形質転換細胞
が特定の細胞画分の中にも多く含まれるということを思
いがけなく見いだした。
【００１７】血液成分の分離は、化学的密度勾配および
それに続く濃縮を行わずに血漿を赤血球および他の血液
成分から瀉血的にリンパ球分離することに通常使用され
るような、回転容器付き遠心機（例えば米国のHaemonet
ics 社から市販されているHaemonetics V50-1 、いわゆ
る「Latham-Bowl」）において実施することが有利であ
る。遠心機自体は約１００〜２００mlの血液の容量を有
している。
【００１８】これまで、このような遠心機は、例えば、
体外放射線法と組み合わされて、リンパ性白血病の患者
においてリンパ球集団を減少させる方法に使用されてき
た（欧州特許公開第０ ０３０ ３５８号公報）。この
目的には、血液を患者から採取し、その血液に、前もっ
て経口投与したか、抽出後の血液に投与した光反応性化
合物、例えばプソラレン誘導体の存在において、紫外線
の放射を加える。プソラレンが細胞のＤＮＡとの間でイ
ンタカレーションを起こし、光活性化されたのち、ＤＮ
Ａと反応することができ、それにより、腫瘍遺伝子を除
く。その後、放射を加えた血液を患者に再び戻す。
【００１９】本発明の方法は、濃縮された形質転換細胞
と、特定の状況のもとでなおも含まれる白血球および／
またはリンパ球とを中に有する画分のみを保護的に血液
から分離し、その一方で他の血液成分を患者に戻すこと
を可能にする。これは、単一過程において連続的に行う
ことが好ましい。このようにして、患者に対するストレ
スを可能な限り低く抑え、その一方で、十分な量の形質
転換癌細胞を短時間に単離し、そのような細胞をさらに
処理することが可能である。
【００２０】血液を供給する前に、薬学的に許容しうる
等張液に凝固抑制剤、例えばヘパリンを添加したものを
遠心機に充填することができる。通常は１，０００〜
２，０００単位がこの目的には十分である。遠心機の出
口に取り付けた適当なバイパス機構を介して形質転換細
胞を血流から分離するためには、任意の数の白血球を、
それらの中に混じった形質転換細胞とともに抽出する。
当業者であれば、白血球画分を難なく識別することがで
きる。
【００２１】赤血球から明らかに区別される白い帯が現
れると、遠心機のパイバスを開き、約４０mlの白血球を
容量１２０mlの遠心機のケースに取り出す。そして、赤
血球、血漿および他の血液成分を体に戻す。
【００２２】形質転換細胞を多く含み、特定の状況のも
とでは白血球および／またはリンパ球をも含む画分（以
下、簡潔に「細胞画分」と呼ぶ）を培養溶液に移す。形
質転換細胞を培養するためには、炭素および窒素源なら
びに他の必要な無機成分および有機成分、例えばビタミ
ン、アミノ酸および微量元素を含む各塩基性細胞培地を
使用することができる。市販の培地、例えばＲＰＭＩ１
６４０培地には、添加物、例えばウシ胎児血清を任意に
添加することが好ましい。培養条件は、製造元の情報に
したがって調節する。通常は、ＣＯ2 ５％、３７℃およ
び湿度９５％の標準条件を使用する。
【００２３】おそらくはまだ診断されても位置確認され
てもいないか、転移形成前の段階にある小さな原発腫瘍
の場合、きわめて少量の形質転換細胞が血液中を循環す
るだけである。マクロファージ抑制性ペプチドを細胞画
分に添加すると、はるかに過剰のリンパ球の中にある数
少ない形質転換細胞がマクロファージによって破壊され
ることを防ぐことができる。それに加え、Ｂ細胞および
Ｔ細胞に特異的な抗体（ＣＤ−８、ＣＤ−２５、インタ
ロイキンおよびインタフェロンに特異的な抗体）を添加
すると、リンパ球の生産を抑制し、これらを最後には死
滅させることができる。他の方法としては、公知の細胞
分類法により、白血球、リンパ球および他の異状のある
細胞を細胞画分から分離することができる。バッチをマ
イクロタイタ（microtiter）プレートのウェルに分散さ
せると、約４日後に、形質転換細胞のクローンがはっき
りと見えるようになる。形質転換細胞は、それらの形態
を基準にして、おそらくはなおも存在するリンパ球から
はっきりと区別することができ、原発腫瘍の細胞に非常
に似ている。約一週間後、その後の免疫感作に十分な数
の形質転換細胞が得られる。このようなクローンはま
た、後日の使用に備えて凍結保存することもできる。
【００２４】癌細胞は、改質された非病原性形態にある
免疫原として体に戻すことができる。このためには、例
えば、腫瘍抗原をなおも含む単離された膜画分を使用す
ることができる。このためには、別の外来性の有機体、
