JPH05507470A - Ｍｃａ２８ａ３２によって認識される抗原ｃｔａａ２８ａ３２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＣＡ　２８Ａ３２Ｇ、１ｍよッテ認識される抗［ＣＴＡＡ８Ａ３２ 魚月しと１１− 結腸直腸癌は米国で男性及び女性の双方ともに２番目に多い癌である。最近まで この疾患の有効な治療方法としては外科手術しかなかった。更に、手術後にも腫 瘍の全層性進展及びリンパ節への転移がみられるなど、患者の予後もよくなかっ た。最近報告された無作為のＨ期活性の特異的な試験免疫療法で予後の劇的な改 善が得られた。即ちこの試験療法では、Ｔｉｃｅ　ＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｕｓＣ ａｌｍｅｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）と混合した白服性腫瘍 細胞による患者の免疫感作によって、遅延型皮膚過敏性反応が有意に増進し、４ 年間にわたって再発及び致死率が有意に減少したことが報告されている（３）。

結腸癌関連抗原の同定は多数の刊行物に記載されている（４〜９）、これらの抗 原の多くは、ある種の形態の結腸腫瘍細胞（抽出物、解離細胞、膜調製物、など ）または結腸腫瘍細胞系によってマウスと免疫感作することによって生成された モノクローナル抗体を用いて同定された。これらのマウス抗体は、マウスにおい て抗原性であったすべての抗原を同定する。これらの研究に加えて、腫瘍物質に 対して特異的反応性を示すヒトモノクローナル抗体もいくつか報告されている。

発明者らは、免疫治療プロトコル中に白服住腫瘍細胞とＢＣＧとによって能動免 疫感作した結腸直腸患者の末梢血液Ｂ細胞を用い、ヒト抗腫瘍モノクローナル抗 体を産生させる手法の開発に成功した（１１）、ヒト結腸癌に対して生成した抗 体でありＣＥＡのような健康個体に検出される組織成分をもしばしば認識するマ ウスモノクローナル抗体と違って、このモノクローナル抗体は、ＣＥＡ、血液型 決定因子または組織適合性抗原に対して反応性を全く示さない、このことは、抗 体が、白服性宿主中で免疫原性であると認識されたエピトープだけに限定された 特異性を有しており、この特異性に基づいて抗体をキャラクタライズし得ること を示している。

発明者らは、これらのヒトモノクローナル抗体を、腫瘍抗原を同定するためのプ ローブとして使用した。結腸腫瘍、結腸腫瘍細胞系の抽出物、ヌードマウスに与 えたヒト腫瘍異種組織移植片中で特定の抗原を同定した。対象となる抗原は、結 腸直腸腫瘍全体の約７０％に検出されたヒトモノクローナル抗体（ＭＣＡ）２８ Ａ３２によって認識されるエピトープを含むことに基づいてキャラクタライズさ れ得る。

光１ｂ久遺Ｊ一 本発明は、ヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２によって認識されるエピトープ、 及び、発明者らがその同定、単離及びキャラクタライズに成功した該エピトープ を含むヒト腫瘍抗原ＣＴＡＡ　２８Ａ３２に関する。ヒトモノクローナル抗体２ ８Ａ３２を産生ずる細胞系は、１９８７年４月１５日付けの特許上！１１１Ｊｓ ｓＮ　０７１０３８．８１１に開示されている。本発明の目的はまた。このエピ トープを含む抗原に対する抗体を診断のため及び癌治療をモニターするために使 用すること、及び、このエピトープを含む腫ｇＩＩＩｎ胞に対して得られた免疫 応答と同様の免疫応答を引き出すワクチンを調製するために抗原を使用すること である。

・　の　゛　ｔｄ 図１は、ＣＴＡＡ　２８Ａ３２のゲル濾過クロマトグラフィーを示す３図２は、 この抗原のゲルｒ過クロマトグラフィー後の５０Ｋ及び４６にの分画、即ちプー ル２及び３のアニオン交換クロマトグラフィーを示す９図３は、ｆｆ１ｌのプー ル４から得られた３６Ｋ及び３２にの抗原のカチオン交換クロマトグラフィーを 示す０図４は、ブチルフラクトゲルカラムの疎水性相互作用クロマトグラフィー による４６Ｋ及び５０にのタンパク質の精製を示す０図５は抗原の純度をＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示し、図６はＨＰＬＣによって示す０ 図７は各抗原のタンパク質配列データを示す。

