JPH06303990A - モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法 - Google Patents
モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法Info
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- JPH06303990A JPH06303990A JP5120956A JP12095693A JPH06303990A JP H06303990 A JPH06303990 A JP H06303990A JP 5120956 A JP5120956 A JP 5120956A JP 12095693 A JP12095693 A JP 12095693A JP H06303990 A JPH06303990 A JP H06303990A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよ
び該抗体の製造方法。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体を用いることに
より、ヒト組織中のヒトインテグリンβ7 を容易に検出
することができる。また、本発明のモノクローナル抗体
を用いることにより、ヒト組織中からヒトインテグリン
β7 を分離精製することができる。従って、本発明のモ
ノクローナル抗体はヒトインテグリンβ7の検出試薬や
分離精製用試薬として有用である。更に、本発明のモノ
クローナル抗体はヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６
６）のフィブロネクチンに対する接着を抑制することか
ら、フィブロネクチン等の細胞接着蛋白と関連する、炎
症性疾患の治療薬としての応用が期待される。
ノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよ
び該抗体の製造方法。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体を用いることに
より、ヒト組織中のヒトインテグリンβ7 を容易に検出
することができる。また、本発明のモノクローナル抗体
を用いることにより、ヒト組織中からヒトインテグリン
β7 を分離精製することができる。従って、本発明のモ
ノクローナル抗体はヒトインテグリンβ7の検出試薬や
分離精製用試薬として有用である。更に、本発明のモノ
クローナル抗体はヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６
６）のフィブロネクチンに対する接着を抑制することか
ら、フィブロネクチン等の細胞接着蛋白と関連する、炎
症性疾患の治療薬としての応用が期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトインテグリンβ7 を
特異的に認識するモノクローナル抗体、それを産生する
ハイブリドーマおよび該抗体の製造方法に関する。
特異的に認識するモノクローナル抗体、それを産生する
ハイブリドーマおよび該抗体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インテグリンα4 β1 （ＶＬＡ−４）は
単核白血球の大部分に発現しており、細胞接着蛋白の一
つであるＶＣＡＭ−１との結合を介して炎症部位に浸潤
し、炎症反応を起こす。従って、喘息、アレルギー、関
節炎および動脈硬化症のような疾患においては、ＶＬＡ
−４とＶＣＡＭ−１との接着を阻害することが治療上重
要であると考えられている（Bosco M. C. Chanら、J. B
iol. Chem.、第267 巻、8366頁、1992年）。
単核白血球の大部分に発現しており、細胞接着蛋白の一
つであるＶＣＡＭ−１との結合を介して炎症部位に浸潤
し、炎症反応を起こす。従って、喘息、アレルギー、関
節炎および動脈硬化症のような疾患においては、ＶＬＡ
−４とＶＣＡＭ−１との接着を阻害することが治療上重
要であると考えられている（Bosco M. C. Chanら、J. B
iol. Chem.、第267 巻、8366頁、1992年）。
【０００３】ＶＬＡ−４はインテグリンβ1 サブファミ
リーに属し、その構成はインテグリンα4 とインテグリ
ンβ1 のヘテロダイマーから成る。しかし、このインテ
グリンα4 サブユニットはインテグリンβ1 のみなら
ず、ヒトではインテグリンβ7とも会合することが報告
されている（Bosco M. C. Chanら、J. Biol. Chem.、第
267 巻、8366頁、1992年およびDavid J. Erle ら、J. B
iol. Chem.、第266 巻、11009 頁、1991年）。
リーに属し、その構成はインテグリンα4 とインテグリ
ンβ1 のヘテロダイマーから成る。しかし、このインテ
グリンα4 サブユニットはインテグリンβ1 のみなら
ず、ヒトではインテグリンβ7とも会合することが報告
されている（Bosco M. C. Chanら、J. Biol. Chem.、第
267 巻、8366頁、1992年およびDavid J. Erle ら、J. B
iol. Chem.、第266 巻、11009 頁、1991年）。
【０００４】ヒトインテグリンα4 β7 はヒトインテグ
リンα4 β1 と同様、フィブロネクチンやＶＣＡＭ−１