例えばハツカネズミ、ウサギもしくはヤギ、または抗原
を抽出したもとと同じ有機体を、これらの抗原によって
免疫感作する。従来の方法によって製造した多クローン
性または単クローン性の抗体を診断または治療に使用す
ることができる。
【００２５】本発明の好ましい実施態様によると、培養
した癌細胞を使用して、同じ有機体から単離したＢリン
パ球に刺激を加える。この目的には、いわゆる試験管内
免疫感作、すなわち、Ｂリンパ球を体外の適当な培地に
おいて形質転換細胞と接触させる方法を利用することが
有利である。このようにして刺激を加えたＢリンパ球か
ら、抗体を永久的に分泌することができるハイブリドー
マ細胞クローンを製造する。ハイブリドーマ技術とは別
に、エプスタイン−バールウイルスによってＢリンパ球
を不死化することも可能である。したがって、本発明
は、体そのものの免疫系を技術的に制御可能な方法でま
ねるものである。
【００２６】本発明の実施態様においては、培養して増
殖させた形質転換細胞を、所与の時点、好ましくは取り
出したのちできるだけ早く、すなわち約８〜４０日後
に、患者に内在するＢリンパ球と接触させる。Ｂリンパ
球の単離には約５０mlの血液しか必要とされないため、
Ｂリンパ球は、遠心法により、密度勾配、例えばFicoll
勾配において全血から単離することができる。しかし、
Ｂリンパ球の抽出は、本発明にしたがってリンパ球瀉血
として使用される分離装置を使用して実施することが有
利である。特に好ましくは、処理の両段階、すなわち癌
細胞の培養物の適用とＢリンパ球の単離とを互いに調和
させて、試験管内免疫感作を細胞抽出後のできるだけ早
い時点、すなわち約８〜１０日後に行うことができるよ
うにする。
【００２７】刺激を受けたＢリンパ球のみが抗体を分泌
するため、試験管内免疫感作のためには、細胞画分全体
（Ｔリンパ球およびＢリンパ球）を使用することができ
る。ここで、細胞画分と形質転換細胞とは、細胞の数を
基準にして、好ましくは１００：１〜１：１、特に好ま
しくは約１０：１の比率で使用する。インタロイキン、
例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６および
ガンマインタフェロンの添加により、抗体形成性細胞を
刺激することが好ましい。免疫感作バッチにおけるこれ
らのアジュバントの濃度は、それぞれ０．１〜１０mM、
好ましくは約１mMである。
【００２８】限りなく増殖させるために、刺激を受けた
Ｂリンパ球を不死化しなければならない。これは、好ま
しくは、ドイツ国特許ＤＥ３９ ２８ ７６９ Ｃ２に
記載の方法と同様に、Ｂリンパ球をエプスタイン−バー
ルウイルスによって形質転換することによって実施する
ことができる。多量の抗体を製造するためには、ハイブ
リドーマ培養物を製造することが好ましい。Ｂ細胞との
融合のためには、供与者有機体（生物体）に依存しなが
ら、種特異的なミエローマ細胞を使用する。人間の場
合、ミエローマ細胞株Ｕ−２６６がこの目的に特に適し
ていることがわかった。Ｂ細胞は、最適比１：１でミエ
ローマ細胞と合わせる。ポリエチレングリコールなどの
添加物を加えて細胞融合を支持することができる。そし
て、ハイブリドーマクローンを選択するためにバッチを
マイクロタイタプレートのウェルに散布し、抗体につい
て培養上澄み液を試験する。培養条件はハイブリドーマ
培養に通常使用するものである。
【００２９】エピトープ選別により、形質転換細胞の表
面上の種々の抗原、すなわち決定基を認めるハイブリド
ーマクローンを選択し、抗体の特異性を立証する。この
ようにして得られたハイブリドーマ細胞株は、抗体の抽
出に備えてさらに複製させることもできるし、後の使用
に備えて凍結保存することもできる。
【００３０】抗体を従来の方法によって培養上澄みから
単離し、できるだけ均質になるまで従来のたんぱく質精
製法、例えば硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィーおよび／またはＦＰＬＣならびに電気泳動法に
よって精製する。
【００３１】体外試験管内免疫感作は、外来性の有機体
に通じることなく実施され、多量の抗体を供給する。こ
れらの抗体は、供与者個体の特別な腫瘍に特異的であ
り、したがって、この特別な個体において、その診断お
よび対応措置に使用するのに最適である。他方、抗体
は、同じ個体から採取されたＢリンパ球から得られる。
したがって、これらの抗体は、体外で製造されるもの
の、「内在性」たんぱく質であり、有機体に適用された
のち、それ自体に対する免疫反応を何ら誘発しない。免
