JPH0686688A - ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0686688A JPH0686688A JP4084681A JP8468192A JPH0686688A JP H0686688 A JPH0686688 A JP H0686688A JP 4084681 A JP4084681 A JP 4084681A JP 8468192 A JP8468192 A JP 8468192A JP H0686688 A JPH0686688 A JP H0686688A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト骨髄腫細胞の細胞亜群に属する成熟骨髄
腫細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−
１を提供する。 【構成】 ヒト骨髄腫細胞ＫＭＳ−５を感作抗原として
免疫した哺乳動物の免疫細胞と形質細胞腫細胞とを細胞
融合することにより作製したハイブリドーマによって産
生される、ヒト成熟骨髄腫細胞を特異的に認識するモノ
クローナル抗体ＭＰＣ−１。
腫細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−
１を提供する。 【構成】 ヒト骨髄腫細胞ＫＭＳ−５を感作抗原として
免疫した哺乳動物の免疫細胞と形質細胞腫細胞とを細胞
融合することにより作製したハイブリドーマによって産
生される、ヒト成熟骨髄腫細胞を特異的に認識するモノ
クローナル抗体ＭＰＣ−１。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト骨髄腫細胞に属す
るヒト成熟骨髄腫細胞を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体に関するものであり、更に詳しくは、ヒト骨髄腫
細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原として作製される、ヒト骨
髄腫細胞の細胞亜群に属するより成熟した成熟骨髄腫細
胞（形質細胞）を特異的に識別し得る新規モノクローナ
ル抗体に関するものである。
るヒト成熟骨髄腫細胞を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体に関するものであり、更に詳しくは、ヒト骨髄腫
細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原として作製される、ヒト骨
髄腫細胞の細胞亜群に属するより成熟した成熟骨髄腫細
胞（形質細胞）を特異的に識別し得る新規モノクローナ
ル抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】癌細胞、特に造血器腫瘍細胞の細胞学的
特性が解明されるに伴って、腫瘍細胞の不均一性（ｈｅ
ｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の問題が認識されるようにな
ってきた。
特性が解明されるに伴って、腫瘍細胞の不均一性（ｈｅ
ｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の問題が認識されるようにな
ってきた。
【０００３】Ｂリンパ球系列の最終分化段階にある形質
細胞と考えられている腫瘍細胞のヒト骨髄腫細胞におい
ても、増殖能、Ｍ−蛋白質（免疫グロブリン）産生能及
び形態学的特性等が質的に相違する細胞亜群が含まれて
いることが認められており、これまでに、例えば、ヒト
骨髄腫細胞を前駆（未熟）骨髄腫細胞と成熟骨髄腫細胞
との二系統に区分して考える仮説も提唱されている〔臨
床医，１８，１８１〜１８５（１９９２）〕。
細胞と考えられている腫瘍細胞のヒト骨髄腫細胞におい
ても、増殖能、Ｍ−蛋白質（免疫グロブリン）産生能及
び形態学的特性等が質的に相違する細胞亜群が含まれて
いることが認められており、これまでに、例えば、ヒト
骨髄腫細胞を前駆（未熟）骨髄腫細胞と成熟骨髄腫細胞
との二系統に区分して考える仮説も提唱されている〔臨
床医，１８，１８１〜１８５（１９９２）〕。
【０００４】最近、これらのヒト骨髄腫細胞に属する細
胞亜群の存在は、骨髄ストローマ細胞との接着特性の相
違、更には、その接着分子発現（特にインテグリン分
子）等によっても明らかにされつつある。
胞亜群の存在は、骨髄ストローマ細胞との接着特性の相
違、更には、その接着分子発現（特にインテグリン分
子）等によっても明らかにされつつある。
【０００５】このような状況の中で、従来、臨床研究の
見地からも、腫瘍細胞の分化度及び細胞系統等を的確に
把握することの重要性が認識されており、そのための有
効な手段として、腫瘍細胞の分化度及び細胞系統等を特
異的に認識する抗体を開発し、その腫瘍細胞の位置づけ
を明らかにすることができれば、腫瘍細胞の診断及び治
療に極めて有用である。このような観点から、これま
で、乳癌細胞、肺癌細胞、悪性黒色腫、胃癌細胞、大腸
癌細胞等の各種癌細胞、造血器悪性腫瘍等について、そ
の分化度及び細胞系統等を識別し得るような抗体の開発
が試みられている。〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７
７，６８４１〜６８４５（１９８０）、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, ７８，４５９１−４５９５（１９８
１）、CancerRes., ４６，２４９０〜２４９６（１９８
６）、Cancer Immunol. Immunother.,２８，２９６〜３
００（１９８９）、Cancer Res., ４９，２４７１〜２
４７６（１９８９）〕
見地からも、腫瘍細胞の分化度及び細胞系統等を的確に
把握することの重要性が認識されており、そのための有
効な手段として、腫瘍細胞の分化度及び細胞系統等を特
異的に認識する抗体を開発し、その腫瘍細胞の位置づけ
を明らかにすることができれば、腫瘍細胞の診断及び治
療に極めて有用である。このような観点から、これま
で、乳癌細胞、肺癌細胞、悪性黒色腫、胃癌細胞、大腸
癌細胞等の各種癌細胞、造血器悪性腫瘍等について、そ
の分化度及び細胞系統等を識別し得るような抗体の開発
が試みられている。〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７
７，６８４１〜６８４５（１９８０）、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, ７８，４５９１−４５９５（１９８
１）、CancerRes., ４６，２４９０〜２４９６（１９８
６）、Cancer Immunol. Immunother.,２８，２９６〜３
００（１９８９）、Cancer Res., ４９，２４７１〜２
４７６（１９８９）〕
【０００６】しかしながら、ヒト骨髄腫細胞について
は、前記のように細胞学的特性に関する基礎研究の段階
であって、ヒト骨髄腫細胞の樹立とその細胞学特性の解
明、各種細胞亜群の存在についての検討等がなされてい
るものの、当該Ｂ細胞系列の最終分化細胞と考えられて
いる形質細胞であるところのヒト骨髄腫細胞の細胞亜群
を特異的に識別する抗体の作製は、いまだなされていな
い。
は、前記のように細胞学的特性に関する基礎研究の段階
であって、ヒト骨髄腫細胞の樹立とその細胞学特性の解
明、各種細胞亜群の存在についての検討等がなされてい
るものの、当該Ｂ細胞系列の最終分化細胞と考えられて
いる形質細胞であるところのヒト骨髄腫細胞の細胞亜群
を特異的に識別する抗体の作製は、いまだなされていな
い。
【０００７】本発明者らは、これまで、臨床研究に対応
した基礎研究として、ヒト骨髄腫細胞の骨髄穿刺液から
精製した骨髄腫細胞がインターロイキン６（ＩＬ−６）
に反応して増殖すること〔Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３
−８５（１９８８）〕、ＩＬ−６受容体を発現している
こと〔Ｎａｔｕｒｅ ３３２，８３−８５（１９８
８）〕、加えて、自らＩＬ−６を産生してオートクリン
機構にて増殖していること〔Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８
３−８５（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ−ｅ
ｙ，８，９０５−９１９（１９８９）〕等を明らかにす
ると共に、ヒト骨髄腫細胞ＫＭＳ−５からヒト骨髄腫細
