JPS61502233A - ヒト細胞の部分集合の分別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト細胞の部分具合の分別 発明の背景 誘発Ｆ！Ａはモノクローナル抗体に関するものである。

ハイプリドーマ技術における最近の開発は、ヒトＴ細胞を２個以上の機能的に異 なる下位集団に分割しうろことを示している。たとえば、ライネルッ等、セル、 第１９巻、第８２１頁（１９８０）及びラインへルッ等、イミュノロジー・ツデ ィ、第４巻、第６９頁（１９８１）は、成る種のＴ細胞外部集合が誘発剤機能を 有するのに対し他の部分集合が抑制剤機能を有することを示す研究を記載してい る。他の研究は、主たるＴ細胞部分集合の隣及びその内部において特定の作用剤 機能の発生に際し、連携した相互作用が生ずることを示している〔エバンス等、 ジャーナル・イミュノロジー、第１２０巻、第１２４３頁（１９７８）；モリモ ト等、ジャーナル・イミュノロジー、第１°２８巻、第１６４５頁（１９８２） ；トーマス等、ジャーナル・イミュノロジー、　第ｔ　２５巻、第２４０２頁（ １９８０）；ガテンビー等、ジャーナル・エキスベリメンタル・メソッド、第１ ５６巻、第５５頁（１９８２）；及びヤッチ等、ジャーナル・イミニノロジー、 第１２９巻、第１０５頁（１９ａ２））。免疫恒常性の維持には調節機構が必須 であるため、部分集合間における相互作用の理解が極めて重要である。

主たるＴＭ胞群Ｔ４及びＴ８には機能異質性と表現型異質性との両者が存在する ことが示されている〔トーマス等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２５巻、 第２４０２頁（１９８０）；モリモト等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２ ８巻、第１６４５頁（１９８２）；ガテンビー等、ジャーナル・エキスベリメン タル・メソッド、第１５６巻、第５５頁（１９１３２）；及びツインへルツ等、 ジャーナル・イミュノロジー、第１２６巻、第６７頁（１９８１））。たとえば 抗原、ヤマゴボウのミトゲン又は自己白血球反応促進系におけるＩｇＧ産生の抑 制を誘発するには、Ｔ４細胞とＴ８細胞との下位集団間で相互作用が必要とされ る。同様に、混成白血球反応におけるグレ＃Ｉ胞毒性Ｔ８リンパ球からのＴ８細 胞毒性作用体の分化には、Ｔ４細胞の存在を必要とすることが示されている。

多数のモノクローナル抗体及び自家抗体が開発されて、これら細胞の主たる集団 内において異質性の最初の表現型規定を与えている。モリモト等、ジャーナル・ クリニカル・インベスチゲーシフン、第６７巻、　第７５５頁（１９８１）は、 急性の若年性リューマチ関節炎（ＪＲＡ）を有する何人かの患者で見出された天 然の抗−Ｔ細胞抗体を使用して、Ｔ４細胞をヤマゴボウのミトゲ／及び抗原促進 免疫プロプリンの産生につきヘルパー集団（Ｔ４ＪＲＡ−）とサプレッサー下位 集団（Ｔ　ａ　ＪＲＡ＋）の誘発体に分割することを記載している。同様に、ラ インヘルツ等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８巻、第４６３頁（１９８ ２）は、Ｉａに対する抗体を使用してＴ４細胞をＴ４１ａ＋及びＴＡＩａ−の部 分集合に分割することを記載しており、これら画部分集合はＢ細胞による最適な Ｉｇ分泌を誘発するのに必要とされた。

発明の要点 一般に本発明は、４ｉ数のヒトミ３胞、好ましくはたとえばＴ４Ａａ胞のような ’１１胞における部分集合の分別方法をｖｉ依とし、この方法はたとえば中ヌザ ル又はチンパンジーのＴｉａ胞のような非ヒト霊長動物の細胞に対するモノクロ ーナル抗体を産生させ、このモノクローナル抗体をヒト細胞と接触させ、かつモ ノクローナル抗体に対する反応性の種々異なる程度に基づいて部分集合を分別す ることからなっている。

本発明の方法は、ヒト細胞における見掛上同質の集団（すなわち「集合」）を独 特な下位集団（すなわち「部分集合」）に分割することを可能にする。Ｔ細胞の 場合、部分集合へのこの分割は、Ｔ細胞が関連するたとえば若年性リューマチ関 節炎（ＴＲＡ）、ショーグレン病及び全身型紅斑性狼＃（ＳＬＥ）のような特に 自家免疫病における罹患性の標識として使用しうる多形性決定子の存在と相関関 係を有する。さらに、Ｔ４細胞の同質と思われる集団を機能止具なりうる部分集 合に分割できるという事実は、たとえばＪＲＡ及びＳＬＥのよう力病気に存在す るがＴ４細胞の簡単な測定とは相関しないような臨床パターンの点で著しい異質 性を説明するのに枚位つ。

したがって、非ヒト霊長動物細胞による免疫化は、たとえ２種の部分集合が集合 を規定する異なるモノクローナル抗体（たとえばＴ４細胞と高度に反応するがＴ ８細胞とは殆んど反応性を示さない抗体）に対しほぼ同程度の反応性を示すとし ても、ヒト細胞群の第１部分集合についてはｔｓ２の部分集合に対するよりも大 きい程度に反応するモノクローナル抗体を産生させることができる。