疫反応が誘発されるならば、それらの抗体の急速な分
解、ひいては、治療上の活性の減退を招くことになろ
う。
【００３２】本発明の方法によって製造された抗体は、
すべてのサブクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇ
Ｅを含むが、ＩｇＧ型の抗体が好ましい。抗体は、それ
らの生理化学的活性、すなわち癌細胞に特異的な抗原決
定基における認識および結合が残る限り、化学的または
酵素的にさらに修飾することができる。
【００３３】従来のグルタルアルデヒド法によって、イ
ムノトキシン、例えばリシンまたはジフテリアトキシン
を抗体に結合させることができる。さらには、ＲＩＡま
たはＥＬＩＳＡに備えて抗体を放射性物質、例えば125
Ｉまたは標識酵素によって標識することができる。
【００３４】好ましい実施態様においては、さらなる修
飾を加えずに抗体を使用して薬剤を製造する。このと
き、薬組成物に、特定のエピトープに対する１種または
それ以上の単クローン性抗体の型式を含めてもよい。
【００３５】患者に投与されたのち、このような抗体
は、付着した腫瘍細胞に結合し、このようにして、マク
ロファージまたは内在性のキラー細胞をおびき寄せるこ
とができ、これらがその役割として癌細胞を破壊する。
【００３６】抗体は、薬学的に許容しうる配合におい
て、従来の担体、希釈剤、安定剤および任意には、他の
補助物質とともに投与される。薬剤は、適当な配合、好
ましくは静脈注射、筋肉注射または皮下注射することが
できる溶液の形態で存在することができる。特に好まし
くは、抗体を、抽出後、凍結乾燥させ、１回分の用量に
充填し、封止する。使用する直前に、抗体を、注射に適
した担体溶液に溶解させるか懸濁させる。通常は無菌緩
衝水溶液である担体溶液は、それ自体のアンプルに、薬
パッキングにある凍結乾燥した抗体とともに封入するこ
とができる。医師が、患者の年齢および状態、腫瘍のタ
イプならびに病状の重さに応じて、適切な用量および投
与形態を選択する。
【００３７】腫瘍に対応する薬剤を製造するために、好
ましくは抗体の特性を利用して、高い特異性を有するそ
の対応する抗原を認識し、それに結合することができ
る。抗体と適当な方法で、すなわち抗原認識に重要な区
域は除いて共融結合した活性成分を、賦形剤としての抗
体を経由して望みの位置までじかに運び、その活性をそ
こだけで発現させ、有機体中に不特定的に分散させない
ようにすることができる。それ自体公知の方法によって
イムノトキシン、例えばリシンまたは放射線治療薬をこ
れらの単クローン性抗体に結合することにより、腫瘍細
胞を破壊することができる。
【００３８】これらの修飾抗体および／または未修飾抗
体を投与することにより、内皮に付着している腫瘍細胞
を検出、破壊することができる。さらに、この方法はま
た、おそらくは外科手術不可能な部分充実性腫瘍または
完全充実性腫瘍、例えばすでに形成した転移の破壊をも
可能にする。手術ののち、循環する形質転換細胞が再定
着したり、転移が発現したりすることを防ぐために、相
当する期間にわたって予防的に抗体の投与を実施するこ
とができる。また、投与は、腫瘍の治療のための他の従
来の薬剤、例えば細胞増殖抑制剤など、およびそれに伴
う治療手段、例えば照射などとともに行うこともでき
る。
【００３９】診断目的のためには、これらの抗体を放射
性または非放射性の標識に結合することができ、腫瘍細
胞の探索および標識に生体内および試験管内で使用する
ことができる。抗体の高い選択性および親和性が、簡単
な手段により、試験管内試験系において患者の血流中の
形質転換細胞の数の定量的および定性的測定を可能にす
る。サンプル中のわずか少数の細胞をも証明することが
できるこのような試験の感度のおかげで、ごく少量の血
液を患者から採取するだけでよく、抗体を絶えず利用し
うることにより、試験を長期間にわたって規則的に実施
して診断に備えることができる。
【００４０】本発明の重要な特徴は、本方法にしたがっ
て抽出された産物、例えば形質転換細胞の培養物、ハイ
ブリドーマ培養物および抗体が当の有機体にきわめて特
異的であるということである。これは、抗体は、それら
の構造において多少なりとも強く、特にそれらの非抗原
認識区域に関して、別の有機体、例えば同じ腫瘍病変を
もつ別の患者とは異なることを意味する。他方、抗体は
個体ごとに実際に内在性であり、免疫系によって「外来
物」とは認識されない。本発明による方法は、比較的短
期間に、かつ許容しうる費用をもって、特定の患者のた
めに、例えばその個人に特異的な抗体を利用することに