を介して内皮細胞にリンパ球を接着させるという報告も
ある（Curzio Rueggら、J. Cell Biol. 、第117 巻、17
9 頁、1992年）。
リンα4 β1 と同様、フィブロネクチンやＶＣＡＭ−１
を介して内皮細胞にリンパ球を接着させるという報告も
ある（Curzio Rueggら、J. Cell Biol. 、第117 巻、17
9 頁、1992年）。
【０００５】従来、インテグリンサブユニットに対する
種々の抗体が知られているが、ヒトインテグリンβ7 に
対するモノクローナル抗体は、知られていなかった。
種々の抗体が知られているが、ヒトインテグリンβ7 に
対するモノクローナル抗体は、知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヒトインテグ
リンβ7 と特異的に結合できるモノクローナル抗体、そ
れを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法を
提供することを目的とする。
リンβ7 と特異的に結合できるモノクローナル抗体、そ
れを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法を
提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
した結果、ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体およびヒトインテグリンβ7 を特異的
に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを見いだし、本発明を完成させた。
した結果、ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体およびヒトインテグリンβ7 を特異的
に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを見いだし、本発明を完成させた。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明のモノクローナル抗体およびそれを
産生するハイブリドーマは、以下の製造方法によって得
ることができる。 （抗原の調製）本発明では、哺乳動物への免疫に用いる
抗原には、精製したヒトインテグリンα4 β7 のヘテロ
ダイマーを用いる。
産生するハイブリドーマは、以下の製造方法によって得
ることができる。 （抗原の調製）本発明では、哺乳動物への免疫に用いる
抗原には、精製したヒトインテグリンα4 β7 のヘテロ
ダイマーを用いる。
【００１０】ヒトインテグリンα4 β7 のヘテロダイマ
ーは、以下のようにして得ることができる。
ーは、以下のようにして得ることができる。
【００１１】先ず、抗ヒトインテグリンα4 抗体（ＳＧ
／１７、順天堂大学医学部免疫学教室から入手）と抗ヒ
トインテグリンβ1 抗体（ＳＧ／１９、順天堂大学医学
部免疫学教室から入手）とを用いて、ヒトメモリーＴ細
胞、ヒト単球およびヒトＢ細胞リンパ腫のなかから選択
されるヒトリンパ細胞から、フローサイトメトリー分析
法により、ヒトインテグリンα4 を発現しているがヒト
インテグリンβ1 を発現していない細胞を選出する（選
出された細胞は、ヒトインテグリンα4 サブユニットと
ヒトインテグリンβ7 サブユニットとがヘテロダイマー
を構成していると考えられる）。次いで、選出された細
胞を非イオン性の界面活性剤が含まれる可溶化バッファ
ーで可溶化し、抗ヒトインテグリンα4 抗体（ＳＧ／１
７）を固定化したイムノアフィニティカラムに通してヒ
トインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーを該カラムに
吸着させた後、酸で溶出し、ヒトインテグリンα4 β7
のヘテロダイマーを含む画分を得る。最後に、得られた
画分を蒸留水にて一夜透析した後、凍結乾燥する。
／１７、順天堂大学医学部免疫学教室から入手）と抗ヒ
トインテグリンβ1 抗体（ＳＧ／１９、順天堂大学医学
部免疫学教室から入手）とを用いて、ヒトメモリーＴ細
胞、ヒト単球およびヒトＢ細胞リンパ腫のなかから選択
されるヒトリンパ細胞から、フローサイトメトリー分析
法により、ヒトインテグリンα4 を発現しているがヒト
インテグリンβ1 を発現していない細胞を選出する（選
出された細胞は、ヒトインテグリンα4 サブユニットと
ヒトインテグリンβ7 サブユニットとがヘテロダイマー
を構成していると考えられる）。次いで、選出された細
胞を非イオン性の界面活性剤が含まれる可溶化バッファ
ーで可溶化し、抗ヒトインテグリンα4 抗体（ＳＧ／１
７）を固定化したイムノアフィニティカラムに通してヒ
トインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーを該カラムに
吸着させた後、酸で溶出し、ヒトインテグリンα4 β7
のヘテロダイマーを含む画分を得る。最後に、得られた
画分を蒸留水にて一夜透析した後、凍結乾燥する。
【００１２】上記のフローサイトメトリー分析法によっ
て選出された細胞としては、ヒトＢ細胞リンパ腫である
ＲＰＭＩ８８６６（順天堂大学医学部免疫学教室から入
手）が例示される。
て選出された細胞としては、ヒトＢ細胞リンパ腫である
ＲＰＭＩ８８６６（順天堂大学医学部免疫学教室から入
手）が例示される。
【００１３】（ハイブリドーマの製造）ハイブリドーマ
