JP2001507210A - α４β７インテグリンと反応するヒト化免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、非ヒト起源（例えは、齧歯類）の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒト枠組み領域、ヒト定常領域）を含有する、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトα４β７インテグリンへの結合に関して、ネズミＡｃｔ−１と競合することができる。好ましい態様においては、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、ネズミＡｃｔ−１抗体の軽鎖および重鎖の相補性決定領域それぞれを含有する。さらに、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖、本発明のヒト化免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン鎖（例えば、単鎖抗体）をコードする配列を含有する単離された核酸、本発明の核酸を含有する構築物、およびヒト化免疫グロブリンの調製方法に有用な、本発明の核酸を含有する宿主細胞に関する。ヒト化免疫グロブリンは、例えば、粘膜組織へのリンパ球浸潤（補給および／または蓄積を含む）を制御するために、ヒトにおける診断および治療上の適用に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 α４β７インテグリンと反応するヒト化免疫グロブリン 発明の背景 インテグリンレセプターは、リンパ球の再循環とリンパ球の炎症部位への補給 の両方の制御に重要である(カルロス(Carlos，T．M．)とハーラン(Harlan，J．M .)、Blood，84:2068-2101(1994))。ヒトα４β７インテグリンは、いくつかのリ ガンドを有し、そのうちの１つは、腸間膜リンパ節やパイエル斑の高内皮性小静 脈で発現している（ストリーター(Streeter，P．R．)ら、Nature 331:41-46(198 8))粘膜血管アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１である(ベルリン(Berlin，C.)ら、Cell 74:185-195(1993);アール(Erle，D．J．)ら、J．Immunol．153:517-528(1994)) 。このように、α４β７インテグリンは、腸の粘膜リンパ組織へのリンパ球の移 動を仲介するホーミングレセプターとして作用する(シュバイクホッファー(Schw eighoffer，T.)ら、J．Immunol．151:717-729(1993))。さらに、α４β７インテ グリンは、フィブロネクチンおよび血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）と相 互作用する。 例えば、潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸 管の炎症を伴う衰弱性及び進行性の疾患でありうる。米国だけでも推定２００万 人の人々を冒している症状には、腹痛、痙攣、下痢および直腸出血などがある。 ＩＢＤ治療には、抗炎症剤（コルチコステロイドおよびスルファサラジンなど） 、免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、シクロスポリンおよびアザチオプリンな ど）および外科手術（結腸切除など）などが用いられている。ポドルスキー（Po dolsky）、New Engl．J．Med.，325:928-937(1991)およびポドルスキー（Podols ky）、New Engl．J．Med.，325:1008-1016(1991)。 ネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ Ａｃｔ−１）のようなヒトα４β７イン テグリンに対する抗体は、粘膜リンパ節の高内皮性小静脈に存在する粘膜アドレ シン細胞接着分子−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）へのα４β７インテグリン結合を妨 害する。Ａｃｔ−１は、ラザロビッツ(Lazarovits，A．I.)ら、J．Immunol．133 :1857-1862（1984）により、ヒト破傷風毒素特異的Ｔリンパ球で免疫したマウス から最初に単離され、マウスＩｇＧ１／κ抗体であると報告された。シュバイク ホッファー(Schweighoffer，T.)ら、J．Immunol．151:717-729（1993）による該 抗体のさらに最近の分析により、該抗体はα４β７インテグリンを選択的に発現 するヒトＣＤ４＋記憶Ｔリンパ球のある種のサブセットに結合できることが示唆 された。しかしながら、ヒトにおける治療上の適用にネズミ抗体を使用すること に関する重大な問題は、それらはヒトにおいて高い免疫原性があり、患者におけ るマウス抗体の効力を低下させ、持続投与を妨げうるヒト抗ネズミ抗体応答（Ｈ ＡＭＡ）を迅速に誘導することである。ＨＡＭＡ応答は、マウス抗体の迅速なク リアランスを生じ、いかなる治療の恩恵をも厳密に制限してしまう。 したがって、炎症性腸疾患に対する改良された治療アプローチに関する要求が ある。発明の要約 本発明は、免疫グロブリンが非ヒト起源（例えば、齧歯類）の抗原結合領域お よびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒト枠組み領域、ガ ンマ型のヒト定常領域）を含有する、α４β７インテグリンに対する結合特異性 を有するヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、本明細書に記載 されるヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンへの結合に関して、ネズ ミＡｃｔ−１またはＬＤＰ−０２（実施例４等を参照のこと）と競合することが できる。好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、Ａｃ ｔ−１モノクローナル抗体に由来する（例えば、ＬＤＰ−０２、図１１（配列番 号：１９）および図１２（配列番号：２１）それぞれに示された軽鎖および重鎖 の可変領域を含有する免疫グロブリン）。 例えば、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒト起源の相補性決定領域（ＣＤＲ）お よびヒト枠組み領域に由来する枠組み領域（ＦＲ）を含む抗原結合領域を含有す ることができる。１つの側面において、α４β７インテグリンに対する結合特異 性を有するヒト化免疫グロブリンは、α４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由 来するＣＤＲおよびヒト起源（例えば、ＧＭ６０７’ＣＬ）の軽鎖に由来するＦ Ｒを含む軽鎖、ならびにα４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ およびヒト起源（例えば、２１／２８’ＣＬ）の重鎖に由来するＦＲを含む重鎖 を含有する。別の側面において、軽鎖は、Ａｃｔ−１抗体の軽鎖に由来する３つ のＣＤＲを含有し、重鎖は、Ａｃｔ−１抗体の重鎖に由来する３つのＣＤＲを含 有する。 また、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖（例えば、Ａｃｔ−１抗体の軽鎖 のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにヒト軽鎖ＦＲを含有する）、なら びにヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、Ａｃｔ−１抗体の重鎖のＣＤＲ１、Ｃ ＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにヒト重鎖ＦＲを含有する）に関する。好ましい態 様において、本発明は、本明細書に記載されたヒト化重鎖および軽鎖（例えば、 図７（配列番号：１２）に示された軽鎖の可変領域を含有するヒト化軽鎖、図９ （配列番号：１５）に示された重鎖の可変領域を含有するヒト化重鎖、図１２（ 配列番号：２１）に示された軽鎖の可変領域を含有するヒト化軽鎖、図１１（配 列番号：１９）に示された重鎖の可変領域を含有するヒト化重鎖）に関する。ま た、１以上のヒト化軽鎖および／または重鎖を含有するヒト化免疫グロブリンも 含まれる。 さらに、本発明は、本発明のヒト化免疫グロブリン（例えば、単鎖抗体）をコ ードする配列を含有する単離された核酸、ならびに本発明のヒト化免疫グロブリ ン軽鎖をコードする配列（例えば、配列番号：２０）または重鎖をコードする配 列（例えば、配列番号：１８）を含有する単離された核酸に関する。例えば、本 発明は、ネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する抗原結合領域をコード する第１の核酸配列と、ヒト起源の免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部 をコードする第２の核酸配列とを含有する、ヒト化免疫グロブリン軽鎖または重 鎖をコードする融合遺伝子を提供する。 さらに、本発明は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化 免疫グロブリンまたはかかる免疫グロブリンの鎖をコードする核酸を含有する構 築物に関する。例えば、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒ ト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコ ードするヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺 伝子を含有する発現ベクターが提供される。かかる構築物の別の例は、α４β７ インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト化抗体の重鎖に由来するＣＤＲ およびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含 むヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を含有する発現ベクターで ある。 また、本発明は、本発明の核酸を含有する構築物の１以上を含む、本発明の核 酸を含有する宿主細胞に関する。１つの態様において、本発明は、ヒト化免疫グ ロブリン軽鎖をコードする第１の組換え核酸およびヒト化免疫グロブリン重鎖を コードする第２の組換え核酸を含有し、前記第１の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体 の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードす るヌクレオチド配列を含み；前記第２の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体の重鎖に由 来するＣＤＲおよびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオ チド配列を含む、宿主細胞に関する。 また、本発明は、本発明の宿主細胞をヒト化免疫グロブリンの発現に適した条 件下で維持し、それにより１または複数のヒト化免疫グロブリン鎖を発現させ、 ヒト化免疫グロブリンを産生する工程を含むヒト化免疫グロブリンの調製方法を 提供する。該方法は、ヒト化免疫グロブリンの単離工程をさらに含むことが可能 である。 本発明のヒト化免疫グロブリンは、それらのネズミまたは他の非ヒトカウンタ ーパートよりも免疫原性が弱くなりうる。したがって、本明細書に記載されたヒ ト化免疫グロブリンは、例えば、粘膜リンパ組織へのリンパ球ホーミングを制御 し、それによって腸での炎症応答を低減するために、ヒトにおける治療剤として 使用することができる。 さらに、本発明は、診断または（予防を含む）治療における使用のための本発 明のヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、本発明は、胃腸管（ 腸に関連する内皮を含む）、他の粘膜組織またはＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現す る組織の白血球浸潤に関連する疾患を含む炎症性疾患の治療等における、組織の 白血球浸潤に関連する疾患の治療での使用のための本発明のヒト化免疫グロブリ ンに関する。特に好ましい態様において、本発明は、潰瘍性結腸炎やクローン病 のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療における使用のための本発明のヒト化免 疫グロブリンに関する。 別の側面において、本発明は、胃腸管、他の粘膜組織またはＭＡｄＣＡＭ−１ 分子を発現する組織の白血球浸潤に関連する疾患を含む炎症性疾患の治療等にお ける組織の白血球浸潤に関連する疾患の治療用の医薬の製造のための本発明のヒ ト化免疫グロブリンの使用に関する。特に好ましい態様において、本発明は、潰 瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療用の医薬の製造 のための本発明のヒト化免疫グロブリンの使用に関する。図面の簡単な説明 図１は、いくつかの独立したマウス重鎖可変領域クローンから決定した可変領 域を含有するコンセンサスＤＮＡ配列（配列番号：１）および予想されるアミノ 酸配列（配列番号：２）の図である。 図２は、Ｈ２Ｂ＃３４と称する独立したマウス重鎖可変領域クローンから決定 した可変領域配列の一部を含有するヌクレオチド配列（配列番号：３）および予 想されるアミノ酸配列（配列番号：４）の図である。 図３は、いくつかの独立したマウス軽鎖可変領域クローンの可変領域を含有す るヌクレオチド配列（配列番号：５）および予想されるアミノ酸配列（配列番号 ：６）の図である。クローニング用のＫａｓＩ部位を導入するために作製した２ つの変異の位置が示される。 図４Ａは、ネズミＡｃｔ−１ ｍＡｂおよびマウスアイソタイプ適合無関係対 照抗体（ＭＯＰＣ ２１；ＩｇＧ１、カッパ）の、α４β７インテグリンを発現 するＨｕＴ７８細胞を染色する能力を示す蛍光プロットである。 図４Ｂは、（ｉ）キメラＡｃｔ−１抗体、（ii）ヒトアイソタイプ適合無関係 対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）および(iii)ＣＯＳ−７細胞上清の、α４β７イ ンテグリンを発現するＨｕＴ７８細胞を染色する能力を示す蛍光プロットである 。 図５は、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域（「Ａｃｔ−１．ｖｌ」）のアミノ酸 配列（配列番号：７）およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域のアミノ酸配列 （配列番号：８）のアラインメントである。同一のアミノ酸を垂直線で示し、類 似のアミノ酸を類似性の程度により４個または２個の点で示す。ＣＤＲを括弧で 標示し、残基に連続番号を付す。 図６は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域（「Ａｃｔ−１．ｖｈ」）のアミノ酸 配列（配列番号：９）およびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域のアミノ酸配列 （配列番号：１０）のアラインメントである。同一のアミノ酸を垂直線で示し、 類似のアミノ酸を類似性の程度により４個または２個の点で示す。ＣＤＲを括弧 で標示し、残基に連続番号を付す。 図７は、マウスＡｃｔ−１軽鎖シグナルペプチド配列に結合したマウスＡｃｔ −１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１１）および予想されるアミ ノ酸配列（配列番号：１２）の図である。 図８は、成熟ヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体カッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配 列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：８）の図である。 図９は、マウスＡｃｔ−１抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ 酸配列の図である。可変領域のヌクレオチド配列を、予想されるマウスＡｃｔ− １重鎖シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に結合させ、混成配 列（配列番号：１４および１５）を得る。（重鎖領域を増幅させるプライマーの 同一性は、縮重配列から予想され、シグナルペプチドに対するアミノ酸配列は、 プライマー、下流の配列および他のシグナルペプチドの配列に由来した。示され たシグナルペプチドは、Ａｃｔ−１ハイブリドーマのものとは同一ではない。） 図１０は、ヒト２１／２８’ＣＬ抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列および アミノ酸配列の図である。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒト抗体 ＨＧ３’ＣＬ（レシャビ(Rechavi，G.)ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA80:855 -859(1983)）のＶ_Hに由来するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド 配列に結合させ、混成配列（配列番号：１６および１７）を得る。 図１１は、重鎖シグナルペプチドを有するヒト化Ａｃｔ−１抗体（ＬＤＰ−０ ２）の重鎖の一部のヌクレオチド配列（配列番号：１８）およびアミノ酸配列（ 配列番号：１９）の図である。 図１２は、軽鎖シグナルペプチドを有するヒト化Ａｃｔ−１抗体（ＬＤＰ−０ ２）の軽鎖の一部のヌクレオチド配列（配列番号：２０）およびアミノ酸配列（ 配列番号：２１）の図である。 図１３は、ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（ＬＤＰ−０２）の軽鎖を作製す るために使用したＬ１〜Ｌ６と称する重複相補的オリゴヌクレオチドのヌクレオ チド配列（配列番号：２２〜２７）、およびヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの 重鎖を作製するために使用したＨ１〜Ｈ１０と称する重複相補的オリゴヌクレオ チドのヌクレオチド配列（配列番号：２８〜３７）の図である。 図１４は、マウスーヒトＡｃｔ−１キメラ免疫グロブリン、ヒト化Ａｃｔ−１ 免疫グロブリンまたは無関係なヒトアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ１、カッ パ）を用いるＨｕＴ７８細胞の染色を示す蛍光プロットである。 図１５は、ＨｕＴ−７８細胞におけるフローサイトメトリーにより行なったビ オチニル化ネズミＡｃｔ−１およびヒト化Ａｃｔ−１（ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ ＬＯＴ♯１、実施例４）の滴定の結果を示すグラフである。 図１６は、対照ネズミＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１と比較した、ネズミＡｃｔ −１またはヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃ １、実施例４）によるビオチニル化ネズミＡｃｔ−１の結合の競合阻害を示すグ ラフである。 図１７は、（ａ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ、（ｂ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇ、（ｃ ）ヒトＩｇＧ１、（ｄ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ♯１（実施例４）、また は（ｅ）ＬＤＰ−０１（ヒト化抗ＣＤ１８、Ｆｃ変異）の、５０、２５、５、２ ．５および０．５μｇ／ｍｌの濃度での存在下で、ヒト末梢血単核細胞の補体介 在細胞溶解に関する⁵¹クロム放出アッセイの結果を示すグラフである。 図１８Ａ〜１８Ｂは、α４β７産生細胞（ＲＰＭＩ８８６６）のネズミＡｃｔ −１（図１８Ａ）、ネズミＩｇＧ１（図１８Ａ）、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏ ｔ＃１（図１８Ｂ）またはヒトＩｇＧ１（図１８Ｂ）およびヒトＭＡｄＣＡＭ− １−Ｉｇキメラ（免疫接着）による接着阻害をモニターする接着アッセイの結果 を示すグラフである。 図１９は、（ａ）ＬＤＰ−０２（Ｆｃ変異した）、（ｂ）軽鎖に１つの変異（ ＭＶ４）と重鎖に二重変異（Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ）を有するＬＤＰ−０２（Ｆｃ 変異した）の誘導体、または（ｃ）無関係なヒトアイソタイプ適合対照抗体（Ｉ ｇＧ１、カッパ）を用いるＨｕＴ７８細胞の染色を比較したグラフである。発明の詳細な説明 本発明は、非ヒト起源の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少な くとも一部を含有する、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト 化免疫グロブリンに関する。ヒト化免疫グロブリンは、少なくとも約１０⁷Ｍ^-1 のアフィニティーでα４β７インテグリンを結合しうることが好ましく、好まし くは少なくとも約１０⁸Ｍ^-1、さらに好ましくは少なくとも約１０⁹Ｍ^-1である。 １つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンを結合す る非ヒト起源の抗原結合領域およびヒト定常領域に由来する定常領域を含む。 別の態様において、α４β７インテグリンを結合するヒト化免疫グロブリンは、 非ヒト起源の相補性決定領域およびヒト起源の可変枠組み領域、ならびに任意に ヒト起源の定常領域を含有する。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、軽鎖がα４ β７インテグリンを結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域および ヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域を含み、重鎖がα４β７インテグリンを結 合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域およびヒト起源の重鎖に由来 する枠組み領域を含む、重鎖ならびに軽鎖を含有しうる。 また、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはヒト化免疫グロブリン重鎖 に関する。１つの態様において、本発明は、非ヒト起源の軽鎖ＣＤＲ（即ち、１ 以上のＣＤＲ）およびヒト軽鎖枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖に関 する。別の態様において、本発明は、非ヒト起源の重鎖ＣＤＲ（即ち、１以上の ＣＤＲ）およびヒト重鎖枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリン重鎖に関する。 ＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンに由来することができる。 天然の免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）と２つの同一の重 鎖（約５５または７０ｋＤ）が四量体を形成する共通のコア構造を有する。各鎖 のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として知られ、各鎖の残りの部分のより保 存された定常（Ｃ）領域から区別されうる。Ｊ領域として知られるＣ末端部分は 、軽鎖の可変領域内にある。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加え、Ｄ領域が存 在する。免疫グロブリンにおけるアミノ酸配列の変化の大部分は、抗原結合に直 接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域中 の３つの分離した位置に限られる。アミノ末端から進んで、これらの領域は、そ れぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。ＣＤＲは、より保存さ れた枠組み領域（ＦＲ）により適切に保持される。アミノ末端から進んで、これ らの領域は、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される。ＣＤ ＲおよびＦＲ領域の位置とナンバリングシステムは、カバット(Kabat)らにより 定義されている（カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immun ological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局( 1991)；表３および４も参照のこと）。 ヒト免疫グロブリンは、重鎖のアイソタイプによりクラスおよびサブクラスに 分けることができる。クラスは、重鎖がそれぞれ、ガンマ（γ）、ミュー（μ） 、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）型のものであるＩｇＧ 、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む。サブクラスは、重鎖がそれぞれ 、γ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２型のものであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ 、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。選択されたクラスまた はサブクラスのヒト免疫グロブリン分子は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽 鎖のいずれかを含んでもよい。例えば、Cellular and Molecular Immunology、 ウォンジーヴィクス(Wonsiewicz，M．J.)編、45章、41-50頁、W．B．Saunders C o、フィラデルフィア、PA(1991);ニソノフ(Nisonoff，A.)