より、その人に特別に合わせた薬剤または診断薬を製造
することを可能にする。そのような薬はまた、その特異
的な活性は別として、高い適合性を特徴とする。
【００４１】しかし、これは、特定の個体からその個体
のために製造された抗体の使用が他の個体に対して原則
的に除外されることを意味しない。同じ種の人間の抗体
がキメラ抗体または動物抗体よりも適合性であることは
公知である。抗体を試験管内診断に使用するならば、い
ずれにせよ、適合性は何の役割をも演じない。したがっ
て、特定の腫瘍病変の疑いがあるか、そのような病状が
すでに診断されている患者の場合には、まず実験的に、
別の患者から得た抗体を使用する。そのような抗体が望
みの方法で反応し、適合性を示すならば、上述したよう
に、この患者のためにその人自身の抗体を製造する必要
はもはやない。
【００４２】それにもかかわらず、不適合性反応に至る
ことがあるとしても、原発腫瘍のタイプがわかっている
ならば、多くの場合、患者に内在性のＢリンパ球を、本
発明の方法を使用して他の個体からすでに単離し、複製
させた同じタイプの癌の形質転換細胞の培養物によって
刺激するだけで十分である。このようにして製造された
抗体は、体にとって「準内在性」であるため、非常に適
合性である。そのような抗体がその患者個人の癌につい
て十分な特異性を有しない場合にのみ、本発明の方法に
よって単離、培養および免疫感作処理を完全に実施する
ことが必要になる。
【００４３】したがって、本発明は、特定の哺乳類の複
数の個体における特定の癌の診断および／または治療に
使用することができる薬剤を製造するための、類別さ
れ、個々に適合しうる方法を構成する。
【００４４】本発明の方法の好ましい実施態様において
は、同じ腫瘍を有する１人または何人かの患者から得た
種々のハイブリドーマ細胞株を用意し、癌細胞に対する
特定の抗原決定基を区別する単クローン性抗体にしたが
って選択する。このようにして、同じ腫瘍病変をもつ異
なる患者から単離した形質転換細胞に対して同一の決定
基が起こるかどうかを決定することができる。そして、
内在性Ｂリンパ球での免疫感作を初めに実施することな
く、これらの抗体を、他の患者の場合の診断およびおそ
らくは治療に使用することができる。
【００４５】抗体は、上述したように、従来の方法によ
って改質された形態または未改質の形態において薬組成
物に配合することができる。
【００４６】
【発明の効果】本方法の簡単、迅速かつ経済的な実用性
が、腫瘍がまだ診断されていなくとも、癌の検査または
早期発見における使用を可能にする。また、これは、形
質転換細胞の存在を求める定期的な診断において癌の疑
いを調べる検査や、Ｘ線によって認知しうる充実性の器
官腫瘍が存在する場合には、その腫瘍がすでに循環系に
悪性細胞を分散させたかどうかを決定することにいっそ
う適している。さらには、疑わしい発見（形質転換細胞
または非形質転換細胞）がある場合には、末梢を循環す
る形質転換細胞の存在について検査を実施することがで
きる。このためには、抗体および／またはそれらの特に
適した誘導体を、好ましくはＥＬＩＳＡのための診断キ
ットに利用することができる。
【００４７】上記の方法は、人間医学の分野だけでな
く、獣医学において哺乳動物全般に、また、関連の科学
分野にも応用することができる。したがって、本明細書
において、生きた個体の代表として人間の患者を例に説
明するものは、限定的に解釈されべきではない。
【００４８】本発明の方法によると、安全に、かつ化学
薬品または他のアジュバントを加えることなく、人間お
よび動物などの生きた有機体から診断および治療の目的
に形質転換細胞を抽出することができる。本方法は、系
を循環する多数の腫瘍細胞を抽出することができる。こ
れにより、通常は転移過程に寄与する腫瘍ストレスを軽
減することができる。
【００４９】本発明の方法はとりわけ次の利点を提供す
る。
【００５０】形質転換細胞の抽出を有機体にとってきわ
めて保護的に実施することができる。すなわち、そのよ
うな細胞の血流中への放出を増すことがない。
【００５１】本単離方法は、血流中の末梢の形質転換細
胞の数を非常に急激に減らすことができ、したがって、
例えば原発腫瘍を切除する外科手術ののち、転移が形成
する危険性を軽減する。
【００５２】個々の処理段階を最適に調和させることに
より、多クローン性または単クローン性の抗体を比較的
短時間に、また費用を抑えて生成することができる。
【００５３】抽出された抗体は個体特異的である。すな
わち、そのような抗体は、当の有機体にとって外来性物
質ではない。不適合性反応が出ることもないし、他の外