い　の；　Ｂ 検査した結腸直腸腫瘍の約７０％にヒトＭＣＡ　２８Ａ３２によって認識される エピトープを含む抗原が検出された（１１）、発明者らはまた、結腸癌細胞系Ｈ Ｔ−２９、ＳＷＩ　４６３．５Ｗ９４８．５Ｗ４０３、ＬＳｌ　７４、ＬｏＶｏ 及びＷｉＤｒ　（ＡＴＣ（、、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｅ、ＭＤ）が同じ抗原を含 むことも知見した。適合した正常結腸組織に対するヒトＭＣＡ　２８Ａ３２の反 応性が低いので、この抗原が結腸腫瘍細胞中で優先的に発現されることが明らか である。

塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相 互作用クロマトグラフィーによって抗原を精製した。精製されたＣＴＡＡ　２８ Ａ３２の成分の各々は、還元条件下の変性勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって単一タンパク質として泳動した。

抗原に特有の天然型タンパク質の分子量をゲル濾過クロマトグラフィーで測定し て得られた値は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定して得られた値と同じであった。ＭＣ Ａ　２８Ａ３２によって認識された４つの抗原性タンパク質の分子量は夫々、約 ５０Ｋ、４６Ｋ、３６Ｋ及び３２にである。

細胞性成分の粗分画化に基づくと、３６にのタンパク質は形質膜から検出され、 ５０Ｋ、４６Ｋ及び３２にのタンパク質は細胞質から検出されることが判明した 。

ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の全部のタンパク質の部分的タンパク質配列情報が得られ た。ＮＢＲＦ　ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅのコンピュータ調査に基づいて 、５０Ｋ、３６Ｋ及び３２にのタンパク質の相同性は全く認められなかった。４ ６にのタンパク質はヒトα−エノラーゼに対して顕著な相同性を示すが、異なる アミノ酸配列をいくつか含んでおり、このことは、４６にのタンパク質が上記酵 素の変化形を示し得る唯一のタンパク質であることを示している。

発明者らは、２８Ａ３２ヒトモノクローナル抗体に対する反応性によってこの腫 瘍関連抗原を単離した。種々の結腸癌中にこの抗原が存在すること及びこの抗原 がクローン化したＴ細胞を刺激する能力を有することに基づいて、この抗原は診 断目的及びワクチン開発のための重要な抗原である。ＣＴＡＡ　２８Ａ３２はヒ トＭＣＡ　２８Ａ３２との免疫反応性、その分子量キャラクタリゼーション及び 部分的タンパク質配列情報によって定義され、明確に同定される。

ヒ　ＭＣＡ　Ａ　こ　つ　ｔ　−れ　ＣＴＡＡいずれも風乾サイトスピン調製物 として調製した７つのヒト結腸腫瘍細胞系、８つの原発性結腸腫瘍の酵素解離細 胞、４つの結腸腫瘍異種組織移植片の酵素解離細胞と用いてＭＣＡ　２８Ａ３２ 抗体の反応性を評価した。７つの結腸腫瘍細胞系には、ヒトＩｇＭのモノクロー ナル抗体２８Ａ３２をスライドあたり３００ｎｇの濃度で使用した。この抗体を 、８つの原発性腫瘍細胞調製物及び結腸腫瘍異種組織移植片調製物に対しても試 験した。ホルマリンで固定しパラフィンに包埋した結腸腫瘍組織及び３人の患者 から採取した対応する正常結腸を間接手順によって試験した。

１１五 ヒト結腸腺癌細胞系ＨＴ−２９、ＳＷ−１４６３，５Ｗ−９４８，５Ｗ−４０３ 、Ｌｓ−１７４、ＬｏＶｏ及びＷ　ｉ　Ｄ　ｒはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌ　ａｎ ｄ）から入手した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した推薦培地中で細胞 を培養した。全部の細胞を５％ＣＯｘ雰囲気下に３７℃でインキュベートした。