、Introduction to Mo lecular Immunology、第２版、４章、45-65頁、Sinauer Associates，Inc.、サ ンダーランド、MA（1984）を参照のこと。 本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、抗体全体およびその生物 学的に機能しうる断片を含むものである。かかる生物学的に機能しうる断片は、 対応する全長の抗体の少なくとも１つの抗原結合機能（例えば、Ａｃｔ−１抗体 のα４β７に対する特異性）を保持し、好ましくはα４β７とその１以上のリガ ンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１、フィブロネクチン）との相互作用を阻害する 能力を保持する。特に好ましい態様において、生物学的に機能しうる断片は、α ４β７の粘膜アドレシン（ＭＡｄＣＡＭ−１）への結合を阻害することができる 。使用されうる生物学的に機能しうる抗体断片の例は、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ 、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂断片等のα４β７インテグリンに結合可能な断 片を含む。かかる断片は、酵素的切断または組換え技術により生成することがで きる。例えば、パパインまたはペプシン切断を用い、それぞれ、ＦａｂまたはＦ （ａｂ’）₂断片を作製することができる。また、１以上の停止コドンを天然の 停止部位の上流に導入した抗体遺伝子を用いて、種々の切断型の抗体も生成する ことができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片の重鎖をコードするキメラ遺伝子は 、重鎖のＣＨ₁ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように 設計することができる。 本明細書で用いる「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、少なくとも一部分 がヒト起源のものである、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含有する免疫グ ロブリンをいう。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を有するマウス等の非ヒ ト起源の免疫グロブリンおよびヒト起源の免疫グロブリン配列に由来し（例えば 、キメラ免疫グロブリン）、通常の技術により化学的に共に連結されるか遺伝子 工学技術を用いて連続的なポリペプチドとして調製された（例えば、キメラ抗体 のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて連続的なポリペプチド鎖を生 成することができる）部分を含有することができる。本発明のヒト化免疫グロブ リンの別の例は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲとヒト起源の軽鎖および／ または重鎖に由来する枠組み領域とを含有する免疫グロブリン（例えば、枠組み 変化を有するまたは有さないＣＤＲを接ぎ合わせた抗体）である。また、キメラ またはＣＤＲを接ぎ合わせた単鎖抗体は、ヒト化免疫グロブリンという用語に含 まれるものである。例えば、キャビリー(Cabilly)ら、米国特許第４，８１６， ５６７号明細書；キャビリーら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号明細書 ；ボス(Boss)ら、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；ボスら、欧州特許第 ０，１２０，６９４ Ｂ１号明細書；ニューバーガー(Neuberger，M．S.)ら、国 際公開第８６／０１５３３号パンフレット；ニューバーガーら、欧州特許第０， １９４，２７６ Ｂ１号明細書；ウインター(Winter)、米国特許第５，２２５， ５３９号明細書；ウインター、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号明細書； パドラン(Padlan，E．A.)ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号明細 書を参照のこと。また、単鎖抗体に関しては、ラドナー(Ladner)ら、米国特許第 ４，９４６，７７８号明細書；ハストン(Huston)ら、米国特許第５，４７６，７ ８６号明細書；およびバード(Bird，R．E.)ら、Science，242:423-426（1988） ）を参照のこと。 ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域（非ヒト部分）は、α４β７インテグリ ンに対する結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリン（ドナー免疫グロブ リンと称する）に由来することができる。例えば、適する抗原結合領域は、ネズ ミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来することができる（ラザロビッツ(Lazar ovits，A．I.)ら、J．Immunol.，133(4):1857-1862(1984));例えば、実施例１〜 ３を参照のこと）。他の供給源は、齧歯類（マウス、ラット等）、ウサギ、ブタ 、ヤギまたは非ヒト霊長類（サル等）のような非ヒト供給源から得られたα４β ７インテグリン特異的抗体を含む。Ａｃｔ−１抗体と同一または類似のエピトー プに結合する抗体のような他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製 することができる(例えば、コーラーら、Nature，256:495-497(1975);ハーロー ら、1988、Antibodies:A Laboratory Manual，(ColdSpringHarbor，NY);およびC urrent Protocols in Molecular Biology，第２巻、（補遺27、94年夏）、アウ スベルら編、（John Wiley & Sons:New York，NY）、第11章(1991))。 例えば、抗体は、適切な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒ ツジ）において適した免疫原に対して惹起することができる。α４β７を産生す る細胞、α４β７を含む膜画分、α４β７の免疫原断片、適当な担体に結合させ たβ７ペプチドが適当な免疫原の例である。抗体産生細胞（例えば、リンパ球） は、例えば、免疫した動物のリンパ節または脾臓から単離することができる。次 いで、該細胞を適当な不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞株）に融合し、それによ りハイブリドーマを生成することができる。融合細胞は、選択培養技術を用いて 単離することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適当なア ッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択することができる。また、α４β７ィ ンテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリンは、抗体ラ イブラリー（例えば、非ヒトＦａｂ分子を含有するファージライブラリー）から 得ることもできる。 １つの態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、非ヒト化起源 のＣＤＲを含有する。この態様において、α４β７インテグリンに対する結合特 異性を有するヒト化免疫グロブリンは、少なくとも１つの非ヒト起源のＣＤＲを 含有する。例えば、ＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンが非ヒト起源の１以上の免 疫グロブリン由来の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３；および／ または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を実質的に含み、生じた ヒト化免疫グロブリンがα４β７インテグリンに結合特異性を有するように、非 ヒト起源の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域から派生させることができ る。好ましくは、選択された鎖の３つのＣＤＲすべてがドナーの対応する鎖のＣ ＤＲと実質的に同じであり、さらに好ましくは、軽鎖および重鎖の３つのＣＤＲ すべてが対応するドナー鎖のＣＤＲと実質的に同じである。 ヒト化免疫グロブリンまたはヒト起源の免疫グロブリン鎖の部分（ヒトの部分 ）は、いかなる適当なヒト免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖に由来するこ とができる。もし存在するならば、例えば、ヒト定常領域またはその一部は、ア レル変異体を含むヒト抗体のκもしくはλ軽鎖、および／またはγ（例えば、γ １、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えば、α１、α２）、δもしくはε重鎖に 由来することができる。特定の定常領域（例えば、ＩｇＧ１）、変異体またはそ の一部は、エフェクター機能を調整するために選択することができる。例えば、 変異した定常領域（変異体）は、Ｆｃレセプターへの結合および／または補体を 固定する能力を最小にするために融合タンパク質に取り込まれうる（例えば、実 施例３を参照のこと；ウインター(Winter)ら、英国特許第２，２０９，７５７Ｂ 号明細書；モリソン(Morrison)ら、国際公開第８９／０７１４２号パンフレット ；モーガン(Morgan)ら、国際公開第９４／２９３５１号パンフレット、１９９４ 年１２月２２日も参照のこと）。 もし存在するならば、ヒト枠組み領域（例えば、軽鎖可変領域のもの）は、抗 原結合領域ドナーの類似体または均等の領域（例えば、軽鎖可変領域）に配列類 似性を有するヒト抗体可変領域に由来することが好ましい。ヒト化免疫グロブリ ンのヒト起源の部分に関する枠組み領域の他の供給源は、ヒト可変コンセンサス 配列を含む(例えば、実施例２を参照のこと；ケトルボロー(Kettleborough，C． A.)ら、Protein Engineering 4:773-783(1991);カーター(Carter)ら、国際公開 第９４／０４６７９号パンフレット、１９９４年３月３日発行も参照のこと))。 例えば、非ヒト部分を得るために用いた抗体または可変領域の配列は、カバット ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健お よびヒトサービス省、米国政府印刷局(1991)に記載のヒト配列と比較することが できる。特に好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリン鎖の枠組み領域は、 非ヒトドナー（例えば、マウスＡｃｔ−１抗体）の可変領域と少なくとも全体の 約６５％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも全体の約７０％の配列同一 性を有するヒト可変領域に由来する。また、ヒト部分は、非ヒトドナーの均等な 部分（例えば、ＦＲ）と比較したとき、用いた特定の部分（例えば、ＦＲ）内で 、少なくとも約６５％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約７０％の配 列同一性を有するヒト抗体に由来することもできる。例えば、実施例２に記載さ れるように、マウスＡｃｔ−１およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域間の全 体の配列同一性は、７１．４％であり、マウスＡｃｔ−１およびヒト２１／２８ ’ＣＬ重鎖可変領域間の全体の配列同一性は、６８．１％であった。 １つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト起源の抗体の１以上の鎖 に由来する少なくとも１つの枠組み領域（ＦＲ）を含有する。したがって、ＦＲ は、ヒト起源の１以上の抗体に由来するＦＲ１および／またはＦＲ２および／ま たはＦＲ３および／またはＦＲ４を含むことができる。好ましくは、選択された ヒト化鎖のヒト部分は、ヒト起源の可変領域に由来（例えば、ヒト免疫グロブリ ン鎖由来、ヒトコンセンサス配列由来）するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ ４を含む。 本発明に用いられる非ヒト起源およびヒト起源の免疫グロブリン部分は、それ らが由来する免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン部分またはそれらの変異体 と同一の配列を有する。かかる変異体は、１以上の残基の付加、欠失または置換 により異なる突然変異体を含む。前に示したように、非ヒト起源のＣＤＲは、非 ヒトドナーにおいて実質的に同じであり、好ましくは非ヒトドナーのＣＤＲと同 一である。実施例２に記載されるように、ヒト起源の枠組み領域の残基をドナー の対応する部分由来の残基と置換するもの等の枠組み領域における変化をなすこ とができる。１以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含む枠組み領域におけ る１以上の突然変異をなすことができる。いくつかのかかる置換は、実施例２に おいてヒト化Ａｃｔ−１抗体の設計に記載されている。選択されたヒト化抗体ま たは鎖に関して、枠組み突然変異を本明細書に記載のように設計することができ る。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒトドナーのものと類似かまたは よりよいアフィニティーで、α４β７インテグリンを結合することができる。変 異体は、非ヒトドナーまたはアクセプターのヒト鎖の突然変異導入を含む種々の 適当な方法で生成することができる。 本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒトα４β７インテグリンに対する結合特 異性を有し、ヘテロダイマーのα４および／またはβ７鎖の決定基を結合可能な （断片を含む）ヒト化免疫グロブリンを含む。好ましい態様において、本発明の ヒト化免疫グロブリンは、結合機能（例えば、α４β７インテグリンに対する特 異性を有する、同一または類似のエピトープ特異性を有する）および／または阻 害機能（例えば、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボでＭＡｄＣＡＭ−１に 結合するα４β７インテグリンを阻害する能力、またはα４β７インテグリンを 産生する細胞のそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１を産生する細胞）への 結合を阻害する能力のようなイン・ビトロおよび／またはイン・ビボでα４β７ 依存性接着を阻害する能力）のようなネズミＡｃｔ−１抗体の少なくとも１つの 機能特性を有する。したがって、好ましいヒト化免疫グロブリンは、ネズミＡｃ ｔ−１抗体の結合特異性、ネズミＡｃｔ−１抗体のエピトープ特異性（例えば、 α４β７（例えば、α４β７インテグリン産生細胞上）への結合に関して、ネズ ミＡｃｔ−１、キメラＡｃｔ−１抗体（例えば、実施例１を参照のこと）または ヒト化Ａｃｔ−１（例えば、ＬＤＰ−０２）と競合できる）および／または阻害 機能を有することができる。 α４β７インテグリンに結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの結合機能 は、例えば、ヒト化免疫グロブリンとα４β７インテグリン（例えば、α４β７ インテグリンを含有する膜画分、ヒトリンパ球（例えば、ＣＤ４＋α４^hi，β１^lo サブセットのリンパ球）、ヒトリンパ球細胞株、またはα４β７インテグリン を発現するα４および／またはβ７をコードする核酸を含有する組換え宿主細胞 ）のようなα４β７インテグリンを産生する細胞上で）との間の複合体の形成を モニターするアッセイを用いる標準的な免疫学的方法により検出することができ る。 また、結合および／または接着アッセイまたは他の適当な方法を、所望の特異 性で、ヒト化免疫グロブリン（例えば、ライブラリー由来）の同定および／また は単離のための手法（例えば、α４β７インテグリンを産生する細胞とそのリガ ンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭを発現する第２の細胞、ＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラ との接着をモニターするアッセイ（実施例４等を参照のこと）、または他の適当 な方法に用いることもできる。 本発明に用いられる非ヒトおよびヒト起源の免疫グロブリン部分は、軽鎖、重 鎖ならびに軽鎖および重鎖の一部を含む。これらの免疫グロブリン部分は、免疫 グロブリンから（例えば、ある部分のドゥノボの合成により）得ることができる し、免疫グロブリンに由来することができ、または、免疫グロブリンまたは所望 の性質（例えば、α４β７インテグリンを結合する、配列類似性）を有するその 鎖をコードする核酸を生成して発現することができる。ヒトおよび非ヒト起源の 所望の部分（例えば、抗原結合領域、ＣＤＲ、ＦＲ、Ｃ領域）を含有するヒト化 免疫グロブリンは、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を 調製するための合成および／または組換え核酸を用いて生成することができる。 鎖の一部を調製するためには、１以上の停止コドンを所望の位置に導入すること ができる。例えば、新規に設計したヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、 ＤＮＡ）配列は、存在するＤＮＡ配列を変化させるためのＰＣＲ突然変異導入方 法を用いて構築することができる（例えば、カマン(Kamman，M.)ら、Nucl．Acid s Res．17:5404(1989)を参照のこと）。新規ＣＤＲをコードするＰＣＲプライマ ーは、同一または非常に類似したヒト可変領域に基づいて前もってヒト化した可 変領域のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることができる(サトー(Sato，K.)ら、C ancer Research 53:851-856(1993))。類似のＤＮＡ配列が鋳型として利用できな いならば、可変領域配列をコードする配列を含有する核酸を合成オリゴヌクレオ チドから構築することができる(例えば、コルビンガー(Kolbinger，F.)、Protei n Engineering 8:971-980(1993))。また、シグナルペプチドをコードする配列を 核酸に組み込む（例えば、合成で、ベクターへの挿入により）こともできる。天 然のシグナルペプチド配列を利用できないならば、他の抗体由来のシグナルペプ チド配列を用いることができる（例えば、ケトルボロー(Kettleborough，C．A.) ら、Protein Engineering 4:773-783（1991）を参照のこと）。これらの方法、 本明細書に記載された方法または他の好適な方法を用いて、変異体を容易に生成 することができる（例えば、実施例５を参照のこと）。１つの態様に おいて、クローニングした可変領域（例えば、ＬＤＰ−０２のもの）は、突然変 異を導入することができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を（例 えば、ファージライブラリーから；例えば、クレバー(Krebber)ら、米国特許第 ５，５１４，５４８号明細書；フーゲンブーム(Hoogenboom)ら、国際公開第９３ ／０６２１３号パンフレット、１９９３年４月１日公開）選択することができる 。核酸および該核酸を含有する構築物 また、本発明は、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリン 軽鎖もしくは重鎖をコードする配列を含有する、単離されたおよび／または組換 え（例えば、本質的に純粋を含む）核酸に関する。 本明細書における「単離された」核酸とは、その供給源のゲノムＤＮＡまたは 細胞ＲＮＡの核酸（例えば、細胞中またはライブラリーのような核酸の混合物中 に存在するもの）から分離された核酸であり、本質的に純粋な核酸、化学合成に より、生物学的方法と化学的方法との組合せにより生成された核酸ならびに単離 された組換え核酸を含む、本明細書に記載された方法または他の好適な方法によ り得られた核酸を含む(例えば、ドウガティ(Daugherty，B．L.)ら、Nucleic Aci dsRes.，19(9):2471-2476(1991);ルイス(Lewis，A．P.)とクローエ(J．S．Crowe )、Gene，101:297-302(1991))。 本明細書における「組換え」と言及された核酸とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクターへのクローニングのような人 工的な組換え方法に依存する手法により生成する核酸を含む、組換えＤＮＡ方法 論により生成された核酸である。また、「組換え」核酸は、細胞の天然のメカニ ズムを通じて発生する組換え事象からも生じるものであるが、所望の組換え事象 を起こさせ、おそらく起こすように設計した核酸の細胞への導入後選択されるも のでもある。 また、本発明は、より具体的にはヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（即ち、非 ヒト部分がネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する本発明のヒト化免疫 グロブリン）またはその鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する単離された および／または組換え核酸に関する。１つの態様において、軽鎖は、Ａｃｔ−１ 抗体の軽鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有し、重鎖は、Ａｃｔ−１抗体 の重鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有する。かかる核酸は、例えば、（ ａ）ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、 図１１の重鎖可変領域（配列番号：１９）、図９の重鎖可変領域（配列番号：１ ５））を含むポリペプチドをコードする配列を含有する核酸、（ｂ）ヒト化Ａｃ ｔ−１免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、図１２の軽鎖可 変領域（配列番号：２１）、図７の軽鎖可変領域（配列番号：１２））を含むポ リペプチドをコードする配列を含有する核酸、（ｃ）ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロ ブリンの軽鎖または重鎖可変領域の少なくとも機能性部分（例えば、前記鎖を含 有するヒト化免疫グロブリンの抗原結合に充分な部分）をコードする配列を含有 する核酸、を含む。遺伝コードの縮重性により、選択されたポリペプチドをコー ドする種々の核酸を作製することができる。１つの態様において、核酸は、二本 鎖または一本鎖のポリヌクレオチドを含む、前記もしくは実質的に前記図１１（ 配列番号：１８）、または前記もしくは実質的に前記図１２（配列番号：２０） の可変領域のヌクレオチド配列を含有する。（種々の図面が可変領域よりも大き いポリペプチド（即ち、シグナルペプチドコーディング配列または定常領域コー ディング配列の一部を含む）を図示してもよいが、特定の図面の可変領域への参 照は、示された配列の可変領域の部分を含むことを意味する。）これらの基準に 適合する単離されたおよび／または組換え核酸は、前記したヒト化Ａｃｔ−１抗 体またはその変異体の配列と同一の配列をコードする核酸を含有することができ る。 本発明の核酸は、α４β７インテグリンに結合特異性を有するヒト化免疫グロ ブリンの生成に使用することができる。例えば、本発明のヒト化免疫グロブリン をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を、さらなる配列の操作または適当な宿主 細胞におけるコード化ポリペプチドの生成のために、適当な構築物（例えば、ベ クター）に組み込むことができる。α４β７インテグリンに対する特異性を有するヒト化免疫グロブリンの製造方法 本発明の別の側面は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト 化免疫グロブリンの調製方法に関する。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、例え ば、適当な宿主細胞でのα４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト 化免疫グロブリンをコードする１以上の組換え核酸の発現により得ることができ る。 また、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリ ンの発現に適する構築物または発現ベクターも提供される。構築物は、適当な宿 主細胞に導入することができ、本発明のヒト化免疫グロブリンを発現する細胞を 製造して培養で維持することができる。好適な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌（Ｂ ．スブチリス）およびまたは他の適当な細菌等の細菌細胞を含む原核細胞、真核 細胞、例えばカビ細胞や酵母細胞（例えば、ピチア パストリス、アスペルギル ス スピーシーズ、サッカロミセス セレビジエ、シゾサッカロミセス ポンベ 、ニューロスポラ クラッサ）または他の下等真核細胞、ならびに昆虫由来の細 胞（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞（国際公開第９４／２６０８７号パンフレット、オ コンノー(O'Connor)、１９９４年１１月２４日公開）または哺乳動物由来の細胞 （例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣 細胞（ＣＨＯ）、ＨｕＴ７８細胞、２９３細胞）等の高等真核細胞を挙げること ができる（例えば、アウスベル(Ausubel，F．M.)ら編、Current Protocols in M olecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc .，(1993)を参照のこと）。 α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンを産 生する宿主細胞は、以下のように製造できる。