来性のたんぱく質の場合とは対照的に、抗体が過剰に早
く分解してしまうこともない。これにより、それらの効
率が実質的に増す。
【００５４】抗体は腫瘍特異的である。すなわち、その
ような抗体は、当の個体から得た特別な腫瘍に特異的な
抗原を高い選択性をもって認識する。しかし、他の個体
から得た形質転換細胞の抗原認識を除外することがな
い。
【００５５】抗体と結合した薬学的に活性の成分が、そ
れらの活性を、有機体中に不特定に分散させるのではな
く、実質的に望みの場所のみに分散させる（細胞標
的）。したがって、望ましくない副作用をおおむね回避
することができる。
【００５６】抗体から製造された薬剤は、血流中を循環
する形質転換細胞に対してだけでなく、原発腫瘍および
おそらくはすでに形成した転移に対しても使用すること
ができる。
【００５７】抗体から製造された薬剤は内在性の資質か
ら抽出され、一方、例えば肝炎またはエイズによる外来
性感染を除くことができる。
【００５８】個々の患者にとって腫瘍特異的な抗体の抽
出を許容しうる費用で実施することができ、その結果、
それらの抗体を、患者特異的な薬剤の製造だけでなく、
早期発見、診断または術後治療にも使用することができ
る。
【００５９】個々の有機体から抽出した抗体を「生産有
機体」以外の有機体に使用することができる。
【００６０】
【実施例】以下の実施例により、本発明の方法を詳細に
説明する。
【００６１】材料および方法 １．使用機器 １．１ 細胞培養 無菌ワークベンチ、ＣＯ2 インキュベータ、インキュベ
ータ、加熱板、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、可変ロータ
式遠心機、冷却器（４、−２０、−８０℃）、液体窒
素、オートクレーブ １．２ ＥＬＩＳＡ マイクロプレートフォトメータ（光度計）、ピペット、
８チャネル １．３ 単クローン性抗体の精製 ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ １．４ 生化学的分析 ＩＥＦ機器、ミジェット（midget）システム、エレクト
ロブロット（electroblot ）、二次元ゲル電気泳動、変
換器 １．５ 瀉血装置 Haemonetics V50-1 (Latham-bowl) 、容量１２０ml、バ
イパス付き、米国Haemonetics 社製
【００６２】２．試薬 ２．１ 組織培養 培地ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン
Ｎａピルベート、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．
０、２０mM、ＨＡＴ培地 ２．２ 単クローン性抗体 抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＩＬ−２、抗−ＩＦＮガンマ
（すべてServa 社より入手） 組換えＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦ
Ｎガンマ（すべてServa 社より入手） マクロファージ抑制性ペプチド（Thr-Lys-Pro 、タフト
シン断片１〜３）（Sigma 社より入手） ２．３ 細胞融合 ＨＥＰＥＳ緩衝液中５０％ポリエチレングリコール１５
００、７５mM（５０重量／容量％）
【００６３】３．方法 ３．１ 瀉血による癌細胞の単離および複製 バイパスを備えたHaemonetics V50 遠心機を使用して、
異なるタイプの腫瘍（前立腺癌、黒色腫）をもつ２人の
患者について、上述の方法にしたがってそれぞれ血液１
２０mlづつの細胞画分を抽出した。
【００６４】両患者の組織的段階は先の手術から既知で
あった。
【００６５】細胞画分から得た白血球２．４・１０9 個
を細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０）とともに管に入れ、次
のように調査した。
【００６６】標準条件（３７℃、ＣＯ2 ５％、湿度９５
％）のもとで細胞を一夜培養した。培地として、ウシ胎
児血清１０％を有するＲＰＭＩ１６４０に、Ｂ細胞およ
びＴ細胞に特異的な抗体（ＣＤ８、ＣＤ２５、ＩＬ−２
およびＩＦＮガンマに特異的な抗体）およびマクロファ
ージ抑制性ペプチドを以下の濃度で加えたものを使用し
た。
【００６７】 抗ＩＦＮ １００μg ／培地５００ml 抗ＣＤ２５ １００μg ／培地５００ml 抗ＣＤ８ １mg／培地５００ml マクロファージ抑制性ペプチド（ＭＩＰ） ５０mg／培地５００ｍｌ
