WO2017026331A1 - 抗体 - Google Patents

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直毅 保仙
治夫 杉山
淳 熊ノ郷
淳一 ▲高▼木
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国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • Multiple myeloma which is a representative example of a disease that causes neoplastic growth of plasma cells, accounts for approximately 1% of all cancers and more than 10% of all hematological malignancies.
  • Multiple myeloma is a disease in which plasma cells present in the bone marrow become cancerous (resulting in abnormal plasma cells) and proliferate in a monoclonal manner.
  • abnormal plasma cells In multiple myeloma, abnormal plasma cells (myeloma cells) spread to the bone marrow throughout the body and proliferate throughout the bone marrow throughout the body. When abnormal plasma cells grow, various symptoms, including bone destruction, appear. From myeloma cells, M protein, which is an abnormal immunoglobulin, is produced, and the blood becomes viscous as the M protein concentration in the blood increases.
  • ⁇ M protein does not function as an original antibody that recognizes foreign substances such as pathogens that have invaded the body, thus causing a decrease in immunity. These affect many organs and produce various signs. Typical signs include bone pain and damage, hypercalcemia, kidney damage and failure, and anemia.
  • proteasome inhibitors such as thalidomide and its derivative lenalidomide
  • chemotherapy such as a combination of melphalan and prednisone, and hematopoietic stem cell transplantation are mainly performed.
  • Patent Document 1 discloses a therapeutic agent for multiple myeloma and the like, which contains an anti-human CD48 monoclonal antibody as an active ingredient.
  • Integrins mainly form ⁇ - and ⁇ -chain heterodimers in vivo and function as receptors on the cell surface. There are various combinations of ⁇ chains and ⁇ chains of such integrins.
  • Non-patent documents 4 to 6 disclose chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) including an antigen recognition site having affinity for a specific antigen.
  • CAR-T cells chimeric antigen receptor T cells
  • anti-CS1 antibody has a relatively high specificity to myeloma cells, it cannot be said that the anti-myeloma effect of the antibody alone is high, and the effectiveness of a single agent has not been shown in clinical trials.
  • the combination with lenalidomide has been found to increase the anti-tumor effect of anti-CS1 antibodies, and it is likely that this combination will be approved.
  • CD38 is expressed on many normal blood cells including CD34-positive hematopoietic progenitor cells, and therefore is a low specificity antigen as a therapeutic target for multiple myeloma. Under such circumstances, it is an object to provide an effective means for the treatment of a disease associated with neoplastic proliferation of plasma cells such as multiple myeloma.
  • an MMG49 antibody by screening using as an index the specific binding to myeloma cells and their precursors. It is confirmed that such antibodies bind to a specific region of the human integrin beta 7, CAR-T cells generated with an antigen recognition site of such antibodies is very useful in the treatment of myeloma I found out. Further, epitope MMG49 antibody was also revealed to be present in the region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7.
  • the antibody (I) includes the following antibodies (I-1) to (I-25).
  • (I-1) An anti-human integrin beta 7 antibodies, antibodies with epitopes in the region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7.
  • (1-1A) Having an epitope in the region consisting of 33 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, the antibody according to (I-1).
  • (1-1B) Having an epitope in the region consisting of 20 to 90 amino acid residues of the human integrin beta 7, the antibody according to (I-1).
  • (1-1C) Having an epitope in the region consisting of 33 to 90 amino acid residues of the human integrin beta 7, the antibody according to (I-1).
  • (I-2) In the presence of at least a region consisting of 379 to 721 amino acid residues of the human integrin beta 7, affinity for said epitope increases, the antibody according to (I-1).
  • (I-3) In the presence of at least a region consisting of 417 to 721 amino acid residues of the human integrin beta 7, affinity for said epitope increases, the antibody according to (I-2).
  • (I-4) In the presence of at least a region consisting of 564 to 721 amino acid residues of the human integrin beta 7, affinity for said epitope increases, the antibody according to (I-2).
  • Heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • Heavy chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or heavy chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • And / or a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • Light chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and / or light chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • the antibody according to any one of (I-1) to (I-10), comprising a light chain variable region comprising: (I-12)
  • (I-13) The antibody according to any one of (I-1) to (I-12), which is Fv, scFv, diabody, triabody, tetrabody, or a combination thereof.
  • (I-14) The antibody according to any one of (I-1) to (I-11), comprising a constant region.
  • (I-15) The antibody according to any one of (I-1) to (I-12) and (I-14), which is a chimeric antibody.
  • (I-16) The antibody according to any one of (I-1) to (I-12) and (I-14), which is a humanized antibody.
  • (I-17) The antibody according to any one of (I-1) to (I-12) and (I-14), which is a human antibody.
  • (I-21) The antibody according to any one of (I-1) to (I-20), which has cytotoxic activity.
  • II-22 The antibody according to (I-21), wherein the cytotoxic activity is ADCC activity and / or CDC activity.
  • (I-23) The antibody according to any one of (I-1) to (I-22), which is a multispecific antibody.
  • II-24 The antibody according to any one of (I-1) to (I-23), which is formed by binding cytotoxin.
  • (I-25) The antibody according to any one of (I-1) to (I-24), which is a monoclonal antibody.
  • the polynucleotide (II) includes the polynucleotide shown in the following (II-1).
  • (II-1) A polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the antibody (I).
  • the host cell (III) includes the host cells shown in the following (III-1) or (III-2).
  • III-1) A host cell carrying a polynucleotide (II).
  • III-2) The host cell according to (III-1), which is a eukaryotic cell.
  • the chimeric antigen receptor (IV) includes the chimeric antigen receptors shown in the following (IV-1) to (IV-5).
  • IV-1) A chimeric antigen receptor having the same epitope as the antibody (I).
  • IV-2) The chimeric antigen receptor according to (IV-1), comprising an antigen recognition site of the antibody (I).
  • the antigen recognition site is Heavy chain CDR1, having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, Heavy chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or heavy chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 And / or a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, Light chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and / or light chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • the antigen recognition site is The chimera according to any one of (IV-1) to (IV-3), comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or a light chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Antigen receptor.
  • V Polynucleotide Unlike the polynucleotide (II), the polynucleotide (V) includes the polynucleotide shown in the following (V-1) or (V-2).
  • V-1) A polynucleotide encoding the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor (IV).
  • V-2 The polynucleotide according to (V-1), which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • the cell (VI) includes cells shown in any of the following (VI-1) to (VI-4).
  • (VI-1) A cell carrying the polynucleotide (V).
  • (VI-2) The cell according to (VI-1), which is a eukaryotic cell.
  • (VI-3) The cell according to (VI-1) or (VI-2), which is a T cell or NK cell.
  • (VI-4) The cell according to any one of (VI-1) to (VI-3), which is a chimeric antigen receptor T cell or a chimeric antigen receptor NK cell.
  • the pharmaceutical composition (VII) includes the pharmaceutical compositions shown in the following (VII-1) to (VII-5).
  • (VII-1) A pharmaceutical composition comprising the antibody (I) or the cell (VI).
  • (VII-2) The pharmaceutical composition according to (VII-1) above, wherein the cell is a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • (VII-3) The pharmaceutical composition according to (VII-1) or (VII-2), which is used for treatment of cancer.
  • VII-4) The pharmaceutical composition according to (VII-3), wherein the cancer is blood cancer.
  • (VII-5) The pharmaceutical composition according to (VII-4), wherein the blood cancer is a disease that causes neoplastic growth of plasma cells.
  • (VIII) Disease treatment or prevention method includes the following disease treatment or prevention methods (VIII-1) to (VIII-6).
  • VIII-1) A method for treating or preventing a disease, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody (I) or the cell (VI) to a subject.
  • VIII-2) The method for treatment or prevention according to (VIII-1) above, wherein the cell is a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • VIII-3) The treatment or prevention method according to (VIII-1) or (VIII-2), wherein the disease is cancer and the subject is a patient suffering from cancer or an animal that is likely to suffer from cancer.
  • VIII-4 The treatment or prevention method according to (VII-3), wherein the cancer is blood cancer.
  • VIII-5) The treatment or prevention method according to (VIII-4), wherein the blood cancer is a disease that causes neoplastic growth of plasma cells.
  • VIII-6) Treatment or prevention of multiple myeloma in which the active human integrin beta 7 targets.
  • the use (IX) includes the uses shown in the following (IX-1) to (IX-5).
  • (IX-1) Use of the antibody (I) or the cell (VI) for the manufacture of a pharmaceutical composition.
  • IX-2) The method for treatment or prevention according to (IX-1) above, wherein the cell is a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • (IX-3) The use according to (IX-1) or (IX-2), which is used for treatment of cancer.
  • (IX-4) The use according to (IX-4), wherein the cancer is blood cancer.
  • (IX-5) The use according to (IX-3), wherein the hematological cancer is a disease that causes neoplastic growth of plasma cells.
  • (X) Screening method Screening method (X) includes the following screening methods (X-1) to (X-4).
  • (X-1) Screening for a candidate substance that specifically binds to human integrin ⁇ 7 and binds to a region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 from a compound library, or A screening method for an active ingredient of a pharmaceutical composition for prevention.
  • (X-2) The screening method according to (X-1), further comprising a step of selecting a substance having cytotoxic activity.
  • (X-3) The screening method according to (X-1) or (X-2), wherein the substance to be selected is a monoclonal antibody.
  • (X-4) The screening method according to any one of (X-1) to (X-3), wherein the cancer is a hematological cancer.
  • (IX-5) The screening method according to (X-4), wherein the blood cancer is a disease that causes neoplastic growth of plasma cells.
  • the diagnosis method (XI) includes the following diagnosis methods (XI-1) to (XI-5).
  • (XI-1) A method for diagnosing cancer, comprising a step of bringing a sample collected from a subject into contact with the antibody (I).
  • (XI-2) The diagnostic method according to (XI-1), wherein the sample collected from the subject is blood or bone marrow fluid.
  • (XI-3) The diagnostic method according to (XI-1) or (XI-2), wherein it is judged that the cancer is affected or possibly affected when cells that bind to the antibody (I) are detected.
  • (XI-4) The diagnostic method according to (XI-3), wherein the cancer is blood cancer.
  • (XI-5) The diagnostic method according to (XI-4), wherein the cell is a plasma cell, and the cancer is a disease that causes neoplastic growth of the plasma cell.
  • kit (XII) includes the kits shown in the following (XII-1) to (XII-3).
  • (XII-1) A kit for diagnosing cancer comprising the antibody (I).
  • (XII-2) The diagnostic method according to (XII-1), wherein the cancer is a hematological cancer.
  • (XII-3) The kit according to (XII-2), wherein the cancer is a disease causing neoplastic growth of plasma cells.
  • the antibody of the present invention does not recognize normal cells, it is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition. Among them, it is useful as an active ingredient of a therapeutic drug for cancer (for example, blood cancer).
  • the antibody of the present invention is useful because a chimeric antigen receptor T cell produced by applying its antigen recognition site to a chimeric antigen receptor can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition as described above. is there.
  • Example 2 the result of having analyzed the binding of the MMG49 antibody with the bone marrow cell derived from a myeloma patient using FACS.
  • the figure which shows the identification method of a myeloma progenitor cell fraction (Myeloma progenitor cells), a myeloma plasma cell fraction (Myeloma plasma cells), and a CD45 + white blood cell (CD45 + leukocytes).
  • FIG. 1 The figure which shows the identification method of a myeloma progenitor cell fraction (Myeloma progenitor cells), a myeloma plasma cell fraction (Myeloma plasma cells), and a CD45 + white blood cell (CD45 + leukocytes).
  • FIG. 2 The figure which shows the identification method of a myeloma progenitor cell fraction (Myeloma progenitor cells), a myeloma plasma cell fraction (Myeloma plasma cells
  • Example 2 Results of FACS analysis of binding of MMG49 antibody to myeloma progenitor cell fraction, myeloma plasma cell fraction, and CD45 + leukocyte cells in multiple myeloma patient-derived bone marrow cells (UPN1-5) in Example 2
  • FIG. 3 The identification process of the antigen protein which the MMG49 antibody recognizes by the expression cloning method in Example 3 is shown.
  • the process of concentrating BaF3 cells bound to MMG49 antibody, which was initially 0.1% or less, by FACS sorting is shown.
  • Example 4 shows the results of ITGB7 deficient U266 cells produced using the Crispa-cas9 system, and stained with MMG49 antibody or FIB27 antibody (commercially available anti-integrin beta 7 antibody) and FACS analysis.
  • Example 4 a cell lysate derived from MM1s myeloma cells was immunoprecipitated using MMG49 antibody or isotype control antibody, followed by SDS-PAGE, followed by Western blotting with a commercially available anti-integrin ⁇ 7 antibody (Abcam). The figure which shows the result of having performed.
  • MMG49 antibody, FIB27 antibody against each cell fraction of healthy human peripheral blood cells in the figure, B cell, T cell, monocyte, neutrophil, erythrocyte, and platelet are shown in order from the left), The figure which shows the result of having analyzed the coupling
  • Example 5 the figure which shows the result of carrying out FACS analysis of the coupling
  • the left figure shows a method for identifying each cell fraction
  • the right figure shows the binding of MMG49 to each fraction.
  • A shows a comparison of hematopoietic stem cell and progenitor cell fractions with myeloma cells
  • B shows a comparison of B / T lymphocyte fractions with myeloma progenitor and myeloma plasma cell fractions.
  • Example 6 the figure which shows the result of having analyzed the coupling
  • ITGA4 in the cells shows the results obtained by FACS analysis.
  • Example 7 the presence of Ca 2+ / Mg 2+ or Mn 2+, a 20-minute treatment with integrin alpha 4 beta 7 forcibly expressing K562 cells and human normal peripheral blood-derived T cells at 37 °C, MMG49 antibody or isotype
  • the figure which shows the result of having dye
  • FIG. 1 The figure which shows the presence or absence of the coupling
  • FIG. The figure which put together the result shown in FIG. In the graph of the figure, the vertical axis represents the percentage of cells bound by the antibody, the horizontal axis represents the various human / mouse chimeric integrin beta 7 protein.
  • Example 9 MMG49 antibody-derived CAR-T cells or T cells (control) into which GFP has been introduced, and K562 cells not expressing integrin ⁇ 7 or K562 cells forcibly expressing integrin ⁇ 4 ⁇ 7
  • the amount of IFN- ⁇ produced by co-culture of MMG49 antibody-derived CAR-T cells or GFP-introduced T cells (control) and MMG49 antigen-expressing cells or non-expressing cells in Example 10 by ELISA The figure which shows the result of having quantified.
  • the amount of IL2 produced by co-culture of MMG49 antibody-derived CAR-T cells or T cells introduced with GFP and MMG49 antigen-expressing cells or non-expressing cells in Example 10 was quantified by ELISA.
  • the y-axis of the graph in a figure means a cytotoxic rate (%).
  • Example 12 shows the presence or absence of binding of MMG49 antibody it the construction of human / mouse chimeric integrin beta 7 protein to 293T cells were transiently expressed.
  • the MFI on the horizontal axis represents the binding strength to the MMG49 antibody, and the higher the value, the higher the binding strength.
  • Myeloma progenitor cells are progenitor cells that have not yet differentiated into myeloma plasma cells. CD38 is strongly expressed, but there is no expression of CD138, a marker specific for mature plasma cells. Characterized. Therefore, myeloma progenitor cells may be referred to as “CD38 ++ CD138 ⁇ cells” or “CD19 ⁇ CD38 ++ CD138 ⁇ cells”.
  • Myeloma plasma cells are generally called myeloma cells and are cells that produce M protein, which is an abnormal immunoglobulin.
  • CD138 is expressed in addition to the strong expression of CD38. Therefore, myeloma plasma cells may be referred to as “CD38 ++ CD138 + cells” or “CD19 ⁇ CD38 ++ CD138 + cells”.
  • Myeloma progenitor cells and myeloma plasma cells also mean tumor progenitor cells and neoplastic plasma cells in diseases that cause neoplastic growth of plasma cells other than multiple myeloma, respectively.
  • Hematopoietic progenitor cells are cells that can differentiate into various blood cells. Hematopoietic progenitor cells are characterized by the expression of CD34. Therefore, in the present specification, hematopoietic progenitor cells may be referred to as “CD34 + cells”.
  • the antibody (I) is preferably an anti-human integrin ⁇ 7 antibody having an epitope in a region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 .
  • an antibody with an epitope in the region consisting of 20 to 90 amino acid residues of an antibody or human integrin beta 7 with an epitope in the region consisting of 33 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7 Can do.
  • Human integrin ⁇ 7 is not particularly limited, and is a transmembrane protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, and can be a protein that forms a heterodimer with integrin ⁇ .
  • Specific integrin alpha mention may be made of integrin alpha 4 or integrin alpha E.
  • the specific amino acid sequence of human integrin ⁇ 7 is, for example, listed in the NCBI database in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, ACCESSION: EAW96675; VERSION: EAW96675.1, GI: 119617081, ACCESSION: NM000889; VERSION : NM000889.2, GI: 540344585, ACCESSION: XM005268851, VERSION: XM005268851.2, GI: 767974096, ACCESSION: XM006719376, VERSION: XM006719376.2, GI: 767974098, ACCESSION: XM005268852, VERSION: XM005268852.3, GI: 767974097 And the like.
  • human integrin ⁇ 7 will be based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, but if it is an amino acid sequence of other human integrin ⁇ 7 , homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 was confirmed in silico. Accordingly, those skilled in the art can easily determine which region or site of the human integrin ⁇ 7 amino acid sequence described below corresponds to the region and / or site of human integrin ⁇ 7 described below. it can.
  • Region consisting of 1-19 amino acid residues of the human integrin beta 7 is the signal peptide is a peptide fragment not present when functioning as a membrane protein in vivo.
  • N-terminal when the human integrin beta 7 to function as a membrane protein is a 20 amino acid residue of the amino acid sequence.
  • the region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7 includes PSI domain.
  • the homology between the PSI domain of human integrin ⁇ 7 and the PSI domain of mouse integrin ⁇ 7 is known to be as high as approximately 80% or more, 20-109 containing the PSI domains of human integrin ⁇ 7 and mouse integrin ⁇ 7 comparing the amino acid residues in the region consisting of amino acid residues, as also shown in FIG.
  • the epitope of antibody (I) is preferably related to any one or more of these 15 amino acid residues, preferably 2 or more, more preferably 3 or more.
  • the epitope of antibody (I) is preferably present in the region consisting of amino acid residues 23 to 109 of human integrin ⁇ 7 and is preferably a region consisting of amino acid residues 23 to 48 or 93 to More preferably, it exists in the region consisting of the 109th amino acid residue.
  • the epitope of antibody (I) of another more preferred embodiment is a region consisting of amino acid residues 23 to 48, a region consisting of amino acid residues 93 to 109, or a region consisting of amino acid residues 23 to 48 And a three-dimensional region combining regions consisting of the 93rd to 109th amino acid residues.
  • the epitope of antibody (I) may be a linear epitope or a three-dimensional epitope (also referred to as a non-linear epitope).
  • a linear epitope is a case where consecutive amino acid residues are epitopes, and a steric epitope is known to those skilled in the art as an epitope composed of non-contiguous amino acid residues.
  • the 48th amino acid residue is strongly related as the epitope of antibody (I) or contained in the epitope of antibody (I).
  • antibody (I) is an antibody which specifically binds to a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, which specifically bind to inter alia 23-109 th region It is preferable to specifically bind to regions 23 to 48 and / or 93 to 109.
  • the property of binding to a region consisting of 20 to 109 amino acid residue of the integrin beta 7 is the epitope of an antibody (I), it is sometimes referred to as affinity for epitopes.
  • affinity for epitopes the term “increasing affinity for an epitope” is equivalent to “increasing specific binding ability to an epitope”.
  • the affinity for the epitope of the antibody (I) rises in the presence of at least a region consisting of 379 to 722 amino acid residues of the human integrin beta 7 It is preferable that
  • At least part of the region consisting of amino acid residues 379 to 722 means that the region may be a region consisting of amino acid residues 379 to 722 or a part thereof. . Specifically as "a part of the region", for example, at least a region consisting of 417 to 722 amino acid residues of the human integrin beta 7, consists of 564-722 amino acid residues of the human integrin beta 7 At least part of the region, at least a region consisting of 379 to 563 amino acid residues of the human integrin beta 7, at least a region consisting of 417 to 563 amino acid residues of the human integrin beta 7, or human at least a region consisting of 379 to 416 amino acid residue of the integrin beta 7 and the like. That is, the affinity of the antibody (I) for the epitope can be increased in the presence of these regions.
  • the term "in the presence” is a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, and at least a portion of a region consisting of 379 to 722 amino acid residues of the human integrin beta 7, It can exist in the same molecule, and both regions can exist in separate molecules. Preferably, both regions are present in the same molecule. Note that the term “in the presence” can be read as “by”.
  • a chimeric integrin beta 7 proteins for various human / mouse shown in Example 8 comprises a region consisting of 1-109 amino acid residues of the human-derived integrin beta 7, and, integrin from human beta 7
  • preparing a chimeric integrin beta 7 protein of human / mouse substituted the region consisting of amino residues residues in the region consisting of 379 to 721 th amino remaining residue of the integrin beta 7 from mouse (# 4961).
  • the degree of binding of the antibody (I) is compared with the cell expressing the latter (# 4961) and the cell expressing the former (# 4960), so that the affinity of the antibody (I) for the above epitope Can be confirmed.
  • affinity for the epitope of the antibody (I) is preferably shall be increased by activating the human integrin beta 7. Since activated human integrin ⁇ 7 has structural characteristics in the region containing the epitope, it is considered that the affinity of the antibody (I) for the epitope is increased.
  • human integrin beta 7 are known.
  • cells expressing the human integrin beta 7, for example, plasma cells, NK cells, T cells, B cells, lymphoblasts, derived from Burkitt's lymphoma cells, either blood cells or immune cells such as dendritic cells By causing a phorbol ester such as PMA or a manganese salt to act on cells, human integrin ⁇ 7 expressed in the cells can be activated.
  • a phorbol ester such as PMA or a manganese salt
  • the human integrin beta 7 be treated such as by manganese salts can be activated.
  • Affinity for the epitope of the antibody (I) is to be raised by activating the human integrin beta 7 is by conventional immunoassays described like in the examples below, there those skilled in the art It can be easily confirmed.