例えば、所望のヒト化免疫グロブ リンのコーディング配列の全部または一部をコードする核酸を、核酸ベクター、 例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レプリコン等のＤＮＡベク ターに挿入することができる。種々のベクターを利用することができ、それらに は単一コピーもしくは多コピーで維持されるベクターまたは宿主細胞染色体に組 込まれるベクターが含まれる。 好適な発現ベクターはいくつかの成分を含有でき、限定されないが、下記の１ 以上：複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現制御エレメント、例え ば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネータ ー）、および／または１以上の翻訳シグナル；膜標的化または分泌のシグナル配 列またはリーダー配列が挙げられる。構築物中、シグナル配列を、該ベクターま たは他の供給源により提供することができる。例えば、免疫グロブリンの転写お よび／または翻訳シグナルを用いて発現を指示することができる。 プロモーターは、適当な宿主細胞での発現用に提供されうる。プロモーターは 構成的であってもよいし、誘導性であってもよい。例えば、プロモーターがコー ドされているポリペプチドの発現を指示するように、ヒト化免疫グロブリンまた は免疫グロブリン鎖をコードする核酸に操作可能に連結することができる。原核 生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば、大腸菌にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主に適した種々のプロモーター（例え ば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ）を、利 用できる。 さらに、発現ベクターは通例、該ベクターを保有する宿主細胞を選択するため の選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合、起点または複製（ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含有する。抗生物質耐性ま たは薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、一般的な選択可能マーカー であり、原核細胞（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テト ラサイクリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）中および真核細胞（例えばネオマイシン（ Ｇ４１８またはゼネティシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、 またはハイグロマイシン耐性遺伝子）中で、使用してもよい。ジヒドロ葉酸レダ クターゼマーカー遺伝子は、メトトレキセートによる選択を、種々の宿主で可能 にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、 ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母における選択可能マーカーとしてしば しば使用される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター および宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルスベクターなどの ベクターの使用も予想される。また本発明は、これらの発現ベクターを保有する 細胞にも関する。 例えば、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブ リンの重鎖および軽鎖をコードする核酸（即ち、１以上の核酸）またはかかる１ もしくは複数の核酸を含有する構築物（即ち、１以上の構築物）は、１もしくは 複数の核酸が１以上の発現制御エレメントに操作可能に（例えば、ベクター中で 、細胞中でプロセッシングにより生成された構築物中で、宿主細胞ゲノムに組み 込まれて）結合されるように、選択した宿主細胞に適した方法（例えば、形質転 換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）で適当な宿主細胞 に導入することができる。宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導剤 、適切な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給物等を補足した好適な培地の存在 下で）維持され、それによりコードされている１もしくは複数のポリペプチドを 生成することができる。所望ならば、コードされた蛋白質（例えば、ヒト化Ａｃ ｔ−１抗体）は、（例えば、宿主細胞、培地、ミルク）から単離できる。この過 程は、トランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含する（例えば、国際公 開第９２／０３９１８号パンフレット、ゲンファーム インターナショナル、１ ９９２年３月１９日公開を参照のこと）。 ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、融合蛋白質のＮ末端位置、 Ｃ末端位置または中間で非免疫グロブリン部分（即ち、天然に見出されるような 免疫グロブリンには存在しない部分）に結合している融合蛋白質を生成すること ができる。例えば、いくつかの態様は、免疫グロブリン配列をコードする核酸の 適当な発現ベクター、例えば、ｐＥＴベクター（ｐＥＴ−１５ｂ）ノバージェン 等）、ファージベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ、ファルマシア等）または他 のベクター（ｐＲＩＴ２Ｔ プロテインＡ融合ベクター、ファルマシア等）への 挿入により生成されうる。得られた構築物を、発現に適した宿主細胞に導入する ことができる。発現後、適当なアフィニティーマトリックスを利用して、細胞溶 解液からいくつかの融合蛋白質を単離または精製できる（例えば、Current Prot ocols in Molecular Biology（アウスベル(Ausubel，F．M.)ら編、第２巻、補遺 26、16.4.1-16.7.8(1991)を参照のこと）。治療法と組成物 本発明は、（１）α４β７インテグリンをイン・ビトロおよび／またはイン・ ビボで結合でき；および／または、（２）α４β７インテグリンの活性または機 能、例えば、（ａ）結合機能（例えば、α４β７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ− １、フィブロネクチンおよび／またはＶＣＡＭ−１に結合する能力）および／ま たは（ｂ）組織における白血球の補給および／または蓄積を含む白血球浸潤機能 （例えば、腸粘膜組織へのリンパ球移動を阻害する能力）を調節することができ るヒト化免疫グロブリンを提供する。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、イ ン・ビトロおよび／またはイン・ビボで選択的にα４β７を結合し、α４β７媒 介相互作用を阻害することが可能である。１つの態様において、ヒト化免疫グロ ブリンは、α４β７インテグリンを結合し、α４β７インテグリンの１以上のそ のリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン）へ の結合を阻害することができ、それにより（組織における白血球の補給および／ または蓄積を含む）組織の白血球浸潤を好ましくは選択的に阻害する。かかるヒ ト化免疫グロブリンは、腸関連組織、リンパ節器官または白血球（特にＴ細胞ま たはＢ細胞のようなリンパ球）を含む粘膜組織で、α４β７インテグリンを産生 する細胞の血管内皮細胞への細胞接着をイン・ビトロおよび／またはイン・ビボ で阻害することができる。特に好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリン（ 例えば、Ａｃｔ−１）は、α４β７のＭＡｄＣＡＭ−１および／またはフィブロ ネクチンとの相互作用を阻害することができる。 本発明のヒト化免疫グロブリンは、研究、診断および治療法における適用を有 する様々な過程で有用である。例えば、それらは、α４β７インテグリンまたは その変異体を（例えば、アフィニティー精製または他の好適な方法により）検出 、単離および／または精製するため、ならびにα４β７インテグリン構造（例え ば、コンフォメーション）および機能を研究するために用いることができる。 また、本発明のヒト化免疫グロブリンは、診断適用（例えば、イン・ビトロ、 エクス・ビボ）または治療（予防を含む）適用におけるα４β７インテグリン機 能の調節にも使用されうる。 例えば、本発明のヒト化免疫グロブリンは、試料（例えば、炎症滲出物、血液 、血清、腸液、α４β７インテグリンを産生する細胞上などの組織または体液） 中のα４β７インテグリンのレベルを検出および／または測定するために使用す ることができる。例えば、試料（例えば、組織および／または体液）は、個体か ら得ることが可能であり、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイおよび免疫 組織学を含む酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の方法を含む適当な免 疫学的方法を用いて、α４β７インテグリン発現を検出および／または測定する ことができる。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンのα４β７インテグ リンへの特異的結合に適した条件下で、試料を本発明のヒト化免疫グロブリンと 接触させる工程および形成された抗体−α４β７インテグリン複合体を検出する 工程を含む、試料中の選択されたα４β７インテグリンの検出方法が提供される 。当該方法の適用において、ヒト化免疫グロブリンは、正常組織と炎症組織（例 えば、ヒト由来）とのα４β７インテグリン反応性および／または発現について （例えば、免疫組織学的に）分析し、ＩＢＤまたは他の状態とα４β７の発現増 加（例えば、冒された組織において）との関連を検出するために用いることがで きる。本発明のヒト化免疫グロブリンは、正常組織と炎症組織とでα４β７イン テグリンの存在の免疫学的評価方法を可能にし、それを通じて、疾患の存在、疾 患の進行および／または抗α４β７インテグリン療法の炎症性疾患における効力 を評価できる。 また、本発明のヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンの結合機能お よび／または白血球（例えば、リンパ球、単球）浸潤機能を調節するために用い られうる。例えば、α４β７インテグリンのリガンド（即ち、１以上のリガンド ）への結合を阻害するヒト化免疫グロブリンは、組織、特にＭＡｄＣＡＭ分子を 発現する組織の白血球（例えば、リンパ球、単球）浸潤（組織における白血球の 補給および／または蓄積を含む）に関連した疾患の治療における方法に従って投 与することができる。本発明のヒト化免疫グロブリン（即ち、１以上）の有効量 を、かかる疾患を治療するために個体（例えば、ヒトまたは他の霊長類のような 哺乳動物）に投与する。例えば、胃腸管（腸関連内皮を含む）、他の粘膜組織、 またはＭＡｄＣＡＭ分子を発現する組織（例えば、小腸および大腸の固有層の細 静脈のような腸関連組織；ならびに乳腺（例えば、泌乳性乳腺））の白血球浸潤 に関連する疾患を含む炎症性疾患は、本発明の方法に従って治療することができ る。同様に、ＭＡｄＣＡＭ分子を発現する細胞（例えば、内皮細胞）への白血球 の結合の結果としての組織の白血球浸潤に関連した疾患を有する個体を、本発明 の方法に従って治療することができる。 特に好ましい態様において、そのように治療できる疾患として、炎症性腸疾患 （ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎、腹腔疾患、非熱帯性ス プルー、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン性大 腸炎、好酸球性胃腸炎または直腸結腸切除術や回腸肛門吻合術後に起こる嚢炎が 含まれる。 膵炎とインシュリン依存性真性糖尿病は、本発明の方法を用いて治療できるそ の他の病気である。ＭＡｄＣＡＭ−１は、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスならび にＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬマウスの外分泌膵臓のいくつかの血管によっ て発現されると報告されている。ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、ＮＯＤマウスの膵 臓の炎症を起こした島の内皮上で誘導されると報告されており、ＭＡｄＣＡＭー １は、インスリン炎の初期段階にＮＯＤ島内皮によって発現される主要アドレシ ンであった（ハンニネン(Hanninen，A.)ら，J．Clin．Invest.，92:2509-2515(1 993)）。さらに、島内にはα４β７を発現するリンパ球の蓄積が観察され、ＭＡ ｄＣＡＭ−１は、炎症を起こした島由来の血管へのα４β７を介したリンパ腫細 胞の結合に関与していた（ハンニネンら，J．Clin．Invest.，92:2509-2515(199 3)）。 本発明の方法に従って治療できる粘膜組織関連炎症性疾患の例は、乳腺炎（乳 腺）、胆嚢炎、胆管炎または胆管周辺炎（胆管と肝臓周辺の組織）、慢性気管支 炎、慢性副鼻腔炎、喘息および（例えば、胃腸管における）対宿主性移植片病を 含む。クローン病に見られるように、炎症はしばしば粘膜表面を超えて広がるの で、間質性繊維症をもたらす肺の慢性炎症性疾患、例えば過敏性肺炎、コラーゲ ン病、類肉腫症および他の突発性疾患も治療できる。 ヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンのそのリガンドへの結合を阻 害する有効量で投与される。治療の場合、有効量とは、所望の治療（予防を含む ）効果を達成するに足る量（例えば、α４β７インテグリンが介在する結合およ び／またはシグナル伝達を軽減または妨げ、そうすることによって、白血球の接 着および浸潤および／または関連する細胞応答を阻害するに足る量）になるだろ う。ヒト化免疫グロブリンは、１回量または多数回量で投与することができる。 用量は、当該技術分野で公知の方法によって決定でき、例えば患者の年齢、感受 性、耐性および総合的健康状態などに依存することができる。抗体の好適な用量 としては、１処置あたり約０．１〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重であることができ る。 本発明の方法に従って、ヒト化免疫グロブリンは、単独でまたは別の薬剤と組 み合わせて個体（例えばヒト）に投与できる。ヒト化免疫グロブリンは、その助 剤投与の前、助剤投与と同時または助剤投与後に投与できる。１つの態様におい て、α４β７インテグリンのそのリガンドへの結合を阻害する１を越えるヒト化 免疫グロブリンを投与する。別の態様において、内皮リガンドへの白血球の結合 を阻害するモノクローナル抗体、例えば、抗ＭＡｄＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１ または抗ＩＣＡＭ−１抗体を、本発明のヒト化免疫グロブリンに追加して投与す る。さらに別の態様において、追加の薬学的に活性な成分（例えば、スルファサ ラジン、他の非ステロイド系抗炎症性化合物またはステロイド系抗炎症性化合物 のような抗炎症性化合物）を、本発明のヒト化免疫グロブリンと組み合わせて投 与することができる。 様々な投与経路が可能であり、治療対象の疾患または状態に応じて、非経口（ 静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射など）、経口（食餌法など）、 局所、吸入（気管支内吸入、鼻孔内吸入または経口吸入、鼻孔内滴剤など）また は直腸投与などが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるわけではない。非経 口投与が好ましい投与法である。 処方は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例えば液剤、乳剤）。投 与対象のヒト化免疫グロブリンを含有する適当な組成物を、生理学的に許容され うる賦形剤または担体中で調製することができる。液剤や乳剤の場合は、適当な 担体には、例えば塩水や緩衝媒体を含む水溶液、アルコール／水溶液、乳液また は懸濁液が含まれる。非経口用の賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデ キストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発 性油が含まれうる。静脈内用の賦形剤には、種々の添加物、保存剤、または液体 、栄養または電解物質補充剤が含まれうる（一般的には、Remington's Pharmace utical Sciences，第17版、Mack Publishing Co.，PA，1985を参照のこと）。 吸入法の場合は、化合物を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー（例えば、ア トマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾールディスペンサー）に充填する ことができる。実施例 以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例により なんら限定されるものではない。 実施例１に記載されるように、ネズミＡｃｔ−１抗体を精製し、該抗体の配列 分析を行なった。マウスＡｃｔ−１抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする ｃＤＮＡをＰＣＲクローニングし、シーケンスした。また、Ａｃｔ−１カッパ軽 鎖可変領域（Ｖ_L）のアミノ酸配列は、蛋白質のシーケンスにより決定し、Ｖ_L遺 伝子のＤＮＡ配列に由来したアミノ酸配列と正確に適合することがわかった。重 鎖可変領域（Ｖ_H）のアミノ酸配列の大部分は、蛋白質のシーケンスにより決定 され、この配列もＶ_H遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸と適合する。 これらの結果により、ハイブリドーマ細胞株から正しいマウスＡｃｔ−１可変領 域がクローニングされたことが示される。正しい配列がクローニングされたこと を確認した機能的なキメラＡｃｔ−１抗体が生成された。特に、マウスＡｃｔ− １軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒトカッパ軽鎖およびヒトガ ンマ−１もしくはガンマ−４重鎖定常領域それぞれに結合させた。また、キメラ 抗体を、ヒト化Ａｃｔ−１ ｍＡｂ（再形成Ａｃｔ−１ ｍＡｂ ＬＤＰ−０２ ）との比較分析に用いた。 α４β７インテグリンとよく結合するヒト化Ａｃｔ−１抗体を作製するために 、再形成ヒト可変領域を設計した（実施例２）。設計過程において補助するため に、マウスＡｃｔ−１可変領域の分子モデルを作った。ネズミＡｃｔ−１抗体の 領域は、抗原への結合に直接関与し、相補性決定領域すなわちＣＤＲは、選択さ れた可変領域内に接ぎ合わされた。ヒト可変領域の枠組み領域（ＦＲ）内の位置 でのいくつかのアミノ酸変化がなされた。再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域は、元 のヒト残基が対応するネズミ残基にそれぞれ変化している、選択されたヒト軽鎖 可変領域のＦＲ中の１つのアミノ酸変化および選択されたヒト重鎖可変領域のＦ Ｒ中の５つのアミノ酸変化を含んでいた。 実施例３に記載されるように、これらの再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域をコー ドするＤＮＡ配列を構築し、ヒト定常領域をコードするＤＮＡ配列に結合させ、 得られた核酸を用いてヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンを生成させた。ヒト化Ａ ｃｔ−１抗体を、哺乳動物細胞で発現させ（実施例３）、マウスＡｃｔ−１抗体 と比較してヒトα４β７インテグリンへの結合を試験した（実施例４）。表５に 示すように、ヒト化Ａｃｔ−１抗体は、ネズミＡｃｔ−１により認識されるエピ トープに対する特異性を保持し、天然のネズミ抗体と比較して予期しない改良さ れた結合アフィニティーを示した。 ヒト化Ａｃｔ−１抗体のいくつかの変異体は、設計過程で同定された（実施例 ２および５）。例えば、以下の位置の１以上での追加の変化がなされうる：軽鎖 変異体Ｍ４Ｖ（４位でのＭｅｔ→Ｖａｌ変異）、重鎖変異体Ｒ３８Ｋ（３８位で のＡｒｇ→Ｌｙｓ変異）、重鎖変異体Ａ４０Ｒ（４０位でのＡｌａ→Ａｒｇ変異 ）。さらに、７３位をヒトスレオニン残基に復帰させる重鎖変異体Ｉ７３Ｔ（７ ３位でのＩｌｅ→Ｔｈｒ復帰突然変異）がヒト枠組み領域中のこの位置で見られ た。一本鎖でのこれらの変化の１以上の導入または１を越える鎖でのこれらの変 化の種々の組合せがなされうる。実施例１ Ａｃｔ−１ Ｖ_HおよびＶ_L領域のクローニングならびにネズミ−ヒ トＡｃｔ−１キメラ免疫グロブリンの構築と発現 Ａｃｔ−１ Ｖ_HおよびＶ_L領域のクローニング ＲＮＡは、製造業者の示したプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬(Gibco/B RL)を用いて、Ａｃｔ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞か ら得た（ラザロビッツら、J．Immunol．133(4):1857-1862(1984);ラザロビッツ とコルビン(R．B．Colvin)により供与された）。 転写された重鎖および軽鎖可変領域は、製造業者の示したプロトコールに従っ てＩｇ−Ｐｒｉｍｅキット(Novagen)を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） により増幅した。要約すると、１．５μｇの全ＲＮＡを、２．０μｌの５Ｘ Ｍ ＭＬＶ緩衝液（５Ｘ＝２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、２５℃でｐＨ８．３、３ ７５ｍＭ ＫＣ１、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、１．０μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ （ジチオスレイトール）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．５μｌのオリゴｄＴ（１μ ｇ／μｌ）、０．２５μｌのアセチル化ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）、１．０μｌの 適当なＩｇ−３’プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭＭＬＶ逆 転写酵素（２００ユニット／μｌ）および１０μｌの全容量まで添加したＲＮア ーゼ不含有水を含む反応で、ｃＤＮＡに逆転写した。混合物を３７℃で５分間、 ４２℃で３０分間および９９℃で５分間インキュベートした。各Ｉｇ−３’プラ イマーを別々の反応に用いた。 可変領域は、製造業者のプロトコールに従って、逆転写した材料から増幅した 。要約すると、８μｌの逆転写した材料を、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５ μｌの１０Ｘ反応緩衝液（１０Ｘ＝１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐ Ｈ８．８、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、２．５μｌのＩｇ−５’リーダープライマー（１０ｐｍｏｌ／μ ｌ）（各Ｉｇ−５’プライマーを別々のＰＣＲ反応に用いた）、０．２５μｌ（ よび５０μｌの全容量までの水と混合した。 ５’プライマーＭｕＩｇＶ_H５’−Ａ、ＭｕＩｇＶ_H５’−Ｂ、ＭｕＩｇκＶ_L ５’−ＡおよびＭｕＩｇκＶ_L５’−Ｂとの増幅に関して、サイクルパラメータ ーは、１分、９４℃；１分、５０℃；２分、７２℃の３５サイクル後７２℃で最 後の６分の伸長であった。アニーリング温度を６０℃に上げたことを除いて、他 のすべての５’プライマーについて同じ反応条件を用いた。 重鎖可変領域は、３’プライマーとしてＭｕＩｇＧＶ_H３’−２またはＭｕｌ ｇＭＶ_H３’−１のいずれか、および５’プライマーとしてＭｕＩｇＶ_H５’−Ｂ またはＭｕＩｇＶ_H５’−Ｅのいずれかを用いて増幅が成功した。軽鎖可変領域 は、３’プライマーとしてＭｕＩｇＫＶ_L３’−１および５’プライマーとして ＭＵＩｇκＶ_L５’−Ｇを用いて増幅が成功した。 これらのプライマーの配列は、以下のようであった： 増幅した断片をアガロースゲルで精製し、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキットとともに提 供されたｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクター(Novagen)にライゲートし、ライゲーショ ン混合物を用いて、製造業者のプロトコールに従って、該キットとともに提供さ れたＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞を形質転換した。 適当なサイズのインサートを含む白色コロニーを、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの ポリクローニングサイトのすぐ外側のインサートの反対側でアニールするＴ７プ ロモータープライマーおよびＵ−１９マープライマーを用いてシーケンスした。 シーケンスは、製造業者の推奨したプロトコールに従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅＴ ７ＤＮＡポリメラーゼキット(USB/Amersham Life Science)を用いてミニプレッ プＤＮＡで行なった。 いくつかの独立した重鎖可変領域クローン由来のコンセンサスＤＮＡ配列(配 列番号：１)および推定アミノ酸配列(配列番号：２)を図１に示す。縮重プライ マーは、配列においてある縮重へ導いた。開始コドンは、ヌクレオチド１３〜１ ５によりコードされるＭｅｔであり、予想されるリーダーペプチダーゼ切断部位 は、ヌクレオチド６７〜６９によりコードされるＳｅｒとヌクレオチド７０〜７ ２によりコードされるＧｌｎとの間（ヌクレオチド１３〜６９はリーダーペプチ ドをコードする）である。