【００６８】バッチをマイクロタイタプレート上に分散
させ、ウェルあたり１００μｌ 中２００，０００個の
細胞を配した。培養を始めて４日目に、細胞にそれぞれ
培地１００μl を与えた（抗体またはＭＩＰ添加物は加
えず）。培養期間全体にわたって、３７℃でＣＯ2 ５％
を絶えず維持した。４日後、位相差顕微鏡において、分
裂したのちの癌細胞がクローンとしてはっきりと見え
た。
【００６９】比較対照の目的に、抗体およびマクロファ
ージ抑制性ペプチドを加えずに同じバッチを培地にあけ
た。３週間後に初めて、位相差顕微鏡において癌細胞を
クローンとして確認することができた。抗体およびマク
ロファージ抑制性ペプチドを加えたバッチのクローンを
取り出し、１０8 個の細胞が得られるまで複製させた。
さらなるクローンを複製させ、凍結保存した。
【００７０】３．２ 免疫感作 白血球をして、癌細胞特異的抗原に対する抗体を分泌さ
せなければらなかった。このために、瀉血サイクルの一
つにおいて白血球１０9 個を取り出し、癌細胞１０8 個
と合わせ、ヘパリンを加えた人間の血漿１００ml中で４
日間３７℃およびＣＯ2 ５％で回転培養した。ＩＬ−
２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＦＮガンマ
を加えることにより、抗体形成性の細胞の成熟を促進し
た。濃度はそれぞれ免疫感作バッチ１００mlあたり１０
０μg に達した。
【００７１】３．３ 細胞融合 ＦＡＣＳにより、Ｂリンパ球を他の細胞から分離した。
融合を行う何日か前に、対数増殖期間中、人間のミエロ
ーマ細胞（Ｕ２６６）を３・１０5 個／mlの密度に維持
した。ミエローマ細胞をＢリンパ球と同時に収穫し、Ｐ
ＢＳ中で３回洗浄した。４個の融合バッチを用意し、そ
れぞれ、ミエローマ細胞５・１０7 個をＢリンパ球５・
１０7 個とともに遠心分離にかけ、次いでそれぞれＨＥ
ＰＥＳ中、５０％ポリエチレングリコール１mlを用いて
融合した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０をゆっくりと１０
ml添加した。融合バッチをＲＰＭＩ１６４０中で洗浄
し、室温で２分間、２００Ｇで遠心分離にかけ、ＨＡＴ
培地５０mlにそれぞれ入れ、９６ウェル式のマイクロタ
イタプレートにウェルあたり０．１mlで散布した。ウェ
ルあたり１０4 個の人間マクロファージをフィーダ細胞
として使用した。
【００７２】３．４ 選別（スクリーニング） ハイブリドーマ細胞の培養上澄みをＥＬＩＳＡで抗体に
ついて試験した。細胞ＥＬＩＳＡをこの目的に用意し
た。適当な方法により、癌細胞をマイクロタイタプレー
トのプラスチック面に塗布し、おそらくはそれらのプレ
ートに結合している抗体を第二の抗体によって検出し
た。
【００７３】ＥＬＩＳＡ 拡散後の最初の選別において、免疫グロブリンを分泌す
るクローンを求めた。
【００７４】１．培養上澄みを、マイクロタイタプレー
トにおいて、ウェルあたり１００μlで一夜４℃で培養
した。
【００７５】２．ＰＢＳで３回洗浄した。
【００７６】３．２時間３７℃でアルブミンまたはブロ
ット（blotto）で阻止した。
【００７７】４．ＰＢＳで３回洗浄した。
【００７８】５．ヒト免疫グロブリンに対して特異的な
抗体を２時間３７℃で培養した。
【００７９】６．酵素（ペルオキシダーゼまたはアルカ
リホスファターゼ）が結合した第二の抗体を１時間３７
℃で培養した。
【００８０】７．基質を加えることによって発現させ、
読取り機器で測定した。
【００８１】癌細胞に特異的な抗体について陽性のクロ
ーンを試験した。このために、細胞ＥＬＩＳＡを用意し
た。
【００８２】１．蒸留水中１ml中ポリ−Ｌ−リシン１mg
の溶液を調製した。
【００８３】２．ポリ−Ｌ−リシンを加えたマイクロタ
イタプレートを１５分間インキュベートした。
【００８４】３．水洗した。乾燥後、室温で保管した。
【００８５】４．細胞をＰＢＳに懸濁させて洗浄し、４
００Ｇで遠心分離にかけた。
【００８６】５．細胞ペレットをＰＢＳ１mlあたり１０
5 個で再び懸濁させた。マイクロタイタプレートに満た
し、室温で１０分間インキュベートした。
【００８７】固定 アセトン／メタノール混合物（５０／５０容量％）２０
０μl をそれぞれマイクロタイタプレートのウェルに注
ぎ、室温で２分間培養した。その後、ＰＢＳで１回洗浄
した。
【００８８】その後の段階は、最初の選別と同様にして
実施した。
【００８９】３．５ 生化学的分析 培養上澄みから直接得た単クローン性抗体を分析した。
Ｌ鎖およびＨ鎖のサブクラスを、サクブラス試験キット
