BRPI9711079B1

BRPI9711079B1 - Humanized immunoglobulin or antigen-binding fragment thereof, isolated nucleic acid, expression vector, humanized heavy chain immunoglobulin or antigen-binding fragment thereof, method for preparing a humanized light chain immunoglobulin, pharmaceutical composition and use of an immunoglobulin humanized or antigen-binding fragment thereof

Info

Publication number: BRPI9711079B1
Application number: BRPI9711079-5A
Authority: BR
Inventors: D. Ponath Paul; J. Ringler Douglas; Tarran Jones S.; Newman Walter; Saldanha José; M. Bendig Mary
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1996-08-15
Filing date: 1997-08-06
Publication date: 2017-06-20
Also published as: JP4578536B2; US7402410B2; BRPI9711079B8; EP0918797B1; JP4171071B2; DK0918797T3; ES2262186T3; US20060292140A1; EP0918797B2; JP2001507210A; DE69735596D1; DK0918797T4; LTC0918797I2; CA2263106A1; CA2263106C; NZ334226A; SI0918797T2; SI0918797T1; JP2008281562A; ES2262186T5

Abstract

"imunoglobulina humanizada reagente com integrina <244>4<225>7" e métodos para sua obtenção e para seu uso". a presente invenção relaciona-se a imunoglobulinas humanizadas tendo especificidade de ligação em relação a integrina <244>4<225>7, compreendendo uma região de ligação a antígeno de origem não humana (por exemplo, de roedor) e pelo menos uma porção de uma imunoglubulina de origem humana (por exemplo, uma região de estrutura humana, uma região constante humana). em uma incorporação, a imunoglobulina humanizada pode competir com act-1 murino em relação à ligação a integrina <244>4<225>7 humana. em uma incorporação preferida, a região de ligação a antígeno da imunoglobulina humanizada compreende cada uma das regiões determinadoras de complementaridade das cadeias leve e pesada do anticorpo act-1 murino. a presente invenção relaciona-se, ademais, a uma cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, a ácidos nucléicos isolados compreendendo uma seqüência codificando uma imunoglobulina ou cadeia de imunoglobulina humanizada da presente invenção (por exemplo, um anticorpo de cadeia única), construções compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, e células hospedeiras compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, úteis em um método para preparar uma imunoglobulina humanizada. as imunoglobulinas humanizadas podem ser usadas em aplicações de diagnóstico e terapêutica em seres humanos, por exemplo, para controlar a infiltração (incluindo recrutamento e/ou acumulação de linfócitos em tecido mucosal.

Description

"IMUNOGLOBULINA HUMANIZADA OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA MESMA, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, IMUNOGLOBULINA HUMANIZADA DE CADEIA PESADA OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA MESMA, MÉTODO PARA PREPARAR UMA IMUNOGLOBULINA HUMANIZADA DE CADEIA LEVE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UMA IMUNOGLOBULINA HUMANIZADA OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA MESMA". Histórico Os receptores de integrina são importantes para regular ambas a recirculação de linfócitos e o recrutamento para locais de inflamação (Carlos, T.M. e Harlan, J.M,, Blood, 54:2068-2101 (1994)). A integrina α4β7 humana possui vários ligandos, um dos quais é a adressina MAdCAM-1 vascular mucosal (Berlin, C., et al., Cell 74:185-195 (1993); Erle, D.J., et al., J. Immunol. 153:517-528 (1994) expressa em vênulas endoteliais elevadas em nódulos linfáticos mesentéricos e segmentos de Peyer (Streeter, P.R., et al., Nature 331:41-46 (1998). A integrina α4β7 como tal atua como um receptor de direcionamento mediando a migração de linfócitos para o tecido linfóide mucosal intestinal (Schweighoffer, T., et al., J. Immunol. 151:717-729 (1993). Ademais, a integrina α4β7 interage com a fibronectina e a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1). A doença inflamatória intestinal (IBD), tal como a colite ulcerativa e a doença de Crohn, por exemplo, pode ser uma doença debilitante e progressiva envolvendo a inflamação do trato gastrointestinal. Afetando estimadamente dois milhões de pessoas somente nos Estados Unidos, os sintomas incluem dor abdominal, câimbras, diarréia e sangramento retal. Os tratamentos de IBD têm incluido medicações anti- inflamatórias (tais como corticosteróides e sulfasalazina), medicações imunosupressoras (tais como 6-mercaptopurina, ciclosporina e azatioprina) e cirurgia (tais como colectomia). Podolsky, New Engl. J. Med., 325:928-937 (1991) e Podolski, New Engl. J. Med., 325:1008-1016 (1991). Os anticorpos contra a integrina α4β7 humana, tais como o "segue-se folha la" anticorpo monoclonal de rato (mAb Act-1), interferem na ligação da integrina α4β7 à molécula de adesão celular adressina mucosal (MAdCAM-1) presente nas vênulas endoteliais elevadas em nódulos linfáticos mucosais. 0 Act-1 foi originalmente isolado por Lazarovits, A.I., et ai., J. Immunol. 133:1857-1862 (1994), a partir de camundongos imunizados com linfócitos T específicos a toxólde de tétano humano e foi relatado como sendo um anticorpo IgG'/K de camundongo. Uma análise mais recente do anticorpo, por Schweighoffer, T., et al. , J, Immunol. 151:717-729 (1993) demonstrou que o mesmo pode ligar-se a um subconjunto de linfócitos CD4+ T de memória humanos que expressam seletivamente a integrina α4β7. Contudo, um grave problema em relação ao uso de anticorpos murinos para aplicações terapêuticas em seres humanos é que os mesmos são altamente imunogênicos em seres humanos e rapidamente induzem uma resposta humana a anticorpo murino (HAMA), que reduz a eficácia do anticorpo do camundongo nos pacientes e pode impedir uma administração continuada. A resposta HAMA resulta em rápida excreção do anticorpo de camundongo, limitando gravemente qualquer benefício terapêutico.

Assim, existe uma necessidade de enfoques terapêuticos aperfeiçoado em relação às doenças inflamatórias intestinais.

Sumário da Invenção A presente invenção relaciona-se a uma imunoglobulina tendo especificidade de ligação para integrina α4β7, compreendendo a citada imunoglobulina uma região de ligação a antígeno de origem não humana (por exemplo, roedor) e pelo menos uma porção de uma imunoglobulina de origem humana (por exemplo, uma região de estrutura humana, uma região constante humana do tipo gama). Em uma incorporação, a imunoglobulina humanizada descrita no presente pode competir com Act-l ou LDP-02 murino (vide, por exemplo, o Exemplo 4) em relação à integrina α4β7. Em uma incorporação preferida, a região de ligação a antígeno da imunoglobulina humanizada é derivada de anticorpo monoclonal Act-l (por exemplo, LDP-02, uma imunoglobulina compreendendo as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas mostradas na figura 11 (SEQ ID Nfi 19) e na figura 12 (SEQ ID NQ 21), respectivamente).

Por exemplo, a imunoglobulina humanizada pode compreender uma região de ligação a antígeno compreendendo uma região determinadora de complementaridade (CDR) de origem não humana, e uma região de estrutura (FR) derivada de uma região de estrutura humana. Em um aspecto, a imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação à integrina α4β7, compreende uma cadeia leve compreendendo um CDR derivado de um anticorpo de origem não humana, que liga α4β7 e uma FR derivada de uma cadeia leve de origem humana (por exemplo, GM607'CL), e uma cadeia pesada compreendendo um CDR derivado de um anticorpo de origem não humana que liga α4β7 e uma FR derivada de uma cadeia pesada de origem humana (por exemplo, 21/28'CL). Em outro aspecto, a cadeia leve compreende três CDRs derivados da cadeia leve do anticorpo Act-1, e a cadeia pesada compreende três CDRs derivados da cadeia pesada do anticorpo Act-1. A presente invenção relaciona-se também a cadeias leves de imunoglobulina humanizadas (por exemplo, compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo Act-1, e uma linha leve FR humana), e a cadeias pesadas de imunoglobulina humanizada (por exemplo, compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo Act-1, e uma cadeia pesada FR humana). Em uma incorporação preferida, a invenção relaciona-se a cadeias leves e pesadas humanizadas descritas no presente (por exemplo, uma cadeia leve humanizada compreendendo a região variável da cadeia leve mostrada na figura 7 (SEQ ID Na 12), uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada mostrada na figura 9 (SEQ ID Na 15), uma cadeia leve humanizada compreendendo a região variável da cadeia leve mostrada na figura 12 (SEQ ID NQ 21), uma cadeia pesada humanizada compreendendo a região variável da cadeia pesada mostrada na figura 11 (SEQ ID N2 19). São também abrangidas imunoglobulinas humanizadas compreendendo uma ou mais cadeias leves e/ou pesadas humanizadas. A invenção relaciona-se, ademais, a ácidos nucléicõs isolados compreendendo uma seqüência codificando uma imunoglobulina humanizada da presente invenção (por exemplo, um anticorpo de cadeia única), bem como a ácidos nucléicos isolados compreendendo uma seqüência codificando uma cadeia leve (por exemplo, SEQ ID NB 20) ou cadeia leve (por exemplo, SEQ ID N° 18) de imunoglobulina humanizada, da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção provê um gene fundido codificando uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada compreendendo uma primeira seqüência de ácidos nucléicos codificando uma região de ligação a antígeno derivada de anticorpo monoclonal Act-1 murino; e uma segunda seqüência de ácidos nucléicos codificando pelo menos uma porção de uma região constante de uma imunoglobulina de origem humana. A presente invenção relaciona-se, ademais, a uma construção compreendendo um ácido nucléico codificando uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 ou uma cadeia de tal imunoglobulina. Por exemplo, é provido um vetor de expressão compreendendo um gene fundido codificando uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando um CDR derivado de uma cadeia leve de um anticorpo não humano tendo especificidade de ligação em relação à integrina α4β7, e uma região de estrutura derivada de uma cadeia leve de origem humana. Um vetor de expressão compreendendo um gene fundido codificando uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um CDR derivado de uma cadeia pesada de um anticorpo não humano tendo especificidade de ligação em relação à integrina α4β7, e uma região de estrutura derivada de uma cadeia pesada de origem humana é outro exemplo de tal construção. A presente invenção relaciona-se, ademais, a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, incluindo uma ou mais construções compreendendo um ácido nucléico da presente invenção. Em uma incorporação, a invenção relaciona-se a uma célula hospedeira compreendendo um primeiro ácido nucléico recombinante codificando uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada, e um segundo ácido nucléico recombinante codificando uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, compreendendo o citado primeiro ácido nucléico uma seqüência de nucleotídeos codificando um CDR derivado da cadeia leve de anticorpo Act-l murino e uma região de estrutura derivada de uma cadeia leve de origem humana; e compreendendo o citado segundo ácido nucléico uma seqüência de nucleotídeos codificando um CDR derivado da cadeia pesada de anticorpo Act-l murino e uma região de estrutura derivada de uma cadeia pesada de origem humana. A presente invenção provê, ademais, um método para preparar uma imunoglobulina humanizada compreendendo manter uma célula hospedeira da presente invenção sob condições apropriadas para a expressão de uma imunoglobulina humanizada, pelo que cadeia(s) de imunoglobulina humanizada(s} é(são) expressada(s) e é produzida uma imunoglobulina humanizada. 0 método pode compreender, ademais, a etapa de isolar a imunoglobulina humanizada.

As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção podem ser menos imunogênicas do que seus equivalentes murinos ou outros humanos. Assim, as imunoglobulinas humanizadas descritas no presente podem ser usadas como agentes terapêuticos em seres humanos, por exemplo, para controlar o direcionamento de linfócitos até o tecido linfóide mucosal, reduzindo assim as respostas inflamatórias nos intestinos. A invenção relaciona-se, ademais, a uma imunoglobulina humanizada da presente invenção para uso no diagnóstico ou terapia (incluindo profilaxia). Em uma incorporação, a invenção relaciona-se a uma imunoglobulina humanizada da presente invenção para uso no tratamento de doenças associadas à infiltração de tecidos por leucócitos, por exemplo, no tratamento de doenças inflamatórias, incluindo doenças associadas à infiltração de leucócitos no trato gastrointestinal (incluindo o endotélio associado aos intestinos), outros tecidos mucosais, ou tecidos expressando a molécula MAdCAM-1. Em uma incorporação particularmente preferida, a invenção relaciona-se a uma imunoglobulina humanizada da presente invenção para uso no tratamento de doença inflamatória dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa ou doença de Crohn.

Em outro aspecto, a invenção relaciona-se ao uso de uma imunoglobulina humanizada da presente invenção para a fabricação de uma medicação para o tratamento de doenças associadas à infiltração de tecidos por leucócitos, por exemplo, no tratamento de doenças inflamatórias, incluindo doenças associadas à infiltração de leucócitos no trato gastrointestetinal, outros tecidos mucosais, ou tecidos expressando a molécula MAdCAM-1. Em uma incorporação particularmente preferida, A invenção relaciona-se ao uso de uma imunoglobulina humanizada da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença inflamatória dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa ou doença de Crohn.