残基４３３〜４３５によりコードされるアラニンで始 まるネズミ定常領域の部分を示す。 いくつかの独立した軽鎖可変領域クローンのＤＮＡ配列（配列番号：５）およ びアミノ酸配列（配列番号：６）を図３に示す。重鎖可変領域とは異なり、増幅 した配列は縮重していなく、おそらく、使用したプライマーがあまり縮重してい なく、可変領域が単一のプライマー対のみから増幅されたためであろう。 キメラ重鎖遺伝子の構築 キメラマウス−ヒト重鎖遺伝子をコードする遺伝子を作製した。ヒト重鎖定常 領域の供給源は、野生型ヒトガンマ１（γ１）定常領域を含むクローン（ヘルマ ン ウォルトマン（Herman Waldman）博士（オックスフォード大学）から得た） であり；構築物は、ｐＥＥ６発現ベクター(Celltech)中にヒト化抗ＣＤ１８重鎖 遺伝子を含有する３８１８と称した。定常領域は、その教示がそのまま参照によ り本明細書に取り込まれる、シムズ(Sims，M．J.)ら、J．Immunol.，151(4):２2 96-2308（1993）および１９９３年２月４日に公開された国際公開第９３／０２ １９１号パンフレットに記載のようにｐＥＥ６．ｈＣＭＶにクローニングされた ヒト化ＣＤ１８重鎖遺伝子の定常領域と一致する。ヒト化抗ＣＤ１８抗体の重鎖 可変領域および定常領域（野生型ガンマ１）をコードする配列は、ＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩとの消化により発現ベクターから放出された。重鎖遺伝子を含む１ ．４２１ｂｐ断片を回収し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM（Stratagene）のＨｉｎｄ IIIおよびＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＲ−ＣＤ１８Ｈと称する プラスミドを得た。ＳｐｅＩ制限部位は、抗ＣＤ１８重鎖遺伝子の可変領域と定 常領域との間のジャンクションに位置する。ｐＣＲ−ＣＤ１８ＨをＨｉｎｄIII とＳｐｅＩで消化して、重鎖可変領域を放出させた。この可変領域を、以下のよ うに、縮重したマウスＡｃｔ−１可変領域と置換した。 新規な制限部位を取り込むために２つのプライマーを合成した。これらのプラ イマーは：であった。太字の活字は、鋳型配列と異なるプライマー中のヌクレオチドを示す 。図２に示したヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番 号：４）を有するＨ２Ｂ＃３４と称する独立したマウスＡｃｔ−１重鎖クローン を鋳型として、前記５’および３’プライマーとともに用いて、開始コドンの５ ’側ＨｉｎｄIII部位とＪ領域のちょうど３’側のＳｐｅＩ部位を同時に導入す るマウス可変領域を増幅させた。ＰＣＲ断片をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMに直接サ ブクローニングしてプラスミドｐＣＲ−ｍＡＣＴ１ＨＶを生じさせ、正しい配列 を確認した。次いで、ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩとの消化によりｐＣＲ−ｍＡＣＴ １ＨＶから断片を放出させて、抗ＣＤ１８可変領域の代わりにｐＣＲ−ＣＤ１８ ＨのＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩ部位に挿入し、ｐＣＲ−ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉ を得た。次いで、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩでｐＣＲ−ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉか らキメラ重鎖（マウスＡｃｔ−１可変＋ヒトガンマ１定常）遺伝子を放出させ、 ｈＣＭＶプロモーターを含有するｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂベクターに戻しクローニ ングし、ｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉと称する構築物を得た。 キメラ軽鎖遺伝子の構築 キメラマウス−ヒト軽鎖遺伝子は、重鎖に関するものと同様な様式で構築した 。しかしながら、キメラ軽鎖の場合、新規な制限部位Ｋａｓ１は、ＫＧ＃８７と 称するマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域クローンの１つを鋳型として用いる可変領 域断片のＰＣＲ増幅、およびヒト化抗ＣＤ１８カッパ軽鎖遺伝子を含む構築物（ ヘルマン ウォルトマン博士（オックスフォード大学）から得た；ｐＥＥ１２発 現ベクター中にヒト化抗ＣＤ１８軽鎖を含む３８１９と称する構築物）を鋳型と して用いるカッパ軽鎖定常領域のＰＣＲ増幅により構築物内で工作した。定常領 域は、シムズ(Sims，M．J.)ら、J．Immunol.，151(4):2296-2308（1993）および １９９３年２月４日に公開された国際公開第９３／０２１９１号パンフレットに 記載のようにｐＥＥ１２にクローニングされたヒト化ＣＤ１８軽鎖遺伝子の定常 領域と一致する。 可変領域に対するプライマーは： であった。太字の活字は、鋳型中のヌクレオチドとは異なるプライマー中のヌク レオチドを示す。Ｋａｓ１部位を創出させるためのコーディング領域内の２個の ヌクレオチドの変化、図３の４２３位でＴ→Ｇおよび４２６位でＡ→Ｇはサイレ ントであり、アミノ酸配列は変化しなかった。 カッパ定常領域に対するプライマーは： であった。 軽鎖可変領域および定常領域を、それぞれの鋳型とプライマーを用いて別々に 増幅し、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMに別々にサブクローニングして配 列を確認した。次いで、各断片をＨｉｎｄIIIとＫａｓＩとの消化により該ベク ターから放出させ、ゲルで精製して、ＨｉｎｄIII消化によりヒト化抗ＣＤ１８ 軽鎖遺伝子をすでに除去しておいた３８１９ ｐＥＥ１２発現ベクターのＨｉｎ ｄIII部位にトリプルライゲートした。得られた構築物をｐＥＥ１２ｍｈＡＣＴ １Ｌｃｈｉと称する。 キメラ免疫グロブリンの発現 キメラ重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現ベクターの構築のために、全重 鎖遺伝子とＣＭＶプロモーターを、ＢｇｌIIとＢａｍＨＩとの消化によりｐＥＥ ６発現ベクター（ｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉ）から放出させた。次いで、こ の断片を、ｐＥＥ１２軽鎖遺伝子発現ベクター（ｐＥＥ１２ｍｈＡＣＴ１Ｌｃｈ ｉ）のＢａｍＨＩ部位にライゲートし、それぞれが別のＣＭＶプロモーターの転 写制御下にあるキメラ軽鎖遺伝子およびキメラ重鎖遺伝子を両方とも含むｐＥＥ １２ｍｈＬＨｃｈｉと称する１つのプラスミドが生成した。 ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２発現ベクターならびにＣｅｌｌｔｅｃ ｈ グルタミン シンセターゼ ジーン アンプリフィケーション システムは 、以前に記載されている（例えば、その教示がそれぞれ、そのまま参照により本 明細書に取り込まれる国際公開第８６／０５８０７号パンフレット（Celltech） 、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット（Celltech）、国際公開第８９／ ０１０３６号パンフレット（Celltech）、欧州特許第０ ３２３ ９９７ Ｂ１ 号明細書（Celltech）および国際公開第８９／１０４０４号パンフレット（Cell tech）を参照のこと）。 キメラ抗体の一過性の発現のために、２０μｇのｐＥＥ１２ｍｈＬＨｃｈｉを 、以下のようにエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞（アメリカンタイ プカルチャーコレクション、パークローンドライブ１２３０１、ロックビル、Ｍ Ｄ、２０８５２）にトランスフェクトした。対数増殖期で生育しているＣＯＳ− ７細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡでの処理により組織培養フラスコから採集した 。該細胞をリン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）で１回、ハンクのバランス塩溶液（ＨＢ ＳＳ）で１回洗浄し、１ｍｌのＨＢＳＳ当たり１．５ｘ１０⁷個の細胞濃度で再 懸濁させた。０．８ｍｌのＨＢＳＳ中１．２ｘ１０⁷個の細胞を２０μｇのプラ スミドＤＮＡと混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ 細胞混合物を０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移し、Ｂｉｏ− Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いて２５０Ｖ、９６０μＦで電流を適応した 。エレクトロポレーション後室温で１０分間のインキュベーション後、該細胞を ２０ｍｌの培養培地（ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ＦＣ Ｓ）に移し、１６２ｃｍ²の組織培養フラスコ(Costar)で培養した。５日後、細 胞培養上清を集め、α４β７インテグリンを発現するＨｕＴ７８細胞を染色する 能力を試験した。ＨｕＴ７８細胞（ヒトＴリンパ腫細胞株）は、アメリカンタイ プカルチャーコレクション、パークローンドライブ１２３０１、ロックビル、Ｍ Ｄ、２０８５２のアクセッション番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ １６１から利用するこ とができる。 １００μｌの一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞培養上清、モック トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞上清、精製したネズミＡｃｔ−１抗体（１ ０μｇ／ｍｌ）またはそれぞれマウスに対する精製した無関係アイソタイプ適合 対照抗体（マウスＩｇＧ１、カッパ（ＭＯＰＣ２１）、Sigma製の１０μｇ／ｍ ｌ）およびヒトに対する精製した無関係アイソタイプ適合対照抗体（ヒトＩｇＧ １、カッパ、Sigma製の１０μｇ／ｍｌ）を、１ｘ１０⁵個のＨｕＴ７８細胞と氷 上で３０分間インキュベートした。該細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およ び０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳからなる緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液） を氷冷したもので２回洗浄した。次いで、該細胞を適切な蛍光二次抗体（フルオ レッセイン（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ヤギ抗 マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Jackson ImmunoResearch)またはフルオレッセイン（Ｆ ＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ ＋Ｌ）(Jackson ImmunoResearch)のいずれか）とともに氷上で３０分間インキュ ベートした。氷上で３０分後、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、３００ｍ ｌの同じ緩衝液に再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓｃａ ｎでフローサイトメトリーにより分析した。図４Ａは、マウスアイソタイプ適合 無関係対照抗体、ＭＯＰＣ２１（ＩｇＧ１、カッパ）と比較したネズミＡｃｔ− １ ｍＡｂの染色を示す。図４Ｂは、ヒトアイソタイプ適合無関係対照抗体（ ＩｇＧ１、カッパ）およびモックトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞上清と比 較したＨｕＴ７８細胞のキメラＡｃｔ−１抗体の染色を示す。したがって、ネズ ミＡｃｔ−１抗体により生じた染色と比較して、キメラ抗体は同様にＨｕＴ７８ 細胞を染色した。まとめると、これらのデータは、マウスＡｃｔ−１可変領域に 関して適切な配列をうまくクローン化し、かつ、発現したことを示す。 アミノ酸配列分析 アミノ酸配列分析を、精製したネズミＡｃｔ−１重鎖および軽鎖で行ない、ハ イブリドーマから単離された軽鎖および重鎖可変領域のｃＤＮＡの同一性を確認 した。これは、軽鎖に関しては以下のように達成された： ネズミＡｃｔ−１（５ｍｇ／ｍｌ）を、窒素雰囲気下、０．３Ｍ ホウ酸ナト リウム、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム中、３７℃で２時間、２ｍＭ ＤＴＴで還 元した。次いで、該溶液をヨードアセトアミドで１０ｍＭにし、室温で４時間イ ンキュベートした。非変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、蛋白質が定 量的に還元されていることを確認した。次いで、該蛋白質溶液をＰＢＳで大量に 透析し、アリコートをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（１６／６０、Pharmacla ）に適用した（操作１）。重鎖および軽鎖は、排除容量のそれに対応する溶出容 量でこのカラムから共溶出し、このことは、２つの鎖がまだ共に保持されている ことを示唆する。次いで、新たなアリコートを８Ｍ尿素処理し、変性条件下（６ Ｍ尿素）でｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムにかけた（操作２）。両鎖は、おそら くフォールディングされないことにより、ボイドボリュームに再び共溶出した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、２つのゲル濾過操作から溶出された２つの試料に 両鎖が存在することを確認した。これらの試料を、Ｎ末端配列分析(Commonwealt h Biotechnologies，Inc.)に供し、以下の結果を得た： 試料２：ＤＶＶＶＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＦＤＧＱＶ（配列番号：４７） 試料１：ＤＶＶＶＴＱＴＰＬＳＬ（配列番号：４８） 得られた配列は、ＤＮＡ配列から推定された成熟軽鎖のＮ末端に対応するもの である。重鎖の配列を得るためのこの試行および他の試行により、そのＮ末端が ブロックされているようであることが示唆された。したがって、内部ペプチド断 片のアミノ酸配列分析を重鎖について行なった。 内部アミノ酸シーケンスを単純化するために、ペプシンでの切断により抗体か らＦ（ａｂ）’２断片を生成させた。ネズミＡｃｔ−１を、０．１Ｍクエン酸ナ トリウム、ｐＨ３．０中、抗体：ペプシンが１：２００の割合でペプシンにより ３７℃で２時間切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で評価したように、反応は完全 であった。次いで、蛋白質をプロテインＧおよびプロテインＡカラムを通して精 製した。次いで、前記したように、試料を還元してアルキル化し、調製用ＳＤＳ −ＰＡＧＥ（１５％）により重鎖断片を軽鎖断片から分離した。重鎖断片を切り 出し、ランニング緩衝液を有する１ｍｌの０．１％ＳＤＳに２時間電気溶出させ た。この試料を、２ｎｇのＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼで３０分間切断し、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７．５％）により断片を分離した。消化産物は、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＳに一晩受動溶出させ、Ｎ末端配列分 析(Commonwealth Biotechnologies，Inc.)に供した。 １７Ｋｄａ断片から得られた配列は、ＤＹＡＩＤＹＷＧ（配列番号：４９）で あり、これは、重鎖のクローンに存在していた（図１；配列ＡＩＤＹはＪＨ４領 域の開始部位に対応する）。実施例２ マウスＡｃｔ−１可変領域の分子モデル化 ＣＤＲを接ぎ合わせた可変領域の設計を補助するために、マウスＡｃｔ−１可 変領域の分子モデルを作製した。よくキャラクタライズされた蛋白質ファミリー の構造を免疫グロブリンでモデル化することは、ホモロジーによるモデル化に関 して確立された方法を用いて行なった。分子モデル化は、ＵＮＩＸオペレーティ ングシステム、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡ（Polygen Corp.，Walth am，MA）および解明された蛋白質構造のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ結晶学データベー ス下で稼働するＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ＩＲＩＳ ４Ｄワークステ ーションを用いて行なった。第１工程として、新規可変領域の枠組み領域（ＦＲ ）を、類似の構造的に解明された免疫グロブリン可変領域由来のＦＲでモデル化 した。同一のアミノ酸側鎖は、それらの元の方向で保持されていたが、変異した 側鎖は、元のマウスＡｃｔ−１抗体と同様なカイ（ｃｈｉ）アングルを維持する ように最大重複法を用いて置換された。新規可変領域のＣＤＲの大部分は、ＣＤ Ｒに関する標準構造に基づいてモデル化された(ショチア(Chothia，C.)とレスク (A．M．Lesk)、J．Mol．Biol．196:901-917(1987);ショチアら、Nature 342:877 -883(1989);トラモンタノ(Tramontano，A.)ら、J．Mol．Biol．215:175-182(199 0);ショチアら、J．Mol．Biol．227:799-817(1992))。公知の標準構造がない重 鎖可変領域のＣＤＲ３のような場合、ＣＤＲループは、いかなる構造的に解明さ れた蛋白質にも存在する類似のループ構造に基づいてモデル化した。最後に、好 ましくない原子の接触を軽減し、ファンデルワールスおよび静電的相互作用を最 適化させるために、該モデルをＱＵＡＮＴＡで実行したようなＣＨＡＲＭｍポテ ンシャル（ブルックス（Brooks，B．R.)、J．Comp．Chem．4:187-217(1983)）を 用いるエネルギ一極小化に供した。 マウスＡｃｔ−１可変領域に関して、軽鎖可変領域由来のＦＲは、マウスモノ クローナル抗体４−４−２０（ヘロン(Herron，J．N.)ら、Proteins．Structure ，Function and Genetics 5:271-280(1989)）のＦａｂ断片由来のＦＲでモデル 化した。重鎖可変領域由来のＦＲは、マウスモノクローナル抗体Ｄ１１．１５（ キターラ(Chitarra，V.)ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 90:7711-7715(1993) ）のＦａｂ断片由来のＦＲでモデル化した。マウスＡｃｔ−１抗体とモデルの基 礎となった可変領域との間で異なるこれらのアミノ酸側鎖を置換した。次いで、 ２つの異質可変領域（即ち、４−４−２０に基づくカッパ軽鎖可変領域およびＤ １１．１５に基づく重鎖可変領域）を互いの観点から正しい方向に置換する ために、Ｆａｂ４−４−２０抗体の軽鎖を、（カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequ ences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒト サービス省、米国政府印刷局(1991)により規定されたように）残基３５〜３９、 ４３〜４７、８４〜８８および９８〜１０２の空間で整列させることによりＤ１ １．１５の軽鎖上に重ね合わせた。 ｍＡｂ Ａｃｔ−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｌ１）は、ショチアら、Natu re 342:877-883(1989)により提唱されたように、Ｌ１標準サブグループ４に適合 した。マウスＦａｂ４−４−２０（前記参照のこと）のＬ１ループは、アミノ酸 の長さが同一であり、アミノ酸配列が類似し、さらに標準サブグループ４にも適 合した。その結果として、該Ｌ１ループは、Ｆａｂ４−４−２０のＬ１ループで モデル化された。同様に、ｍＡｂ Ａｃｔ−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｌ２ ）およびＣＤＲ３（Ｌ３）は、それぞれの標準サブグループ１ループ構造および Ｆａｂ４−４−２０の対応するＣＤＲの両方に適合した。したがって、Ａｃｔ− １カッパ軽鎖可変領域のＬ２およびＬ３ループは、Ｆａｂ４−４−２０のＣＤＲ Ｌ２およびＬ３でモデル化された。 ｍＡｂ Ａｃｔ−１の重鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｈ１）は、マウス ｍＡｂＤ １１．１５（前記を参照のこと）の対応するＨ１ループと同様に、ショチアら、 Nature 342:877-883(1989)により規定されたように、Ｈ１標準サブグループ１に 適合した。さらに、ｍＡｂ Ｄ１１．１５ ＣＤＲ１ループは、ｍＡｂ Ａｃｔ −１のＨ１と長さが同一であり、アミノ酸配列が非常に類似していた。その結果 として、軽鎖と同様に、このループは、該モデルの基礎となった重鎖可変領域の ＣＤＲ１ループでモデル化された。重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｈ２）を規定する のはより困難であったが、Ｈ２標準サブグループ２に対応するように思われた。 また、Ｄ１１．１５抗体のＨ２ループも同一の標準サブグループに適合し、アミ ノ酸配列が非常に類似していたので、ｍＡｂ Ａｃｔ−１のＨ２ループは、Ｄ１ １．１５のＨ２ループでモデル化された。 前記考察したように、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、高度に変化しており、同定 可能な構造グループに分類することができない。Ｈ３ループをモデル化するため には、同一の長さと類似のアミノ酸配列のループ−好ましくは別の抗体由来−が 同定され、ループのモデル化の基礎として用いられる。ループサイズに関してＡ ｃｔ−１のＣＤＲ３に適合する、３種の抗体由来のすべてがＨ３ループである３ つのループが存在した。立体的不一致についてすべての３つのループ構造をモデ ルで試験した後、ヒト抗体ｐｏｔ(ファン(Fan，Z．C.)ら、J．Mol．Biol．228:1 88-207(1992))由来のＨ３ループが選ばれ、ｍＡｂ Ａｃｔ−１のＨ３ループを モデル化した。自明な立体的不一致についてモデルの全体を調整した後、該モデ ルをＱＵＡＮＴＡで実行したように、エネルギー極小化に供した。 ＣＤＲ接合可変領域の設計 ＣＤＲを接ぎ合わせた可変領域の設計における第１工程は、ヒト化可変領域の 基礎として役立つヒト軽鎖および重鎖可変領域の選択である。ヒト可変領域の選 択に関する２つのアプローチを試験して比較した。１つのアプローチでは、ヒト 可変領域をヒト可変領域の異なるサブグループに対するコンセンサス配列から選 択した（カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局(1991)） 。齧歯類軽鎖および重鎖可変領域を、ヒトコンセンサス配列と比較し、最も類似 したヒト軽鎖および重鎖コンセンサス配列を、ヒトラムダ軽鎖可変領域の６つの サブグループ、ヒトカッパ軽鎖可変領域の４つのサブグループおよびヒト重鎖可 変領域の３つのサブグループの中から選択した（ケトルボロー、Protein Engine ering 4:773-783（1991）を参照のこと）。別のアプローチでは、ヒト可変領域 をヒト可変領域に関するすべての公開された配列から選択した（カバット(Kabat ，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米 国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局(1991)）。齧歯類軽鎖および重鎖 可変領域のアミノ酸配列を、ヒト配列と比較し、齧歯類可変領域と高い程度の類 似性を有するヒト可変領域を選択した。同一のヒト抗体に由来するヒト軽鎖およ び重鎖可変領域は、２つの可変領域が適切に集合するということを確実にするた めに用いることができる（クィーン(Queen，C.)ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，U SA 86:10029-10033(1989)）。しかしながら、本明細書に記載されるように、鋳 型として選択されたヒト軽鎖および重鎖可変領域は、２つの異なるヒト抗体に由 来するものであった。このようにして、齧歯類可変領域に高い程度の類似性を有 するヒト可変領域を選択することが可能であった。２つの異なるヒト抗体に由来 する可変領域に基づくＣＤＲを接ぎ合わせた抗体の多くの成功例がある。最もよ く研究された例の１つは、再形成されたヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体である（リ ーヒマン(Riechmann，L.)ら、Nature322:323-327(1988)）。 再形成ヒトＡＣＴ−１可変領域を設計するために、マウスＡＣＴ−１可変領域 を、マウスおよびヒト可変領域のすべてのサブグループに関するコンセンサス配 列と比較した（カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immuno logical Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局(1 991)）。その結果を表１および２に要約する。 マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、全体で８３．９％の同一性およびＦＲのみ 内で８７．５％の同一性を有し、マウスカッパ軽鎖サブグループIIのコンセンサ ス配列と最も類似していた（表１）。ヒト抗体配列の観点から、マウスＡｃｔ− １軽鎖可変領域は、全体で７２．３％の同一性およびＦＲのみ内で７８．８％の 同一性を有し、ヒトカッパ軽鎖サブグループIIのコンセンサス配列と最も類似し ていた（表１）。 表１．マウスＡｃｔ−１カッパ軽鎖可変領域とマウスおよびヒトカッパ軽鎖可変 領域のサブグループのコンセンサス配列との比較。 