好ましくは、ヒト細胞はリンパ球、たとえばＢ細胞又はたとえばＴ４若しくはＴ ８細胞のよさなＴ細胞である。

非ヒト霊長動物細胞での免疫化によりさらに利点が得られることが突き止められ た。その理由はまだ明らかでないが、ヒト及び非ヒト霊長動物の細胞に共通の抗 原決定子は、しばしはヒト細胞に比較して非ヒト細胞に提供した場合ゲツシ動物 たとえばネズミにおいてより大きい免疫性を示すことができる。これは、恐らく より高度な抗原配列における非ヒト細胞に対する決定子の発現により、非ヒト霊 長動物細胞につき幾つかの決定子の免疫性が相対的に大きいためであろう。この 知見は、決定子を同様に有する非ヒ）Ｗ長動物細胞での免疫化により、ヒト細胞 において重要であるが抗原性の弱い決定子に対しモノクローナル抗体の産生を増 大させることを可能にする。

第１図を参照して、ヒト細胞の集合を部分集合まで分割しさるモノクローナル抗 体を産生ずるため非ヒト霊長動物細胞を使用する方法は、次のように部分集合の 一方に対し特異性であるモノクローナル抗体を産生させるべく追加工程で行なう ことができる。非ヒト霊長動物由来のモノクローナル抗体を使用して、ヒ）Ｔ４ 細胞の２種の異なる部分集合（一方の部分集合は抗体に対し反応性が大きくかつ 他方は反応性が小さい）を同定した後、同定されたこれら部分集合の一方（すな わち反応性の大きい部分集合）を使用して、複数のハイプリドーマを生産するよ うネズミを免疫化することができ、次いでこれらハイプリドーマにより産生され たモノクローナル抗体を免疫化用部分集合及び他の部分集合に対しスクリーニン グすることができる。他の部分果合に対するよりも免疫化用部分集合に対し大ぎ い反応性を有する抗体は、これら２種の部分集合を区別する多形性表面構造を形 成する。

この種の抗体は、免疫化用部分集合により生ずる又は悪化する病気、たとえばＴ ＲＡの診断及び（又は）処置に有用であろう。診断は、螢光染料と結合した抗体 に対する細胞の反応性を測定するための流動血球計数法を用いて行なうことがで きる。病気を処置するには、この抗体を細胞毒性剤に化学結合させて、これを病 気に罹った患者に投与することができる。この抗体は病気の原因となる細胞に特 異的に結合してこれを破壊するが、正常細胞は破壊しない。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の好適実施例の説明及び請求の範囲の記載か ら明らかとなるであろう。

先ず図面につき説明する。

図面 第１図は上記抗体産生法の流れ図であり、第２図は本発明の抗体とヒトＴ細胞と の反応性を示す一連のグラフであり、 第３図は各種の細胞及び細胞組合せによる誘発を示す棒グラフである。

この方法における第１工程は、細胞を免疫化用に使用する非ヒト霊長動物細胞を 選択することである。霊長動物の選択は、その霊長動物がヒトとはどの程度に系 統発生的に隔たっているかに部分的に依存する。この系統発生的な隔たりは、一 般にヒトからのモノクローナル抗体に対する霊長動物細胞の反応性に反映され、 る。

下記第１表は、Ｂａ１ｂ　／　Ｃ若しくはＣＡＦｌねずみを免疫化して産生され たモノクローナル抗体を有する各種動物のＴ細胞と、各種のヒ）Ｔ細胞部分集合 との反応性を示している。系統発生的にヒトに近いチンパンジーの細胞は全ての ヒト細胞由来の抗体と反応するが、隔たりのあるキツネザルの細胞は反応しない 。一般的なキヌザルのＴｌＩＩＩＢ胞は、Ｔ４Ａ及びＴＲＡと反応するが、他の 抗体とは反応しない。

第　１　表 サプレッサ／細胞毒性　ヘルパー／誘発性ＴＴ細胞決定子　細胞決定子 動物種類　Ｔ８　Ｔ５　ＴＲＡ　Ｔ０ｎ　Ｔ２ＯＴ４　Ｔ４Ａ　Ｔ４ｎ　Ｔ４Ｃ ヒト　２５±４＊２叱Ｈ２５±４２５±４２５±４４１±２４１仕り　４１±２ ４１七チンパン ジー　５１　３９七　４６±６５４±４５６±５　２７　３５　５２　３１±４ テナガザ ル　５４±１１４０±５　５５−１：１０　５１±８５１±１０２５±１　２１ ±４１９±４〈２台湾岩ア カゲザル２３＋８２０±４（５２７±８２８±７２８±１０２にヒＯ（２１１± ６ヨザ＃　（５２６±３（５（５７±２　（’２　４５±０４３±１〈２一般的 キ ヌザル　＜ｓ　＜ｓ　２１’：ｌ＝２＜５　＜５　＜２　４２±４　〈２　７ガ ラゴ　＜５　＜５　＜５　＜５　＜５　＜２　＜２　＜２　＜２ル　Ｎ、Ｔ、　 Ｎ、Ｔ、Ｎ、Ｔ、　Ｎ、Ｔ、Ｎ、Ｔ、　＜２　＜２　＜２　＜２＊　データはＰ ＨＭ染色陽性士Ｓ、Ｄ、のチとして示わす。

非ヒト霊長動物のＴ細胞を次のように免疫化用に使用することができる。最初に 、細胞をフィコール−ノーイノくり及びｍ［勾配遠心分離によってヘパリン処理 血液から分離する。次いで、キネザルの細胞をＱ、１５°ＭのＮＨ，ＣＩで処理 して赤血球を溶解させ、洗浄し、燐酸塩緩衝塩水中に再懸濁させ、そして免疫化 用に使用すると共にその後のスクリーニング用に凍結する。