Breve Descrição das figuras A figura 1 é uma ilustração de uma sequência de DNA de consenso (SEQ ID Ne 1) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NQ 2) compreendendo a região variável determinada a partir de vários clones independentes de região variável de cadeia pesada de camundongo. A figura 2 é uma ilustração de uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID Na 3) e seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID ND 4) compreendendo uma porção da seqüência da região variável determinada a partir de um clone independente de região variável de cadeia pesada de camundongo designado H2B#34. A figura 3 é uma ilustração de uma seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NQ 5) e seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N° 6) compreendendo a região variável de vários clones independentes de região variável de cadeia leve de camundongo. São indicadas as posições de duas mutações feitas para introduzir um local de clonagem Kasl. A figura 4A é uma tabulação de fluorescência ilustrando a capacidade do mAb de Act-1 murino e de um anticorpo de controle irrelevante acoplado a isotipo de camundongo (M0PC21; IgGl, kappa), de manchar células HuT 78 expressando integrina α4β7 . A figura 4B é uma tabulação de fluorescência ilustrando a capacidade de (i) anticorpo Act-1 quimérico, (ii) um anticorpo de controle irrelevante acoplado a isotipo humano (IgGl/ kappa), e (iii) um sobrenadante de células COS-7, de manchar células HuT 78 expressando integrina α4β7. A figura 5 é um alinhamento das seqüências de aminoácido da região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo ("Act-l.vl") (SEQ ID NQ 7) e da região variável de cadeia leve de GM 607'CL humano (SEQ ID Ne 8). Os aminoácidos idênticos são indicados por uma linha vertical e os aminoácidos similares são indicados por quatro ou dois pontos, dependendo do grau de similaridade. Os CDR's estão entre chaves e rotulados, e os resíduos são numerados seqüencialmente. A figura 6 é um alinhamento das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo ("Act-1.vh") (SEQ ID Mõ 9) e da região variável de cadeia pesada de 21/28'CL humano (SEQ ID N2 10). Os aminoácidos idênticos são indicados por uma linha vertical e os aminoácidos similares são indicados por quatro ou dois pontos, dependendo do grau de similaridade. Os CDRs estão entre chaves e rotulados, e os resíduos estão numerados seqüencialmente. A figura 7 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos (SEQ ID Ns 11) e da seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NQ 12) da região variável de cadeia leve Act-1 do camundongo, unida à seqüência de peptídeos de cadeia leve de Act-1 de camundongo. A figura 8 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos (SEQ ID Nfi 13) e da seqüência de aminoácidos (SEQ ID N° 8) da região variável de cadeia leve do anticorpo kappa GM607'CL humano maduro. A figura 9 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos e da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo Act-1 do camundongo A seqüência de nucleotídeos da região variável é unida a uma seqüência de nucleotídeos codificando uma seqüência deduzida de peptídeos de sinal de cadeia pesada de Act-1 de camundongo, para produzir uma seqüência composta (SEQ ID Na 14 e 15). (A identidade do imprimador que amplificou a região de cadeia pesada foi deduzida a partir da seqüência degenerada, e uma seqüência de aminoácidos para o peptídeo de sinal foi derivada do imprimador, da seqüência a jusante e das seqüências de outros peptídeos de sinal. 0 peptídeo de sinal mostrado pode não ser idêntico ao do hibridoma de Act-1). A figura 10 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos e da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 21/28'CL humano. A seqüência de nucleotídeos codificando a região variável é unida a uma seqüência de nucleotídeos codificando uma seqüência de peptídeos de sinal derivada do Vg do HG3'CL de anticorpo humano (Rechavi, G., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA 80:855-859 (1983), para produzir uma seqüência composta (SEQ ID Na 16 e 17). A figura 11 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos (SEQ ID Ns 18) e da seqüência de aminoácidos (SEQ ID N2 19) de uma porção da cadeia pesada de um anticorpo Act-1 humanizado (LDP-02) com um peptídeo de sinal de cadeia pesada. A figura 12 é uma ilustração da seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NB 20) e da seqüência de aminoácidos (SEQ ID N2 21) de uma porção da cadeia leve de um anticorpo Act-1 humanizado (LDP-02) com um peptídeo de sinal de cadeia leve. A figura 13 é uma ilustração das seqüências de oligonucleotídeo dos oligonucleotídeos complementares sobrepostos designados L1-L6 (SEQ ID NQ 22-27), utilizados para produzir a cadeia leve de uma imunoglobulina Act-1 humanizada (LDP-02), e as seqüências de nucleotídeo dos oligonucleotídeos complementares sobrepostos designados Hl- Η10 (SEQ ID NQ 28-37), utilizados para produzir a cadeia pesada da imunoglobulina Act-1 humanizada. A figura 14 é uma tabulação de fluorescência ilustrando as manchas produzidas em células HuT 78 usando uma imunoglobulina quimérica Act-1 murina-humana, uma imunoglobulina Act-1 humanizada ou um anticorpo de controle irrelevante acoplado a isotipo humano (IgGl, kappa) . A figura 15 é um gráfico ilustrando os resultados de uma titulação de Act-1 murino biotinilado e Act-1 humanizado (LDP-02/3A9/LOTE#1), Exemplo 4), realizada por citometria de fluxo em células Hut-78. A figura 15 é um gráfico ilustrando a inibição competitiva de ligação de Act-1 murino biotinilado por Act-1 murino ou uma imunoglobulina de Act-1 humanizado (LDP-02/3A9/LOTE#1, Exemplo 4), comparada com IgGl murino ou IgGl humano de controle. A figura 17 é um gráfico ilustrando os resultados de um ensaio de liberação de ^cromo para lise celular mediada por complemento, de células mononucleares sangüíneas periféricas humanas, na presença de (a) CAMPATH-1H, (b) CAMPATH-1G, (c) IgGl humano, (d) LDP-02/3A9/Lote#l (Exemplo 4), ou (e) LDP-01 (anti-CD18 humanizado mutacionado com Fc), a concentrações de 50, 25, 5, 2,5 e 0,5μg/ml.

As figuras 18A-18B são gráficos ilustrando os resultados de um ensaio de adesão monitorando a inibição de adesão por Act-1 murino (figura 18A), IgGl murino (figura 18A), LDP-02/3A9/Lote#l (figura 18B) ou IgGl humano (figura 18B) de células contendo α4β7 (RPMI 8866) e uma quimera MAdCAM-l-Ig humana (imunoadesina). A figura 19 é um gráfico comparando a produção de manchas em células HuT 78 usando (a) LDP-02 (mutacionadas com Fc), (b) um derivado de LDP-02 (mutacionado com Fc) tendo uma mutação na cadeia leve (MV4), mais uma mutação dupla na cadeia pesada (R38K, A40R), ou (c) um anticorpo de controle acoplado a isotipo humano, irrelevante (IgGl, kappa). Descrição Detalhada A presente invenção relaciona-se a uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de adesão ema relação a integrina α4β7, compreendendo uma região de ligação a antígeno de origem não humana e pelo menos uma porção de uma imunoglobulina de origem humana. Preferivelmente, as imunoglobulinas humanizadas podem ligar-se a integrina α4β7 com uma afinidade de pelo menos 10^ M~l, preferivelmente pelo menos cerca de 10^ M"1 e, mais preferivelmente, de pelo menos 10^ M”-*-. Em uma incorporação, a imunoglobulina humanizada inclui uma região de ligação a antígeno de origem não humana, que se liga a integrina α4β7 e uma região constante derivada de uma região constante humana. Em outra incorporação, a imunoglobulina humanizada que se liga a integrina α4β7 compreende uma região determinadora de complementaridade de origem não humana e uma região de estrutura variável de origem humana e, opcionalmente, uma região constante de origem humana. Por exemplo, a imunoglobulina humanizada pode compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde a cadeia leve compreende uma região determinadora de complementaridade derivada de um anticorpo de origem não humana que se liga a integrina α4β7 e uma região de estrutura derivada de uma cadeia leve de origem humana, e a cadeia pesada compreende uma região determinadora de complementaridade derivada de um anticorpo de origem não humana que se liga a integrina α4β7 e uma região de estrutura derivada de uma cadeia pesada de origem humana. A presente invenção relaciona-se, ademais, a uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada ou uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada. Em uma incorporação, a invenção relaciona-se a uma cadeia leve humanizada compreendendo uma cadeia leve CDR {isto é, um ou mais CDRs) de origem não humana e uma região de estrutura de cadeia leve humana. Em outra incorporação, a presente invenção relaciona-se a uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada compreendendo um CDR de cadeia pesada (isto é, um ou mais CDRs) de origem não humana e uma região de estrutura de cadeia pesada humana. Os CDRs podem ser derivados de uma imunoglobulina não humana.

As imunoglobulinas de ocorrência natural têm uma estrutura de núcleo comum, na qual duas cadeias leves idênticas (de cerca de 24 kD) e duas cadeias pesadas idênticas (de cerca de 55 ou 70 kD) formam um tetrâmero. A porção amino-terminal de cada cadeia é conhecida como a região variável (V) e pode ser distinguida das regiões constantes mais conservadas (C) do restante de cada cadeia. Dentro da região variável da cadeia leve existe uma porção C-terminal conhecida como região J. Dentro da região variável da cadeia pesada, existe uma região D em adição à região J. A maior parte das variações de seqüências de aminoácidos nas imunoglobulinas está confinada a três locais separados nas regiões V, conhecidas como regiões hipervariáveis, ou regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) que estão diretamente envolvidas na ligação a antígenos. Partindo do término amino, estas regiões são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. Os CDRs são retidos no lugar pelas regiões de estrutura mais conservadas (FRs). Partindo do término amino, estas regiões são designadas FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente. As localizações das regiões CDR e FR e o sistema de numeração foram definidos por Kabat et al., (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991); vide também Tabelas 3 e 4).

As imunoglobulinas humanas podem ser divididas em classes e subclasses, dependendo do isotipo da cadeia pesada. As classes incluem IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, nas quais as cadeias pesadas são do tipo gama (γ), mu (μ), alfa (a), delta (8), ou epsilon (£) , respectivamente. As subclasses incluem IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2, nas quais as cadeias pesadas são do tipo γΐ, γ2, γ3, γ4, al e α2, respectivamente. As moléculas de imunoglobulina humana de uma classe ou subclasse selecionada podem conter quer uma cadeia leve kappa (K), quer larobda (λ). Vide, por exemplo, Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Capítulo 45, pp. 41-50, W.B. Saunders Co., Philadelphia· PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2- Edição, Capítulo 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984). O termo "imunoglobulina", como usado no presente, inclui anticorpos integrais e fragmentos biologicamente funcionais dos mesmos. Tais fragmentos biologicamente funcionais retêm pelo menos uma função de ligação a antígeno de um anticorpo de comprimento integral correspondente (por exemplo, especificidade em relação a α4β7 de anticorpo Act-1) e, preferivelmente, retêm a capacidade de inibir a interação de α4β7 com um ou mais de seus ligandos (por exemplo, MAdCAM-1, fibronectina). Em uma incorporação particularmente preferida, fragmentos biologicamente funcionais podem inibir a ligação de α4β7 à adressina mucosal (MAdCAM-1). Os exemplos de fragmentos de anticorpos biologicamente funcionais que podem ser utilizados incluem fragmentos capazes de ligar-se a uma integrina α4β7, tal como anticorpos de cadeia singela, fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2- Tais fragmentos podem ser produzidos por divagem enzimática ou através de técnicas recombinantes. Por exemplo, pode-se utilizar divagem com papaína ou pepsina para gerar os fragmentos Fab ou F(ab')2/ respectivamente. Os anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas truncadas, usando genes de anticorpos nos quais um ou mais codons de parada foram introduzidos a montante do local de parada natural. Por exemplo, um gene quimérico codificando a cadeia pesada de um fragmento F(ab')2 pode ser projetado para incluir seqüências de DNA codificando o domínio CH^ e região de dobra da cadeia pesada. 0 termo "imunoglobulina humanizada", como usado no presente, refere-se a uma imunoglobulina compreendendo porções de imunoglobulinas de origem diferente, onde pelo menos uma porção é de origem humana. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender porções derivadas de uma imunoglobulina de origem não humana tendo a especificidade necessária, tal como um camundongo, e de seqüências de imunoglobulinas de origem humana (por exemplo, imunoglobulina quimérica), unidas quimicamente entre si através de técnicas convencionais (por exemplo, sintéticas) ou preparadas como um polipeptídeo contíguo usando técnicas de engenharia genética (por exemplo, DNA codificando as porções de proteína do anticorpo quimérico pode ser expressado para produzir uma cadeia de polipeptídeos contígua). Outro exemplo de uma imunoglobulina humanizada da presente invenção é uma imunoglobulina contendo uma ou mais cadeias de imunoglobulina compreendendo um CDR derivado de um anticorpo de origem não humana e uma região de estrutura derivada de uma cadeia leve e/ou pesada de origem humana (por exemplo, anticorpos enxertados a CDR com ou sem alterações de estrutura). Anticorpos de cadeia singela quiméricos ou enxertados em CDR também são abrangidos pelo termo imunoglobulina humanizada. Vide, por exemplo, Cabilly et al. , Patente dos E.U.A. NQ 4.816.567; Cabilly et al. , Patente Européia Ns 0.125.023 Bl; Boss et al., Patente dos E.U.A. Na 4.816.397; Boss et al., Patente Européia N2 0.120.694 Bl; Neuberger, M.S. et al. , WO 86/10533; Neuberger, M.S. et al., Patente Européia NQ 0.194.276 Bl; Winter, Patente dos E.U.A. NQ 5.225.539; Winter, Patente Européia Na 0.239.400 Bl; Padlan, E.A. et al. , Pedido de Patente Europeu N2 0.519.596 Al. Vide também Ladner et al., Patente dos E.U.A. NQ 4.946.778; Houston, Patente dos E.U.A. Na 5.476.786; e Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426 (1988)), relativos a anticorpos de cadeia singela. A região de ligação a antígeno da imunoglobulina humanizada (a porção não humana) pode ser derivada de uma imunoglobulina de origem não humana (denominada imunoglobulina doadora) tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7. Por exemplo, uma região de ligação a antígeno adequada pode ser derivada do anticorpo monoclonal Act-1 murino (Lazarovits, A.I. et al., J. immunol., 133(4):1857-1862 (1984)); vide, por exemplo, Exemplos 1-3). Outras fontes incluem anticorpos específicos a integrina α4β7 obtidos a partir de fontes não humanas, tais como de roedor (por exemplo, camundongo, rato), coelho, porco, cabra ou primata não humano (por exemplo, macaco). Outros anticorpos policlonais ou monoclonais, tais como anticorpos que se ligam ao epitopo igual ou similar ao anticorpo Act-1, podem ser produzidos (por exemplo, Kohler et al. , Nature, 256:495-497 (1975); Harlow et al. , 1988, Antíbodíes: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY); e Current Protocols ín Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verão de '94), Ausubel, et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Capítulo 11 (1991).