  • a chimeric integrin beta 7 proteins for various human / mouse shown in Example 8 prepare the cells expressing # 4960 or # 4961 comprises a region consisting of 1-109 amino acid residues, it After being subjected to the integrin ⁇ 7 activation means as shown in Example 7 and then using an immunological measurement means, the antibody to the cells after activation is compared by comparing before and after the activation treatment. An increase in affinity of (I) for the epitope can be confirmed.
  • Another aspect of the antibody (I) is characterized in that it has a higher affinity for human integrin ⁇ 7 expressed on cells derived from myeloma than human integrin ⁇ 7 expressed on normal cells. it can be an anti-human integrin beta 7 antibodies.
  • the normal cell is not particularly limited as long as it is a cell derived from a healthy person.
  • it can be a normal cell derived from blood, and it is preferable to use a normal plasma cell among such normal cells.
  • Examples of methods for confirming higher affinity for human integrin ⁇ 7 expressed on myeloma cells than human integrin ⁇ 7 expressed on normal cells include the following examples. Can be easily carried out by those skilled in the art by the conventional immunoassay methods described in 1).
  • the “conventional immunoassay” is not particularly limited as long as it is a method using various antibodies regardless of the antigen.
  • a flow cytometry method FACS
  • cell sorting FACS
  • Western blotting ELISA
  • immunoprecipitation method SPR method
  • QCM method QCM method and the like associated therewith can be mentioned.
  • the antibody (I) it is preferable that it has the same epitope as the MMG49 antibody disclosed in Examples described later. Most preferably, it is the same antibody as the MMG49 antibody.
  • the following Examples can be referred to for the production method of MMG49 antibody.
  • an antibody having an aspect including a heavy chain variable region and / or a light chain variable region is preferable. That is, the antibody (I) can be a heavy chain variable region alone or a light chain variable region alone. Preferably, the antibody includes a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • variable region is also called an antigen recognition site and is understood by those skilled in the art as an important site for the antibody to recognize an antigen.
  • a variable region has three regions called hypervariable regions (also called complementarity determining regions [CDRs]), and these CDRs are the most important regions most involved in the antigen recognition function of antibodies. It is also known to those skilled in the art.
  • the heavy chain variable region included in another embodiment of the antibody (I) includes one or more of heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, and heavy chain CDR3. That is, the heavy chain variable region can contain heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, or heavy chain CDR3 alone, and preferably contains at least heavy chain CDR3. More preferred is an embodiment comprising a heavy chain CDR1, a heavy chain CDR2, and a heavy chain CDR3 in this order from the amino terminus (N terminus).
  • the light chain variable region can also be the same as the heavy chain variable region, and includes, for example, any of light chain CDR1, light chain CDR2, or light chain CDR3, and preferably includes at least light chain CDR3. It is preferable that a light chain CDR1, a light chain CDR2, and a light chain CDR3 are included in this order from the N-terminus of the chain variable region.
  • regions other than the respective CDR1 to 3 may be referred to as FR. More specifically, the region between the N-terminus and CDR1 is FR1, the region between CDR1 and CDR2 is FR2, the region between CDR2 and CDR3 is between FR3, and the CDR3 and carboxy terminus (C-terminus). This region is called FR4, and is a name set in each of the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • the amino acid sequences of the heavy chain CDR1 to 3 and the light chain CDR1 to 3 are not particularly limited.
  • the heavy chain CDR1-3 or light chain CDR1-3 of the MMG49 antibody Heavy chain CDR1, having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, Heavy chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Heavy chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, A light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, A light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, A light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, Etc.
  • the heavy chain variable region containing the heavy chain CDRs 1 to 3 for example, a heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 which is the heavy chain variable region of the MMG49 antibody can be mentioned.
  • a preferred embodiment of the light chain variable region comprising the above light chain CDRs 1 to 3 is, for example, the light chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, which is the light chain variable region of the MMG49 antibody.
  • amino acid sequences of the MMG49 antibodies shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 and 6 to 9 are as shown in Table 1 below.
  • the underlined portions provided in the amino acid sequences of the heavy chain and variable region shown in SEQ ID NOs: 4 and 9, respectively, in the table indicate portions located in CDR1, CDR2, and CDR3 in order from the N-terminus.
  • antibody (I) is not limited. Specific structures include Fv, scFv, diabody, triabody, tetrabody, and the like, and a structure in which these are appropriately combined can also be used. In addition, these combined structures are sometimes referred to as fragment antibodies. Such a fragment antibody can be an artificially designed recombinant protein containing Fv or can be fused with a biomolecule such as a protein.
  • Fv is also called the minimum structural unit of an antibody, and is a structure in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are associated by non-covalent intermolecular interaction. Furthermore, a structure in which thiol groups of cysteine residues present in the heavy chain variable region and the light chain variable region are disulfide bonded to each other can also be used.
  • ScFv is a structure in which the C-terminus of the heavy chain variable region and the N-terminus of the light chain variable region are connected by a linker, and is also called a single-chain antibody. Further, the C-terminal and N-terminal connected by a linker may be reversed.
  • the structure of scFv can also be formed by association such as non-covalent intermolecular interaction like Fv.
  • the above-mentioned scFv forms a dimer, a trimer, and a tetramer, respectively.
  • Fv non-covalent intermolecular interactions between variable regions It is a structure that is associated in the most structurally stable state.
  • the antibody (I) having such various structures is constructed by using conventional genetic engineering means to construct an expression vector, and prokaryotic cells (such as E. coli, actinomycetes, etc.) suitable for the production of the antibody. ), Expression systems employing host cells such as eukaryotic cells (yeast cells, insect cells, mammalian cells, etc.), commonly used cell-free expression systems, etc., can be easily produced by those skilled in the art. it can. The produced antibody can also be obtained in a highly purified state by appropriately subjecting it to a conventional purification step.
  • prokaryotic cells such as E. coli, actinomycetes, etc.
  • Expression systems employing host cells such as eukaryotic cells (yeast cells, insect cells, mammalian cells, etc.), commonly used cell-free expression systems, etc., can be easily produced by those skilled in the art. it can.
  • the produced antibody can also be obtained in a highly purified state by appropriately subjecting it to a conventional purification step.
  • a constant region can be contained. It will be understood by those skilled in the art that the constant region includes CH1, CH2, and CH3 if it is a heavy chain constant region and CL if it is a light chain constant region. A region containing CH2 and CH3 may also be called an Fc domain.
  • the origin of the specific constant region is not particularly limited.
  • animal species that can tolerate mass production such as human origin, mouse origin, rat origin, rabbit origin, monkey origin, chimpanzee origin, animal species closely related to humans, animals that are unlikely to produce immunogenicity even when administered to humans
  • constant regions derived from species and the like may be mentioned.
  • the antibody (I) when the heavy chain variable region and / or the light chain variable region has a mouse-derived amino acid sequence, the antibody (I) is combined with a chimeric antibody by combining, for example, human-derived constant regions. can do.
  • the antibody (I) can be converted into a humanized antibody by substituting the heavy chain FR1-4 and / or the light chain FR1-4 with a human-derived amino acid sequence in the above-described chimeric antibody.
  • the antibody (I) is humanized. It can be an antibody.
  • human antibody is sometimes referred to as “fully humanized antibody”.
  • the structure of the antibody (I) of the embodiment containing a constant region includes a heavy chain having a heavy chain variable region and a heavy chain constant region; and a pair of light chains having a light chain variable region and a light chain constant region, respectively.
  • Examples include not only immunoglobulins having the structure of this chain, but also Fab, F (ab ′) 2 , minibody, scFv-Fc and the like. Furthermore, it can also be set as the structure which combined these suitably. In addition, these combined structures are sometimes referred to as fragment antibodies.
  • Such a fragment antibody can be an artificially designed recombinant protein containing Fv or can be fused with a biomolecule such as a protein.
  • Fab includes a heavy chain fragment comprising CH1 in the heavy chain variable region and the heavy chain constant region, and a light chain comprising the light chain variable region and the light chain constant region, the heavy chain variable region and the light chain variable region, Are associated by the non-covalent intermolecular interaction described above or have a structure formed by bonding by a disulfide bond. Furthermore, CH1 and CL can be formed by disulfide bonding between thiol groups of cysteine residues present in each of them.
  • F (ab ′) 2 has a pair of the above-mentioned Fabs, and CH 1 has a structure formed by disulfide bonding between thiol groups of cysteine residues contained therein.
  • a minibody has a pair of antibody fragments containing the above scFv and CH3, and such antibody fragments have a structure in which CH3 are associated with each other by non-covalent intermolecular interaction.
  • scFv-Fc has a pair of antibody fragments containing the above scFv, CH2, and CH3, and associates with each CH3 by non-covalent intermolecular interaction between CH3 as in the above minibody. It has a structure formed by disulfide bonding between thiol groups of cysteine residues contained.
  • the antibody (I) containing constant regions having such various structures is also constructed by using conventional genetic engineering means to construct an expression vector in the same manner as the antibody (I) containing no constant region.
  • Those skilled in the art can easily produce a vector by using an expression system that employs a host cell suitable for antibody production.
  • the produced antibody can also be obtained in a highly purified state by appropriately subjecting it to a conventional purification step.
  • IgG which is an immunoglobulin
  • F (ab ′) 2 can also be obtained by decomposing IgG using a protease such as pepsin.
  • an immunoglobulin a preferred structure is an immunoglobulin.
  • immunoglobulin subtypes are not particularly limited, and examples thereof include IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM.
  • IgG is preferable.
  • IgG2 is preferable among the four subclasses.
  • the antibody of a more preferred embodiment is an antibody comprising a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and / or a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the most preferred antibody is an antibody comprising a heavy chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the above-mentioned amino acid sequence can be introduced with mutations depending on the situation.
  • Such mutations are preferably not made to the heavy and light chain CDRs. That is, it is preferably applied to the heavy chain FR and the light chain FR, and when the antibody (I) contains a constant region, in addition to the mutation for adjusting ADCC activity or CDC activity shown below, further mutation Can be applied.
  • the number of amino acid residues subjected to specific mutagenesis is not particularly limited.
  • the identity between the amino acid sequence before mutagenesis and the amino acid sequence after mutagenesis is about 70%, preferably about 75%, more preferably about 80%, more preferably about 85%, more preferably about 90%, More preferably, it is about 95%, more preferably about 96%, more preferably about 97%, more preferably about 98%, and most preferably about 99%.
  • such a numerical value shall be obtained by rounding off.
  • identity refers to the degree of identical amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences relative to each other. Therefore, it can be said that the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the similarity as well as the identity of those sequences.
  • the amino acid identity can be calculated using commercially available analysis tools (for example, software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, etc.) available through the Internet.
  • main initial conditions generally used for BLAST search are as follows. That is, in Advanced BLAST 2.1, blastp is used for the program, Expect value is 10, Filter is OFF, BLOSUM62 is used for Matrix, Gap existence cost, Per residue gap cost, and Lambda ratio are 11, 1, 0.85, respectively.
  • the amino acid sequence identity value (%) can be calculated.
  • the above-described mutation introduction into the amino acid sequence includes substitution, deletion, insertion and the like.
  • Specific mutagenesis is not particularly limited as long as it can be achieved by employing a conventional method. For example, a conservative replacement technique may be employed for replacement.
  • conservative substitution technique means a technique in which an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, histidine and the like is a conservative substitution technique.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • alanine, valine Amino acid residues having non-polar side chains such as leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues having ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • tyrosine, phenylalanine, tryptophan Substitution with amino acid residues having an aromatic side chain such as histidine is also a conservative substitution technique.
  • the antibody (I) can have cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity refers to an activity that causes some damage to the bound cells as a result of binding of the antibody to the cells.
  • ADCC activity is an abbreviation for antibody-dependent cytotoxicity (antibody-dependent cellular cytotoxicity), and cells having cytotoxic activity such as NK cells expressing a receptor specific for the constant region of an antibody. Is induced in the vicinity of the antibody, and induces damage to the cell to which the antibody binds by the action of such a cell or the like.
  • CDC activity is an abbreviation of complement-dependent cytotoxicity (Complement-Dependent Cytotoxicity), in which an antibody recruits complement in the vicinity and the antibody is bound by the action of such complement. It refers to the activity that induces an action that damages cells.
  • ADCC activity and CDC activity are Lazar GA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103: 4005-10 (2006), Shields RL et al., J Biol Chem, 276: 6591-604 (2001)) , Moore GL et al., J Immunol, 159: 3613-21 (1997), An Z et al., MAbs, 1: 572-9 (2009) The activity can be adjusted.
  • the constant region is a human IgG 1
  • S298A, K334A, S298A / K334A by applying a mutation such S298A / E333A / K334A, ADCC activity Can be raised.
  • the constant region is a human IgG 1, V234A / G237A, by applying a mutation such H268Q / V309L / A330S / P331S, can be lowered ADCC activity.
  • the constant region is human IgG 1
  • the activity is increased if mutations such as S267E, H268F, S324T, S267E / H268F, S267E / S324T, H268F / S324T, S267E / H268F / S324T are performed. be able to.
  • ADCC activity can be measured according to the method of Brunner KT et al. (Brunner, KT, et al., Immunology, 1968. 14: 181-96).
  • myeloma cells are cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS and prepared so that the number of cells is 0.5 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 4 .
  • An appropriate amount of Na 2 51 CrO 4 is added to this, reacted at 37 ° C. for 1 hour, the cells are labeled with 51 Cr, and the washed cells are used as target cells.
  • SCID mouse bone marrow cells cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS, 10 ng / ml mouse GM-CSF, and 40 IU / ml human IL2 can be used.
  • the reaction is carried out at 37 ° C. for 4 hours, and after centrifugation, 51 Cr released into the supernatant is measured with a ⁇ -counter.
  • ADCC activity can be determined based on the following equation.
  • ADCC activity ⁇ ([ 51 Cr release from target cells] ⁇ [Spontaneous 51 Cr release in the absence of antibody]) / ([Maximum 51 Cr release by addition of 1% Triton X-100] ⁇ [Antibody Spontaneous 51 Cr release in the absence of]] ⁇ ⁇ 100
  • CDC activity can also be measured according to the method of Brunner KT et al. (Brunner, KT, et al., Immunology, 1968. 14: 181-96).
  • myeloma cells as target cells are cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS and prepared so that the number of cells is 0.5 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 4 .
  • An appropriate amount of Na 2 51 CrO 4 is added to this, reacted at 37 ° C. for 1 hour, the cells are labeled with 51 Cr, and the washed cells are used as target cells.
  • test antibody or control isotype antibody suspended in RPMI1640 medium supplemented with fetal bovine serum to a 96-well plate to a final concentration of 0.5-50 ⁇ g / mL, then add the target cells and complement. Let react for 1.5 hours. The reaction solution is centrifuged, and 51 Cr released into the supernatant is measured with a ⁇ -counter. CDC activity can be determined based on the following formula.
  • CDC activity ⁇ ([ 51 Cr release from target cells] ⁇ [Spontaneous 51 Cr release in the absence of antibody]) / ([Maximum 51 Cr release by addition of 1% Triton X-100] ⁇ [Antibody Spontaneous 51 Cr release in the absence of]] ⁇ ⁇ 100
  • An antibody having cytotoxic activity can be obtained, for example, by evaluating the presence or absence of cytotoxic activity using the above-described method and selecting an antibody having the activity.
  • a multispecific antibody can be used. That is, it can have an ability to bind with specificity to an antigen other than the region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 (hereinafter referred to as other antigen).
  • an antigen is a region structurally dissimilar consisting 20-109 amino acid residues of the human integrin beta 7. .
  • the specific other antigen is not particularly limited.
  • CD3, CD16, C1q, Adenovirus knob domain and the like can be mentioned, and at least one of them can be appropriately used as another antigen by appropriately combining them.
  • one of the antigens exemplified above is selected as the other antigen. That is, a preferred multispecific antibody is a bispecific antibody.
  • Such multispecific antibodies can be easily produced by those skilled in the art by appropriately adopting conventional techniques.
  • peptide fragments corresponding to the region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, or only a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7 was derived from a human, the rest prepare the hybridomas produced using the antibody-producing cells such as B cells obtained cells expressing chimeric integrin beta 7 which was derived from a non-human, such as mouse-derived from immunized animals, other above
  • a new hybridoma obtained by separately preparing a hybridoma using antibody-producing cells such as B cells obtained from an animal immunized with an antigen, and fusing these hybridomas together (in the case of creating a bispecific antibody) In some cases, this is also referred to as quadroma.)
  • a multispecific antibody is obtained. Door can be.
  • bispecific antibodies (1) An antibody having the above F (ab ′) 2 structure is prepared using the region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 as an epitope: (2) On the other hand, an antibody having a structure of F (ab ′) 2 that specifically binds to another antigen is also prepared: (3) After treating each of the F (ab ′) 2 structure antibodies obtained in (1) and (2) with a reducing agent such as DTT, one of the treated products is further subjected to Elman reagent. Process with: (4) These F (ab ′) 2 structure antibodies after the treatment obtained in (3) are mixed and reacted: Bispecific antibodies can also be prepared by the procedures shown in (1) to (4).
  • Bispecific antibodies can also be produced by the procedures shown in (A) to (D).
  • a cytotoxin (a substance having cytotoxic activity) can be bound.
  • the cytotoxin is not particularly limited as long as it is a substance that causes some damage to the cell, such as killing the cell or suppressing cell proliferation.
  • cytotoxins include, for example, alkylating agents such as cyclophosphamide hydrate, ifosfamide, thiotepa, busulphalan, melphalan, nimustine hydrochloride, ranimustine, dacarpazine, temozolomide; methotrexate, pemetrexed sodium hydrate, fluorouracil , Doxyfluridine, capecitabine, tagafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, fludarabine phosphate ester, nelarabine, cladribine, levofolinate calcium, etc.
  • alkylating agents such as cyclophosphamide hydrate, ifosfamide, thiotepa, busulphalan, melphalan, nimustine hydrochloride, ranimustine, dacarpazine, temozolomide; methotrexate, pemetrexed sodium hydrate, fluorouracil ,
  • Amrubicin hydrochloride mitoxantrone hydrochloride, mitomycin C, actinomycin D, bleomaciin hydrochloride, Antibiotics such as romasin hydrochloride, dinostatin stimamarer, calicheamicin, microtubule inhibitors such as vincristine sulfate, vinblastine sulfate, vindesine sulfate, paclitaxel; anastrozole, exemestane, letrozole, fadrazole hydrochloride water Aromatase inhibitors such as Japanese; platinum preparations such as cisplatin, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin; topoisomerase inhibitors such as irinotecan hydrochloride hydrate, nogitecan hydrochloride, etoposide, sobuzoxane, corticosteroids such as prednisolone, dexamethasone, thalidomide
  • calicheamicin, melphalan, vincristine sulfate, doxorubicin hydrochloride, prednisolone, dexamethasone, thalidomide, lenalidomide, and bortezomib are preferable, and calicheamicin that has a proven record of binding to an antibody is more preferable. It is.
  • cytotoxins are all commercially available and can be selected from one or more of the above-mentioned combinations as appropriate.
  • the binding mode between the cytotoxin and the above-described antibody is not particularly limited.
  • a conventional genetic engineering technique or protein engineering technique those skilled in the art can easily bind the cytotoxin to the above-described antibody. it can. More specifically, a method of binding to a functional group such as an amino group, a thiol group, a guanidyl group, a hydroxyl group or a carboxyl group of the amino acid residue side chain of the antibody (I) through a linker can be mentioned.
  • Antibody (I) may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody is preferable.
  • monoclonal means obtained from a substantially homogeneous population
  • “monoclonal antibody” means an antibody obtained from such a population. That is, it is understood that the individual antibodies contained in such a population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts.
  • an antibody specific binding target for example, which in antibody (I) are those present in the region consisting 20-109 amino acid residues of the human integrin beta 7, if a polyclonal antibody , This is a multiple site in the region consisting of amino acid residues 20-109 of human integrin ⁇ 7 , whereas a monoclonal antibody exhibits high specificity in that it is a single site So it is more advantageous.
  • “monoclonal” used as a modifier is understood as a product obtained from a substantially uniform population as described above, and should not be interpreted as a modifier for which the production method is specified.
  • antibody (I) adopts hybridoma method, recombinant DNA method using host cell (III) holding polynucleotide (II) shown below, isolation from phage library, etc. If it is those skilled in the art, it can manufacture easily.
  • the hybridoma method is used after immunizing an animal suitable for antibody production such as mouse, rat, rabbit, etc. with a peptide corresponding to the region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 and then recovering B cells. And a method for producing the antibody (I) by screening using the function exhibited by the antibody (I) described above as an index.
  • immunize an animal (preferably mouse) suitable for antibody production such as mouse, rat, rabbit, etc., and then collect B cells and use it for hybridoma method to demonstrate the above-mentioned antibody (I)
  • a method for producing the antibody (I) can be exemplified by screening using the function to be performed as an index.
  • the antibody (I) can also be obtained by the method shown in the following screening method (X) using such a function.
  • Antibodies (I) have an epitope in the region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, to cells expressing the integrin beta 7, not only the ADCC activity and CDC activity above, By combining one or more of apoptosis-inducing activity, survival signal blocking activity, and the like, it is expected to exert cytotoxic activity on such cells. Therefore, the composition containing antibody (I) is useful as pharmaceutical composition (IV) as described in detail below.
  • antibody (I) has a region consisting of amino acid residues 20 to 109 of human integrin ⁇ 7 as an epitope, but affinity of antibody (I) for the epitope activates integrin ⁇ 7 To rise. Since active integrin ⁇ 7 is expressed in blood cells such as plasma cells, antibody (I) is used as an active ingredient in pharmaceutical compositions for these cancers (eg, blood cancer). In particular, it is effectively used as a pharmaceutical composition for diseases (eg, myeloma, multiple myeloma, etc.) that cause abnormalities in the above cells.
  • diseases eg, myeloma, multiple myeloma, etc.
  • Polynucleotide (II) is a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the antibody (I).
  • the term “polynucleotide” includes, for example, a single-stranded or double-stranded form in which ribonucleotides, deoxyribonucleotides, or any of these nucleotides are appropriately modified by a known method.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide (II) can be appropriately determined by those skilled in the art, for example, in silico based on the amino acid sequence of the antibody (I).
  • the kind of codon used for determining such a base sequence is not ask
  • the specific nucleotide sequence of the polynucleotide (II) is not particularly limited.
  • Table 2 below shows the correspondence between each SEQ ID NO indicating an amino acid sequence specified as one of the embodiments of the antibody (I) and a SEQ ID NO indicating a base sequence encoding the amino acid sequence. That is, preferred base sequences possessed by the polynucleotide (II) are those shown in SEQ ID NOs: 11 to 20.
