CN107922938B - 抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种骨髓瘤治疗用的医药组合物的有效成分。本发明的抗体在人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域具有表位。

Description

抗体
技术领域
本发明揭示一种新的抗体及其应用等。
背景技术
作为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病的代表例的多发性骨髓瘤在全部癌中约占1％，在全部血液学恶性肿瘤中占超过10％。多发性骨髓瘤是存在于骨髄中的浆细胞癌化(结果成为异常的浆细胞)而单克隆性地增殖的疾病。
在多发性骨髓瘤中，异常的浆细胞(骨髓瘤细胞)在体内的骨髄中扩散，遍及全身骨髄而进行增殖。如果异常的浆细胞增殖，则会出现包括骨的破裂在内的各种症状。由骨髓瘤细胞产生作为异常免疫球蛋白的M蛋白质，血中的M蛋白质浓度上升，导致血液变粘稠。
M蛋白质不会作为识别侵入至体内的病原体等异物的原本抗体发挥功能，因此还会导致免疫力降低。这些会对多个器官产生影响，而产生各种症候。具代表性的症候是骨的疼痛和损伤、高钙症、肾损伤或肾衰竭、贫血等。
目前，作为多发性骨髓瘤的治疗，主要进行蛋白酶体抑制剂、沙利度胺(Thalidomide)和作为其衍生物的来那度胺(Lenalidomide)等免疫调节药物(iMIDs)、及美法仑(merphalan)和泼尼松(Prednisone)的并用等化学疗法、以及造血干细胞移植。
但是，骨髓瘤细胞在多数情况下几乎都对这些治疗药获得抗性。因此，就目前的治疗方法而言，现实情况是发病后的平均存活时间为3～5年左右，且骨髓瘤患者的预后不良。另外，这些治疗药并非仅特异性地作用于靶肿瘤细胞，对于正常细胞也显示出毒性，结果存在伴有严重副作用的问题。
业界尝试开发应用单克隆抗体的多发性骨髓瘤的治疗方法。例如认为抗CS1抗体及抗CD38抗体等有前景(非专利文献1及2)。并且，专利文献1中披露了将抗人CD48单克隆抗体作为有效成分的以多发性骨髓瘤等为对象的治疗药。
整合素在活体内主要形成α链与β链的异源二聚体，在细胞表层上作为受体而发挥功能。这种整合素的α链与β链的组合有多种。
另外，非专利文献4～6中披露了包含对特定抗原具有亲和性的抗原识别部位的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开公报2010/117059
非专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Oncology,2012 Jun 1；30(16):1953-9.
非专利文献2：Journal of immunology,2011 Feb 1；186(3):1840-8.
非专利文献3：J Biol Chem.2012 May 4；287(19):15749-59.
非专利文献4：J Immunol.2009 Nov 1；183(9):5563-74.
非专利文献5：N Engl J Med.2014 Oct 16；371(16):1507-17.
非专利文献6：Nat Biotechnol.2002 Jan；20(1):70-5.
发明内容
[发明所要解决的问题]
抗CS1抗体对于骨髓瘤细胞的特异性相对较高，但单独使用抗体时的抗骨髓瘤效果并不好，且单剂在临床试验中没有显示出有效性。发现通过与来那度胺并用，抗CS1抗体的抗肿瘤效果会上升，认为目前的目标是得到将两者并用的批准。另一方面，CD38也在包括CD34阳性造血祖细胞在内的大多正常血液细胞中表达，因此是作为多发性骨髓瘤的治疗靶而特异性低的抗原。本发明的主题之一在于基于这种现状，提供一种对于多发性骨髓瘤等伴有浆细胞的肿瘤性增殖的疾病等的更有效的治疗方法。
[解决问题的技术手段]
本发明人等为了解决这种问题而进行了努力研究，结果以和骨髓瘤细胞及其祖细胞特异性地结合为指标加以筛选，而获得MMG49抗体。然后，确认该抗体结合在人类整合素β7的特定区域，发现使用该抗体的抗原识别部位所制作的CAR-T细胞对于骨髓瘤的治疗非常有用。另外，还确认了MMG49抗体的表位存在于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域。
本发明是基于这种见解而完成，包括以下所示的多个方面的发明。
(I)抗体
抗体(I)包括以下的(I-1)至(I-25)所示的抗体。
(I-1)
一种抗体，其是抗人类整合素β7抗体，且在人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域具有表位。
(1-1A)
根据(I-1)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第33～109号氨基酸残基的区域具有表位。
(1-1B)
根据(I-1)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第20～90号氨基酸残基的区域具有表位。
(1-1C)
根据(I-1)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第33～90号氨基酸残基的区域具有表位。
(I-2)
根据(I-1)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-3)
根据(I-2)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第417～721号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-4)
根据(I-2)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第564～721号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-5)
根据(I-2)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第379～563号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-6)
根据(I-2)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第417～563号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-7)
根据(I-2)所述的抗体，其在人类整合素β7的包含第379～416号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下，对所述表位的亲和性上升。
(I-8)
根据(I-1)至(I-7)中任一项所述的抗体，其通过将人类整合素β7活化而对所述表位的亲和性上升。
(I-9)
一种抗体，其是抗人类整合素β7抗体，且对于在骨髓瘤细胞中表达的人类整合素β7的亲和性高于对于在正常细胞中表达的人类整合素β7的亲和性。
(I-10)
根据(I-1)至(I-9)中任一项所述的抗体，其具有和MMG49抗体相同的表位。
(I-11)
根据(I-1)至(I-10)中任一项所述的抗体，其包含重链可变区及/或轻链可变区，该重链可变区包含：
具有序列编号1所示的氨基酸序列的重链CDR1、
具有序列编号2所示的氨基酸序列的重链CDR2及/或
具有序列编号3所示的氨基酸序列的重链CDR3，
该轻链可变区包含：
具有序列编号6所示的氨基酸序列的轻链CDR1、
具有序列编号7所示的氨基酸序列的轻链CDR2及/或
具有序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
(I-12)
根据(I-1)至(I-10)中任一项所述的抗体，其包含
具有序列编号4所示的氨基酸序列的重链可变区及/或
具有序列编号9所示的氨基酸序列的轻链可变区。
(I-13)
根据(I-1)至(I-12)中任一项所述的抗体，其是Fv、scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)或这些的组合。
(I-14)
根据(I-1)至(I-11)中任一项所述的抗体，其包含恒定区。
(I-15)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)中任一项所述的抗体，其是嵌合抗体。
(I-16)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)中任一项所述的抗体，其是人源化抗体。
(I-17)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)中任一项所述的抗体，其是人类抗体。
(I-18)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)至(I-17)中任一项所述的抗体，其是免疫球蛋白、Fab、F(ab')2、微型抗体(minibody)、scFv-Fc或这些的组合。
(I-19)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)至(I-18)中任一项所述的抗体，其是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
(I-20)
根据(I-1)至(I-12)及(I-14)至(I-19)中任一项所述的抗体，其包含具有序列编号5所示的氨基酸序列的重链及/或具有序列编号10所示的氨基酸序列的轻链。
(I-21)
根据(I-1)至(I-20)中任一项所述的抗体，其具有细胞毒性。
(I-22)
根据(I-21)所述的抗体，其细胞毒性为ADCC活性及/或CDC活性。
(I-23)
根据(I-1)至(I-22)中任一项所述的抗体，其是多特异性抗体。
(I-24)
根据(I-1)至(I-23)中任一项所述的抗体，其是细胞毒素(cytotoxin)结合而成。
(I-25)
根据(I-1)至(I-24)中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
(II)多核苷酸
多核苷酸(II)包括以下的(II-1)所示的多核苷酸。
(II-1)
一种多核苷酸，其具有编码所述抗体(I)的氨基酸序列的碱基序列。
(III)宿主细胞
宿主细胞(III)包括以下的(III-1)或(III-2)所示的宿主细胞。
(III-1)
一种宿主细胞，其携带多核苷酸(II)。
(III-2)
根据(III-1)所述的宿主细胞，其是真核细胞。
(IV)嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(IV)包括以下的(IV-1)至(IV-5)所示的嵌合抗原受体。
(IV-1)
一种嵌合抗原受体，其具有和所述抗体(I)相同的表位。
(IV-2)
根据(IV-1)所述的嵌合抗原受体，其包含所述抗体(I)的抗原识别部位。
(IV-3)
根据(IV-1)或(IV-2)所述的嵌合抗原受体，其中抗原识别部位包含重链可变区及/或轻链可变区，该重链可变区包含：
具有序列编号1所示的氨基酸序列的重链CDR1、
具有序列编号2所示的氨基酸序列的重链CDR2及/或
具有序列编号3所示的氨基酸序列的重链CDR3，
该轻链可变区包含：
具有序列编号6所示的氨基酸序列的轻链CDR1、
具有序列编号7所示的氨基酸序列的轻链CDR2及/或
具有序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
(IV-4)
根据(IV-1)至(IV-3)中任一项所述的嵌合抗原受体，其中抗原识别部位包含
具有序列编号4所示的氨基酸序列的重链可变区及/或
具有序列编号9所示的氨基酸序列的轻链可变区。
(IV-5)
根据(IV-1)至(IV-4)中任一项所述的嵌合抗原受体，其具有序列编号21所示的氨基酸序列。
(V)多核苷酸
多核苷酸(V)和所述多核苷酸(II)不同，包括以下的(V-1)或(V-2)所示的多核苷酸。
(V-1)
一种多核苷酸，其编码所述嵌合抗原受体(IV)的氨基酸序列。
(V-2)
根据(V-1)所述的多核苷酸，其具有序列编号22所示的碱基序列。
(VI)细胞
细胞(VI)和所述宿主细胞(III)不同，包括以下的(VI-1)至(VI-4)中的任一项所示的细胞。
(VI-1)
一种细胞，其携带所述多核苷酸(V)。
(VI-2)
根据(VI-1)所述的细胞，其是真核细胞。
(VI-3)
根据(VI-1)或(VI-2)所述的细胞，其是T细胞或NK细胞。
(VI-4)
根据(VI-1)至(VI-3)中任一项所述的细胞，其是嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体NK细胞。
(VII)医药组合物
医药组合物(VII)包括以下的(VII-1)至(VII-5)所示的医药组合物。
(VII-1)
一种医药组合物，其包含所述抗体(I)或所述细胞(VI)。
(VII-2)
根据所述(VII-1)所述的医药组合物，其中所述细胞为嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
(VII-3)
根据(VII-1)或(VII-2)所述的医药组合物，其用于癌的治疗。
(VII-4)
根据(VII-3)所述的医药组合物，其中癌为血液癌。
(VII-5)
根据(VII-4)所述的医药组合物，其中血液癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
(VIII)疾病的治疗或预防方法
疾病的治疗或预防方法(VIII)包括以下的(VIII-1)至(VIII-6)所示的疾病的治疗或预防方法。
(VIII-1)
一种疾病的治疗或预防方法，其包括对受试者投予治疗有效量的所述抗体(I)或所述细胞(VI)的步骤。
(VIII-2)
根据(VIII-1)所述的治疗或预防方法，其中所述细胞为嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
(VIII-3)
根据(VIII-1)或(VIII-2)所述的治疗或预防方法，其中疾病为癌，且受试者为罹患癌的患者或有可能罹患癌的动物。
(VIII-4)