Por exemplo, anticorpos podem ser levantados contra um imunógeno apropriado em um mamífero adequado (por exemplo, um camundongo, rato, coelho ou ovelha). As células contendo α4β7, frações de membrana contendo α4β7, fragmentos imunogênicos α4β7, um peptídeo β7 conjugado com um portador adequado, são exemplos de imunógenos adequados. Células produtoras de anticorpos (por exemplo, um linfócito) podem ser isolados, por exemplo, dos nódulos linfáticos ou do baço de um animal imunizado. As células podem então ser fundidas em uma célula imortalizada adequada (por exemplo, uma linha de células de mieloma) , formando assim um hibridoma. As células fundidas podem ser isoladas empregando técnicas de cultura seletiva. As células produtoras de anticorpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ELISA). As imunoglobulinas de origem não humana tendo especificidade de ligação em relação à integrina α4β7 também podem ser obtidas a partir de bibliotecas de anticorpos (por exemplo, uma biblioteca de fagos compreendendo moléculas Fab não humanas).

Em uma incorporação, a região de ligação a antígeno da imunoglobulina humanizada compreende um CDR de origem não humana. Nesta incorporação, a imunoglobulina tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 compreende pelo menos um CDR de origem não humana. Por exemplo, CDRs podem ser derivados das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulinas de origem não humana, de tal modo que uma imunoglobulina humanizada inclua CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia substancialmente pesada, e/ou CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve de uma ou mais imunoglobulinas de origem não humana, e a imunoglobulina humanizada resultante tem especificidade de ligação em relação a integrina α4β7. Preferivelmente, todos os três CDRs de uma cadeia selecionada são substancialmente os mesmos que os CDRs da cadeia correspondente de um doador e, mais preferivelmente, todos os três CDRs das cadeias leves e pesadas são substancialmente os mesmos que os CDRs da cadeia doadora correspondente. A porção da imunoglobulina humanizada ou da cadeia de imunoglobulina de origem humana (a porção humana) pode ser derivada de qualquer imunoglobulina ou cadeia de imunoglobulina humana adequada. Por exemplo, uma região constante humana ou porção da mesma, se presente, pode ser derivada das cadeias levesK ou λ, e/ou das cadeias pesadasγ (por exemplo, γΐ, γ2, γ3 , γ4 ), μ, α (por exemplo, αΐ, α2), δ ou ε de anticorpos humanos, incluindo variantes alélicas. Uma região constante particular (por exemplo, IgGl), variante ou porções da mesma pode ser selecionada para adaptar a função de efeito. Por exemplo, uma região constante mutante (variante) pode ser incorporada em uma proteína de fusão para minimizar a ligação a receptores Fc e/ou a capacidade de fixar complemento (vide, por exemplo, o Exemplo 3; vide também Winter et al. , GB 2.209.757 B; Morrison et al. , WO 89/07142; Morgan et al., W094/29351, 22 de Dezembro de 1994) .

Se presentes, as regiões de estrutura humana (por exemplo, da região variável de cadeia leve) são preferivelmente derivadas de uma região variável de anticorpo humano tendo similaridade de seqüência à região análoga ou equivalente (por exemplo, região variável de cadeia leve) do doador de região de ligação a antígeno. Outras fontes de regiões de estrutura para porções de origem humana de uma imunoglobulina humanizada incluem seqüências de consenso variáveis (vide, por exemplo, o Exemplo 2; vide também Kettleborough, C.A. et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al. , WO 94/04679, publicado em 03 de Março de 1994 )). Por exemplo, a seqüência do anticorpo ou região variável usada para obter a porção não humana pode ser comparada com seqüências humanas, como descrito em Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of immunological Interest, Quinta Edição, Ü.S. Department of Health and Human Services, Ü.S. Government Printing Office (1991). Em uma incorporação particularmente preferida, as regiões de estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são derivadas de uma região variável humana tendo pelo menos cerca de 65% de identidade de seqüência total e, preferivelmente, pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência total, com a região variável do doador não humano (por exemplo, anticorpo Act-1 de camundongo). Uma porção humana pode também ser derivada de um anticorpo humano tendo pelo menos cerca de 65% de identidade de seqüência e, preferivelmente, pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência, dentro da porção particular (por exemplo, FR) sendo utilizada, quando comparada com a porção equivalente (por exemplo, FR) do doador não humano. Por exemplo, como descrito no Exemplo 2, a identidade de seqüência total entre as regiões variáveis de cadeia leve Act-1 de camundongo e GM607'CL humana era de 71,4%, e a identidade de seqüência total entre as regiões variáveis de cadeia pesada Act-1 de camundongo e 21/28'CL humana era de 68,1%. Em uma incorporação, a imunoglobulina humanizada compreende pelo menos uma das regiões de estrutura (FR) derivada de uma ou mais cadeias de um anticorpo de origem humana. Assim, a FR pode incluir uma FR1 e/ou FR2 e/ou FR3 e/ou FR4 derivada de um ou mais anticorpos de origem humana. Preferivelmente, a porção humana de uma cadeia humanizada selecionada inclui FR1, FR2, FR3 e FR4 derivadas de uma região variável de origem humana (por exemplo, de uma cadeia de imunoglobulina humana, de uma seqüência de consenso humana).

As porções de imunoglobulina de origem não humana e humana para uso na presente invenção têm seqüências idênticas às imunoglobulinas ou porções de imunoglobulina das quais as mesmas são derivadas, ou a variantes das mesmas. Tais variantes incluem mutantes diferindo pela adição, cancelamento, ou substituição de um ou mais resíduos. Como indicado acima, os CDRs de origem não humana são substancialmente os mesmos que os do doador não humano e, preferivelmente, são idênticos aos CDRs do doador não humano. Como descrito no Exemplo 2, pode-se fazer alterações na região de estrutura, tais como as que substituem um resíduo da região de estrutura de origem humana por um resíduo ca posição correspondente do doador. Pode-se fazer uma ou mais mutações na região de estrutura, incluindo cancelamentos, inserções e substituições de um ou mais aminoácidos. Varias de tais substituições estão descritas no projeto de um anticorpo Act-1 humanizado no Exemplo 2. Para um anticorpo ou cadeia humanizado selecionado, as mutações de estrutura podem ser projetadas como descrito no presente. Preferivelmente, as imunoglobulinas podem ligar-se a integrina α4β7 com uma afinidade similar a, ou melhor que a do doador não humano. Pode-se produzir variantes através de uma variedade de métodos adequados, incluindo mutagênese de cadeias de doador não humano ou receptor humano.

As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção têm especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 humana, e incluem imunoglobulinas humanizadas (incluindo fragmentos) que podem ligar-se a determinantes das cadeias 0.4 e/ou β7 do heterodímero. Em uma incorporação preferida, a imunoglobulina humanizada da presente invenção tem pelo menos uma função característica de anticorpo Act-1 murino, tal como função de ligação (por exemplo, tendo especificidade em relação a integrina α4β7, tendo a mesma ou similar especificidade epitópica), e/ou função inibidora (por exemplo, a capacidade de inibir a adesão dependente de integrina α4β7 in vitro e/ou in vivo, tal como a capacidade de inibir a ligação de integrina (Χ4β7 a MAdCAM-1 in vitro e/ou in vivo, ou a capacidade de inibir a ligação de uma célula portando integrina α4β7 a um ligando da mesma (por exemplo, uma célula portando MAdCAM-1)). Assim, as imunoglobulinas humanizadas preferidas podem ter a especificidade de adesão do anticorpo Act-1 murino, a especificidade epitópica de anticorpo Act-1 murino (por exemplo, podem competir com o Act-1 murino, um anticorpo Act-1 quimérico (vide, por exemplo, o Exemplo 1), ou Act-1 humano (por exemplo, LDP-02) em relação á ligação a α4β7 (por exemplo, em uma célula portando integrina α4β7), e/ou função inibidora. A função de ligação de uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 pode ser detectada através de métodos imunológicos padrão, por exemplo, utilizando ensaios que monitoram a formação de um complexo entre a imunoglobulina humanizada e integrina α4β7 (por exemplo, uma fração de membrana portando integrina α4β7, tal como um linfócito humano (por exemplo, um linfócito do subconjunto CD4+ahi,β^°) , linha de célula de linfócito humano ou célula hospedeira recombinante compreendendo ácido nucléico codificando 0C4 e/ou β7, que expresse integrina α4β7) .

Ensaios de ligação e/ou adesão ou outros métodos adequados também podem ser usados em procedimentos para a identificação e/ou isolação de imunoglobulinas humanizadas (por exemplo, de uma biblioteca) tendo a necessária especificidade (por exemplo, um ensaio que monitore a adesão entre uma célula portando uma integrina α4β7 e um ligando da mesma (por exemplo, uma segunda célula expressando MAdCAM, uma quimera MAdCAM-Ig (vide, por exemplo, o Exemplo 4), ou outros métodos adequados.

As porções de imunoglobulina de origem não humana e humana para uso na presente invenção incluem cadeias leves, cadeias pesadas e porções de cadeias leves e pesadas. Estas porções de imunoglobulina podem ser obtidas ou derivadas de imunoglobulinas (por exemplo, por síntese de novo de uma porção), ou de ácidos nucléicos codificando uma imunoglobulina ou cadeia da mesma, tendo a propriedade desejada (por exemplo, liga-se a integrina α4β7, similaridade de seqüência) podem ser produzidas e expressadas. Imunoglobulinas humanizadas compreendendo as porções desejadas (por exemplo, região de ligação a antígeno, região CDR, FR, C) de origem humana e não humana podem ser produzidas usando ácidos nucléicos sintéticos e/ou recombinantes para preparar genes (por exemplo, cDNA) codificando a cadeia humanizada desejada. Para preparar uma porção de uma cadeia, um ou mais codons de parada podem ser introduzidos na posição desejada. Por exemplo, seqüências de ácidos nucléicos (por exemplo, DNA) codificando regiões variáveis humanizadas recém projetadas podem ser construídas usando métodos de mutagênese por PCR, para alterar as seqüências de DNA existentes (vide, por exemplo, Kamman, M., et al. , Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)). Imprimadores de PCR codificando os novos CDRs podem ser hibridizados em uma matriz de DNA de uma região variável previamente humanizada baseada em uma região variável humana igual ou muito similar (Sato, K., et al., Câncer Research 53:851-856 (1993)). Se uma seqüência de DNA similar não estiver disponível para uso como uma matriz, pode-se construir um ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando uma seqüência de região variável a partir de oligonucleotídeos sintéticos (vide, por exemplo, Kolbinger, F., Protein Engineering 8\971-980 (1993)). Uma seqüência codificando um peptídeo de sinal também pode ser incorporada ao ácido nucléico (por exemplo, na síntese, quando da inserção em um vetor). Se a seqüência de peptídeo de sinal natural não estiver disponível, pode-se usar uma seqüência de peptídeo de sinal de outro anticorpo (vide, por exemplo, Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Usando estes métodos, métodos descritos no presente ou outros métodos adequados, pode-se produzir facilmente variantes (vide, por exemplo, o Exemplo 5). Em uma incorporação, regiões variáveis clonadas(por exemplo, de LDP-02) podem ser mutagenizadas, e sequências codificando variantes tendo a especificidade desejada podem ser selecionadas (por exemplo, de uma biblioteca de fagos; vide, por exemplo, Krebber et al. , Ü.S. 5.514.548; Hoogenboom et al., WO93/06213, publicado em 01 de Abril de 1993)). Ácidos Nucléicos e Construções Compreendendo os Mesmos A presente invenção relaciona-se também a ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes (incluindo, por exemplo, essencialmente puros) compreendendo sequências codificando uma imunoglobulina humanizada ou cadeia leve ou pesada de imunoglobulina humanizada da presente invenção.

Os ácidos nucléicos denominados no presente como "isolados" são ácidos nucléicos que foram separados dos ácidos nucléicos do DNA genômico ou RNA celular de suas fontes de origem (por exemplo, tal como a mesma existe em células ou em uma mistura de ácidos nucléicos, tal como uma biblioteca), e incluem ácidos nucléicos obtidos por métodos descritos no presente ou outros métodos adequados, incluindo ácidos nucléicos essencialmente puros, ácidos nucléicos produzidos por síntese química, pela combinação de métodos biológicos e químicos, e ácidos nucléicos recombinantes que são isolados (vide, por exemplo, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. e J.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)).