  • Polynucleotide (II) may be incorporated in a vector.
  • the vector is not particularly limited, and for example, it can be a cloning vector or an expression vector, and its use is not limited.
  • it can be a vector for prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes, and a vector for eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes
  • eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells.
  • nucleotide sequence encoding a signal peptide can be appropriately added to the 5 ′ terminal side of the polynucleotide (II) (N terminal side in the above antibody (I)).
  • the specific method of using the polynucleotide (II) is not particularly limited. Examples thereof include introduction into the following host cell (III) and use for expression of the antibody (I).
  • the host cell (III) is a cell that retains the polynucleotide (II).
  • retention refers to maintaining the state in which the polynucleotide (II) is present in the cell, and the state in which the cell does not spontaneously excrete the polynucleotide regardless of whether it is positive or not. It means that.
  • the mode in which the host cell (III) holds the polynucleotide (II) is not particularly limited.
  • the polynucleotide can be retained in the form of a vector in the cell, or the polynucleotide (II) can be retained in an integrated form in the genome of the cell.
  • Specific cell types of the host cell (III) may be eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells and mammalian cells, or prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes, and are not particularly limited.
  • a chimeric antigen receptor is an artificial T-cell receptor (TCR) -like protein that expresses an antigen recognition site (corresponding to the extracellular domain) expressed on the cell membrane of T cells. It is a protein constructed so that it can be replaced with a desired antigen recognition site, and functions such as cytotoxic activity of T cells themselves can be more effectively exhibited.
  • TCR T-cell receptor
  • Chimeric antigen receptor (IV) has the same epitope as antibody (I), and more specifically is a protein containing the antigen recognition site of antibody (I). That is, the epitope present in the antigen recognition site contained in the chimeric antigen receptor can be the same as that described in detail for the antibody (I).
  • the antigen recognition site of the antibody (I), spacer sequence, transmembrane domain, costimulatory factor, and intracellular domain of TCR are arranged in order from the N-terminus of the chimeric antigen receptor (IV). It is a protein.
  • the antigen recognition site of the antibody (I) arranged in the chimeric antigen receptor (IV) can be as described in detail for the antibody (I), specifically, the heavy chain variable region and / or A light chain variable region can be mentioned. Of these, the scFv structure is preferable while having a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • a spacer sequence composed of about 10 to 25 amino acid residues can be appropriately provided between the heavy chain variable region and the light chain variable region. More preferably, the number is about 15 to 18.
  • Such a spacer sequence may be the same as or different from the above-described spacer sequence arranged in the chimeric antigen receptor (IV).
  • the spacer sequence arranged in the chimeric antigen receptor (IV) is not particularly limited.
  • it can be composed of about 10 to 25 amino acid residues. More preferably, the number is about 15 to 18.
  • the transmembrane domain arranged in the chimeric antigen receptor (IV) is not particularly limited. Specifically, a transmembrane domain derived from a protein such as CD28 or 4-1BB expressed in T cells or the like can be employed while allowing appropriate mutagenesis.
  • the costimulatory factor arranged in the chimeric antigen receptor (IV) is not particularly limited as long as it is a costimulatory factor possessed by T cells and the like.
  • 4-1BB, OX40, CD28, etc. can be employed while allowing appropriate mutagenesis.
  • the intracellular domain of TCR arranged in the chimeric antigen receptor (IV) is not particularly limited.
  • an intracellular domain derived from CD3 or the like, also called a TCR ⁇ chain can be employed while allowing appropriate mutagenesis.
  • the mutation introduction into CD3 is preferably performed so that ITAM (ImmunoreceptorceptTyrosine-based Activation Motif) is included.
  • the chimeric antigen receptor (IV) preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • amino acid sequence specifying the above chimeric antigen receptor can be appropriately mutagenized. Moreover, the same can be said for the introduction of mutations into the transmembrane domain, costimulatory factor, and intracellular domain of TCR.
  • the number of specific mutation introductions is not particularly limited.
  • the identity between the amino acid sequence before mutagenesis and the amino acid sequence after mutagenesis is about 70%, preferably about 75%, more preferably about 80%, more preferably about 85%, more preferably about 90%, More preferably, it is about 95%, more preferably about 96%, more preferably about 97%, more preferably about 98%, and most preferably about 99%.
  • such a numerical value shall be obtained by rounding off.
  • the above-described mutation introduction into the amino acid sequence includes substitution, deletion, insertion and the like.
  • Specific mutagenesis is not particularly limited as long as it can be achieved by employing a conventional method. For example, a conservative replacement technique may be employed for replacement.
  • V Polynucleotide
  • the polynucleotide (V) is a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor (IV), unlike the polynucleotide (II).
  • the base sequence of the polynucleotide (V) can be determined as appropriate based on the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor (IV) in silico, for example, in the same manner as the polynucleotide (II).
  • the type of codon used for determining the base sequence is not limited. It is preferable to determine the base sequence in consideration of the codon frequency of the cells to be used with the polynucleotide.
  • the specific base sequence is not particularly limited.
  • a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 determined based on the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor (IV) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • the base sequence determined based on such an amino acid sequence is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 in view of the type of codon used.
  • a base sequence encoding a signal peptide can be appropriately added to the 5 ′ end side of the polynucleotide (V) (N-terminal side as referred to in the above chimeric antigen receptor (IV)).
  • the specific method of using the polynucleotide (V) is not particularly limited. Examples thereof include introduction into the following cells (VI) and use for expression of the chimeric antigen receptor (IV).
  • the cell (VI) is a cell that retains the polynucleotide (V), unlike the host cell (III).
  • the term “retention” can be the same as the host cell (III).
  • the specific cell type can be the same as that of the host cell (III), but preferably has cytotoxic activity.
  • T cells, NK cells, K cells and the like can be mentioned, and among them, killer T cells (also referred to as cytotoxic T cells [CTL]) which are a kind of T cells are most preferable.
  • CTL cytotoxic T cells
  • the antigen recognition site of the antibody (I) constituting the chimeric antigen receptor (IV) is outside the cell.
  • the transmembrane domain that is exposed and constitutes the chimeric antigen receptor (IV), the above-mentioned costimulatory factor, or the intracellular domain of TCR is preferably localized in the cell membrane or in the cell.
  • Domains localized to these costimulatory factor or a cell membrane or intracellular, antigen recognition site of the antibody (I) is, when bound to a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7, the cell Activates a signal that induces cytotoxic activity. Moreover, the affinity of the antibody (I) to a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7 is increased by activating the human integrin beta 7. Thus, antibodies (I) exerts attack or cytotoxic activity against the target cells or tissues expressing active integrin beta 7.
  • a T cell When the cell that exhibits such a function is a T cell, it is called a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • VI-4 chimeric antigen receptor T cell
  • NK cells cells with the potential to exert cytotoxic activity
  • the effect similar to that of a chimeric antigen receptor T cell can be exerted by linking the binding to a region to be activated and the operation of a signal that induces cytotoxic activity in the cell membrane or intracellular domain (this is equivalent to the chimeric antigen receptor T cell).
  • Called NK cells Called NK cells.
  • the composition comprising cells (VI) in the same manner as the antibody (I) is It can be said that it is useful as a pharmaceutical composition (IV) as described in detail below.
  • active integrin ⁇ 7 is expressed in blood cells such as plasma cells, it is used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for cancer (eg, blood cancer).
  • a pharmaceutical composition for diseases eg, myeloma, multiple myeloma, etc.
  • compositions include the antibody (I) or the cell (VI).
  • the cell (VI) is preferably a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • the content of the antibody (I) or the cell (VI) in the pharmaceutical composition (VII) is not particularly limited.
  • the amount can be about 0.001 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the pharmaceutical composition.
  • cells (VI) it can be about 1 cell / mL to 10 4 cells / mL.
  • the administration method of the pharmaceutical composition (VII) is not particularly limited. Since the active ingredient is an antibody or a cell, parenteral administration or parenteral administration is preferred. For example, intravenous administration, transmuscular administration, transdermal administration and the like can be mentioned, and intravenous administration is preferable.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition (VII) can be prepared with a conventional pharmaceutically acceptable carrier according to the above administration method. Considering the above-mentioned preferable administration method, an injection is preferable.
  • the target disease of the pharmaceutical composition (VII) is not particularly limited. Specific examples of target diseases include cancer, blood cancer is preferable, and diseases that cause neoplastic growth of plasma cells are more preferable.
  • the term "disease causing plasma cell neoplastic growth" is a disease characterized by neoplastic growth of abnormal plasma cells and an increase in abnormal proteins secreted therefrom. Examples of such diseases include myeloma, multiple myeloma, plasma cell leukemia, plasmacytoma, heavy chain disease, systemic AL amyloidosis and the like.
  • the target disease of the pharmaceutical composition (VII) may be other hematological malignancies such as malignant lymphoma and leukemia.
  • the administration subject (subject) of the pharmaceutical composition (VII) may be a patient suffering from the above-mentioned disease or an animal that may be affected. “May be affected” can be determined by the diagnostic method (XI) described later.
  • the animal can be, for example, a mammal, and is preferably a human.
  • the dosage of the pharmaceutical composition (VII) varies depending on the conditions of the subject, such as the degree of the disease, the degree of the desired effect by administration, body weight, sex, age, animal species, etc. and cannot be determined in general. .
  • the active ingredient when the active ingredient is antibody (I), it can be usually about 1 ⁇ g / kg (body weight) to 10 g / kg (body weight) per day.
  • the active ingredient is cells (VI), it can be usually about 10 4 cells / kg (body weight) to 10 9 cells / kg (body weight).
  • the administration schedule of the pharmaceutical composition (VII) is different depending on the conditions such as the degree of the disease to be administered and cannot be determined in a general manner, like the dosage. For example, it is preferably administered once a day to 1 month in the above-mentioned daily dose.
  • the method for treating or preventing a disease includes the step of administering a therapeutically effective amount of the antibody (I) or the cell (VI) to a subject. It is a preventive method.
  • the cell (VI) is preferably a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • the subject can be the same as the above-mentioned pharmaceutical composition (VII).
  • the therapeutic effect is expected by administering a therapeutically effective amount of the antibody (I) or the cell (VI), and the subject may suffer from the disease. If it is a sex animal, its preventive effect is expected.
  • Prevention means that the numerical value measured by a conventional immunological method does not reach the numerical value determined to be affected by the disease, as shown in the diagnostic method (XI) below.
  • the disease can be the same as the above pharmaceutical composition (VII), and examples include cancer, and preferable cancers include diseases that cause neoplastic growth of plasma cells (for example, multiple myeloma). it can.
  • the therapeutically effective amount can be the same as the dosage of the pharmaceutical composition (VII), and the formulation of the antibody (I) or the cell (VI) is the same as the dosage form of the pharmaceutical composition (VII). The same can be said. Further, the administration method, administration schedule, etc. of the antibody (I) or the cell (VI) can be as described in detail in the pharmaceutical composition (VII).
  • the active human integrin beta 7 may include a method for the treatment or prevention of multiple myeloma that target.
  • the target include application of the antibody (I) or the cell (VI).
  • Use Use is the use of the antibody (I) or the cell (IV) for producing a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be the same as the pharmaceutical composition (VII).
  • the cell (IV) is preferably a chimeric antigen receptor T cell (VI-4).
  • diseases for cancer treatment preferably blood cancer, more preferably plasma cell neoplastic growth (eg, myeloma, multiple myeloma, etc.).
  • plasma cell neoplastic growth eg, myeloma, multiple myeloma, etc.
  • Screening method (X) is a method for screening an active ingredient of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a disease that causes neoplastic growth of plasma cells, from a compound library to human integrin ⁇ 7 specifically binds to, and including the step of selecting the candidate substance which binds to a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7.
  • the pharmaceutical composition can be the same as the above-mentioned pharmaceutical composition (VII), and cancer, preferably hematological cancer, more preferably a disease causing neoplastic growth of plasma cells (for example, myeloma, multiple myeloma, etc.)
  • cancer preferably hematological cancer, more preferably a disease causing neoplastic growth of plasma cells (for example, myeloma, multiple myeloma, etc.)
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition for treating or preventing the above include the antibody (I).
  • the compound library is not particularly limited, and an existing library can be used.
  • An antibody library is preferable, and a hybridoma prepared using antibody-producing cells such as B cells obtained from an animal immunized with a desired antigen is preferably used as the library.
  • the desired antigen is preferably a region made of, for example, 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7. More preferably activated human integrin beta 7.
  • the method for selecting candidate substances is not particularly limited. For example, to screen a candidate substance that specifically binds to human integrin beta 7, and immunological customary that binds to a peptide fragment corresponding to a region consisting of 20 to 109 amino acid residues of the human integrin beta 7 It is possible to adopt a means for confirming and selecting using the automatic measuring means.
  • a candidate substance that specifically binds to human integrin ⁇ 7 is selected, and only the region consisting of amino acid residues 20 to 109 of integrin ⁇ 7 detailed in the above antibody (I) is derived from human, Employs a means to identify and select candidate substances that bind to cells expressing chimeric integrin ⁇ 7 that are otherwise derived from non-human sources such as mice. can do. A means for selecting this can also be adopted.
  • a candidate substance that specifically binds to human integrin ⁇ 7 is selected, and only the region consisting of amino acid residues 20 to 109 of integrin ⁇ 7 detailed in the above antibody (I) is derived from human. Treating cells expressing chimera-type integrin ⁇ 7 that are otherwise derived from non-human sources, such as mice, with phorbol ester, manganese salt, etc., increase the degree of binding before and after treatment. It is also possible to adopt means for confirming candidate substances and selecting them.
  • a candidate substance that specifically binds to human integrin ⁇ 7 is selected, and the region consisting of amino acid residues 111 to 378 of human integrin ⁇ 7 described in detail in antibody (I) above is derived from a mouse. and cells expressing substituted chimeras, a region consisting of 110 to 721 amino acid residues of the human integrin beta 7 was prepared as chimera was replaced with murine origin, to verify the candidate substance having high degree of binding to the former It is also possible to adopt a means for selecting this.
  • the screening method (X) may include a step of selecting candidate substances using an indicator that they have cytotoxic activity.
  • an indicator that they have cytotoxic activity There are no particular limitations on the cells to be confirmed for specific cytotoxic activity. Examples thereof include blood cells that express active human-derived integrin ⁇ 7 characterized by the PSI domain of human integrin ⁇ 7 described above.
  • the step of selecting the candidate substance using an indicator that it has cytotoxic activity may be a step of selecting an antibody having ADCC activity or CDC activity.
  • the candidate substance thus selected by the screening method (X) is preferably an antibody, and more preferably a monoclonal antibody. Most preferred is the antibody (I).
  • the diagnostic method (XI) is a method for diagnosing cancer, and includes a step of contacting a sample collected from a subject with the antibody (I).
  • the subject may be the same as the subject described in detail in the disease treatment or prevention method (VIII).
  • the sample collected from the subject can be blood or bone marrow fluid.
  • the specific diagnostic method is not particularly limited. For example, when a cell that binds to the antibody (I) is detected, it may be determined that the patient is suffering from or may be affected.
  • the degree of binding can be easily determined by those skilled in the art by employing a conventional immunoassay. Depending on the degree measured here, it is possible to determine whether or not the cancer is affected.
  • the specific diagnosis of cancer is not particularly limited.
  • a cell that binds to the above-described antibody (I) is a plasma cell
  • a disease that causes neoplastic proliferation of the plasma cell for example, myeloma
  • Kit kit (XII) is a cancer diagnostic kit containing the antibody (I).
  • the cancer is not particularly limited and can be as described in detail in the above-mentioned pharmaceutical composition (VII), preferably a hematological cancer, more preferably a disease that causes neoplastic growth of plasma cells (for example, Myeloma, multiple myeloma, etc.).
  • a manual can be attached to the kit (XII) as appropriate.
  • the method described in detail in the above-described diagnostic method (XI) can be described as a diagnostic criterion for cancer.
  • Bone marrow mononuclear cells collected from the iliac bones of myeloma patients who obtained informed consent were suspended in ACK solution (150 mM NH 4 Cl and 10 mM KHCO 3 ), and left for 3 minutes at 4 ° C. to erythrocytes. Was removed. After washing the bone marrow mononuclear cells with PBS supplemented with 2% fetal bovine serum, to prevent nonspecific antibody binding, in PBS containing 10% human AB serum for 20 minutes, Blocking was performed at 4 ° C.
  • each antibody labeled with a fluorescent dye was added thereto, stained for 30 minutes at 4 ° C., washed with PBS, and then in PBS containing 1 ⁇ g / ml of propidium iodide (PI). And then subjected to FACS analysis.
  • Cell analysis and cell sorting were performed using a FACS Aria cell sorter (Becton DickinsoncytoImmunocytometry System).
  • APC-conjugated anti-human CD34 antibody (BD Pharmingen)
  • PE-Cy7-conjugated anti-human CD34 antibody (BD Pharmingen)
  • APC / Cy7 -conjugated anti-human CD19 antibody (Biolegend)
  • FITC -conjugated anti-human CD38 antibody (manufactured by eBioscoiences)
  • APC-conjugated anti-human CD138 antibody manufactured by Biolegend
  • PE / Cy7-conjugated anti-human CD3 antibody (manufactured by Biolegend)
  • FITC-conjugated anti-human CD14 Antibody (BD Pharmingen) / PE / Cy7-conjugated anti-human CD45 antibody (Biolegend).
  • Example 1 Preparation of a monoclonal antibody library that binds to myeloma cell lines and does not bind to peripheral blood of healthy individuals In antibody therapy for multiple myeloma, it is necessary to use antibodies that bind to myeloma cells but not normal blood cells. is important. Therefore, such an antibody was identified by the following method. First, 10,000 or more monoclonal antibodies that bind to various myeloma cell lines were prepared using the following procedure.
  • human myeloma cell lines (MM.1s cells, RPMI8226 cells, INA6 cells, U266 cells, OPM2 cells, and KMS12BM cells) are used as antigens and immunized twice a week for the footpad of Balb / c mice. did. Thereafter, the lymph nodes below the knee were taken out, a cell suspension was prepared, and the hybridoma was prepared by cell fusion with the SP2 / 0 mouse myeloma cell line. Cell fusion was performed using a method using polyethylene glycol (PEG method). Hybridomas were then selected by culturing the cells in hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium (HAT medium) (> 10,000 clones).
  • HAT medium hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium
  • a supernatant containing an antibody that binds to the myeloma cell line used for immunization and does not bind to mononuclear cells derived from healthy human peripheral blood was selected using FACS.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • Example 2 Identification of antibodies that specifically bind to myeloma cells in the bone marrow of human multiple myeloma patients Using the approximately 200 clone candidate antibodies obtained in Example 1 above, staining myeloma cells derived from myeloma patients, Analysis was performed using FACS.
  • Each candidate antibody was added to bone marrow cells derived from a patient with multiple myeloma, incubated at 4 ° C for 30 minutes, washed, then added with PE-conjugated anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody and further incubated at 4 ° C for 30 minutes. . After washing, the cells were finally stained with APC-conjugated / anti-human / CD138 / antibody, FITC-conjugated / anti-human / CD38, or PE / Cy7-conjugated / anti-human / CD45. As a negative control, a sample to which Isotype control was added instead of the candidate antibody was prepared at the same time.
  • the MMG49 antibody was identified as an antibody satisfying the above conditions (FIGS. 1 and 2).
  • the Y axis shows the number of cells
  • the X axis shows the binding strength of the MMG49 antibody.
  • Example 3 Identification of antigen protein to which MMG49 antibody binds The antigen protein to which MMG49 antibody binds was identified by expression cloning method.
  • a cDNA library was prepared from MM.1s cells known to bind to the MMG49 antibody using superscript choice system for cDNA synthesis (Invitrogen) and pMXs retrovirus using BstXI adapter (Invitrogen). It was inserted into a virus vector (distributed by Prof. Toshio Kitamura, Institute of Medical Science, University of Tokyo). Infect BaF3 cells with the retrovirus obtained by introducing the thus generated cDNA library into plat-E cells (provided by Prof. Toshio Kitamura) to express a cDNA library derived from MM.1s BaF3 cells were obtained.
  • Example 4 Confirmation that the binding antigen of MMG49 antibody by ITGB7-deficient myeloma cells is ITGB7-expressed protein
  • An ITGB7-deficient U266 myeloma cell line was prepared using Crispa-Cas9 system.
  • a vector was prepared by inserting a double-stranded DNA sequence of an ITGB7-specific target sequence into a PX330 (adgene) vector. It was introduced into U266 cells using Nucleofector (registered trademark) II (Lonza) together with linear hygromycin-resistance gene expression vector (Clontech) as a vector for drug selection. Thereafter, express FIB27 antibody of ITGB7 for clones has increased in medium supplemented with hygromycin; by analyzing with FACS stained and with (anti-integrin beta 7 antibody Biolegend Inc.), identified ITGB7 deficient cells did.
  • Example 5 Healthy human peripheral blood and myeloma patients anti-integrin are measured commercial binding patterns MMG49 antibody in each cell fraction of the bone marrow beta 7 antibody; using (FIB27 antibody Biolegend Inc.) and MMG49 antibodies, healthy human peripheral blood and Binding to various cell fractions in bone marrow cells was measured.
  • Fc receptor blocking reagent (Miltenyi) was added to block nonspecific antibody binding, and then MMG49 antibody, FIB27 antibody, or Isotype control As a secondary antibody, PE-conjugated / anti-mouse / IgG / antibody was added and further incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
  • bone marrow cells of myeloma patients were similarly stained with MMG49 antibody, and finally APC-conjugated anti-human CD34 antibody (BD Pharmingen) Alexa647-conjugatged human CD3 (BD Pharmingen), Cy7APC-conjugated anti-CD19 human antibody (BD Pharmingen), PE-Cy7-conjugated anti-CD38 human Staining was performed using an antibody (BD Pharmingen) or FITC-conjugated anti-CD14 human antibody (BD Pharmingen).
  • BD Pharmingen APC-conjugated anti-human CD34 antibody
  • Alexa647-conjugatged human CD3 BD Pharmingen
  • Cy7APC-conjugated anti-CD19 human antibody BD Pharmingen
  • PE-Cy7-conjugated anti-CD38 human Staining was performed using an antibody (BD Pharmingen) or FITC-conjugated anti-CD14 human antibody (BD Pharm
  • the binding of the MMG49 antibody in each fraction was measured by analyzing using myeloma FACS derived from myeloma patients after staining (FIG. 7). These results indicate that the MMG49 antibody binds strongly to myeloma cells, but hardly binds to all normal blood cells including hematopoietic stem cell and progenitor cell fractions.