根据(VIII-3)所述的治疗或预防方法，其中癌为血液癌。
(VIII-5)
根据(VIII-4)所述的治疗或预防方法，其中血液癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
(VIII-6)
一种多发性骨髓瘤的治疗或预防方法，其将活性型人类整合素β7设为靶。
(IX)用途
用途(IX)包含以下的(IX-1)至(IX-5)所示的用途。
(IX-1)
一种所述抗体(I)或所述细胞(VI)的用途，其用以制造医药组合物。
(IX-2)
一种所述(IX-1)所述的治疗或预防方法，其中所述细胞为嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
(IX-3)
根据(IX-1)或(IX-2)所述的用途，其用于癌的治疗。
(IX-4)
根据(IX-3)所述的用途，其中癌为血液癌。
(IX-5)
根据(IX-4)所述的用途，其中血液癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
(X)筛选方法
筛选方法(X)包括以下的(X-1)至(X-5)所示的筛选方法。
(X-1)
一种癌的治疗用或预防用的医药组合物的有效成分的筛选方法，其包括如下步骤：从化合物库筛选和人类整合素β7特异性地结合且和人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域结合的候选物质。
(X-2)
根据(X-1)所述的筛选方法，其还包括如下步骤：筛选具有细胞毒性的物质。
(X-3)
根据(X-1)或(X-2)所述的筛选方法，其中所筛选的物质为单克隆抗体。
(X-4)
根据(X-1)至(X-3)中任一项所述的筛选方法，其中癌为血液癌。
(X-5)
根据(X-4)所述的筛选方法，其中血液癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
(XI)诊断方法
诊断方法(XI)包括以下的(XI-1)至(XI-5)所示的诊断方法。
(XI-1)
一种癌的诊断方法，其包括如下步骤：使从受试者采集的样品和所述抗体(I)接触。
(XI-2)
根据(XI-1)所述的诊断方法，其中从受试者采集的样品为血液或骨髄液。
(XI-3)
根据(XI-1)或(XI-2)所述的诊断方法，其中将检测到和所述抗体(I)结合的细胞的情况判断为罹患癌或有罹患癌的可能性。
(XI-4)
根据(XI-3)所述的诊断方法，其中癌为血液癌。
(XI-5)
根据(XI-4)所述的诊断方法，其中该细胞为浆细胞，且该癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
(XII)试剂盒
试剂盒(XII)包括以下的(XII-1)至(XII-3)所示的试剂盒。
(XII-1)
一种癌的诊断用试剂盒，其包含所述抗体(I)。
(XII-2)
根据(XII-1)所述的诊断方法，其中癌为血液癌。
(XII-3)
根据(XII-2)所述的试剂盒，其中癌为产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。
[发明的效果]
本发明的抗体由于不识别正常细胞，所以作为医药组合物的有效成分有用。尤其是作为癌(例如血液癌)的治疗药的有效成分有用。
关于本发明的抗体，通过将其抗原识别部位应用于嵌合抗原受体而制造嵌合抗原受体T细胞，由于可将所制造的嵌合抗原受体T细胞用作如上述的医药组合物的有效成分，所以本发明的抗体有用。
附图说明
图1是表示如下结果的图，该结果是在实施例2中，使用FACS(Fluorescenceactivated cell sorter，流式细胞仪)对MMG49抗体对于源自骨髓瘤患者的骨髄细胞的结合进行分析而获得。左图表示骨髓瘤祖细胞组分(Myeloma progenitor cells)、骨髓瘤浆细胞组分(Myeloma plasma cells)及CD45+白血球细胞(CD45+leukocytes)的鉴定方法。右图表示MMG49抗体对于各组分的结合。
图2是表示如下结果的图，该结果是在实施例2中，利用FACS对MMG49抗体对于多个源自骨髓瘤患者的骨髄细胞(UPN1～5)的骨髓瘤祖细胞组分、骨髓瘤浆细胞组分及CD45+白血球细胞的结合进行分析而获得。
图3是表示在实施例3中，通过表达克隆法来鉴定MMG49抗体所识别的抗原蛋白质的过程。表示通过FACS分选将最初为0.1％以下的和MMG49抗体结合的BaF3细胞加以浓缩的过程。
图4是表示如下结果的图，该结果是在实施例4中，利用MMG49抗体或FIB27抗体(市售的抗整合素β7抗体)对使用Crisp-cas9系统所制作的ITGB7缺损U266细胞进行染色，并进行FACS分析而获得。
图5是表示如下结果的图，该结果是在实施例4中，使用MMG49抗体或同型对照(isotype control)抗体从源自MM1s骨髓瘤细胞的细胞溶解液进行免疫沉淀，将所得者进行SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，继而利用市售的抗整合素β7抗体(Abcam公司)进行蛋白质免疫印迹法而获得。
图6是表示如下结果的图，该结果是在实施例5中，使用FACS对MMG49抗体、FIB27抗体、及FIB504抗体分别对于健康人末梢血细胞的各细胞组分(图中，从左开始依序表示B细胞、T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、红细胞及血小板)的结合进行分析而获得。
图7是表示如下结果的图，该结果是在实施例5中，对MMG49抗体分别对于源自骨髓瘤患者的骨髄细胞的各细胞组分的结合进行FACS分析而获得。左图表示各细胞组分的鉴定方法，右图表示MMG49对于各组分的结合。A表示造血干细胞、祖细胞组分与骨髓瘤细胞的比较，B表示B/T淋巴球组分、与骨髓瘤祖细胞及骨髓瘤浆细胞组分的比较。
图8是表示如下结果的图，该结果是在实施例6中，使用FACS对MMG49抗体及FIB27抗体分别对于各种骨髓瘤细胞株、源自末梢血的T细胞及B细胞的结合进行分析而获得。还一并表示如下结果，该结果是对所述细胞中的ITGA4的表达(抗整合素α4抗体的结合)及ITGAE的表达(抗整合素αE抗体的结合)的确认进行FACS分析而获得。
图9是表示如下结果的图，该结果是在实施例6中，对MMG49抗体及FIB27抗体对于U266细胞及ITGA4(整合素α4)缺损U266细胞的结合进行FACS分析而获得。还一并表示如下结果，该结果是对所述细胞中的ITGA4的表达(抗整合素α4抗体的结合)进行FACS分析而获得。
图10是表示如下结果的图，该结果是在实施例7中，在Ca2+/Mg2+或Mn2+的存在下，使在37℃下经20分钟处理的整合素α4β7强制表达K562细胞及源自人类正常末梢血的T细胞和MMG49抗体或同型(isotype)抗体进行反应后，使用抗小鼠IgG抗体作为二次抗体进行染色，并对这些进行FACS分析而获得。
图11是表示实施例8中的人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质的构建和MMG49抗体对于暂时性表达该人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质的293T细胞有无结合的图。
图12是表示如下结果的图，该结果是在实施例8中，对MMG49抗体对于暂时性表达人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质的293T细胞的结合进行FACS分析而获得。
图13是汇总图12所示的结果的图。在图中的图表中，纵轴表示结合有抗体的细胞的百分率，横轴表示各种人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质。
图14是表示如下结果的图，该结果是使用通过将MMG49抗体的可变区和人类IgG4抗体恒定部连接而制作的嵌合化MMG49抗体，对MM1s细胞及KMS12BM细胞进行染色而获得。
图15是表示使用MMG49抗体的可变区的CAR构建物的制作方法的图解。
图16是表示如下结果的图，该结果是使用PE-抗人类F(ab')2抗体，对使使用MMG49抗体的可变区的CAR构建物所表达的T细胞进行染色而获得。
图17是表示如下结果的图，该结果是在实施例11中，通过ELISA(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，酶联免疫吸附法)，对通过源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)的T细胞(对照)和没有表达整合素β7的K562细胞或强制表达整合素α4β7的K562细胞的共培养所产生的IFN-γ及IL2的量进行定量而获得。﹡：p＜0.05。
图18是表示如下结果的图，该结果是在实施例11中，利用ELISA，对通过源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)和MMG49抗原表达细胞或非表达细胞的共培养所产生的IFN-γ的量进行定量而获得。
图19是表示如下结果的图，该结果是在实施例11中，利用ELISA，对通过源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)和MMG49抗原表达细胞或非表达细胞的共培养所产生的IL2的量进行定量而获得。
图20是表示如下结果的图，该结果是在实施例11中，通过51Cr杀伤实验(killingassay)，对源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)对于没有表达整合素β7的K562细胞或强制表达整合素α4β7的K562细胞的细胞杀伤程度进行测定而获得。此外，图中的图表的y轴是指细胞杀伤率(％)。
图21是表示如下结果的图，该结果是在实施例11中，通过51Cr杀伤实验，对源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)对于MMG49抗原表达细胞或非表达细胞的细胞杀伤程度进行测定而获得。
图22是表示实施例12中针对移植至NOG小鼠的骨髄内的骨髓瘤细胞株MM1s的治疗实验的设计及其结果的图。采集植入源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)后1周后的骨髄细胞，利用FACS进行分析。MM1s细胞能够鉴定为人类CD138+细胞。在源自MMG49抗体的CAR-T细胞投予组中骨髄内的MM1s细胞几乎完全消失。
图23是表示实施例12中针对移植至NOG小鼠全身的骨髓瘤细胞株MM1s的治疗实验的设计及其结果的图。植入源自MMG49抗体的CAR-T细胞或导入了GFP的T细胞(对照)前后的骨髓瘤细胞的量是通过利用IVIS成像的荧光强度的测定而评价。在源自MMG49抗体的CAR-T细胞投予组中骨髄内的MM1s细胞几乎完全消失。
图24是表示源自人类的整合素β7的氨基酸序列和源自小鼠的整合素β7的氨基酸序列的比较的图。
图25是表示实施例13中的人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质的构建及MMG49抗体对于暂时性表达该人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质的293T细胞有无结合的图。
图26是表示实施例14中对MMG49抗体的表位进行研究的实验结果的图。横轴的MFI表示对于MMG49抗体的结合强度，数值越高，表示结合力越高。
具体实施方式
在本说明书中，“包含”及“具有”是所谓开放型语言(OpenLanguage)，但这些是包括“仅包含”等封闭性语言(ClosedLanguage)在内的概念，在一个实施方式中，可替换为“仅包含”。
“骨髓瘤祖细胞”是分化为骨髓瘤浆细胞前的阶段的祖细胞，其特征在于：虽然强力表达CD38，但不表达对于成熟浆细胞具有特异性的标记物即CD138。因此，骨髓瘤祖细胞有时也记载为“CD38++CD138-细胞”或“CD19-CD38++CD138-细胞”。
“骨髓瘤浆细胞”一般也称为骨髓瘤细胞，是产生作为异常免疫球蛋白的M蛋白质的细胞。在骨髓瘤浆细胞中，除强力表达CD38以外，也表达CD138。因此，骨髓瘤浆细胞有时也记载为“CD38++CD138+细胞”或“CD19-CD38++CD138+细胞”。
骨髓瘤祖细胞及骨髓瘤浆细胞也指各多发性骨髓瘤以外的产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病中的肿瘤祖细胞、肿瘤性浆细胞。
“造血祖细胞”是能够分化为各种血液细胞的细胞。造血祖细胞的特征在于表达CD34。因此，在本说明书中，造血祖细胞有时也记载为“CD34+细胞”。
(I)抗体
抗体(I)优选如下抗体，其是抗人类整合素β7抗体，且在人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域具有表位。
更优选可列举：在人类整合素β7的包含第33～109号氨基酸残基的区域具有表位的抗体或在人类整合素β7的包含第20～90号氨基酸残基的区域具有表位的抗体。最优选可列举：在人类整合素β7的包含第33～90号氨基酸残基的区域具有表位的抗体。
人类整合素β7没有特别限定，是具有序列编号31所示的氨基酸序列的跨膜蛋白质，可设为与整合素α形成异源二聚体的蛋白质。作为具体的整合素α，可列举整合素α4或整合素αE。
具体的人类整合素β7的氨基酸序列除序列编号31所示的氨基酸序列以外，还可列举例如NCBI的数据库所收集记载的ACCESSION:EAW96675；VERSION:EAW96675.1,GI:119617081、ACCESSION:NM000889；VERSION:NM000889.2,GI:540344585、ACCESSION:XM005268851,VERSION:XM005268851.2,GI:767974096、ACCESSION:XM006719376,VERSION:XM006719376.2,GI:767974098、ACCESSION:XM005268852,VERSION:XM005268852.3,GI:767974097等所记载的氨基酸序列。