次いで、Ｂａ１ｂ　／　Ｃ若しくはＣＡＦ１ネズミを標準法によりこれら細胞で 免疫化する。得られた牌細胞をＰＥＧ中にてＰ３／ＮＳＩ／１−ＡＣ３−１骨髄 朧細胞と融合させる。次いで、免疫化用細胞と反応するがと）ＴＭ脂またはＢ細 胞系とは反応しないハイブリドーマ培養上澄を選択し、これら細胞系をクローン 化させ、かつ標準技術により供給細胞の存在下で制限希釈により再クローン化さ せる。

最初のスクリーニングは、霊長動物Ｔ細胞と反応するがヒ）　Ｂ　ＩＪンパ球と は反応しない抗体を同定することを意味する。その後のスクリーニングは、新た に単離されたＴ４細胞、Ｔ４ＪＲＡ−ＴＱ１＋、Ｔ　ａ　Ｊ　ＲＡ　−ＴＱｌ− Ｔ８細胞、Ｔ４細胞毒性系、Ｔ８細胞毒性系、Ｔ４４部特異性誘発Ｔ細胞系、サ プレッサーＴ細胞系のＴ４抗原特異性誘発体、Ｔ８サプレッサー系、及び新たに 単離された活性化Ｔ細胞を包含する多数のヒトＴリンパ球に対するこの種の抗体 の特性化に関係する。誘発体又はサプレッサー集団の１部とは反応するがヒ）Ｂ リンパ球、Ｂ細胞系、骨髄細胞及び骨髄系とは反応Ｕない抗体を単離する。

次いで、この種の抗体を使用して、Ｔ４若しくはＴ８集団を各部分集合からの細 胞がこの抗体と反応する程度に基づいて部分集合まで分割する。これら異なる反 応性は、Ｔ４若しくはＴ８を規定する単一表面抗原の構造に多形性エピドーグが 存在するか、或いはＴ４及びＴ８集団を規定するこの種の表面抗原の群（この抗 原群は異質性を示す）が存在することを示す。いずれの場合にも、多形性又は異 質性を、霊長動物由来のモノクローナル抗体を用いて検出することができる。免 疫調節性部分集合における各種の異常が多数の自家免疫病に存在すれば、多形性 決定子若しくは独特な部分集合のいずれかを規定することが極めて重要であるこ とが証明でき、ただしＭＨＣ複合体の構造における変化が罹患性を予測するのに 重要であるという証拠が存在するものとする。

Ｔ４及びＴ８細胞集団の下位群と反応する抗体は、次のようにして間接的免疫螢 光性によって特性化される。

約１０６個の細胞をハイプリドーマ上澄若しくは腹水のいずれかと一緒に培養し 、４℃で充分洗浄し、次いでＦＩＴＣ抗−ネズミＩｇＧ　で染色する。次いで、 螢光性抗体で被覆した細胞をＦＡＣ−Ｉ型、ＥＰＩＣ８−Ｖ型又は同様な装置で 分析し、反応性細胞の個数を正確に定量測定することができる。

抗−２Ｈ４ 抗−２Ｈ４と命名した特定の抗−霊長動物細胞のモノクローナル抗体を、下記の ように標準技術を用いて産生させた。

ＢＡＬＢ／ｃＪネズミ（￥イン州、バー・ハーバ−在、ジャクシン・ラボラドリ ース社）をワタゲシシザル（サキヌス・エデイプス（５ａｑｕｉｎｕｓ　ｏｅｄ ｉｐｕｓ　）　、すなわち草食性の新大陸霊長動物からのＴリッツ球細胞で免疫 化した。この動物からの末梢血液リンパ球を試験管内にてＰＨＡで刺戟し、次い でＴ細胞成長因子と共に連続培養状態に維持した。ヒ）（Ｅ＋）細胞に対し反応 性である抗体を含有するノ・イブリドーマ培養物を選択し、クローン化させ、そ して供給細胞の存在下に制限希釈法で再クローン化した。Ｅ子細胞は、Ｔ細胞由 来の抗体を非Ｔ細胞由来の抗体から分離しうろことが知られている。次いで、悪 性腹水を発生させて、これを分析に使用した。このモノクローナル抗体抗−２Ｈ ４は、フルオレシン標識したヤギ抗−ネズミＩｇＧ　（バージニア州、スプリン グフィルド在、メロイ・ラボラドリース社）での染色の特異性により、或いはネ ズミ免疫グロブリンの他の種類に向けられるフルオレシン標識した抗体で染色し えないことにより、ＩｇＧ　１同型であることが示された。

ヒトＥ＋リンパ球を抗−Ｔ４若しくは抗−Ｔ８モノクローナル抗体及びウサギ相 補体（Ｃ）（ペルーフリーズ・バイオロジカルス社）で処理した。２Ｘ１０’個 の細胞量を１−の抗体と共に１：２５０希釈にて室温で１時間培養し、次いでＩ ］、３ｔｔＬｔのウサギＣを混合物へ添加した。

この混合物を３７℃の振とり水浴中でさらに１時間培養し、洗浄し、そして残存 細胞を３７℃で１晩培養した。

抗−Ｔ４及びＣで細胞を溶解させた後、残存細胞の９０チより多くがＴ８＋細胞 であり、かつ５チ未満がＴ４＋細胞であった。抗−Ｔ８及びＣで溶慣させた後、 残存細胞の９０％より多くがＴ４＋細施でありかつ５チ未満がＴ８＋細胞であっ た。これら２種の集団を本明細書においてそれぞれＴ８＋集団及びＴ４＋集団と 呼ぶ。