により、ＥＬＩＳＡにおいて決定した。等電点電気泳動
を利用して、抗体の単クローン性を確認することができ
た（Hoffmann et al., Human Genetics, Springer Verl
ag, 1990, 84, 137-146 ）。
【００９０】３．６ エピトープ選別（スクリーニン
グ） 癌細胞を培養し、細胞１０7 個を取り出し、ＰＢＳで３
回洗浄し、二つの画分に分けた。一方を均質化し、負の
ゲル電気泳動（ｐＨ８．８、分離側ゲル中にアクリルア
ミド９％、捕集側ゲル中にアクリルアミド３％）におい
て分析し、他方を変性し（尿素、ＳＤＳ）、一次元およ
び二次元のゲル電気泳動（Waldinger etal., Electorop
horesis, 1986）によって分離した。それに続くウエス
タンブロットの検出を培養上澄みによって実施した。認
められた帯および／または点を抽出し、配列し、こうし
て腫瘍特異的抗原を識別した。他の組織および白血球の
サンプルを比較対照として使用した（E. Harlowe, D. L
ane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1988; D. Baron, U. Hartlaub, Hu
mane monoklonale Antikoerper, Gustav Fischer Verla
g, Stuttgart, New1987）。
【００９１】４．結果 いずれの場合（前立腺癌、黒色腫）でも、４日後に、細
胞培養プレートのウェルの約３０％において、形質転換
細胞のクローンが位相差において確認できた。
【００９２】悪性でない病変（リンパ球の自己免疫調整
障害）を有する患者の細胞画分を、白血球を他の理由か
ら体外で治療しなければならない比較対照として使用し
た。この場合、細胞分裂は見られなかった。
【００９３】同様にして、以下の形質転換細胞株を単離
し、それらの系から、対応する抗体を分泌するハイブリ
ドーマ培養体を製造した。
【００９４】乳癌 Ｂ細胞リンパ腫 気管支癌 腎腺癌
【００９５】癌細胞およびハイブリドーマ細胞株の寄託 以下のような形質転換細胞（癌細胞株）の培養体を製造
し、それらの培養体から、対応するハイブリドーマ細胞
株を製造した。
【００９６】
【表１】
【００９７】これらのハイブリドーマ細胞株は安定であ
り、２４時間中に細胞１０6 個あたり抗体５〜７μg を
分泌した（文献によると、人間ハイブリドーマの場合、
２４時間中に細胞１０6 個あたり抗体１〜１０μg が平
均値とされている）。
【００９８】これらの癌細胞株およびハイブリドーマ細
胞株のいくつかは、１９９３年８月１７日のブダペスト
協定にしたがって、Deutsche Sammlung fuer Mikroorga
nismen、ＤＳＭ（ドイツ連邦共和国、Mascheroder Weg
1b, 38 124 Braunschweig ）に寄託された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ｊ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウルリッヒ・キュブラー ドイツ連邦共和国、デー−80538 ミュン ヘン、レルヒェンフェルドシュトラーセ 20 (72)発明者 ライネル・ホフマン ドイツ連邦共和国、デー−82256 フュル ステンフェルドブルック、ヴェッターシュ テインプラッツ １

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 個体の血流中を循環する形質転換細胞を
    単離、培養する方法であって、 特定の状況のもとではなおも白血球および／またはリン
    パ球を含み、かつ形質転換細胞を多く含む細胞画分を抽
    出し、その形質転換細胞を増殖させることを特徴とする
    方法。
  2. 【請求項２】 全血を個体から連続的に抽出し、その全
    血を、形質転換細胞を多く含む細胞画分を抽出する瀉血
    装置に通し、他の血液成分を個体に戻す請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 形質転換細胞を複製させるために、形質
    転換細胞を多く含む画分の中に特定の状況のもとで含ま
    れるリンパ球および／または白血球の成育および／また
    は機能を抑制する請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 マクロファージ抑制性ペプチドとして、