胞由来のストローマ細胞株ＫＭ−１０２に付着性を有す
る細胞株と非付着性の細胞株とを分離した〔臨床血液，
３２，１４００（１９９１）〕。
した基礎研究として、ヒト骨髄腫細胞の骨髄穿刺液から
精製した骨髄腫細胞がインターロイキン６（ＩＬ−６）
に反応して増殖すること〔Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３
−８５（１９８８）〕、ＩＬ−６受容体を発現している
こと〔Ｎａｔｕｒｅ ３３２，８３−８５（１９８
８）〕、加えて、自らＩＬ−６を産生してオートクリン
機構にて増殖していること〔Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８
３−８５（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ−ｅ
ｙ，８，９０５−９１９（１９８９）〕等を明らかにす
ると共に、ヒト骨髄腫細胞ＫＭＳ−５からヒト骨髄腫細
胞由来のストローマ細胞株ＫＭ−１０２に付着性を有す
る細胞株と非付着性の細胞株とを分離した〔臨床血液，
３２，１４００（１９９１）〕。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ヒト骨髄腫細胞に関す
るこのような知見とこれまでの研究成果を踏まえ、本発
明者は、これらヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を特異的に識
別し得る抗体を開発することを目標として鋭意研究を積
み重ねた結果、ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原
としてモノクローナル抗体を作製したところ、当該モノ
クローナル抗体がヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を特異的に
認識する特性を有することを見い出した。
るこのような知見とこれまでの研究成果を踏まえ、本発
明者は、これらヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を特異的に識
別し得る抗体を開発することを目標として鋭意研究を積
み重ねた結果、ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原
としてモノクローナル抗体を作製したところ、当該モノ
クローナル抗体がヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を特異的に
認識する特性を有することを見い出した。
【０００９】すなわち、本発明者は、ヒト骨髄腫細胞株
ＫＭＳ−５を感作抗原として作製したマウスモノクロー
ナル抗体ＭＰＣ−１が、前記ヒト骨髄腫細胞株Ｋ−１０
２に付着性を有する細胞株に反応し、非付着性の細胞株
には反応しないことを見い出すと共に、当該モノクロー
ナル抗体がヒト骨髄腫細胞のより成熟した骨髄腫細胞
（形質細胞）を特異的に認識することを見い出し本発明
を完成するに至った。
ＫＭＳ−５を感作抗原として作製したマウスモノクロー
ナル抗体ＭＰＣ−１が、前記ヒト骨髄腫細胞株Ｋ−１０
２に付着性を有する細胞株に反応し、非付着性の細胞株
には反応しないことを見い出すと共に、当該モノクロー
ナル抗体がヒト骨髄腫細胞のより成熟した骨髄腫細胞
（形質細胞）を特異的に認識することを見い出し本発明
を完成するに至った。
【００１０】本発明は、ヒト成熟骨髄腫細胞を特異的に
認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供すること
を目的とするものである。
認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供すること
を目的とするものである。
【００１１】また、本発明は、ヒト骨髄腫細胞に属する
前駆骨髄腫細胞とは反応せず、成熟骨髄腫細胞に対して
反応性を有するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供す
ることを目的とするものである。
前駆骨髄腫細胞とは反応せず、成熟骨髄腫細胞に対して
反応性を有するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供す
ることを目的とするものである。
【００１２】さらに、本発明は、ヒト骨髄腫細胞の細胞
亜群を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗
体ＭＰＣ−１を提供することを目的とするものである。
亜群を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗
体ＭＰＣ−１を提供することを目的とするものである。
【００１３】さらには、本発明は、成熟骨髄腫細胞の同
定及び骨髄腫細胞の臨床上の診断用試薬として有用なモ
ノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供することを目的とす
るものである。
定及び骨髄腫細胞の臨床上の診断用試薬として有用なモ
ノクローナル抗体ＭＰＣ−１を提供することを目的とす
るものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は、以下の（１）〜（２）からな
る。
るための本発明の構成は、以下の（１）〜（２）からな
る。
【００１５】（１） ヒト骨髄腫細胞の細胞亜群に属す
るヒト成熟骨髄腫細胞に対して反応性を有し、前駆骨髄
腫細胞とは反応しないことを特徴とする、ヒト成熟骨髄
腫細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−
１。 （２） ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原として
免疫した哺乳動物の免疫細胞と形質細胞腫細胞とを細胞
融合することにより作製したハイブリドーマによって産
生される前記（１）記載のヒト成熟骨髄腫細胞を特異的
に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１。
るヒト成熟骨髄腫細胞に対して反応性を有し、前駆骨髄
腫細胞とは反応しないことを特徴とする、ヒト成熟骨髄
腫細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−
１。 （２） ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原として
免疫した哺乳動物の免疫細胞と形質細胞腫細胞とを細胞
融合することにより作製したハイブリドーマによって産
生される前記（１）記載のヒト成熟骨髄腫細胞を特異的
に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１。
【００１６】続いて、本発明の構成について詳細に説明
する。
する。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体は、基本的に
は、例えば次のようにして作製することができる。すな
わち、本発明の抗体ＭＰＣ−１は、本発明のモノクロー
ナル抗体が認識する抗原あるいは抗原を含有する細胞、
細胞組織等を感作抗原として使用して、通常の免疫法、
細胞融合法、クローン化法等に準じて作製することがで
きる。
は、例えば次のようにして作製することができる。すな
わち、本発明の抗体ＭＰＣ−１は、本発明のモノクロー
ナル抗体が認識する抗原あるいは抗原を含有する細胞、
細胞組織等を感作抗原として使用して、通常の免疫法、
細胞融合法、クローン化法等に準じて作製することがで
きる。
【００１８】本発明のモノクローナル抗体の作製方法
は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、培
養細胞として樹立されているヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−
５〔ＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ，２巻３号，２９７−３０３
（１９８９）〕を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳
動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス・ミエローマ等
の哺乳動物の形質細胞腫細胞と融合させ、得られた融合
細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前