关于以下的人类整合素β7的说明是基于序列编号31所示的氨基酸序列而进行，但对于其他人类整合素β7的氨基酸序列，本领域技术人员通过计算机模拟分析(in silico)确认和序列编号31所示的氨基酸序列的同源性，能够容易地判断以下所说明的人类整合素β7的区域及/或部位相当于其他人类整合素β7的氨基酸序列的哪个区域或部位。
人类整合素β7的包含第1～19号氨基酸残基的区域是信号肽，且是在活体内作为膜蛋白质发挥功能时不存在的肽片段。因此，人类整合素β7发挥作为膜蛋白质的功能时的N末端是所述氨基酸序列的第20号氨基酸残基。
人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域包含PSI结构域。已知人类整合素β7的PSI结构域和小鼠整合素β7的PSI结构域的同源性较高，约为80％以上，但如果将人类整合素β7及小鼠整合素β7的包含PSI结构域的包含第20～109号氨基酸残基的区域的氨基酸残基进行比较，则如图24所示，人类整合素β7的第23号、第26号、第28号、第30号、第32号、第35号、第36号、第38号、第41号、第42号、第48号、第93号、第94号、第102号、及第109号氨基酸残基的合计15个氨基酸残基不同。
因此，抗体(I)的表位优选和这15个氨基酸残基中的任意一个以上相关，优选2个以上，进一步优选3个以上。具体而言，抗体(I)的表位优选存在于人类整合素β7的包含第23～109号氨基酸残基的区域，进一步优选存在于包含第23～48号氨基酸残基的区域或包含第93～109号氨基酸残基的区域。
其他进一步优选形态的抗体(I)的表位也可为包含第23～48号氨基酸残基的区域、包含第93～109号氨基酸残基的区域或者将包含第23～48号氨基酸残基的区域及包含第93～109号氨基酸残基的区域组合而成的立体区域。
此外，抗体(I)的表位可为线状表位，也可为立体表位(也称为非线状表位)。本领域技术人员已知线状表位是指连续的氨基酸残基成为表位的情形，立体表位是由不连续的氨基酸残基所构成的表位。
例如作为相当于立体表位的例子，可列举以所述将包含第23～48号氨基酸残基的区域及包含第93～109号氨基酸残基的区域组合而成的立体区域作为表位的情形，但所述立体表位也包括以包含第20～109号氨基酸残基的区域所含的包含不连续的氨基酸残基的区域作为表位的情形。
所述的表位中，优选第48号氨基酸残基和抗体(I)的表位密切相关，或者包含于抗体(I)的表位。
关于具体的线状表位及立体表位，本领域技术人员例如可通过参照日本专利特许2011-527572号公报、日本专利特许2009-534401号公报、"Dissecting antibodies withregards to linear and conformational epitopes."Forsstrom B,Axnas BB,RockbergJ,Danielsson H,Bohlin A,Uhlen M.PLoS One.2015 Mar 27；10(3):e0121673.doi:10.1371/journal.pone.0121673.eCollection 2015.等而理解。
换言之，抗体(I)是和人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域特异性地结合的抗体，其中优选和包含第23～109号的区域特异性地结合，更优选和包含第23～48号及/或第93～109号的区域特异性地结合。
另外，有时将抗体(I)的和所述表位即整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域结合的性质称为对于表位的亲和性。因此，术语“对于表位的亲和性上升”和“对于表位的特异性的结合能力上升”含义相同。
术语“特异性地”可区别于“选择性地”。
作为抗体(I)的其他形态，优选将抗体(I)的对所述表位的亲和性设为在人类整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下上升。
“包含第379～721号氨基酸残基的区域的至少一部分”是表示：可为包含第379～721号氨基酸残基的区域，也可为其一部分的区域。关于具体的“其一部分的区域”，例如可列举：人类整合素β7的包含第417～721号氨基酸残基的区域的至少一部分、人类整合素β7的包含第564～721号氨基酸残基的区域的至少一部分、人类整合素β7的包含第379～563号氨基酸残基的区域的至少一部分、人类整合素β7的包含第417～563号氨基酸残基的区域的至少一部分或者人类整合素β7的包含第379～416号氨基酸残基的区域的至少一部分。即，在这些区域的存在下，可使抗体(I)的对所述表位的亲和性上升。
所谓术语“存在下”，可设为人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域和人类整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域的至少一部分存在于同一分子内，也可设为两个区域分别存在于单个分子内。优选两个区域存在于同一分子内。此外，术语“存在下”，也可改称为“通过”。
关于所述抗体(I)的对于表位的亲和性上升，本领域技术人员通过下述实施例等所述的惯用免疫学测定法而容易地确认。
例如，准备已表达人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质(#4960)的细胞，且准备人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质(#4961)，所述人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质(#4960)是实施例8所示的各种人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质，其包含源自人类的整合素β7的包含第1～109号氨基酸残基的区域，且包含源自人类的整合素β7的包含第722～798号氨基酸残基的区域，所述人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质(#4961)是将#4960的源自人类的整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域置换为源自小鼠的整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域而获得。在此，针对抗体(I)的结合的程度，将表达后者(#4961)的细胞和表达前者(#4960)的细胞加以比较，由此可确认抗体(I)的对所述表位的亲和性上升。
作为抗体(I)的其他形态，优选将抗体(I)的对所述表位的亲和性设为通过使人类整合素β7活化而上升。经活化的人类整合素β7在包含所述表位的区域具有结构上的特征，因此认为抗体(I)的对所述表位的亲和性上升。
将人类整合素β7活化的方法已众所周知。例如可通过使PMA(phorbol myristateacetate，佛波醇十四酸酯乙酸酯)等佛波酯、锰盐等作用于表达人类整合素β7的细胞、例如浆细胞、NK细胞、T细胞、B细胞、淋巴母细胞、源自伯基特淋巴瘤的细胞、树状细胞等血球细胞或免疫细胞中的任一种细胞，而将该细胞中表达的人类整合素β7加以活化。另外，不限于所述的具体细胞，也可使用已表达人类整合素β7的细胞，并利用佛波酯、锰盐等进行处理而将人类整合素β7加以活化。
关于抗体(I)的对所述表位的亲和性通过使人类整合素β7活化而上升的情况，本领域技术人员可通过下述实施例等所述的惯用免疫学测定法而容易地确认。
例如准备已表达#4960或#4961的细胞，所述#4960或#4961是实施例8所示的各种人类/小鼠的嵌合整合素β7蛋白质，其含有包含第1～109号氨基酸残基的区域，将所述已表达#4960或#4961的细胞供至如实施例7所示的整合素β7的活化方法后，使用免疫学测定方法进行测定，由此可比较活化处理的前后，而确认对于活化后的细胞的抗体(I)的对所述表位的亲和性上升。
作为抗体(I)的其他形态，可设为如下抗人类整合素β7抗体，其特征在于：和对于在正常细胞中表达的人类整合素β7相比，对于在源自骨髓瘤的细胞中表达的人类整合素β7的亲和性更高。
所谓正常细胞，如果为源自健康人的细胞，则没有特别限定，例如可设为源自血液的正常细胞，这种正常细胞中优选设为正常浆细胞。
关于确认这种和在正常细胞中表达的人类整合素β7相比，对于在骨髓瘤细胞中表达的人类整合素β7的亲和性更高的情况的方法，本领域技术人员可通过下述实施例等所述的惯用免疫学测定法而容易地实施。
所谓“惯用的免疫学测定法”，只要是无关乎抗原而使用各种抗体进行测定的方法，则没有特别限定。例如可列举：流式细胞仪法(FACS)、其所附带的细胞分选、蛋白质免疫印迹法、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附法)、免疫沉淀法、SPR(Surface Plasmon Resonance，表面等离子共振)法、QCM(Quartz Crystal Microbalance，石英晶体微天平)法等。
作为抗体(I)的其他形态，优选设为具有和下述实施例中所揭示的MMG49抗体相同的表位的抗体。最优选和MMG49抗体相同的抗体。MMG49抗体的制造方法可参照下述实施例。
作为抗体(I)的其他形态，优选设为包含重链可变区及/或轻链可变区的形态的抗体。即，抗体(I)可设为单独包含重链可变区，也可设为单独包含轻链可变区。优选包含重链可变区及轻链可变区的抗体。
可变区也称为抗原识别部位，本领域技术人员的理解是该可变区是抗体用以识别抗原的重要部位。本领域技术人员还知道这种可变区中有3个称为超变区(也称为互补决定区[CDR])的区域，这些CDR是和抗体的抗原识别功能最相关的非常重要的区域。
抗体(I)的其他形态所包含的重链可变区包含重链CDR1、重链CDR2或重链CDR3中的任意1种以上。即，该重链可变区中可单独地含有重链CDR1、重链CDR2或重链CDR3，优选至少含有重链CDR3。更优选从氨基末端(N末端)依序包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3的形态。
轻链可变区也可设为和重链可变区相同，例如包含轻链CDR1、轻链CDR2、或轻链CDR3中的任一种，优选至少包含轻链CDR3，优选从轻链可变区的N末端依序包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3。
有时将所述重链可变区及轻链可变区中的各自的CDR1～3以外的区域称为FR。更详细而言，将N末端和CDR1之间的区域称为FR1，将CDR1和CDR2之间的区域称为FR2，将CDR2和CDR3之间的区域称为FR3，将CDR3和羧基末端(C末端)之间的区域称为FR4，而对重链可变区及轻链可变区分别设定称呼。
所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列没有特别限定。例如可列举MMG49抗体的重链CDR1～3或轻链CDR1～3、即
具有序列编号1所示的氨基酸序列的重链CDR1、
具有序列编号2所示的氨基酸序列的重链CDR2、
具有序列编号3所示的氨基酸序列的重链CDR3、
具有序列编号6所示的氨基酸序列的轻链CDR1、
具有序列编号7所示的氨基酸序列的轻链CDR2、
具有序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR3等。
作为包含所述重链CDR1～3的重链可变区的优选形态，例如可列举：作为MMG49抗体的重链可变区的具有序列编号4所示的氨基酸序列的重链可变区。另外，作为包含所述轻链CDR1～3的轻链可变区的优选形态，例如可列举：作为MMG49抗体的轻链可变区的具有序列编号9所示的氨基酸序列的轻链可变区。
所述序列编号1～4及6～9所示的MMG49抗体的氨基酸序列如以下的表1所示。表中的序列编号4及9所示的各重链及可变区的氨基酸序列中所设置的下划线部是表示从N末端开始依序位于CDR1、CDR2、及CDR3的部分。
[表1]
Figure GDA0001574342000000221
抗体(I)的结构没有限定。作为具体的结构，可列举：Fv、scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)等，也可设为将这些适当组合而成的结构。另外，有时也将组合这些而成的结构包括在内而称为片段抗体。此外，这种片段抗体可设为包含Fv的人工设计的重组蛋白质，也可设为和蛋白质等生物分子融合而成的抗体。
Fv也称为抗体的最小结构单元，是重链可变区和轻链可变区通过非共价键合性的分子间相互作用而缔合而成的结构。此外，也可设为存在于重链可变区及轻链可变区内的半胱氨酸残基的硫醇基彼此进行双硫键合而成的结构。
scFv是重链可变区的C末端和轻链可变区的N末端由连接物连接而成的结构，也称为单链抗体。另外，由连接物连接的C末端和N末端也可相反。此外，scFv还可与Fv同样地通过非共价键合性的分子间相互作用等而缔合形成其结构。
所谓双链抗体、三链抗体、及四链抗体，分别为所述scFv形成二聚体、三聚体及四聚体，与Fv等同样地通过可变区彼此的非共价键合性的分子间相互作用等而以最稳定的状态缔合而成的结构。
关于这种具有各种结构的抗体(I)，本领域技术人员可采用使用惯用的基因工程方法构建表达载体并将这种表达载体应用于抗体产生的使用原核细胞(大肠杆菌、放线菌等)、真核细胞(酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类细胞等)等宿主细胞的表达系统、惯用的无细胞表达系统等而容易地制造。所制造的抗体也可通过适当地供于惯用的纯化步骤而以高纯度状态获得。
作为抗体(I)的其他形态，也可含有恒定区。所谓恒定区，本领域技术人员的理解是，如果为重链恒定区，则包含CH1、CH2及CH3，如果为轻链恒定区，则包含CL。另外，包含CH2及CH3的区域有时也称为Fc域。
具体的恒定区的来源没有特别限定。例如可列举：源自人类、源自小鼠、源自大鼠、源自兔、源自猴、源自黑猩猩等源自可承担大量生产的动物种类、和人类近缘的动物种类、即便对人类投予也难以产生免疫原性的动物种类等的恒定区。
抗体(I)之中，在重链可变区及/或轻链可变区具有源自小鼠的氨基酸序列的情况下，例如通过组合源自人类的恒定区，可将抗体(I)制成嵌合抗体。
另外，通过将上述的嵌合抗体中的重链FR1～4及/或轻链FR1～4置换为源自人类的氨基酸序列，可将抗体(I)制成人源化抗体。