Os ácidos nucléicos denominados no presente como "recombinantes" são ácidos nucléicos que foram produzidos através de metodologia de DNA recombinante, incluindo os ácidos nucléicos gerados por procedimentos baseados em um método de recombinação artificial, tal como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou clonagem em um vetor, utilizando enzimas de restrição. Os ácidos nucléicos "recombinantes" também são aqueles que resultam de eventos de recombinação que ocorrem através dos mecanismos naturais de células, porém são selecionados após introduzir nas células ácidos nucléicos projetados para permitir e tornar provável um evento de recombinação desejado. A presente invenção relaciona-se também, mais especificamente, a ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma imunoglobulina Act-1 humanizada (isto é, uma imunoglobulina humanizada da presente invenção, na qual a porção não humana é derivada do anticorpo monoclonal Act-1 murino) ou cadeia da mesma. Em uma incorporação, a cadeia leve compreende três regiões determinadoras de complementaridade derivadas da cadeia leve do anticorpo Act-1, e a cadeia pesada compreende três regiões determinadoras de complementaridade derivadas da cadeia pesada do anticorpo Act-1. Tais ácidos nucléicos incluem, por exemplo, (a) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de uma imunoglobulina Act-1 humanizada (por exemplo, região variável de cadeia pesada da figura 11 (SEQ ID Ns 19), região variável de cadeia pesada da figura 9 (SEQ ID N° 15), (b) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de uma imunoglobulina Act-1 humanizada (por exemplo, região variável de cadeia leve da figura 12 (SEQ ID NQ 21), região variável de cadeia leve da figura 7 (SEQ ID Ne 12)), (c) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando pelo menos uma porção funcional da região variável de cadeia leve ou pesada de uma imunoglobulina Act-1 humanizada (por exemplo, uma porção suficiente para ligação a antígeno, de uma imunoglobulina compreendendo a citada cadeia). Devido à degeneração do código genético, pode-se produzir uma variedade de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo selecionado. Em uma incorporação, o ácido nucléico compreende a seqüência de nucleotídeos da região variável como estabelecido ou substancialmente como estabelecido na figura 11 (SEQ ID Ns 18), ou como estabelecido ou substancialmente como estabelecido na figura 12 (SEQ ID NQ 20), incluindo polinucleotídeos de fileira dupla ou única, (apesar de várias figuras poderem ilustrar polipeptídeos maiores que a região variável (isto é, incluírem uma seqüência de codificação de peptídeo de sinal ou uma porção de uma seqüência codificando uma região constante), a referência à região variável de uma figura particular destina-se a incluir a porção de região variável da seqüência mostrada). Os ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes atendendo a estes critérios podem compreender ácidos nucléicos codificando seqüências idênticas às seqüências de anticorpo Act-1 humanizado ou variantes do mesmo, como discutido acima.

Os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser usados na produção de imunoglobulinas humanizadas tendo especificidade de ligação em relação à integrina α4β7. Por exemplo, um ácido nucléico (por exemplo, DNA) codificando uma imunoglobulina humanizada da presente invenção pode ser incorporado a uma construção adequada (por exemplo, um vetor) para manipulação adicional de seqüências ou para a produção do polipeptídeo codificado em células hospedeiras adequadas. Método para Produzir Imunoglobulina Humanizada Tendo Especificidade em Relação a integrina 0,4^7 Outro aspecto da invenção relaciona-se a um método para preparar uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7. A imunoglobulina humanizada pode ser obtida, por exemplo, pela expressão de um ou mais ácidos nucléicos recombinantes codificando uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 em uma célula hospedeira adequada, por exemplo.

Também são providas construções ou vetores de expressão adequados para a expressão de uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7. As construções podem ser introduzidas em uma célula hospedeira adequada, e células expressando uma imunoglobulina humanizada da presente invenção podem ser produzidas e mantidas em cultura. As células hospedeiras adequadas podem ser procarióticas, incluindo células bacterianas, tais como E. coli, B. subtilis e/ou outras bactérias adequadas, ou eucarióticas, tais como células fúngicas ou de levedo (por exemplo, Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), ou outras células eucarióticas inferiores, e células de eucariotas mais elevados, tais como as de insetos (por exemplo, células de inseto Sf9 (WO84/26086, 0'Connor, publicada em 24 de Novembro de 1994)) ou de mamíferos (por exemplo, células COS, células NSO, SP2/0, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HuT 78, células 293). Vide, por exemplo, Ausubel, F.M., et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e John Wiley and Sons, Inc., (1993)).

As células hospedeiras produzindo uma imunoglobulina humanizada tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7 podem ser produzidas como segue. Por exemplo, um ácido nucléico codificando toda ou parte da seqüência de codificação da imunoglobulina humanizada desejada pode ser inserido em um vetor de ácido nucléico, por exemplo, um vetor de DNA, tal como um plasmida, vírus ou outro replicante adequado para expressão. Uma variedade de vetores está disponível, incluindo vetores mantidos em cópia única ou em cópia múltipla, ou que se tornam integrados ao cromossomo da célula hospedeira.

Os vetores de expressão adequados podem conter um certo número de componentes, incluindo, porém não se limitando a um ou mais dos seguintes: uma origem de replicação; um gene marcador selecionável; um ou mais elementos de controle de expressão, tal como um elemento de controle de transcrição (por exemplo, um promotor, um acentuador, um terminador), e/ou um ou mais sinais de tradução; uma seqüência de sinal ou seqüência líder para direcionamento a membrana ou secreção. Em uma construção, uma seqüência de sinala pode ser provida pelo vetor ou outra fonte. Por exemplo, os sinais de transcrição e/ou tradução de uma imunoglobulina podem ser usados para expressão direta.

Um promotor pode ser provido para expressão em uma célula hospedeira adequada. Os promotores podem ser constitutivos ou indutíveis. Por exemplo, um promotor pode ser operacionalmente ligado a um ácido nucléico codificando uma imunoglobulina ou cadeia de imunoglobulina humanizada, de tal modo que o mesmo direcione a expressão do polipeptídeo codificado. Existe disponível uma variedade de promotores adequados para hospedeiros procarióticos (por exemplo, promotores lac, tac, T3. T7 para E. coli) e eucarióticos (por exemplo, desidrogenase de álcool do levedo (ADH1), SV40, CMV).

Ademais, os vetores de expressão tipicamente compreendem um marcador selecionável para a seleção de células hospedeiras portando o vetor e, no caso de vetor de expressão replicável, uma origem ou replicação. Os genes codificando produtos que proveem resistência a antibiótico ou medicação são marcadores selecionáveis comuns e podem ser usados em células procarióticas (por exemplo, gene de β-lactamase (resistência à ampicilina), gene Tet para resistência à tetraciclina) e eucarióticas (por exemplo, genes de resistência à neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, ou higromicina). Os genes marcadores de redutase de dihidrofolato permitem a seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros. Os genes codificando o produto genético de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU 2, URA3, HIS3) são freqüentemente usados como marcadores selecionáveis no levedo. Contempla-se também o uso de vetores viróticos (por exemplo, baculovirus) ou fagos, e vetores capazes de integrar-se no genoma da célula hospedeira, tais como vetores retroviróticos. A presente invenção relaciona-se também a células portando estes vetores de expressão.

Por exemplo, um ácido nucléico (isto é, um ou mais ácidos nucléicos) codificando as cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina tendo especificidade de ligação em relação a integrina α4β7, ou uma construção (isto é, uma ou mais construções) compreendendo tal(ais) ácido(s) nucléico(s), pode(m) ser introduzida(s) em uma célula hospedeira adequada, por um método apropriado à célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), de tal modo que o(s) ácido(s) nucléico(s) seja(m) operacionalmente ligado(s) a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em uma construção criada por processos na célula, integrada no genoma da célula hospedeira) . As células hospedeiras podem ser mantidas sob condições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de indutor, meios adequados suplementados com sais apropriados, fatores de crescimento, antibiótico, suplementos nutritivos, etc.)/ pelo que o(s) polipeptídeo(s) codificado(s) é(são) produzido(s). Se desejado a proteína codificada (por exemplo, anticorpo Act-1 humanizado) pode ser isolada de (por exemplo, as células hospedeiras, meio, leite). Este processo abrange a expressão em uma célula hospedeira de um animal transgênico (vide, por exemplo, WO 92/03918, GenPharm International, publicado em 19 de Março de 1992). Pode-se produzir proteínas de fusão nas quais uma imunoglobulina ou cadeia de imunoglobulina humanizada é ligada a uma parcela que não de imunoglobulina (isto é, uma parcela que não ocorre em imunoglobulinas, como encontradas na natureza) em uma ligação N-terminal, localização C-terminal ou interna à proteína de fusão. Por exemplo, algumas incorporações podem ser produzidas pela inserção de um ácido nucléico codificando sequências de imunoglobulina em um vetor de expressão adequado, tal como um vetor pET (por exemplo, pET-15b, Novagen), um vetor fago (por exemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia), ou outro vetor (por exemplo, vetor de fusão de Proteína A pRITlT, Pharmacia). A construção resultante pode ser introduzida em uma célula hospedeira adequada, para expressão. Quando da expressão, algumas proteínas de fusão podem ser isoladas ou purificadas de um lisado de células por meio de uma matriz de afinidade adequada (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al. , eds. Vol. 2, Suplemento 26, pp. 16.4.1Ί6.7.8 (1991)). Métodos e Composições Terapêuticos A presente invenção provê imunoglobulinas humanizadas que (1) podem ligar-se a integrina α4β7 in vitro e/ou in vivo; e/ou (2) podem modular uma atividade ou função de uma integrina α4β7, tal como (a) função de ligação (por exemplo, a capacidade da integrina α4β7, de ligar-se a MAdCAM-1, fibronectina e/ou VCAM-1) e/ou função de infiltração de leucócitos, incluindo o recrutamento e/ou acumulação de leucócitos em tecidos (por exemplo, a capacidade de inibir a migração de linfócitos para o tecido mucosal intestinal). Preferivelmente, as imunoglobulinas humanizadas são capazes de ligar-se seletivamente a α4β7 in vitro e/ou in vivo, e inibir as interações mediadas por α4β7. Em uma incorporação, uma imunoglobulina humanizada pode ligar-se a uma integrina α4β7, e pode inibir a ligação da integrina α4β7 a um ou mais de seus ligandos (por exemplo, MAdCAM-1, VCAM-1, fibronectina), inibindo assim a infiltração de leucócitos em tecidos (incluindo o recrutamento e/ou a acumulação de leucócitos em tecidos), preferivelmente de maneira seletiva. Tais imunoglobulinas humanizadas podem inibir a adesão celular de células portando uma integrina α4β7 a células endoteliais vasculares em tecidos mucosais, incluindo tecidos associados aos intestinos, órgãos linfóides ou leucócitos (especialmente linfócitos, tais como células T ou B) in vitro e/ou in vivo. Em uma incorporação particularmente preferida, uma imunoglobulina humanizada (por exemplo, Act-1) pode inibir a interação de α4β7 com MAdCAM-1 e/ou fibronectina.

As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção são úteis em uma variedade de processos tendo aplicações em pesquisa, diagnóstico e terapia. Por exemplo, s mesmas podem ser usadas para detectar, isolar e/ou purificar integrina α4β7 ou variantes da mesma (por exemplo, através de purificação por afinidade ou outros métodos adequados), e para estudar a estrutura (por exemplo, conformação) e função da integrina α4β7 .

As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção também podem ser usadas em aplicações de diagnóstico (por exemplo, ín vitro, ex vivo) ou para modular a função da integrina α4β7 em aplicações terapêuticas (incluindo profiláticas). Por exemplo, as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção podem ser usadas para detectar e/ou medir o nível de uma integrina α4β7 em uma amostra (por exemplo, tecidos ou fluídos corporais, tais como exsudado inflamatório, sangue, serum, fluído intestinal, ou células portando uma integrina α4β7). Por exemplo, uma amostra (por exemplo, tecido e/ou fluído corporal) pode ser obtida de um indivíduo e pode-se usar um método imunológico para detectar e/ou medir a expressão da integrina α4β7, incluindo métodos tais como ensaios imunosorbentes ligados a enzima (ELISA), incluindo ensaios quimioluminescentes, ensaio rádio-imunológico, e imunohistologia. Em uma incorporação, é provido um método para detectar uma integrina α4β7 selecionada em uma amostra, compreendendo contactar uma amostra com uma imunoglobulina humanizada da presente invenção, sob condições adequadas para ligação específica da imunoglobulina humanizada à integrina α4β7 e detectar os complexos anticorpo-integrina α4β7 que são formados. Em uma aplicação do método, as imunoglobulinas humanizadas podem ser usadas para analisar tecidos normais versus inflamados (por exemplo, de um ser humano) quanto à reatividade e/ou expressão de integrina α4β7 (por exemplo, imunohistologicamente), para detectar associações entre IBD ou outras condições e uma maior expressão de α4β7 (por exemplo, em tecidos afetados). As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção permitem métodos de avaliação imunológica da presença de integrina α4β7 em tecidos normais versus inflamados, através dos quais pode-se avaliar a presença da doença, a progressão da doença e/ou a eficácia da terapia com integrina α4β7 em doença inflamatória.

As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção também podem ser usadas para modular (por exemplo, inibir (reduzir ou prevenir)) a função de ligação e/ou a função de infiltração de leucócitos (por exemplo, linfócitos, monócitos) da integrina α4β7. Por exemplo, as imunoglobulinas humanizadas que inibem a ligação da integrina α4β7 a um ligando (isto é, um ou mais ligandos) podem ser administradas de acordo com o método no tratamento de doenças associadas a infiltração de leucócitos (por exemplo, linfócitos, monócitos) (incluindo 0 recrutamento e/ou acumulação de leucócitos em tecidos), particularmente de tecidos expressando a molécula MAdCAM. Uma quantidade eficaz de uma imunoglobulina humanizada da presente invenção (isto é, uma ou mais) é administrada a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano ou outro primata) para tratar tal doença. Por exemplo, doenças inflamatórias, incluindo doenças associadas a infiltração de leucócitos no trato gastrointestinal (incluindo endotélio associado aos intestinos), outros tecidos mucosais, ou tecidos expressando a molécula MAdCAM- 1 (por exemplo, tecidos associados aos intestinos, tais como vênulas da lamina própria dos intestino fino e grosso; e glândula mamária (por exemplo, glândula mamária lactante), podem ser tratados de acordo com o presente método. De maneira similar, um indivíduo tendo uma doença associada à infiltração de leucócitos em tecidos como resultado da ligação de leucócitos a células (por exemplo, células endoteliais) expressando MAdCAM-1 pode ser tratado de acordo com a presente invenção.