ノ　ロー　ル ヒトモノクローナル抗体ＭＣＡ　２８Ａ３２を産生するＩ　１６４０の存在下に 中空ファイバカートリ・フジ中で増殖させた。ゲルＰ通及びイオン交換クロマト グラフィーによって抗体、ヒト免疫グロブリン−Ｍ　（Ｉ　ｇＭ）を精製した。

ＭＣＡ　２８Ａ３２に　る ジメチルホルムアミドに溶解したビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｃ ａｌｂｔｏｃｈｅｍ）を用い、生理的バッファ溶液中で、ビオチンと抗体との初 期モル比１２０：１でＭＣＡ　２８Ａ３２及び対照ヒトエｇＭのビオチン標識を 行なった。室温に１５分間維持した後、反応混合物をＰＢＳに透析して逆層ビオ チンを除去した。ビオチニル化した抗体をホルマリンで固定しパラフィンに包埋 した結腸腫瘍及び外科手術で摘出した結腸の縁部がら採取した非腫瘍性正常結腸 組織と反応させた。反応性を可視化するためにＡＢＣペルオキシダーゼ法（Ｖｅ ｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。４０μｇ／ｍｌまでの種々の 抗体濃度で抗体価を測定した。

また、その他の正常組織に対するビオチニル化抗体の反応性を検査した。この抗 体の特異性を確認するために、胸、食道、胃、胆のう、腎臓及び肺の正常ＭＪＩ のホルマリンで固定しパラフィンに包埋した切片に対して試験した。

間接ペルオキシダーゼ法で７つの結腸腫瘍細胞系の全部が２８Ａ３２と反応した 。抗体はまた、８つの原発性結腸腫瘍のうちの７つ及び４つの異種組織移植片調 製物の全部と反応しな、このデータを表１にまとめる。

ビオチンで直接標識したＭＣＡ　２８Ａ３２をホルマリンで固定しパラフィンに 包埋した７対の結腸腫瘍及び白服性非腫瘍性結腸と反応させた。これらの種々の 組織切片から得られた結果を表２に示す、抗体使用量が試験した最大濃度（４０ μｓ／ｍｌ）であるときにも、より低い濃度であるときにも、正常結腸に比べて 腫瘍組織に対する諷著な特異性が観察された。

また、ビオチニル化抗体ＭＣＡ　２８Ａ３２を、ホルマリンで固定しパラフィン に包埋した種々の正常組織に対して試験した。２人の被験者から採取した顆粒球 、導管組織及び正常胸組織の全部分は陰性て゛あった。正常食道に対する試験で は、１人の被験者の組織は、試験した最大抗体濃度（８０μｓ／ｍ　Ｉ　）で正 常上皮の中程度から高度の染色を示し、より低い濃度では低度の染色を示した。

第２の被験者の組織は、４０μｇ／ｍｌの抗体濃度で染色を全く示さず、８０μ ｇ　／　ｍ　ｌのより高い濃度で軽度の染色を示した。正常胃に対する試験では 、２人の被験者の組織が染色を全く生じなかった。胆のうに対する試験では、上 皮の軽度の染色が生じた。腎臓に対する試験では、集合細管の上皮が抗体に反応 したが、糸球体は反応しなかった。肝臓に対する試験では、細管及び管の上皮の 軽度の染色が観察されたが、実質の染色は観察されなかった。肺に対する試験で は、気管支上皮または肺胞の染色は全く観察されなかった。これらのデータを表 ３にまとめる。

坑」Ｕ１逼− １，０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とリン酸塩ｖｌ街生理食塩水 （ＰＢＳ）とで処理することによってＨＴ−２９またはＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞を採 集した。細胞をベレット化した後で、細胞洗浄液と呼ばれる上清流体を細胞から 分離して保存した。ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の５０Ｋ及び４６にのタンパク質につ いては、細胞自体から得られるこれらの抗原と同量の抗原が細胞洗浄液に含まれ ていることが観察された。抗原材料としての細胞洗浄液は原形（ｉｎｔａｃｔ） 細胞から得られた抽出物よりも夾薙物が少ないので、上記の２つのタンパク質を 単離するための好ましい材料ソースを提供する。ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の３６Ｋ 及び３２にのタンパク質は、凍結細胞の抽出物から得られた。