此外，通过在不会减弱CDR所具有的功能的范围内，将所述人源化抗体中的重链CDR1～3及/或轻链CDR1～3置换为源自人类的氨基酸序列，可将抗体(I)制成人类抗体。此外，术语“人类抗体”有时也称为“完全人源化抗体”。
关于包含恒定区的形态的抗体(I)的结构，不仅有包含具有重链可变区及重链恒定区的重链以及具有轻链可变区及轻链恒定区的轻链各1对而成为四链的结构的免疫球蛋白，还可列举Fab、F(ab')2、微型抗体(minibody)、scFv-Fc等结构。此外，也可设为适当组合这些而成的结构。另外，有时也将组合这些而成的结构包括在内而称为片段抗体。此外，这种片段抗体也可设为包含Fv的人工设计的重组蛋白质，还可设为和蛋白质等生物分子融合而成的抗体。
Fab具有如下结构，该结构是含有包含重链可变区及重链恒定区中的CH1的重链的片段及包含轻链可变区及轻链恒定区的轻链，且重链可变区和轻链可变区通过所述非共价键合性的分子间相互作用而缔合、或者通过双硫键合进行键合而成。此外，还可设为CH1和CL以分别存在于这些中的半胱氨酸残基的硫醇基彼此进行双硫键合而成的结构。
F(ab')2具有如下结构，该结构是具有1对所述Fab，且CH1彼此以这些所包含的半胱氨酸残基的硫醇基彼此进行双硫键合而成。
微型抗体具有如下结构，该结构是具有包含所述scFv及CH3的1对抗体片段，且这种抗体片段彼此以CH3彼此通过非共价键合性的分子间相互作用进行缔合而成。
scFv-Fc具有如下结构，该结构是具有包含所述scFv、CH2及CH3的1对抗体片段，与所述微型抗体同样地以CH3彼此通过非共价键合性的分子间相互作用进行缔合，且以各CH3所包含的半胱氨酸残基的硫醇基彼此进行双硫键合而成。
对于这样包含具有各种结构的恒定区的抗体(I)，本领域技术人员也可与不包含恒定区的抗体(I)同样地通过采用使用惯用的基因工程方法构建表达载体并将这种表达载体应用于抗体产生的使用宿主细胞的表达系统而容易地制造。所制造的抗体也可通过适当地供于惯用的纯化步骤而以高纯度状态获得。
此外，如果为Fab，则例如也可通过对作为免疫球蛋白的IgG使用木瓜酶等蛋白酶，将其分解而获得。另外，如果为F(ab')2，则也可通过对IgG使用胃蛋白酶等蛋白酶，将其分解而获得。
在包含所述恒定区的抗体(I)中，优选结构为免疫球蛋白。这种免疫球蛋白的亚型没有特别限定，例如可列举：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。这些中，优选IgG，例如如果为源自小鼠的IgG，则4个亚类中优选IgG2。
在包含所述恒定区的抗体(I)中，进一步优选形态的抗体是包含具有序列编号5所示的氨基酸序列的重链及/或具有序列编号10所示的氨基酸序列的轻链的抗体。最优选的抗体是包含具有序列编号5所示的氨基酸序列的重链及具有序列编号10所示的氨基酸序列的轻链的抗体。
所述氨基酸序列可设为根据状况实施突变导入而成的氨基酸序列。这种突变优选不对重链CDR及轻链CDR实施。即，优选对重链FR、轻链FR实施而成的氨基酸序列，在抗体(I)包含恒定区的情况下，可设为除实施用以调整下述所示的ADCC活性或CDC活性的突变以外，还进一步实施突变而成的氨基酸序列。
实施具体的突变导入的氨基酸残基的数量没有特别限定。例如突变导入前的氨基酸序列和突变导入后的氨基酸序列的同源性为70％左右，优选75％左右，更优选80％左右，更优选85％左右，更优选90％左右，更优选95％左右，更优选96％左右，更优选97％左右，更优选98％左右，最优选99％左右。此外，这种数值是通过四舍五入而获得的数值。
术语“同源性”是指2个以上的能够进行比对的氨基酸序列的相互相同程度。因此，某2个氨基酸序列的同源性越高，不仅可以说这些序列的同源性越高，也可以说类似性越高。
氨基酸的同源性可使用市售的分析工具或者能够通过利用因特网的分析工具(例如FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等软件)进行计算。例如，BLAST检索一般使用的主要初期条件如下所述。即，在Advanced BLAST 2.1中，程序使用blastp，将期望值(Expectvalue)设为10，将过滤(Filter)全部设为关(OFF)，计分矩阵(Matrix)使用BLOSUM62，将空位存在罚分(Gap existence cost)、每个残基空位罚分(Per residue gap cost)、及λ比值(Lambda ratio)分别设为11、1、0.85(默认值)，且将其他各种参数也设定为默认值而进行检索，由此可算出氨基酸序列的同源性的值(％)。
所述向氨基酸序列的突变导入为置换、缺失、插入等。具体的突变导入只要是可通过采用惯用方法而达成的突变导入，则没有特别限定。例如，如果是置换，则采用保守性置换(conservative substitution)技术即可。
术语“保守性置换技术”是指某氨基酸残基被置换为具有和其类似的侧链的氨基酸残基的技术。
例如，以赖氨酸、精氨酸、组氨酸等具有碱性侧链的氨基酸残基彼此进行置换属于保守性置换技术。此外，天冬氨酸、谷氨酸等具有酸性侧链的氨基酸残基彼此；甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等具有抗静电极性侧链的氨基酸残基彼此；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸等具有非极性侧链的氨基酸残基彼此；苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等具有β-分枝侧链的氨基酸残基彼此；酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸等具有芳香族侧链的氨基酸残基彼此的置换同样也属于保守性置换技术。
作为抗体(I)的其他形态，可将抗体(I)设为具有细胞毒性的抗体。所谓细胞毒性是指抗体和细胞结合，结果对所结合的细胞带来某种毒性的活性。
作为这种细胞毒性，例如可列举ADCC活性、CDC活性等。术语“ADCC活性”是抗体依赖性细胞毒性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)的简称，且是在抗体附近寻找表达对于抗体的恒定区具有特异性的受体的NK细胞等具有细胞毒性的细胞，通过所述细胞等的作用而诱发对抗体所结合的细胞产生毒性的活性。
术语“CDC活性”是补体依赖性细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity)的简称，且是指在抗体的附近寻找补体，通过所述补体的作用而诱发对抗体所结合的细胞产生毒性的作用的活性。
此处，不管是ADCC活性，还是CDC活性，都可通过适当参照Lazar GA et al.,ProcNatl Acad Sci USA,103:4005-10(2006)、Shields RL et al.,J Biol Chem,276:6591-604(2001))、Moore GL et al.,J Immunol,159:3613-21(1997),An Z et al.,MAbs,1:572-9(2009)等文献对恒定区实施突变而调节细胞毒性。
例如，如果恒定区为人类IgG1，则可通过实施S239D、I332E、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S298A、K334A、S298A/K334A、S298A/E333A/K334A等突变而使ADCC活性上升。
另外，同样地，在恒定区为人类IgG1的情况下，可通过实施V234A/G237A、H268Q/V309L/A330S/P331S等突变而使ADCC活性下降。
关于CDC活性，在恒定区为人类IgG1的情况下，如果实施S267E、H268F、S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、H268F/S324T、S267E/H268F/S324T等突变，则可使该活性上升。
ADCC活性可依据Brunner K.T.等人的方法(Brunner,K.T.,et al.,Immunology,1968.14:181-96)进行测定。例如在添加了10％FCS(Fetal Calf Serum，胎牛血清)的RPMI1640培养基中培养骨髓瘤细胞，将细胞数制备为0.5×104～1.0×104个。向其中加入适量的Na2 51CrO4，在37℃下反应1小时，利用51Cr将细胞标记化并洗净，将所获得的细胞设为靶细胞。作为效应细胞，使用在添加了10％FBS(Fetal Bovine serum，胎牛血清)、10ng/ml的小鼠GM-CSF(Mouse Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、及40IU/ml的人类IL2的RPMI1640中培养SCID(Severe combinedimmune deficency，严重联合免疫缺损)小鼠的骨髄细胞6天后所获得的细胞等。将受检抗体或成为对照的其同型抗体以成为最终浓度0.05～10μg/mL的方式添加到96孔培养板中，进而添加靶细胞(1.0×104个)及效应细胞(5×105个)。在37℃下反应4小时，进行离心分离后，利用γ-计数器对被释放到上清液中的51Cr进行测定。ADCC活性可基于以下的式求出。
ADCC活性＝{([从靶细胞释放的51Cr]－[在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr])/([由添加1％Triton X-100引起的最大51Cr释放量]－[在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr])}×100
关于CDC活性，也可依据Brunner K.T.等人的方法(Brunner,K.T.,et al.,Immunology,1968.14:181-96)进行测定。例如，在添加10％FCS的RPMI1640培养基中培养成为靶细胞的骨髓瘤细胞，将细胞数制备为0.5×104～1.0×104个。向其中加入适量的Na2 51CrO4，在37℃下反应1小时，利用51Cr将细胞标记化并洗净，将所获得的细胞设为靶细胞。将悬浮在添加有胎牛血清的RPMI1640培养基中的受检抗体或成为对照组的同型抗体以成为最终浓度0.5～50μg/mL的方式加入到96孔培养板中，继而加入所述靶细胞和补体，使之反应1.5小时。将反应液进行离心分离，利用γ-计数器对释放到上清液中的51Cr进行测定。CDC活性可基于以下的式求出。
CDC活性＝{([从靶细胞释放的51Cr]－[在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr])/([由添加1％Triton X-100引起的最大51Cr释放量]－[在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr])}×100
具有细胞毒性的抗体例如可通过使用所述方法评价有无细胞毒性，选出具有该活性的抗体而获得。
作为抗体(I)的其他形态，也可设为多特异性抗体。即，可设为对于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域以外的抗原(以下将其称为其他抗原)具有特异性且具有结合能力的抗体。
其他抗原优选结构上和人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域不类似的抗原。
具体的其他抗原没有特别限定。例如可列举：CD3、CD16、C1q、腺病毒knob结构域(Adenovirus knob domain)等，可从其中适当组合而适当采用至少1个作为其他抗原。优选选择以上所例示的抗原中的1个作为其他抗原。即，优选多特异性抗体为二重特异性抗体。
关于这种多特异性抗体，本领域技术人员可通过适当采用惯用技术而容易地制造。例如准备如下杂交瘤，该杂交瘤是使用B细胞等抗体产生细胞而制作，该B细胞是从对表达相当于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的肽片段、或者仅将人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域设为源自人类，将其以外设为源自小鼠等源自人类以外的嵌合型整合素β7的细胞进行过免疫赋予的动物获得，使用从利用所述其他抗原进行免疫赋予的动物获得的B细胞等抗体产生细胞另外制作杂交瘤，使这些杂交瘤彼此进行细胞融合而获得新的杂交瘤(在制作二重特异性抗体的情况下，其也称为四源杂交瘤(quadroma))，通过惯用方法从所获得的新的杂交瘤进行筛选，由此可获得多特异性抗体。
此外，例如如果为二重特异性抗体，则也可通过如下(1)至(4)所示的顺序而制作二重特异性抗体：
(1)制作以人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域为表位的所述F(ab')2结构的抗体；
(2)另一方面，也以相同方式制作和其他抗原特异性地结合的F(ab')2结构的抗体；
(3)使用DTT等还原剂对在(1)及(2)中所获得的各F(ab')2结构的抗体进行处理后，进而利用埃尔曼试剂对任一个处理物进行处理；
(4)将(3)中所获得的这些处理后的F(ab')2结构的抗体加以混合而使之反应。
也可通过如下(A)至(D)所示的顺序而产生二重特异性抗体：
(A)制作以人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域为表位的抗体。
(B)另一方面，也以相同方式制作和其他抗原特异性地结合的抗体。
(C)对(A)及(B)中所获得的各可变区的氨基酸序列及编码其的多核苷酸的碱基序列加以鉴定。
(D)制作将具有(C)中所鉴定的各碱基序列的多核苷酸和根据需要的恒定部位的碱基序列、具有连接序列的多核苷酸一并组入的表达载体后，将其导入到CHO细胞等适于抗体产生的宿主细胞中。
作为抗体(I)的其他形态，可设为和细胞毒素(具有细胞毒性的物质)结合而成的抗体。所谓细胞毒素，只要为使细胞死亡、抑制细胞增殖等给细胞带来某种毒性的物质，则没有特别限定。