記成熟骨髄腫細胞を特異的に認識する本発明の抗体を産
生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗
体を回収する方法が好ましく例示される。
は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、培
養細胞として樹立されているヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−
５〔ＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ，２巻３号，２９７−３０３
（１９８９）〕を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳
動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス・ミエローマ等
の哺乳動物の形質細胞腫細胞と融合させ、得られた融合
細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前
記成熟骨髄腫細胞を特異的に認識する本発明の抗体を産
生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗
体を回収する方法が好ましく例示される。
【００１９】前記作製方法において、感作抗原で免疫さ
れる哺乳動物としては、特に限定されるものではない
が、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性など
を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウ
ス、ラット、アルメニアンハムター等が使用される。
れる哺乳動物としては、特に限定されるものではない
が、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性など
を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウ
ス、ラット、アルメニアンハムター等が使用される。
【００２０】免疫は、一般的方法により、例えば、前記
ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５の培養細胞を哺乳動物に腹
腔内注射等により投与することにより行われる。より具
体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁
したものを所望により通常のアジュバンドを併用して、
動物に４〜２１日毎に数回投与し、総投与量が約１〜１
００マイクログラム／動物程度になるようにするのが好
ましい。また、前記投与に際しては通常の担体（シュレ
ッバー）を採用することもできる。免疫細胞としては、
前記細胞株の最終投与の約４日後に摘出した脾細胞を使
用するのが好ましい。
ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５の培養細胞を哺乳動物に腹
腔内注射等により投与することにより行われる。より具
体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁
したものを所望により通常のアジュバンドを併用して、
動物に４〜２１日毎に数回投与し、総投与量が約１〜１
００マイクログラム／動物程度になるようにするのが好
ましい。また、前記投与に際しては通常の担体（シュレ
ッバー）を採用することもできる。免疫細胞としては、
前記細胞株の最終投与の約４日後に摘出した脾細胞を使
用するのが好ましい。
【００２１】前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、すでに公知
の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３×６３−Ａｇ８）
[Na-ture, ２５６，４９５−４９７（１９７５）〕、ｐ
３−Ｕ１〔Current Topicsin Micro-biology and Immun
ology,８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Eur.J.
Imm-unol.,６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ
−１１〔Cell, ８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓ
Ｐ２／０〔Nature, ２７６，２６９−２７０（１９７
８）〕、ＦＯ〔J.Immunol.Meth.,３５，１−２１（１９
８０）〕、Ｓ１９４〔J.Exp.Med., １４８，３１３−３
２３（１９７８）〕、Ｒ２１０〔Nat-ure,２７７，１３
１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、すでに公知
の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３×６３−Ａｇ８）
[Na-ture, ２５６，４９５−４９７（１９７５）〕、ｐ
３−Ｕ１〔Current Topicsin Micro-biology and Immun
ology,８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Eur.J.
Imm-unol.,６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ
−１１〔Cell, ８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓ
Ｐ２／０〔Nature, ２７６，２６９−２７０（１９７
８）〕、ＦＯ〔J.Immunol.Meth.,３５，１−２１（１９
８０）〕、Ｓ１９４〔J.Exp.Med., １４８，３１３−３
２３（１９７８）〕、Ｒ２１０〔Nat-ure,２７７，１３
１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
【００２２】前記免疫細胞と形質細胞腫細胞との細胞融
合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Milstein et al.)の方法〔Methods Enzymol., ７
３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができ
る。
合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Milstein et al.)の方法〔Methods Enzymol., ７
３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができ
る。
【００２３】より具体的には、前記細胞融合は、例え
ば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施され
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用割合は、例えば、形
質細胞腫細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とす
るのが好ましい。前記細胞融合に用いる培地としては、
例えば、前記形質細胞腫細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ
−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養
に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎
児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することも可能で
ある。
ば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施され
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用割合は、例えば、形
質細胞腫細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とす
るのが好ましい。前記細胞融合に用いる培地としては、
例えば、前記形質細胞腫細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ
−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養
に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎
児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することも可能で
ある。
【００２４】細胞融合は、前記免疫細胞と形質細胞腫細
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１，０００
〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６
０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって
行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して
上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハ
イブリドーマが形成される。
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１，０００
〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６
０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって
行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して
上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハ
イブリドーマが形成される。
【００２５】当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、
例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノブテリン
及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択さ
れる。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限
界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリ
ドーマのスクリーニング及び単一クローン化が実施され
る。
例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノブテリン
及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択さ
れる。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限
界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリ
ドーマのスクリーニング及び単一クローン化が実施され
る。
【００２６】このようにして作製される本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することが可能であり、また液体窒素中で長
期保存することが可能である。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することが可能であり、また液体窒素中で長
期保存することが可能である。
【００２７】当該ハイブリドーマから本発明のモノクロ
ーナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるい
はハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与
して増殖させその腹水として得る方法などが採用され
る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法
であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した
方法である。
ーナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるい
はハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与
して増殖させその腹水として得る方法などが採用され
る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法
であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した
方法である。
【００２８】更に、前記の方法により得られる抗体は、
塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィ
ー等の通常の精製手段を利用して高純度に精製すること
ができる。
塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィ
ー等の通常の精製手段を利用して高純度に精製すること
ができる。
【００２９】このようにして作製される本発明のモノク
ローナル抗体ＭＰＣ−１は、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光抗体法等の通常
の免疫学的手段により、ヒト骨髄腫細胞（形質細胞）に
属する細胞亜群のより成熟した骨髄腫細胞（形質細胞）
を高感度、高精度且つ高い特異性をもって識別し、同定
することを可能にするものである。
ローナル抗体ＭＰＣ−１は、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光抗体法等の通常
の免疫学的手段により、ヒト骨髄腫細胞（形質細胞）に
属する細胞亜群のより成熟した骨髄腫細胞（形質細胞）
を高感度、高精度且つ高い特異性をもって識別し、同定
することを可能にするものである。
【００３０】このような本発明のモノクローナル抗体を
利用して成熟骨髄腫細胞を識別ないし同定するための具
体的システムの設定、その改変及び応用等は、当業者に
とって自明の通常の方法を応用して適宜実施される。
利用して成熟骨髄腫細胞を識別ないし同定するための具
体的システムの設定、その改変及び応用等は、当業者に
とって自明の通常の方法を応用して適宜実施される。
【００３１】
【実施例】次に、実施例に基づいて本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
【００３２】実施例 １．モノクローナル抗体ＭＰＣ−１の作製 １）感作抗原と免疫法 感作抗原として、ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５〔HUMAN
CELL, ２巻３号，２９７−３０３（１９８９）〕を用い
て抗原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血清（Ｆ
ＣＳ、Ｍ．Ａ．Bioproducts 社製）及び１×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０（日水
製薬社製）を培地として使用し、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中で３７℃の温度条件下で継代培養を行った。
CELL, ２巻３号，２９７−３０３（１９８９）〕を用い
て抗原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血清（Ｆ
ＣＳ、Ｍ．Ａ．Bioproducts 社製）及び１×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０（日水
製薬社製）を培地として使用し、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中で３７℃の温度条件下で継代培養を行った。
【００３３】細胞は、軽いピペッティングによってイン
キュベーターの培養フラスコより回収した。この細胞を
１×１０5 個／μｌの細胞数でリン酸緩衝液（ＰＢＳ、
ｐＨ７．４）に懸濁し、浮遊させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス（４週令、♀、日本クレア社製）に免疫した。初回免
疫には、１×１０7 個／１００μｌの細胞を５０％（Ｗ