  • Example 6 Analysis of binding of MMG49 to various cell lines
  • the binding of MMG49 antibody and FIB27 antibody in various cell lines was analyzed using FACS.
  • the staining method is the same as that for the peripheral blood shown in Example 5 above.
  • integrin ⁇ 7 is known to be expressed on the cell surface by forming a heterodimer with integrin ⁇ 4 or integrin ⁇ E , Alexa647-cojugated anti-human CD49d antibody (Biolegend) and APC-conjugated anti These expressions were simultaneously analyzed using FACS using -human CD103 antibody (Biolegend). Note that the CD103 showed the integrin alpha E, it shows the integrin alpha 4 and CD49d. In addition, in the same manner as in Experimental Example 5, the expression levels of integrin ⁇ E and integrin ⁇ 4 in peripheral blood derived from healthy subjects were also examined (FIG. 8).
  • ITGA4 was expressed in most myeloma cell lines and ITGAE was not expressed in any cell line.
  • FIB27 antibody bound to all myeloma cell lines, the binding of MMG49 antibody did not match the expression level of FIB27 antibody.
  • FMG examined the binding of MMG49 antibody and FIB27 antibody to ITGA4-deficient U266 cells prepared using the Crispa-Cas9 system the binding to U266 cells disappeared due to ITGA4 deficiency.
  • both MMG49 antibody and FIB27 antibody recognized ⁇ 7 integrin expressed as ⁇ 4 ⁇ 7 integrin.
  • Example 7 Analysis of the relationship between integrin activation and MMG49 antibody binding Considering the above-mentioned specific binding mode of MMG49 antibody, it is speculated that MMG49 antibody is activated and recognizes integrin ⁇ 7 whose structure has changed. It was.
  • K562 cells forcibly expressing ⁇ 4 ⁇ 7 and human normal peripheral blood CD4 T cells concentrated using CD4 T cell enrichment kit were washed with 5 mM EDTA / HBS, and then 1 mM Ca 2+ / Incubate with MMG49 antibody or FIB27 antibody at room temperature for 30 minutes in 1mM Mg2 + / HBS (low activity buffer) or 2mM Mn2 + / HBS (activation buffer), wash, and PE-conjugated anti as a secondary antibody -mouse IgG antibody was added and further incubated at room temperature for 30 minutes. By analyzing these using FACS, the binding of MMG49 antibody and FIB27 antibody in cells in which integrin ⁇ 4 ⁇ 7 was activated was measured.
  • BD pharmingen CD4 T cell enrichment kit
  • Example 8 Identification of epitopes essential for recognition of MMG49 antibody
  • eight types of human / mouse chimeric integrin ⁇ 7 protein expression as shown in FIG. A vector was prepared.
  • Each expression vector was introduced into 293T cells by the lipofection method, and the presence or absence of binding of the MMG49 antibody was analyzed 48 hours later.
  • the cells were suspended in PBS supplemented with 1% fetal bovine serum, MMG49 antibody was added, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After washing, Alexa488-anti-mouse IgG antibody was added, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then analyzed by FACS.
  • the region consisting of the 110th to 721st amino acid residues is derived from the mouse, and other regions (the 20th to 109th amino acid residues and the 722 to 798th amino acid residues). It has been clarified that the entire region binds strongly to the chimeric integrin ⁇ 7 protein (# 4960), which is a human-derived sequence, in the same manner as the chimeric integrin ⁇ 7 protein (# 4927) (# 4927). Figures 11-13.
  • the region consisting of amino acid residues 722 to 798 includes a transmembrane domain (TM) and intracellular domain (cytoplasmic), and that the region consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal peptide. It was shown that an epitope essential for binding to the MMG49 antibody exists in a region consisting of amino acid residues 20 to 109 containing the PSI domain.
  • the integrin ⁇ 7 protein (# 4961) has a slightly increased binding power of the MMG49 antibody compared to the chimeric integrin ⁇ 7 protein (# 4960), and the full length of the human integrin ⁇ 7 protein (# 4927) It became clear that it became the completely same binding level as the case.
  • the region consisting of the 20th to 109th amino acid residues shown to contain the epitope of the above-mentioned MMG49 antibody and the region corresponding to the signal peptide consisting of the 1st to 19th amino acid residues include the 1st to 378th positions
  • the chimeric integrin ⁇ 7 protein (# 4945), whose region consisting of human is derived from human and whose region consisting of amino acid residues from 417 to 798 is derived from human, is the region where the region consisting of amino acid residues from 1 to 563 is mouse derived from, and, chimeric integrin beta 7 protein (# 4946) region consisting 564-798 amino acid residue is derived from a human, and the region consisting of
  • the specific binding force, ie affinity, of the MMG49 antibody integrin ⁇ 7 to the region consisting of the 20th to 109th amino acid residues is the amino acids 379 to 721 of human integrin ⁇ 7.
  • Example 9 Determination of base sequence of antibody molecule variable region of MMG49 antibody Confirmation of MMG49 antibody subclass using Isotyping kit (Roche) confirmed that it was IgG2a subclass. Furthermore, the base sequence and amino acid sequence of the variable region of the MMG49 antibody were determined.
  • the sequencing method was performed using Smarter® RACE® cDNA amplification kit (Clontech). That is, using cDNA prepared from mRNA derived from the hybridoma MMG49 producing the MMG49 antibody as a template, the cDNA fragments of the H chain and ⁇ chain variable region were amplified by PCR reaction, and the nucleotide sequences were decoded. Tables 3 and 4 below show the amino acid sequence, base sequence, and excess variation region (CDR1 to 3) of the decoded heavy chain variable region.
  • Tables 3 and 4 below also show the amino acid sequence, base sequence, and excess variable region (CDR1-3) of the decoded L chain ( ⁇ chain) variable region.
  • variable region sequence of the isolated MMG49 antibody a chimeric antibody was prepared by binding the variable region cDNA to the constant region sequence of human IgG4 constant region and human IgL kappa chain. Specifically, after inserting each variable region sequence into pFuse-CH-Ig-hG4 and pFuse-CL-Ig-hk (invivogen) using In-Fusion cloning kit (Takara), FreeStyle CHO- The chimerized antibody that was introduced into S cells (Invitrogen) and secreted into the culture supernatant was recovered.
  • MM1s cells to which MMG49 antibody binds and KMS12BM cells to which MMG49 antibody does not bind are incubated in a buffer containing MMG49-hIgG4, washed, and then biotinylated anti-human IgG (Rockland) is added as a secondary antibody. After washing again, staining was performed by adding streptavidin-PE (Biolegend), and FACS analysis was performed. As a result, MMG49-hIgG4 showed the same staining pattern as the original MMG49 antibody, suggesting that the obtained variable region sequence was correct (FIG. 14).
  • Example 10 Production of chimeric antigen receptor T cell using antibody molecule variable region of MMG49 antibody Chimeric antigen receptor T cell (hereinafter referred to as MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cell) using MMG49 antibody molecule variable region sequence.
  • the production was performed according to the following procedure with reference to Non-Patent Documents 2 to 4.
  • the combined chimeric cDNA was cloned using Zeroblunt PCR cloning kit (Invitrogen), and then sequenced to confirm the nucleotide sequence. Further, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 21) confirmed based on the confirmed base sequence and the base sequence (SEQ ID NO: 22) are shown in the sequence listing.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 does not contain the Kozak sequence (gaattccacc) shown in SEQ ID NO: 23, but is converted from the disclosed codon (atg) immediately following it into an amino acid sequence.
  • the MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor cDNA retroviral vector prepared above was introduced into 293T cells using lipofectamine 2000 (Invitrogen) together with gag / pol and VSV-G envelope expression vector to prepare a retrovirus. The supernatant was collected 48 hours after gene introduction and used as a virus solution.
  • human peripheral blood mononuclear cells were added to a 48-well plate coated with anti-CD3 antibody (eBioscience) and cultured for 72 hours. Peripheral blood mononuclear cells were stimulated using X-VIVO15 (Lonza) supplemented with 10% human AB serum and IL-2 (175IU / L). Then, the virus solution prepared above was added to a 48-well plate coated with Retrotronectin (Takara), adsorbed to Retrotronectin by centrifugation at 1700xg for 120 minutes, and then stimulated peripheral blood mononuclear cells (T cells) And the gene was introduced into this.
  • Retrotronectin Retrotronectin
  • MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells were amplified by continuing the culture in the above-mentioned medium and used for the following studies.
  • T cells expressing a CAR construct using the variable region of the MMG49 antibody were stained with PE-anti-human F (ab ') 2 antibody (Jackson Laboratory), and were proportional to the expression of GFP indicating the introduction of the construct.
  • PE-anti-human F (ab ') 2 antibody Jackson Laboratory
  • the expression of human F (ab ′) 2 was detected (FIG. 16). That is, it was confirmed that the introduced CAR was expressed on the cell surface.
  • Example 9 Recognition of ITGB7-expressing tumor cells by MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells and analysis of cytotoxic activity MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells prepared by the method described above or control T cells introduced with GFP alone and integrin ⁇ 7 co-cultured with K562 cells K562 cells or integrin alpha 4 beta 7, which do not express was forcibly expressed, and quantify the amount of cytokine produced. Specifically, 1 ⁇ 10 5 T cells and target cells were added to a 96-well plate. After 24 hours, the supernatant was collected, and the amount of IFN- ⁇ produced was measured by ELISA. The measurement was performed using a Quantikine kit (R & D).
  • myeloma cell lines (MM.1s cells, RPMI8226 cells, and JJN3 cells) or MMG49 antibodies bind to MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells or control T cells into which only GFP has been introduced Cells that did not (KMS12BM, Molt4, and Raji cells) were co-cultured and the amount of cytokines produced in the same manner was quantified.
  • K562 cells that do not express integrin ⁇ 7 or K562 cells forcibly expressed integrin ⁇ 4 ⁇ 7 as target cells are cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS, and the number of cells is 0.5 to 1.0. x10 4 were prepared.
  • the cytotoxic rate (%) was determined based on the following formula (1).
  • myeloma cell lines (MM1s cells, RPMI8226 cells, and JJN3 cells) that bind MMG49 antibody to MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells or control T cells into which only GFP has been introduced, or cells that do not bind MMG49 antibody (KMS12BM, Molt4, and Raji cells) were co-cultured and examined in the same manner.
  • KMS12BM, Molt4, and Raji cells cells that do not bind MMG49 antibody
  • the above results indicate that the MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells can specifically damage cells expressing the antigen recognized by the MMG49 antibody.
  • Example 11 Analysis of in vivo bone marrow tumor cell exclusion ability by MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells Using MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells, the therapeutic effect on multiple myeloma in vivo was examined.
  • Myeloma cell line MM1s cells (4 ⁇ 10 5 cells) were transplanted into the bone marrow of NOG mice irradiated with 2.4 Gy. Five days later, the mice were divided into an MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cell administration group and a control T cell administration group, and 5 ⁇ 10 6 mice were administered intravenously. Seven days later, bone marrow analysis revealed that all mice showed prominent myeloma cell proliferation in the control T cell administration group, whereas MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells. In the treatment group, the tumor had almost completely disappeared. These results indicate that administration of the MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cells has the ability to eliminate tumors expressing the MMG49 antigen even in vivo (FIG. 22).
  • the myeloma cell line MM1s cells (5 ⁇ 10 6 cells) into which the luciferase gene was introduced were transplanted into the vein of NOG mice irradiated with 2.4 Gy. Five days after transplantation, the degree of tumor cell engraftment was measured using the IVIS imaging system (Perkin Elmer). Thereafter, the mice were divided into an MMG49 antibody-derived chimeric antigen receptor T cell administration group and a control T cell administration group, and 3 ⁇ 10 6 mice were intravenously administered 5 days and 7 days after transplantation. Seven days after the second T cell administration, the tumor volume was measured again using the IVIS imaging system, and clearly all myeloma cells proliferated in the control T cell administration group.
  • Example 12 With respect to the epitope of MMG49 antibody, an experiment was conducted to examine the results examined in Example 8 in more detail.
  • MMG49 antibody is a region mice consisting of 1-32 second and 91-798 amino acid residue of the integrin beta 7 protein, and, other (33-90 amino acid residues consisting region) (in FIG. 25, Ch5.1) chimeric integrin beta 7 protein is the sequence of human-derived, (in FIG. 11, # 4927) integrin beta 7 full-length protein is derived from human to bind substantially similarly strongly in the case of It became clear (FIG. 25).
  • Example 13 Expression of various mutants (R35E / N36D, H38D, M41L / L42Q, and A48V) in which only one or two amino acids of human integrin ⁇ 7 , mouse integrin ⁇ 7 , and human integrin ⁇ 7 are mutated to amino acid sequences derived from mice
  • the vector to be introduced was introduced into 293T cells by the lipofection method, and then the experiment was conducted in the same manner as in Example 8.
  • FIG. 25 only A48V variant avidity for MMG49 antibody significantly reduced compared to the human integrin beta 7, it became clear that close to a number of mouse mouse integrin beta 7. From this result, 48 amino acid residues of the human integrin beta 7 was found to be included in the epitope of the relevant or MMG49 antibody strongly to an epitope of MMG49 antibody.

Abstract

骨髄腫治療用の医薬組成物の有効成分の提供。　ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体。

Description

抗体
　新たな抗体およびその利用などが開示される。
　形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の代表例である多発性骨髄腫は、全ての癌の中のおよそ１％を占め、全ての血液学的悪性腫瘍の１０％強を占める。多発性骨髄腫とは、骨髄に存在する形質細胞が癌化し（結果として異常な形質細胞となる）、単クローン性に増殖する疾患である。
　多発性骨髄腫では、異常な形質細胞（骨髄腫細胞）が体中の骨髄に広がり、全身の骨髄の至るところで増殖する。異常な形質細胞が増殖すると、骨の破壊を含む様々な症状が現れる。骨髄腫細胞からは、異常免疫グロブリンであるＭタンパク質が産出され、血中のＭタンパク質濃度が上昇することにより、血液が粘稠になる。
　Ｍタンパク質は、体内に侵入した病原体などの異物を認識するという本来の抗体としては機能しないため、免疫力の低下も引き起こす。これらが多くの臓器に影響を与え、様々な徴候が生じる。代表的な徴候は、骨の痛みと損傷、高カルシウム症、腎障害や腎不全、貧血などである。
　現在、多発性骨髄腫の治療として、プロテアソーム阻害剤、サリドマイドとその誘導体であるレナリドマイドなどのiMIDs、およびメルファランとプレドニゾンとの併用などの化学療法、並びに造血幹細胞移植が主に行われている。
　しかし、骨髄腫細胞は、ほとんどの場合、やがてこれらの治療薬に対して抵抗性を獲得する。このため、現在の治療手段では、発症後の平均生存期間は３～５年程度であり、骨髄腫患者の予後は厳しいのが現実である。また、これらの治療薬は、標的とする腫瘍細胞にだけ特異的に作用するものではないため、正常な細胞に対しても毒性を示し、結果として重篤な副作用を伴うという問題がある。
　モノクローナル抗体を利用した多発性骨髄腫の治療法の開発が試みられている。例えば、抗CS1抗体、および抗CD38抗体などが有望視されている（非特許文献１および２）。そして、特許文献１には抗ヒトCD48モノクローナル抗体を有効成分とする多発性骨髄腫などを対象とする治療薬が開示されている。
　インテグリンは、生体内においては主としてα鎖とβ鎖とのヘテロダイマーを形成し、細胞表層上にてレセプターとしての機能を果たす。このようなインテグリンのα鎖とβ鎖の組みわせは多岐に渡る。
　また、非特許文献４～６には、特定の抗原に対して親和性を有する抗原認識部位を含むキメラ抗原受容体T細胞（CAR-T細胞）が開示されている。
国際公開公報２０１０／１１７０５９
Journal of Clinical Oncology, 2012 Jun 1; 30(16): 1953-9. Journal of immunology, 2011 Feb 1; 186(3): 1840-8. J Biol Chem. 2012 May 4;287(19):15749-59. J Immunol. 2009 Nov 1;183(9):5563-74. N Engl J Med. 2014 Oct 16;371(16):1507-17. Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):70-5.