作为这种细胞毒素，例如可列举：环磷酰胺水合物、异环磷酰胺、塞替派、白消安、美法仑、盐酸尼莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪(Dacarbazine)、替莫唑胺等烷基化剂；氨甲蝶呤、培美曲塞钠水合物、氟尿嘧啶、去氧氟尿苷、卡培他滨、替加氟、阿糖胞苷、盐酸吉西他滨、磷酸氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、左亚叶酸钙等代谢拮抗剂；盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸依达比星、盐酸阿克拉霉素、盐酸氨柔比星、盐酸米托蒽醌、丝裂霉素C、放射菌素D、盐酸博来霉素(Bleomycin Hydrochloride)、盐酸培洛霉素、净司他丁斯酯、卡奇霉素(Calicheamicin)等抗生素、硫酸长春新碱、硫酸长春花碱、硫酸长春地辛、紫杉醇等微管抑制剂；阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、盐酸法倔唑水合物等芳香酶抑制剂；顺铂、卡铂、奈达帕汀、奥沙利铂等铂制剂；盐酸伊立替康水合物、盐酸拓扑替康、依托泊苷、索布佐生等拓扑异构酶抑制剂、泼尼松龙、地塞米松等肾上腺皮质类固醇、沙利度胺及作为其衍生物的来那度胺、作为蛋白酶抑制剂的硼替佐米、90-Ittrium等放射性同位元素。
这些中，优选卡奇霉素、美法仑、硫酸长春新碱、盐酸多柔比星、泼尼松龙、地塞米松、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米，更优选有良好的和抗体结合的实际成果的卡奇霉素。
这些细胞毒素均可在商业上取得，可从所述中适当选择1种或组合2种以上而选择。
细胞毒素和上述抗体的结合方式没有特别限定，如果适当采用例如惯用的基因工程技术或蛋白质工程技术，则本领域技术人员可容易地使细胞毒素和上述抗体结合。更具体而言，可列举：经由连接物而与所述抗体(I)的氨基酸残基侧链的氨基、硫醇基、胍基、羟基、羧基等官能基结合的方法等。
抗体(I)可为多克隆抗体，也可为单克隆抗体。优选单克隆抗体。
术语“单克隆”是指从实质上均匀的群体获得，“单克隆抗体”是指从这种群体获得的抗体。即，对于这种群体所包含的各抗体，如果将可能微量地存在的天然产生的突变排除，则理解为相同。
此外，关于抗体的特异性的结合对象(表位)，例如如果为抗体(I)，则抗体的特异性的结合对象存在于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域，如果为多克隆抗体，则抗体的特异性的结合对象为人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域中的多个部位，相对于此，如果为单克隆抗体，则以单一的部位发挥高特异性，因此更有利。
此外，关于作为修饰语使用的“单克隆”，如以上所述那样理解为从实质上均匀的群体获得，而不应理解为对其制造方法加以限定的修饰语。
抗体(I)除了可通过所述方法制造以外，本领域技术人员采用杂交瘤法、下述所示的使用携带多核苷酸(II)的宿主细胞(III)的重组DNA法、从噬菌体库的单独分离等便可容易地制造。
例如可列举如下方法：将相当于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的肽对小鼠、大鼠、兔等适于抗体产生的动物进行免疫赋予，继而回收B细胞后供于杂交瘤法，以所述的抗体(I)所发挥的功能为指标进行筛选，由此制造抗体(I)。
此外，可列举如下方法：制作表达仅将整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域设为源自人类，将其以外设为源自小鼠等源自人类以外的嵌合型整合素β7的细胞，利用其对小鼠、大鼠、兔等适于抗体产生的动物(优选小鼠)进行免疫赋予，继而回收B细胞后供于杂交瘤法，以所述的抗体(I)所发挥的功能为指标进行筛选，由此制造抗体(I)。
作为抗体(I)所发挥的功能，例如可列举：对于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的亲和性在人类整合素β7的包含第380～721号氨基酸残基的区域的至少一部分的存在下上升；通过将人类整合素β7活化而上升等。因此，也可通过利用这种功能的下述筛选方法(X)所示的方法而获得抗体(I)。
抗体(I)在人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域具有表位，因此期待对于表达该整合素β7的细胞不仅发挥所述的ADCC活性及CDC活性，也通过将诱导细胞凋亡活性、存活信号阻断活性等中的1个或2个以上组合，而对这种细胞发挥细胞毒性等。因此，包含抗体(I)的组合物如以下详细说明般作为医药组合物(VII)有用。
尤其是抗体(I)是以人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域为表位的抗体，但抗体(I)的对于表位的亲和性是通过将整合素β7活化而上升。活性型整合素β7是以浆细胞等血球细胞表达，因此抗体(I)可用作针对这些癌(例如血液癌)的医药组合物的有效成分。尤其是可有效地用作针对使所述细胞产生突变的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)的医药组合物。
(II)多核苷酸
多核苷酸(II)是具有编码所述抗体(I)的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。术语“多核苷酸”例如包括：通过适当的公知方法修饰核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或这些中的任一种核苷酸等而成的单链或双链的形态。
关于多核苷酸(II)的碱基序列，本领域技术人员例如可通过计算机模拟，基于所述抗体(I)的氨基酸序列而适当确定。为了确定这种碱基序列而使用的密码子的种类没有限制。优选考虑使用多核苷酸的宿主的密码子频率而确定碱基序列。
具体的多核苷酸(II)的碱基序列没有特别限定。将作为所述抗体(I)的形态之一特定的表示氨基酸序列的各序列编号和表示编码这种氨基酸序列的碱基序列的序列编号对应示于下述表2。即，多核苷酸(II)所具有的优选碱基序列是序列编号11～20所示的碱基序列。
[表2]
氨基酸序列 碱基序列
序列编号1 序列编号11
序列编号2 序列编号12
序列编号3 序列编号13
序列编号4 序列编号14
序列编号5 序列编号15
序列编号6 序列编号16
序列编号7 序列编号17
序列编号8 序列编号18
序列编号9 序列编号19
序列编号10 序列编号20
多核苷酸(II)也可设为组入到载体内的形态。载体没有特别限定，例如也可设为克隆用载体或表达用载体，其用途没有限制。
另外，如果为表达用载体，则可设为大肠杆菌、放线菌等原核细胞用的载体，也可设为酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类细胞等真核细胞用的载体。
此外，也可在多核苷酸(II)的5'末端侧(在所述抗体(I)中指N末端侧)适当附加编码信号肽的碱基序列。
多核苷酸(II)的具体使用方法没有特别限定。例如可列举导入到下述宿主细胞(III)中而用以表达所述抗体(I)。
(III)宿主细胞
宿主细胞(III)是携带所述多核苷酸(II)的细胞。术语“携带”是指维持所述多核苷酸(II)存在于细胞内的状态，且是指该细胞不会自发地将所述多核苷酸积极地或消极地释放到细胞外的状态。
宿主细胞(III)携带所述多核苷酸(II)的形态没有特别限定。例如可在细胞内以载体的形态携带多核苷酸，也可在细胞内的基因组中以整合的形态携带所述多核苷酸(II)。
关于宿主细胞(III)的具体的细胞种类，可为酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类细胞等真核细胞，也可为大肠杆菌、放线菌等原核细胞，没有特别限定。
(IV)嵌合抗原受体
嵌合抗原受体是人工的类T细胞受体(TCR)的蛋白质，且是以将在T细胞的细胞膜上表达(相当于细胞外区)的抗原识别部位置换为所需的抗原识别部位，且可更有效地发挥T细胞其本身所具有的细胞毒性等功能的方式构建而成的蛋白质。
嵌合抗原受体(IV)具有和所述抗体(I)相同的表位，更具体而言，是包含所述抗体(I)的抗原识别部位的蛋白质。即，存在于嵌合抗原受体所包含的抗原识别部位的表位可设为和所述抗体(I)中所详细说明的表位相同。
更详细而言，是从嵌合抗原受体(IV)的N末端依序配置所述抗体(I)的抗原识别部位、间隔序列、跨膜结构域、共刺激因子及TCR的细胞质结构域而成的蛋白质。
配置于嵌合抗原受体(IV)的所述抗体(I)的抗原识别部位可设为和抗体(I)中所详细说明的抗原识别部位相同，具体而言，可列举重链可变区及/或轻链可变区。其中，优选具有重链可变区及轻链可变区并且为scFv的结构。
在这种scFv中，例如在重链可变区和轻链可变区之间可适当设置包含10个～25个左右氨基酸残基的间隔序列。更优选15～18个左右。这种间隔序列可设为和配置于嵌合抗原受体(IV)的所述间隔序列相同，也可设为和配置于嵌合抗原受体(IV)的所述间隔序列不同。
配置于嵌合抗原受体(IV)的间隔序列没有特别限定。例如可设为包含10个～25个左右氨基酸残基的间隔序列。更优选15～18个左右。
配置于嵌合抗原受体(IV)的跨膜结构域没有特别限定。具体而言，可容许对T细胞等中所表达的CD28、4-1BB等源自蛋白质的细胞跨膜结构域适当实施突变导入并且采用。
配置于嵌合抗原受体(IV)的共刺激因子为T细胞等所具有的共刺激因子即可，没有特别限定。例如可容许对4-1BB、OX40、CD28等适当实施突变导入并且采用。
配置于嵌合抗原受体(IV)的TCR的细胞质结构域没有特别限定。例如可容许对源自也称为TCRζ链的CD3等的细胞质结构域适当实施突变导入并且采用。此外，关于对于CD3的突变导入，优选以包含ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，免疫受体酪氨酸活化基序)的方式实施而成。
嵌合抗原受体(IV)优选设为具有序列编号21所示的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
特定所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列可设为适当实施突变导入而成的氨基酸序列。另外，向所述跨膜结构域、共刺激因子、及TCR的细胞质结构域的突变导入也可设为相同。具体的突变导入数没有特别限定。
例如，突变导入前的氨基酸序列和突变导入后的氨基酸序列的同源性为70％左右，优选75％左右，更优选80％左右，更优选85％左右，更优选90％左右，更优选95％左右，更优选96％左右，更优选97％左右，更优选98％左右，最优选99％左右。此外，这种数值是通过四舍五入而获得。
向所述氨基酸序列的突变导入为置换、缺失、插入等。具体的突变导入为可采用惯用方法而达成的突变导入即可，没有特别限定。例如，如果为置换，则采用保守性置换技术即可。
此外，在制造这种嵌合抗原受体时，本领域技术人员参照非专利文献4～6等所记载的方法便可容易地制造。
(V)多核苷酸
多核苷酸(V)和所述多核苷酸(II)不同，是编码所述嵌合抗原受体(IV)的氨基酸序列的多核苷酸。
多核苷酸(V)的碱基序列可与所述多核苷酸(II)同样地，例如通过计算机模拟，基于所述嵌合抗原受体(IV)的氨基酸序列而适当确定。为了确定碱基序列而使用的密码子的种类没有限制。优选考虑成为使用多核苷酸的对象的细胞的密码子频率，而确定碱基序列。
具体的碱基序列没有特别限定。例如可列举：具有序列编号22所示的碱基序列的多核苷酸，该序列编号22所示的碱基序列是基于具有序列编号21所示的氨基酸序列的嵌合抗原受体(IV)的氨基酸序列所确定。当然，关于基于这种氨基酸序列所确定的碱基序列，如果考虑不限于所使用的密码子种类，则当然不限定于所述序列编号22所示的碱基序列。
此外，在多核苷酸(V)的5'末端侧(在所述嵌合抗原受体(IV)为N末端侧)可适当附加编码信号肽的碱基序列。
多核苷酸(V)的具体使用方法没有特别限定。例如可列举：导入到下述细胞(VI)中而用以表达所述嵌合抗原受体(IV)。
(VI)细胞
细胞(VI)和所述宿主细胞(III)不同，是携带所述多核苷酸(V)的细胞。术语“携带”可设为和所述宿主细胞(III)相同。具体的细胞的种类也可设为和所述宿主细胞(III)相同，但优选具有细胞毒性。例如可列举T细胞、NK细胞、K细胞等，其中最优选作为T细胞的一种的杀手T细胞(也称为细胞毒性T细胞[CTL])。
优选通过表达编码所述细胞(VI)所包含的嵌合抗原受体的多核苷酸(V)，而使构成嵌合抗原受体(IV)的所述抗体(I)的抗原识别部位显露在细胞外侧，从而使构成嵌合抗原受体(IV)的跨膜结构域、所述共刺激因子或TCR的细胞质结构域局部存在于细胞膜或细胞内。
关于这些共刺激因子或者局部存在于细胞膜或细胞内的区域，如果所述抗体(I)的抗原识别部位和人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域结合，则会激活在细胞内引起细胞毒性的信号。另外，抗体(I)对于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的亲和性是通过将人类整合素β7活化而上升。因此，抗体(I)以表达活性型整合素β7的细胞或组织为对象进行攻击或发挥细胞毒性。
在发挥这种功能的细胞为T细胞的情况下，将其称为嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。此外，关于NK细胞等有可能发挥细胞毒性的细胞，也和所述嵌合抗原受体T细胞同样地通过使抗原识别部位对于活性型人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的结合和引起细胞膜或细胞质结构域的细胞毒性的信号的激活发生连动，而可发挥和嵌合抗原受体T细胞同样的效果(将其称为嵌合抗原受体NK细胞)。
如上所述，细胞(VI)对于表达活性型整合素β7的细胞或组织发挥出细胞毒性等，因此可认为和所述抗体(I)同样地，包含细胞(VI)的组合物作为如以下详细说明的医药组合物(IV)有用。活性型整合素β7在浆细胞等血球细胞中进行表达，因此可用作针对癌(例如，血液癌)的医药组合物的有效成分。尤其可有效地用作针对使所述细胞产生突变的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)的医药组合物。
(VII)医药组合物