凍結細胞は、５０ｍＭのＴｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａＣＩ　、 ５．０ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド及 び０．５％のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０から成るバッファで細胞を処理すること によって得られる。

細胞を４℃で６０分間攪拌し、次いで、１００，０００×ｇで３０分間超遠心し て清澄化した。細胞洗浄液材料もこの平原で清澄化した。

ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の 抽出細胞または細胞洗浄液材料から得られた清澄化した上清流体を４℃に維持し 、固体硫酸アンモニウムを添加して３０％飽和した。混合物を４℃で６０分間以 上攪拌し、次いで４０．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心した。次に、上清流体を 除去し、固体硫酸アンモニウムを添加して８０％飽和にし、４℃で６０分間以上 攪拌し、次いで４０，０００×ｇで再度３０分間遠心した。５０Ｋ及び４６にの タンパク質を含有する細胞洗浄液から得られた硫酸アンモニウムベレットを少量 のＰＢＳに溶解し、３６Ｋ及び３２にのタンパク質を含む溶解ｍ胞ペレットを少 量の５０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８，ｏに溶解させた。

ゲルー゛クロマトグーフィー ＰＢＳ中で予め平衡させな５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００（５，０Ｘ９０ｃｍ ）カラムを用い、ＣＴＡＡ２８Ａ３２タンパク質を流速１．５ｍｌ／分でクロマ トグラフィー処理した。抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンプロット法に よって分析し、以後の処理のために適当なピークをプールした。

ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の５０Ｋ及び４６にのタンパク質は細胞洗浄液中に濃縮し 、３６Ｋ及び３２にのタンパク質は細胞溶解液中に濃縮しているので、これらの 双方の液を精製抗原の生成ソースとして使用した。［安沈殿後にゲル２通によっ て双方の抗原調製物をクロマトグラフィー処理すると、等しいクロマトグラフィ ーパターンが観察された。

クロマトグラフィー後に、図１に示すような複数のピークが得られた。５０Ｋ及 び４６にのタンパク質を得るためには、プール２及び３を一緒にして更に処理し た。３６Ｋ及び３２にのタンパク質を得るためには、プール４を使用して更に精 製した１図１に示すように、５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムにおいて分子 量サイズに基づく十分な分離を行なうことができ、このステップによって抗原の 十分な精製が達成された。

ン　ロマト　−フィー ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラムから得られた５０Ｋ及び４６にのタンパ ク質を含有するプールを２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４を含有するバ ッファに透析した。このアールを、同じバッファで予め平衡しておいなＭｏｎｏ 　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ、Ｉ　ｎｃ、）にロードした０図２に示す ように、使用された条件下にこのカラムを通過した材料は、５０Ｋ及び４６にの タンパク質を含んでいた。大部分のタンパク質がカラムに結合し、直線状塩勾配 で溶出した。

＜ｍ胞抽出材料から得られた）Ｓ−２００カラムのプール４を、５０ｍＭの酢酸 ナトリウムバッファ　ｐＨ５，５に透析し、同じバッファで予め平衡しておいた Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ、Ｉｎｃ 、）にロードした。酢酸塩バッファ中の塩化ナトリウムが０．５Ｍになるまで酢 酸塩バッファ中の塩化ナトリウム濃度と０．０５Ｍずつ増加させることによって カラムを溶出させた６図３に示すように、プール３は５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェ スタンプロット分析で測定したＣＴＡＡ２８Ａ３２の３６にタンパク質を含有し ており、プール５は３２にタンパク質を含有していた。

ロマト　−フィー ５０にのタンパク質を４６にのタンパク質から分離するために、アニオン交換カ ラムを通過したプールを［酸アンモニウム濃度３０％に調整し、３０％の硫酸ア ンモニウムを含有する２０ｍＭの”ｌ’ｒｉｓ　ｐＨ７，０で予め平衡させたブ チルフラクトゲル（Ｔｏｙｏｈａｕｓ）の疎水性カラムに入れた１次いで、Ｔｒ ｉｓバッファ中の硫酸アンモニウム濃度が２１％になるまで硫酸アンモニウム濃 度を３％ずつ減少させることによってカラムから逐次溶出させた。

次に２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４でカラムを洗浄した。このカラム の流速は０．１ｍｌ／分であった。