Em uma incorporação particularmente preferida, as doenças que podem ser tratadas de acordo incluem doença inflamatória dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa, doença de Crohn, ileíte, doença celíaca, Sprue não tropical, enteropatia associada a artropatias seronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica, ou pouquite resultando apôs proctocolectomia, e anastomose ileoanal. A pancreatite e o diabetes mellitus dependente de insulina são outras doenças que podem ser tratadas usando o presente método. Tem-se relatado que MAdCAM-1 é expressada por alguns vasos no pâncreas exócrino de camundongos NOD (diabéticos não obesos), bem como de camundongos BALB/c e SJL. Relatou-se que a expressão de MAdCAM-1 foi induzida no endotélio em ilhotas inflamadas do pâncreas do camundongo NOD, e MAdCAM-1 era a adressina predominante expressada pelo endotélio de ilhota NOD nos estágios iniciais da insulite (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92:2509-2515 (1993)). Ademais, observou-se a acumulação de linfôcitos expressando α4β7 dentro de ilhotas, e MAdCAM-1 estava implicada na ligação de células de linfoma através de α4β7 a vasos de ilhotas inflamadas (Hanninen, A. , et al., J. Clin. Invest., 92:2509-2515(1993)).

Os exemplos de doenças inflamatórias associadas a tecidos mucosais que podem ser tratadas de acordo com o presente método incluem mastite (glândula mamária), colecistite, colangite ou pericolangite (duto biliar e tecido circundante do fígado), bronquite crônica, sinusite crônica, asma, e doença de enxerto versos hospedeiro (por exemplo, no trato gastrointestinal). Como observado na doença de Crohn, a inflamação freqüentemente se estende além da superfície mucosal; portanto, as doenças inflamatôrias crônicas do pulmão que resultam em fibrose intersticial, tais como pneumonite hipersensível, doenças de colágeno, sarcoidose, e outras condições idiopáticas podem ser passíveis de tratamento. A imunoglobulina humanizada é administrada em uma quantidade eficaz que inibe a ligação da integrina α4β7 a um ligando da mesma. Para terapia, uma quantidade eficaz será suficiente para obter o efeito terapêutico (incluindo profilático) (tal como uma quantidade suficiente para reduzir ou impedir a ligação e/ou sinalização mediada por integrina α4β7, inibindo assim a adesão e infiltração de leucócitos e/ou as respostas celulares associadas) A imunoglobulina humanizada pode ser administrada em uma única dose ou em doses múltiplas. A dosagem pode ser determinada por métodos conhecidos na arte e pode ser dependente, por exemplo, da idade, sensibilidade, tolerância e bem-estar geral do indivíduo. As dosagens adequadas de anticorpos podem ser desde cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal até cerca de 10,0 mg/kg de peso corporal por tratamento.

De acordo com o método, a imunoglobulina humanizada pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) sozinha ou em conjunto com outro agente. Uma imunoglobulina humanizada pode ser administrada, juntamente com ou após a administração do agente adicional. Em uma incorporação, é administrada mais de uma imunoglobulina humanizada que inibe a ligação de integrina α4β7 a seus ligandos. Em outra incorporação, um anticorpo monoclonal, tal como um anticorpo anti-MAdCAM-1, anti-VCAM-1, ou anti-ICAM-1, que inibe a ligação de leucócitos a um ligando endotelial, é administrado em adição a uma imunoglobulina humanizada da presente invenção. Em ainda outra incorporação, um ingrediente farmacologicamente ativo adicional (por exemplo, um composto anti-inflamatório, tal como sulfasalazina, outro composto anti-inflamatório não esteroidal, ou um composto anti-inflamatório esteroidal) pode ser administrado em conjunto com uma imunoglobulina humanizada da presente invenção.

Uma variedade de vias de administração é possível, incluindo, porém não se limitando necessariamente a, parenteral (por exemplo, injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea), oral (por exemplo, dietária), tópica, por inalação (por exemplo, inalação intra-brônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais) ou retal, dependendo da doença ou condição a ser tratada. A administração parenteral é uma modalidade de administração preferida. A formulação irá variar de acordo com a via de administração selecionada (por exemplo,solução , emulsão)· Uma composição apropriada compreendendo o anticorpo humanizado a ser administrado pode ser preparada em um veículo ou portador fisiologicamente aceitável. Em relação a soluções ou emulsões, os portadores aceitáveis incluem, por exemplo, soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer lactados ou fixos. Os veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, preservantes, ou recuperadores de fluído, nutriente ou eletrólito (vide, em geral, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edição, Mack Publishing Co., PA, 1985). Para inalação, o composto pode ser solubilizado e carregado em um aplicador adequado para administração (por exemplo, um atomizador, nebulizador ou aplicador de aerossol pressurizado).

Exemplificacão A presente invenção será ilustrada agora pelos Exemplos que seguem, os quais não se destinam a ser limitativos de modo algum.

Como descrito no Exemplo 1, purificou-se anticorpo Act-1 murino e realizou-se a análise de sequência do anticorpo. cDNAs codificando as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo Act-1 de camundongo foram clonados e seqüenciados por PCR. As sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve kappa ((V^) de Act-1 também foi determinada por sequenciamento de proteína e demonstrou coincidir exatamente com a sequência de aminoácidos derivada da seqüência de DNA do gene VL. A maior parte da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) foi determinada por seqüência de proteínas, e esta seqüência também coincide com a seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de aminoácidos do gene VH. Estes resultados indicam que as regiões variáveis de Act-1 de camundongo corretas foram clonadas da linha de células de hibridoma. Produziram-se anticorpos Act-1 quiméricos funcionais, os quais confirmaram que as sequências corretas haviam sido clonadas. Em particular, os DNAs codificando as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de Act-1 de camundongo foram unidas a DNA codificando as regiões constantes de cadeia leve kappa humanas e de cadeia pesada gama-1 ou gama-4 humanas, respectivamente. 0 anticorpo quimérico também foi usado em uma análise comparativa com uma mAb de Act-1 humanizada (mAb LDP-02 de Act-1 remodelada).

Para criar um anticorpo Act-1 humanizado que se ligasse bem à integrina (Χ4β7, projetaram-se regiões variáveis humanas remodeladas (Exemplo 2). Para auxiliar no processo de projeto, construiu-se um modelo molecular das regiões variáveis de Act-1 de camundongo. As regiões do anticorpo Act-1 murino diretamente envolvidas na ligação a antígeno, a região determinadora de complementaridade ou CDRs, foram enxertadas em regiões variáveis humanas selecionadas. Realizaram-se algumas alterações em aminoácidos em posições dentro das regiões de estrutura (FRs) das regiões variáveis humanas. As regiões variáveis de Act-1 humanas remodeladas incluíram uma única alteração de aminoácido nas FRs da região variável de cadeia leve humana selecionada e cinco alterações de aminoácido nas FRs da região variável de cadeia pesada humana selecionada, cada uma alterando o resíduo humano original para o correspondente resíduo murino.

Como descrito no Exemplo 3, sequências de DNA codificando estas regiões variáveis de Act-1 humanas remodeladas e unidas a sequências de DNA codificando regiões constantes humanas, e os ácidos nucléicos resultantes foram usados para produzir imunoglobulina Act-1 humanizada. 0 anticorpo Act-1 humanizado foi expressado em células de mamíferos (Exemplo 3), e foi ensaiado quanto à ligação à integrina α4β7 humana, em comparação com o anticorpo Act-1 de camundongo (Exemplo 4). Como mostrado na Tabela 5, o anticorpo Act-1 humanizado reteve a especificidade em relação ao epitopo reconhecido pelo Act-1 murino, e apresentou uma afinidade de ligação inespexadamente melhorada, quando comparado com o anticorpo murino nativo. Várias variantes do anticorpo Act-1 humanizado foram identificadas no processo de projeto (Exemplos 2 e 5) . Por exemplo, pode-se fazer alterações adicionais em uma ou mais das seguintes posições: mutante de cadeia leve M4V (mutação Met -» Vai na posição 4), mutante de cadeia pesada R3 8K (mutação Arg -4 Lys na posição 38), mutante de cadeia pesada A40R (mutação Ala-» Arg na posição 40). Ademais, um mutante de cadeia pesada I73T (retromutação Ile -» Thr na posição 73), restaurando a posição 73 ao resíduo de treonina humano encontrado nesta posição na região de estrutura humana. Pode-se fazer a introdução de uma ou mais destas alterações em uma só cadeia ou várias combinações destas alterações em mais de uma cadeia.

Exemplo 1 Clonagem de Regiões VH e VL de Act-1, e Construção e Expressão de uma Imunoglobulina Ouimérica Act-1 Murina- humana.

Clonagem de regiões VH e VL de Act-1 Obteve-se RNA de células de hibridoma que produzem anticorpo monoclonal Act-1 (Lazarovits, A.I. et al., J. Immunol./ 133(4):1857-1862 (1984); provido por A.I.

Lazarovits e R.B. Colvin)) usando Reagente TRIzol (Gibco/BRL), seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve transcritas foram amplificadas através de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando um kit Ig-Prime (Novagen), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Em resumo, 1/5 μρ de RNA total foi submetido a transcrição reversa para cDNA em uma reação contendo 2,0 μΐ 5X Tampão MMLV (5X = 250 mM Tris-HCl, pH 8,3 a 25eC, 375 mM KCl, 15 mM MgC12), 1,0 μΐ 100 mM DTT (ditiotreitol), 0,5 μΐ 10 mM mistura dNTP (10 mM cada dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0,5 μΐ oligo dT (1 μρ/μΐ), 0,25 μΐ BSA acetilado (4 mg/ml), 1,0 μΐ de imprimador Ig-3' apropriado (10 pmol/μΐ), 0,5 μΐ Transcriptase Reversa MMLV (200 unidades/μΐ), e água livre de RNase adicionada até um volume total de 10 μΐ. A mistura foi incubada durante 5 minutos a 37 aC, 30 minutos a 42SC; e 5 minutos a 992C. Cada imprimador Ig-3' foi usado em uma reação separada.

As regiões variáveis foram amplificadas a partir do material de transcrição reversa, de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, 8 μΐ do material reversamente transcrito foram misturados com 4 μΐ de 2,5 mM dNTPs, 5 μΐ 10X tampão de reação (10X = 100 mM Tris-HCl, pH 8,8 a 25QC, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2/ 1¾ Triton X-100), 2m5 μΐ imprimador líder Ig-5' (10 pmol/μΐ) (cada imprimador líder Ig-5' foi usado em uma reação PCR separada), 0,25 μΐ (1,25 unidades) de polimerase de DNA AmpliTaq* (Perkin-Elmer), e água até um volume total de 50 μΐ.

Para amplificações com imprimadores 5' MulgVjgS'-A, MuIgVfj5'-B, MuIgKV^S'-A, e MuIgKV^S'-B, os parâmetros de ciclo eram de 35 ciclos de 1 minuto, 94SC; 1 minuto, 50QC; 2 minutos, 72QC; seguidos de uma extensão final de 6 minutos a 72BC. As mesmas condições de reação foram utilizadas em relação a todos os outros imprimadores 5', exceto que a temperatura de têmpera foi aumentada para 60aC. A região de cadeia pesada foi amplificada com sucesso usando quer MuIgGVH3'-2 ou MuIgMVjj3'-l como imprimador 3', e quer MuIgVH5'-B ou MuIgVH5'-E como imprimadores 5'. A região variável de cadeia leve foi amplificada com sucesso usando MuIgKVL3'-l como imprimador 3' e MuIgKVL5'-G como imprimador 5'.

As seqüências destes imprimadores eram como segue: MuIgGVH3'-2 (SEQ ID Ns 56): 5'-CCC AAT CTT CCA GGG RCC ARK GGA TAR ACI GRT GG MuIgMVH3'-l (SEQ ID Na 57): 5'-CCC AAG CTT ACG AGG GGG AAG ACA TTT GGG AA MuIgVH5'-B (SEQ ID Ne 58): 5'-GGG AAT TCA TGR AAT GSA SCT GGG TYW TYC TCT T MuIgVH5'-E (SEQ ID Na 59): 51-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GBT RAA CTG GRT MuIgKVL3'- 1 (SEQ ID Ns 60): 5'-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA MuIgKVL5’-G (SEQ ID Ne 61): 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA RGT GCA GAT TWT CAG CTT Os fragmentos amplificados foram purificados em gel de agarose e ligados no vetor pT7Blue T (Novagen) fornecido com o kit Ig-Prime, e a mistura de ligação foi usada para transformar células NovaBlue competentes fornecidas com o kit, de acordo com o protocolo do fabricante.

Colônias em branco, contendo inserções da dimensão apropriada, foram sequenciadas usando imprimador de promotor T7 e imprimador U-19mer, que se temperam em lados opostos da inserção, logo fora do local de policlonagem do vetor pT7Blue. 0 sequenciamento foi realizado em DNA miniprep usando um kit de polimerase de DNA Sequenase T7 (USB/Amersham Life Science), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. A seqüência de DNA de consenso (SEQ ID Na 1) de vários clones independentes de região variável de cadeia pesada e a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N° 2) estão mostradas na figura 1. Os imprimadores degenerados levaram a uma certa degeneração de seqüência. 0 codon de iniciação é a Met codificado pelos nucleotídeos 13-15, o local de divagem de peptidase líder previsto está entre a Ser codificada pelos nucleotídeos 67-69 e a Gin codificada pelos nucleotídeos 70-72 (nucleotídeos 13-69 codificando o peptídeo líder). É mostrada uma porção da região constante murina, começando com a alanina codificada pelos resíduos 433-435. A seqüência de DNA (SEQ ID NQ 5) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID Na 6) de vários clones independentes de região variável de cadeia leve ,está mostrada na figura 3 . Contrariamente à região variável de cadeia pesada, as seqüências amplificadas não eram degeneradas, provavelmente porque os imprimadores utilizados não estavam muito degenerados, e a região variável foi amplificada a partir de apenas um único par de imprimadores.