医药组合物(VII)包含所述抗体(I)或所述细胞(VI)。作为所述细胞(VI)，优选嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
医药组合物(VII)中的所述抗体(I)或所述细胞(VI)的含量没有特别限定。例如，如果为抗体(I)，则可相对于医药组合物100重量份设为0.001重量份～10重量份左右。另外，如果为细胞(VI)，则可设为1个细胞/mL～104个细胞/mL左右。
医药组合物(VII)的投予方法没有特别限定。由于有效成分为抗体或细胞，所以优选设为非经口投予或非经肠投予。例如可列举：静脉内投予、肌内投予、皮下投予等，优选静脉内投予。
关于医药组合物(VII)的剂型，可根据所述投予方法而和药学上所容许的惯用载体一并制备。如果考虑所述优选的投予方法，则优选设为注射剂。
医药组合物(VII)的对象疾病没有特别限定。作为具体的对象疾病，例如可列举癌，优选血液癌，进一步优选产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病。术语“产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病”是如下疾病，其特征在于异常的浆细胞的肿瘤性增殖及由这些所分泌的异常蛋白质的增加。作为这种疾病，例如可列举：骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、浆细胞瘤、重链病、全身性AL型淀粉样变性等。此外，在其他实施方式中，医药组合物(VII)的对象疾病也可为恶性淋巴瘤、白血病等其他血液恶性疾病。
医药组合物(VII)的投予对象(受试者)可设为罹患所述疾病的患者或者有罹患所述疾病的可能性的动物。“有罹患的可能性”可通过下述诊断方法(XI)而确定。动物可设为例如哺乳类动物，优选人类。
关于医药组合物(VII)的投予量，根据投予对象的疾病的程度、期望通过投予带来的效果的程度、体重、性别、年龄、动物种类等各条件而有所不同，无法一概而论。例如在有效成分为抗体(I)的情况下，通常设为每天1μg/kg(体重)～10g/kg(体重)左右。另外，如果有效成分为细胞(VI)，则通常可设为104个细胞/kg(体重)～109个细胞/kg(体重)左右。
关于医药组合物(VII)的投予方案，也和医药组合物(VII)的投予量同样地，根据投予对象的疾病的程度等各条件而有所不同，无法一概而论。例如优选以所述每1天的投予量为1天～1月1次的方式进行投予。
(VIII)疾病的治疗或预防方法
疾病的治疗或预防方法(VIII)是包括将所述抗体(I)或所述细胞(VI)的治疗有效量向受试者进行投予的步骤的疾病的治疗或预防方法。作为细胞(VI)，优选嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
受试者可设为和所述医药组合物(VII)相同。在受试者为罹患疾病的患者的情况下，通过投予所述抗体(I)或所述细胞(VI)的治疗有效量，而期待其治疗效果，在受试者为有罹患疾病的可能性的动物的情况下，期待其预防效果。所谓预防是指如下述的诊断方法(XI)所示通过惯用的免疫学方法所测得的数值未达到判断为罹患疾病的数值的情形。
疾病可设为和所述医药组合物(VII)相同，例如可例示癌，作为优选癌，可列举产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病(例如多发性骨髓瘤等)。
治疗有效量可设为和所述医药组合物(VII)的投予量相同，所述抗体(I)或所述细胞(VI)制剂的制备可设为和所述医药组合物(VII)的剂型相同。另外，所述抗体(I)或所述细胞(VI)的投予方法、投予方案等也可如所述医药组合物(VII)中所详细说明般设置。
疾病的治疗或预防方法(VIII)可包含以活性型人类整合素β7为靶的多发性骨髓瘤的治疗或预防方法。此外，所谓靶，可列举所述的抗体(I)或所述的细胞(VI)的应用。
(IX)用途
用途(IX)是用以制造医药组合物的所述抗体(I)或所述细胞(IV)的用途。
医药组合物可设为和所述医药组合物(VII)相同。此外，细胞(IV)优选嵌合抗原受体T细胞(VI-4)。
另外，医药组合物的对象疾病也相同，例如可列举：癌的治疗用、优选血液癌、进一步优选产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)。
此外，医药组合物中的作为有效成分的所述抗体(I)或细胞(VI)的含量、这些的剂型、投予方法、投予方案等也可设为和所述医药组合物(VII)中所详细说明的相同。
(X)筛选方法
筛选方法(X)是产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病的治疗用或预防用的医药组合物的有效成分的筛选方法，该方法包括如下步骤：从化合物库筛选和人类整合素β7特异性地结合且和人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域结合的候选物质。
医药组合物可设为和所述医药组合物(VII)相同，所谓癌、优选血液癌、进一步优选产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)的治疗用或预防用的医药组合物的有效成分，例如可列举所述抗体(I)。
化合物库没有特别限定，可使用现有的库。优选抗体库，优选将如下杂交瘤设为库，该杂交瘤是使用从利用所需抗原赋予免疫的动物获得的B细胞等抗体产生细胞而制作。
此处，所需的抗原没有特别限定，例如优选人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域。进一步优选活性型人类整合素β7。
筛选候选物质的方法没有特别限定。例如可采用如下方法：筛选和人类整合素β7特异性地结合的候选物质，且使用惯用的免疫学测定方法确认和相当于人类整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的肽片段结合，从而筛选候选物质。
另外，也可采用如下方法：筛选和人类整合素β7特异性地结合的候选物质，进而使用惯用的免疫学测定方法确认和所述抗体(I)中所详细说明的表达仅将整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域设为源自人类且将其以外设为源自小鼠等源自人类以外的嵌合型整合素β7的细胞结合的候选物质，从而筛选候选物质。
另外，也可采用如下方法：筛选和人类整合素β7特异性地结合的候选物质，进而利用佛波酯、锰盐等对于所述抗体(I)中所详细说明的表达仅将整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域设为源自人类且将其以外设为源自小鼠等源自人类以外的嵌合型整合素β7的细胞进行处理，确认在处理前后结合的程度上升的候选物质，从而筛选候选物质。
另外，也可采用如下方法：筛选和人类整合素β7特异性地结合的候选物质，进而制作所述抗体(I)中所详细说明的表达将人类整合素β7的包含第111～378号氨基酸残基的区域置换为源自小鼠而成的嵌合体的细胞及将人类整合素β7的包含第110～721号氨基酸残基的区域置换为源自小鼠而成的嵌合体，确认对于前者的结合的程度高的候选物质，从而筛选候选物质。
此外，筛选方法(X)也可包括如下步骤：以具有细胞毒性为指标而筛选候选物质。具体的成为确认细胞毒性的对象的细胞没有特别限定。例如可列举：表达在所述人类整合素β7的PSI结构域具有特征的活性型源自人类的整合素β7的血球细胞等。
此处，在所筛选的候选物质为抗体的情况下，也可将以具有细胞毒性为指标而筛选候选物质的步骤作为筛选具有ADCC活性或CDC活性的抗体的步骤。
如上所述通过筛选方法(X)所筛选的候选物质优选抗体，进一步优选单克隆抗体。最优选所述抗体(I)。
(XI)诊断方法
诊断方法(XI)是癌的诊断方法，包括使从受试者采集的样品和所述抗体(I)接触的步骤。
受试者可设为和疾病的治疗或预防方法(VIII)中所详细说明的受试者相同。
从受试者采集的样品可设为血液或骨髄液。
具体的诊断方法没有特别限定，例如可列举：在检测到和所述抗体(I)结合的细胞的情况下判断为罹患癌、或者有罹患癌的可能性。
关于结合的程度，本领域技术人员可通过采用惯用的免疫学测定法而容易地确定。可根据此处所测得的程度而确定是否罹患癌、或者有罹患癌的可能性中的任一种。
具体的癌的诊断没有特别限定，例如在为血液癌、更优选和所述抗体(I)结合的细胞为浆细胞的情况下，可判断为罹患产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)或有罹患的可能性。
(XII)试剂盒
试剂盒(XII)是包含所述抗体(I)的癌的诊断用试剂盒。
癌没有特别限定，可设为和在所述医药组合物(VII)中所详细说明的癌相同，优选血液癌，进一步优选产生浆细胞的肿瘤性增殖的疾病(例如骨髓瘤、多发性骨髓瘤等)。
此外，在试剂盒(XII)中可适当随附指南。在这种指南中可记载所述诊断方法(XI)中所详细说明的方法作为癌的诊断基准。
[实施方式]
以下，表示用以更详细地说明本发明的实施例。此外，本发明当然不限定于以下所示的实施例。
试验方法：流式细胞仪及分选
在以下的实施例中，为了分选细胞而使用的流式细胞仪(FACS)分析是根据下述要点而进行。
从已获得知情同意的骨髓瘤患者的髂骨采集骨髄单细胞，使该骨髄单细胞悬浮在ACK液(150mM的NH4Cl及10mM的KHCO3)中，通过在4℃下静置3分钟而去除红细胞。利用添加有2％的胎牛血清的PBS将去除后的骨髄单细胞洗净后，为了防止非特异性的抗体结合，而在包含10％的人类AB型血清的PBS中在4℃下阻断20分钟。
其后，将经荧光色素标记的各抗体(参照下述)添加到其中，在4℃下染色30分钟，继而利用PBS洗净后，使之悬浮在包含1μg/ml的碘化丙啶(PI)的PBS中，其后供于FACS分析。细胞的分析及细胞分选是使用FACS Aria细胞分选仪(Becton DickinsonImmunocytometry Systems公司制造)进行。
细胞的染色是适当选择以下的单克隆抗体而使用。
·APC(Antigen presenting cell，抗原提呈细胞)结合抗人CD34抗体(APC-conjugated anti-human CD34 antibody)(BD Pharmingen公司制造)·PE-Cy7结合抗人CD34抗体(PE-Cy7-conjugated anti-human CD34 antibody)(BD Pharmingen公司制造)·APC/Cy7结合抗人CD19抗体(APC/Cy7-conjugated anti-human CD19 antibody)(Biolegend公司制造)·FITC(Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)结合抗人CD38抗体(FITC-conjugated anti-human CD38 antibody)(eBioscoience公司制造)·APC结合抗人CD138抗体(APC-conjugated anti-human CD138 antibody)(Biolegend公司制造)·PE-Cy7结合抗人CD3抗体(PE/Cy7-conjugated anti-human CD3 antibody)(Biolegend公司制造)·FITC结合抗人CD14抗体(FITC-conjugated anti-human CD14antibody)(BD Pharmingen公司制造)·PE/Cy7结合抗人CD45抗体(PE/Cy7-conjugatedanti-human CD45 antibody)(Biolegend公司制造)。
[实施例1]
制作和骨髓瘤细胞株结合而没有和健康人末梢血结合的单克隆抗体库
在针对多发性骨髓瘤的抗体治疗中，重要的是使用虽然和骨髓瘤细胞结合，但没有和正常血液细胞结合的抗体。对此，通过以下的方式鉴定这种抗体。首先，使用以下方法制作1万个克隆以上的和各种骨髓瘤细胞株结合的单克隆抗体。
将6种人类骨髓瘤细胞株(MM.1s细胞、RPMI8226细胞、INA6细胞、U266细胞、OPM2细胞、及KMS12BM细胞)作为抗原，对于Balb/c小鼠的足垫(footpad)以1周2次的方式免疫2～3周。其后，取出膝下淋巴结而制作细胞悬浮液，使之与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株细胞融合而制作杂交瘤。细胞融合是利用使用聚乙二醇的方法(PEG法)而进行。其后，通过在次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷培养基(HAT培养基)中培养细胞而选择杂交瘤(＞1万个克隆)。
最后使用杂交瘤的培养上清液，使用FACS选择包含用于免疫的和骨髓瘤细胞株结合而没有和源自健康人末梢血的单细胞结合的抗体的上清液。其结果为，所获得的对骨髓瘤细胞具有特异性的抗体的候选为约200个克隆，使表达这些的杂交瘤增殖后，将其冷冻保存。
[实施例2]
鉴定在人类多发性骨髓瘤患者骨髄中和骨髓瘤细胞特异性地结合的抗体
使用在所述实施例1中所获得的约200克隆的候选抗体，对源自骨髓瘤患者的骨髄细胞进行染色，使用FACS进行分析。
在源自多发性骨髓瘤患者的骨髄细胞中加入各候选抗体，在4℃下培养30分钟后进行洗净，加入PE结合抗小鼠IgG抗体(PE-conjugated anti-mouse IgG antibody)作为二次抗体，进而在4℃下培养30分钟。洗净后，最后使用APC结合抗人类CD138抗体(APC-conjugated anti-human CD138antibody)、FITC结合抗人类CD38(FITC-conjugated anti-human CD38)、或PE/Cy7结合抗体CD45(PE/Cy7-conjugated anti-human CD45)进行染色。作为阴性对照，同时制备加入同型对照(Isotype control)代替候选抗体所获得的样品。
使用FACS对这些进行分析，由此选择虽然和CD45-CD38++CD138+骨髓瘤浆细胞及CD45-CD38++CD138-骨髓瘤祖细胞结合，但没有和CD45+血液细胞结合的抗体。
其结果为，鉴定出MMG49抗体为满足所述条件的抗体(图1及图2)。关于图中的各柱状图，Y轴表示细胞数，X轴表示MMG49抗体的结合强度。
[实施例3]
鉴定和MMG49抗体结合的抗原蛋白质