ＣＤＲ配列を有するおよび有しないマウスＡｃｔ−１カッパ軽鎖可変領域のアミ ノ酸配列は、ＣＤＲ配列を有するおよび有しないマウスならびにヒトカッパ軽鎖 可変領域の異なるサブグループのコンセンサス配列と比較した。最も類似したマ ウスおよびヒトサブグループのパーセント類似性および同一性を掲載する。 マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域は、全体で８３．５％の同一性およびＦＲのみ 内で９４．３％の同一性を有し、マウス重鎖サブグループIIＢのコンセンサス配 列と最も類似していた（表２）。ヒト抗体配列の観点から、マウスＡｃｔ−１重 鎖可変領域は、全体で６８．６％の同一性およびＦＲのみ内で７５．９％の同一 性を有し、ヒト重鎖サブグループＩのコンセンサス配列と最も類似していた（表 ２）。これらの結果により、マウスＡｃｔ−１可変領域がマウス可変領域の典型 例のようであることが確認される。また、この結果は、ヒト可変領域鋳型または ＣＤＲ接合用受容体のよい供給源として役立ちうるヒト可変領域のサブグループ を示唆する。 表２．マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域とマウスおよびヒト重鎖可変領域のサブグ ループのコンセンサス配列との比較。 ＣＤＲ配列を有するおよび有しないマウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のアミノ酸配 列は、ＣＤＲ配列を有するおよび有しないマウスならびにヒト重鎖可変領域の異 なるサブグループのコンセンサス配列と比較した。最も類似したマウスおよびヒ トサブグループのパーセント類似性および同一性を掲載する。 また、マウスＡｃｔ−１可変領域は、マウスおよびヒト可変領域の記録された すべての例の個々の配列とも比較した(カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequences o f Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国 政府印刷局(1991);UW GCGパッケージ(ウイスコンシン大学))。ヒト抗体配列に関 して、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、ヒト抗体ＧＭ６０７’ＣＬ（クロベッ ク(Klobeck，H.-G.)ら、Nature 309:73-76(1984))由来のヒトカッパ軽鎖可変領 域の配列と非常に類似していた。図５は、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域のアミ ノ酸配列（配列番号：７）およひヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域のアミノ酸 配列（配列番号：８）のアラインメントを示す。予想されたように、ヒトＧＭ６ ０７’ＣＬの軽鎖可変領域は、ヒトカッパ軽鎖可変領域のサブグループIIのメン バーである。マウスＡｃｔ−１およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域間の全 体の配列同一性は、７１．４％であると計算された。マウスＡｃｔ−１重鎖可変 領域は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬ(デルシモニアン(Dersimonian，H.)ら、J．I mmunol．139:2496-2501(1987))由来のヒト重鎖可変領域の配列と非常に類似して いた。図６は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）お よびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１０）のア ラインメントを示す。予想されたように、ヒト２１／２８’ＣＬの重鎖可変領域 は、ヒト重鎖可変領域のサブグループＩのメンバーである。マウスＡｃｔ−１お よびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域間の全体の配列同一性は 、６８．１％であると計算された。これらの比較に基づき、ヒトＧＭ６０７’Ｃ Ｌ軽鎖可変領域を、再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域の設計に関するヒト鋳型 として選択し、ヒト２１／２８’ＣＬの重鎖可変領域を、再形成ヒトＡｃｔ−１ 重鎖可変領域の設計に関するヒト鋳型として選択した。 設計過程の第２の工程は、選択されたヒト軽鎖および重鎖可変領域に齧歯類Ｃ ＤＲを挿入することであった。カバット(Kabat，E．A.)ら、Sequences of Prote ins of Immunologiacal Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印 刷局(1991))により規定されたように、齧歯類ＣＤＲ全体をヒトＦＲに結合して 単純なＣＤＲ接合部を作製した。いくつかの場合において、単純なＣＤＲ接合で ヒト化される齧歯類抗体は、抗原に対してほとんどまたは全く結合を示さないで あろう。これらのアミノ酸残基のいずれが、抗原との相互作用を介して直接的に またはＣＤＲループの配置を変化させることにより間接的に、抗原への結合に反 する影響を及ぼすと考えられるかどうかを決定するために、ヒトＦＲのアミノ酸 配列を研究することが重要である。 第３の工程において、ヒトＦＲのアミノ酸残基を抗原への良好な結合を達成す るために変えるべきかに関する決定がされた。この段階で、齧歯類可変領域のモ デルが設計過程において最も有用になる。また、ショチアら、Nature 342:877-8 83(1989)により規定されたように、ＣＤＲの標準構造も有用である。該標準構造 の一部である齧歯類アミノ酸残基のいずれかをヒト化可変領域中に保存すること が重要である。ある位置のアミノ酸が異常であるかまれであるかを決定するため には、ヒト化対象の齧歯類抗体の配列を他の齧歯類抗体由来の類似の配列と比較 することが役に立つ。これは、その位置での齧歯類アミノ酸が抗原結合に重要な 役割を有することを示唆するであろう。齧歯類可変領域のモデルを研究すること により、特定の位置のアミノ酸が抗原結合に影響を及ぼしうるか否かを予想する ことが可能である。個々のヒト抗体由来のヒト可変領域を設計の基礎として用い られつつあるとき、そのときは、個々のヒト配列をヒト可変領域のそのサブグ ループのコンセンサス配列と比較することが望ましい。特に異常なアミノ酸はい ずれも注意すべきである。ほとんどの場合、ヒト可変領域中のその位置に存在す るアミノ酸から齧歯類可変領域中のその位置に存在するアミノ酸に変えるべきヒ トＦＲにおけるいくつかのアミノ酸が同定される。 表３および４は、再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域がどのように設計されたかを 要約する。表３は、再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_L領域の設計に用いたア ミノ酸配列のアラインメントであり、４列にはヒト化対象のマウスＡｃｔ−１軽 鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：７）、５列（マウスκ−II）にはマウス Ａｃｔ−１可変領域が属するマウス可変領域のサブグループに関するコンセンサ ス配列（配列番号：５０）、６列（ヒトκ−II）にはマウスＡｃｔ−１可変が最 も類似するヒト可変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（配列番号： ５１）、７列には鋳型として供する（即ち、ＧＭ６０７’ＣＬ）ヒト可変領域の アミノ酸配列（配列番号：８）および８列（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶκ）には設計さ れた再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域のアミノ酸配列（配列番号：５２）を掲載す る。表４は、再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_H領域の設計に用いたアミノ酸 配列のアラインメントであり、４列にはヒト化対象のマウスＡｃｔ−１重鎖可変 領域のアミノ酸配列（配列番号：９）、５列（マウスIIＢ）にはマウスＡｃｔ− １可変領域が属するマウス可変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（ 配列番号：５３）、６列（ヒトＩ）にはマウスＡｃｔ−１が最も類似するヒト可 変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（配列番号：５４）、７列には 鋳型として供する（即ち、２１／２８’ＣＬ）ヒト可変領域のアミノ酸配列（配 列番号：１０）および８列（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶ_H）には設計された再形成Ａｃ ｔ−１可変領域のアミノ酸配列（配列番号：５５）を掲載する。表３および４の 終わりから２番目の列は、マウスＡｃｔ−１と選択されたヒトＦＲとの間で異な る残基のＦＲにおける位置（表面または埋没）を示す。表３および４の最後の列 は、可変領域中のその位置に関連したコメントを掲載する。 表３において、以下の印を用いる：（＊）カバット(Katlat)コンセンサス配列 即ち、カバットサブグループ内の９５％以上の出現（カバット(Kabat，E．A.)ら 、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサ ービス省、米国政府印刷局(1991)）（５列および６列の場合）、またはショチア ら、Nature 342:877-883(1989)により規定されたようなＣＤＲループ（５列およ び６列の場合）に対する規定構造の一部としてもしくはＣＤＲループ（８列の場 合）に対する規定構造の一部としてのいずれかにより規定された非変異残基；（ 太字）ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基により置換されたＦＲおよびＣＤ Ｒでの位置；（下線）ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なるＦＲでの位置； （△）ヒトＦＲでの変化の番号付け；（マウス Ａｂ Ａｃｔ−１）マウスＡｃ ｔ−１抗体由来のＶ_L領域のアミノ酸配列；（マウスκ−II）サブグループII由 来のマウスカッパＶ_L領域のコンセンサス配列（カバットら、前述）（ヒトκ−I I）サブグループII由来のヒトカッパＶ_L領域のコンセンサス配列（カバットら、 前述）；（ＧＭ６０７’ＣＬ）ヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体由来のアミノ酸配列（ クロベックら、Nature 309:73-76(1984)）；（表面または埋没）抗体可変領域の 両鎖における残基の残りに関連したアミノ酸の位置；（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶ_K） 再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_L領域のアミノ酸配列。 表４において、以下の印を用いる：（＊）カバット(Kabat)コンセンサス配列 即ち、カバットサブグループ内の９５％以上の出現（カバット(Kabat，E．A.)ら 、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサ ービス省、米国政府印刷局(1991)）（５列および６列の場合）、またはショチア ら、Nature 342:877-883(1989)により規定されたようなＣＤＲループ（８列の場 合）に対する規定構造の一部としてのいずれかにより規定された非変異残基；（ 太字）ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基により置換されたＦＲおよびＣＤ Ｒでの位置；（下線）ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なるＦＲでの位置； （△）ヒトＦＲでの変化の番号付け；（マウス Ａｂ Ａｃｔ−１）マウスＡｃ ｔ−１抗体由来のＶ_H領域のアミノ酸配列；（マウスIIＢ）サブグループIIＢ由 来のマウスＶＨ領域のコンセンサス配列（カバットら、前述）；（ヒトＩ）サブ グループＩ由来のヒトＶ_H領域のアミノ酸配列（カバットら、前述）；（ヒト２ １／２８’ＣＬ ヒト２１／２８’ＣＬ抗体由来のアミノ酸配列(デルシモニア ンら、J．Immunol．139:2496-2501(1987))；（表面または埋没）抗体可変領域の 両鎖における残りの残基に関連したアミノ酸の位置；（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶ_H） 再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_H領域のアミノ酸配列。 再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域の設計（表３）に関して、ヒトＦＲの１つ の残基がヒトＦＲに存在するアミノ酸から元のマウスＦＲに存在するアミノ酸に 変化した。この変化は、ＦＲ１の２位であった（カバット(Kabat，E．A.)ら、Se quences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービ ス省、米国政府印刷局(1991)により規定されたように）。特に、ヒトＧＭ６０７ ’ＣＬ軽鎖可変領域で見られるイソロイシンがマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域で 見られるようなバリンに変化した。カッパ軽鎖可変領域でのこの位置は、Ｌ１ル ープの正しい方向と構造に厳密な位置の１つとして、ショチアら、Nature 342:8 77-883(1989)により同定され、それ自体、「標準アミノ酸」の１つとして知られ ている。ループコンフォメーションにおける重要な役割のため、かかるマウス枠 組み残基は、再形成可変領域で一般にいつも保存されている。 ＦＲ１の４位では、マウス配列においてバリンおよびヒト配列においてメチオ ニンが存在する。バリンからメチオニンへの変化は、両アミノ酸が非極性で、疎 水性残基であるので、それ自体ドラスティックな変化ではなく、したがって、ヒ ト配列に存在するメチオニンを再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域に使用した。しか しながら、該モデルは、バリンがＬ１ループとＬ２ループとの間に埋もれており 、蛋白質に埋もれた場合のバリンの平均体積は１４２ųであることを示唆する が、一方、メチオニンは約１７１ųの空間を占める。より大きなメチオニン残 基は、Ｌ１ループとＬ２ループのいずれかまたは両方のコンフォメーション変化 を生じさせうるであろう。再形成ヒトＡｃｔ−１の抗原結合は、再形成ヒトＡｃ ｔ−１軽鎖可変領域において４位のメチオニンからバリンへの追加の変化により 改良されてもよい。 再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域の設計（表４）に関して、ヒトＦＲに存在 するアミノ酸から元のマウスＦＲに存在するアミノ酸に変化したヒトＦＲの５つ の残基が存在した。ＦＲ１の２４位およびＦＲ３の７１位では（カバット(Kabat ，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米 国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局(1991)により規定されたように） 、これらの位置はそれぞれＨ１ループとＨ２ループの標準構造の一部であるので （ショチアら、Nature342:877-883(1989)）、マウス配列に存在するようなアミ ノ酸残基が再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域に保持されていた。これらの位置 でのいかなるアミノ酸変化もＨ１ループとＨ２ループのパッキングと最終的な構 造を破壊しうるので、これらの厳密な位置でのマウス残基は、ヒト化重鎖可変領 域で定型的に保存されている。 ＦＲ２の４８位では、ヒト配列のメチオニンがマウスＡｃｔ−１配列に存在す るようなイソロイシンに変化した。イソロイシンをメチオニンに置換することは 異常である。より重要なことには、該モデルは、イソロイシン残基がＨ２ループ の下に隠れて埋もれていることを示す。結論として、この埋もれた位置での変化 は、Ｈ２ループの構造に影響を及ぼし、故に抗原結合を妨害したかもしれない。 ＦＲ３の６９位では、ヒト配列のイソロイシンがマウスＡｃｔ−１配列に存在 するようなロイシンに変化した。イソロイシンをロイシンに置換することは異常 ではないけれども、該モデルは、ロイシンがＨ２ループの下に埋もれていること を示す。結論として、４８位の残基のように、この位置での変化は、Ｈ２ループ のコンフォメーションに影響を及ぼし、それにより抗原結合を破壊しうるだろう 。 最後に、ＦＲ３の７３位では、ヒト配列のスレオニンがマウス配列に存在する ようなイソロイシンに変化した。ＦＲ３のこの位置でのイソロイシンは、マウス サブグループIIＢまたはヒトサブグループＩでこれまで見られたことがなく（カ バット(Kabat，E．A.)ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest 、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局(1991)により規定されたよう に）、このことは、この位置のイソロイシンが抗原結合に重要な役割を有するか もしれないことを示唆する。 該モデルにおいて、７３位のロイシンが結合部位の縁近辺の表面上に存在する ようであり、α４β７インテグリンのエピトープの大きさと方向に応じて抗原結 合に直接の役割を果たす可能性があるだろう。しかしながら、表面残基の位置と して、抗体全体は、もしマウスアミノ酸が再形成ヒト抗体に存在しないならば、 より低い免疫原性ポテンシャルを有するだろう。イソロイシンは、再形成抗体誘 導体においてヒトスレオニン残基に置換でき、新規な構築物を再試験して、２番 目のバージョンが類似のレベルの抗原結合を維持するかどうかを決定した。 再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域の元の設計でなされたヒトＦＲでの５つの 変化に加え、抗原結合を改良するかもしれない２つの別の変化が存在した。該モ デルは、マウスｍＡｂ Ａｃｔ−１の重鎖可変領域の３８Ｌｙｓおよび４０Ａｒ ｇ残基がＨ２ループの下に隠れて位置し、ＣＤＲ２の６３Ｐｈｅに近接してパッ キングすることを示唆する（表４と同じ番号付け）。しかしながら、これらの残 基も重鎖可変領域の核に位置し、それらがそれらの対応するヒトアミノ酸（各３ ８Ａｒｇおよび４０Ａｌａ）を置換するために用いられるならば、他の有害な効 果を有するかもしれないであろう。したがって、ＦＲ２の３８位と４０位に対す る変化は、ｍＡｂ Ａｃｔ−１の再形成ヒト重鎖可変領域に取り込まれなかった 。しかしながら、再形成重鎖の修飾のいずれかまたは両方を誘導体に用いて抗原 結合を改良してもよい。 結論 マウスＡｃｔ−１可変領域のモデルは、主に他の抗体可変領域の溶解した構造 に基づいて作られた。該モデルをヒト化Ａｃｔ−１可変領域の設計に用いた。再 形成ヒト可変領域の抗原結合部位の構造を保持することに特に重点を置いた。 再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域および再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域 を設計した（表３および４）。再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、マウスＡ ｃｔ−１軽鎖可変領域のＣＤＲおよびヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体の軽鎖可変領域 由来のＦＲを基礎とした。１つのアミノ酸変化がヒトＦＲの２位でなされた。再 形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のＣＤＲお よびヒト２１／２８’ＣＬ抗体の重鎖可変領域由来のＦＲを基礎とした。５つの アミノ酸変化がヒトＦＲの２４、４８、６９、７１および７３位でなされた。 さらに、再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域のさらなるバージョンの設計に考慮さ れるであろうカッパ軽鎖のＦＲ１の４位の１つの部位ならびに重鎖のＦＲ２の３ ８および４０位の２つの部位が注目された。また、抗体の表面上の位置という観 点から、重鎖のＦＲ３の７３位の１つの残基もマウスからヒトアミノ酸への復帰 突然変異の候補として同定された。実施例３ 再形成可変領域をコードする核酸の構築 正しい重鎖および軽鎖可変領域が生物化学的に（部分アミノ酸配列）および機 能的に（ＨｕＴ７８細胞のキメラ抗体染色）クローニングされたことを確認した 後、再形成アミノ酸配列を前記のように設計した。次に、再形成抗体鎖をコード する遺伝子を設計して調製した。 ヒト化ＡＣＴ−１の設計、構築および発現 実施例２に記載のようにヒト化抗体の一次アミノ酸配列を決定した後、該配列 を縮重核酸配列に逆翻訳し、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ(Kodak，Scientific Imaging S ystems)４．５．３版を用いて可能性のある制限酵素部位を分析した。次いで、 制限酵素切断部位を取り込むが一次アミノ酸配列を保存する核酸配列を選択した 。サブクローニングに使用される注目の制限酵素部位を有する重鎖核酸配列（配 列番号：１８）およびアミノ酸配列（配列番号：１９）を図１１に示し、ならび に軽鎖核酸配列（配列番号：２０）およびアミノ酸配列（配列番号：２１）を図 １２に示す。 以下のようにして、ヒト化Ａｃｔ−１重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を構築し た。軽鎖に対してＬ１〜Ｌ６（それぞれ配列番号：２２〜２７）、重鎖に対して Ｈ１〜Ｈ１０（それぞれ配列番号：２８〜３７）と称する重複した相補的なオリ ゴヌクレオチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９２を用いて合成した（図１３）。５５℃で一 晩脱保護した後、オリゴをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃで乾燥させ、１００ｍｌの水に再 懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラム(Bio-Rad)で脱塩した。該オリゴの濃度は 、２６０ｎｍで吸光度を測定することにより決定し、オリゴを変性ポリアクリル アミドゲル電気泳動により精製した。 各オリゴの１００μｇを２倍容量の負荷色素（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノー ルＦＦ）と混合し、６５℃で２分間加熱し、１Ｘ ＴＢＥ中で約３時間、２５０ Ｖで泳動した。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線下で観察した。次いで 、正しい長さのオリゴをゲルから切り出し、水とともに透析チューブに入れ、電 気溶出させた。該オリゴを、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルア ルコール（２５：２４：１ ｖ／ｖ）(Gibco/BRL)で２回抽出し、０．１倍容量 の３．０Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ６）と２倍容量の冷エタノールの添加により沈 澱させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥さ せ、５０μｌの水に再懸濁させた。 相補性オリゴを、等モル量（５０μｌの水に約１００μｇ）の精製オリゴを等 容量（１００μｌ）の２Ｘ アニーリング緩衝液（２Ｘ＝１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５の４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合することによ りアニーリングした。オリゴは、９５℃まで１０分間加熱することにより変性さ せた後、６５℃で８時間インキュベーションした。次いで、アニーリングしたオ リゴを、以前に記載のようにエタノール沈澱させ、４０μｌの水に再懸濁した。 アニーリングしたオリゴの伸長は、２μｌのラージフラグメントＤＮＡポリメ ラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）、５μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰおよび５μｌの１０ Ｘ 緩衝液（１０Ｘ＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を添加し、最終容量を５２μｌまで上げる ことにより達成した。該混合物を室温で１時間インキュベートした。３７℃で０ ．５時間のインキュベーションで１μｌのｄＮＴＰと１μｌのＫｌｅｎｏｗをさ らに添加した。重鎖断片Ａを伸長させる必要がなかったことに注目すること。 アニーリングして伸長した断片を、１２％非変性ポリアクリルアミドゲルによ る電気泳動により一本鎖のアニーリングしていないものから精製した。該ゲルを 臭化エチジウムで染色し、紫外線下で観察した。正しい長さの断片を切り出し、 前記したように透析チューブ中の電気溶出により回収した。該断片を、等容量の フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回洗浄し、エタノール沈 澱し、１０μｌの水に再懸濁させた。 ３つの軽鎖断片（ＬＡ、ＬＢおよびＬＣ）ならびに５つの重鎖断片（ＨＡ〜Ｈ Ｅと称する）を、別々にｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMにライゲートし、以下に記載し たことを除いて、製造業者の推奨したプロトコールに従ってｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐ ｔキット（Stratagene）を用いてＸＬ−１ Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔ ｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに形質転換した。