離 Ｔ４＋のＴ細胞を２Ｈ４＋及び２Ｈ４−の下位集団に分離するため、１晩培養し たａｏｘ１ｏａ個のＴ４＋細胞を抗−２Ｈ４の１／　２５０希釈物４−で標識し 、かつフルオレシン結合したＦ（ａｂ’）、ヤギ抗−ネズミＦ（ａｂ’）ｔで発 色させた。

細胞集団の細胞螢光分析は、７／Ｉ／オレシン結合したＦ（ａｂ’）ｔヤギ抗− ネズミＦ（ａｂ’）ｇでの間接的免疫螢光性によりエビツクス■セル型選別器（ クールター・エレクトロ二ックス社）にて行表った。バックグランドとしての螢 光反応性は、非分泌性バイブリド−！クローンで免疫化したネズミから得られた 比較腹水によって決定した。分析のため、全てのモノクローナル抗体を１／２５ ０〜１／１０００の希釈で過剰の抗体にて使用した。

この過程はＴ４＋細胞の２種の部分集合、すなわち抗−２Ｈ４に対し高い反応性 を示す部分集合（「２Ｈ４＋Ｊと命名）及び抗−２Ｈ４に対し低い反応性を示す 部分集合（ｒ　２Ｔ（４−Ｊ　’）を産生じた。

全ての場合に、選別後の生存率はトリバンブルー排析により９５チより多かった 。分離したＴｍ胞部分集合の純度は９５チ以上であった。

抗　２Ｈ４の特性化 第２図は抗−２Ｈ４モノクローナル抗体を用いた未分別Ｔ、Ｔ４＋及びＴ８＋細 胞の細胞螢光グラフ分析を示し、対数尺度で示されている。第２図に示したよう に、抗−２Ｈ４は４２±４チ（平均上ＳＥ％ｎ＝２０）の末梢血液ヒトＴリンパ 球に対し反応性であり、かつ４１±５％（平均上ＳＥ、ｎ＝１５）のＴ４＋Ｔリ ンパ球及び５４±４１％（平均上ＳＥ、ｎ＝１５　）のＴ８＋Ｔリンパ球に対し 反応性であることが判明した。したがって、２Ｈ４＋Ｔ細胞はＴ４＋とＴ８＋と の両下位集団に見出された。

他のヒトリンパ細胞及び細胞系に対する抗−２Ｈ４抗体の反応性を下記第２表に 示す。抗−２Ｈ４はＳＯチを越える末梢血液Ｂ細胞とゼロ細胞との両者に対し反 応性であり、付着技術により得られたマクロファージに対し僅かのみ反応性であ り、かつ胸腺リンパ球に対し非反応性であることが判明した。さらに、抗−２Ｈ ４は試験した４種のヒ）Ｔ細胞系のうち５種に対し非反応性であり、試験した４ 種のＴ細胞系のうち最も成熟したＪＭ細胞系に対し弱い反応性を示した。さらに 、第２表におけるデに制限されなか゛つたことを示している。４種のリンパ繊維 芽Ｂ細胞系及び２椎のバーキットリンパ種糸も抗−２Ｈ４との反応性を示した。

さらに、試験した３種の造血細胞系のうち、２種の細胞系、すなわちＵ−９３７ 及びＫＧＩが抗−２Ｈ４に対し反応性であった。これらの結果は、抗−２Ｈ４の 反応性がＴ系列の培養細胞系のみに制限されないことを示唆し、寧ろ非Ｔ細胞も 抗−２Ｈ４反応性である。

第　２　表 ヒトリンパ系及び細胞系１に対する抗−２Ｈ４抗体の反応性１、リンパ細胞 Ｂ細胞　十 ゼロ細胞　十 Ｍ（５± ■、　胸腺細胞　− ＩＶ、Ｂセル細胞 ■、　造血細胞系 ａ：抗−２Ｈ４抗体の反応性は、チトグラ７における間接的免疫螢光性によって 決定した。（−）はバックグランド比較よりも５％高い反応性を示し、（±）は ５〜３０チの反応性を示し、（±）は３０チの反応性を示す。

未分別Ｔ４＋のＴＩ＠胞及びＴ４＋２Ｈ４−のリンパ球の増殖反応 Ｔ４＋細胞の２Ｈ４＋又は２Ｈ４一部分集合における各員につき、種々異なる条 件下で機能上特徴的な増殖反応を相関させるため次の手法を行なった。

Ｔｉ１ｔ！胸をＲＰＭ１１６４０培地中で１０％のヒトＡＢ血清、２００ｍＭの Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（マイクロバイオロジカル・アソ シエーツ社）、α５チの重炭酸ナトリウム及び１チのペニシリン−ストレプトマ イシンと共に培養した。はクロ培養穴１個当り１０１個の細胞を、フィトヘマグ ルチニン（ＰＥＡ）（ノースカロライナ州、リサーチ・トライアングル・パーク 在、バラ−ウェルカム・カンパニー社）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（カ リホルニア州、サン・ジエゴ在、カルビオケム社）の最適投与量に対する増殖反 応につき試験した。アロ抗原促進された増殖反応系を刺戟して同時に測定した。