の製造は、常法に従って次のようにして行うことができ
る。即ち、上記のようにして得られるヒトインテグリン
α4 β7 の凍結乾燥品（抗原）をリン酸緩衝生理食塩液
に溶解し、これをハムスター等の哺乳小動物に投与して
該動物を免疫した後、その脾臓を摘出して抗体産生脾細
胞を調製する。
の製造は、常法に従って次のようにして行うことができ
る。即ち、上記のようにして得られるヒトインテグリン
α4 β7 の凍結乾燥品（抗原）をリン酸緩衝生理食塩液
に溶解し、これをハムスター等の哺乳小動物に投与して
該動物を免疫した後、その脾臓を摘出して抗体産生脾細
胞を調製する。
【００１４】免疫された動物の抗体産生脾細胞は骨髄腫
細胞と細胞融合されるが、用いる骨髄腫細胞は、例え
ば、マウス由来のものが好ましい。細胞融合は、例え
ば、ミルステインらの方法（C. Milstein ら、Nature、
第256 巻、495 頁、1975年）に準じて行われる。即ち、
30％〜60％ポリエチレングリコール（平均分子量1000〜
4000）を用いて30℃〜40℃の温度で約１〜３分反応させ
ることによって行われる。
細胞と細胞融合されるが、用いる骨髄腫細胞は、例え
ば、マウス由来のものが好ましい。細胞融合は、例え
ば、ミルステインらの方法（C. Milstein ら、Nature、
第256 巻、495 頁、1975年）に準じて行われる。即ち、
30％〜60％ポリエチレングリコール（平均分子量1000〜
4000）を用いて30℃〜40℃の温度で約１〜３分反応させ
ることによって行われる。
【００１５】このようにして得られるハイブリドーマが
産生するモノクローナル抗体を、フローサイトメトリー
分析法によりスクリーニングを行い、ヒトインテグリン
α4を認識せずにヒトインテグリンβ7 を特異的に認識
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選
別する。
産生するモノクローナル抗体を、フローサイトメトリー
分析法によりスクリーニングを行い、ヒトインテグリン
α4を認識せずにヒトインテグリンβ7 を特異的に認識
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選
別する。
【００１６】上記により得られたハイブリドーマは、
「抗ヒトインテグリンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１
１４）産生ハイブリドーマ」と表示し、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託した［受託番号、微工研菌寄第
１３２０２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２０２）］。
「抗ヒトインテグリンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１
１４）産生ハイブリドーマ」と表示し、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託した［受託番号、微工研菌寄第
１３２０２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２０２）］。
【００１７】（モノクローナル抗体の製造）本発明のモ
ノクローナル抗体は、上記により得られるハイブリドー
マを、これと適合性のある哺乳小動物、例えば、マウス
等の腹腔内に接種し、増殖させ、その腹水から本発明の
モノクローナル抗体を常法により分離精製することによ
って得られる。
ノクローナル抗体は、上記により得られるハイブリドー
マを、これと適合性のある哺乳小動物、例えば、マウス
等の腹腔内に接種し、増殖させ、その腹水から本発明の
モノクローナル抗体を常法により分離精製することによ
って得られる。
【００１８】ハイブリドーマとして「抗ヒトインテグリ
ンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハイブリ
ドーマ」を用いることにより、本発明のモノクローナル
抗体（ＴＮ１１４）が得られる。
ンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハイブリ
ドーマ」を用いることにより、本発明のモノクローナル
抗体（ＴＮ１１４）が得られる。
【００１９】
【発明の作用効果】本発明のモノクローナル抗体を用い
ることにより、ヒト組織中のヒトインテグリンβ7 を容
易に検出することができる。また、本発明のモノクロー
ナル抗体を用いることにより、ヒト組織中からヒトイン
テグリンβ7 を分離精製することができる。従って、本
発明のモノクローナル抗体は、ヒトインテグリンβ7 の
検出試薬や分離精製用試薬として有用である。
ることにより、ヒト組織中のヒトインテグリンβ7 を容
易に検出することができる。また、本発明のモノクロー
ナル抗体を用いることにより、ヒト組織中からヒトイン
テグリンβ7 を分離精製することができる。従って、本
発明のモノクローナル抗体は、ヒトインテグリンβ7 の
検出試薬や分離精製用試薬として有用である。
【００２０】更に、本発明のモノクローナル抗体（ＴＮ
１１４）はヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）の
フィブロネクチンに対する接着を抑制することから（試
験例１参照）、フィブロネクチン等の細胞接着蛋白と関