／Ｖ）フロイント完全アジュバント〔Complete Freund
Adjuvant(Bacto社製）〕を加えて、マウス腹腔内に注射
し、４週後に１×１０7 個／１００μｌの細胞を５０％
（Ｗ／Ｖ）フロイント不完全アジュバント（incomplete
Freund Adjuv-ant)を加えて追加免疫した。更に、２週
間隔にて１×１０7 個／１００μｌの細胞を２〜３回追
加免疫し、最終免疫４日後にマウスを屠殺して脾臓を摘
出した。
キュベーターの培養フラスコより回収した。この細胞を
１×１０5 個／μｌの細胞数でリン酸緩衝液（ＰＢＳ、
ｐＨ７．４）に懸濁し、浮遊させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス（４週令、♀、日本クレア社製）に免疫した。初回免
疫には、１×１０7 個／１００μｌの細胞を５０％（Ｗ
／Ｖ）フロイント完全アジュバント〔Complete Freund
Adjuvant(Bacto社製）〕を加えて、マウス腹腔内に注射
し、４週後に１×１０7 個／１００μｌの細胞を５０％
（Ｗ／Ｖ）フロイント不完全アジュバント（incomplete
Freund Adjuv-ant)を加えて追加免疫した。更に、２週
間隔にて１×１０7 個／１００μｌの細胞を２〜３回追
加免疫し、最終免疫４日後にマウスを屠殺して脾臓を摘
出した。
【００３４】２）細胞融合 ２匹のマウスから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細
胞を遠沈した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬社
製）中に懸濁し、浮遊させ充分洗浄を行った。一方、マ
ウス・ミエローマ細胞株Ｐ３×６３を、１０％牛胎児血
清（FCS, M. A.Bioproducts 社製）及び１×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ−１６４０
（日水製薬社製）培地にて培養して得た細胞を同様に前
記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、その２×１０7 個
と、前記脾細胞１×１０8 個とを遠心管に入れ混合し、
５０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール（Hybri-Max,
Sigma 社製 No.P −７７７７）によって常法〔Clin. Ex
p. Immunol.,４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従
い細胞融合させた。
胞を遠沈した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬社
製）中に懸濁し、浮遊させ充分洗浄を行った。一方、マ
ウス・ミエローマ細胞株Ｐ３×６３を、１０％牛胎児血
清（FCS, M. A.Bioproducts 社製）及び１×１０-5Ｍ２
−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ−１６４０
（日水製薬社製）培地にて培養して得た細胞を同様に前
記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、その２×１０7 個
と、前記脾細胞１×１０8 個とを遠心管に入れ混合し、
５０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール（Hybri-Max,
Sigma 社製 No.P −７７７７）によって常法〔Clin. Ex
p. Immunol.,４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従
い細胞融合させた。
【００３５】得られた融合細胞を、６０ｍｌのＨＡＴ選
択培地（１．０×１０-4Ｍヒポキサンチン、４．０×１
０-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０-5Ｍチミジンを含
む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０％ＦＣＳ及び１
×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールを加えた培地）に
懸濁させ、次いで、この懸濁液０．２ｍｌを、９６個の
ウエルプレートを３プレート使用して、各ウエルにそれ
ぞれ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中で３７℃で
培養した。
択培地（１．０×１０-4Ｍヒポキサンチン、４．０×１
０-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０-5Ｍチミジンを含
む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０％ＦＣＳ及び１
×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールを加えた培地）に
懸濁させ、次いで、この懸濁液０．２ｍｌを、９６個の
ウエルプレートを３プレート使用して、各ウエルにそれ
ぞれ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中で３７℃で
培養した。
【００３６】各ウエルには、予め、ＢＡＬＢ／Ｃ系ノー
マルマウスの腹腔から採取した腹腔マクロファージをフ
ィーダー細胞として収容した。すなわち、前記ＢＡＬＢ
／Ｃ系マウスの腹腔に５ｍｌＰＢＳを注入した後、腹腔
マクロファージを採取し、これを、予め、一日前に各ウ
エルに収容して前記融合細胞の選択に供した。
マルマウスの腹腔から採取した腹腔マクロファージをフ
ィーダー細胞として収容した。すなわち、前記ＢＡＬＢ
／Ｃ系マウスの腹腔に５ｍｌＰＢＳを注入した後、腹腔
マクロファージを採取し、これを、予め、一日前に各ウ
エルに収容して前記融合細胞の選択に供した。
【００３７】培養開始後、上清の半分を培養３日、６日
及び１０日後に、それぞれ新しいＨＡＴ培地に代え、培
養を継続し、増殖維持させた。
及び１０日後に、それぞれ新しいＨＡＴ培地に代え、培
養を継続し、増殖維持させた。
【００３８】このようにして得られた融合細胞を限界希
釈法を用いてクローニングした。すなわち、前記融合細
胞の培養上清中の抗体を利用して、感作抗原との結合性
を調べ、感作抗原と強い結合性を有するクローンだけを
常法により限界希釈法を用いてクローンを形成させた。
釈法を用いてクローニングした。すなわち、前記融合細
胞の培養上清中の抗体を利用して、感作抗原との結合性
を調べ、感作抗原と強い結合性を有するクローンだけを
常法により限界希釈法を用いてクローンを形成させた。
【００３９】クローンの形成は、前記ハイブリドーマ及
びＢＡＬＢ／Ｃ系マウス脾細胞を所定量含むように調整
し、ハイブリドーマ３個／ウエルとなるように９６ウエ
ルのプレートに播いて５％ＣＯ2 インキュベーター中で
３７℃にて培養した。増殖してくるハイブリドーマを同
様にハイブリドーマ１個／ウエルとしてクローニング
し、更に、増殖してくるハイブリドーマを同様にクロー
ニングする操作を通常の限界希釈法に従って繰り返し
た。目的の抗体を産生するクローンは、前記感作抗原を
用いてスクリーニングした。このようにして、成熟骨髄
腫細胞に特異的反応性を有する本発明のモノクローナル
抗体ＭＰＣ−１を産生するハイブリドーマを分離した。
びＢＡＬＢ／Ｃ系マウス脾細胞を所定量含むように調整
し、ハイブリドーマ３個／ウエルとなるように９６ウエ
ルのプレートに播いて５％ＣＯ2 インキュベーター中で
３７℃にて培養した。増殖してくるハイブリドーマを同
様にハイブリドーマ１個／ウエルとしてクローニング
し、更に、増殖してくるハイブリドーマを同様にクロー
ニングする操作を通常の限界希釈法に従って繰り返し
た。目的の抗体を産生するクローンは、前記感作抗原を
用いてスクリーニングした。このようにして、成熟骨髄
腫細胞に特異的反応性を有する本発明のモノクローナル
抗体ＭＰＣ−１を産生するハイブリドーマを分離した。
【００４０】なお、本発明のモノクローナル抗体ＭＰＣ
−１を産生する当該ハイブリドーマは、ＢＡＬＢ／Ｃ系
マウス脾細胞とマウス・ミエローマＰ３×６３を親細胞
として作製された新規な融合細胞であり、公的微生物寄
託機関である工業技術院微生物工業技術研究所に、ハイ
ブリドーマＭＰＣ−１、微工研菌寄第１２８３２（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２８３２）、として寄託されている。