破傷風毒素（マサチューセッツ州、ジャマイカ・プレイン在、パブリック・ヘル ス・バイオロジカル・ラボラドリース社のマサチニーセツツ部門）及び耳下腺炎 抗原（マイクロバイオロジカル・アンシエーツ社）に対する増殖を、それぞれ１ ０μｇ／−の最終＃度及び１：２０の希釈にて試験した。マクロファージを全て のリンパ球集団に対し試験管内培養の開始時点に５チ最終濃度で加えた。ミ）ゲ ン刺戟された培養物を、セル穴部１個当りα１５μＣ１のトリチウム化したチミ ジン（Ｈ”−ＴｄＲ）（ｔ　９Ｃｉ／ｍＭ特異活性）にューヨーク州、オレンジ バーク在、シ３−　／＜ルツーマン社）で４日後に刺戟し、１６時間培養した後 これら細胞をマツシュ■屋装置（マイクロバイオロジカル・アソシエーツ社）に て収穫し、セしてＨ”−ＴｄＲ組込みをパラカード・シンチレーション・カウン ター（イリノイ州、ダウナース・グローブ在、バラカード・インストルメント・ カンパニー社）にて測定した。パックグランドとしてのＨ”−ＴｄＲ組込みは、 ミトゲンの代りに培地を使用して得た。可溶性かつ細胞表面のアロ抗原促進され た培養物を、５日後にＨ”−ＴｄＲで１６時間刺戟し、収穫しかつ上記と同様に 計数した。

下記第５表に示したように、Ｃｏｎ　Ａ及び可溶性抗ぷに対する反応の差が、Ｔ 　４＋２Ｈ４＋及びＴａ＋２Ｈ４−のＴ細胞集団に見られた。Ｃｏｎ　Ａに対す る反応において、Ｔａ＋２Ｈ４＋のＴ細胞はＴａ＋２Ｈ４−集団よりも著しく多 いＨ”−ＴｄＲを組み込んだ。たとえばＴＴ及び耳下腺炎のような可溶性抗原に 対する反応において、Ｔａ＋２Ｈ４−のＴ細胞はＴａ＋２Ｈ４＋のＴ細胞集団よ りも顕著に多いＨ”−ＴｄＲを組み込んだ。Ｔａ＋２Ｈ４＋集団とＴａ＋２Ｈ４ −集団との増殖反応性におけるこれらの差は有意であった（Ｐ＜０．０５）。こ の結果は、可溶性抗原に反応する主たる増殖活性がＴ　４＋２Ｈ４−のＴ細胞集 団に見られかつＣａｎ　Ａに反応する主たる増殖活性がＴａ＋２Ｈ４＋のＴ細胞 集団に見られることを示唆している。

＆：数値は３反復試料の平均上ＳＥＭとして表わす。

ｂ　：Ｔ４＋２Ｈ４＋ＴＭ胞とＴ４＋２Ｈ４−’ｒ細胞との間の９５チ信頼限界 に基づく有意差（ｐ　ｃＬｏ　ｓ　）。

Ｂ細胞免疫グロブリンの産生に対するＴ細胞の役割がＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ ４＋２Ｈ４−のＴ細胞部分集合に制約されるかどうかを決定するため、未分別Ｔ ４＋のＴ細胞又はＴ４＋２Ｈ４＋及びＴ４＋２Ｈ４−細胞を自己Ｂ　リンパ球と 混合し、試験管内でＰＷＭによって刺戟し、かつ全ＩｇＧ産生を培養物中で７日 後に測定した。

リンパ球の未分別及び分離集団を、丸底微小培養プレート（ファルコン社）にて ３７℃で５チのｃｏ、を有する湿潤雰囲気中にて２０％の加熱失活させた子牛血 清（Ｙイクロバイオロジカル・アソシェーツ社）、（１５％の重炭醸ナトリウム 、２００ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１％の、ペニシリン −ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭ１１ｓ４ｏ中で７日間培養した。自家 血漿細胞によるＩｇＧの分泌に対するＴ４細胞の各種部分集合の効果を決定する ため、種々の個数の未分割Ｔ４＋Ｔ細胞又は精製したＴ４＋２Ｈ４＋及びＴ４＋ ２Ｈ４−のＴ細胞部分集合を、１ｄの容量で５×１０４個のＢ細胞に加えた。こ れに（Ｌｌ−のヤマゴボウミトゲン（ｐｗＭ）にューヨーク州、グランドアイラ ンド在、ギプコ・ラボラドリース、グランド・アイランド・バイオ四ジカル・カ ンパニー社）を１：５０希釈にて加えた。全ての集団にマクロファージを試験管 内培養の開始時点で５％最終濃度にて加えた。７日目に培養を停止させ、上澄を 収穫し、かつ上澄中へのＩｇＧ分泌を固相放射免疫分析（ＲＩＡ）により測定し 、その際ヒト１重＠（抗−ＦＣ）（ダナ・ハーバ−・カンサー・インスティチュ ートのＶ、ラソ博士による寄贈）のＦＣ部分に対するモノクローナル抗体を使用 した。

第２図に示したように、凰独で培養するとＢ細胞も未分割Ｔ４＋Ｔ細胞も選別し たＴ十部分集合もＩｇＧを分泌しなかった。これに対し、未分割Ｔ４＋Ｔ細胞と Ｂ細胞とを混合しかつＰＷＭと共に培養すると、培養物上澄１１１ｔ当り１４４ ００±９００　ｎｇのＩｇＧが分泌された。