この溶出によって得られたプロフィルを因４に示す、４６にタンパク質は硫酸ア ンモニウム濃度２７％で溶出し、５０にタンパク質は硫酸アンモニウム濃度２４ ％で溶出した。この最終ステップ後のこれらの抗原は双方ともほぼ均質であった 。カラムから得られた各プールを０．ＩＭ酢酸アンモニウムバッファＰ）ｒ７． ｏに透析し、次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット分析によって分析 した。

ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の３６Ｋ及び３２にタンパク質はアニオン交換カラム後に ほぼ均質であり、それ以上の精製は不要であった。

」ｌ乳支（ｌ ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の単離タンパク質の純度を評価するために、各タンパク質 に対してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。図５に示すように 、この判定基準によればタンパク質はほぼ均質である。

天然型非変性タンパク質の純度をサイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）によって評価した１図６に示すように、この方法によればすべてのタン パク質が純度９５％以上であると考えられる。

乙ユｌｆｉ目Ｌ Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ法を用いてアミノ酸分析を行なった。この方法 では、タンパク質を減圧下に加水分解し、次いで、得られたアミノ酸をフェニル インチオシアネートを用いて誘導体化する。誘導体化したアミノ酸を次に、逆相 高性能液体クロマトグラフィーによって分離し定量した。

精製したタンパク質の各々を加水分解し、次いでフェニルインチオシアネートに よって誘導体化し、逆相ＨＰＬＣによって分離した。この分析の結果を表４に示 す、数値は、タンパク質１モルあたりの各アミノ酸残基の数を示す、各値は、少 なくとも４回の異なる測定の平均である。この表から明らかなように、各タンパ ク質は互いに異なるアミノ酸組成を有している。

タンパク エドマン分解法に基づく全自動気相タンパク質シーゲンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）を用いて分子のＮ末端部分からタンパク質を配 列決定した。

Ｎ末端アミノ酸が封鎖されており、従ってこの位置のタンパク質の配列決定がで きないタンパク質に対しては、タンパク質を開裂しペプチドを単離した。標準法 では、ブロムシアンまたはタンパク質分解酵素を用いて開裂させ、次いで、得ら れたペプチドを逆相高性能液体クロマトグラフィーによって分離する。このよう にして単離した個々のペプチドに対して上記の方法でＮ末端タンパク質配列決定 を行なった。

各タンパク質の配列データを得るための初期の試みは、非封鎧の３６にタンパク 質に関する以外は成功しなかった。

５０Ｋ、４６Ｋ及び３２にのタンパク質のＮ末端アミノ酸は封鎖されており、従 って、この位置で配列決定できなかった。封鎖されたタンパク質に関するタンパ ク質配列情報を得るなめに、精製タンパク質の各々をフラグメントに分割し、各 フラグメントのタンパク質配列情報を分析することにした。

５０Ｋ及び４６にのタンパク質を、タンパク質内部のメチオニン残基のカルボキ シル末端部分に対する開裂特異性を有するブロムシアン開裂によってフラグメン トに分割した。３２にのタンパク質を、タンパク質内部のりシン残基のカルボキ シル末端に対する開裂特異性を有するＬｙｓＣによる酵素消化によってフラグメ ントに分割した。タンパク質の開裂によって得られたペプチドを逆相高性能液体 クロマトグラフィーによって分離した。同じ開裂方法を用いた各抗原のペプチド マツプを比較すると、各タンパク質が異なるペプチドマツプを有していることが 判明した。特定タンパク質に関するタンパク質配列情報を作成するためには、各 タンパク質の開裂によって得られたフラグメントのうちで最も有力であり且つ再 現可能に単離できるフラグメントを使用した。

図７に示すデータは、ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の５０Ｋ、４６Ｋ、３６Ｋ及び３２ にのタンパク質のタンパク質配列情報を示す、これらの配列を既存のタンパク質 データベースと照合すると、ヒトαエノラーゼに対する相同性を有する４、　６ 　Ｋタンパク質以外のタンパク質は既知のタンパク質に対する有意な相同性を有 していなかった。ヒトαエノラーゼに対する４６にタンパク質の相同性は約７５ ％〜８０％であり、これは、このタンパク質が腫瘍細胞中で産生されたαエノラ ーゼの変形であることを示すと考えられる。