　抗CS1抗体は骨髄腫細胞への特異性は比較的高いが、抗体単独での抗骨髄腫効果は高いとはいえず、単剤での有効性は臨床試験では示されていない。レナリドマイドとの併用により抗CS1抗体の抗腫瘍効果が上昇するということが見出され、この併用による承認を目指していると思われる。一方、CD38は、CD34陽性造血前駆細胞を含む多くの正常な血液細胞にも発現しているため、多発性骨髄腫の治療ターゲットとして特異性の低い抗原である。このような現状のもと、多発性骨髄腫等の形質細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患等の治療により有効な手段を提供することが１つの課題である。
　本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、骨髄腫細胞およびその前駆体に特異的に結合することを指標にスクリーニングを行ってMMG49抗体を得た。そして、斯かる抗体がヒトインテグリンβ7の特定の領域に結合することを確認し、斯かる抗体の抗原認識部位を用いて作製したCAR-T細胞が、骨髄腫の治療に非常に有用であることを見出した。また、MMG49抗体のエピトープが、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に存在することも明らかにした。
　本発明はこのような知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を包含する。
(I)　抗体
抗体(I)は、以下の(I-1)～(I-25)に示す抗体を包含する。
(I-1)
抗ヒトインテグリンβ7抗体であって、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体。
(1-1A)
　ヒトインテグリンβ7の33～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する、(I-1)に記載の抗体。
(1-1B)
　ヒトインテグリンβ7の20～90番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する、(I-1)に記載の抗体。
(1-1C)
　ヒトインテグリンβ7の33～90番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する、(I-1)に記載の抗体。
(I-2)
ヒトインテグリンβ7の379～721番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-1)に記載の抗体。
(I-3)
ヒトインテグリンβ7の417～721番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-2)に記載の抗体。
(I-4)
ヒトインテグリンβ7の564～721番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-2)に記載の抗体。
(I-5)
ヒトインテグリンβ7の379～563番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-2)に記載の抗体。
(I-6)
ヒトインテグリンβ7の417～563番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-2)に記載の抗体。
(I-7)
ヒトインテグリンβ7の379～416番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-2)に記載の抗体。
(I-8)
ヒトインテグリンβ7を活性化することにより、前記エピトープへの親和性が上昇する、(I-1)～(I-7)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-9)
抗ヒトインテグリンβ7抗体であって、正常細胞上にて発現するヒトインテグリンβ7よりも、骨髄腫細胞上で発現するヒトインテグリンβ7に対して親和性が高い抗体。
(I-10)
MMG49抗体と同一のエピトープを有する、(I-1)～(I-9)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-11)
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および／または
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号７に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および／または
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、(I-1)～(I-10)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-12)
配列番号４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または
配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、(I-1)～(I-10)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-13)
Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、またはこれらの組み合わせである、(I-1)～(I-12)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-14)
定常領域を含む、(I-1)～(I-11)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-15)
キメラ抗体である、(I-1)～(I-12)および(I-14)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-16)
ヒト化抗体である、(I-1)～(I-12)および(I-14)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-17)
ヒト抗体である、(I-1)～(I-12)および(I-14)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-18)
イムノグロブリン、Fab、F(ab')2、ミニボディ（minibody）、scFv-Fc、またはこれらの組みあわせである、(I-1)～(I-12)および(I-14)～(I-17)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-19)
IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMである、(I-1)～(I-12)および(I-14)～(I-18)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-20)
配列番号５に示すアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、(I-1)～(I-12)および(I-14)～(I-19)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-21)
細胞障害活性を有する、(I-1)～(I-20)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-22)
細胞障害活性が、ADCC活性および／またはCDC活性である、(I-21)に記載の抗体。
(I-23)
多重特異性抗体である、(I-1)～(I-22)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-24)
サイトトキシンが結合してなる、(I-1)～(I-23)のいずれか１項に記載の抗体。
(I-25)
モノクローナル抗体である、(I-1)～(I-24)のいずれか１項に記載の抗体。
(II)　ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド(II)は、以下の(II-1)に示すポリヌクレオチドを包含する。
(II-1)
上記抗体(I)のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(III)　宿主細胞
宿主細胞(III)は、以下の(III-1)または(III-2)に示す宿主細胞を包含する。
(III-1)
ポリヌクレオチド(II)を保持する宿主細胞。
(III-2)
真核細胞である、(III-1)に記載の宿主細胞。 
(IV)　キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体(IV)は、以下の(IV-1)～(IV-5)に示すキメラ抗原受容体を包含する。
(IV-1)
上記抗体(I)と同一のエピトープを有するキメラ抗原受容体。
(IV-2)
上記抗体(I)の抗原認識部位を含む、(IV-1)に記載のキメラ抗原受容体。
(IV-3)
抗原認識部位が、
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および/または
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号７に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および／または
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、(IV-1)または(IV-2)に記載のキメラ抗原受容体。
(IV-4)
抗原認識部位が、
配列番号４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または
配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、(IV-1)～(IV-3)のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
(IV-5)
配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する(IV-1)～(IV-4)のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
(V)　ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド(V)は、上記ポリヌクレオチド(II)とは異なり、以下の(V-1)または(V-2)に示すポリヌクレオチドを包含する。
(V-1)
上記キメラ抗原受容体(IV)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
(V-2)
配列番号２２に示す塩基配列を有する、(V-1)に記載のポリヌクレオチド。
(VI)　細胞
細胞(VI)は、上記宿主細胞(III)とは異なり、以下の(VI-1)～(VI-4)のいずれかに示す細胞を包含する。
(VI-1)
上記ポリヌクレオチド(V)を保持する細胞。
(VI-2)
真核細胞である、(VI-1)に記載の細胞。
(VI-3)
T細胞またはNK細胞である、(VI-1)または(VI-2)に記載の細胞。
(VI-4)
キメラ抗原受容体T細胞またはキメラ抗原受容体NK細胞である、(VI-1)～(VI-3)のいずれか１項に記載の細胞。
(VII)　医薬組成物
医薬組成物(VII)は、以下の(VII-1)～(VII-5)に示す医薬組成物を包含する。
(VII-1)
上記抗体(I)または上記細胞(VI)を含む医薬組成物。
(VII-2)
上記細胞がキメラ抗原受容体T細胞(VI-4)である、上記(VII-1)に記載の医薬組成物。
(VII-3)
癌の治療用である、(VII-1)または(VII-2)に記載の医薬組成物。
(VII-4)
癌が血液癌である、(VII-3)に記載の医薬組成物。
(VII-5)
血液癌が、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(VII-4)に記載の医薬組成物。
(VIII)　疾患の治療または予防方法
疾患の治療または予防方法(VIII)は、以下の(VIII-1)～(VIII-6)に示す疾患の治療または予防方法を包含する。
(VIII-1)
上記抗体(I)または上記細胞(VI)の治療有効量を被験体に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法。
(VIII-2)
上記細胞がキメラ抗原受容体T細胞(VI-4)である、上記(VIII-1)に記載の治療または予防方法。
(VIII-3)
疾患が癌であり、かつ被験体が癌に罹患する患者または癌に罹患する可能性のある動物である、(VIII-1)または(VIII-2)に記載の治療または予防方法。
(VIII-4)
癌が血液癌である、(VII-3)に記載の治療または予防方法。
(VIII-5)
血液癌が、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(VIII-4)に記載の治療または予防方法。
(VIII-6)
　活性型ヒトインテグリンβ7を標的とした多発性骨髄腫の治療または予防方法。
(IX)　使用
使用(IX)は、以下の(IX-1)～(IX-5)に示す使用を包含する。
(IX-1)
医薬組成物を製造するための、上記抗体(I)または上記細胞(VI)の使用。
(IX-2)
上記細胞がキメラ抗原受容体T細胞(VI-4)である、上記(IX-1)に記載の治療または予防方法。
(IX-3)
癌の治療用である、(IX-1)または(IX-2)に記載の使用。
(IX-4)
癌が血液癌である、(IX-4)に記載の使用。
(IX-5)
血液癌が、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(IX-3)に記載の使用。
(X)　スクリーニング方法
スクリーニング方法(X)は、以下の(X-1)～(X-4)に示すスクリーニング方法を包含する。
(X-1)
化合物ライブラリーからヒトインテグリンβ7に特異的に結合し、且つ、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に結合する候補物質を選別する工程を含む、癌の治療用または予防用の医薬組成物の有効成分のスクリーニング方法。
(X-2)
さらに、細胞障害活性を有する物質を選別する工程を含む、(X-1)に記載のスクリーニング方法。
(X-3)
選別される物質がモノクローナル抗体である、(X-1)または(X-2)に記載のスクリーニング方法。
(X-4)
癌が血液癌である、(X-1)～(X-3)のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。(IX-5)
血液癌が、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(X-4)に記載のスクリーニング方法。
(XI)　診断方法
診断方法(XI)は、以下の(XI-1)～(XI-5)に示す診断方法を包含する。
(XI-1)
被験体から採取したサンプルと、上記抗体(I)とを接触させる工程を含む、癌の診断方法。
(XI-2)
被験体から採取したサンプルが、血液または骨髄液である、(XI-1)に記載の診断方法。
(XI-3)
上記抗体(I)と結合する細胞が検出された場合に癌に罹患した、または罹患する可能性があると判断する(XI-1)または(XI-2)に記載の診断方法。
(XI-4)
癌が血液癌である、(XI-3)に記載の診断方法。
(XI-5)
該細胞が形質細胞であり、かつ該癌が形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(XI-4)に記載の診断方法。
(XII)　キット
キット(XII)は、以下の(XII-1)～(XII-3)に示すキットを包含する。
(XII-1)
上記抗体(I)を含む、癌の診断用キット。
(XII-2)
癌が血液癌である、(XII-1)に記載の診断方法。
(XII-3)
癌が、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である、(XII-2)に記載のキット。
　本発明の抗体は、正常細胞を認識しないため、医薬組成物の有効成分として有用である。なかでも癌（例えば血液癌）の治療薬の有効成分として有用である。
　本発明の抗体は、その抗原認識部位をキメラ抗原受容体に適用することにより製造されるキメラ抗原受容体T細胞を、上述のような医薬組成物の有効成分として用いることができるので、有用である。
実施例２において、骨髄腫患者由来骨髄細胞に対するMMG49抗体の結合をFACSを用いて解析した結果。（左）骨髄腫前駆細胞分画（Myeloma progenitor cells）、骨髄腫形質細胞分画（Myeloma plasma cells）、およびCD45+白血球細胞（CD45+ leukocytes）の同定方法を示す図。（右）各分画に対するMMG49抗体の結合を示す図。 実施例２において、複数の骨髄腫患者由来骨髄細胞（UPN1～5）の骨髄腫前駆細胞分画、骨髄腫形質細胞分画、およびCD45+白血球細胞に対するMMG49抗体の結合をFACSにて解析した結果を示す図。 実施例３における、発現クローニング法によるMMG49抗体が認識する抗原タンパクの同定過程を示す。当初0.1%以下であったMMG49抗体に結合するBaF3細胞をFACSソーティングにより濃縮した過程を示す。 実施例４において、Crispa-cas9システムを用いて作製したITGB7欠損U266細胞を、MMG49抗体またはFIB27抗体（市販の抗インテグリンβ7抗体）で染色しFACS解析した結果を示す図。 実施例４において、MM1s骨髄腫細胞由来の細胞溶解液から、MMG49抗体またはisotype control抗体を用いて免疫沈降したものをSDS-PAGEし、次いで市販の抗インテグリンβ7抗体（アブカム社）でウェスタンブロットを行った結果を示す図。 実施例５において、健常人末梢血細胞の各細胞分画（図中、左から順にB細胞、T細胞、単球、好中球、赤血球、および血小板を示す）に対する、それぞれMMG49抗体、FIB27抗体、およびFIB504抗体の結合をFACSを用いて解析した結果を示す図。 実施例５において、骨髄腫患者由来骨髄細胞の各細胞分画に対する、それぞれMMG49抗体の結合をFACS解析した結果を示す図。左に各細胞分画の同定方法を示し、右に各分画に対するMMG49の結合を示す図。Aでは造血幹細胞、前駆細胞分画と骨髄腫細胞との比較を、BではB/Tリンパ球分画と、骨髄腫前駆細胞および骨髄腫形質細胞分画との比較を示した。 実施例６において、各種骨髄腫細胞株、末梢血由来のT細胞、およびB細胞に対する、それぞれMMG49抗体およびFIB27抗体の結合をFACSを用いて解析した結果を示す図。併せて、上記細胞におけるITGA4の発現（抗インテグリンα4抗体の結合）およびITGAEの発現（抗インテグリンαE抗体の結合）の確認をFACS解析した結果も示す。 実施例６において、U266細胞およびITGA4(インテグリンα4)欠損U266細胞に対する、MMG49抗体およびFIB27抗体の結合をFACS解析した結果を示す図。併せて、上記細胞におけるITGA4の発現(抗インテグリンα4抗体の結合）をFACS解析した結果も示す。 実施例７における、Ca2+/Mg2+またはMn2+の存在下、３７℃で２０分間処理したインテグリンα4β7強制発現K562細胞およびヒト正常末梢血由来T細胞を、MMG49抗体あるいはisotype抗体と反応させた後、二次抗体としてanti-mouse IgG antibodyを用いて染色し、これらをFACS解析した結果を示す図。 実施例８における、ヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質の構築とそれを一過性に発現させた293T細胞に対するMMG49抗体の結合の有無を示す図。 実施例８における、ヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質を一過性に発現させた293T細胞に対するMMG49抗体の結合をFACS解析した結果を示す図。 図１２に示す結果をまとめた図。図中のグラフにおいて、縦軸は抗体が結合した細胞のパーセンテージを示し、横軸は各種ヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質を示す。 MMG49抗体の可変領域をヒトIgG4抗体定常部に接続することにより作製したキメラ化MMG49抗体を用いて、MM1s細胞およびKMS12BM細胞を染色した結果を示す図。 MMG49抗体の可変領域を用いたCARコンストラクトの作製法を示したシェーマ。 MMG49抗体の可変領域を用いたCARコンストラクトを発現させたT細胞をPE-抗ヒトF(ab')2抗体用いて染色した結果を示す図。 実施例９における、MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPが導入されたT細胞（control）と、インテグリンβ7を発現していないK562細胞あるいはインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞との共培養により産生されるIFN-γおよびIL2の量をELISAにて定量した結果を示す図。＊:p<0.05。 実施例１０における、MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPが導入されたT細胞（control）と、MMG49抗原発現細胞または非発現細胞との共培養により産生されるIFN-γの量をELISAにて定量した結果を示す図。 実施例１０における、MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPが導入されたT細胞（control）と、MMG49抗原発現細胞または非発現細胞との共培養により産生されるIL2の量をELISAにて定量した結果を示す図。 実施例１０における、MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPを導入されたT細胞（control）によるインテグリンβ7を発現していないK562細胞あるいはインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞に対する細胞傷害の程度を51Cr killing assayにて測定した結果を示す図。なお、図中のグラフのｙ軸は細胞傷害率（%）を意味する。 実施例１０における、MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPを導入されたT細胞（control）によるMMG49抗原発現細胞または非発現細胞に対する細胞傷害の程度を51Cr killing assayにて測定した結果を示す図。 実施例１１における、NOGマウスの骨髄内に生着させた骨髄腫細胞株MM1sに対する治療実験のデザインおよびその結果を示す図。MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPを導入されたT細胞（control）の移入後１週後の骨髄細胞を採取し、FACSにて解析した。MM1s細胞はヒトCD138+細胞として同定可能である。MMG49抗体由来CAR-T細胞投与群で骨髄内のMM1s細胞がほぼ完全に消失している。 実施例１１における、NOGマウスの全身に生着させた骨髄腫細胞株MM1sに対する治療実験のデザインおよびその結果を示す図。MMG49抗体由来CAR-T細胞またはGFPを導入されたT細胞（control）の移入前後の骨髄腫細胞の量はIVIS imagingでの蛍光強度の測定により評価した。MMG49抗体由来CAR-T細胞投与群で骨髄内のMM1s細胞がほぼ完全に消失している。 ヒト由来のインテグリンβ7のアミノ酸配列と、マウス由来のインテグリンβ7とのアミノ酸配列の比較を示す図。 実施例１２における、ヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質の構築とそれを一過性に発現させた293T細胞に対するMMG49抗体の結合の有無を示す図。 実施例１３における、MMG49抗体のエピトープを検討する実験結果を示す図。横軸のMFIとはMMG49抗体に対する結合強度を表し、数値が高いほど結合力が高いことを示す。
　本明細書において、「含む」及び「有する」は、いわゆるオープンラングエッジであるが、これらは「のみから成る」というクローズドラングエッジを含む概念であり、一実施形態において、「のみから成る」に置き換えることができる。
　「骨髄腫前駆細胞」は、骨髄腫形質細胞に分化する前の段階の前駆細胞であり、CD38が強発現しているが、成熟形質細胞に特異的なマーカーであるCD138の発現がないことによって特徴付けられる。よって、骨髄腫前駆細胞は、「CD38++CD138-細胞」又は「CD19-CD38++CD138-細胞」と表記される場合もある。
　「骨髄腫形質細胞」は、一般には骨髄腫細胞とも呼ばれ、異常免疫グロブリンであるMタンパクを産生する細胞である。骨髄腫形質細胞では、CD38の強発現に加え、CD138が発現している。よって、骨髄腫形質細胞は、「CD38++CD138+細胞」又は「CD19-CD38++CD138+細胞」と表記される場合もある。
　骨髄腫前駆細胞、及び骨髄腫形質細胞は、各々多発性骨髄腫以外の形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患における腫瘍前駆細胞、腫瘍性形質細胞をも意味する。
　「造血前駆細胞」は、様々な血球系細胞へと分化可能な細胞である。造血前駆細胞は、CD34の発現によって特徴付けられる。よって、本明細書において造血前駆細胞は、「CD34+細胞」と表記される場合もある。
(I)　抗体
　抗体(I)とは、好ましくは抗ヒトインテグリンβ7抗体であって、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体である。
　より好ましくは、ヒトインテグリンβ7の33～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体またはヒトインテグリンβ7の20～90番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体を挙げることができる。最も好ましくは、ヒトインテグリンβ7の33～90番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体を挙げることができる。
　ヒトインテグリンβ7とは特に限定はされず、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有する膜貫通タンパク質であり、インテグリンαとヘテロダイマーを形成するタンパク質とすることができる。具体的なインテグリンαとして、インテグリンα4またはインテグリンαEを挙げることができる。
　具体的なヒトインテグリンβ7のアミノ酸配列は、配列番号３１に示すアミノ酸配列以外に、たとえばNCBIのデータベースに収載される、ACCESSION:EAW96675; VERSION:EAW96675.1,GI:119617081、ACCESSION:NM000889; VERSION:NM000889.2,GI:540344585、ACCESSION:XM005268851, VERSION:XM005268851.2,GI:767974096、 ACCESSION:XM006719376, VERSION:XM006719376.2,GI:767974098、 ACCESSION:XM005268852, VERSION:XM005268852.3,GI:767974097などに記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
　以下のヒトインテグリンβ7に関する説明は配列番号３１に示すアミノ酸配列を基に行うが、他のヒトインテグリンβ7のアミノ酸配列であればインシリコで配列番号３１に示すアミノ酸配列との相同性を確認し、これによって以下に説明するヒトインテグリンβ7の領域および／または部位が、他のヒトインテグリンβ7のアミノ酸配列のどの領域または部位に相当するのかを、当業者であれば容易に判断することができる。
　ヒトインテグリンβ7の1～19番目のアミノ酸残基からなる領域はシグナルペプチドであり、生体内で膜タンパク質として機能する際には存在しないペプチド断片である。よって、ヒトインテグリンβ7が膜タンパク質としての機能を発揮する際のN末端は、上記アミノ酸配列の20番目のアミノ酸残基である。
　ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にはPSIドメインが含まれる。ヒトインテグリンβ7のPSIドメインとマウスインテグリンβ7のPSIドメインの相同性は、おおよそ80％以上と高いことが知られるものの、ヒトインテグリンβ7およびマウスインテグリンβ7のPSIドメインが含まれる20～109番目のアミノ酸残基からなる領域のアミノ酸残基を比較すると、図24にも示すように、ヒトインテグリンβ7の23番目、26番目、28番目、30番目、32番目、35番目、36番目、38番目、41番目、42番目、48番目、93番目、94番目、102番目、および109番目のアミノ酸残基の計15個のアミノ酸残基が異なっている。
　したがって、抗体(I)のエピトープはこれらの１５個のアミノ酸残基のいずれか一つ以上、好ましくは２つ以上、更に好ましくは３つ以上に関連することが好ましい。具体的には、抗体(I)のエピトープは、ヒトインテグリンβ7の23～109番目のアミノ酸残基からなる領域に存在することが好ましく、23～48番目のアミノ酸残基からなる領域または93～109番目のアミノ酸残基からなる領域に存在することが更に好ましい。
　他の更に好ましい態様の抗体(I)のエピトープは、23～48番目のアミノ酸残基からなる領域、93～109番目のアミノ酸残基からなる領域、または23～48番目のアミノ酸残基からなる領域および93番目～109番目のアミノ酸残基からなる領域を組み合わせた立体的な領域であってもよい。
　なお、抗体(I)のエピトープは線状エピトープであっても、立体エピトープ（非線状エピトープともいう。）であってもよい。線状エピトープとは、連続したアミノ酸残基がエピトープとなる場合であり、立体エピトープとは非連続的なアミノ酸残基によって構成されるエピトープであると当業者に知られる。
　例えば上述の23～48番目のアミノ酸残基からなる領域および93～109番目のアミノ酸残基からなる領域を組み合わせた立体的な領域をエピトープとする場合が立体エピトープに相当する例として挙げることができるが、20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に含まれる非連続的なアミノ酸残基からなる領域をエピトープとする場合も上記立体エピトープに包含される。
　上記のエピトープの中でも、48番目のアミノ酸残基が抗体（I）のエピトープとして強く関連するか、または抗体（I）のエピトープに含まれることが好ましい。
　具体的な線状エピトープおよび立体エピトープについては、例えば特表２０１１－５２７５７２号公報、特表２００９－５３４４０１号公報、"Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes." Forsstrom B, Axnas BB, Rockberg J, Danielsson H, Bohlin A, Uhlen M.PLoS One. 2015 Mar 27;10(3):e0121673. doi: 10.1371/journal.pone.0121673. eCollection 2015.などを参照することで当業者であれば理解することができる。