連する、炎症性疾患の治療薬としての応用が期待され
る。
１１４）はヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）の
フィブロネクチンに対する接着を抑制することから（試
験例１参照）、フィブロネクチン等の細胞接着蛋白と関
連する、炎症性疾患の治療薬としての応用が期待され
る。
【００２１】試験例１ 抗ヒトインテグリンβ7 モノクローナル抗体による、ヒ
トＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフィブロネク
チンに対する接着の抑制作用： （１）検体 ・本発明のモノクローナル抗体（ＴＮ１１４、実施例２
参照）
トＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフィブロネク
チンに対する接着の抑制作用： （１）検体 ・本発明のモノクローナル抗体（ＴＮ１１４、実施例２
参照）
【００２２】（２）試験方法 96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに、リン
酸緩衝生理食塩液（pH7.4、 以下ＰＢＳと略記する）に
溶解したヒト血漿フィブロネクチン（ＧＩＢＣＯ製）10
μｇ／ｍｌを50μｌずつ分注し、４℃で一夜培養した。
各ウエルの溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血
清アルブミンを含有するＰＢＳで２時間ブロッキングを
行った。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ウシ血清アルブ
ミンを除去した。
酸緩衝生理食塩液（pH7.4、 以下ＰＢＳと略記する）に
溶解したヒト血漿フィブロネクチン（ＧＩＢＣＯ製）10
μｇ／ｍｌを50μｌずつ分注し、４℃で一夜培養した。
各ウエルの溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血
清アルブミンを含有するＰＢＳで２時間ブロッキングを
行った。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ウシ血清アルブ
ミンを除去した。
【００２３】他方、ヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８
６６）を10μＭの2',7'-ビス（カルボキシエチル）カル
ボキシフルオレセインテトラアセトキシメチルエステル
（以下ＢＣＥＣＦ−ＡＭと略記する）のジメチルスルホ
キシド溶液（同仁化学製）と共に30分間培養した後、無
血清リンパ球培地（ＡＩＭ ＶTM培地、ＧＩＢＣＯ製）
で３回洗浄した。得られたＢＣＥＣＦ−ＡＭを取り込ま
せたヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）と検体と
を予め３０分間培養後、先の96ウエルマイクロタイター
プレートの各ウエルに分注した（各ウエル当たり、該細
胞：１×105 個、検体濃度：20μｇ／ｍｌ）。37℃で10
分間培養した後、各ウエルをＰＢＳで満たし、プレート
シール（大日本製薬製）で密閉した。該プレートを逆さ
にして800 回転／分で２分間遠心回転を行った。各ウエ
ルの溶液を除去した後、１％ノニデットＰ−40TM（ナカ
ライテスク製）を 100μｌ加え、接着によって残ってい
る細胞を溶解させた。次いで、各ウエル中のＢＣＥＣＦ
−ＡＭ量をフルオロスキャンを用いて測定し、これを指
標にしてヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフ
ィブロネクチンに対する接着率を求めた。接着率は、フ
ィブロネクチンをコートしていないウエルを用いて上記
試験を行った場合の蛍光強度を０％とし、上記における
ＢＣＥＣＦ−ＡＭを取り込ませたヒトＢ細胞リンパ腫
（ＲＰＭＩ８８６６）（１×105 個）を１％ノニデット
Ｐ−40TM 100μｌに溶解させた場合の蛍光強度を 100％
として算出した。
６６）を10μＭの2',7'-ビス（カルボキシエチル）カル
ボキシフルオレセインテトラアセトキシメチルエステル
（以下ＢＣＥＣＦ−ＡＭと略記する）のジメチルスルホ
キシド溶液（同仁化学製）と共に30分間培養した後、無
血清リンパ球培地（ＡＩＭ ＶTM培地、ＧＩＢＣＯ製）
で３回洗浄した。得られたＢＣＥＣＦ−ＡＭを取り込ま
せたヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）と検体と
を予め３０分間培養後、先の96ウエルマイクロタイター
プレートの各ウエルに分注した（各ウエル当たり、該細
胞：１×105 個、検体濃度：20μｇ／ｍｌ）。37℃で10
分間培養した後、各ウエルをＰＢＳで満たし、プレート
シール（大日本製薬製）で密閉した。該プレートを逆さ
にして800 回転／分で２分間遠心回転を行った。各ウエ
ルの溶液を除去した後、１％ノニデットＰ−40TM（ナカ
ライテスク製）を 100μｌ加え、接着によって残ってい
る細胞を溶解させた。次いで、各ウエル中のＢＣＥＣＦ
−ＡＭ量をフルオロスキャンを用いて測定し、これを指
標にしてヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフ
ィブロネクチンに対する接着率を求めた。接着率は、フ
ィブロネクチンをコートしていないウエルを用いて上記