−１を産生する当該ハイブリドーマは、ＢＡＬＢ／Ｃ系
マウス脾細胞とマウス・ミエローマＰ３×６３を親細胞
として作製された新規な融合細胞であり、公的微生物寄
託機関である工業技術院微生物工業技術研究所に、ハイ
ブリドーマＭＰＣ−１、微工研菌寄第１２８３２（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２８３２）、として寄託されている。
【００４１】３）スクリーニング 融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フロ
ーサイトメーター（F-low Cytometer)を使った間接蛍光
抗体法により行った。目的の抗体を産生するクローンの
スクリーニングは、ターゲット細胞として、ａ）ＫＭＳ
−５（感作抗原）、ｂ）ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６、
ｃ）ＥＢＶ感染Ｂ細胞ＫＵＳ、ｄ）新鮮分離したヒト骨
髄腫細胞、等を用いて行った。最初のスクリーニング
は、反応細胞として感作抗原であるヒト骨髄腫細胞株Ｋ
ＭＳ−５を用いて行った。 先ず、ヒト骨髄腫細胞株Ｋ
ＭＳ−５に反応する融合細胞クローンを選ぶために、当
該ＫＭＳ−５に反応する培養上清を選別し、１次スクリ
ーニングを行った。
ーサイトメーター（F-low Cytometer)を使った間接蛍光
抗体法により行った。目的の抗体を産生するクローンの
スクリーニングは、ターゲット細胞として、ａ）ＫＭＳ
−５（感作抗原）、ｂ）ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６、
ｃ）ＥＢＶ感染Ｂ細胞ＫＵＳ、ｄ）新鮮分離したヒト骨
髄腫細胞、等を用いて行った。最初のスクリーニング
は、反応細胞として感作抗原であるヒト骨髄腫細胞株Ｋ
ＭＳ−５を用いて行った。 先ず、ヒト骨髄腫細胞株Ｋ
ＭＳ−５に反応する融合細胞クローンを選ぶために、当
該ＫＭＳ−５に反応する培養上清を選別し、１次スクリ
ーニングを行った。
【００４２】すなわち、細胞を反応バッファー〔リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に２００μｇ／
ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０１％ＮａＮ
3 を加えたもの〕に懸濁し、浮遊させ（５×１０5 個／
４０μｌ）、ハイブリドーマ培養上清１０μｌを加えて
４℃にて３０分間反応させた。前記バッファーにより２
回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体
（Ｔａｇｏ社製）を加えて３０分間インキュベーション
した。３回洗浄した後、フローサイトメーター（Flow C
ytometer) （CytronR , Ortho 社製）にて解析した。
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に２００μｇ／
ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０１％ＮａＮ
3 を加えたもの〕に懸濁し、浮遊させ（５×１０5 個／
４０μｌ）、ハイブリドーマ培養上清１０μｌを加えて
４℃にて３０分間反応させた。前記バッファーにより２
回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体
（Ｔａｇｏ社製）を加えて３０分間インキュベーション
した。３回洗浄した後、フローサイトメーター（Flow C
ytometer) （CytronR , Ortho 社製）にて解析した。
【００４３】次に、反応細胞として付着性細胞株ＫＭＳ
−５Ａｄと非付着性細胞株ＫＭＳ−５ＮＡｄを用い、前
記の如くフローサイトメーター（Flow Cytometer) によ
り解析した。これによって付着性細胞株にのみ反応する
抗体を産生しているハイブリドーマとして３つの細胞を
得た（そのうちの１種類を、ハイブリドーマＭＰＣ−１
として、前記受託番号により、寄託した）。更に、ヒト
骨髄腫患者の骨髄腫細胞を反応細胞として用いて解析を
行った。この場合の解析は、抗ＣＤ３８抗体との２カラ
ー解析法により行った。
−５Ａｄと非付着性細胞株ＫＭＳ−５ＮＡｄを用い、前
記の如くフローサイトメーター（Flow Cytometer) によ
り解析した。これによって付着性細胞株にのみ反応する
抗体を産生しているハイブリドーマとして３つの細胞を
得た（そのうちの１種類を、ハイブリドーマＭＰＣ−１
として、前記受託番号により、寄託した）。更に、ヒト
骨髄腫患者の骨髄腫細胞を反応細胞として用いて解析を
行った。この場合の解析は、抗ＣＤ３８抗体との２カラ
ー解析法により行った。
【００４４】このフローサイトメーター（Flow Cytomet
er) による２カラー解析は、正常人あるいはヒト骨髄腫
患者の骨髄穿刺液をフィコールーハイパーキュー密度勾
配遠心（Ficoll-Hypaque) にて分離し、単核球分画を採
取し、細胞をＭＰＣ−１抗体（またはＶＬＡ−５抗体）
に反応させ、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、更
にマウスＩｇＧを加えた後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３８抗
体で染色し、染色後細胞をフローサイトメーター（Orth
o 社製，CytronR ) により解析して、ＣＤ３８++のヒト
骨髄腫細胞と反応する培養上清を選ぶことにより実施し
た。
er) による２カラー解析は、正常人あるいはヒト骨髄腫
患者の骨髄穿刺液をフィコールーハイパーキュー密度勾
配遠心（Ficoll-Hypaque) にて分離し、単核球分画を採
取し、細胞をＭＰＣ−１抗体（またはＶＬＡ−５抗体）
に反応させ、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、更
にマウスＩｇＧを加えた後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３８抗
体で染色し、染色後細胞をフローサイトメーター（Orth
o 社製，CytronR ) により解析して、ＣＤ３８++のヒト
骨髄腫細胞と反応する培養上清を選ぶことにより実施し
た。
【００４５】すなわち、細胞を前記反応バッファーに懸
濁し、浮遊させ（５×１０5 個／４０μｌ）、ハイブリ
ドーマ培養上清１０μｌを加えて、４℃にて３０分間反
応させた。前記反応バッファーで２回洗浄した後、ＰＥ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Immunotech社製）を加え
て、３０分間インキュベーションした。２回洗浄後、ブ
ロッキングとしてマウス血清（５６℃、３０分処理）１
５μｌ加えて４℃、２０分間インキュベーションし、反
応バッファー２０μｌ、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３８抗体
（Immunotech社製）５μｌを加えて、４℃、３０分間イ
ンキュベーションした。３回洗浄した後、フローサイト
メーター（Flow Cytometer) により解析した。
濁し、浮遊させ（５×１０5 個／４０μｌ）、ハイブリ
ドーマ培養上清１０μｌを加えて、４℃にて３０分間反
応させた。前記反応バッファーで２回洗浄した後、ＰＥ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Immunotech社製）を加え
て、３０分間インキュベーションした。２回洗浄後、ブ
ロッキングとしてマウス血清（５６℃、３０分処理）１
５μｌ加えて４℃、２０分間インキュベーションし、反
応バッファー２０μｌ、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３８抗体
（Immunotech社製）５μｌを加えて、４℃、３０分間イ
ンキュベーションした。３回洗浄した後、フローサイト
メーター（Flow Cytometer) により解析した。
【００４６】このようなフローサイトメーターによるカ
ラー解析の結果、図１に示す如く、骨髄腫細胞は、ＣＤ
３８++（ＣＤ３８抗原強陽性）であり（図中の↓印参
照）、インテグリンであるＶＬＡ−５発現により、ＶＬ
Ａ−５+ 細胞とＶＬＡ−５- 細胞に分けられることが分
った。形態学的特性及びin vitro 増殖能、in vitro I
g 産生能等より、ＣＤ３８++ＶＬＡ−5- 細胞は、前駆