断片ｐＣＲ−ＬＡおよびｐＣＲ−ＬＢは、 制限酵素ＭｓｃＩでの消化を阻止するであろうＤｃｍメチラーゼを避けるために 、ＤＭ１(Gibco/BRL)コンピテント細胞に形質転換した。白色コロニーを拾い、 製造業者の推奨したプロトコールに従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ７ＤＮＡポリ メラーゼキットを用いてミニプレップＤＮＡをシーケンスした。インサートのそ れぞれ反対側にアニーリングするＴ３およびＴ７プライマーをシーケンスに用い た。 ヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域断片の複雑サブクローニングは、合成 の間に配列に取り込まれた特異的な制限部位を用いて達成された。重鎖断片ＨＡ 〜ＨＤは、以下に記載するように断片の連続サブクローニングを可能にする、各 配列の末端に追加のＡｇｅＩ制限部位を含む。 ｐＣＲ−ＨＡおよびｐＣＲ−ＨＢ由来のミニプレップＤＮＡを制限酵素Ｓｐｅ ＩとＡｇｅＩで消化した。ＤＮＡは、１％アガロースゲルで電気泳動した。１４ １ｂｐ断片ＨＢを該ゲルから回収し、ＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位でｐＣＲ−Ｈ Ａにライゲートし、ｐＣＲ−ＨＡＢが生じた。次に、１１２ｂｐ断片ＨＣを、Ｘ ｂａＩとＡｇｅＩを用いてｐＣＲ−ＨＣから放出させ、ｐＣＲ−ＨＡＢのＸｂａ ＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＣＲ−ＡＣを得た。断片Ｈ Ｄ（１４１ｂｐ）およびＨＣ（１３０ｂｐ）は、断片ＨＤに対しては制限部位Ｎ ｈｅＩおよびＡｇｅＩを、ならびに断片Ｅに対しては制限部位ＢｓｔＥIIおよび ＡｇｅＩを用いて、同じ一連の様式でライゲートした。ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔに すべての５つの重鎖可変領域断片を含む最終プラスミドを、ｐＣＲ−ＨＡＥと称 した。すべての消化は、６５℃の最適インキュベーション温度を有するＢｓｔＥ IIを用いる場合を除いて、３７℃で少なくとも２時間のインキュベーションでミ ニプレップＤＮＡを用いて行なった。ライゲーションは、１：１０のベクター対 インサート比でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩行ない、次の日に、製 造業者の推奨したプロトコールに従ってＤＨ５αサブクローニング効率コンピテ ント細胞(Glbco/BRL)に形質転換した。 ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中のＡｃｔ−１ヒト化重鎖可変領域を、ｐＣＲ−ＨＡ ＥのＨｉｎｄIIIとＡｇｅＩでの消化により放出させた。この４１１ｂｐ断片を 用いて、ＨｉｎｄIIIとＡｇｅＩで消化しておいたｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈ ｉ（実施例１）のマウス可変領域配列を置換し、ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂにヒト化 ＡＣＴ−１重鎖遺伝子を生成させた。得られたプラスミドをｐＥＥ６ｈＡＣＴ１ Ｈと称する。正しいＤＮＡ配列は、シーケンスにより決定した。 ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中の軽鎖断片Ａを、ＢｓｐＥＩとＭｓｃＩで消化した 。次いで、この１５３ｂｐ断片を用いて、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ^TM中のマウス可 変軽鎖のＢｓｐＥＩからＭｓｃＩのマウス部分を置換した。このプラスミドをｐ ＣＲ−ＬｈＡｍＢＣと称する。ＭｓｃＩとＮｒｕＩで消化した軽鎖断片Ｂおよび ＮｒｕＩとＫａｓＩで消化した軽鎖断片Ｃを、ｐＣＲ−ＬｈＡｍＢＣのＭｓｃＩ およびＫａｓＩ部位にトリプルライゲートし、残りのマウス配列を置換した。消 化、ライゲーションおよび形質転換には、ＤＭ１コンピテント細胞を最後の形質 転換を除くすべてに使用することを除いて、前述したのと同じ手法を用いた。 ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中のヒト化軽鎖可変領域およびプラスミドｐＥＥ１２ ｍｈＡＣＴ１Ｌｃｈｉ（実施例１）をＨｉｎｄIIIとＫａｓＩで消化した。３６ ０ｂｐ軽鎖可変領域断片および３１５ｂｐ軽鎖定常領域をゲルで精製し、ｐＥＥ １２のＨｉｎｄIII制限部位にトリプルライゲートし、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１Ｌ を得た。シーケンスを行ない、正しい方向および核酸配列を確認した。 ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現ベクターは、以下の例外を除い て、キメラ抗体に関して記載されたのと同じ方法（実施例１、キメラ免疫グロブ リンの発現を参照のこと）を用いて構築した。ヒト化可変重鎖領域の追加のＢｇ III制限部位により、ＢｇIIIでの切断の際には部分消化を用いて正しい断片を得 た。ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含むベクターを、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ １ＬＨと称する。 すべてのヒト化抗体構築物の一過性の発現および細胞染色は、キメラ抗体に用 いられたものと同じプロトコールを用いて行なった（実施例１、キメラ免疫グロ ブリンの発現を参照のこと）。図１４は、無関係のアイソタイプ適合対照抗体（ ＩｇＧ１、カッパ）と比較して、マウス−ヒトキメラＡｃｔ−１抗体またはヒト 化Ａｃｔ−１抗体を用いるＨｕＴ７８染色の結果を示す。 骨髄腫細胞株であるＮＳＯ細胞(Methods in Enzymol．73(B):3-46(1981);ヨー ロピアンコレクション・オブ・アニマルセルカルチャーズ、PHLS CAMR，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，U．K．，ECACCNo．85110503)の安定なト ランスフェクタントは、ＮＳＯ細胞のｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨとのエレクトロ ポレーションにより得た。 ＮＳＯ細胞の安定な発現 安定なトランスフェクション用の４０μｇのｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨを、構 築物の細菌のプラスミド部分内を切断するＳａｌＩ制限酵素での消化により線状 にした。線状ＤＮＡを、２倍容量のエタノールと１／１０倍容量の酢酸ナトリウ ムを用いて溶液から沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させて滅菌水に 再懸濁した。 対数増殖中のＮＳＯ細胞は、非選択培地（ダルベッコの改変イーグル培地（高 グルコース）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウム不含、４５ ００ｍｇ／Ｌ グルコースおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(GIBCO/BRL、カタ ログ番号12430-021)含有、１０％ウシ胎仔血清(Gibco/BRL、カタログ番号16000- 044)を補足）で維持した。ＮＳＯ細胞を遠心分離し、洗浄して、ＤＮＡの添加後 に該細胞が１０⁷細胞／ｍｌの濃度で存在するように、冷ＰＢＳに再懸濁した。 線状プラスミドＤＮＡ（４０μｇ）を、氷上のエレクトロポレーションキュベッ ト中の１０⁷個の細胞に加えた。該細胞とＤＮＡを泡を生じさせないようにゆっ くり混合させ、該混合物を氷上で１０分間放置した。該キュベットの外側を拭い て乾燥させ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ(Bio-Rad)を用いて１５００Ｖ、３μＦの ２回の連続パルスを加えた。該キュベットを１０分間氷上に戻した。 トランスフェクトした細胞を、５０μｌの非選択培地中３ｘ１０⁵、７．５ｘ １０⁴および１．５ｘ１０⁴細胞／ｍｌの密度で９６ウエルプレートに移し、３７ ℃で２４時間インキュベートした。その後、１５０μｌの選択培地（グルタミン 不含ダルベッコの改変イーグル培地、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース含有、４ｍ ｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ含有、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム含有 、硝酸鉄不含、Ｌ−グルタミン不含(JRH BioSciences、カタログ番号51435-78P) 、１Ｘ ＧＳサプルメント（JRH Biosciences、カタログ番号58672-77Pから入手 した５０Ｘ ＧＳサプルメント）と１０％透析ウシ胎仔血清(Gibco/BRL 、カタログ番号26300-061)を補足）をすべてのウエルに添加した。該プレートを 、実質的な細胞死が起こり、不連続な生存コロニーが出現するまでインキュベー ターに戻した。一旦グルタミン非依存性トランスフェクタントのコロニーが見ら れれば、シングルコロニーを有するウエルを選択し、消費した組織培養上清を回 収し、以下に記載のようにＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧ分泌をアッセイした。こ のようにして、その後の研究に用いた３Ａ９と称する抗体産生クローンを得た。 第２のトランスフェクションは、選択をＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ 、グルタミンシンテターゼインヒビター）の存在下で行なうことを除いて、前記 したように行なつた。 陽性のコロニーは、以下のようにしてヒトＩｇＧ分泌に対するＥＬＩＳＡによ りスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート(NUNC Maxlsorp)を、炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．５中２．５μｇ／ｍｌで１００μｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ ’）₂断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Jackson ImmunoResearch Laboratories) を用いて、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄 し、２００μｌ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロックした。プレ ートを洗浄し、１００μｌの安定なトランスフェクトＮＳＯの上清で３７℃で１ ５分間インキュベートした。ＰＢＳ １％ ＢＳＡ中１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ １カッパを標準として用いた。新鮮なＮＳＯ培地（ＤＭＥ＋ＧＳサプルメント） を陰性対照として用いた。プレートを洗浄し、ＰＢＳ（Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺なし）中 ０．０５μｇ／ｍｌで１００μｌのペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Jackson ImmunoResearchLabo ratories)を用いて、３７℃で１５分間インキュベートした。５ｍｇ Ｏ−フェ ニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）の１錠(Sigma)を１２ｍｌのクエン 酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）に溶解し、該錠剤が溶解した後、１２μｌの ３０％過酸化水素を加えた。洗浄して二次抗体を除去した後、１００μｌの溶解 したＯＰＤ基質を加えた。反応は１２．５％の硫酸で停止させ、Ｄｙｎａｔ ｅｃｈ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで４９０ｎｍでプレートを読んだ。陽性のウ エルを、ウエル当たり２、１および０．５個の細胞の限界希釈によりクローニン グした。シングルクローニング由来のすべてのウエルをＥＬＩＳＡによる抗体産 生に関して陽性と評価した場合、該株はクローニングされたと見なした。 一過性または安定細胞トランスフェクタント培養物の細胞培養上清由来のヒト 化ＡＣＴ−１抗体の精製は、Ｂｉｏ−Ｃａｄワークステーション(Perseptive Bi osystems，Inc.)を用いるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Por osA/M4.6/100mm，5mL/min)により行なった。該カラムは、ＰＢＳで平衡化させた 後、前もって０．２ミクロンフィルターで濾過しておいた細胞培養上清を適用し た。１回の操作当たり適用した細胞培養上清の体積は、抗体の濃度により変えた 。通常、１回の所定の操作で、１５ｍｇ以下の抗体をカラムに適用した。流速は 、精製手法を通して５ｍｌ／ｍｉｎであった。結合後、まず、該カラムをＯＤ_{28 0} ｎｍ＝０になるまでＰＢＳで大量に洗浄した。次いで、該カラムを最小限５０ カラム体積でさらに洗浄した。次いで、該カラムを引き続き０．１Ｍ 酢酸ナト リウム、ｐＨ５．０で洗浄した。溶出は、０．１Ｍ クエン酸Ｎａ、ｐＨ３．５ での洗浄により達成された。溶出液は、５ｍｌの画分で回収し、２００μｌの１ ．５Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃ ｐＨ１２の添加によりｐＨを中性にした。次いで、抗体含 有画分をプールし、限外濾過（セントリコン、３０，０００ＫＤａカットオフ、 Amicon）により所望の濃度に濃縮した。 Ｆｃ変異改変体の構築 また、ヒト化Ａｃｔ−１抗体の非Ｆｃ結合（Ｆｃ変異）版も構築した。この抗 体は、ヒト化Ａｃｔ−１抗体と同じ可変領域（図１１および図１２）ならびに、 ＦｃＲ認識を排除し、Ｆｃ結合を除去するように設計されたＩｇＧ１重鎖定常領 域に２個のアミノ酸の置換（即ち、Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵置換およびＧｌｙ²³⁷ →Ａｌａ²³⁷置換）を除いて同一のヒトＩｇＧ１定常領域を有する。Ｆｃ変異 誘導体の重鎖をコードする核酸を以下のように構築した。ｐＥＥ１２発現ベクタ ー中でヒト化抗ＣＤ１８抗体（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット（１ ９９３年２月４日公開）；シムズら、J．Immunol．151(4):2296-2308(1993)）の 軽鎖および重鎖をコードするが、部位特異的変異導入（Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵お よびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）により２個のアミノ酸置換をＩｇＧ１重鎖定常領域 内に導入した３６７８と称する構築物（ヘルマン・ウォルトマン博士、オックス フォード大学から供与）を、ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化してガンマ定常領域変 異を含む９００ｂｐの断片を放出させた。次いで、この断片を用いて、ｐＥＥ６ ｈＡＣＴ１ＨのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位で重鎖野生型ガンマ１定常領域を置換 し、ｐＥＥ６ｈＡＣＴ１Ｈ／ＦＣｍｕｔを生じさせた。両鎖を含有する他の構築 物に対しては、前記したのと同様な方法で、再形成軽鎖遺伝子およびＦｃ変異再 形成重鎖遺伝子を含む１つの構築物（ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍｕｔ） を調製した。実施例４ ヒト化ＡＣＴ−１抗体ＬＤＰ−０２のキャラクタライゼーション 最初のキャラクタライゼーション研究は、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍ ｕｔで一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から産生された抗体を用い て行なった。この抗体標品は、前記したように産生および精製され、以下、適当 なロット番号が後に続く「１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１」と称する。 前記ネズミ細胞株ＮＳＯの安定なトランスフェクタント（線状ｐＥＥ１２ｈＡ ＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍｕｔでトランスフェクト）から産生された抗体を用いて、追 加のアッセイを行なった。この抗体標品を以下、「ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏ ｔ１」と称する。 「ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１」抗体を以下に記載の次の研究に用いた ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、等電点電気泳動、アミノ酸組成 分析、種交差反応性、滴定、補体介在溶解アッセイ、ＡＤＣＣアッセイおよび結 合阻害アッセイ。「１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃７をアフィニティーアッ セイ＃１〜２に使用し、１°ＨＵＭ ＡＣＴ−ｌ Ｌｏｔ＃８／９をアフィニテ ィーアッセイ＃３〜５に使用し、そして１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃８／ ９をＣｌｑ結合アッセイに使用した。 Ａ．物理化学的特性 １． ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 同一性の立証を補助し、最初の標品をキャラクタライズして純度を評価するた めに、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を、非還元および還元条件下でドデシ ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し 、コロイドクーマシーブルーで染色した。 ０．８２ｍｇ／ｍｌの公称濃度のＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１を８０μ ｌ、微量濃縮器に加えた。抗体を溶解したクエン酸緩衝液を、１６０μｌのＴｒ ｉｓ緩衝液（０．５ｍＭ、ｐＨ８．８）で３回交換した。緩衝液交換後の試料の 最終容量は、１３５μｌであり、０．４８６ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を得た。こ の溶液を非還元および還元緩衝液で２倍に希釈し、０．２４３ｍｇ／ｍｌの濃度 を得た。３．１６μｇの蛋白質を含む０．２４３ｍｇ／ｍｌ溶液の１３μｌアリ コートを、ＳＤＳゲルの指定された試料のレーンに負荷した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ を行ない、対照アーティクルは、マーク（Ｍａｒｋ）１２分子量標準（Novex，# LC5677）を含んでいた。 非還元条件下では、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１に、２００，０００ダ ルトンよりわずかに小さい見かけ上の分子量を有する主要なバンドが存在した。 １１６，３００〜２００，０００ダルトンの間に、いくつかのマイナーな成分が 観察された。約９７，４００ダルトンの分子量、５５，４００ダルトンよりわず かに大きな分子量および３１，０００ダルトンより小さい分子量を有する３つの 追加のマイナーな成分も観察された。レーザーデンシトメトリーを用いてゲルを スキャンすることにより、染色されたポリペプチドバンドの定量分析、次いで、 各可視化バンドに関連したエリアのパーセントの計算を可能にした（表５）。定 量分析から得られたデータは、約２００，０００ダルトンで観察された主要な成 分が試験した試料のレーンで全染色バンドの８４．４％に相当することを示唆す る。この主要なバンドは、インタクトな抗体に相当したが、５５，０００および ３１，０００ダルトンの他のバンドはそれぞれ、１本の重鎖および軽鎖に相当し た。 還元条件下では、２つの主要な成分が電気泳動ゲル上で観察された。該成分の うちの１つの分子量は、約５５，４００ダルトンであり、該ゲルレーンで可視化 された全染色バンドの６８．６％に相当し、一方、３１，０００ダルトンよりわ すかに小さいものに相当する第２の成分は、全染色バンドの３０．５％に相当し た（表５）。これらの２つの成分の分子量は、免疫グロブリンＧの重鎖および軽 鎖の予想される分子量とよく一致する。これらのデータは、約９９％の標品がイ ンタクトな抗体または１本の重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリン鎖のいずれかから なることを示唆する。また、２つの主要な成分以外にも、６６，３００ダルトン よりわずかに小さい１つのマイナーな成分が観察された。 この分析から、インタクトな免疫グロブリンＧに対するものと一致する高分子 量種がＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に主要なバンドとして存在する。また 、いくつかのマイナーなバンドもＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に存在する 。還元後、免疫グロブリンＧ分子の重鎖および軽鎖のものと一致する電気泳動上 の移動度を示す２つの主要なバンドが観察された。 ２．ウエスタンブロット分析 前記したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料および標準を分析した。要約す ると、還元しないおよび還元した試料を４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで 分析した。また、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）マーク（Ｍａｒｋ）１２分子量標準 もゲルで泳動した。それぞれ０．５１および１．０９μｇの蛋白質を生ずる、０ ．２１４３ｍｇ／ｍｌ溶液の２．１μｌおよび４．５μｌアリコートの容量をＳ ＤＳゲルの指定された試料レーンに負荷した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ウエスタン・トランスファー ・アパレイタス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）の 使用説明書に従って、試料蛋白質をゲルからニトロセルロースに移した。用いた トランスファー緩衝液は、２０％メタノール中１Ｘ Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液 であった。約２時間後、該ニトロセルロースブロットをトランスファー装置から 除去し、ＤＤＩ水でリンスした。次いで、該ニトロセルロースブロットを、３％ ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ）中、 ３７℃で３５分間ブロックした。該ブロットをブロッキング溶液から除去し、Ｔ ｒｉｓ緩衝液で２回洗浄した。抗マウスＩｇＧ抗体ストック溶液を２０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−３％ ＢＳＡ溶液で１０００倍に希釈することにより調製したヤギ抗マ ウスＩｇＧ溶液を、該ブロットに添加し、２〜８℃で一晩インキュベートした。 インキュベーション後、該ブロットを５分毎にＴｒｉｓ緩衝液を４回交換するこ とで洗浄した。抗ヤギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−３％ ＢＳＡ溶液で５０００倍に希釈することにより調製した抗ヤ ギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート溶液を、該ブロットに添加し、 室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該ブロットを５分毎 にＴｒｉｓ緩衝液を４回交換することで洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロ モ−４−クロロー３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩／ニトロ−ブ ル−テトラゾリウムクロリド）基質を、１０ｍｌ同時に該ブロットに添加した。 ブロットを揺動させながら室温で現像した。Ｔｒｉｓ緩衝液でブロットをリンス することにより反応を停止させた。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにヤギ 抗ヒトＩｇＧを用いて前記手法を繰り返した。 抗マウスＩｇＧ試薬を用いる非還元および還元の両条件下で、０．５１μｇお よび１．０９μｇのＩｇＧ試料が、該ニトロセルロースブロット上で明確に検出 された。バンドの強度は、濃度が増加するにつれて増加した。非還元条件下で、 ２００，０００ダルトンマーカーよりもわずかに速く移動する主要なバンドが検 出された。また、いくつかのより弱いバンドも検出された。これらのバンドのう ちの２つは、主要バンドよりも遅く移動し、他の３つのバンドは概ねより速く移 動した。還元条件下では、免疫グロブリンＧの重鎖および軽鎖の特徴を有する２ つのバンドが検出された。 非還元および還元の両条件下で抗ヒトＩｇＧ試薬を用いて、０．５１μｇおよ び１．０９μｇのＩｇＧ試料を該ニトロセルロースブロット上で明確に検出した 。バンドの強度は、濃度が増加するにつれて増加した。非還元条件下で、２００ ，０００ダルトンよりもわずかに小さい見かけ上の分子量マーカーを有する種に 相当する主要バンドが検出された。また、抗マウスＩｇＧで検出され、該ブロッ トで観察されたより弱いバンドも検出された。免疫染色の強度は、抗ヒトＩｇＧ で検出した際のすべてのバンドに対してより強かった。他のブロットでは観察さ れないいくつかの追加のバンドが検出された。これらのバンドは、抗マウスＩｇ Ｇで認識されるエピトープを欠くＩｇＧ断片に相当すると思われる。還元条件下 では、免疫グロブリンＧの重鎖の特徴を有するバンドが検出された。該抗体はヒ トＩｇＧのＦｃ部分に特異的であったので、軽鎖は検出されなかった。