試験を行った場合の蛍光強度を０％とし、上記における
ＢＣＥＣＦ−ＡＭを取り込ませたヒトＢ細胞リンパ腫
（ＲＰＭＩ８８６６）（１×105 個）を１％ノニデット
Ｐ−40TM 100μｌに溶解させた場合の蛍光強度を 100％
として算出した。
【００２４】なお、対照として、抗ヒトインテグリンβ
1 抗体（ＳＧ／１９）、抗ヒトインテグリンα4 抗体
（ＳＧ／７３、順天堂大学医学部免疫学教室から入手）
および抗体非添加の場合における接着率も上記と同様に
して求めた。
1 抗体（ＳＧ／１９）、抗ヒトインテグリンα4 抗体
（ＳＧ／７３、順天堂大学医学部免疫学教室から入手）
および抗体非添加の場合における接着率も上記と同様に
して求めた。
【００２５】（３）試験結果 結果を図１に示した。図１から明らかなように、本発明
のモノクローナル抗体は、ヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭ
Ｉ８８６６）のフィブロネクチンに対する接着を抑制す
ることが判明した。
のモノクローナル抗体は、ヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭ
Ｉ８８６６）のフィブロネクチンに対する接着を抑制す
ることが判明した。
【００２６】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明する。
【００２７】なお、実施例においては、以下の−の
培地を目的に応じて使用した。 ＲＰＭＩ１６４０培地 細胞（骨髄腫細胞またはハイブリドーマ）用培地 上記の培地に以下のものを添加した培地 10％ ウシ胎児血清 2ｍＭ Ｌ−グルタミン 50μＭ ２−メルカプトエタノール 100 Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧ 100 μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン 20ｍＭ 炭酸水素ナトリウム ＨＡＴ培地 上記の培地に更に、以下のものを添加した培地 0.1 ｍＭ ヒポキサンチン 0.4 μＭ アミノプテリン 16μＭ チミジン
培地を目的に応じて使用した。 ＲＰＭＩ１６４０培地 細胞（骨髄腫細胞またはハイブリドーマ）用培地 上記の培地に以下のものを添加した培地 10％ ウシ胎児血清 2ｍＭ Ｌ−グルタミン 50μＭ ２−メルカプトエタノール 100 Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧ 100 μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン 20ｍＭ 炭酸水素ナトリウム ＨＡＴ培地 上記の培地に更に、以下のものを添加した培地 0.1 ｍＭ ヒポキサンチン 0.4 μＭ アミノプテリン 16μＭ チミジン
【００２８】実施例１ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ ： （抗原の調製）種々のヒトリンパ細胞（６×105 個）を
三分し、夫々50μｌのＰＢＳに懸濁した。そのうちの１
つには抗ヒトインテグリンα4 抗体（ＳＧ／１７）を、
もう１つには抗ヒトインテグリンβ1 抗体（ＳＧ／１
９）を夫々１μｇずつ添加し、残り１つには何も添加せ
ず、それらを４℃で30分間培養した。培養後、夫々をＰ
ＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（オ
リンパス製）0.5 μｌを含有するＰＢＳ50μｌに懸濁し
た。次いで、再度４℃で30分間培養し、ＰＢＳで洗浄し
た後、それらをＰＢＳ 200μｌに再懸濁した。各懸濁液
をフローサイトメトリーにより分析し、ヒトインテグリ
ンα4 を発現しているがヒトインテグリンβ1 を発現し
ていない細胞を選出し、ヒトＢ細胞リンパ腫であるＲＰ
ＭＩ８８６６を得た。
ル抗体を産生するハイブリドーマ ： （抗原の調製）種々のヒトリンパ細胞（６×105 個）を
三分し、夫々50μｌのＰＢＳに懸濁した。そのうちの１
つには抗ヒトインテグリンα4 抗体（ＳＧ／１７）を、
もう１つには抗ヒトインテグリンβ1 抗体（ＳＧ／１
９）を夫々１μｇずつ添加し、残り１つには何も添加せ
ず、それらを４℃で30分間培養した。培養後、夫々をＰ
ＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（オ
リンパス製）0.5 μｌを含有するＰＢＳ50μｌに懸濁し
た。次いで、再度４℃で30分間培養し、ＰＢＳで洗浄し
た後、それらをＰＢＳ 200μｌに再懸濁した。各懸濁液
をフローサイトメトリーにより分析し、ヒトインテグリ
ンα4 を発現しているがヒトインテグリンβ1 を発現し
ていない細胞を選出し、ヒトＢ細胞リンパ腫であるＲＰ
ＭＩ８８６６を得た。
【００２９】得られたＲＰＭＩ８８６６（３×108 個）
を可溶化バッファー［50ｍＭトリス−塩酸、pH 7.6、15
0 ｍＭ塩化ナトリウム、１％ポリオキシエチレン(10)オ
クチルフェニルエーテル、50ｍＭヨードアセトアミド、
２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、0.1
％アジ化ナトリウム、１ｍＭフッ化フェニルメチルスル
ホニル］30ｍｌにより可溶化し、抗ヒトインテグリンα
4 抗体（ＳＧ／１７）をセファロースビーズに結合させ
たイムノアフィニティカラムに吸着させた。次いで、0.