通过表达克隆法而鉴定和MMG49抗体结合的抗原蛋白质。
首先，使用cDNA合成用superscript choice system(Invitrogen公司)，由已知和MMG49抗体结合的MM.1s细胞制作cDNA库，使用BstXI接头(Invitrogen公司)插入到pMXs反转录病毒载体中(由东京大学医科学研究所的北村俊雄先生提供)。将通过所述方式制作的cDNA库导入到plat-E细胞(由北村俊雄先生分让)中，使所获得的反转录病毒感染BaF3细胞，而获得表达源自MM.1s的cDNA库的BaF3细胞。
其次，利用MMG49抗体对这些细胞进行染色，通过利用FACS分选阳性细胞而反复进行细胞浓缩(图3)。在第3次分选后，大部分细胞成为和MMG49抗体结合的细胞。于是，通过PCR而扩增这些细胞所具有的反转录病毒的插入物后，进行测序，由此鉴定碱基序列，结果明确了细胞所保有的插入物为ITGB7。
[实施例4]
通过制作ITGB7缺损骨髓瘤细胞而确认MMG49抗体的结合抗原为ITGB7表达蛋白质
使用Crisp-Cas9系统而制作ITGB7缺损U266骨髓瘤细胞株。
首先，通过将ITGB7特异性的靶序列的双链DNA序列插入到PX330(addgene公司)载体中，而制作载体。使用Nucleofector(注册商标)II(Lonza公司)将其和用以选择药剂的载体即线性潮霉素-抗病基因表达载体(Clontech公司)一并导入到U266细胞中。其后，在添加有潮霉素的培养基中对于所增加的克隆体，使用FIB27抗体(抗整合素β7抗体；Biolegend公司)对ITGB7的表达进行染色，利用FACS进行分析，由此鉴定ITGB7缺损细胞。
其次，使用MMG49抗体对所获得的ITGB7缺损细胞进行染色，利用FACS进行分析，结果MMG49抗体和野生型的U266细胞结合，相对于此，在ITGB7缺损株中，MMG49抗体的结合完全消失(图4)。该情况表示MMG49仅和ITGB7表达蛋白质(整合素β7)结合。
再次，使用MMG49抗体从MM1s骨髓瘤细胞的溶解液进行免疫沉淀后，进行SDS-PAGE，继而使用抗整合素β7抗体(Miltenyi公司)进行WB。结果在MMG49抗体的免疫沉淀物中检测到整合素β7(图5)。该情况表示MMG49抗体和整合素β7结合。
[实施例5]
测定健康人末梢血及骨髓瘤患者骨髄的各细胞组分中的MMG49抗体的结合方式
使用市售的抗整合素β7抗体(FIB27抗体；Biolegend公司)及MMG49抗体，测定对于健康人末梢血及骨髄细胞中的各种细胞组分的结合。
使用HES40，从源自健康人的末梢血细胞去除红细胞后，加入Fc受体阻断剂(Fcreceptor blocking reagent)(Miltenyi公司)而阻断非特异性的抗体的结合，其后加入MMG49抗体或FIB27抗体、或者作为同型对照的小鼠IgG2a，在4℃下培养30分钟后进行洗净，加入作为二次抗体的PE结合抗小鼠IgG抗体，进而在4℃下培养30分钟。
将这些洗净后，最后使用APC/Cy7结合抗人类CD19抗体、FITC结合抗人类CD14抗体、PE/Cy7结合抗人类CD3抗体进行染色。使用FACS对染色后的细胞进行分析，由此测定各组分中的MMG49抗体及FIB27抗体的结合(图6)。
另外，同样地使用MMG49抗体或FIB27抗体对将1μl的健康人的末梢血加入到100μl的PBS(含EDTA)中所得者进行染色，最后使用Pacific blue结合抗人类CD235抗体(BDPharmingen公司)或FITC结合抗人类CD41抗体(BD Pharmingen公司)进行染色，由此也同样地通过FACS分析对各抗体有没有和CD235+的红细胞及血小板结合进行研究(图6)。这些结果表示：FIB27抗体和多数淋巴系细胞强力地结合，相对于此，MMG49抗体对于所述的正常血球细胞的结合极弱。
此外，为了明确在骨髄中MMG49抗体对于骨髓瘤细胞以外的各正常细胞组分的结合是否存在，也同样地使用MMG49抗体对骨髓瘤患者的骨髄细胞进行染色，最后使用APC结合抗人类CD34抗体(BD Pharmingen公司制造)Alexa647结合人类CD3(BD Pharmingen公司制造)、Cy7APC结合抗CD19人类抗体(BD Pharmingen公司制造)、PE-Cy7结合抗CD38人类抗体(BD Pharmingen公司制造)、或者FITC结合抗CD14 human antibody(BD Pharmingen公司制造)进行染色。使用FACS对这些染色后的源自骨髓瘤患者的骨髄细胞进行分析，由此测定各组分中的MMG49抗体的结合(图7)。这些结果表示，MMG49抗体和骨髓瘤细胞牢固地结合，相对于此，几乎没有和包括造血干细胞、祖细胞组分在内的全部正常血球结合。
[实施例6]
MMG49对于各种细胞株的结合的分析
使用FACS对各种细胞株(MM1s细胞、U266细胞、RPMI8226细胞、及JJN3细胞)中的MMG49抗体及FIB27抗体的结合进行分析。染色的方法是和所述实施例5所示的末梢血等情况相同。
已知整合素β7和整合素α4或整合素αE形成异源二聚体并在细胞表面表达，因此使用Alexa647结合抗人类CD49d抗体(Biolegend公司)及APC结合抗人类CD103抗体(Biolegend公司)，同时也使用FACS对这些的表达加以分析。此外，CD103表示整合素αE，CD49d表示整合素α4。此外，和所述实施例5同样地，也对源自健康人的末梢血中的整合素αE及整合素α4的表达量进行研究(图8)。
其结果为，ITGA4在大部分的骨髓瘤细胞株中表达，而ITGAE在所有细胞株均不表达。FIB27抗体和所有骨髓瘤细胞株结合，但MMG49抗体的结合和FIB27抗体的表达水平不一致。此外，利用FACS，对MMG49抗体、FIB27抗体对于使用Crisp-Cas9系统所制作的ITGA4缺损U266细胞的结合进行研究，结果均因ITGA4缺损而对于U266细胞的结合消失。即，可知MMG49抗体、FIB27抗体均识别出表达为α4β7整合素的β7整合素。
[实施例7]
整合素的活化和MMG49抗体的结合的关联分析
从所述MMG49抗体的特异性的结合方式加以考虑，推测MMG49抗体会识别出发生活化而结构产生变化的整合素β7。
对此，利用5mM的EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)/HBS将强制表达α4β7的K562细胞及使用CD4T细胞富集试剂盒(BD pharmingen公司)进行浓缩所获得的人类正常末梢血CD4T细胞洗净后，在1mM Ca2+/1mM Mg2+/HBS(低活性用缓冲液)或2mM Mn2+/HBS(活性化缓冲液)中，和MMG49抗体或FIB27抗体一并在室温下培养30分钟后进行洗净，加入作为二次抗体的PE结合抗小鼠IgG抗体，进而在室温下培养30分钟。使用FACS对这些进行分析，由此测定整合素α4β7被活化的细胞中的MMG49抗体及FIB27抗体的结合。
其结果为，观察到在Mn2+的存在下MMG49抗体的结合增强(图10)。另一方面，关于FIB27抗体，没有发现同样的变化。该情况提示MMG49抗体有可能是对经活化的整合素β7具有特异性的抗体。
[实施例8]
识别MMG49抗体所需的表位的鉴定
为了鉴定MMG49抗体所识别的表位，而使用重叠PCR法制作如图11所示的8种人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质表达用载体。
通过脂转染法将各表达载体导入到293T细胞中，48小时后分析有没有结合MMG49抗体。使细胞悬浮在添加有1％的胎牛血清的PBS中，添加MMG49抗体后，在室温下静置30分钟。洗净后，加入Alexa488-抗小鼠IgG抗体，在室温下静置30分钟后，利用FACS进行分析。
其结果为，明确MMG49抗体几乎和全长均源自人类的嵌合整合素β7蛋白质(#4927)的情况同样地，牢固地和嵌合整合素β7蛋白质(#4960)结合，该嵌合整合素β7蛋白质是包含第110～721号氨基酸残基的区域源自小鼠且其余区域(包含第20～109号氨基酸残基的区域及第722～798号氨基酸残基的区域)源自人类的序列(图11～13)。
鉴于包含第722～798号氨基酸残基的区域包含跨膜结构域(TM)及细胞质结构域(cytoplasmic)，进而包含第1～19号氨基酸残基的区域为信号肽，而表示在包含PSI结构域的包含第20～109号氨基酸残基的区域存在MMG49抗体的结合所必须的表位。
另外明确，嵌合整合素β7蛋白质(#4961)和嵌合整合素β7蛋白质(#4960)相比，MMG49抗体的结合力有些许上升，而成为和全长均源自人类的嵌合整合素β7蛋白质(#4927)的情况完全相同的结合水平，该嵌合嵌合整合素β7蛋白质是将包含第110～378号氨基酸残基的区域设为源自小鼠，且将包含第20～109号氨基酸残基的区域及包含第379～798号氨基酸残基的区域设为源自人类。
进而明确，嵌合整合素β7蛋白质(#4944)、及嵌合整合素β7蛋白质(#4945)和嵌合整合素β7蛋白质(#4946)及嵌合整合素β7蛋白质(#4947)相比，MMG49抗体的结合能力有些许上升，该嵌合整合素β7蛋白质(#4944)的显示出包含所述MMG49抗体的表位的包含第20～109号氨基酸残基的区域及包括包含第1～19号氨基酸残基的相当于信号肽的区域的包含第1～378号氨基酸残基的区域是源自小鼠，且包含第379～798号氨基酸残基的区域是源自人类；该嵌合整合素β7蛋白质(#4945)的包含第1～416号氨基酸残基的区域是源自人类，且包含第417～798号氨基酸残基的区域是源自人类；该嵌合整合素β7蛋白质(#4946)的包含第1～563号氨基酸残基的区域是源自小鼠，且包含第564～798号氨基酸残基的区域是源自人类；该嵌合整合素β7蛋白质(#4947)的包含第1～721号氨基酸残基的区域是源自小鼠，且包含第722～798号氨基酸残基的区域是源自人类。
鉴于以上的实验结果，明确了MMG49抗体对于整合素β7的包含第20～109号氨基酸残基的区域的特异性结合力、即亲和性因人类整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域、即在人类整合素β7的包含第379～721号氨基酸残基的区域的存在下上升。
[实施例9]
确定MMG49抗体的抗体分子可变区的碱基序列
MMG49抗体亚类(subclass)的确认是使用同型试剂盒(Isotyping kit)(Roche公司)而进行，结果确认为IgG2a亚类。进而确定MMG49抗体的可变区的碱基序列及氨基酸序列。
序列确定的方法是使用Smarter RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司)而进行。即，以由源自产生MMG49抗体的杂交瘤MMG49的mRNA所制作的cDNA为模板，通过PCR反应扩增H链及κ链可变区的cDNA片段，解码其碱基序列。将所解码的H链可变区的氨基酸序列、碱基序列及超变区(CDR1～3)示于下述表3及4。
将所解码的L链(κ链)可变区的氨基酸序列、碱基序列及超变区(CDR1～3)也示于下述表3及4。
为了确认单独分离的MMG49抗体的可变区序列的特异性，通过使可变部序列cDNA和人类IgG4恒定部及人类IgL的κ链的恒定部序列结合，而制作嵌合化抗体。具体而言，使用In-Fusion克隆试剂盒(cloning kit)(Takara公司)，向pFuse-CH-Ig-hG4、pFuse-CL-Ig-hk(invivogen公司)插入各可变部序列后，将这些导入到FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen公司)中，回收分泌到其培养上清液中的嵌合化抗体。继而，将和MMG49抗体结合的MM1s细胞及没有和MMG49抗体结合的KMS12BM细胞在添加有MMG49-hIgG4的缓冲液中进行培养，洗净后加入生物素化抗人类IgG(Rockland公司)作为二次抗体，再次洗净后，加入抗生蛋白链菌素-PE(Biolegend公司)，由此进行染色，并进行FACS分析。其结果为，MMG49-hIgG4显现和原本的MMG49抗体相同的染色图案，提示所获得的可变部序列正确(图14)。
[表3]
Figure GDA0001574342000000501
[表4]
Figure GDA0001574342000000502
[实施例10]
使用MMG49抗体的抗体分子可变区而制作嵌合抗原受体T细胞
使用MMG49抗体分子可变部序列来制作嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigenreceptor T cell)(以下，称为源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞)是参照非专利文献2～4等，通过以下的顺序而进行。
(1)CD28及CD3z的克隆：
使用Trizol(Invitrogen公司)从Jurkat细胞采集RNA，进而使用Superscript IIIcDNA合成试剂盒(synthesis kit)(Invitrogen公司)而制作cDNA。然后，以此为模板，通过PCR而扩增CD28及CD3z的cDNA，分别使用TA克隆试剂盒(cloning kit)(Invitrogen公司)进行克隆、测序，由此确认这些的碱基序列。
(2)源自MMG49抗体的VL/VH与CD28/CD3z的4个片段的结合：
使用重叠PCR法，结合源自MMG49抗体的VL区域及VH区域以及所述克隆的CD28及CD3z的各基因片段，而制作嵌合cDNA。将其顺序和所使用的引物示于图15。将所使用的引物的碱基序列示于以下的表5。
[表5]
编号 引物名 碱基序列
23 49_car_vk-s5 gaattccaccatggattttcaagtgcagatt
24 49_car_vk-as6 gccggaaccgctagtggagccccgtttgatttccagcttggt
25 593_car_vk_as4 gctgccttctccgctgccaggtttgccggaaccgctagtggagcc
26 49_car_vh-s5 aaacctggcagcggagaaggcagccaggttcagctgcagcagtc
27 49_car_vh-as6 tgaggagacggtgaccgtgg
28 49_VKVH28as8 atacataacttcaattgcggccgctgaggagacggtgaccgtgg