　以上を換言すると、抗体(I)はヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に特異的に結合する抗体であり、なかでも23～109番目の領域に特異的に結合することが好ましく、23～48番目および／または93～109番目の領域に特異的に結合することがより好ましい。
　また、抗体(I)の上記エピトープであるインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に結合する性質を、エピトープへの親和性と呼ぶことがある。よって、用語「エピトープへの親和性が上昇する」とは、「エピトープへの特異的な結合能が上昇する」と同意である。
　用語「特異的」とは、用語「選択的」とは区別され得る。
　抗体(I)の他の態様として、抗体(I)の上記エピトープへの親和性が、ヒトインテグリンβ7の379～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で上昇することとすることが好ましい。
　「379～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部」とは、379～722番目のアミノ酸残基からなる領域であっても、その一部の領域であってもよいことを意味する。具体的に「その一部の領域」とは、例えばヒトインテグリンβ7の417～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部、ヒトインテグリンβ7の564～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部、ヒトインテグリンβ7の379～563番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部、ヒトインテグリンβ7の417～563番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部、またはヒトインテグリンβ7の379～416番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部が挙げられる。すなわち、これらの領域の存在下で、抗体(I)の上記エピトープへの親和性を上昇させることができる。
　用語「存在下で」とは、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域と、ヒトインテグリンβ7の379～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部とが、同一の分子内にて存在することができ、両者の領域が別々の分子で存在するものとすることもできる。好ましくは、両者の領域が同一の分子内にて存在することである。なお、用語「存在下で」とは「によって」と読み替えることもできる。
　上述の抗体(I)のエピトープへの親和性が上昇することは、下記の実施例などに記載される慣用の免疫学的測定法によって、当業者であれば容易に確認することができる。
　例えば、実施例８に示す各種ヒト／マウスのキメラインテグリンβ7タンパク質であって、ヒト由来のインテグリンβ7の1～109番目のアミノ酸残基からなる領域を含み、且つ、ヒト由来のインテグリンβ7の722～798番目アミノ残残基からなる領域を含むヒト／マウスのキメラインテグリンβ7タンパク質（#4960）を発現させた細胞を準備し、#4960のヒト由来のインテグリンβ7の379～721番目アミノ残残基からなる領域をマウス由来のインテグリンβ7の379～721番目アミノ残残基からなる領域に置換されたヒト／マウスのキメラインテグリンβ7タンパク質（#4961）を準備する。ここで、抗体(I)の結合の程度を、後者（#4961）を発現する細胞と前者（#4960）を発現する細胞とを比較することによって、抗体(I)の上記エピトープへの親和性の上昇を確認することができる。
　抗体(I)の他の態様として、抗体(I)の上記エピトープへの親和性は、ヒトインテグリンβ7を活性化することによって上昇するものとすることが好ましい。活性化されたヒトインテグリンβ7は上記エピトープを含む領域に構造的な特徴を有するため、抗体(I)の上記エピトープへの親和性が上昇すると考えられる。
　ヒトインテグリンβ7を活性化する方法は公知である。例えば、ヒトインテグリンβ7を発現する細胞、例えば、形質細胞、NK細胞、T細胞、B細胞、リンパ芽球、バーキットリンパ腫由来の細胞、樹状細胞などの血球細胞または免疫細胞のいずれかの細胞に対して、PMAなどのホルボールエステル、マンガン塩などを作用させることにより、その細胞にて発現するヒトインテグリンβ7を活性化させることができる。また、上記の具体的な細胞に限らず、ヒトインテグリンβ7を発現させた細胞を用いて、ホルボールエステル、マンガン塩などによって処理してもヒトインテグリンβ7を活性化することができる。
　抗体(I)の上記エピトープへの親和性が、ヒトインテグリンβ7を活性化することによって上昇することは、下記の実施例などに記載される慣用の免疫学的測定法によって、当業者であれば容易に確認することができる。
　例えば、実施例８に示す各種ヒト／マウスのキメラインテグリンβ7タンパク質であって、1～109番目のアミノ酸残基からなる領域を含む#4960または#4961を発現させた細胞を準備し、これを実施例７に示すようなインテグリンβ7の活性化手段に供した後に、免疫学的測定手段を用いて測定することによって、活性化処理の前後を比較して、活性化後の細胞への抗体(I)の上記エピトープへの親和性の上昇を確認することができる。
　抗体(I)の他の態様として、正常細胞上で発現するヒトインテグリンβ7よりも、骨髄腫に由来する細胞上で発現するヒトインテグリンβ7に対して、より親和性が高いことを特徴とする抗ヒトインテグリンβ7抗体とすることができる。
　正常細胞とは、健常者に由来する細胞であれば特に限定はされず、例えば血液に由来する正常細胞とすることができ、このような正常細胞中でも正常形質細胞とすることが好ましい。
　このような正常細胞上で発現するヒトインテグリンβ7に比して、骨髄腫細胞上で発現するヒトインテグリンβ7に対して、より親和性が高いことを確認する方法は、下記の実施例などに記載される慣用の免疫学的測定法によって、当業者であれば容易に実施することができる。
　「慣用の免疫学的測定法」とは、その抗原に関係なく種々の抗体を用いて測定する方法であれば特に限定されない。例えばフローサイトメトリー法（FACS）、これに付随するセルソーティング、ウエスタンブロッティング、ELISA、免疫沈降法、SPR法、QCM法などを挙げることができる。
　抗体(I)の他の態様として、後述する実施例にて開示されるMMG49抗体と同一のエピトープを有するものとすることが好ましい。最も好ましくは、MMG49抗体と同一の抗体である。MMG49抗体の製造方法は、下記の実施例を参照することができる。
　抗体(I)の他の態様として、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む態様の抗体とすることが好ましい。すなわち、抗体(I)は重鎖可変領域単独とすることもでき、軽鎖可変領域単独とすることもできる。好ましくは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体である。
　可変領域とは抗原認識部位とも呼ばれ、抗体が抗原を認識するために重要な部位であると当業者に理解される。斯かる可変領域には３つの超可変領域（相補性決定領域〔CDR〕ともいう。）と呼ばれる領域を有しており、これらのCDRが抗体の抗原認識機能に最も関与する非常に重要な領域であることも当業者に知られている。
　抗体(I)の他の態様に含まれる重鎖可変領域は、重鎖CDR1、重鎖CDR2、または重鎖CDR3のいずれか１つ以上を含む。すなわち、当該重鎖可変領域には重鎖CDR1、重鎖CDR2、または重鎖CDR3を単独で含有させることができ、少なくとも重鎖CDR3を含んでいることが好ましい。より好ましくはアミノ末端（N末端）から順に重鎖CDR1、重鎖CDR2、および重鎖CDR3を含む態様である。
　軽鎖可変領域も重鎖可変領域と同様とすることができ、例えば、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、または軽鎖CDR3のいずれかを含み、少なくとも軽鎖CDR3を含んでいることが好ましく、軽鎖可変領域のN末端から順に軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、および軽鎖CDR3を含むことが好ましい。
　上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域における、それぞれのCDR1～3以外の領域をFRを称することがある。より詳細には、N末端とCDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3とカルボキシ末端（C末端）との間の領域をFR4と呼び、重鎖可変領域および軽鎖可変領域それぞれに設定される呼称である。
　上記重鎖CDR1～3および軽鎖CDR1～3のアミノ酸配列は、特に限定はされない。例えば、MMG49抗体の重鎖CDR1～3または軽鎖CDR1～3である、
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号７に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
などが挙げられる。
　上記重鎖CDR1～3を含む重鎖可変領域の好ましい態様として、例えばMMG49抗体の重鎖可変領域である配列番号４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。また上記軽鎖CDR1～3を含む軽鎖可変領域の好ましい態様として、例えばMMG49抗体の軽鎖可変領域である配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。
　上記の配列番号１～４および６～９に示すMMG49抗体のアミノ酸配列は以下の表１に示すとおりである。表中の配列番号４および９に示すそれぞれ重鎖および可変領域のアミノ酸配列中に設けた下線部は、N末端から順にCDR1、CDR2、およびCDR3に位置する部分を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　抗体(I)の構造は限定されない。具体的な構造として、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられ、これらを適宜組み合わせた構造とすることもできる。また、これらの組み合わせた構造も含めて、フラグメント抗体と呼ぶこともある。なお、このようなフラグメント抗体は、Fvを含む人工的にデザインされた組み換えタンパク質とすることもでき、タンパク質などの生体分子と融合されてなるものとすることもできる。
　Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。さらに、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合してなる構造とすることもできる。
　scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。また、リンカーで繋がれるC末端とN末端は、それぞれ逆であってもよい。なお、scFvもFvと同様に非共有結合性の分子間相互作用などの会合によって、その構造を形成させることができる。
　ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上述のscFvが２量体、３量体および４量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用などにより、最も構造的に安定な状態で会合した構造である。
　このような種々の構造を有する抗体(I)は、慣用の遺伝子工学的な手段を用いて発現ベクターを構築し、斯かる発現ベクターを抗体の産生に適した、原核細胞（大腸菌、放線菌など）、真核細胞（酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）などの宿主細胞を採用する発現系、慣用される無細胞発現系などを用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。製造した抗体は適宜、慣用の精製工程に供することで純度の高い状態として得ることも可能である。
　抗体(I)の他の態様として、定常領域を含有させることもできる。定常領域とは重鎖定常領域であればCH1、CH2、およびCH3を含み、軽鎖定常領域であればCLを含むと当業者に理解される。また、CH2およびCH3を含む領域はFcドメインと呼ばれることもある。
　具体的な定常領域の由来は特に限定はされない。例えばヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、サル由来、チンパンジー由来などといった大量生産に耐えうる動物種、ヒトに近縁する動物種、ヒトに投与しても免疫原性を生じさせにくい動物種などに由来する定常領域を挙げることができる。
　抗体(I)の中でも、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域がマウス由来のアミノ酸配列を有している場合、例えばヒト由来の定常領域を組み合わせることで、抗体(I)をキメラ抗体とすることができる。
　また、上述のキメラ抗体における、重鎖FR1～4および／または軽鎖FR1～4をヒト由来のアミノ酸配列に置換することで、抗体(I)をヒト化抗体とすることができる。
　さらに、上記ヒト化抗体における重鎖CDR1～3および／または軽鎖CDR1～3を、CDRが有する機能を減衰しない範囲に限ってヒト由来のアミノ酸配列に置換することで、抗体(I)をヒト抗体とすることができる。なお、用語「ヒト抗体」とは「完全ヒト化抗体」と呼ばれることもある。
　定常領域を含む態様の抗体(I)の構造は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を有する重鎖；ならびに軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する軽鎖をそれぞれ１対ずつ含み、４本鎖の構造となるイムノグロブリンのみならず、Fab、F(ab')2、ミニボディ（minibody）、scFv-Fcなどの構造を挙げることができる。さらに、これらを適宜組みわせた構造とすることもできる。また、これらの組み合わせた構造も含めて、フラグメント抗体と呼ぶこともある。なお、このようなフラグメント抗体は、Fvを含む人工的にデザインされた組み換えタンパク質とすることもでき、タンパク質などの生体分子と融合されてなるものとすることもできる。
　Fabとは重鎖可変領域および重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。さらに、CH1とCLとがこれらのそれぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなるものとすることができる。
　F(ab')2とは、１対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造を有する。
　ミニボディとは、上記scFvおよびCH3を含む１対の抗体断片を有し、斯かる抗体断片同士が、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合してなる構造を有する。
　scFv-Fcとは、上記scFv、CH2、およびCH3を含む１対の抗体断片を有し、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造を有する。
　このような種々の構造を有する定常領域を含む抗体(I)も、定常領域を含まない抗体(I)と同様に、慣用の遺伝子工学的な手段を用いて発現ベクターを構築し、斯かる発現ベクターを抗体の産生に適した宿主細胞を採用する発現系を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。製造した抗体は適宜、慣用の精製工程に供することで純度の高い状態として得ることも可能である。
　なお、Fabであれば、例えばイムノグロブリンであるIgGをパパインなどのプロテアーゼを用いてこれを分解することによっても得ることができる。またF(ab')2であれば、IgGをペプシンなどのプロテアーゼを用いてこれを分解することによって得ることもできる。
　上記の定常領域を含む抗体(I)の中でも、好ましい構造はイムノグロブリンである。このようなイムノグロブリンのサブタイプは特に限定はされず、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなどを挙げることができる。これらの中でも、IgGが好ましく、例えばマウス由来のIgGであれば、４つのサブクラスの中でもIgG2が好ましい。
　上記の定常領域を含む抗体(I)の中でも、さらに好ましい態様の抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体である。最も好ましい抗体は配列番号５に示すアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体である。
　上述のアミノ酸配列には、状況に応じて変異導入が施されてなるものとすることができる。このような変異は、重鎖CDRおよび軽鎖CDRには施されないことが好ましい。すなわち、重鎖FR、軽鎖FRに施されてなることが好ましく、抗体(I)が定常領域を含む場合は、下記に示すADCC活性またはCDC活性を調整するための変異の他に、更に変異が施されてなるものとすることができる。
　具体的な変異導入を施すアミノ酸残基の数は、特に限定はされない。例えば、変異導入前のアミノ酸配列と変異導入後のアミノ酸配列の同一性が７０％程度、好ましくは７５％程度、より好ましくは８０％程度、より好ましくは８５％程度、より好ましくは９０％程度、より好ましくは９５％程度、より好ましくは９６％程度、より好ましくは９７％程度、より好ましくは９８％程度であり、最も好ましくは９９％程度である。なお、このような数値は四捨五入によって得られるものとする。
　用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性のみならず類似性も高いと言える。
　アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。
　上述のアミノ酸配列への変異導入とは、置換、欠失、挿入などである。具体的な変異導入は、慣用の方法を採用することにより達成できるものであれば、特に限定はされない。例えば、置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。
　用語「保存的な置換技術」とは、あるアミノ酸残基がそれと類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される技術を意味する。
　例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸などといった酸性側鎖を有するアミノ酸残基同士；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなどといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基同士；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなどといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基同士；スレオニン、バリン、イソロイシンなどといったβ-分枝側鎖を有するアミノ酸残基同士；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に保存的な置換技術にあたる。
　抗体(I)の他の態様として、抗体(I)を細胞障害活性を有するものとすることができる。細胞障害活性とは、抗体が細胞に結合することにより、結果として結合した細胞に何らかの障害を与える活性のことをいう。
　このような細胞障害活性として、例えばADCC活性、CDC活性などが挙げられる。用語「ADCC活性」とは、抗体依存性細胞傷害活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)の略であり、抗体の定常領域に特異的なレセプターを発現しているNK細胞などの細胞障害活性を有する細胞を抗体の近傍にリクルートさせ、斯かる細胞などの作用によって、抗体が結合する細胞に対して傷害を与えることを誘起する活性である。
　用語「CDC活性」とは、補体依存性細胞傷害活性（Complement-Dependent Cytotoxicity）の略であり、抗体が補体をその近傍にリクルートさせ、斯かる補体の作用によって抗体が結合している細胞に対して障害を与える作用を誘起する活性を言う。
　ここで、ADCC活性もCDC活性も、Lazar GA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103: 4005-10 (2006)、Shields RL et al., J Biol Chem, 276: 6591-604 (2001))、Moore GL et al., J Immunol, 159:3613-21 (1997), An Z et al., MAbs, 1:572-9 (2009)などの文献を適宜参照しながら、定常領域に変異に施すことによってその活性を調整することができる。
　例えば、定常領域がヒトIgG1であれば、S239D、I332E、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S298A、K334A、S298A/K334A, S298A/E333A/K334Aなどの変異を施すことによって、ADCC活性を上昇させることができる。
　また、同じく定常領域がヒトIgG1である場合、V234A/G237A、H268Q/V309L/A330S/P331Sなどの変異を施すことによって、ADCC活性を下降させることができる。
　CDC活性に関しては、定常領域がヒトIgG1である場合、S267E、H268F、S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、H268F/S324T、S267E/H268F/S324Tなどの変異を施せば、その活性を上昇させることができる。
　ADCC活性は、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って測定することができる。例えば、骨髄腫細胞を10％FCS添加のRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5×104～1.0×104個となるように調製する。これに適量のNa2 51CrO4を加え、37℃で1時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とする。エフェクター細胞としては、SCID マウスの骨髄細胞を10％のFBS、10ng/mlのマウスGM-CSF、及び40IU/mlのヒトIL2を添加したRPMI1640中で６日間培養したもの等を使用することができる。96ウェルプレートに被検抗体又はコントロールとなるそのアイソタイプ抗体を終濃度0.05～10μg/mLとなるように添加し、さらに標的細胞（1.0×104個）及びエフェクター細胞（5×105個）を添加する。37℃で4時間反応させ、遠心分離後、上清に放出された51Crをγ－カウンターにて測定する。ADCC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。
　ADCC活性＝｛（[標的細胞からの51Cr 放出]－[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]－[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
　CDC活性についても、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って測定することができる。例えば、標的細胞となる骨髄腫細胞を10％FCS添加のRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5×104～1.0×104個となるように調製する。これに適量のNa2 51CrO4を加え、37℃で1時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とする。ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁した被検抗体又はコントロールとなるアイソタイプ抗体を終濃度0.5～50μg/mLとなるように96ウェルプレートに加え、次いで前記標的細胞と補体とを加えて1.5時間反応させる。反応液を遠心分離し、上清に放出された51Crをγ－カウンターにて測定する。CDC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。
　CDC活性=｛（[標的細胞からの51Cr 放出]－[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]－[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
　細胞傷害活性を有する抗体は、例えば上記方法を用いて細胞傷害活性の有無を評価し、当該活性を有する抗体を選抜することによって得ることが出来る。
　抗体(I)の他の態様として、多重特異性抗体とすることもできる。すなわち、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域以外の抗原（以後、これを他の抗原とよぶ。）に特異性をもって結合能を有するものとすることができる。
　他の抗原は、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域と構造的に非類似である抗原であることが好ましい。。
　具体的な他の抗原は特に限定はされない。例えばCD3、CD16、C1q、Adenovirus knob domainなどが挙げられ、この中から適宜組み合わせて少なくとも１つを他の抗原として適宜採用することができる。好ましくは上記に例示する抗原のうちの１つを、他の抗原として選択することである。すなわち、好ましい多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
　このような多重特異性抗体は、当業者であれば慣用の技術を適宜採用することで容易に製造することができる。例えば、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に相当するペプチド断片、またはヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域のみをヒト由来とし、それ以外をマウス由来などのヒト以外に由来するものとしたキメラ型インテグリンβ7を発現する細胞を免疫付与した動物から得られるB細胞などの抗体産生細胞を用いて作製したハイブリドーマを準備し、上述の他の抗原で免疫付与した動物から得られるB細胞などの抗体産生細胞を用いて別途ハイブリドーマを作製して、これらのハイブリドーマ同士を細胞融合させて得られる新たなハイブリドーマ（二重特異性抗体の作成の場合には、これをクワドローマともいう。）から、慣用の方法によってスクリーニングすることにより、多重特異性抗体を得ることができる。
　このほかに、例えば二重特異性抗体であれば、
（１）ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域をエピトープとする、上記F(ab')2の構造の抗体を作製する：
（２）一方で、他の抗原に特異的に結合するF(ab')2の構造の抗体も同様に作製する：
（３）（１）および（２）で得られたそれぞれのF(ab')2の構造の抗体をDTTなどの還元剤を用いて処理した後に、どちらか片方の処理物にはさらにエルマン試薬で処理する：
（４）（３）で得られたこれらの処理後のF(ab')2構造の抗体を混合して反応させる：
といった（１）～（４）に示す手順によっても二重特異性抗体を作製することができる。
（Ａ）ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域をエピトープとする抗体を作製する。
（Ｂ）一方で、他の抗原に特異的に結合する抗体も同様に作製する。
（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）で得られたそれぞれの可変領域のアミノ酸配列およびこれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を同定する。
（Ｄ）（Ｃ）にて同定したそれぞれの塩基配列を有するポリヌクレオチドを、要すれば定常部位の塩基配列配列、リンカー配列を有するポリヌクレオチドと共に組みこんだ発現ベクターを作製したのち、これをCHO細胞など抗体産生に適した宿主細胞に導入する。
といった（Ａ）～（Ｄ）に示す手順によっても二重特異性抗体を産生させることができる。
　抗体(I)の他の態様として、サイトトキシン（細胞傷害活性を有する物質）が結合されてなるものとすることができる。サイトトキシンとは、細胞を死滅させる、細胞増殖を抑制するなどといった、細胞に何らかの障害を与える物質である限り特に限定はされない。
　このようなサイトトキシンとして、例えば、シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミドなどのアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウムなどの代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシンなどの抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセルなどの微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物などのアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンなどの白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ、90-Ittriumなどの放射性同位元素を挙げることができる。
　これらの中でも、好ましくは、カリケアマイシン、メルファラン、ビンクリスチン硫酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、プレドニゾロン、デキサメサゾン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブであり、より好ましくは良好な抗体への結合の実績のあるカリケアマイシンである。
　これらのサイトトキシンは、いずれも商業的に入手可能で上述の中から１種または２種以上を適宜組み合わせて選択することができる。
　サイトトキシンと上述の抗体との結合様式は特に限定されず、例えば慣用の遺伝子工学的技術またはタンパク質工学的技術を適宜採用すれば、当業者は上述の抗体にサイトトキシンを容易に結合させることができる。より具体的にはリンカーを介して、上記抗体(I)のアミノ酸残基側鎖のアミノ基、チオール基、グアニジル基、水酸基、カルボキシル基など官能基に結合させる方法などが挙げることができる。
　抗体(I)は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくはモノクローナル抗体である。