Construção de um Gene de Cadeia Pesada Quimérico Produziu-se um gene codificando um gene de cadeia pesada de camundongo-humano quimérico. A fonte da região constante de cadeia pesada humana era um clone contendo uma região constante gama um (γΐ) humana do tipo silvestre (obtido do Dr. Herman Weldmann (Universidade de Oxford); uma construção designada 3818 compreendendo um gene de cadeia pesada anti-CD18 humanizada em um vetor de expressão pEE6 (Celltech). A região constante corresponde à do gene de cadeia pesada CD18 humanizado clonado em pEE6.hCMV, como descrito em Sims, M.J. et ai. , J. Immunol., 151 (4): 2296-2308 (1993 ) e WO 93/02191/ publicado em 4 de Fevereiro de 1993, cujos ensinamentos são, cada um, incorporados integralmente ao presente através de referência. As sequências codificando a região variável e constante de cadeia pesada (gama um do tipo silvestre) do anticorpo anti-CD18 humanizado foram liberadas do vetor de expressão através de digestão com HindIII e EcoRI. O fragmento de 1.421 pb contendo o gene de cadeia pesada foi recuperado e subclonado nos locais HindIII e EcoRI de pCR-Script™ (Stratagene), para resultar em um plasmida designado pCR-CD18H. Um local de restrição Spe I está localizado na junção entre a região variável e a região constante no gene de cadeia pesada anti-CD18. pCR-CD18H foi digerido através de restrição com HindIII e Spe I, para liberar a região variável de cadeia pesada. Esta região variável foi substituída pela região variável Act-1 de camundongo, gerada como segue.

Sintetizaram-se dois imprimadores para incorporar novos locais de restrição. Estes imprimadores eram: imprimador 5'- (SEQ ID Ns 41): Hind III 5’- T[AA GCT T]CC GCC ATG GGA TGG AGC imprimador 3'- (SEQ ID Νθ 42): Spe I 5'- GGT GAC [ACT AGT] GCC TTG ACC CCA G Os caracteres em negrito indicam um nucleotídeo nos imprimadores que difere da seqüência matriz. Um clone independente de cadeia pesada de Act-1 de camundongo, designado H2B#34, com a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NB 3) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NB 4) apresentada na figura 2, foi usado como uma matriz com os imprimadores 5' e 3' acima, para amplificar uma região variável de camundongo, introduzindo concomitantemente um local 5’ de HindIII do codon de iniciação e um local Spe logo a 3' da região J. 0 fragmento de PCR foi subclonado diretamente em pCR-Script™, dando origem ao plasmida pCR-mACTlHV, e a seqüência correta foi confirmada. 0 fragmento foi então liberado de pCR-mACTIHV através de digestão com HindIII e Spe I, e inserido nos locais HindIII e Spe I de pCR-CD18H, no lugar da região variável anti-CDl8, para produzir pCR-mhACTlHchi. 0 gene de cadeia pesada quimérica (variável de Act-1 de camundongo mais constante gama um humana) foi então liberado de pCR-mhACTlHchi com HindIII e EcoRI e clonado de volta no vetor pEE6hCMV-B, contendo o promotor hCMV, para resultar em uma construção designada pEE6mhACTlHchi.

Construção de um Gene de Cadeia Leve Quimérico Um gene quimérico de cadeia leve de camundongo-humano foi construído de maneira similar à da cadeia pesada. Contudo, no caso da cadeia leve quimérica, um novo local de restrição, Kas I, foi produzido na construção, através de amplificação por PCR, de um fragmento de região variável usando um dos clones de região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo designado KG#87 como matriz, e por amplificação de PCR de uma região constante de cadeia leve kappa, usando uma construção contendo um gene de cadeia leve kappa anti-CD18 humanizado como matriz (obtido do Herman Waldmann (Universidade de Oxford); construção designada 3819 contendo uma cadeia leve anti-CD18 humanizada no vetor de expressão pEEl2). A região constante corresponde à do gene de cadeia leve CD18 humanizado clonado em pEE12, como descrito em Sims, M.J. et al. , J. Immunol., 151 (4)·. 2296-2308 (1993) e WO 93/02191, publicado em 04 de Fevereiro de 1993.

Os imprimadores para a região variável eram: imprimador 5'- (SEQ ID NQ 43): HindIII] 5'-T[AA GCT T]CC GCC ATG AAG TTG CCT imprimador 3'- (SEQ ID NQ 44): Kas I 5'-[GGC GCC] GCA TCA GCC CGT TTT Os caracteres em negrito indicam os nucleotideos no imprimador que diferem dos da matriz. As duas alterações de nucleotídeos dentro da região de codificação, T —> G na posição 423 e A G na posição 426 na figura 3 para criar o local Kas I são silenciosas, e não alteram a sequência de aminoácidos.

Os imprimadores para a região constante kappa eram: imprimador 5'- (SEQ ID Na 45): Kas I 5'-C[GG CGC C]AT CTG TCT TCA TC imprimador 3'- (SEQ ID NQ 46): HindIII

5’- [AAG CTT] CTA ACA CTC TCC

As regiões variável e constante de cadeia leve foram amplificadas separadamente com as respectivas matrizes e imprimadores, e os produtos PCR foram subclonados individualmente em pCR-Script™, para confirmar a seqüência. Cada fragmento foi então liberado do vetor através de digestão com HindIII e Kasl, purificado em gel e triplamente ligado no local HindIII do vetor de expressão 3819 pEE12 do qual o gene de cadeia leve anti-CD18 humanizado havia sido removido por digestão com HindIII. A construção resultante é designada pEE!2mhACTlLchi.

Expressão de uma Imunoglobulina Quimérica Para construção de um vetor de expressão contendo ambos os genes de cadeia pesada eleve quiméricos, o gene de cadeia pesada completo mais promotor CMV foi liberado do vetor de expressão pEE6 (pEE6mhACTlHchi), através de digestão com BglII e BamHI. Este fragmento foi então ligado ao local BamHI do vetor de expressão de gene de cadeia leve pEE12 (pEE12mhACTlLchi), dando origem a um único plasmida designado pEE12mhLHchi, que contém ambos o gene de cadeia leve quimérico e o gene de cadeia pesada quimérico, cada um sob o controle de transcrição de um promotor CMV separado. Os vetores de expressão pEE6hCMV-B e pEE12 e o sistema de amplificação de gene de sintetase de glutamina Celltech foram descritos anteriormente (vide, por exemplo, WO 86/05807 (Celltech), WO 87/04462 (Celltech), WO 89/01036 (Celltech), EP 0 323 997 Bl (Celltech), e WO 89/10404 (Celltech), cujos ensinamentos são, cada um, integralmente incorporados ao presente através de referência.

Para expressão transiente do anticorpo quimérico, 20 μg de pEE12mhLHchi foram transfectados em células COS-7 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852), através de eletroporação, como segue. Células COS-7 desenvolvendo-se em fase log foram coletadas de frascos de cultura de tecido, por tratamento com tripsina-EDTA. As células foram lavadas uma vez em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), uma vez com Solução de Sais Balanceada de Hank (HBSS) e resuspensas a uma concentração de 1,5 x 10? células por ml de HBSS. 1,2 x 10^ células em 0,8 ml de HBSS foram misturadas com 20 μρ do DNA de plasmida e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente. A mistura de DNA/células foi então transferida para uma cubeta de eletroporação e aplicou-se corrente a 250 V, 960 μΕ com um GenePulser da Bio-Rad. Após uma incubação de 10 minutos pós-eletroporação à temperatura ambiente, as células foram transferidas para 20 mis de meio de cultura (Meio de Eagle Modificado, de Dulbecco (DMEM) mais 10% FCS) e cultivadas em um frasco de cultura de tecido de 162 cm^ (Costar). Após 5 dias, o sobrenadante da cultura de células foi coletado e ensaiado quanto à capacidade de manchar células HuT 78, que expressam a integrina α4β7. As células HuT 78 (uma linha de linfoma de células T humanas) estão disponíveis na American Type Culture Collection, de 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, N° de Acesso ATCC TIB 161. 100 μΐ de sobrenadante de cultura de células COS-7 transfectadas transientemente, sobrenadante de células COS-7 com transfecção simulada, anticorpo Act-1 murino purificado (10 μg/ml), os respectivos anticorpos de controle de isotipo coincidente irrelevantes purificados para camundongo (IgGl, Kappa (M0PC21) de camundongo, 10 μg/ml da Sigma), e para ser humano (IgGl, Kappa humano, 10 μg/ml da Sigma) foram incubados com 1 x 10^ células HuT 78 em gelo durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão gelado consistindo de PBS contendo serum de bezerro fetal a 2% (FCS) e 0,01% de azeto de sódio (tampão FACS). As células foram então incubadas durante 30 minutos em gelo com o anticorpo secundário fluorescente apropriado (quer fragmento IgG(H+L) de cabra anti- camundongo AffiniPure F(ab')2 conjugado com fluoresceína (FITC) (Nackson ImmunoResearch), quer fragmento IgG(H+L) de cabra anti-humano AffiniPure F(ab')2 conjugado com fluoresceína (Jackson ImmunoResearch)). Após 30 minutos em gelo, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, resuspensas em 300 ml do mesmo tampão, e analisadas por citometria de fluxo em um FACscan Becton Dickonson. A figura 4 mostra as manchas no mAb de Act-1 murino, comparado com um anticorpo de controle irrelevante coincidente com isotipo de camundongo, MOPC 21 (IgGl, kappa). A figura 4B mostra mancha de anticorpo Act-1 quimérico de células HuT 78, em comparação com um anticorpo de controle irrelevante coincidente com isotipo humano (IgGl, kappa), e sobrenadante de células COS-7 transfectadas simulado. Assim, em comparação com a mancha produzida pelo anticorpo Act-1 murino, o anticorpo quimérico manchou as células HuT 78 de maneira similar. Coletivamente, estes dados demonstram que as seqüências apropriadas para as regiões variáveis de Act-1 murino foram clonadas e expressadas com sucesso.

Análise de Sequência de Ãminoácidos A análise de sequência de ãminoácidos foi realizada em cadeias pesada e leve de Act-1 murino purificado dos cDNAs das regiões de cadeia leve e pesada isoladas do hibridoma. Isto foi realizado em relação à cadeia leve como segue: Act-1 murino (5 mg/ml) foi reduzido com 2 mM DTT durante 2 horas a 37DC em borato de sódio 0,3 M, cloreto de sódio 0,15 M, sob nitrogênio. A solução foi então levada a 10 mM em iodoacetamida e incubada durante 4 horas à temperatura ambiente. A análise de SDS-PAGE sob condições não desnaturantes confirmou que as proteínas foram reduzidas quantitativamente. A solução de proteína foi então amplamente dializada em PBS e uma alíquota foi aplicada a uma coluna Superdex 75 (16/60, Pharmacia) (corrida 1). As cadeias pesada e leve coeluaram-se desta coluna com um volume de elução correspondente ao do volume de exclusão, indicando que as duas cadeias ainda estavam unidas entre si. Outra alíquota foi então combinada com uréia 8M e operada em uma coluna Superdex 75, sob condições desnaturantes (6M uréia) (corrida 2). Ambas as cadeias coeluaram-se novamente no volume vazio, provavelmente devido a desdobramento. A análise SDS-PAGE confirmou a presença de ambas as cadeias nas duas amostras eluadas das 2 corridas de filtragem em gel. Estas amostras foram submetidas a análise de sequência N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.) com o seguinte resultado: Amostra 1: DVWTQTPLSLPVSFDGQV (SEQ ID ND 47) Amostra 2: DVWTQTPLSL (SEQ ID Na 48) A seqüência obtida corresponde ao terminal N da cadeia leve madura, como deduzida da seqüência de DNA. Estas e outras tentativas de obter seqüência da cadeia pesada indicaram que seu terminal N estava provavelmente bloqueado. Portanto, a análise de seqüência de aminoácidos de fragmentos de peptídeos internos foi realizada na cadeia pesada.

Para simplificar o sequenciamento de aminoácidos internos, fragmentos F(ab)'2 do anticorpo foram produzidos através de clivagem com pepsina. 0 Act-1 murino foi clivado com pepsina a uma razão de anticorpo:pepsina de 1:200 durante 2 horas a 37SC em citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0. A reação foi completa, como avaliado por análise SDS-PAGE. A proteína foi então purificada através de colunas de proteína G e proteína A. A amostra foi então reduzida e alquilada como descrito acima, e o fragmento de cadeia pesada foi separado da cadeia leve através de SDS-PAGE preparativo (15%). 0 fragmento de cadeia pesada foi excisado, e eletroeluado em 1 ml de SDS a 0,1% com tampão circulante durante 2 horas. Esta amostra foi clivada com 2 ng de endoproteinase Asp-N durante 30 minutos e os fragmentos foram separados por SDS-PAGE (17,5%). Os produtos de digestão foram eluados passivamente em 0,1 M Hepes, pH 8,0, 0,1% SDS durante a noite e submetidos a análise de sequência de N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.). A sequência obtida de um fragmento de 17 kDa era DYAIDYWG (SEQ ID Na 49), que estava presente no clone da cadeia pesada (figura 1; a seqüência AIDY corresponde ao início da região JH4).