29 49carinfusl ctaggcgccggaattccaccatggattttc
30 tcrzcarinfuas4 aatgtcgacctcgagtggctgttagcgag
所结合的嵌合cDNA是在使用Zeroblunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆后，进行测序而确认碱基序列。另外，将基于所确认的碱基序列而确认的氨基酸序列(序列编号21)及其碱基序列(序列编号22)示于序列表。此外，序列编号21所示的氨基酸序列不包含所述序列编号23所示的Kozak序列(gaattccacc)，从紧接其后的起始密码子(atg)开始转换为氨基酸序列。
(3)向表达载体的插入：
继而，用EcoRI/SalI的两个限制酶切出(2)中所结合的嵌合cDNA，并插入到MSCV-ires-GFP载体。
使用lipofectamine2000(invitrogen公司)，将通过所述方式制作的源自MMG49抗体的嵌合抗原受体cDNA反转录病毒载体和gag/pol及VSV-G包膜表达载体一并导入到293T细胞中，由此制作反转录病毒。在导入基因后48小时后，回收上清液而用作病毒溶液。
(4)向T细胞的导入：
继而，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体的cDNA向人类T细胞的导入是通过下述方式进行。
首先，在涂覆有抗CD3抗体(eBioscience公司)的48孔培养板中加入人类末梢血单细胞，并培养72小时。培养液是使用在X-VIVO15(Lonza公司)中添加10％的人类AB型血清及IL-2(175IU/L)所获得的培养液，而刺激末梢血单细胞。其后，在涂覆有纤维连接蛋白(Retronectin)(Takara公司)的48孔培养板中添加所述制作的病毒溶液，以1700×g进行120分钟离心，由此使纤维连接蛋白吸附病毒后，加入刺激后的末梢血单细胞(包含T细胞)，对其进行基因导入。其后，在所述的培养基中继续培养，由此扩增源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞，并用于以下的研究。使用PE-抗人类F(ab')2抗体(Jackson Laboratory公司)对表达出使用MMG49抗体的可变区的CAR构建物的T细胞进行染色，结果检测到人类F(ab')2的表达和表示构建物的导入的GFP的表达成比例(图16)。即，确认到在所导入的CAR细胞表面表达。
[实施例11]
利用源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞所进行的ITGB7表达肿瘤细胞的识别及 细胞毒性的分析
将通过所述方法制作的源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞或仅导入了GFP的对照T细胞和未表达整合素β7的K562细胞或强制表达整合素α4β7的K562细胞进行共培养，对所产生的细胞因子的量进行定量。具体而言，将T细胞及靶细胞各1×105个加入到96孔培养板中。24小时后回收上清液，利用ELISA测定IFN-γ的产生量。测定是使用Quantikine试剂盒(R&D公司)而进行。其结果为，仅在强制表达整合素α4β7的K562细胞和源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞的共培养中，发现IFN-γ及IL2的产生高于对照组(将导入了GFP表达载体的刺激后的末梢血单细胞以相同方式培养所获得的T细胞)(图17)。
其次，将源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞或仅导入了GFP的对照组T细胞与MMG49抗体所结合的骨髓瘤细胞株(MM.1s细胞、RPMI8226细胞及JJN3细胞)或没有和MMG49抗体结合的细胞(KMS12BM、Molt4、及Raji细胞)进行共培养，同样地对所产生的细胞因子的量进行定量。其结果为，仅在将MMG49抗体所结合的细胞即MM.1s、RPMI8226细胞及JJN3细胞和源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞进行共培养时，发现IFN-γ及IL2的产生高于对照组(将导入了GFP表达载体的刺激后的末梢血单细胞以相同方式培养所获得的T细胞)(图18及19)。这些结果表示，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞通过识别MMG49抗体所识别的抗原(有将其称为MMG49抗原的情况)而活化。
此外，在51Cr细胞杀伤检定中，研究源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞是否杀伤骨髓瘤细胞株。首先，将成为靶细胞的没有表达整合素β7的K562细胞或者强制表达整合素α4β7的K562细胞在添加有10％的FCS的RPMI1640培养基中进行培养，将细胞数制备为0.5～1.0×104个。
向其中加入适量的Na2 51CrO4，在37℃下反应2小时，利用51Cr将细胞标记化，并洗净，将所获得的细胞设为靶细胞。将其和悬浮在添加有胎牛血清的RPMI1640培养基中的源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞混合并共培养4小时。
其后，利用γ-计数器对释放到上清液中的51Cr进行测定。细胞杀伤率(％)是基于以下的式(1)而求出。
(A－B)/(C－D)×100 (1)
A：从用于实验的细胞释放的51Cr的量
B：在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr的量
C：由添加1％的Triton X-100引起的最大51Cr释放量
D：在不存在抗体的状态下自发释放的51Cr的量。
其结果为，如果为MMG49抗体所结合的强制表达整合素α4β7的K562细胞，则发现和作为对照的仅表达GFP的T细胞相比，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞所带来的细胞杀伤高(图20)。
其次，将源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞或仅导入了GFP的对照组T细胞与MMG49抗体所结合的骨髓瘤细胞株(MM1s细胞、RPMI8226细胞及JJN3细胞)或没有和MMG49抗体结合的细胞(KMS12BM、Molt4、及Raji细胞)进行共培养，进行同样的研究。其结果为，仅在MMG49抗体所结合的强制表达整合素α4β7的K562细胞中发现，和作为对照的仅表达GFP的T细胞相比，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞所带来的细胞杀伤更高(图21)。
以上的结果为，表示源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞可特异性地杀伤表达通过MMG49抗体所识别的抗原的细胞。
[实施例12]
源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞所带来的活体内的骨髓瘤细胞消除能力的 分析
使用源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞，调查在活体内的对于多发性骨髓瘤的治疗效果。
将骨髓瘤细胞株MM1s细胞(4×105个)移植到经2.4Gy的放射线照射的NOG小鼠的骨髄内。5天后将小鼠分为源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予组和对照组T细胞投予组，将各自5×106个分别进行静脉内投予。7天后对其进行骨髄的分析，结果在对照组T细胞投予组中，明确地在所有小鼠体内发现明显的骨髓瘤细胞的增殖，相对于此，在源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予组中，肿瘤几乎完全消失。这些结果表示，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予即便在活体内，也具有将表达MMG49抗原的肿瘤消除的能力(图22)。
进而使用骨髓瘤全身接种模型，调查对于在活体内的多发性骨髓瘤的治疗效果。
将导入了萤光素酶基因的骨髓瘤细胞株MM1s细胞(5×106个)移植到经2.4Gy的放射线照射的NOG小鼠的静脉内。移植后5天使用IVIS成像系统(珀金埃尔默公司)，测定肿瘤细胞的移植的程度。其后，将小鼠分为源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予组和对照组T细胞投予组，在移植后5天和7天，将各自3×106个分别进行静脉内投予。在第2次的T细胞投予后7天，使用IVIS成像系统，再次测定肿瘤量，结果在对照组T细胞投予组中，明确地在所有小鼠体内发现明显的骨髓瘤细胞的增殖，相对于此，在源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予组中，肿瘤几乎完全消失(图23)。这些结果表示，源自MMG49抗体的嵌合抗原受体T细胞投予即便在活体内，也具有将表达MMG49抗原的肿瘤消除的能力。
[实施例13]
针对MMG49抗体的表位，进行如下实验，即进一步详细地研究实施例8中所研究出的结果。制作如图25所示的3种人类/小鼠嵌合整合素β7蛋白质表达用载体，通过脂转染法将各表达载体导入到293T细胞中，48小时后利用FACS而分析没有没结合MMG49抗体。
其结果为，明确MMG49抗体几乎和全长均源自人类的整合素β7蛋白质(图11中的#4927)的情况同样地，牢固地和嵌合整合素β7蛋白质(图25中的ch5.1)结合，该嵌合整合素β7蛋白质的整合素β7蛋白质的包含第1～32号及第91～798号氨基酸残基的区域是源自小鼠，且其余区域(包含第33～90号氨基酸残基的区域)是源自人类(图25)。
因此，强烈提示MMG49抗体的表位包含在人类整合素β7蛋白质的第33～90号氨基酸残基中。
[实施例14]
通过脂转染法将表达人类整合素β7、小鼠整合素β7及仅使人类整合素β7的1或2个氨基酸变异为源自小鼠的氨基酸序列的各种变异体(R35E/N36D、H38D、M41L/L42Q及A48V)的载体导入到293T细胞中，其后以与实施例8相同的方式进行实验。其结果为，明确如图26所示，与人类整合素β7相比，仅A48V突变体对于MMG49抗体的结合力明显减少，变得接近小鼠整合素β7的数值。由该结果明确，人类整合素β7的第48号氨基酸残基和MMG49抗体的表位密切相关，或者包含在MMG49抗体的表位中。
以下，披露本说明书中所表示的碱基序列及氨基酸序列。
Figure IDA0001574343010000011
Figure IDA0001574343010000021
Figure IDA0001574343010000031
Figure IDA0001574343010000041
Figure IDA0001574343010000051
Figure IDA0001574343010000061
Figure IDA0001574343010000071
Figure IDA0001574343010000081
Figure IDA0001574343010000091
Figure IDA0001574343010000101
Figure IDA0001574343010000111
Figure IDA0001574343010000121
Figure IDA0001574343010000131
Figure IDA0001574343010000141
Figure IDA0001574343010000151
Figure IDA0001574343010000161
Figure IDA0001574343010000171
Figure IDA0001574343010000181
Figure IDA0001574343010000191
Figure IDA0001574343010000201

Claims (11)

1.一种抗体，其包含重链可变区及轻链可变区，
该重链可变区包含：
由序列编号1所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、
由序列编号2所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及
由序列编号3所示的氨基酸序列构成的重链CDR3，
该轻链可变区包含：
由序列编号6所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、
由序列编号7所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及
由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含
由序列编号4所示的氨基酸序列构成的重链可变区及
由序列编号9所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其是多特异性抗体。
4.一种多核苷酸，其具有编码权利要求1至3中任一项所述的抗体的碱基序列。
5.一种宿主细胞，其携带权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种嵌合抗原受体，其包含权利要求1至3中任一项所述的抗体的抗原识别部位。
7.一种多核苷酸，其编码权利要求6所述的嵌合抗原受体。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其具有序列编号22所示的碱基序列。
9.一种细胞，其携带权利要求7或8所述的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的细胞，其是嵌合抗原受体T细胞或NK细胞。
11.一种医药组合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的抗体或权利要求9或10所述的细胞。
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