    Ｂリンパ球特異的および／またはＴ細胞特異的な抗体を
    添加する請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 白血球および／またはリンパ球を、細胞
    選別法により、形質転換細胞を多く含む画分から分離す
    る請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】 乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、腎腺癌、気管支
    癌、前立腺癌および黒色腫から選択される形質転換細胞
    を単離、培養する請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜５の１項またはそれ以上に記
    載の方法によって得ることができる形質転換細胞の個体
    特異的細胞株。
  8. 【請求項８】 気管支癌の形質転換細胞の個体特異的細
    胞株（ＳＢ １；ＤＳＭ寄託番号２１４４）。
  9. 【請求項９】 腫瘍抗原に対する個体特異的抗体を製造
    する方法であって、 請求項１〜６の１項に記載の方法によって単離した形質
    転換細胞によってＢリンパ球に刺激を加えて、形質転換
    細胞上の腫瘍抗原に対する抗体を産生させ、刺激を受け
    たＢリンパ球を不死化し、増殖させ、選択し、不死化し
    たＢリンパ球培養物から得た抗体を単離、精製すること
    を特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】 形質転換細胞を単離したもとと同じ個
    体からＢリンパ球を抽出する請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 不死化のために、刺激を加えたＢリン
    パ球を種特異的ミエローマ培養物と融合し、選択して、
    抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を得る請求項９記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 乳癌ハイブリドーマ、Ｂ細胞リンパ腫
    ハイブリドーマ、腎腺癌ハイブリドーマ、気管支癌ハイ
    ブリドーマ、前立腺癌ハイブリドーマおよび黒色腫ハイ
    ブリドーマから選択される個体特異的ハイブリドーマ細
    胞株を製造する請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 エプスタイン−バールウイルスでの形
    質転換により、刺激を受けたＢリンパ球を不死化する請
    求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１１または１２の１項に記載の
    方法によって得ることができる個体特異的ハイブリドー
    マ細胞株。
  15. 【請求項１５】 黒色腫ハイブリドーマのハイブリドー
    マ細胞株（４Ｅ６；ＤＳＭ寄託番号２１４３）。
  16. 【請求項１６】 請求項９〜１３の１項に記載の方法に
    よって得ることができる、腫瘍抗原に対する個体特異的
    多クローン性または単クローン性抗体。
  17. 【請求項１７】 腫瘍特異的抗原に結合することができ
    る請求項１６記載の修飾抗体。
  18. 【請求項１８】 イムノトキシンおよび／またはプルー
    フマーカが結合されている請求項１７記載の修飾抗体。
  19. 【請求項１９】 請求項１６記載の１種以上の抗体およ
    び／または請求項１７もしくは１８記載の１種以上の修
    飾抗体を含み、場合によっては薬学的に許容しうる担体
    および他のアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
  20. 【請求項２０】 癌の治療のための請求項１９記載の薬
    剤。
  21. 【請求項２１】 請求項１６記載の１種以上の抗体およ
    び／または請求項１７もしくは１８記載の１種以上の修
    飾抗体を含むことを特徴とする診断薬。
  22. 【請求項２２】 請求項１６記載の１種以上の抗体およ
    び／または請求項１７もしくは１８記載の１種以上の修
    飾抗体の、癌の診断および／または治療のための薬剤の
    製造における用途。
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