Exemplo 2 Modelagem Molecular das Regiões Variáveis de Act-1 de Camundongo Para auxiliar no projeto das regiões variáveis enxertadas em CDR, produziu-se um modelo molecular das regiões variáveis de Act-1 de camundongo. A modelagem das estruturas de famílias de proteínas bem caracterizadas com imunoglobulinas foi realizada usando os métodos estabelecidos para modelagem por homologia. A modelagem molecular foi realizada usando uma estação de trabalho Silicon Graphics IRIS 4D, operando sob o sistema operacional UNIX, o pacote de modelagem molecular QUANTA (Polygen Corp., de Waltham, MA), e a base de dados cristalográficos Brookhaven, de estruturas de proteína resolvidas. Como uma primeira etapa, as regiões de estrutura (FRs) das novas regiões variáveis foram modeladas em FRs de regiões variáveis de imunoglobulina similares, estruturalmente resolvidas. Enquanto as cadeias laterais de aminoácidos idênticas eram mantidas em sua orientação original, as cadeias laterais submetidas a mutação foram substituídas, usando o procedimento de sobreposição maxima, para manter os ângulos chi como no anticorpo Act-1 de camundongo original. A maior parte dos CDRs das novas regiões variáveis foi modelada com base nas estruturas canônicas para CDRs (Chothia, C., e A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989); Tramontano, A., et al. , J. Mol. Biol. 215:175-182 (1990); Chothia, C., et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992)). Em casos tais como CDR3 da região variável de cadeia pesada, nos quais não existem estruturas canônicas conhecidas, a alça CDR foi modelada com base em uma estrutura de alça similar presente em qualquer proteína estruturalmente resolvida. Finalmente, para aliviar contatos atômicos desfavoráveis e para otimizar as interações de Van der Waals e eletrostáticas, o modelo foi submetido a minimização de energia usando o potencial CHARMm (Brooks, B.R., J. Comp. Chem. 4:187-217 (1983)), como implementado em QUANTA.

Para as regiões variáveis de Act-1 de camundongo, as FRs da região variável de cadeia leve foram modeladas nas FRs do fragmento Fab do anticorpo monoclonal de camundongo 4-4-20 (Herron, J.N., et al., Proteins. Structure, Function and Genetics 5:271-280 (1989)). As FRs da região variaável de cadeia pesada foram modeladas nas FRs do fragmento Fab do anticorpo monoclonal de camundongo D11.15 (Chitarra, V. , et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90:7711-7715 (1993)). As cadeias laterais de aminoácidos que diferiam entre o anticorpo Act-1 de camundongo e as regiões variáveis nas quais o modelo estava baseado foram substituídas. A cadeia leve do anticorpo Fab 4-4-20 foi então superposta sobre a cadeia leve de D11.15, ao alinhar no espaço os resíduos 35-39, 43-47, 84-88 e 98-102 (como definidos por Kabat, Ε.Ά., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)), de modo a colocar as duas regiões variáveis heterólogas (isto é, a região variável de cadeia leve kappa à base de 4-4-20 e a região variável pesada à base de D11.15) na orientação correta uma com respeito à outra. CDR1 (Ll) da região variável de cadeia leve de mAb de Act-1 encaixou-se no subgrupo canônico Ll 4, como proposto por Chothia, C., et al. , Nature 342:877-883 (1989). A alça Ll do Fab 4-4-20 de camundongo (vide acima) era idêntico em comprimento de aminoácido, similar em seqüência de aminoácido, e também coincidiu com o subgrupo canônico 4. Consequentemente, a alça Ll foi modelada na alça Ll de Fab 4-4-20. De maneira similar, CDR2 (L2) e CDR3 (L3) da região variável de cadeia leve de mAb de Act-1 coincidiu com ambos as estruturas de alça do subgrupo 1 canônico e os correspondentes CDRs de Fab 4-4-20. Assim, as alças L2 d L3 da região variável de cadeia leve kappa de Act-1 foram modeladas em CDRs L2 e L3 de Fab 4-4-20. CDR1 (Hl) da região variável de cadeia pesada de mAb de Act-1 coincidiu com o subgrupo canônico 1 de Hl, definido por Chothia, C., et al. , Nature 342:877-883 (1989), como também coincidiu a correspondente alça Hl do mAb D11.15 de camundongo (vide acima). Ademais, a alça CDR1 de mAb D11.15 era de comprimento idêntico e muito similar em seqüência de aminoácidos a Hl de Act-1 de mAb. Consequentemente, tal como em relação à cadeia leve, esta alça foi modelada com base na alça CDR1 da região variável pesada na qual se baseava o modelo. CDR2 da região variável de cadeia pesada (H2) era mais difícil de definir, porém parecia corresponder ao subgrupo canônico 2 de H2. Novamente, a alça H2 do anticorpo D11.15 também coincidiu com o mesmo subgrupo canônico e era muito similar em seqüência de aminoácidos e, portanto, a alça H2 de Act-1 de mAb foi modelada com base na alça H2 de D11.15.

Como discutido acima, os CDR3s de regiões variáveis de cadeia pesada são altamente variáveis e não podem ser divididos em grupos estruturais identificáveis. Para a modelagem de alças H3, alças de comprimento idêntico e seqüência de aminoácidos similar - preferivelmente de outro anticorpo - são identificadas e usadas como base para a alça modelada. Havia três alças, todas alças H3 de três anticorpos, que coincidiam com a CDR3 de Act-1 em relação à dimensão da alça. Após ensaiar todas as três estruturas de alças quanto a choques estéricos no modelo, a alça H3 do anticorpo humano Pot (Fan, Z.C., et al. , J. Mol. Biol. 228:188-207 (1992)) foi escolhida para modelar a alça H3 de Act-1 de mAb. Após ajustar o modelo como um todo em relação a choques estéricos óbvios, o mesmo foi submetido a minimização de energia, como implementada em QUANTA.

Projeto de Regiões Variáveis enxertadas em CDR A primeira etapa no projeto de regiões variáveis enxertadas em CDR é a seleção das regiões variáveis de cadeia leve e pesada humanas que servirão como base para as regiões variáveis humanizadas. Dois enfoques de seleção de regiões variáveis humanas foram ensaiados e comparados. Em um enfoque, as regiões variáveis humanas foram selecionadas das seqüências de consenso para os diferentes subgrupos de regiões variáveis humanas (Kabat, E.A., et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada de roedor foram comparadas com as seqüências de consenso humanas e as seqüências de consenso de cadeias leve e pesada humanas mais similares foram selecionadas dentre os seis subgrupos de regiões variáveis de cadeia leve lambda humanas, e os três subgrupos de regiões variáveis de cadeia pesada humana (vide Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Em outro enfoque, as regiões variáveis humanas foram selecionadas de todas as seqüências publicadas para regiões variáveis humanas (Kabat, E.A., et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). As seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de roedores foram comparadas com seqüências humanas, e selecionaram-se as regiões variáveis humanas tendo um elevado grau de similaridade com as regiões variáveis de roedores. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada humanas do mesmo anticorpo humano podem ser usadas para assegurar que as duas regiões variáveis serão montadas adequadamente (Queen, C., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA 65:10029-10033 (1989)). Contudo, como descrito no presente, as regiões variáveis de cadeias leve e pesada humanas selecionadas como matrizes foram derivadas de dois diferentes anticorpos humanos. Desta maneira, foi possível selecionar regiões variáveis humanas tendo um mais elevado grau de similaridade com as regiões variáveis de roedor. Existem muitos exemplos de sucesso de anticorpos enxertados em CDR baseados em regiões variáveis derivadas de dois anticorpos humanos diferentes. Um dos exemplos melhor estudados é o anticorpo humano CAMPATH-1 remodelado (Ríechmann, L., et al. , Nature 332:323-327 (1988)) .

Para projetar regiões variáveis de Act-1 humanas remodeladas, as regiões variáveis de Act-1 de camundongo foram comparadas com as seqüências de consenso em relação a todos os subgrupos de regiões variáveis de camundongo e humanas (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). Os resultados estão sumarizados nas Tabelas 1 e 2. A região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo era a mais similar à seqüência de consenso do subgrupo II de cadeia leve kappa de camundongo, com uma identidade geral de 83,9% e uma identidade de 87,5% apenas dentro das FRs (Tabela 1). Com respeito às seqüências de anticorpos humanos, a região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo era a mais similar à sequência de consenso para o subgrupo II de cadeia leve kappa humana, com uma identidade geral de 72,3% e uma identidade de 78,8% apenas dentro das FRs (Tabela 1).

Tabela 1. Comparação da região variável de cadeia leve kappa de Act-1 de camundongo com as seqüências de consenso dos subgrupos de regiões variáveis de cadeia leve kappa de camundongo e humanas. A seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve kappa de Act-1 de camundongo foi comparada, com e seu as sequências dos CDRs, com as seqüências de consenso dos diferentes subgrupos de regiões variáveis de cadeia leve kappa de camundongo e humanas, com e sem as seqüências dos CDRs. Estão relacionadas as porcentagens de similaridade e identidade em relação aos subgrupos de camundongo e humanos mais similares. A região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo era a mais similar à seqüência de consenso em relação ao subgrupo IIB de cadeia pesada de camundongo, com uma identidade geral de 83,5% e uma identidade de 94,3% apenas dentro das FRs (Tabela 2) . Com respeito às seqüências de anticorpos humanos, a região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo era a mais similar à seqüência de consenso em relação ao subgrupo I de cadeia pesada humana, com uma identidade geral de 68,5% e uma identidade de 75,9% apenas dentro das FRs (Tabela 2) . Estes resultados confirmam que as regiões variáveis de Act-1 de camundongo parecem ser típicas das regiões variáveis de camundongo. Os resultados indicam também subgrupos de regiões variáveis humanas que podem servir como boas fontes de matrizes ou receptores de regiões variáveis humanas para enxerto em CDR.

Tabela 2. Comparação de região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo com as seqüências de consenso dos subgrupos de regiões variáveis de cadeia pesada de camundongo e humanas. A seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo foi comparada, com e sem as seqüências dos CDRs, com as seqüências de consenso dos diferentes subgrupos de regiões variáveis de cadeia pesada de camundongo e humanas, com e seu as seqüências dos CDRs. Estão relacionadas as porcentagens de similaridade e identidade em relação aos subgrupos de camundongo e humanos mais similares.

As regiões variáveis de Act-1 de camundongo foram também comparadas com as seqüências individuais de todos os exemplos registrados de regiões variáveis de camundongo e humanas (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991); pacote UW GCG (Universidade de Wisconsin) ) . Com respeito às seqüências de anticorpos humanos, a região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo era muito similar à seqüência da região variável de cadeia leve kappa humana do anticorpo humano GM607'CL (Klobeck, H.-G., et al., Nature 309:73-76 (1984)). A figura 5 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo (SEQ ID Ns 7) e da região variável de cadeia leve de GM607'CL humano (SEQ ID NQ 8) . Como esperado a região variável de cadeia leve de GM607'CL humano é um membro do subgrupo II de regiões variáveis de cadeia leve kappa humanas. A identidade geral de seqüências entre as regiões variáveis de cadeia leve de Act-1 de camundongo e de GM607'CL humano foi calculada como sendo de 71,4%. A região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo era muito similar a região variável de cadeia pesada humana do anticorpo humano 21/28'CL (Dersimonian, H., et al. , J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)). A figura 6 mostra um alinhamento das sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo (SEQ ID Ne 9) e da região variável de cadeia pesada 21/28'CL humano (SEQ ID N° 10). Como esperado, a região variável de cadeia pesada do 21/28'CL humano é um membro do subgrupo I de regiões variáveis de cadeia pesada humanas. A identidade geral de seqüências entre as regiões variáveis de cadeia pesada de Act-1 de camundongo e de 21/28'CL humano foi calculada como sendo de 68,1%. Com base nestas comparações, a região variável de cadeia leve de GM607'CL humano foi selecionada como matriz humana para o projeto de região variável de cadeia leve de Act-1 humano remodelado, e a região variável de cadeia pesada de 21/28'CL humano foi selecionada como matriz humana para o projeto de região variável de cadeia pesada de Act-1 humano remodelado. A segunda etapa no processo de projeto foi inserir os CDRs de roedor nas regiões variáveis de cadeias leve e pesada humanas selecionadas. Os CDRs de roedor completos, como definidos por Kabat, E.A., et al. , Sequences of Proteins of Imaunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)), foram unidos às FRs humanas para criar um enxerto em CDR simples. Em alguns casos, um anticorpo de roedor que esteja humanizado em um enxerto em CDR simples apresentará pouca ou nenhuma ligação a um antígeno. É importante estudar as seqüências de aminoácidos das FRs humanas para determinar se alguns destes resíduos de aminoácidos são passíveis de influenciar adversamente a ligação a antígeno, quer diretamente, através de interações com o antígeno, quer indiretamente, ao alterarem o posicionamento das alças CDR.

Na terceira etapa, são tomadas decisões quanto a quais resíduos de aminoácidos nas FRs humanas devem ser alterados, de modo a obter uma boa ligação ao antígeno. Neste estágio, o modelo das regiões variáveis de roedor torna-se ainda mais útil no processo de projeto. Também são úteis as estruturas canônicas dos CDRs, como definidas por Chothia, C., et ai., Nature 342:877-883 (1989). É importante conservar nas regiões variáveis humanizadas quaisquer dos resíduos de aminoácidos de roedor que sejam parte das estruturas canônicas. É útil comparar a sequência do anticorpo de roedor a ser humanizada com sequências similares de outros anticorpos de roedor, para determinar se os aminoácidos em certas posições são incomuns ou raros. Isto podería indicar que o aminoácido de roedor nessa posição tem uma função importante na ligação a antígeno. Ao estudar o modelo das regiões variáveis de roedor, é possível prever se os aminoácidos em posições particulares poderíam influenciar ou não a ligação a antígeno. Quando regiões variáveis humanas de anticorpos humanos individuais estiverem sendo usadas como base para o projeto, então é aconselhável comparar a sequência humana individual com a sequência de consenso para esse subgrupo de regiões variáveis humanas. Quaisquer aminoácidos que sejam particularmente incomuns devem ser anotados. Na maioria dos casos, estão identificados alguns aminoácidos nas FRs humanas que devem ser alterados do aminoácido presente nessa posição na região variável humana para o aminoácido presente nessa posição, na região variável de roedor.