その他のタンパク質は、タンパク質データベース中に収納されているいかなる配 列に対しても有意な相同性を有していなかった。

ＣＴＡＡ　２８Ａ３２に・　るヒトＴ ヒトＴ　クローンの ヒトＴ細胞クローンを５人のヒト結腸癌患者の腫瘍浸潤リンパ球から単離し、単 離した純粋なＣＴＡＡ　２８Ａ３２タンパク質に対する幼若化応答を試験した。

１０単位のインターロイキン−２（ｒＬ−２＞／ｍｌ、２０％ヒトＡＢ血清、し −グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳバッファ、 ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びフンギシンを補充したＲ ＰＭ　Ｉ　−１’６４０の基底培地中で、Ｘ線照射した１０’の自製性腫瘍細胞 を刺激剤として含む９６ウエルのプレート中での限界希釈によってコラゲナーゼ 解離ヒト結腸腫瘍細胞をブレーティングすることによってＴ細胞をクローニング した。Ｔ細胞クローンを同じ培地中で増殖させ、抗腫瘍応答性及び特異性を維持 するために７〜１４日毎に白魚性腫瘍で刺激した。

ＣＤ４　（ヘルパーＴ）及びＣＤ８　（細胞障害性Ｔ）の細胞表面マーカーに対 するネズミのモノクローナル抗体と結合させたフルオレセインで標識した細胞を フローサイトメトリー分析することによってＴ細胞サブセットを分析した。

ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンの幼若化応答をマイクロタイターアッセイで測定した 。マイクロタイターアッセイでは、１０’のクローン化したＴ細胞を、９６ウエ ルのマイクロタイタープレートの各ウェルで、１単位のＩＬ、−２／ｍ＋を添加 した増殖培地中で、エプスタイン−バールウィルスで形質転換させた５Ｘ１０’ の自製性Ｂ細胞（抗原呈示のため）、ニトロセルロースに固定した１０μｇ　／ 　ｍ　ｌの試験抗原または対照抗原と共に、３７℃で６日間インキユベートシた 。細胞を１．０μＣＬの〔３Ｈ〕−メチルチミジンで１８時間パルスし、ガラス 繊維フィルターに採取し、シンチレーションカウンターでカウントして〔１Ｈ〕 の取込み量を測定した。これは抗原による特異的胴部に対する細胞増殖の測定値 である。試験抗原で処理した細胞の毎分カウント数（ＣＰＭ）を対照抗原で処理 した細胞のＣＰＭで除算することによって刺激指数（ＳＩ＞を計算した。

２．０を上回るＳＩを有意とする。

単離したクローンの大部分がＴヘルパー（ＣＤ４）表現型であった。ＣＴＡＡ　 ２８Ａ３２タンパク質に対する応答性を評価すると、異なる２つの個体から得ら れたクローン（ＷＯＲ及びＫＥＨ＞は４６にタンパク質に応答した（表６）。Ｗ ＯＲから得られた２つの異なるクローン＃１５及び＃１６とＫＥＨから得られた １つのクローン＃１１は４６にタンパク質に応答して増殖したが、その他のＣＴ ＡＡ　２８Ａ３２のいずれにも応答しなかった。別の個体から得られたクローン が応答しなかったので（表５、ＲＯＢＣ６３参照）、４６にタンパク質は一般的 なＴ細胞刺激物質ではない。

Ｔ細胞免疫は、ヒト及び動物における腫瘍退行の主要要因である。腫瘍を有する 個体のＴ細胞が腫瘍関連抗原に応答することはこれらの抗原がヒト結腸癌のワク チンとして適当であることを示す、ＣＴＡＡ　２８Ａ３２の５０Ｋ、３６Ｋ及び ３２にのタンパク質に対しては陰性結果が得られたが、これらのタンパク質が適 当なワクチン候補でないことを決定するためには多数のクローンを試験する必要 があり、この結果だけで結論することはできない、４６にのタンパク質に対して は３つの異なる反応性Ｔ細胞クローンが同定されたので、このタンパク質の反応 性は有意であり、従ってこの抗原はワクチンとして適当であると考えることがで きよう。