抗−２Ｈ４と一緒にＴ４＋Ｔ細胞を培養しても、Ｂ細胞に与えられるこれら細胞 の役割に何の作用も示さなかった。

等しい個数のＴ４＋２Ｈ４＋細胞とＴ４＋２Ｈ４−細胞とを加えて自家Ｂ細胞の 培養物を分離すると、Ｔ４＋２Ｈ４−のＴｍ胞部分集合により誘発されるＩｇＧ 分泌はＴ４＋２Ｈ４＋とＢ細胞との組合せで得られるよりも約１０倍大きかった （２７５００±１８００ｎｇ対２４００±１２０ｎｇ）。さらに、Ｂ細胞のＩｇ Ｇ産生につきＴ４＋２Ｈ４＋及びＴ４＋２Ｈ４−のＴａ胞により与えられるヘル パー機能の定量的比較（下記第４表）は、Ｔ４＋２Ｈ４−のＴ細胞のヘルパー効 果が試験したＴ細胞及びＢ細胞のいかなる個数においてもＴ４＋２Ｈ４＋のＴ細 胞におけるよりも著しく大であることを示した。

したがって、Ｂ細胞によるｐ　Ｗ　Ｍ　Ｉｃ反応する抗体産生のヘルパー活性の 大部分が細胞のＴ４＋２Ｈ４一部分集合に見られ、かつＴ４＋２Ｈ４＋はこの相 互作用において最小のヘルパー効果であった。

第　４　表 Ｂ細胞のＩｇＧ産生にっきＴ４＋２Ｈ４＋及びＴ４−）−２Ｈ４−のＴ細胞によ り与えられるヘルパー機能の定量的比較 Ｂ　（５Ｘ１０’　）’　３ｄＯｂ　１６ｏ６４０　２４０Ｂ　（５ｘ１（７″ ）　＋Ｔ４＋２Ｈ４＋　（５Ｘ１０’　）　８８０　１４０　１６ｏａ　２０８ Ｇ＋Ｔ４＋２Ｈ４＋　（ＩＸ１０’　）　２０００　７２０　８８０　２８００ ＋Ｔ４＋２Ｈ４＋（２Ｘ１０’）　１６００　１５０　９６０　２８８０＋Ｔ４ ＋２Ｈ４＋（４Ｘ１０’）　２４００　４８０　１７６０　４１６０Ｂ　（５Ｘ ＩＧ’）　＋Ｔ４＋２Ｈ４−（５Ｘ１０’）　１４４００２０００　１４００　 １６０００＋Ｔ４＋２Ｈ４−（ｊＸ１０’）　２０４００７８００　８０００　 ２４０００＋Ｔ４＋２Ｈ４−（２Ｘ１［７’　）　３２０００１０８００１２０ ００２００００＋Ｔ４＋２Ｈ４＝　（４Ｘ１０’）　２４４００２１（５００８ ４００２４０００Ｔ４＋２）！４＋（５Ｘ１０’）　２００　１００　２００　 １５０Ｔ４＋２Ｈ４−（５Ｘ１ｒ）　２００　１００　２００　１５０ａ：括弧 内に示した数字は、培養物に加えた各集団のリンパ球の個数を示す。

ｂ＝数値は３反復試料の平均ｎｇ／―として示す。

ＳＥＭは常に１０％未涜であった。

サプレッサー作用細胞の発生に対するＴ４＋２Ｈ４−細細胞のこれらＴ　、ａ　 ＋　２　Ｈ４＋及びＴ４＋２Ｈ４一部分集合がサプレッサ機能の発生に何らかの 作用を示すかどうかを決定するため次の手法を行なった。

種々異なる個数のＴ４＋２Ｈ４＋又はＴ４＋２Ｈ４−細胞を一定数のＢ細胞（ｓ ｘ１ｏ’）、Ｔ４＋２Ｈ４−若しくはＴ４＋２Ｈ４＋のＴ細胞（２×１０番）及 びＴ８ｍ胞（１×１０４）へＰＷＭの存在下で加えた。下記第５表及び第６表に 示したようにＢ細胞、Ｔ４＋２Ｈ４−細胞及びＴ８細胞の一定個数に加えるＴ４ ＋２Ｈ４＋細胞の個数を増大させると、ＩｇＧ産生の抑制が増大することが観察 された（　４８００　ｎｇ対５００　ｎｇ、　３２０００ｎｇ対５０００　ｎｇ 、　２４０００　ｎｇ対４８００　ｎｇ　）。

これに対し、Ｔ４＋２Ｈ４＋のＴ１ｍ１胞の添加個数を増大すると、ＩｇＧ産生 の増加をもたらした。これらの結果は、Ｔ４＋２Ｈ４＋のＴ細胞がＴ８＋のＴ細 胞を活性化し又は誘発してサプレッサー作用細胞となることを示唆している。

第５表 サプレッサー作用細胞の発生に対するＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４一部 分集合の効果 Ａ、Ｂ（５Ｘ１♂） ＋Ｔ４＋２Ｈ４−）（２Ｘ１０’）　０　３０００ｂ　７２０　４２００ｓｘ１ ｏ”　２ｓｏｏ（２３）（’　２ｓｓ（６ｏ）　４０００（５）１ｘ１ｏ’　５ ６ｏ（ａｌ）　８８Ｂ（０）　２４８０（４１）２Ｘ１０’　２８０（９１）　 ２００（７２）　５００（８８）４Ｘ１０’　５（１００）　２８ｏ（ｓｌ）　 １４０（９７）Ｂ、Ｂ　（ｓｘ１ω） ＋Ｔ４＋２Ｈ４−（：２Ｘ１（１’）　０　１５４００　１８００　２６０００ ５Ｘ１０’　３３２００（０）　２８００（０）　４００００（０）ＩＸ１０’ 　２１６００（０）　５０００（０）　３６ｏｏｏ（ｏ）２Ｘ１（１’　１５６ ００（０）　２１６０（０）　１ｓｓｏ、ｏ（ａｏ）４Ｘ１０’　８０００（４ ７）　１２４０（！＋１）　５６ｏｏ（７ａ）＆：Ｓ、々異なる個数のＴ８＋Ｔ 細胞を一定数のＢ細胞（ｓｘｔｏ’）に添加し、かつこれに分別したＴ４＋２Ｈ ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４−Ｔ細胞（２Ｘ１０’）をＰＷＭの存在下で加えた。