抗ヒトＩ ｇＧで検出を行なった際に、抗マウスＩｇＧで現像したブロットでは見られない いくつかのマイナーバンドが観察された。２つのブロット間のこの相違は、抗マ ウスＩｇＧ結合に対するエピトープを欠くＩｇＧ断片の存在の結果であろう。 ３．等電点電気泳動 ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供し、コロ イドクーマシーブルーで染色した。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に対して 得られた結果を、同一のゲルで泳動したＩＥＦ標準と比較した。 ０．８２ｍｇ／ｍｌの公称濃度のＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を８０μ ｌ、微量濃縮器に加えた。抗体が入っているクエン酸緩衝液を、１６０μｌのＴ ｒｉｓ緩衝液（０．５ｍＭ、ｐＨ８．８）で３回交換した。試料の最終容量は、 １３５μｌであった。最終濃度は、０．４８６ｍｇ／ｍｌであると計算された。 この溶液を、２Ｘ ＩＥＦ試料緩衝液で２倍に希釈して、０．２４３ｍｇ／ｍｌ の濃度を得た。３．１６μｇの蛋白質を生ずる０．２４３ｍｇ／ｍｌ溶液に対し て１３μｌのアリコートを、ＩＥＦゲルの指定された試料の上に負荷した。対照 のアーティクルは、ＩＥＦ標準ｐＩ３．６〜９．３を含んでいた(Sigma、Cat#I- 3018)。 標準プロットは、８つのＩＥＦ標準の相対的な移動距離の平均をこれらの標準 蛋白質のそれぞれに関して公知のｐＩに対してグラフ化することにより作成した 。これらのデータの回帰直線に適合させることにより、０．０３４５９の負の傾 斜と８．９１８５７の切片を得た。該適合のＲ²は、０．９９２０６に等しかっ た。 表６は、６つのＩＥＦ標準およびＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１により移 動した平均の距離を含む。また、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に関して計 算されたｐＩもこの表に示す。 標準プロット由来の直線回帰パラメーターを用いて、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ Ｌｏｔ♯１に関する５つのバンドの概略ｐＩ値は、８．０９のｐＩ値で表される 優勢なピークとともに、７．８８、７．９５、８．０９、８．２６および８．４ ３であると計算された（表６）。この主要ピークのｐＩ値は、一次アミノ酸配列 に基づく予想ｐＩ値７．９１に都合よく匹敵する。 ＊ 平均¹ 標準曲線に基づく（ｐＩ対移動距離） ここで： 試料ｐＩ＝切片−傾斜（試料移動距離）。 ４．アミノ酸組成分析 アミノ酸組成分析を、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１の蛋白質含有量およ びアミノ酸組成を決定して同一性を確認するために行なった。 まず、三連の４５μｌアリコートを加水分解用に取り除いた。加水分解は、６ Ｎ ＨＣｌ蒸気を用いて１６５℃で６０分間行なった。対照として、加水分解容 器は、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１と同時に加水分解される標準蛋白質を 含んでいた。また、アミノ酸標準は、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１分析の 前後にクロマトグラフィーに付した。対照のアーティクルは、標準蛋白質として ウシ血清アルブミン(Tektagen Solution Control:310:197A)、およびアミノ酸標 準としてアミノ酸加水分解混合物(Tektagen Solution Control:310:l99A)を含ん でいた。 試験方法には、カラム後ニンヒドリン反応および２波長での吸光度のモニター を伴うイオン交換ＨＰＬＣによる再懸濁した蛋白質加水分解物または遊離のアミ ノ酸溶液の分析を用いた。両波長での吸光度は、三連でアミノ酸標準を分析する ことにより得られた校正表と比較して定量化した。 表７にアミノ酸組成を示す。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１の蛋白質濃度 は、０．７０９ｍｇ／ｍＬであると決定された。ＷおよびＣの定量の欠如に関す る補正に基づいて、蛋白質濃度を、０．７４０ｍｇ／ｍＬに修正した。データお よび直接関係のある計算値を表８に要約する。 ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に関しては、１６５℃で６Ｎ ＨＣｌ蒸気 を用いる単一の加水分解時点（６０分）を行なった。標準蛋白質（ＢＳＡ）に由 来する補正係数を、蛋白質含有量の決定に適用した（表８）。 この方法の条件下では、ともに溶出するシステインのピークの存在により、プ ロリンに関して得られたモルパーセント値（表７）がわずかに高くなるかもしれ ない。その結果として、プロリンの定量の精度は試料に依存し、試料加水分解物 中に存在するシステインの量に基づく。この分析に関して、プロリンの含有量を 、ＢＳＡ由来の補正係数を用いて補正した（表８）。この補正の精度は試料に依 存し、ＢＳＡ（６．０％）および試料中のシステインの相対量に基づく。 重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列に基づき、相対パーセント（頻度またはモ ルパーセント）としてのＬＤＰ−０２の予想アミノ酸組成（予想％）ならびにア ミノ酸分析の実際の結果（実測％）を表９に示す。予想値対実測値の比較は、前 記したようにプロリンがともに溶出するシステインのピークにより人為的に高い と思われることを除いて、良好な相関を示す。 ¹− 相関係数は０．９５８であり、これは、それぞれ１．８％および２．４％ のＷおよびＣの含有量に基づいている。 ¹ 蛋白質含有量はシステインおよびトリプトファンに対して補正しない。² ＢＳＡ由来の補正係数を、検出した各アミノ酸に適用した。³ 加水分解した全ｎｇ＝（注入した全ｎｇ ｘ 再構成容量）／注入容量（５０ μ１） ５． ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析 ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し て、分子量を決定した。１４９，８０８Ｄａを中心とする質量を有する主要ピー クが検出された。７４，９２７Ｄａを中心とするピークは、主要ピークに見出さ れる種の＋２イオンを表す。＋２イオンの質量は、Ｍ＋Ｈイオンのちょうど半分 ではないことに注目すべきであり；このわずかな格差は実験上の不正確さにより 生ずると思われ、これは測定値の+/-０．２％以内である。 抗体の予測された一次配列に基づくと、予想された分子質量は、１４７，１５ ４Ｄａであるべきである。観測されたおよび予測されたＩｇＧ分子質量の間の２ ，６５４Ｄａという質量の差は、該分子のグリコシル化によることが最も蓋然性 が高いといえる。この観測された差は、約１．８％のグリコシル化レベルを表す 。 Ｂ．アフィニテイー まず、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１およびネズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃ ２）の滴定を、ヒト由来のＨＵＴ−７８細胞でフローサイトメトリーを用いて行 なった。要約すると、１．０ｘ１０⁶個のＨＵＴ−７８細胞を、ビオチニル化ネ ズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃２）、ビオチニル化ネズミＩｇＧ１（LeukoSite，Inc ．で作られたＬｏｔ＃１）、ビオチニル化ＬＤＰ−ｏ２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１ま たはビオチニル化ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch，Avondale，PA;Lot25794 )のいずれか１００μｌの容量に４℃で２０分間懸濁した後、抗体を除去した。 特に示さない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／ ０．１％アジ化ナトリウムで希釈した。両抗体に対する濃度変化には、３０μｇ ／ｍｌ（ネズミＡＣＴ−１のみ）、１５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌおよびそ れぞれの続く１：１０希釈が含まれた。一次抗体の除去後、次に、該細胞を、１ ：２００に希釈した１００μｌのストレプトアビジンフィコエリスリン(DakoCor p.，Carpinteria，CA)に懸濁した。２００μｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を０ ．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は 、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍのレーザーを用いて、Ｆ ＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.，San Jose，CA）で分析した。各試料に 対して、最小限１０，０００個の細胞を分析し、最大平均チャンネルフルオレッ センス（ＭＣＦ）の半値を計算した。すべての試料は、二連で行なった。 これらの滴定研究により、約１．０μｇ／ｍｌの濃度で、ネズミＡＣＴ−１お よびＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１の両方を用いて最大の蛍光に近づくこと が示唆された（図１５）。最大平均チャンネルフルオレッセンスの半値は、ネズ ミＡＣＴ−１よりもＬＤＰ−０２の方が低い濃度で達成された（それぞれ、ビオ チニル化ネズミＡＣＴ−１Ｌｏｔ＃２に対して０．１μｇ／ｍｌおよびＬＤＰ− ０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃に対して０．０２μｇ／ｍｌ）。 アフィニティー（および特異性）の相対的評価は、フローサイトメトリーなら びにＬＤＰ−０２およびネズミＡｃｔ−１抗体の交差競合結合を用いて、逆にヒ ト由来のＨｕＴ−７８細胞で行なった。要約すると、１．０ｘ１０⁶個のＨｕＴ −７８細胞を、種々の濃度の非コンジュゲート化１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１または 非コンジュゲート化ネズミＡｃｔ−１のいずれかと０．１μｇ／ｍｌのビオチニ ル化ネズミＡｃｔ−１（Ｌｏｔ＃２）の１００μ１に、４℃で２０分間懸濁した 後、抗体を除去した。別々の実験において、１００μｌの０．０２μｇ／ｍｌの ビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を、種々の濃度の非コンジュゲ ート化ネズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃２）および非コンジュゲート化ＬＤＰ−０２ ／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１とともに用いた。一定に保たれたビオチニル化抗体の濃度 は、前記したように、同一の条件下で染色したＨＵＴ−７８細胞での最大平均チ ャンネルフルオレッセンス（ＭＣＦ）の半値で得られた濃度であった。特に示さ ない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／０．１％ アジ化ナトリウムで希釈した。両抗体に対する濃度変化は、２．０Ｘ１０^-6Ｍ〜 ５．０Ｘ１０^-11Ｍの対数増加の半値にわたっていた。一次抗体の除去後、次に 、該細胞を、１：２００に希釈した１００μｌのストレプトアビジンフィコエリ スリン(Dako Corp.，Carpinteria，CA)に懸濁した。２００μｌのＰＢＳで洗浄 した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで 冷凍した。試料は、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍのレーザー を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.，SanJose，CA）で分析し た。各試料に対して、最小限１０，０００個の細胞を分析し、ＭＣＦを計算した 。すべての試料は、二連で行なった。ＩＣ₅₀は、ビオチニル化ホモログ抗体から ＭＣＦで５０％の低下を生ずる非コンジュゲート化抗体の濃度として決定された 。 アフィニティーの見積もりは、ＬＤＰ−０２（１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１）とネ ズミＡＣＴ−１との間の５つの独立した交差競合実験で行なった。ビオチニル化 ネズミＡｃｔ−１を該アッセイで一定に保つ抗体として用いた場合、ＬＤＰ−０ ２に対する平均ＩＣ₅₀値（±１ ＳＥＭ）（５．４３±０．８６ｎＭ）は、ネズ ミＡＣＴ−１に対するもの（７．９４±１．１７ｎＭ；ｐ＝．０２、両側ｔ−検 定：平均に対して対の２個の試料）よりも統計学的に低く、一方、無関係なヒト ＩｇＧ１またはネズミＩｇＧ１は、競合的効果を有していなかった（すべての実 験を表１０に要約する；１つの実験を図１６に示す）。同様に、ビオチニル化Ｌ ＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１が該アッセイで一定に保たれた抗体である場合 、ＨｕＴ−７８細胞膜からＬＤＰ−０２を競合除去するのにＬＤＰ−０２／３Ａ ９／Ｌｏｔ＃１よりも高い濃度の非コンジュゲート化ネズミＡｃｔ−１を要した （それぞれ、ＩＣ₅₀＝６．３ｎＭ対４．３ｎＭ）。各実験において、ＬＤＰ−０ ２は、ネズミＡｃｔ−１よりも低いＩＣ₅₀を有した。これらの結果は、ＬＤＰ− ０２がネズミＡｃｔ−１により認識されるエピトープに対して特異的であり、そ の結合アフィニティーがネズミ抗体のものよりも良好であったことを示唆する。ｐ＝０．０２ 両側ｔ−検定：平均に対して対の２個の試料 Ｃ． 種の交差反応性 フローサイトメトリーを用いて、種の交差反応性を評価した。ヒト、イヌ、ネ コ、モルモットまたはラットから採取した１００μｌのＥＤＴＡ抗凝固血を、Ｆ ＡＣＳチューブに加えた。血漿を除去し、次いで、血液ペレットを、１５μｇ／ ｍｌの濃度でビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃１、無関係なビオチ ニル化ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno Research，Avondale，PA）、ビオチニル化 ネズミＡｃｔ−１ Ｌｏｔ＃２または無関係なビオチニル化ネズミＩｇＧ１（Da ko Corp.，Carpinteria，CA）のいずれか１００μｌ中に再懸濁した。特に示さ ない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／０．１％ アジ化ナトリウムで希釈した。試料を４℃で２０分間抗体とともにインキュベー トした後、該抗体を洗浄により除去した。次いで、細胞を４℃で２０分間、１： ２００に希釈したストレプトアビジンフィコエリスリン（Southern Biotechnolo gy Associates，Inc.，Birmingham，AL）１００μｌとともにインキュベートし た。次いで、赤血球を、製造業者のプロトコールに従って、市販の溶解試薬（FA CS Lysing Solution，Becton Dickinson，San Jose，CA）を用いて溶解した。Ｐ ＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分 析するまで冷凍した。試料は、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍ のレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.，San Jose，CA ）で分析した。リンパ球捕捉ゲートを前方に９０度の光散乱パラメーターでセッ トした。各試料に対して、１０，０００個の細胞を分析した。 ビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１は、ネズミＡｃｔ−１で生じ たものと類似で、ヒトまたはネズミアイソタイプ適合対照での染色により生じた パターンとは異なる異質の染色パターンでヒトリンパ球の亜集団を認識した。さ らに、イヌまたはネコ由来のリンパ球で調べたとき、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌ ｏｔ＃１およびネズミＡｃｔ−１は両方とも、ヒトリンパ球を用いて派生したも のと類似の異質な染色パターンを生じた。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１ま たはネズミＡＣＴ−１は、これらの条件下でラットまたはモルモット由来のリン パ球を認識しなかった。 Ｄ． Ｃｌｑ結合 以前に記載された技術(シムズら、J．Immunol．151:2296-2308(1993))を用い て、フローサイトメトリーを使用してＬＰＤ−０２のヒト補体成分Ｃｌｑを結合 する能力を評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準フィコール（Ｆｉ ｃｏｌｌ）密度分離により単離した。まず、３７５，０００個の細胞を４℃で１ ０分間、１０％正常ウサギ血清／ＰＢＳでブロックした。洗浄による除去の後、 該細胞を、１０μｇ／ｍｌの（ａ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ(Therapeutic Antibod y Center，Cambridge，U．K.)、（ｂ）ヒトＩｇＧ１（Sigma Chemial Co.，St． Louis，MO）、（ｃ）ＬＤＰ−０１（２個のアミノ酸置換をＩｇＧ１重鎖定常領 域に含み（Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）、また、「Ｆｃ Ｒｍｕｔ ＣＤ１８」とも称する、国際公開第９３／０２１９１号パンフレット （１９９３年２月４日公開）およびシムズら、J．Immunol．151(4):2296-2308(1 993)に記載された抗ＣＤ１８抗体の誘導体、Therapeutic Antibody Center，Cam brldge，U．K.)、または（ｄ）ＬＤＰ−０２（１°Ｃ ｈｕｍ ＡＣＴ−１ Ｌ ｏｔ＃８／９）のいずれか１００μｌとともに、４℃で２０分間インキュベート した。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈを陽性対照抗体として供し、一方、ＬＤＰ−０１お よびヒトＩｇＧ１を陰性対照抗体として用いた。すべての試薬を２％ＢＳＡ／Ｐ ＢＳで希釈した。追加の陰性対照として、２％ＢＳＡ／ＰＢＳも単独で加えた。 次いで、抗体を洗浄により除去し、細胞を４℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌのヒ ト補体成分Ｃｌｑ(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)５０μｌに再懸濁した 。次いで、細胞を洗浄して、２０μｇ／ｍｌ℃ＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＣｌｑ 抗体(DakoCorp.，Carpinteria，CA)１００μｌに４℃で２０分間再懸濁した。２ ００μｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに 再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は、ＦＩＴＣを励起させるために４８８ ｎｍのレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.，San Jose ，CA）で分析した。各試料について、最小限１０，０００個の細胞を 分析し、平均チャンネルフルオレッセンス（ＭＣＦ）を計算した。 ヒトＰＢＭＣを、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ結合ヒトＣｌｑとともにインキュベー トし、ＭＣＦで有意なシフトが生じたが、ＰＢＭＣのＬＤＰ−０ＬＢＳＡまたは ヒトＩｇＧｌとのインキュベーションにより誘発された染色パターンはすべて類 似しており、相対的に低いバックグランド染色を特徴とした。ＬＤＰ−０２との ＰＭＢＣのプレインキュベーションにより生じた染色のパターンは、これらの陰 性対照試料で生じたものと同一であり、ＬＤＰ−０２はこれらの条件下ではＣｌ ｑを結合しないことを示唆した。 Ｅ． 補体介在溶解 ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯ｌの補体介在細胞溶解に関与する能力を、ビ ンドン(Bindon，C．I.)ら(Transplantation，40:538-544(1985))により以前に記 載されたプロトコールを用いて調べた。ヘパリン処理したヒト血液を無菌的に吸 引し、血漿を回収してすぐに氷上に置いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フ ィコールーハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、密度１．０７７ｇ／ ｍｌの層に重層して１５分間遠心分離することにより単離し、ＲＰＭＩ１６４０ ／１０％ＦＣＳ／１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイ シン／２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンからなる完全培地で２回洗浄した。次いて、 ２５００万個の細胞を３７℃で１時間、１５０μＣｉの⁵¹クロム酸ナトリウム(E ．I．du Pontde Nemours & Co．Inc.，Wilmington，DE)の滅菌塩水中でインキュ ベートした。細胞を培地で２回洗浄し、１０⁶／ｍｌに再懸濁した。次いで、培 地中に５０、２５、５、２．５および０．５μｇ／ｍｌの濃度の（ａ）ＣＡＭＰ ＡＴＨ−１Ｈ（Therapeutic Center，Cambridge，U．K.）、（ｂ）ＣＡＭＰＡＴ Ｈ−１Ｇ（Therapeutic Center，Cambridge，U．K.）、（ｃ）ヒトＩｇＧ１(Sig ma Chemical Co.，St．Louis，MO)、（ｄ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ♯１ 、または（ｅ）ＬＤＰ−０１（ＦｃＲｍｕｔ ＣＤ１８、Therapeutic An tibody Center，Cambridge，U．K.(前記参照のこと))のいずれか１００μｌを含 むＵ底マイクロタイタープレートのウエルに、５０μｌの懸濁物（５．０ｘ１０⁴ 個の細胞）を添加した。ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体を陽性対照抗体としてアッセ イに用い、一方、ヒトＩｇＧ１およびＬＤＰ−０１を陰性対照として用いた。追 加のウエルは、完全培地中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Fisher Sci entific，Fair Lawn，NJ）の１００μｌに懸濁した細胞を含んでいた。Ｔｒｉｔ ｏｎ−Ｘ−１００とインキュベートした細胞を用いて全放出を測定し、一方、抗 体を含まない対照ウエルを用いて自発放出を測定した。室温で１５分間のインキ ュベーション後、補体供給源として５０μｌの自己血漿を各ウエルに添加して２ ０％の最終濃度とした。該細胞を３７℃で４５分間インキュベートし、次いで、 １００ｇで２分間遠心分離し、１００ｕｌの上清を回収した。放出された⁵¹Ｃｒ は、ＣｏｂｒａIIガンマカウンター(Packard Instruments，Downers Grove，IL) で測定した。すべての試料は、二連で行なった。特異的⁵¹Ｃｒ放出パーセントは 、式： を用いて計算した。 ビンドン（Bindon）ら(Transplantation，40:538-544(1985))により以前に報 告されたように、ＣＡＭＰＡＴＨ−１ＨおよびＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇは両方とも 、用量に依存した様式でヒトＰＢＭＣの補体介在溶解を３５％まで誘発した。さ らに、予想されたように、ヒトＩｇＧ１およびＬＤＰ−０１（Ｆｃ−ｍｕｔＣＤ １８）対照は、いかなる検出可能な細胞溶解をも誘発しなかった。ＬＤＰ−０２ は、２５μｇ／ｍｌまでを含む調べたいかなる濃度でも細胞溶解を仲介しなかっ た（図１７）。 Ｆ． 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ） ヒトＣＤ３＋芽球を標的細胞として用い、ＬＤＰ−０２の抗体依存性細胞傷害 （ＡＤＣＣ）に関与する能力を評価した。ＣＤ３＋芽球は、ＰＢＳで５μｇ／ｍ ｌの濃度に希釈した抗ＣＤ３抗体ＲＴ６６で被覆した２４ウエルプレートで生成 した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）は、フィコールーハイパーク（Ｆｉｃ ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、密度１．０７７ｇ／ｍｌの層に重層して１５分間遠 心分離することにより単離し、前章で記載したように、完全培地で洗浄および再 懸濁した。次いで、２００万個の細胞を２４ウエルプレートの各ウエルに加え、 ３７℃、５％ＣＯ₂で４日間インキュベートした。次いで、細胞をカルチャーフ ラスコに移し、１０ユニット／ｍｌの濃度のヒト組換えＩＬ−２(Genzyme Corp. ，Cambridge,MA)を含む培地で、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。培養 ３日後、次に、１０．０ｘ１０⁶個のＣＤ３芽球を３７℃で４５分間、１５０μ Ｃｉの⁵¹クロム酸ナトリウム(E．I．du Pontde Nemours & Co．Inc.，Wilmingto n，DE;Lot#95M682)の滅菌塩水中でインキュベートした。完全培地で２回洗浄し た後、細胞を２ｘ１０⁵細胞／ｍｌになるように再懸濁し、５０μｌの懸濁物（ １０，０００個の細胞）をＵ底９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに 加えた。該ウエルは、培地中に５０、５、２．５、０．５、０．２５または０． ０５μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ(TherapeuticAntlbodyCenter ，Cambridge，U．