宍」− 風乾結腸ａｆＩ＆細胞系及び異種移植細胞に対するＭＣＡ２８Ａ３２の反応性 ＭｉＪＬＬ　抜差ｍ　ｍ ＨＴ−２９０，３μｇ／スライド　２＋５Ｗ−１４６３０，３μｇ／スライド　 ２÷５Ｗ−９４８０，３μｇ／スライド　４＋５Ｗ−４０３０，３μｇ／スライ ド　３＋ＬＳ−１７４０，３μｇ／スライド　３＋ＬｏＶｏ　０．３μｇ／スラ イド　３＋ＷｉＤｒ　０．３μｇ／スライド　１＋ＡＴＫ異種移植￥’ＩＪ　１ ７ｎｇ／スライド　１＋ＪＥＦ異種移植物　８５ｎｇ／スライド　１＋Ｔ）（Ｏ 異種移植物　１７ｎｇ／スライド　１＋ＢＬＵ異種移植物　１７ｎｇ／スライド 　１＋宍」Ｌ ＣＴＡＡ　２８Ａ３２のアミノ酸分析 抗原 １支Ｌ１　５０Ｋ　４６Ｋ　３６Ｋ　３２ＫＤ、Ｎ　ａ４０　３６　２５　２６ Ｅ、Ｑ　５３　３７　３２　３４ Ｓ　２８　２５　２３　２５ Ｇ　４１　３０　１８　２９ Ｈ１３４３３ Ｒ２３２１１９１７ Ｔ　３１　２１　１８　１６ Ａ　３４　３１　２６　２１ Ｐ　１６　１３　７　７ Ｙ　１３　１６　１７　１１ Ｖ　１５　１８　１４　１２ Ｍ　４６６５ １　１．５　１７　１５　１３ Ｌ　３９　３３　２５　２３ Ｆ　１３　１４　５　８ Ｋ　４１　２２　２８　１８ Ｗ　３２１２ Ｃ４３２２ ａ：抗原１モルあたりのアミノ酸残基の総数轟Σ 腫瘍抗原に対するヒトＴ４１１！クローン幼若化応答（ａ）抗原　ＣＰＭ（ＳＩ ）　（ｂ） 糾ＯＲＣ１５１４０ＲＣ１６ＫＥＨＣＩＩ　ＲＯＢ　Ｃ６３対照培地　４４４　 ４５４　１１．７０５　１．８２７二トσ七ルび−ス対照　４１８　４４６　１ １，５２７　２．２２５ＣＴ＾＃２　ｐ５０　４０８（１，０＞　３１９（０， ７＞　２８，６０４（２，２）　３，７４９（１，５）ＣＴ＾＃２ｐ４６　１， ３２８（３，２）　１，２３６（２，８）　３６，６９５（２，９）　４，０７ ３（１，７）ＣＴ＾＃２　ｐ３６　４３０（１，０）　４３Ｂ（１，０）　１７ ，９０７（１，４）　２，７９６（１，１）ＣＴ＾＃２　ｐ３２　５２２（１， ２）　５８１（１，３）　２１，３９１（１，７）　２，６９３（１，１）（ｂ ）：Ｃ，Ｐ、Ｍ、は、毎分あたりのカウント数の３つの測定値の平均：Ｓ。

■、は被検抗原存在中の細胞のＣ，Ｐ、Ｍ、をニトロセルロース対照存在中の細 胞のＣ，Ｐ、Ｍ、で除算することによって決定した刺激指数。

（ａ）：患者ＷＯＲ，ＫＥＨ及びＲＯＢから得られた１０５／ウエルのクローン 化したＴ細胞を、Ｘ線照射しＥＢＶで形質転換させた５Ｘ１０５の自速性Ｂ細胞 、１単位のＩＬ−２／ｍｌ、及び、ニトロセルロースに固定した１０μｇ／ｍｌ の試験抗原と共に、６日間インキュベートし、１゜ＯμＣｉの〔３Ｈ〕−メチル チミジンでパルスし、採取し、カウントした。