　用語「モノクローナル」とは、実質的に均一な集団から得られることを意味し、「モノクローナル抗体」とはこのような集団から得られる抗体であることを意味する。すなわち、このような集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在し得る可能な天然に生じる突然変異を除けば同一であると解される。
　さらに、抗体の特異的な結合対象（エピトープ）に関して、例えば抗体(I)ではこれがヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に存在するものであるが、ポリクローナル抗体であれば、これがヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域における複数のサイトであるのに対し、モノクローナル抗体であれば、単一のサイトであるという点で、高い特異性を発揮するのでより有利である。
　なお、修飾語として用いる「モノクローナル」とは上述のように実質的に均一の集団から得られる物と解され、その製造方法が特定される修飾語であると解されるべきではない。
　抗体(I)は、上記の方法の他に、ハイブリドーマ法、下記に示すポリヌクレオチド(II)を保持する宿主細胞(III)を用いた組換えDNA法、ファージライブラリーからの単離などを採用すれば当業者であれば容易に製造することができる。
　例えば、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に相当するペプチドをマウス、ラット、ウサギなどの抗体産生に適した動物に免疫付与し、次いでB細胞を回収した後にハイブリドーマ法に供して、上述する抗体(I)が発揮する機能を指標にスクリーニングすることで、抗体(I)を製造する方法を挙げることができる。
　このほかに、インテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域のみをヒト由来とし、それ以外をマウス由来などのヒト以外に由来するものとしたキメラ型インテグリンβ7を発現する細胞を作成して、これをマウス、ラット、ウサギなどの抗体産生に適した動物（好ましくはマウス）に免疫付与し、次いでB細胞を回収した後にハイブリドーマ法に供して、上述する抗体(I)が発揮する機能を指標にスクリーニングすることで、抗体(I)を製造する方法を挙げることができる。
　抗体(I)が発揮する機能として、例えばヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に対する親和性が、ヒトインテグリンβ7の380～722番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも１部の下で上昇すること、ヒトインテグリンβ7を活性化することによって上昇することなどを挙げることができる。よって、このような機能を利用する、下記のスクリーニング方法(X)に示す方法によって、抗体(I)を得ることもできる。
　抗体(I)は、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有するので、当該インテグリンβ7を発現する細胞に対し、上述するADCC活性およびCDC活性のみならず、アポトーシス誘導活性、生存シグナル遮断活性などのうちの一つまたは２つ以上を組み合わせることによって、斯かる細胞に対して細胞障害活性などを発揮することが期待される。よって、抗体(I)を含む組成物は下記に詳述するように医薬組成物(IV)として有用である。
　特に、抗体(I)はヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域をエピトープとするものであるが、抗体(I)のエピトープへの親和性はインテグリンβ7を活性化することによって上昇する。活性型インテグリンβ7は形質細胞などの血球細胞にて発現することから、抗体(I)は、これらの癌（例えば、血液癌）に対する医薬組成物の有効成分として用いられる。特に、上記の細胞に異変を生じさせる疾患（例えば骨髄腫、多発性骨髄腫など）に対する医薬組成物として有効に用いられる。
(II)　ポリヌクレオチド
　ポリヌクレオチド(II)とは、上記抗体(I)のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」とは、たとえばリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらのいずれかのヌクレオチドなどが適宜公知の方法によって修飾されてなる一本鎖または二本鎖の形態を含む。
　ポリヌクレオチド(II)の塩基配列は、当業者であれば、例えばインシリコで上記抗体(I)のアミノ酸配列を基に適宜決定することができる。このような塩基配列を決定するのに使用されるコドンの種類は問わない。ポリヌクレオチドを使用する宿主のコドン頻度を勘案して、塩基配列を決定することが好ましい。
　具体的なポリヌクレオチド(II)の塩基配列は特に限定はされない。上記抗体(I)の態様の一つとして特定するアミノ酸配列を示す各配列番号と斯かるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す配列番号の対応を下記表２に示す。すなわち、ポリヌクレオチド(II)が有する好ましい塩基配列は、配列番号１１～２０に示す塩基配列である。 
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　ポリヌクレオチド(II)は、ベクター内に組み込まれた態様とすることもできる。ベクターとは特に限定はされず、例えばクローニング用ベクターまたは発現用ベクターとすることもでき、その用途は問わない。
　また、発現用ベクターであれば、大腸菌、放線菌などの原核細胞用のベクターとすることもでき、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などの真核細胞用のベクターとすることもできる。
　なお、ポリヌクレオチド(II)の5'末端側（上記抗体(I)でいうN末端側）には、適宜シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加させることもできる。
　ポリヌクレオチド(II)の具体的な使用方法は、特に限定されない。例えば下記の宿主細胞(III)に導入し、上記抗体(I)を発現させるために用いることを挙げることができる。
(III)　宿主細胞
　宿主細胞(III)とは、上記ポリヌクレオチド(II)を保持する細胞である。用語「保持」とは、細胞内に上記ポリヌクレオチド(II)が存在する状態を維持することをいい、当該細胞が自発的に上記ポリヌクレオチドを積極的かどうかに関わらず細胞外に排出しない状態であることを意味する。
　宿主細胞(III)が上記ポリヌクレオチド(II)を保持する態様は特に限定されない。例えば細胞内でベクターの形態でポリヌクレオチドを保持させることもできるし、細胞内のゲノムに上記ポリヌクレオチド(II)がインテグレイトされた形態で保持させることもできる。
　宿主細胞(III)の具体的な細胞の種類は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などの真核細胞であっても大腸菌、放線菌などの原核細胞であってもよく、特に限定はされない。 
(IV)　キメラ抗原受容体
　キメラ抗原受容体とは、人工のT細胞受容体（TCR）様のタンパク質であり、Ｔ細胞の細胞膜上にて発現する（細胞外ドメインに相当する）抗原認識部位を所望の抗原認識部位に置換し、且つT細胞そのものが有する細胞障害活性などの機能を、より効果的に発揮できるように構築されたタンパク質である。
　キメラ抗原受容体(IV)とは、上記抗体(I)と同一のエピトープを有するものであり、より具体的には、上記抗体(I)の抗原認識部位を含むタンパク質である。すなわち、キメラ抗原受容体に含まれる抗原認識部位に存在するエピトープは、上記抗体(I)にて詳述したものと同様とすることができる。
　さらに詳細には、キメラ抗原受容体(IV)のN末端から順に、上記抗体(I)の抗原認識部位、スペーサー配列、膜貫通ドメイン、共刺激因子、およびTCRの細胞内ドメインが配置されてなるタンパク質である。
　キメラ抗原受容体(IV)に配置される上記抗体(I)の抗原認識部位とは、抗体(I)にて詳述した通りとすることができ、具体的には重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を挙げることができる。なかでも、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有しながらscFvの構造であることが好ましい。
　このようなscFvにおいては、例えば重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間には、適宜１０個～２５個程度のアミノ酸残基からなるスペーサー配列を設けることができる。より好ましくは、１５～１８個程度である。このようなスペーサー配列とは、キメラ抗原受容体(IV)に配置される上述のスペーサー配列とは同一とすることもでき、異なるものとすることもできる。
　キメラ抗原受容体(IV)に配置されるスペーサー配列とは、特に限定はされない。例えば、１０個～２５個程度のアミノ酸残基からなるものとすることができる。より好ましくは、１５～１８個程度である。
　キメラ抗原受容体(IV)に配置される膜貫通ドメインとは特に限定されない。具体的には、T細胞などで発現するCD28、4-1BBなどのタンパク質に由来する細胞膜貫通ドメインを、適宜変異導入が施されることを許容しながら採用することができる。
　キメラ抗原受容体(IV)に配置される共刺激因子とは、T細胞などが有する共刺激因子であればよく特に限定はされない。例えば、4-1BB、OX40、CD28などを、適宜変異導入が施されることを許容しながら採用することができる。
　キメラ抗原受容体(IV)に配置されるTCRの細胞内ドメインとは特に限定はされない。たとえばTCRζ鎖とも呼ばれるCD3などに由来する細胞内ドメインを適宜変異導入が施されることを許容しながら採用することができる。なお、CD3への変異導入に関して、ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)が含まれるように施されてなることが好ましい。
　キメラ抗原受容体(IV)は配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するものとすることが好ましい。
　上記のキメラ抗原受容体を特定するアミノ酸配列は、適宜変異導入が施されてなるものとすることができる。また、上記の膜貫通ドメイン、共刺激因子、およびTCRの細胞内ドメインに対する変異導入も同様とすることができる。具体的な変異導入数は、特に限定はされない。
　例えば、変異導入前のアミノ酸配列と変異導入後のアミノ酸配列の同一性が７０％程度、好ましくは７５％程度、より好ましくは８０％程度、より好ましくは８５％程度、より好ましくは９０％程度、より好ましくは９５％程度、より好ましくは９６％程度、より好ましくは９７％程度、より好ましくは９８％程度であり、最も好ましくは９９％程度である。なお、このような数値は四捨五入によって得られるものとする。
　上述のアミノ酸配列への変異導入とは、置換、欠失、挿入などである。具体的な変異導入については、慣用の方法を採用して達成できるものであればよく、特に限定はされない。例えば、置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。
　なお、このようなキメラ抗原受容体を製造するには、非特許文献４～６などに記載される方法を参照すれば、当業者であれば容易に製造することができる。
(V)　ポリヌクレオチド
　ポリヌクレオチド(V)とは、上記ポリヌクレオチド(II)とは異なり上記キメラ抗原受容体(IV)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
　ポリヌクレオチド(V)の塩基配列は、上記ポリヌクレオチド(II)と同様に、例えばインシリコで上記キメラ抗原受容体(IV)のアミノ酸配列を基に適宜決定することができる。塩基配列を決定するのに使用されるコドンの種類は問わない。ポリヌクレオチドを使用する対象となる細胞のコドン頻度を勘案して、塩基配列を決定することが好ましい。
　具体的な塩基配列は、特に限定はされない。例えば配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体(IV)のアミノ酸配列を基に決定される配列番号２２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。当然、このようなアミノ酸配列を基に決定される塩基配列は、使用するコドンの種類を問わないことを勘案すれば上記配列番号２２に示す塩基配列に限定されないのは言うまでもない。
　なお、ポリヌクレオチド(V)の5'末端側（上記キメラ抗原受容体(IV)でいうN末端側）には、適宜シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加させることができる。
　ポリヌクレオチド(V)の具体的な使用方法は、特に限定されない。例えば下記の細胞(VI)に導入し、上記キメラ抗原受容体(IV)を発現させるために用いることを挙げることができる。
(VI)　細胞
　細胞(VI)とは、上記宿主細胞(III)とは異なり、上記ポリヌクレオチド(V)を保持する細胞である。用語「保持」とは、上記宿主細胞(III)と同様にすることができる。具体的な細胞の種類も、上記宿主細胞(III)と同様にすることができるが、細胞障害活性を有するが好ましい。例えば、T細胞、NK細胞、K細胞などを挙げることができ、なかでもT細胞の一種であるキラーT細胞（細胞障害性T細胞〔CTL〕ともいう）が最も好ましい。
　上記細胞(VI)に含まれるキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド(V)が発現することにより、キメラ抗原受容体(IV)を構成する上記抗体(I)の抗原認識部位が細胞の外側に露呈し、キメラ抗原受容体(IV)を構成する膜貫通ドメイン、上述の共刺激因子、もしくはTCRの細胞内ドメインは細胞膜または細胞内に局在することが好ましい。
　これらの共刺激因子もしくは細胞膜または細胞内に局在するドメインは、上記抗体(I)の抗原認識部位が、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に結合すると、細胞内にて細胞障害活性を惹起させるシグナルを作動させる。また、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域への抗体(I)の親和性は、ヒトインテグリンβ7を活性化することにより上昇する。したがって、抗体(I)は活性型インテグリンβ7を発現する細胞または組織を対象に対して攻撃または細胞障害活性を発揮する。
　このような機能を発揮する細胞がT細胞である場合、これをキメラ抗原受容体T細胞(VI-4)と呼ぶ。なお、NK細胞などの細胞障害活性を発揮する可能性を有する細胞も上述のキメラ抗原受容体T細胞と同様に、抗原認識部位の活性型ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域へ結合と、細胞膜または細胞内ドメインでの細胞障害活性を惹起させるシグナルの作動とを連動させることによって、キメラ抗原受容体Ｔ細胞と同様の効果を発揮し得る（これをキメラ抗原受容体NK細胞と呼ぶ。）。
　このように、細胞(VI)は活性型インテグリンβ7を発現する細胞または組織に対して細胞障害活性などを発揮するので、上記抗体(I)と同様に細胞(VI)を含む組成物は、下記に詳述する様な医薬組成物(IV)として有用であると言える。活性型インテグリンβ7は形質細胞などの血球細胞にて発現することから、癌（例えば、血液癌）に対する医薬組成物の有効成分として用いられる。特に、上記の細胞に異変を生じさせる疾患（例えば骨髄腫、多発性骨髄腫など）に対する医薬組成物として有効に用いられる。
(VII)　医薬組成物
　医薬組成物(VII)とは、上記抗体(I)または上記細胞(VI)を含む。上記細胞(VI)として、キメラ抗原受容体T細胞(VI-4)であることが好ましい。
　医薬組成物(VII)中の上記抗体(I)または上記細胞(VI)の含有量は、特に限定はされない。例えば、抗体(I)であれば、医薬組成物１００重量部に対して０．００１重量部～１０重量部程度をすることができる。また、細胞(VI)であれば、１細胞／ｍＬ～１０４細胞／ｍＬ程度とすることができる。
　医薬組成物(VII)の投与方法は、特に限定はされない。有効成分が抗体または細胞であることから、非経口的投与または非経腸的投与とすることが好ましい。例えば、経静脈投与、経筋肉投与、経皮下投与などが挙げられ、経静脈投与が好ましい。
　医薬組成物(VII)の剤形は、上述の投与方法に応じて薬学的に許容される慣用の担体と共に調製することができる。上述の好ましい投与方法を勘案すると、注射剤とすることが好ましい。
　医薬組成物(VII)の対象疾患は、特に限定はされない。具体的な対象疾患として、例えば癌が挙げられ、血液癌が好ましく、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患であることが更に好ましい。用語「形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患」とは、異常な形質細胞の腫瘍性増殖とそれらより分泌される異常タンパク質の増加によって特徴づけられる疾患である。このような疾患として、例えば骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、形質細胞腫、H鎖病、全身性AL型アミロイドーシスなどを挙げることができる。なお、他の実施形態において、医薬組成物(VII)の対象疾患は、悪性リンパ腫、白血病など他の血液悪性疾患であってもよい。
　医薬組成物(VII)の投与対象（被験体）は、上記疾患に罹患した患者であるか、または罹患する可能性がある動物とすることができる。「罹患する可能性がある」とは、後述する診断方法(XI)にて決定することができる。動物とは、例えば哺乳類動物とすることができ、好ましくはヒトである。
　医薬組成物(VII)の投与量は、投与対象の、疾患の程度、投与による所望効果の程度、体重、性別、年齢、動物種などの各条件によって区々であり一概に決定することができない。例えば有効成分が抗体(I)である場合、一日当たりで、通常は1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。また、有効成分が細胞(VI)であれば、通常は104細胞／kg（体重）～109細胞/kg（体重）程度とすることができる。
　医薬組成物(VII)の投与スケジュールも、その投与量と同様に、投与対象の疾患の程度などの各条件によって区々であり一概に決定することができない。例えば、上記の１日当たりの投与量で、１日～１月に１回投与されることが好ましい。
(VIII)　疾患の治療または予防方法
　疾患の治療または予防方法(VIII)とは、上記抗体(I)または上記細胞(VI)の治療有効量を被験体に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法である。細胞(VI)として、は好ましくはキメラ抗原受容体Ｔ細胞(VI-4)である。
　被験体とは、上記医薬組成物(VII)と同様とすることができる。被験体が疾患に罹患する患者である場合には、上記抗体(I)または上記細胞(VI)の治療有効量を投与することにより、その治療効果が期待され、被験体が疾患に罹患する可能性のある動物である場合には、その予防効果が期待される。予防とは、下記の診断方法(XI)に示すように、慣用の免疫学的方法によって測定された数値が、疾患に罹患すると判断される数値に到達させないようにすることを意味する。
　疾患とは、上記医薬組成物(VII)と同様とすることができ、例えば癌が例示され、好ましい癌として形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患（例えば、多発性骨髄腫など）を挙げることができる。
　治療有効量とは上記医薬組成物(VII)の投与量と同様とすることができ、上記抗体(I)または上記細胞(VI)の製剤化は、上記医薬組成物(VII)の剤形と同様とすることができる。また、上記抗体(I)または上記細胞(VI)の投与方法、投与スケジュールなども上記医薬組成物(VII)にて詳述した通りとすることができる。
　疾患の治療または予防方法(VIII)には、活性型ヒトインテグリンβ7を標的とした多発性骨髄腫の治療または予防方法を包含することができる。なお、標的とは上記の抗体(I)または上記の細胞(VI)の適用を挙げることができる。
(IX)　使用
　使用(IX)とは、医薬組成物を製造するための、上記抗体(I)または上記細胞(IV)の使用である。
　医薬組成物とは、上記医薬組成物（VII）と同様とすることができる。なお、細胞(IV)はキメラ抗原受容体Ｔ細胞(VI-4)であることが好ましい。
　また、医薬組成物の対象疾患も同様であり、例えば、癌の治療用、好ましくは血液癌、更に好ましくは形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患（例えば、骨髄腫、多発性骨髄腫など）が挙げられる。
　そのほか、医薬組成物中の有効成分である上記抗体(I)または細胞(VI)の含有量、これらの剤形、投与方法、投与スケジュールなども、上記医薬組成物(VII)にて詳述したものと同様とすることができる。
(X)　スクリーニング方法
　スクリーニング方法(X)とは形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療用または予防用の医薬組成物の有効成分のスクリーニング方法であって、化合物ライブラリーからヒトインテグリンβ7に特異的に結合し、且つ、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に結合する候補物質を選別する工程を含む。
　医薬組成物とは上記医薬組成物(VII)と同様とすることができ、癌、好ましくは血液癌、更に好ましくは形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患（例えば骨髄腫、多発性骨髄腫など）の治療用または予防用の医薬組成物の有効成分とは、例えば上記抗体(I)が挙げられる。
　化合物ライブラリーとは特に限定はされず、既存のライブラリーを用いることができる。好ましくは抗体ライブラリーであり、所望の抗原によって免疫付与された動物から得られるB細胞などの抗体産生細胞を用いて作製したハイブリドーマをライブラリーとすることが好ましい。
　ここで、所望の抗原とは特に限定されず、例えばヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域であることが好ましい。さらに好ましくは、活性型ヒトインテグリンβ7である。
　候補物質を選別する方法は特に限定はされない。例えば、ヒトインテグリンβ7に特異的に結合する候補物質を選別し、且つ、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に相当するペプチド断片に結合することを慣用の免疫学的測定手段を用いて確認し、これを選別する手段を採用することができる。
　また、ヒトインテグリンβ7に特異的に結合する候補物質を選別し、更に上記抗体(I)にて詳述したインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域のみをヒト由来とし、それ以外をマウス由来などのヒト以外に由来するものとしたキメラ型インテグリンβ7を発現する細胞に結合する候補物質を慣用の免疫学的測定手段を用いて確認し、これを選別する手段を採用することができる。これを選別する手段を採用することもできる。
　また、ヒトインテグリンβ7に特異的に結合する候補物質を選別し、更に、上記抗体(I)にて詳述したインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域のみをヒト由来とし、それ以外をマウス由来などのヒト以外に由来するものとしたキメラ型インテグリンβ7を発現する細胞に対して、ホルボールエステル、マンガン塩などによって処理し、処理前後で結合の程度が上昇するする候補物質を確認し、これを選別する手段を採用することもできる。
　また、ヒトインテグリンβ7に特異的に結合する候補物質を選別し、更に、上記抗体(I)にて詳述したヒトインテグリンβ7の111～378番目のアミノ酸残基からなる領域をマウス由来に置換したキメラ体を発現する細胞と、ヒトインテグリンβ7の110～721番目のアミノ酸残基からなる領域をマウス由来に置換したキメラ体と作製し、前者に対する結合の程度が高い候補物質を確認し、これを選別する手段を採用することもできる。
　さらに、スクリーニング方法(X)には細胞障害活性を有することを指標に候補物質を選別する工程が包含させることもできる。具体的な細胞障害活性を確認する対象となる細胞とは特に限定はされない。例えば上述したヒトインテグリンβ7のPSIドメインに特徴がある活性型ヒト由来インテグリンβ7を発現する血球細胞などを挙げることができる。
　ここで、スクリーニングする候補物質が抗体である場合、細胞障害活性を有することを指標に候補物質を選別する工程を、ADCC活性またはCDC活性を有する抗体を選別する工程としてもよい。
　このようにスクリーニング方法(X)によって選別される候補物質は、抗体であることが好ましく、更に好ましくはモノクローナル抗体である。最も好ましくは上記抗体(I)である。
(XI)　診断方法
　診断方法(XI)とは癌の診断方法であり、被験体から採取したサンプルと、上記抗体(I)とを接触させる工程を含む。
　被験体とは、疾患の治療または予防方法(VIII)にて詳述した被験体と同様とすることができる。
　被験体から採取したサンプルとは、血液または骨髄液とすることができる。
　具体的な診断方法は、特に限定はされないが、例えば上記抗体(I)に結合する細胞が検出された場合に癌に罹患した、または罹患する可能性があると判断することが挙げられる。
　結合の程度は、慣用の免疫学的測定法を採用することによって、当業者であれば容易に決定することができる。ここで測定された程度に応じて、癌に罹患したか、あるいは罹患する可能性があるかのいずれかを決定することができる。
　具体的な癌の診断は特に限定されないが、例えば血液癌、より好ましくは上記抗体(I)に結合する細胞が形質細胞である場合に、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患（例えば、骨髄腫、多発性骨髄腫など）に罹患するまたは罹患する可能性があると診断することができる。
(XII)　キット
　キット(XII)とは、上記抗体(I)を含む、癌の診断用キットである。
　癌とは、特に限定はされず、上述の医薬組成物(VII)にて詳述した通りとすることができ、好ましくは血液癌、更に好ましくは形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患（例えば、骨髄腫、多発性骨髄腫など）である。
　なお、キット(XII)には適宜マニュアルを添付させることができる。このようなマニュアルには上述の診断方法(XI)にて詳述する方法を癌の診断基準として記載させることができる。
　以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
試験方法：フローサイトメトリーおよびソーティング
　以下の実施例において、細胞の選別のために用いたフローサイトメトリー（FACS）は下記の要領で行った。
　インフォームドコンセントを得た骨髄腫患者の腸骨から採取した骨髄単核球をACK液（150mMのNH4Clおよび10mMのKHCO3）に浮遊させ、３分間、４℃で静置することにより赤血球を除去した。2%の胎児ウシ血清を添加したPBSで除去後の骨髄単核球を洗浄したのち、非特異的な抗体の結合を防ぐため、10%のヒトAB型血清を含むPBS中で、２０分間、４℃でブロッキングを行った。
　その後、蛍光色素でラベルされた各抗体（下記参照）をこれに加え、３０分間、４℃で染色を行い、次いでPBSで洗浄したのち、1μg/mlのpropidium iodide（PI）を含んだPBS中に浮遊させ、その後FACS解析に供した。細胞の解析およびセルソーティングはFACS Aria セルソーター（Becton Dickinson Immunocytometry System社製）を用いて行った。
　細胞の染色には、次のモノクローナル抗体を適宜選択して使用した。
・APC-conjugated anti-human CD34 antibody（BD Pharmingen社製）・PE-Cy7-conjugated anti-human CD34 antibody（BD Pharmingen社製）・APC/Cy7 -conjugated anti-human CD19 antibody（Biolegend社製）・FITC-conjugated anti-human CD38 antibody（eBioscoiences社製）・APC-conjugated anti-human CD138 antibody（Biolegend社製）・PE/Cy7-conjugated anti-human CD3 antibody（Biolegend社製）・FITC-conjugated anti-human CD14 antibody（BD Pharmingen社製）・PE/Cy7-conjugated anti-human CD45 antibody（Biolegend社製）。
〔実施例１〕
骨髄腫細胞株に結合し健常人末梢血に結合しないモノクローナル抗体ライブラリーの作製　多発性骨髄腫に対する抗体治療においては、骨髄腫細胞には結合するが正常血液細胞には結合しない抗体を用いることが重要である。そこで、このような抗体を以下の方法により同定した。まず、以下の手法を用いて、様々な骨髄腫細胞株に結合するモノクローナル抗体を１万クローン以上作製した。
　６種類のヒト骨髄腫細胞株（MM.1s細胞、RPMI8226細胞、INA6細胞、U266細胞、OPM2細胞、およびKMS12BM細胞）を抗原として、Balb/cマウスのfootpadに週２回、２－３週間免疫した。その後、膝下リンパ節を取り出して、細胞浮遊液を作製し、SP2/0マウスミエローマ細胞株と細胞融合させてハイブリドーマを作製した。細胞融合はポリエチレングリコールを用いる方法（PEG法）を用いて行った。その後ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン培地（HAT培地）で細胞を培養することにより、ハイブリドーマを選択した（＞１万クローン）。
　最後に、ハイブリドーマの培養上清を用いて、免疫に用いた骨髄腫細胞株に結合し、健常人末梢血由来単核球には結合しない抗体を含む上清をFACSを用いて選択した。その結果得られた骨髄腫細胞に特異的な抗体の候補は約２００クローンであり、これらを発現するハイブリドーマを増殖させた後にこれを凍結保存した。
〔実施例２〕
ヒト多発性骨髄腫患者骨髄において骨髄腫細胞特異的に結合する抗体の同定
　上記の実施例１にて得られた約200クローンの候補抗体を用いて、骨髄腫患者由来の骨髄細胞を染色し、FACSを用いて解析した。
　多発性骨髄腫患者由来の骨髄細胞に各候補抗体を加えて４℃で３０分間インキュベートしたのち洗浄し、二次抗体としてPE-conjugated anti-mouse IgG antibodyを加えてさらに4℃で30分間インキュベートした。洗浄の後、最後に、APC-conjugated anti-human CD138 antibody、FITC-conjugated anti-human CD38、またはPE/Cy7-conjugated anti-human CD45を用いて染色した。陰性コントロールとして、候補抗体の代わりに、Isotype control を加えたサンプルを同時に用意した。
　これらをFACSを用いて解析することにより、CD45-CD38++CD138+骨髄腫形質細胞およびCD45-CD38++CD138-骨髄腫前駆細胞には結合するが、CD45+血液細胞には結合しない抗体を選択した。