金ＩｇＧ産生を７日後に測定した。

ｂ：数値は５反復試料の平均ｎ　ｇ　／　ｔｘｌとして表わす。

ＳＥＭは常に１０％未満であった。

Ｃ：括弧内の数値は次式にしたがって計算した抑制チに等しい： 第６表 効果的サプレッサー機能につきＴ４＋２Ｈ４＋Ｔ細胞はＴ８＋Ｔ細胞を誘発し又 は活性化する Ｔ４＋２Ｈ４＋の添加 Ａ、Ｂ＋ Ｔ４＋２Ｈ４−＋Ｔ８　０　４８００ｂ　５２０００　２４０００５Ｘ１０”　 ２０００（５８）　ｚ６ｏｏｏ（１９）　１８０００（２５）ＩＸ１０’　４０ ００（１７）　１４ｏｏｏ（ｓｓ）　１ｔ４ｏｏ（３ｚ）２ｘｔｏ’　１ｓｏｏ （６３）　１１ｏｏｏ（６６）　４８００（８０）４Ｘ１０’　５ｏｏ（９４） 　５０００（８４）　Ｎ、Ｄ。

Ｔ４＋２Ｈ４＋　＋Ｔ８　０　２００．　５４０　４２０ｓｘ１ｏ”　８００（ ０）　４０００（０）　２４ｏＯ（ｏ）１×１♂　１６ｏｏ（ｏ）　５２００（ ０）　４６ｏｏ（ｏ）２×１が　２０００（０）　９１５００（０）　６ｏｏｏ （ｏ）４Ｘ１ｏ’　３２００（０）　１４０００（０）　Ｎ、Ｄ。

ａ：雅々異なる個数のＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４−ＴＡａｌ＠を一定 数７７）Ｂ細胞（ｓｘｔｏ’）及びＴ４＋２Ｈ４＋（２Ｘ１０’　）若しくはＴ ４＋２Ｈ４−（２Ｘ１０番）へＰｗＭの存在下で加えた。

ｂ：数値は３反復試料の平均ｎｇ／−として表わす。

ＳＥＭは常に１０チ未満であった。

Ｃ：括弧内の数値は次式にしたがって計算した抑制チに等しい： Ｔ４＋２Ｈ４＋のＴ細胞がそれ自身でサプレッサー作用細胞となる可能性を排除 するため、種々の個数のＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４−細胞を一定数の Ｂ細胞（５×１０４）及びＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４−細胞（２×１ ０４）へＴ８＋細胞（ＩＸ１０’）とＰＷＭとの存在下又は不存在下に加えた。

下記第７表に示したように、Ｔ８細胞を含むＢ細胞とＴ４＋２Ｈ４−細胞との混 合物に加えるＴ４＋２Ｈ４＋Ｔ細胞の個数を増大させると、第６表に前記したよ うに顕著な抑制が見られた。

これに対し、Ｔ８細胞を加え又は加えずＫＢ細胞とＴ４＋２Ｈ４＋細胞との゛混 合物へ加えるＴ４＋２Ｈ４−細胞の個数を増大させると、ＩｇＧ産生の増加をも たらした。

したがって、Ｔ４＋２Ｈ４＋細胞はそれ自身では抑制の作用体でなく、寧ろこれ らはＴ８＋細胞を訴発し若しくは活性化させて免役反応を抑制した。

・第７表 Ｔ　４　＋２　Ｈ４＋　Ｔ細胞はそれ自身ではサプレッサー作用集団でない。

Ｅｘｐ、　Ｉ　ＥＸＰ、　２ ５×１−　ｘｚ４ｏ（１）　５０６０（０）ＩＸ１０’　５２４０（１）　１９ ９５（５）２Ｘ１０’　２４００（２４）　２０９０（１）Ｂ、ｌＴ４＋２Ｈ４ −＋Ｔ８　０　４４００　２０４０５Ｘ１０’　３１５００（１８）　１４ｏｏ （３１）ＩＸ１０’　２８００（３６）　８４０（５９）２Ｘ１０’　９２０（ ７９）　４４Ｇ（７Ｂ）Ｔ４＋２Ｈ４−の添加 Ｃ，Ｂ−１−Ｔ４＋２Ｈ４＋　０　７２０　３２０５Ｘ１０１　１０４０（０） 　５１０（０）１×−１０８０（０）　１５１０（０）２ＸＩＣＩ’　１８２０ （０）　１９４０（０）Ｄ、Ｂ＋’ｒ４＋２Ｈ４＋　＋Ｔ８　０　２８０５Ｘ１ ０”　７２０ ＩＸＩＯ’　８８０（０）　Ｎ、　Ｄ。

２×１♂　１３２０（０） ＆：種々異なる個数のＴ４＋２Ｈ４＋若しくはＴ４＋２Ｈ４−のＴ細胞を一定数 のＢ細胞（５Ｘ１０’）及びＴ４＋２Ｈ４＋（２Ｘ１０’　）若しくはＴ４＋２ Ｈ４−（２Ｘ１０’　）へＴ８８＠（１ｘ１ｏ’）を含む又は含まないＰＷＭの 存在下で加えた。