（未熟）骨髄腫細胞、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞は、
成熟骨髄腫細胞であることが確認されている。
ラー解析の結果、図１に示す如く、骨髄腫細胞は、ＣＤ
３８++（ＣＤ３８抗原強陽性）であり（図中の↓印参
照）、インテグリンであるＶＬＡ−５発現により、ＶＬ
Ａ−５+ 細胞とＶＬＡ−５- 細胞に分けられることが分
った。形態学的特性及びin vitro 増殖能、in vitro I
g 産生能等より、ＣＤ３８++ＶＬＡ−5- 細胞は、前駆
（未熟）骨髄腫細胞、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞は、
成熟骨髄腫細胞であることが確認されている。
【００４７】これらの細胞に対する前記ハイブリドーマ
培養上清の反応を検討したところ、１つの抗体（ＭＰＣ
−１抗体）は、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞とのみ反応
し、ＣＤ３８++ＶＬＡ−5- 細胞とは反応しないことが
分った。しかも、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞を、更
に、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１- とＣＤ３８++
ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ 細胞とに分けることができ、
骨髄細胞（ＣＤ３８++）（図中の↓印参照）は、図１
の、ａ）ＶＬＡ−５- ＭＰＣ−１- 、ｂ）ＶＬＡ−５+
ＭＰＣ−１- 、及び、ｃ）ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ 、
の３群に分けられることが分った。骨髄腫細胞の分化成
熟は、図１の、ａ）→ｂ）→ｃ）の順であることが確認
されており、本抗体ＭＰＣ−１は、ヒト骨髄腫細胞（形
質細胞）（ＣＤ３８++）の中で、より成熟した骨髄腫細
胞を認識し得る抗体であることが分った。
培養上清の反応を検討したところ、１つの抗体（ＭＰＣ
−１抗体）は、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞とのみ反応
し、ＣＤ３８++ＶＬＡ−5- 細胞とは反応しないことが
分った。しかも、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ 細胞を、更
に、ＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１- とＣＤ３８++
ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ 細胞とに分けることができ、
骨髄細胞（ＣＤ３８++）（図中の↓印参照）は、図１
の、ａ）ＶＬＡ−５- ＭＰＣ−１- 、ｂ）ＶＬＡ−５+
ＭＰＣ−１- 、及び、ｃ）ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ 、
の３群に分けられることが分った。骨髄腫細胞の分化成
熟は、図１の、ａ）→ｂ）→ｃ）の順であることが確認
されており、本抗体ＭＰＣ−１は、ヒト骨髄腫細胞（形
質細胞）（ＣＤ３８++）の中で、より成熟した骨髄腫細
胞を認識し得る抗体であることが分った。
【００４８】前駆（未熟）骨髄腫細胞と考えられる形質
細胞性白血病細胞、末梢血中に認められる骨髄腫細胞等
に対しては本抗体ＭＰＣ−１は反応しない。一方、成熟
骨髄腫細胞に対応すると考えられる多クローン性免疫グ
ロブリン血症の形質細胞に対しては本抗体は反応するこ
とが分った。
細胞性白血病細胞、末梢血中に認められる骨髄腫細胞等
に対しては本抗体ＭＰＣ−１は反応しない。一方、成熟
骨髄腫細胞に対応すると考えられる多クローン性免疫グ
ロブリン血症の形質細胞に対しては本抗体は反応するこ
とが分った。
【００４９】本抗体の形質細胞以外の他の細胞に対する
反応特性を図２、図３に示した。図２、図３は、正常人
骨髄液からリンパ球分離液（セパレートＬ、ムトー化学
社製）により分離した骨髄単核球分画について前記と同
様にして２カラー解析を行ったものである。
反応特性を図２、図３に示した。図２、図３は、正常人
骨髄液からリンパ球分離液（セパレートＬ、ムトー化学
社製）により分離した骨髄単核球分画について前記と同
様にして２カラー解析を行ったものである。
【００５０】図２、図３において、ＣＤ１９+ 、ＣＤ２
０+ は、Ｂ細胞の表面抗原、ＣＤ１０+ は、Ｐｒｅ−Ｂ
細胞の表面抗原、ＣＤ３+ は、成熟Ｔ細胞の表面抗原、
ＣＤ１４+ 、ＣＤ１３+ 、ＣＤ３３+ は、単球又は骨髄
球系細胞の表面抗原、ＧＰＡは、赤芽球系細胞の表面抗
原をそれぞれ示す。図２、図３に基づいて本発明のＭＰ
Ｃ−１抗体と反応する細胞を同定した結果を表１に示
す。表１に示されるように、本発明のＭＰＣ−１抗体
は、単球、骨髄球系細胞及び成熟Ｂ細胞の一部とも反応
することが分った。
０+ は、Ｂ細胞の表面抗原、ＣＤ１０+ は、Ｐｒｅ−Ｂ
細胞の表面抗原、ＣＤ３+ は、成熟Ｔ細胞の表面抗原、
ＣＤ１４+ 、ＣＤ１３+ 、ＣＤ３３+ は、単球又は骨髄
球系細胞の表面抗原、ＧＰＡは、赤芽球系細胞の表面抗
原をそれぞれ示す。図２、図３に基づいて本発明のＭＰ
Ｃ−１抗体と反応する細胞を同定した結果を表１に示
す。表１に示されるように、本発明のＭＰＣ−１抗体
は、単球、骨髄球系細胞及び成熟Ｂ細胞の一部とも反応
することが分った。
【００５１】
【表１】
【００５２】４）抗体の精製 前記２）で作製した融合細胞を常法に従って培養し、培
養上清中に産生される抗体を常法により分離し、精製し
た。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原に対する抗
体価の最も高かったウエルからハイブリドーマを採取
し、細胞の増殖が認められたウエルのうち１つを取り、
得られた培養細胞を５％ＣＯ2 組織培養フラスコに広げ
て３７℃にて継代培養を行い、増殖させた。得られた培
養物を５０％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析
後、抗ラットＩｇＧカラムでアフィニティー精製を行っ
た。抗体は、更に塩析し、充分に透析を行い約５ｍｇ／
ｍｌの精製品を得た。
養上清中に産生される抗体を常法により分離し、精製し
た。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原に対する抗
体価の最も高かったウエルからハイブリドーマを採取
し、細胞の増殖が認められたウエルのうち１つを取り、
得られた培養細胞を５％ＣＯ2 組織培養フラスコに広げ
て３７℃にて継代培養を行い、増殖させた。得られた培
養物を５０％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析
後、抗ラットＩｇＧカラムでアフィニティー精製を行っ
た。抗体は、更に塩析し、充分に透析を行い約５ｍｇ／
ｍｌの精製品を得た。
【００５３】５）抗体の性状 抗体のアイソタイプ 培養上清中、本抗体ＭＰＣ−１のアイソタイプは、マウ
スモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Mouse
monoclonal antibody isotyping kit, Amersh-am社製Ｒ
ＰＮ２９）を使用して同定した。結果は、図４に示すよ
うに、マウスＩｇＧ２ａ、Ｋ型であった。
スモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Mouse
monoclonal antibody isotyping kit, Amersh-am社製Ｒ
ＰＮ２９）を使用して同定した。結果は、図４に示すよ
うに、マウスＩｇＧ２ａ、Ｋ型であった。
【００５４】抗体ＭＰＣ−１の特性 本発明のモノクローナル抗体ＭＰＣ−１は、ヒト骨髄腫
細胞の細胞亜群に属する、成熟骨髄腫細胞を特異的に認
識する作用を有する。ヒト骨髄腫細胞は、２カラー解析
によりＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５-の前駆（未
熟）骨髄腫細胞とＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５+
の成熟骨髄腫細胞とに２分されるが、本発明の抗体ＭＰ
Ｃ−１は、ＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５+ の成熟