　その結果、MMG49抗体が上記の条件を満たす抗体として同定された（図１および図２）。図中の各ヒストグラムについて、Y軸は、細胞数を示し、X軸はMMG49抗体の結合強度を示す
〔実施例３〕
MMG49抗体が結合する抗原タンパクの同定
　MMG49抗体が結合する抗原タンパクの同定を発現クローニング法によって行った。
　まず、MMG49抗体が結合することがわかっているMM.1s細胞から、superscript choice system for cDNA synthesis（Invitrogen社）を用いてcDNAライブラリーを作製し、BstXIアダプター（Invitrogen社）を用いて、pMXsレトロウィルスベクター（東京大学医科学研究所　北村俊雄先生より分与）に挿入した。このようにして作製されたcDNA libraryをplat-E細胞（北村俊雄先生より分与）に導入することにより得たレトロウィルスをBaF3細胞に感染させて、MM.1s由来のcDNAライブラリーを発現するBaF3細胞を得た。
　次に、これらの細胞をMMG49抗体で染色し、陽性細胞をFACSでソーティングすることにより細胞濃縮を繰り返した（図３）。３回目のソーティング後にはほとんどの細胞がMMG49抗体に結合する細胞となった。そこで、これらの細胞が持つレトロウィルスのインサートをPCRにて増幅した後、シークエンシングすることにより塩基配列を同定した結果、細胞が保有するインサートがITGB7であることが明らかになった。
　〔実施例４〕
ITGB7欠損骨髄腫細胞の作製によるMMG49抗体の結合抗原がITGB7発現タンパク質であることの確認
　Crispa-Cas9システムを用いてITGB7欠損U266骨髄腫細胞株を作製した。
　まず、PX330（adgene社）ベクターにITGB7特異的な標的配列の二本鎖DNA配列を挿入することによりベクターを作製した。それを薬剤選択のためのベクターであるlinear hygromycin-resistance gene expression vector（Clontech社）と共に、Nucleofector（登録商標）II（Lonza社）を用いてU266細胞に導入した。その後、ハイグロマイシンを添加した培地中で増えてきたクローンについてITGB7の発現をFIB27抗体（抗インテグリンβ7抗体；Biolegend社）を用いて染色してFACSにて解析することにより、ITGB7欠損細胞を同定した。
　次に得られたITGB7欠損細胞をMMG49抗体を用いて染色し、FACSにて解析したところ、野生型のU266細胞にはMMG49抗体が結合するのに対して、ITGB7欠損株ではMMG49抗体の結合が完全に消失していた（図４）。このことはMMG49はITGB7発現タンパク質（インテグリンβ7）のみに結合していることを示している。
　次に、MM1s骨髄腫細胞の溶解液からMMG49抗体を用いて免疫沈降を行ったのちSDS-PAGEし、次いで抗インテグリンβ７抗体（Miltenyi社）を用いてWBを行った。その結果、MMG49抗体による免疫沈降物中にはインテグリンβ7が検出された（図５）。このことは、MMG49抗体がインテグリンβ7に結合していることを示している。
　〔実施例５〕
健常人末梢血および骨髄腫患者骨髄の各細胞分画におけるMMG49抗体の結合パターンの測定
　市販されている抗インテグリンβ７抗体（FIB27抗体；Biolegend社）およびMMG49抗体を用いて、健常人末梢血および骨髄細胞における様々な細胞分画への結合を測定した。
　健常人由来の末梢血細胞からHES40を用いて赤血球を除いた後、Fc receptor blocking reagent（Miltenyi社）を加えて非特異的な抗体の結合をブロッキングし、その後、MMG49抗体またはFIB27抗体、あるいはIsotype controlとしてmouse IgG2aを加えて４℃で３０分間インキュベートしたのち洗浄し、二次抗体としてPE-conjugated anti-mouse IgG antibodyを加えてさらに４℃で３０分間インキュベートした。
　これらを洗浄した後、最後に、APC/Cy7-conjugated anti-human CD19 antibody、FITC-conjugated anti-human CD14 antibody、PE/Cy7-conjugated anti-human CD3 antibodyを用いて染色した。染色後の細胞をFACSを用いて解析することにより各分画におけるMMG49抗体およびFIB27抗体の結合を測定した（図６）。
　また、1μlの健常人の末梢血を100μlのPBS（含EDTA）に加えたものを、同様にMMG49抗体またはFIB27抗体を用いて染色し、最後にPacific blue-conjugated anti-human CD235 antibody（BD Pharmingen社）またはFITC-conjugated anti-human CD41antibody（BD Pharmingen社）を用いて染色することにより、CD235+の赤血球および血小板への各抗体の有無も同様にFACS解析により検討した（図６）。これらの結果はFIB27抗体が多くのリンパ系細胞に強く結合するのに対して、MMG49抗体の上記の正常血球細胞への結合はきわめて弱いことを示している。
　さらに、骨髄中において骨髄腫細胞以外の各正常細胞分画へのMMG49抗体の結合がないかどうかを明らかにするため、骨髄腫患者の骨髄細胞も同様にMMG49抗体を用いて染色し、最後にAPC-conjugated anti-human CD34 antibody（BD Pharmingen社製）Alexa647-conjugatged human CD3（BD Pharmingen社製）、Cy7APC-conjugated anti-CD19 human antibody（BD Pharmingen社製）、PE-Cy7-conjugated anti-CD38 human antibody（BD Pharmingen社製）、またはFITC-conjugated anti-CD14 human antibody（BD Pharmingen社製）を用いて染色した。これらの染色後の骨髄腫患者由来の骨髄細胞FACSを用いて解析することにより、各分画におけるMMG49抗体の結合を測定した（図７）。これらの結果はMMG49抗体は骨髄腫細胞に強く結合するのに対し、造血幹細胞、前駆細胞分画を含めた全ての正常血球にはほとんど結合しないことを示している。
　〔実施例６〕
MMG49の各種細胞株への結合の解析
　各種細胞株（MM1s細胞、U266細胞、RPMI8226細胞、およびJJN3細胞）におけるMMG49抗体およびFIB27抗体の結合をFACSを用いて解析した。染色の方法は上記実施例５に示す末梢血などの場合と同じである。
　インテグリンβ7はインテグリンα4またはインテグリンαEとヘテロダイマーを形成して細胞表面にて発現されることが知られているので、Alexa647-cojugated anti-human CD49d antibody（Biolegend社）およびAPC-conjugated anti-human CD103 antibody（Biolegend社）を用いて、これらの発現も同時にFACSを用いて解析した。なお、CD103とはインテグリンαEを示し、CD49dとはインテグリンα4を示す。なお、上記実験例５と同様に、健常者由来の末梢血におけるインテグリンαEおよびインテグリンα4の発現量も検討した（図８）。
　その結果ITGA4はほとんどの骨髄腫細胞株に発現しており、ITGAEはどの細胞株にも発現していなかった。FIB27抗体は全ての骨髄腫細胞株に結合していたが、MMG49抗体の結合はFIB27抗体の発現レベルとは一致しなかった。さらに、Crispa-Cas9システムを用いて作製したITGA4欠損U266細胞に対するMMG49抗体、FIB27抗体の結合をFACSにて検討したところ、共に、ITGA4欠損によりU266細胞への結合が消失していた。つまり、MMG49抗体、FIB27抗体共にα4β7インテグリンとして発現しているβ7インテグリンを認識していることがわかった。
　〔実施例７〕
インテグリンの活性化とMMG49抗体の結合の関連の解析
　上記のMMG49抗体の特異な結合様式から考えて、MMG49抗体は活性化して構造の変化したインテグリンβ7を認識しているのではないかと推測された。
　そこで、α4β7を強制発現させたK562細胞およびCD4 T cell enrichment kit(BD pharmingen社)を用いて濃縮したヒト正常末梢血CD4T細胞を5mM EDTA/HBSで洗浄した後、1mM Ca2+/1mM Mg2+/HBS（低活性用バッファー）あるいは2mM Mn2+/HBS(活性化バッファー)中において、MMG49抗体あるいはFIB27抗体と共に室温で３０分間インキュベートしたのち洗浄し、二次抗体としてPE-conjugated anti-mouse IgG antibodyを加え、さらに室温で30分分間インキュベートした。これらをFACSを用いて解析することによりインテグリンα4β7が活性化された細胞におけるMMG49抗体およびFIB27抗体の結合を測定した。
　その結果、Mn2+の存在下でMMG49抗体の結合が増強していることが観察された（図１０）。一方、FIB27抗体については同様の変化は見られなかった。このことは、MMG49抗体が活性化したインテグリンβ7に特異的な抗体である可能性を示唆する。
　〔実施例８〕
MMG49抗体の認識に必須のエピトープの同定
　MMG49抗体が認識しているエピトープを同定するために、オーバーラッピングPCR法を用いて、図１１に示すような８種類のヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質発現用ベクターを作製した。
　それぞれの発現ベクターをリポフェクション法により293T細胞に導入し、48時間後にMMG49抗体の結合の有無を解析した。細胞を１％のウシ胎児血清添加PBSに浮遊させ、MMG49抗体を添加したのち、室温で30分間静置した。洗浄ののち、Alexa488-抗マウスIgG抗体を加え、室温で30分間静置したのち、FACSにて解析した。
　その結果、MMG49抗体は、110～721番目のアミノ酸残基からなる領域がマウス由来で、且つ、これ以外（20～109番目のアミノ酸残基からなる領域および722～798番目のアミノ酸残基からなる領域）がヒト由来の配列であるキメラインテグリンβ7タンパク質(#4960)に、全長がヒト由来のキメラインテグリンβ7タンパク質(#4927)の場合とほぼ同様に強く結合することが明らかとなった（図１１～１３）。
　722～798番目のアミノ酸残基からなる領域は膜貫通ドメイン(TM)および細胞内ドメイン(cytoplasmic)が含まれ、さらに1～19番目のアミノ酸残基からなる領域がシグナルペプチドであることに鑑みると、PSIドメインを含む20～109番目のアミノ酸残基からなる領域に、MMG49抗体の結合に必須のエピトープが存在することが示された。
　また、110～378番目のアミノ酸残基からなる領域をマウス由来とし、且つ、20～109番目のアミノ酸残基からなる領域および379～798番目のアミノ酸残基からなる領域をヒト由来としたキメラキメラインテグリンβ7タンパク質(#4961)は、キメラインテグリンβ7タンパク質(#4960)と比較して、MMG49抗体の結合力が、若干上昇し、全長がヒト由来のキメラインテグリンβ7タンパク質(#4927)の場合と完全に同じ結合レベルとなることが明らかとなった。
　さらに、上述のMMG49抗体のエピトープが含まれると示された20～109番目のアミノ酸残基からなる領域、および1～19番目のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドに相当する領域を含む1～378番目のアミノ残残基からなる領域がマウス由来で、且つ、379～798番目のアミノ酸残基からなる領域がヒト由来であるキメラインテグリンβ7タンパク質(#4944)、および1～416番目のアミノ酸残基からなる領域がヒト由来であり、且つ417～798番目のアミノ酸残基からなる領域がヒト由来であるキメラインテグリンβ7タンパク質(#4945)は、1～563番目のアミノ酸残基からなる領域がマウス由来で、且つ、564～798番目のアミノ酸残基からなる領域がヒト由来であるキメラインテグリンβ7タンパク質(#4946)、および1～721番目のアミノ酸残基からなる領域がマウス由来で、且つ、722～798番目のアミノ酸残基からなる領域がヒト由来であるキメラインテグリンβ7タンパク質(#4947)と比べて、MMG49抗体の結合能が若干上昇することも明らかとなった。
　以上の実験結果に鑑みると、MMG49抗体インテグリンβ7の20～109番目のアミノ残酸基からなる領域への特異的な結合力、すなわち親和性は、ヒトインテグリンβ7の379～721番目のアミノ酸残基からなる領域によって、すなわちヒトインテグリンβ7の379～721番目のアミノ酸残基からなる領域の存在下で、上昇することも明らかとなった。
　〔実施例９〕
MMG49抗体の抗体分子可変部領域の塩基配列の決定
　MMG49抗体サブクラスの確認はIsotyping kit（Roche社）を用いて行ったところ、IgG2aサブクラスであることを確認した。さらに、MMG49抗体の可変部領域の塩基配列およびアミノ酸配列を決定した。
　配列決定の方法は、Smarter RACE cDNA amplification kit（Clontech）社を用いて行った。すなわち、MMG49抗体を産生するハイブリドーマMMG49由来のmRNAから作製したcDNAを鋳型にして、PCR反応によりH鎖およびκ鎖可変部領域のcDNA断片を増幅し、その塩基配列を解読した。解読したH鎖可変領域のアミノ酸配列、塩基配列、および超過変領域（CDR1～3）を下記表３および４に示す。
　解読したL鎖（κ鎖）可変領域のアミノ酸配列、塩基配列、および超過変領域（CDR1～3）も下記表３および４に示す。
　単離したMMG49抗体の可変領域配列の特異性を確認するため、可変部配列cDNAをヒトIgG4定常部およびヒトIgLのκ鎖の定常部配列と結合させることによりキメラ化抗体の作製を行った。具体的にはIn-Fusion cloning kit (Takara社)を用いてpFuse-CH-Ig-hG4, pFuse-CL-Ig-hk（invivogen社）に各可変部配列を挿入したのち、それらをFreeStyle CHO-S細胞(Invitrogen社)に導入し、その培養上清に分泌されるキメラ化抗体を回収した。次に、MMG49抗体が結合するMM1s細胞およびMMG49抗体が結合しないKMS12BM細胞をMMG49-hIgG4を加えたバッファー中でインキュベートし、洗浄した後、ビオチン化抗ヒトIgG(Rockland社)を二次抗体として加え、再度洗浄した後、ストレプトアビジン-PE(Biolegend社)を加えることにより染色し、FACS解析を行った。その結果、MMG49-hIgG4は元のMMG49抗体と同様の染色パターンを示し、得られた可変部配列が正しいものであることが示唆された（図１４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　〔実施例１０〕
MMG49抗体の抗体分子可変部領域を用いたキメラ抗原受容体T細胞の作製
　MMG49抗体分子可変部配列を用いたchimeric antigen receptor T cell（以下、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞と呼ぶ。）の作製は、非特許文献２～４などを参照しながら以下の手順で行った。
（１）CD28およびCD3zのクローニング：
　Jurkat細胞からTrizol（Invitrogen社）を用いてRNAを採取し、さらにSuperscript III cDNA synthesis kit（Invitrogen社）を用いてcDNAを作製した。そして、それを鋳型としてPCRによりCD28およびCD3zのcDNAを増幅し、それぞれ、TA cloning kit（Invitrogen社）を用いてクローニングし、シークエンシングによりこれらの塩基配列を確認した。
（２）MMG49抗体由来のVL/VHとCD28/CD3zの４つの断片の結合：
　オーバーラッピングPCR法を用いて、MMG49抗体由来のVL領域およびVH領域、ならびに上記クローニングしたCD28およびCD3zの各遺伝子断片を結合し、キメラcDNAを作製した。その手順と用いたプライマーを図１５に示す。用いたプライマーの塩基配列を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　結合されたキメラcDNAはZeroblunt PCR cloning kit（Invitrogen）を用いてクローニングした後、シークエシングを行い塩基配列を確認した。また確認した塩基配列に基づいて確認されたアミノ酸配列（配列番号２１）およびその塩基配列（配列番号２２）を配列表に示す。なお、配列番号２１に示すアミノ酸配列は、上記配列番号２３に示すコザック配列（gaattccacc）を含まない、その直ぐ後に続く開示コドン（atg）からアミノ酸配列に変換したものである。
（３）発現ベクターへの挿入：
　次いで、（２）で結合されたキメラｃDNAをEcoRI/SalIの二つの制限酵素で切り出し、MSCV-ires-GFPベクターに挿入した。
　上記により作製したMMG49抗体由来キメラ抗原受容体cDNAレトロウィルスベクターをgag/polおよびVSV-Gエンベロープ発現ベクターと共にlipofectamine2000（invitrogen社）を用いて293T細胞に導入することによりレトロウィルスの作製を行った。遺伝子導入後48時間後に上清を回収しウィルス溶液として用いた。
（４）Ｔ細胞への導入：
　次いで、ヒトT細胞へMMG49抗体由来キメラ抗原受容体のcDNAの導入は以下のように行った。
　まず、anti-CD3 antibody（eBioscience社）をコーティングした４８ウェルプレートにヒト末梢血単核球を加え７２時間培養した。培養液にはX-VIVO15（Lonza社）に10%のヒトAB型血清とIL-2（175IU/L）を添加したものを用い末梢血単核球を刺激した。その後、Retronectin（Takara社）をコーティングした48ウェルプレートに上記作製のウィルス溶液を添加し、1700xgで120分間の遠心によりウィルスをRetronectinに吸着させた後、刺激後の末梢血単核球（T細胞を含む）を加え、これに遺伝子導入を行った。その後上述の培地で培養を続けることによりMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞を増幅させ、以下の検討に用いた。MMG49抗体の可変領域を用いたCARコンストラクトを発現させたT細胞をPE-抗ヒトF(ab')2抗体（Jackson Laboratory社）を用いて染色した結果、コンストラクトの導入を示すGFPの発現に比例してヒトF(ab')2の発現が検出された（図１６）。つまり、導入されたCARは細胞表面に発現されていることが確認された。
　〔実施例９〕
MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞によるITGB7発現腫瘍細胞の認識と細胞傷害活性の解析
　上述の方法により作製したMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞あるいはGFPだけを導入されたコントロールT細胞とインテグリンβ7を発現していないK562細胞あるいはインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞を共培養し、産生されるサイトカインの量を定量した。具体的にはT細胞およびターゲット細胞のそれぞれ1x105個を９６ウェルプレートに加えた。24時間後に上清を回収し、ELISAにてIFN-γの産生量を測定した。測定はQuantikine kit（R&D社）を用いて行った。その結果、インテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞とMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞との共培養においてのみ、control（GFP発現ベクターを導入した刺激後の末梢血単核球を同様に培養して得られるT細胞）よりも高いIFN-γおよびIL2の産生が見られた（図１７）。
次に、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞あるいはGFPだけを導入されたコントロールT細胞とMMG49抗体が結合する骨髄腫細胞株（MM.1s細胞、RPMI8226細胞、およびJJN3細胞）あるいはMMG49抗体が結合しない細胞（KMS12BM, Molt4, およびRaji細胞）とを共培養し、同様に産生されるサイトカインの量を定量した。その結果、MMG49抗体が結合する細胞であるMM.1s、RPMI8226細胞、およびJJN3細胞とMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞とを共培養したときにのみ、control（GFP発現ベクターを導入した刺激後の末梢血単核球を同様に培養して得られるT細胞）よりも高いIFN-γおよびIL2の産生が見られた（図１８および１９）。これらの結果は、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞はMMG49抗体が認識する抗原（これをMMG49抗原と呼ぶことがある。）を認識することにより活性化していることを示している。
　さらに、51Cr細胞傷害アッセイにて、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞が骨髄腫細胞株を傷害するかどうかを検討した。まず、標的細胞となるインテグリンβ7を発現していないK562細胞あるいはインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞を10％のFCSを添加したRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5～1.0ｘ104個となるように調製した。
　これに適量のNa2 51CrO4を加え、３７℃で２時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とした。これを、ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁したMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞と混和し４時間共培養した。
　その後、上清に放出された51Crをγ-カウンターにて測定した。細胞傷害率（%）は以下の式（１）に基づいて求めた。
　(A-B)/(C-D)x100　　　　（１）
A: 実験に用いた細胞からの51Crの放出量
B: 抗体の存在しない状態での自発的な51Crの放出量
C: 1%のTriton X-100の添加による最大51Cr放出量
D: 抗体の存在しない状態での自発的51Crの放出量。
　その結果、MMG49抗体が結合するインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞では、controlであるGFPだけを発現するT細胞に比べてMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞による高い細胞傷害が見られた（図２０）。
　次に、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞あるいはGFPだけを導入されたコントロールT細胞とMMG49抗体が結合する骨髄腫細胞株（MM1s細胞、RPMI8226細胞、およびJJN3細胞）あるいはMMG49抗体が結合しない細胞（KMS12BM, Molt4,および Raji細胞）とを共培養し、同様の検討を行った。その結果、MMG49抗体が結合するインテグリンα4β7を強制発現させたK562細胞でのみ、controlであるGFPだけを発現するT細胞に比べてMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞による高い細胞傷害が見られた（図２１）。
　以上の結果は、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞がMMG49抗体により認識される抗原を発現する細胞を特異的に傷害しうることを示している。
　〔実施例１１〕
MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞によるin vivoにおける骨髄腫瘍細胞排除能の解析　MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞を用いて、in vivoでの多発性骨髄腫に対する治療効果を調べた。
　2.4Gyの放射線照射を行ったNOGマウスの骨髄内に骨髄腫細胞株MM1s細胞（4x105個）を移植した。５日後に、マウスをMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与群と、コントロールT細胞投与群に分け、それぞれ5x106個ずつ経静脈的に投与した。その７日後に骨髄の解析を行ったところ、コントロールT細胞投与群では明らかに全てのマウスに著明な骨髄腫細胞の増殖が見られたのに対して、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与群では腫瘍はほぼ完全に消失していた。これらの結果はMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与がin vivoにおいてもMMG49抗原を発現する腫瘍を排除する能力を有することを示している（図２２）。
　さらに骨髄腫全身播種モデルを用いて、in vivoでの多発性骨髄腫に対する治療効果を調べた。
　2.4Gyの放射線照射を行ったNOGマウスの静脈内にルシフェラーゼ遺伝子を導入した骨髄腫細胞株MM1s細胞（5x106個）を移植した。移植後５日後にIVIS imaging system（パーキンエルマー社）を用いて、腫瘍細胞の生着の程度を測定した。その後、マウスをMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与群と、コントロールT細胞投与群に分け、移植後５日後と７日後に、それぞれ3x106個ずつ経静脈的に投与した。２回目のT細胞投与後７日後にIVIS imaging systemを用いて、再度腫瘍量の測定を行ったところ、コントロールT細胞投与群では明らかに全てのマウスに著明な骨髄腫細胞の増殖が見られたのに対して、MMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与群では腫瘍はほぼ完全に消失していた（図２３）。これらの結果はMMG49抗体由来キメラ抗原受容体T細胞投与がin vivoにおいてもMMG49抗原を発現する腫瘍を排除する能力を有することを示している。
〔実施例１２〕
　MMG49抗体のエピトープについて、実施例８にて検討した結果を更に詳細に検討する実験を行った。図２５に示すような３種類のヒト/マウスキメラインテグリンβ7タンパク質発現用ベクターを作製し、それぞれの発現ベクターをリポフェクション法により293T細胞に導入し、48時間後にMMG49抗体の結合の有無をFACSにて解析した。
　その結果、MMG49抗体は、インテグリンβ7タンパク質の1～32番目および91～798番目のアミノ酸残基からなる領域がマウス由来で、且つ、これ以外（33～90番目のアミノ酸残基なる領域）がヒト由来の配列であるキメラインテグリンβ7タンパク質(図25における、ch5.1)に、全長がヒト由来のインテグリンβ7タンパク質(図11における、#4927)の場合とほぼ同様に強く結合することが明らかとなった（図２５）。
　よって、MMG49抗体のエピトープは、ヒトインテグリンβ7タンパク質の33～90番目のアミノ酸残基に含まれることが強く示唆された。
〔実施例１３〕
ヒトインテグリンβ7、マウスインテグリンβ7、およびヒトインテグリンβ7の1あるいは2アミノ酸のみをマウス由来のアミノ酸配列に変異させた各種変異体（R35E/N36D、H38D、M41L/L42Q、およびA48V）を発現するベクターをリポフェクション法により293T細胞に導入し、その後は実施例８と同様に実験を行った。その結果、図２５に示すように、A48V変異体のみがMMG49抗体に対する結合力がヒトインテグリンβ7と比べて顕著に減少し、マウマウスインテグリンβ7の数値に近くなることが明らかとなった。この結果より、ヒトインテグリンβ7の48番目のアミノ酸残基が、MMG49抗体のエピトープに強く関連するか、またはMMG49抗体のエピトープに含まれることが明らかとなった。
　以下に、本明細書にて表示する塩基配列およびアミノ酸配列を示す。

Claims (15)

  1. 抗ヒトインテグリンβ7抗体であって、ヒトインテグリンβ7の20～109番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する抗体。
  2. ヒトインテグリンβ7の379～721番目のアミノ酸残基からなる領域の少なくとも一部の存在下で、前記エピトープへの親和性が上昇する、請求項１に記載の抗体。
  3. ヒトインテグリンβ7を活性化することにより、前記エピトープへの親和性が上昇する、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
    配列番号２に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および／または
    配列番号３に示すアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
    配列番号６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
    配列番号７に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および／または
    配列番号８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 配列番号４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または
    配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
    を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 多重特異性抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを保持する宿主細胞。
  9. 請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体の抗原認識部位を含むキメラ抗原受容体。
  10. 請求項９に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
  11. 配列番号２２に示す塩基配列を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドを保持する細胞。
  13. キメラ抗原受容体T細胞である、請求項１２に記載の細胞。
  14. 請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１２に記載の細胞を含む医薬組成物。
  15. 請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３に記載のキメラ抗原受容体T細胞を含む医薬組成物。
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