K.)またはＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１のいずれか５０ μｌを含んでいた。細胞を室温で３０分間抗体とともにインキュベートした後、 異なるドナ一由来の０．５ｘ１０⁶個の新たに単離したＰＢＭＣ（ｆｉｃｏｌｌ −ｈｙｐａｑｕｅ勾配、３７℃で完全培地で２回洗浄）をエフェクター細胞とし て各ウエルに加えた（５０：１のエフェクター：標的比）。追加のウエルには、 培地中５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）の １００μｌを加えた。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００とインキュベートした細胞を用 いて全放出を測定し、一方、抗体およびエフェクター細胞を含まない対照 を、自発放射能放出を測定するために算入した。細胞を室温で１００ｇ、２分間 遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ₂で２０時間インキュベートした後、細胞をＶ底 ９６ウエルプレートに移し、室温で沈澱させた。１００μｌの上清を回収し、放 出された放射能をＣｏｂｒａIIガンマカウンター(Packard Instruments，Downer s Grove，IL)で測定した。すべての試料は、二連で行なった。特異的⁵¹Ｃｒ放出 パーセントは、式： を用いて計算した。 シムズら、J．Immunol.，151(4):2296-2308（1993）により以前に示されたよ うに、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈは、用量に依存した様式でＡＤＣＣに関与し、５． ０μｇ／ｍｌ以上の濃度で約３０％までの特異的⁵¹Ｃｒ放出を誘発した。調べた いかなる濃度でもＬＤＰ−０２を含むウエルでは特異的放出を検出しなかった。 Ｇ． ＭＡｄＣＡＭ−１への接着阻害 α４β７のＭＡｄＣＡＭ−１への結合を阻害するＬＤＰ−０２の能力は、蛍光 標識したα４β７＋ＲＰＭＩ８８６６細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）、およびヒト ＩｇＧ１のＦｃ領域（Ｆｃ変異ＬＤＰ−０２の定常領域を作製するために用いた 同じ構築物由来の定常領域）に融合したヒトＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメイ ンを含有するＭＡｄＣＡＭ−１キメラを用いて評価した。 １．ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧキメラの構築 ｐｃＤｈｕＭＡｄ４と称するヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン（ｐＣＤＮＡ３中 のクローン４ｃＤＮＡ；シジャン(Shyjan，A．M.)ら、J．Immunol.，156:2851 -2857(1996)；その教示は、参照によりそのまま本明細書に取り込まれる）を、 １９９５年２月１０日に出願された米国出願第０８／３８６，８５７号明細書の 一部継続出願てある、１９９５年９月１日に出願された米国出願第０８／５２３ ，００４号明細書の一部継続出願である、１９９６年２月１２日に出願された国 際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２１５３（国際公開第９６／２４６７３号パン フレット）に記載されたように、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の細胞外領域のＰＣＲ増 幅用の鋳型として用い、ヒトＩｇＧ１の定常領域と融合させた。ＭＡｄＣＡＭ− ＩｇＧキメラを構築するために、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１コーディング配列の５’ 末端（ＡＴＧコドン、太字）を含むプライマーＨＵＭＡＤＩＧ４／２（配列番号 ：６２）を合成した： この５’プライマーは、ＨＵＭＡＤＩＧ３と称する３’プライマーと合わせて用 い、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインをコードする領域を増幅した。３ ’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ３（配列番号：６３）は、下記配列を有する： 示したように、５’ＨｉｎｄIII部位または３’ＳｐｅＩ部位を有するプライマ ーを設計した。これらのプライマーを使用して、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ）(San Dlego，CA)製のＰＣＲオプティマイザーキットを用いてＭＡｄ ＣＡＭ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩで 消化して、クローニング用末端を生成させ、グラスマックス（Ｇｌａｓｓｍａｘ ）ＤＮＡ単離システム(Gibco，Bethesda，MD)を用いるゲル電気泳動により精製 した。 ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２およびＣＨ３領域を包含する約１ｋｂの断片を 、Ｆｃ変異ヒト定常領域を有するヒト免疫グロブリンγ１重鎖をコードする構築 物からＳｐｅＩとＥｃｏＲＩとの消化により切り出した。その教示がそれぞれ参 照によりそのまま本明細書に取り込まれる、シムズら（J．Immunol.，151:2296- 2308(1993)）およびウォルトマンら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレッ ト １９９３年２月４日（第２３頁））により記載されたように、この構築物中 のヒト定常領域は、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖(ライヒマンら、Nature，322:323 -327(1988))のＰＣＲ増幅により得られたものに相当する。この構築物の定常領 域中の変異（Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）は、ヒトＦｃ γレセプターへの結合を低下させるように設計され、オリゴヌクレオチド特異的 変異導入により生成された。したがって、生成したＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合体は 、Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷変異の導入を除いて、シム ズら（J．Immunol.，151:2296-2308(1993)）およびウォルトマンら（国際公開第 ９３／０２１９１号パンフレット）により記載されたＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ定常 領域断片を含む。 Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域をコードする１ｋｂのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を 、Ｇｌａｓｓｍａｘ ＤＮＡ単離システム(Gibco，Bethesda，MD)を用いるゲル 電気泳動により単離した。この定常領域断片およびＭＡｄＣＡＭの全細胞外ドメ インを含むＨｉｎｄIII−ＳｐｅＩ断片を、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで消化して おいたベクターｐＥＥ１２（ステファンズ(Stephens，P．L.)とコケット(M．L． Cockett)、Nucl．AcidsRes.，17:7110（1989）およびベビングトン(Bebbington ，C．R.)とヘンチェル(C．C．G．Hentschel)、1987、哺乳動物細胞におけるクロ ーン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの利用、(Academic Pr ess，N．Y.)に三部ライゲーションで連結した。細菌株ＤＨ１０Ｂの形質転換体 を得た。コロニーを生育させ、ミニ−プラスミドプレップを制限マッピングによ り分析した。Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域に融合したＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外 ドメインを含有する融合蛋白質をコードする構築物（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ２１ ）を、全ＭＡｄＣＡＭ−１部分にわたってシーケンスし、セグメントが適 切に融合していることおよびＰＣＲで誘導した変異がないことを確認した。キメ ラをＮＳＯ細胞で生成させ、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラ フィーにより精製した。 ２． 接着アッセイ 高結合型平底９６ウエルプレート（Costar）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５で ２．５μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌのＭＡｄＣＡＭ−１キメラを用いて、３７ ℃で１時間被覆した。次いで、マイクロプレート自動洗浄機(Bio-Tek Instrumen ts，Winooski，VT)を用いて、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ０．１ ４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ₂、ｐＨ７．２）で１回ウエルを洗浄し、Ｐ ＢＳに希釈した１０％ＦＢＳ１００μｌで、３７℃で１．５時間ブロックした。 まず、ＲＰＭＩ８８６６細胞（α４β７を発現する（そしてα４β１を発現し ない）ヒトＢリンパ腫細胞株（アール(Erle，D．J.)ら、J．Immunol.，153:517( 1994);アール博士から供与))を２０ｍｌのＰＢＳ（４℃）で洗浄し、ＰＢＳ中４ ．０ｘ１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁した。ＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス−（２− カルボキシエチル）−５−（アンド６）−カルボキシフルオレッセイン，アセト キシメチルエステル；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR）を、ＤＭＳＯ中５ ０μｇ／ｍｌに再構成し、１：５００の最終希釈になるように細胞懸濁物に加え た。３７℃で３０分間インキュベートした後、次に、細胞をアッセイ緩衝液（２ ％ウシ胎仔血清を含むＨＢＳＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプ トマイシン、ｐＨ７．２）で洗浄し、ｖ底９６ウエルプレートの各ウエルに５０ ，０００個の細胞を加えた。次いで、細胞を、アッセイ緩衝液中に１５．０〜０ ．０００７５μｇ／ｍｌの濃度の（ａ）ネズミＡｃｔ−１、（ｂ）ネズミＩｇＧ ｌ(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)、（ｃ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏ ｔ♯１、または（ｄ）ヒトＩｇＧ１（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO） のいずれか１００μｌに室温で１０分間再懸濁した。ＭＡｄＣＡＭ−１キメラで 被覆したプレートを洗浄してブロッキング緩衝液を除去し、次いで、これらの蛍 光標識されたＲＰＭＩ８８６６細胞を各ウエルに移した。該プレートをアルミホ イルで覆って、室温で３０分間、４０ＲＰＭのプラットホーム振盪機（New Brun swick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ）上に置いた。未結合の細胞を１回の 洗浄工程で除去し、続いて洗浄前後に、フルオレッセンス コンセントレーター アナライザー(Fluorescence Concentrator Analyzer)(IDEXX Laboratories，I nc.，Westbrook，ME)で蛍光を測定した（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで読む ）。各ウエルについての結合した細胞のパーセントは、式： を用いる相対蛍光単位（ＲＦＵ）から計算された。 ＬＤＰ−０２およびネズミＡｃｔ−１の両方は、用量に依存した様式で、ヒト ＭＡｄＣＡＭへのＲＰＭＩ８８６６細胞の接着を阻害した（図１８Ａ〜１８Ｂ） 。５０％接着を阻害する濃度（ＩＣ₅₀）は、ネズミＡｃｔ−１（０．００１８μ ｇ／ｍｌ）およびＬＤＰ−０２（０．００１４μｇ／ｍｌ）に関して相対的に類 似していた。したがって、ＬＤＰ−０２は、少なくともネズミＡｃｔ−１と同じ 程度に有効にＭＡｄＣＡＭ−１へのα４β７介在接着を機能的に阻害した。実施例５ 追加のヒト化抗体 前記したように、実施例２で設計された再形成抗体のいくつかの変異を作製し てアフィニティーを改良することおよび／または再形成抗体の抗原性を減少させ ることかできる。かかる構築物は、１以上の下記変異：軽鎖のＭ４Ｖ変異、重鎖 のＲ３８Ｋ変異、重鎖のＡ４０Ｒ変異および重鎖のＩ７３Ｔ復帰突然変異を有す るものを含むがこれに限定されるものではない。変異体は、独立して（例えば、 １つの鎖に１つの変異）または種々の組合せで生成させることができる。 例えば、図１９は、再形成抗体（実施例２で設計された）または軽鎖に１つの 追加の変異（ＭＶ４）および重鎖に２つの追加の変異（Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ）を 有する誘導体を用いたＨｕＴ７８染色の結果を示す。これらの２つの抗体は、Ｈ ｕＴ７８細胞で類似の染色パターンを示す（図１９）。該変異は、製造業者の提 案するプロトコールに従って、トランスフォーマー サイト−ディレクテッドミ ュータゼネシス キット（Clontech）を用いて核酸配列を変化させることにより 作製した。重鎖および軽鎖可変領域の両方の変異は、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMに クローニングされた可変領域で作製された。トランスオリゴＳｃａ１／ＳｔｕＩ （Clontech）をトランスオリゴ用に用いた。変異誘発オリゴの配列（配列番号： ３８〜４０）は、下記のようであった： 発現ベクターｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２へのサブクローニングなら びに重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現プラスミドの構築を含む他のすべて の操作は、最初の再形成抗体に関する記載と同様であった。また、一過性のトラ ンスフェクションおよび細胞染色も最初の再形成抗体に関する記載と同様になさ れた。均等物 当業者であれば、単なる日常的な実験方法によって、本明細書に記載された発 明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができる であろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲の範鴫に含まれることを意図 されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リングラー，ダグラス，ジェイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02151 リヴィア，ナンバー 1008，オー シャン アヴェニュー 382 (72)発明者 ジョーンズ，エス．，タラン 英国 ハートフォードシャー ダブリュデ ィー７ ８エイジー，ラドレット，クライ ストチャーチ クレッセント １ (72)発明者 ニューマン，ウォルター アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115 ボストン，ナンバー ３，ダーラ ム ストリート ３ (72)発明者 サンダニャ，ホセ 英国 ミドルセックス イーエヌ１ １テ ィーイー エンフィールド，リンカーン ウェイ 22エイ (72)発明者 ベンディグ，マリー，エム. 英国 ロンドン エヌ20 ０エックスエル グレシャム アヴェニュー 26

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 免疫グロブリンが非ヒト起源の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブ リンの少なくとも一部を含有してなる、α４β７インテグリンに対する結合特異 性を有するヒト化免疫グロブリン。 ２． ヒト起源の免疫グロブリンの一部がヒト定常領域に由来するものである請 求項１記載のヒト化免疫グロブリン。 ３． ヒト定常領域がガンマ型のものである請求項２記載のヒト化免疫グロブリ ン。 ４． 抗原結合領域が齧歯類起源のものである請求項２記載のヒト化免疫グロブ リン。 ５． 抗原結合領域がＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来するものである請求 項２記載のヒト化免疫グロブリン。 ６． 抗原結合領域が齧歯類起源の相補性決定領域を含有し、ヒト起源の免疫グ ロブリンの一部がヒト枠組み領域に由来するものである請求項１記載のヒト化免 疫グロブリン。 ７． 相補性決定領域がＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来するものである請 求項６記載のヒト化免疫グロブリン。 ８． α４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域およびヒ ト起源の軽鎖に由来する枠組み領域を含む軽鎖；ならびに α４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域およひヒト起 源の重鎖に由来する枠組み領域を含む重鎖 を含有してなる、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫 グロブリン。 ９． 前記免疫グロブリンがα４β７への結合に関してネズミＡｃｔ−１と競合 することができるものである請求項８記載のヒト化免疫グロブリン。 １０． 軽鎖がＡｃｔ−１抗体の軽鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有し 、重鎖がＡｃｔ−１抗体の重鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有してなる 請求項８記載のヒト化免疫グロブリン。 １１． ヒト起源の軽鎖がＧＭ６０７’ＣＬ抗体の軽鎖である請求項８記載のヒ ト化免疫グロブリン。 １２． ヒト起源の重鎖がヒト２１／２８’ＣＬ抗体である請求項８記載のヒト 化免疫グロブリン。 １３． ネズミＡｃｔ−１抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３なら びにヒト軽鎖枠組み領域を含有してなるヒト化免疫グロブリン軽鎖。 １４． ヒト枠組み領域がＧＭ６０７’ＣＬ抗体の軽鎖に由来するものである請 求項１３記載のヒト化免疫グロブリン軽鎖。 １５． 配列番号：２１の可変領域を含有してなる請求項１４記載のヒト化免疫 グロブリン軽鎖。 １６． 請求項１５記載のヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする単離された核 酸。 １７． 配列番号：２０の可変領域コーディング配列を含有してなる請求項１６ 記載の単離された核酸。 １８． Ａｃｔ−１抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにヒ ト重鎖枠組み領域を含有してなるヒト化免疫グロブリン重鎖。 １９． ヒト枠組み領域がヒト２１／２８’ＣＬ抗体の重鎖に由来するものであ る請求項１８記載のヒト化免疫グロブリン重鎖。 ２０． 配列番号：１９の可変領域を含有してなる請求項１９記載のヒト化免疫 グロブリン重鎖。 ２１． 請求項２０記載のヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする単離された核 酸。 ２２． 配列番号：１８の可変領域コーディング配列を含有してなる請求項２１ 記載の単離された核酸。 ２３． 軽鎖が図７（配列番号：１２）に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列の 少なくとも機能しうる部分を含有するアミノ酸配列を有する、ヒト化免疫グロブ リン軽鎖。 ２４． 軽鎖が図７（配列番号：１２）に示されたシグナルペプチド配列および 図７（配列番号：１２）に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも機能 しうる部分を含有するアミノ酸配列を有する、請求項２３記載のヒト化免疫グロ ブリン軽鎖。 ２５． 請求項２３記載のヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする配列を含有し てなる単離された核酸。 ２６． 配列番号：１１の可変領域コーディング配列を含有してなる請求項２５ 記載の単離された核酸。 ２７． 重鎖が図９（配列番号：１５）に示された重鎖可変領域アミノ酸配列の 少なくとも機能しうる部分を含有するアミノ酸配列を有する、ヒト化免疫グロブ リン重鎖。 ２８． 重鎖が図９（配列番号：１５）に示されたシグナルペプチド配列および 図９（配列番号：１５）に示された重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも機能 しうる部分を含有するアミノ酸配列を有する、請求項２７記載のヒト化免疫グロ ブリン重鎖。 ２９． 請求項２７記載のヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする単離された核 酸。 ３０． 配列番号：１４の可変領域コーディング配列を含有してなる請求項２９ 記載の単離された核酸。 ３１． 遺伝子がα４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト抗体 の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードす るヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子 を含有してなる発現ベクター。 ３２． 非ヒト抗体がネズミＡｃｔ−１抗体である請求項３１記載の発現ベクタ ー。 ３３． 請求項３１記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。 ３４． 遺伝子がα４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト抗体 の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードす るヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子 を含有してなる発現ベクター。 ３５． 非ヒト抗体がネズミＡｃｔ−１抗体である請求項３４記載の発現ベクタ ー。 ３６． 請求項３４記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。 ３７． ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする第１の組換え核酸およびヒト化 免疫グロブリン重鎖をコードする第２の組換え核酸を含有してなる宿主細胞であ って、 前記第１の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体の軽鎖に由来するＣＤＲおよひヒト起 源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含み；ならびに 、 前記第２の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起 源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞 。 ３８． 請求項３７記載の宿主細胞をヒト化免疫グロブリンの発現に適した条件 下で維持し、それによりヒト化免疫グロブリン鎖を発現させ、ヒト化免疫グロブ リンを産生する工程を含む、ヒト化免疫グロブリンの調製方法。 ３９． ヒト化免疫グロブリンの単離工程をさらに含む請求項３８記載の方法。 ４０． ａ）ネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する抗原結合領域をコ ードする第１の核酸配列；および ｂ） ヒト起源の免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部をコードする第２ の核酸配列 を含有してなるヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードする融合遺伝子。 ４１． α４β７を産生する第１細胞を請求項１記載のヒト化免疫グロブリンの 有効量と接触させる工程を含む、前記第１細胞とそのリガンドを産生する第２細 胞との相互作用を阻害する方法。 ４２． 請求項１記載のヒト化免疫グロブリンの有効量を患者に投与する工程を 含む、粘膜組織の白血球浸潤を阻害する方法。 ４３． 請求項１記載のヒト化免疫グロブリンの有効量を患者に投与する工程を 含む、ＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織の白血球浸潤に関連する疾患の治療 方法。 ４４． 該疾患がＭＡｄＣＡＭ分子を発現する腸に関連した内皮への白血球の結 合の結果としての組織の白血球浸潤に関連する疾患である、請求項４３記載の方 法。 ４５． 請求項１記載のヒト化免疫グロブリンの有効量を患者に投与する工程を 含む、炎症性腸疾患の患者における治療方法。 ４６． 治療または診断における使用のための請求項１記載のヒト化免疫グロブ リン。 ４７． 組織の白血球浸潤に関連する疾患（例えば、炎症疾患）の治療における 使用のための請求項１記載のヒト化免疫グロブリン。 ４８． 炎症性腸疾患の治療における使用のための請求項１記載のヒト化免疫グ ロブリン。 ４９． 組織の白血球浸潤に関連する疾患（例えば、炎症疾患）の治療用の医薬 の製造のための請求項１記載のヒト化免疫グロブリンの使用。 ５０． 炎症性腸疾患の治療用の医薬の製造のための請求項１記載のヒト化免疫 グロブリンの使用。 ５１． 請求項１記載のヒト化免疫グロブリンおよび適当な担体を含有してなる 医薬組成物。