骨髄腫細胞を更にＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１-
とＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ に細分し得る特
性を有する。
細胞の細胞亜群に属する、成熟骨髄腫細胞を特異的に認
識する作用を有する。ヒト骨髄腫細胞は、２カラー解析
によりＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５-の前駆（未
熟）骨髄腫細胞とＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５+
の成熟骨髄腫細胞とに２分されるが、本発明の抗体ＭＰ
Ｃ−１は、ＣＤ３８++ＶＬＡ−４+ ＶＬＡ−５+ の成熟
骨髄腫細胞を更にＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１-
とＣＤ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+ に細分し得る特
性を有する。
【００５５】形態学的特性及びin vitro増殖能等からＣ
Ｄ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+細胞は最も成熟した
骨髄腫細胞であることが確認されており、本発明の抗体
ＭＰＣ−１は、ヒト骨髄腫細胞（形質細胞）ＣＤ３８++
の中で、より成熟した骨髄腫細胞（形質細胞）を識別し
得る特性を有する。
Ｄ３８++ＶＬＡ−５+ ＭＰＣ−１+細胞は最も成熟した
骨髄腫細胞であることが確認されており、本発明の抗体
ＭＰＣ−１は、ヒト骨髄腫細胞（形質細胞）ＣＤ３８++
の中で、より成熟した骨髄腫細胞（形質細胞）を識別し
得る特性を有する。
【００５６】更に、ヒト骨髄腫細胞以外の細胞について
は、本発明の抗体ＭＰＣ−１は、多クローン性免疫グロ
ブリン血症の形質細胞（成熟形質細胞）に対しても陽性
特性を有する。このような、性状を有する抗体は従来知
られていない新規なものであり、本発明者は、これをＭ
ＰＣ−１と命名した。
は、本発明の抗体ＭＰＣ−１は、多クローン性免疫グロ
ブリン血症の形質細胞（成熟形質細胞）に対しても陽性
特性を有する。このような、性状を有する抗体は従来知
られていない新規なものであり、本発明者は、これをＭ
ＰＣ−１と命名した。
【００５７】
【発明の効果】本発明の抗体ＭＰＣ−１は、前記特性を
有するものであり、従来、適当な抗体がなく不可能とさ
れていたヒト骨髄腫細胞（形質細胞）、特に、成熟骨髄
腫細胞（形質細胞）の識別をはじめて可能とした点で、
従来技術にみられない有用性を有する。
有するものであり、従来、適当な抗体がなく不可能とさ
れていたヒト骨髄腫細胞（形質細胞）、特に、成熟骨髄
腫細胞（形質細胞）の識別をはじめて可能とした点で、
従来技術にみられない有用性を有する。
【００５８】また、本発明の抗体ＭＰＣ−１は、ヒト骨
髄腫細胞の細胞学的特性の解明に有用であることはもと
より、臨床レベルにおける成熟骨髄腫細胞を同定するた
めの診断用試薬の有効成分としても有用なものであり、
自動細胞解析装置（フローサイトメーター）を使用した
成熟骨髄腫細胞の同定試薬としても有用である。
髄腫細胞の細胞学的特性の解明に有用であることはもと
より、臨床レベルにおける成熟骨髄腫細胞を同定するた
めの診断用試薬の有効成分としても有用なものであり、
自動細胞解析装置（フローサイトメーター）を使用した
成熟骨髄腫細胞の同定試薬としても有用である。
【００５９】さらに、本発明のモノクローナル抗体ＭＰ
Ｃ−１は、ヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を識別する特性を
有することから、この特性を利用することにより、骨髄
腫の診断システムの確立と骨髄腫の臨床病態の把握が可
能となり、これによって、骨髄腫患者に対する化学療法
剤の選択及び投与時期の決定を的確なものとなし得る等
の臨床上の利用価値を有する。
Ｃ−１は、ヒト骨髄腫細胞の細胞亜群を識別する特性を
有することから、この特性を利用することにより、骨髄
腫の診断システムの確立と骨髄腫の臨床病態の把握が可
能となり、これによって、骨髄腫患者に対する化学療法
剤の選択及び投与時期の決定を的確なものとなし得る等
の臨床上の利用価値を有する。
【図１】ヒト骨髄腫細胞を用いて、抗ＣＤ３８抗体との
２カラー解析を行った結果を示す。
２カラー解析を行った結果を示す。
【図２】正常人骨髄液からの骨髄単核球細胞分画につい
て２カラー解析を行った結果〔ａ）〜ｆ）〕を示す。
て２カラー解析を行った結果〔ａ）〜ｆ）〕を示す。
【図３】正常人骨髄液からの骨髄単核球細胞分画につい
て２カラー解析を行った結果〔ｇ）〜ｍ）〕を示す。
て２カラー解析を行った結果〔ｇ）〜ｍ）〕を示す。
【図４】抗体のアイソタイプの分析結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト骨髄腫細胞の細胞亜群に属するヒト
成熟骨髄腫細胞に対して反応性を有し、前駆骨髄腫細胞
とは反応しないことを特徴とする、ヒト成熟骨髄腫細胞
を特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１。 - 【請求項２】 ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５を感作抗原
として免疫した哺乳動物の免疫細胞と形質細胞腫細胞と
を細胞融合することにより作製したハイブリドーマによ
って産生される請求項１記載のヒト成熟骨髄腫細胞を特
異的に認識するモノクローナル抗体ＭＰＣ−１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08468192A JP3180125B2 (ja) | 1992-03-07 | 1992-03-07 | ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08468192A JP3180125B2 (ja) | 1992-03-07 | 1992-03-07 | ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0686688A true JPH0686688A (ja) | 1994-03-29 |
| JP3180125B2 JP3180125B2 (ja) | 2001-06-25 |
Family
ID=13837438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08468192A Expired - Lifetime JP3180125B2 (ja) | 1992-03-07 | 1992-03-07 | ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3180125B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
-
1992
- 1992-03-07 JP JP08468192A patent/JP3180125B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| JPWO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2018-05-31 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| JP2019201641A (ja) * | 2015-08-11 | 2019-11-28 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| US10654931B2 (en) | 2015-08-11 | 2020-05-19 | Osaka University | Antibody |
| US10988540B2 (en) | 2015-08-11 | 2021-04-27 | Osaka University | Antibody |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3180125B2 (ja) | 2001-06-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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