ｂ：数値は３反復試料の平均ｎｇ／―として示す。

ＳＥＭは常に１０％未満であった。

Ｃ：括弧内の数字は第５表に示したと同様な抑制嗟に流動血球計数試験を、ＳＬ Ｅに罹患した２名のヒト患者から採取したリンパ球につき行なった。患者の１人 は正常検体に比較してＴ４＋２Ｈ４十部分集合の大きさにおいて相当な低下を示 したのに対し、第２のＳＬＥ患者はＴ４：＋−２Ｈ４＋部分集合が完全に存在し ないことを示した。これらの結果は、これらの抑制誘発剤の喪失がこの自家免疫 病における原因である可能性を示唆している。

抗−２Ｈ４抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞はメリーランド州、ロックビル在 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託して、ＡＴＣＣ受託番 号ＨＢ８５７０が付与されている。

Ｔ４や化報ら ７４２Ｍ４争◆８　口 ”Ｉｇ　’５１＠。

Ｓ、田ａｅ、邊−−→ 国際調査報告 ＋Ｉ″□Ａｐ−−渭／Ｕ！５８５１００１！８５１１１“Ａ″に″′−ＰＣＴ／ υ８８５１００８８５］の続き ｔ、ｃｌ、４　識別記号　庁内整理番号間者　モリモト、チカオ　アメリカ合衆 国　０２１９２プレイン　アベニュー 特衣昭６１−５０２２３３　（ｌｊ） ：　マサチューセッツ、ニーダム、グレイト

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト細胞の集合における第１部分集合に対し前記ヒト細胞の集合における第 ２部分集合に対するよりも大きい程度で反応し、前記第１及び第２部分集合の細 胞は互いに対比して第１モノクローナル抗体とは異なる第２モノクローナル抗体 に対しほぼ同程度の反応性を示すことを特徴とする非ヒト霊長動物細胞に対する 第１モノクローナル抗体。
2. ２．ヒト細胞がリンパ球である請求の範囲第１項記載の第１モノクローナル抗体 。
3. ３．リンパ球がＴ細胞である請求の範囲第２項記載の第１モノクローナル抗体。
4. ４．ヒト細胞の集合がＴ４十細胞である請求の範囲第３項記載の第１モノクロー ナル抗体。
5. ５．ヒト細胞の集合がＴ８十細胞である請求の範囲第３項記載の第１モノクロー ナル抗体。
6. ６．抗体が、ヒトＴ８細胞の第１及び第２部分集合に対し畏なる程度の反応性を 示す請求の範囲第４項記載の第１モノクローナル抗体。
7. ７．抗体が、ヒトＴ４十細胞の第１及び第２部分集合に対し異なる程度の反応性 を示す請求の範囲第５項記載の第１モノクローナル抗体。
8. ８．抗体がＩｇＧ１同型である請求の範囲第４項又は第５項記載の第１モノクロ ーナル抗体。
9. ９．Ｔ４十細胞の第１部分集合の増殖が、Ｔ４十細胞の第２部分集合よりも大き いコンカナバリンＡによる誘発感受性を有する請求の範囲第４項記載の第１モノ クローナル抗体。
10. １０．Ｔ４十細胞の第２部分集合の増殖が、Ｔ４十細胞の第１部分集合よりも大 きい可溶性抗原により誘発感受性を有する請求の範囲第４項記載の第１モノクロ ーナル抗体。
11. １１．Ｔ４十細胞の第２部分集合がヤマゴボウミトゲンの存在下で第１部分集合 よりも大きい程度にヒトＢ細胞におけるＩｇＧ分泌を誘発しうる請求の範囲第４ 項記載の第１モノクローナル抗体。
12. １２．Ｔ４十細胞の第１部分集合がヤマゴボウミトゲンの存在下で第２部分集合 よりも大きい程度にヒトＴ８十細胞を誘発してヒトＢ細胞におけるＩｇＧ分泌を 抑制する請求の範囲第４項記載の第１モノクローナル抗体。
13. １３．非ヒト霊長動物細胞に対するモノクローナル抗体を産生させ、 このモノクローナル抗体をヒト細胞と接触させ、かつ 前記モノクローナル抗体に対する反応性の程度の差に基づいて部分集合を分別す る ことを特徴とする複数のヒト細胞における部分集合の分別方法。
14. １４．ヒト細胞がＴ細胞である請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．Ｔ細胞がＴ４十細胞又はＴ８十細胞である請求の範囲第１４項記載の方法 。
16. １６．非ヒト霊長動物細胞がＴ細胞である請求の範囲第１３項記載の方法。
17. １７．複数の動物を第１部分集合の細胞で免疫化して、異なるモノクローナル抗 体を産生する複数の異なるハイブリドーマを生産し、 免疫化に使用しなかつた第２部分集合の細胞に対する前記抗体の反応性を試験し 、かつ 第２部分集合に対し前記第１部分集合に対するよりも小さい反応性を有する抗体 を選択する工程をさらに含む請求の範囲第１３項記載の方法。
18. １８．動物を非ヒト霊長動物細胞で免疫化することを特徴とする、ヒト細胞及び 非ヒト霊長動物細胞に存在する抗原決定子に対する動物の免疫反応を増大させる 方法。
19. １９．ヒト細胞及び非ヒト霊長動物細胞がＴ細胞である請求の範囲第１８項記載 の方法。