１、　Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、、　ＣＡ　（１９８３１３３：９−２５゜ ７、　Ｍａｇｎａｎｉ、Ｊ、Ｌ、肱ａ１．．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ−（１９８３１ ４３：５４８９”５４９２゜８、　Ａｒｔｉｇａｓ、　Ｃ，ａｔ　ａｌ、、　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（１９８６）　４５：１８７４−１８８１゜９；　Ｂｌ ａｓｚｃｚｙｋ、Ｍ、−ｅｔ　ａｌ＝、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　′（１９８４１ ４４：２４５−２５３゜１０、　Ｒｏｓｓ、　Ａ、Ｈ−、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉ 、ｏｃｈｅｍ、　里亜匠ＬＲｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　（１９８６１１３５：２９７ −３０３゜ １１　Ｈａｓｐｅｌ、　Ｍ、Ｖ−ｅｔ　ａｌ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　（１ ９８５）　４５：３９５１−３９６１、峰−−Ａ　Ｊ８６ □Ａ２８０ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　５ ａｂｃｄｅｆＲ ７ぐドア°°２−７ ＦＩＧ、　６ａ ／ｌ奉持ｗｒ向（分２Ａ木竹雪向（分ジＣＴＡＡ　＊　２８Ａ３２−５０Ｋ　Ｃ ＴＡＡ会２８Ａ３２−４６にＦＩＧ、　６ｂ ＦＩＧ、　７ ”Ｘ　：：ｎＡｓ１７−アｊ　／　ａ　Ｌ　”５９１，１・８　’ｇｈＸ＞　ｆ ｚ　。

票」１ 本発明は、ヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２によって認識されるエピトープを 提供し、また、本発明によってその同定、単離及びキャラクタリゼーションに成 功した上記エピトープを含むヒト腫瘍抗原、及びヒトＭＣＡ　２８Ａ３２を提供 する。本発明はまた、癌の診断のため及び治療をモニターするためにこのエピト ープを含む抗原に対する抗体を使用すること、及び、このエピトープを含む腫瘍 細胞に対して得られた免疫応答と同機の免疫応答を生じさせるワクチンを調製す るためにこの抗原を使用することを目的とする。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ３８、ＣＣＬ２３４、ＣＣＬ２３７、ＣＣＬ２３０及 びＣＣＬ２２９を夫々有する結腸癌細胞系ＨＴ−２９、ＳＷ１４６３、ＳＷ９４ ８、ＳＷ４０３及びＬｏＶｏと、Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｈｉｌ ａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡから入手できるＷｉＤｒに共通の腫瘍関連抗原 で検出される、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８９４５を有するヒトモノクローナル抗体 ２８Ａ３２に対して免疫応答性のヒト腫瘍細胞エピトープ。
2. ２．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定された分子量５０Ｋ、 ４６Ｋ、３６Ｋまたは３２Ｋを有する請求項１に記載のヒト腫瘍細胞エビトープ 及びヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２に対して免疫反応性のサブユニットを含 むヒト腫瘍細胞抗原。
3. ３．哺乳類被検体中で請求項１に記載のエピトープを含む抗原を有する腫瘍細胞 の存在を検出する方法であって、前記被検体から採取した標本を前記エピトープ に対する抗体を含む試薬と反応させ、得られた抗体／抗原免疫結合体を検出する ステップを含む方法。
4. ４．被検体がヒトであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. ５．試薬がヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２であることを特徴とする請求項３ に記載の方法。
6. ６．請求項３に記載の方法によって腫瘍細胞の存在を検出し、腫瘍細胞の量を決 定するステップを含む癌療法のモニター方法。
7. ７．試薬がヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２であることを特徴とする請求項６ に記載の方法。
8. ８．請求項１に記載のエピトープを含む免疫原で動物を免疫感作し、前記エピト ープに対する抗体を産生する細胞を単離し、単離した細胞を不死化することによ って産生された抗体。
9. ９．免疫原性的に有効量の請求項２に記載の抗原を含むワクチン。
10. １０．ヒトモノクローナル抗体２８Ａ３２によって動物を免疫感作することによ って産生された抗イディオタイプ抗体を含む請求項１に記載のエピトープ。
11. １１．請求項１０に記載の抗イディオタイプ抗体を含む抗イディオタイプワクチ ン。
12. １２．請求項２に記載の抗原に対する抗体と、検出可能ラベル及び細胞障害性化 合物から成るグループから選択された化合物とを含む免疫化学試薬。