1 Ｍグリシン−塩酸バッファー（pH 3.0）で溶出し、ヒ
トインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーを含む画分を
得た。得られた画分を、蒸留水にて一夜透析した後、凍
結乾燥させた（収量10μｇ）。該凍結乾燥品をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に付し、120-150 kD
a にヒトインテグリンα4 β7 の存在を確認した。
を可溶化バッファー［50ｍＭトリス−塩酸、pH 7.6、15
0 ｍＭ塩化ナトリウム、１％ポリオキシエチレン(10)オ
クチルフェニルエーテル、50ｍＭヨードアセトアミド、
２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、0.1
％アジ化ナトリウム、１ｍＭフッ化フェニルメチルスル
ホニル］30ｍｌにより可溶化し、抗ヒトインテグリンα
4 抗体（ＳＧ／１７）をセファロースビーズに結合させ
たイムノアフィニティカラムに吸着させた。次いで、0.
1 Ｍグリシン−塩酸バッファー（pH 3.0）で溶出し、ヒ
トインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーを含む画分を
得た。得られた画分を、蒸留水にて一夜透析した後、凍
結乾燥させた（収量10μｇ）。該凍結乾燥品をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に付し、120-150 kD
a にヒトインテグリンα4 β7 の存在を確認した。
【００３０】（ハイブリドーマの製造）上記により得ら
れたヒトインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーの凍結
乾燥品10μｇを0.5 ｍｌのＰＢＳに溶解し、１〜２週間
間隔でアルメニアハムスターの腹腔内に５回注射して免
疫した。
れたヒトインテグリンα4 β7 のヘテロダイマーの凍結
乾燥品10μｇを0.5 ｍｌのＰＢＳに溶解し、１〜２週間
間隔でアルメニアハムスターの腹腔内に５回注射して免
疫した。
【００３１】最終免疫の４日後にハムスターの脾臓を摘
出して抗体産生脾細胞を調製した。次いで、該脾細胞と
マウス骨髄腫細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７）を５：１の割合で混合し、50％ポリ
エチレングリコール（平均分子量4000）を用いて37℃で
２分間反応させることにより細胞融合を行った。
出して抗体産生脾細胞を調製した。次いで、該脾細胞と
マウス骨髄腫細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７）を５：１の割合で混合し、50％ポリ
エチレングリコール（平均分子量4000）を用いて37℃で
２分間反応させることにより細胞融合を行った。
【００３２】細胞融合を行った細胞を96ウエルマイクロ
タイタープレートに植え込み、ＨＡＴ培地にて37℃、５
％炭酸ガス条件下で７〜14日培養を行った。
タイタープレートに植え込み、ＨＡＴ培地にて37℃、５
％炭酸ガス条件下で７〜14日培養を行った。
【００３３】次いで、増殖した細胞の培養上清について
フローサイトメトリー分析法によりスクリーニングを行
った。フローサイトメトリー分析法の詳細は、以下の通
りである。
フローサイトメトリー分析法によりスクリーニングを行
った。フローサイトメトリー分析法の詳細は、以下の通
りである。
【００３４】160 μｌのヒトインテグリンβ7 ハイブリ
ドーマ培養上清を二分し、半分は２×105 個のＲＰＭＩ
８８６６と共に、残り半分はヒトインテグリンβ7 を有
しない２×105 個のＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５９６）と共に４℃で30分間培養した。ＰＢＳで洗
浄後、0.5 μｌのヤギ抗ハムスターＩｇＧ−ＦＩＴＣ(
ＣＡＬＴＡＧ製）を含む50μｌの細胞用培地中に４℃で
30分間細胞を再懸濁し、そして再びＰＢＳで洗浄した。
それらを200 μｌの細胞用培地に再懸濁し、フローサイ
トメトリーにより分析した。
ドーマ培養上清を二分し、半分は２×105 個のＲＰＭＩ
８８６６と共に、残り半分はヒトインテグリンβ7 を有
しない２×105 個のＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５９６）と共に４℃で30分間培養した。ＰＢＳで洗
浄後、0.5 μｌのヤギ抗ハムスターＩｇＧ−ＦＩＴＣ(
ＣＡＬＴＡＧ製）を含む50μｌの細胞用培地中に４℃で
30分間細胞を再懸濁し、そして再びＰＢＳで洗浄した。
それらを200 μｌの細胞用培地に再懸濁し、フローサイ
トメトリーにより分析した。
【００３５】この結果、４クローンが目的の抗原に対し
陽性を示すことが判明した。
陽性を示すことが判明した。
【００３６】上記スクリ−ニング工程で得られた４クロ
ーンをそれぞれ、BALB/cマウスの胸腺細胞（約１×106
個／ｍｌ）を含む細胞用培地で１個／0.2 ｍｌとし96ウ
エルマイクロタイタープレートの各ウエルに植え込ん
だ。37℃、５％炭酸ガス条件下で培養後７〜14日で、肉
眼で認められるコロニーが形成された。こうして得られ
たコロニーについて上記と同様にスクリーニングおよび
クローニングを行い、最終的にβ7 ペプチドに対するウ
サギ抗血清（アメリカ、ハーバードメディカルスクー
ル、Michael B, Brenner博士から入手）を用いてウエス
タン・ブロッティングによる確認操作を行い、ヒトイン
テグリンβ7 を特異的に認識する単クローン株を得た
（120kD のβ鎖の部位に発色を認めた）。
ーンをそれぞれ、BALB/cマウスの胸腺細胞（約１×106
個／ｍｌ）を含む細胞用培地で１個／0.2 ｍｌとし96ウ
エルマイクロタイタープレートの各ウエルに植え込ん
だ。37℃、５％炭酸ガス条件下で培養後７〜14日で、肉
眼で認められるコロニーが形成された。こうして得られ
たコロニーについて上記と同様にスクリーニングおよび
クローニングを行い、最終的にβ7 ペプチドに対するウ
サギ抗血清（アメリカ、ハーバードメディカルスクー
ル、Michael B, Brenner博士から入手）を用いてウエス
タン・ブロッティングによる確認操作を行い、ヒトイン
テグリンβ7 を特異的に認識する単クローン株を得た
（120kD のβ鎖の部位に発色を認めた）。
【００３７】得られた単クローン株は「抗ヒトインテグ
リンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハイブ
リドーマ」と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した［受託番号、微工研菌寄第１３２０２号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３２０２）］。
リンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハイブ
リドーマ」と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した［受託番号、微工研菌寄第１３２０２号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３２０２）］。
【００３８】実施例２ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体 ：予め 2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン
（ナカライテスク製）0.5 ｍｌを腹腔内投与したBALB/c
マウス（３匹）に対し、実施例１で得られた抗ヒトイン
テグリンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハ
イブリドーマ（１×107 個）を腹腔内に接種した。約１
週間後にハムスター抗ヒトインテグリンβ7 モノクロー
ナル抗体（ＴＮ１１４）を含む腹水（約３ｍｌ／マウ
ス）を得た。
ル抗体 ：予め 2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン
（ナカライテスク製）0.5 ｍｌを腹腔内投与したBALB/c
マウス（３匹）に対し、実施例１で得られた抗ヒトイン
テグリンβ7 モノクローナル抗体（ＴＮ１１４）産生ハ
イブリドーマ（１×107 個）を腹腔内に接種した。約１
週間後にハムスター抗ヒトインテグリンβ7 モノクロー
ナル抗体（ＴＮ１１４）を含む腹水（約３ｍｌ／マウ
ス）を得た。
【００３９】次に、得られた腹水約10ｍｌにＰＢＳ 20
ｍｌを加え、４℃においてＰＢＳで１夜透析した。これ
を0.2 μｍのフィルターに通した後、プロテインＧセフ
ァロース４ファーストフロー（ファルマシア製）カラム
で分離精製し、再び、４℃においてＰＢＳで１夜透析
し、ハムスター抗ヒトインテグリンβ7 モノクローナル
抗体（ＴＮ１１４）のＰＢＳ溶液 5ｍｌを得た（濃度：
100 μｇ／ｍｌ）。
ｍｌを加え、４℃においてＰＢＳで１夜透析した。これ
を0.2 μｍのフィルターに通した後、プロテインＧセフ
ァロース４ファーストフロー（ファルマシア製）カラム
で分離精製し、再び、４℃においてＰＢＳで１夜透析
し、ハムスター抗ヒトインテグリンβ7 モノクローナル
抗体（ＴＮ１１４）のＰＢＳ溶液 5ｍｌを得た（濃度：
100 μｇ／ｍｌ）。
【図１】本発明のモノクローナル抗体（ＴＮ１１４）が
ヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフィブロネ
クチンに対する接着を抑制することを示す図である。
ヒトＢ細胞リンパ腫（ＲＰＭＩ８８６６）のフィブロネ
クチンに対する接着を抑制することを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 八木田 秀雄 東京都板橋区小豆沢３丁目９番２−610号 (72)発明者 奥村 康 千葉県千葉市中央区松波１丁目14番９号
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒトインテグリンβ7 を特異的に認識す
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１に記載の抗体を産生するハイブ
リドーマ。 - 【請求項３】 抗ヒトインテグリンα4 抗体と抗ヒトイ
ンテグリンβ1 抗体とを用いて、ヒトメモリーＴ細胞、
ヒト単球およびヒトＢ細胞リンパ腫のなかから選択され
るヒトリンパ細胞から、フローサイトメトリー分析法に
より、ヒトインテグリンα4 を発現しているがヒトイン
テグリンβ1 を発現していない細胞を選出した後、該細
胞の可溶化溶液を抗ヒトインテグリンα4 抗体を固定化
したイムノアフィニティカラムに付してヒトインテグリ
ンα4 β7 のヘテロダイマーを得、次にこれを抗原とし
て哺乳小動物を免疫した後、その脾臓を摘出して抗体産
生脾細胞を調製し、該抗体産生脾細胞と骨髄腫細胞とを
細胞融合してハイブリドーマを調製し、該ハイブリドー
マが産生するモノクローナル抗体をフローサイトメトリ
ー分析法によりスクリーニングしてヒトインテグリンα
4 を認識せずにヒトインテグリンβ7 を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別
し、該ハイブリドーマを、これと適合性のある哺乳小動
物の腹腔内に接種して増殖させ、該腹水から生成したモ
ノクローナル抗体を分離精製することを特徴とするヒト
インテグリンβ7 を特異的に認識するモノクローナル抗
体の製造方法。 - 【請求項４】 ヒトＢ細胞リンパ腫がＲＰＭＩ８８６６
である請求項３に記載のモノクローナル抗体の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5120956A JPH06303990A (ja) | 1993-04-24 | 1993-04-24 | モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5120956A JPH06303990A (ja) | 1993-04-24 | 1993-04-24 | モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303990A true JPH06303990A (ja) | 1994-11-01 |
Family
ID=14799151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5120956A Pending JPH06303990A (ja) | 1993-04-24 | 1993-04-24 | モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよび該抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06303990A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998006248A3 (en) * | 1996-08-15 | 1998-05-07 | Leukosite Inc | HUMANIZED IMMUNOGLOBULIN REACTIVE WITH α4β7 INTEGRIN |
| WO2000030681A1 (en) * | 1998-11-25 | 2000-06-02 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antagonists of the alpha e beta 7 integrin as therapeutic agents for inflammatory diseases |
| US6551593B1 (en) | 1995-02-10 | 2003-04-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam |
| US8277808B2 (en) | 1995-09-01 | 2012-10-02 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Mucosal vascular addressins and uses thereof |
| WO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| US9663579B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-05-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
| US10040855B2 (en) | 2011-05-02 | 2018-08-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
-
1993
- 1993-04-24 JP JP5120956A patent/JPH06303990A/ja active Pending
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6551593B1 (en) | 1995-02-10 | 2003-04-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam |
| US8277808B2 (en) | 1995-09-01 | 2012-10-02 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Mucosal vascular addressins and uses thereof |
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| AU730326B2 (en) * | 1996-08-15 | 2001-03-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin |
| AU730326C (en) * | 1996-08-15 | 2005-06-16 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin |
| EP1710314A1 (en) * | 1996-08-15 | 2006-10-11 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin |
| US7147851B1 (en) | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
| US7402410B2 (en) | 1996-08-15 | 2008-07-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
| WO2000030681A1 (en) * | 1998-11-25 | 2000-06-02 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antagonists of the alpha e beta 7 integrin as therapeutic agents for inflammatory diseases |
| US9663579B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-05-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
| US10143752B2 (en) | 2011-05-02 | 2018-12-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating ulcerative colitis |
| US9764033B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-09-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
| US11560434B2 (en) | 2011-05-02 | 2023-01-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
| US10004808B2 (en) | 2011-05-02 | 2018-06-26 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating ulcerative colitis |
| US10040855B2 (en) | 2011-05-02 | 2018-08-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
| EP3336184A4 (en) * | 2015-08-11 | 2019-01-23 | Osaka University | ANTIBODY |
| WO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| JP2019201641A (ja) * | 2015-08-11 | 2019-11-28 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| US10654931B2 (en) | 2015-08-11 | 2020-05-19 | Osaka University | Antibody |
| US10988540B2 (en) | 2015-08-11 | 2021-04-27 | Osaka University | Antibody |
| JP2021130676A (ja) * | 2015-08-11 | 2021-09-09 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| CN113893341A (zh) * | 2015-08-11 | 2022-01-07 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
| JPWO2017026331A1 (ja) * | 2015-08-11 | 2018-05-31 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体 |
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