As Tabelas 3 e 4 sumarizam como as regiões variáveis de Act-1 humano remodeladas foram projetadas. A Tabela 3 é um alinhamento de sequências de aminoácidos usadas nas regiões de Act-1 de mAb humano remodelado, e relaciona a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo a ser humanizada (SEQ ID NQ 7) na coluna 4, a seqüência de consenso para o subgrupo de regiões variáveis de camundongo à qual pertence a região variável de Act-1 de camundongo (SEQ ID Ns 50) na coluna 5 (K-II de camundongo), a seqüência de consenso para o subgrupo de regiões variáveis humanas em relação às quais a variável de Act-1 de camundongo é mais similar (SEQ ID Ns 51) na coluna 6 (K-II humano)/ a sequência de aminoácidos da região variável humana que está servindo como matriz (isto é, GM607'CL) (SEQ ID Ne 8) na coluna 7, e a sequência de aminoácidos da região variável de Act-1 humano remodelado (SEQ ID Ns 52) como projetada na coluna 8 (RHVk de Act-1) . A Tabela 4 ê um alinhamento das seqüências de aminoácidos usadas no projeto de regiões Vy de Act-1 de mAb humano remodelado e relaciona a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo a ser humanizada (SEQ ID N° 9) na coluna 4, a seqüência de consenso para o subgrupo de regiões variáveis de camundongo à qual pertence a região variável de Act-1 de camundongo (SEQ ID NB 53) na coluna 5 (IIB de camundongo)/ a seqüência de consenso para o subgrupo de regiões variáveis humanas em relação à qual o Act-1 de camundongo é mais similar (SEQ ID N2 54) na coluna 6 (Humano I), a seqüência de aminoácidos da região variável humana que está servindo como matriz (isto é/ 21/28'CL) (SEQ ID NQ 10) na coluna 7, e a seqüência de aminoácidos da região variável de Act-1 remodelada (SEQ ID Na 55), como projetada na coluna 8 (RHVjj de Act-1). A penúltima coluna nas Tabelas 3 e 4 indica a posição (de superfície ou embutida) dos resíduos nas FRs que diferem entre as FRs de Act-1 de camundongo e humanas selecionadas. A coluna final nas Tabelas 3 e 4 relaciona comentários relevantes a essa posição na região variável.

Na Tabela 3, são usados os seguintes símbolos: (*) resíduos invariantes, como definidos quer pelas seqüências de consenso de Kabat, isto é, 95% ou maior ocorrência dentro do subgrupo de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)) (no caso das colunas 5 e 6) ou como parte da estrutura canônica para as alças CDR (no caso das colunas 5 e 6) ou como parte da estrutura canônica em relação às alças CDR (no caso da coluna 8), como definido por Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989); (NEGRITO) posições em FRs e CDRs nas quais o resíduo de aminoácido humano foi substituído pelo correspondente resíduo de camundongo; (SUBLINHADO! posições nas FRs nas quais o resíduo humano difere do número de resíduo de camundongo análogo: (Δ) numeração de alterações nas FRs humanas; (Act-1 Ab de camundongo) seqüência de aminoácidos da região VL de anticorpo Act-1 de camundongo; (K-II de camundongo) sequência de consenso de regiões kappa Vp do subgrupo II (Kabat, E.A., et al. , supra); (K-II humano) seqüência de consenso de regiões VL humanas do subgrupo II (Kabat, E.A., et al., supra); (GM607'CL) seqüência de aminoácidos do anticorpo GM607'CL humano (Klobeck, H.-G., et al., Nature 309:73-76 (1984)); (De Superfície ou Embutido) posição do aminoácido em relação ao restante dos resíduos em ambas as cadeias das regiões variáveis do anticorpo; (Act-1 RH Vk) seqüência de aminoácidos da região de Act-1 de mAb humano remodelado.

Na Tabela 4, são usados os seguintes símboios (*) resíduos invariantes, como definidos quer pelas sequências de consenso de Kabat, isto é, 95% ou maior ocorrência dentro do subgrupo de Kabat (Kabat, E.A., et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)) (no caso das colunas 5 e 5) ou como parte da estrutura canônica em relação às alças CDR (no caso da coluna 8), como definido por Chothia, C., et al. , Nature 342:877-883 (1989); (NEGRITO) posições em FRs e CDRs nas quais o resíduo de aminoácido humano foi substituído pelo correspondente resíduo de camundongo; (SUBLINHADO·) posições nas FRs nas quais o resíduo humano difere do número de resíduo de camundongo análogo: (Δ) numeração de alterações nas FRs humanas; (Act-1 Ab de camundongo) seqüência de aminoácidos da região de anticorpo Act-1 de camundongo; (IIB de camundongo) seqüência de consenso de regiões Vjj de camundongo do subgrupo I (Kabat, E.A., et al., supra); (21/28'CL humano) seqüência de aminoácidos do anticorpo humano 21/28'CL (Dersimonian, H., et al. , J. Immunol. 139:2496-2501 (1987); (De Superfície ou Embutido) posição do aminoácido em relação ao restante dos resíduos em ambas as cadeias das regiões variáveis do anticorpo; (Act-1 RH VH) seqüência de aminoácidos da região de Act-1 de mAb humano remodelado.

Com respeito ao projeto de região variável de cadeia leve de Act-1 humana remodelada (Tabela 3), um resíduo nas FRs humanas foi trocado do aminoácido presente nas FRs humanas para o aminoácido presente nas FRs de camundongo originais. Esta troca foi na posição 2 em FR1 (como definida por Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). Em particular, a isoleucina encontrada na região variável de cadeia leve do GM607'CL humano foi trocada por valina, como encontrada na região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo. Esta posição na região variável de cadeia leve kappa tem sido identificada por Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989) como sendo uma das localizações críticas para a orientação e estrutura correta da alça LI e, como tal, é conhecida como sendo um dos "aminoácidos canônicos". Devido á sua importante função na conformação da alça, tais resíduos de estrutura de camundongo são geralmente sempre conservados na região variável remodelada.

Na posição 4 em FR1, existe uma valina na sequência de camundongo e uma metionina na seqüência humana. Uma mudança de valina para metionina não é uma alteração drástica por si própria, visto que ambos os aminoácidos são resíduos não polares, hidrófobos, de modo que a metionina presente na seqüência humana foi usada na região variável de Act-1 humana remodelada. Contudo, o modelo indica que a valina está embutida entre as alças LI e L2 e o volume médio da valina, quando embutido em proteínas, é de 142Â^ de espaço. 0 maior resíduo de metionina podería provocar uma alteração na conformação de qualquer uma das, ou de ambas as alças LI e L2. Ά ligação a antígeno do Act-1 humano remodelado pode ser melhorada por uma alteração adicional na posição 4, de metionina para valina na região variável de cadeia leve de Act-1 humano remodelado.

Com respeito ao projeto da região variável de cadeia pesada de Act-1 humana remodelada (Tabela 4), havia cinco resíduos nas FRs humanas, que foram alterados dos aminoácidos presentes nas FRs humanas para os aminoácidos presentes nas FRs de camundongo originais. Nas posições 24 em FR1 e 71 em FR3 (como definidas por Kabat, E.A., et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)), os resíduos de aminoácidos, como presentes na seqüência de camundongo, foram retidos na região variável de cadeia pesada de Act-1 humana remodelada, porque estas posições sao parte das estruturas canônicas para as alças H1 e H2, respectivamente (Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989)). Visto que quaisquer alterações de aminoácidos nestas posições poderiam prejudicar a aglomeração e as estruturas finais das alças H1 e H2, os resíduos de camundongo nestas localizações críticas são rotineiramente conservados na região variável de cadeia pesada humanizada.

Na posição 48, a metionina da seqüência humana foi trocada por uma isoleucina, como presente na seqüência de Act-1 de camundongo. A substituição de uma metionina por uma isoleucina é incomum. Ainda mais importante, o modelo mostra que o resíduo de isoleucina está embutido em baixo da alça H2. Como resultado, alterações nesta posição embutida podem ter influenciado a estrutura da alça H2 e, portanto, interferido com a ligação ao antígeno.

Na posição 69 em H3, a isoleucina na seqüência humana foi trocada por uma leucina, como presente na seqüência de Act-1 de camundongo. Apesar da substituição de uma leucina por uma isoleucina não ser incomum, o modelo mostra que a leucina está embutida sob a alça H2. Consequentemente, tal como o resíduo na posição 48, alterações nesta localização poderiam influenciar a conformação da alça H2 e, assim, prejudicar a ligação ao antígeno.

Finalmente, na posição 73 em FR3, a treonina na seqüência humana foi mudada para uma isoleucina, como presente na seqüência de camundongo. Uma isoleucina nesta posição em FR3 jamais foi vista anteriormente no subgrupo IIB de camundongo ou no subgrupo I humano (como definido por Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of ImmuhologiCal Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)), o que sugere que a isoleucina nesta localização pode ter uma função importante na ligação a antígeno.

No modelo, a leucina na posição 73 parece estar na superfície, próximo à borda do local de ligação e, dependendo da dimensão e orientação do epitopo na integrina α4β7, pode possivelmente desempenhar uma função direta na ligação a antígeno. Contudo, como uma posição de resíduo de superfície, o anticorpo como um todo teria menos potencial imunogênico se o aminoácido de camundongo não estivesse presente no anticorpo humano remodelado. A isoleucina podería ser substituída pelo resíduo de treonina humano em derivados do anticorpo remodelado, e a nova construção podería ser novamente ensaiada para determinar se a segunda versão mantém um nível similar de ligação a antígeno.

Em adição às cinco alterações nas FRs humanas feitas no projeto original da região variável de cadeia pesada de Act-1 humano remodelado, havia duas outras alterações que poderíam ser feitas, as quais poderíam melhorar a ligação a antígeno. 0 modelo sugere que os resíduos 3 8 Lys e 40 Arg na região variável pesada do Act-1 de mAb de camundongo estão posicionados abaixo da alça H2 e se aglomeram intimamente a 63 Phe em CDR2 (numeração de acordo com a Tabela 4). Contudo, estes resíduos também estão localizados no núcleo da região variável de cadeia pesada e podem ter outros efeitos, possivelmente prejudiciais, se os mesmos forem usados para substituir seus correspondentes aminoácidos humanos (38 Arg e 40 Ala, respectivamente). Portanto, as alterações nas posições 3 8 e 40 em FR2 não foram incorporadas na região variável pesada humana remodelada de Act-1 de mAb. Contudo, qualquer uma das ou ambas as modificações da cadeia pesada remodelada pode(m) ser usada(s) em derivados para melhorar a ligação a antígeno.

Conclusões Construiu-se um modelo das regiões variáveis de Act-1 de camundongo, baseado principalmente nas estruturas resolvidas de regiões variáveis de outros anticorpos. 0 modelo foi usado no projeto das regiões variáveis de Act-1 humanizado. Deu-se ênfase particular à retenção da estrutura do local de adesão a antígeno, nas regiões variáveis humanas remodeladas.

Projetou-se uma região variável de cadeia leve de Act-1 humana remodelada e uma região variável de cadeia pesada de Act-1 humano remodelado (Tabelas 3 e 4). A região variável de cadeia leve de Act-1 humano remodelado foi baseada nos CDRs da região variável de cadeia leve de Act-1 de camundongo e nas FRs da região variável de cadeia leve do anticorpo GM607'CL humano. Foi feita uma alteração de aminoácido nas FRS humanas na posição 2. A região variável de cadeia pesada de Act-1 humana remodelada foi baseada nos CDRs de região variável de cadeia pesada de Act-1 de camundongo e nas FRs da região variável de cadeia pesada do anticorpo 21/28'CL humano. Realizaram-se cinco alterações de aminoácidos nas FRs humanas, nas posições 24, 48, 69, 71 e 73.

Ademais, notaram-se um único local na posição 4 em FR1 da cadeia leve kappa e dois locais nas posições 38 e 40 em FR2 da cadeia pesada, que poderíam ser consideradas no projeto de versões adicionais de regiões variáveis de Act-1 humano remodelado. Ademais, identificou-se também um único resíduo na posição 73 em FR3 da cadeia pesada, como um candidato para retro-mutação do aminoácido de camundongo para humano, em vista da localização na superfície do anticorpo.

Exemplo 3 Construção de Ácidos Nucléicos Codificando Regiões Variáveis Remodeladas Após confirmar que as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve corretas haviam sido clonadas bioquimicamente (sequência parcial de aminoácidos) e funcionalmente (mancha de anticorpo quimérico em células HuT 78), uma seqüência de aminoácidos remodelada foi projetada como descrito acima. A seguir, projetaram-se e prepararam-se genes codificando as cadeias de anticorpo remodelado.

Projeto, construção, e expressão de ÃCT-1 remodelado Após determinar a sequência de aminoácidos primária do anticorpo humanizado, como descrito no Exemplo 2, a seqüência foi submetida a tradução reversa até uma seqüência de ácidos nucléicos degenerada e analizada quanto a possíveis locais de enzimas de restrição, usando MacVector (Kodak, Scientific Xmaging Systems), versão 4.5.3. Selecionou-se então uma seqüência de ácidos nucléicos que incorporava locais de divagem de enzimas de restrição, porém conservava a seqüência de aminoácidos primária. A seqüência de ácidos nucléicos de cadeia pesada (SEQ ID Ns 18) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID ND 19) estão mostradas na figura 11, e a seqüência nucléica de cadeia leve (SEQ ID NB 20) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID Nfi 21) estão mostradas na figura 12, com anotação dos locais de enzimas de restrição usados na subclonagem.

Os genes de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de Act-1 humanizado foram construídos como segue.

Oligonucleotídeos complementares sobrepostos, designados L1-L6 (SEQ ID Ns 22-27, respectivamente) para a cadeia leve, e H1-H10 (SEQ ID Na 28-37, respectivamente) para a cadeia pesada foram sintetizados usando um Sintetizador de DNA Modelo 392 da Applied Biosystems (figura 13). Após desproteger durante a noite a 55DC, os oligos foram secados em um Speed-Vac, resuspensos em 100 ml de água e dessalinizados sobre colunas Bio-Spin s6 (Rio-Rad). A concentração de oligos foi determinada ao medir a absorbância a 260 nm, e os oligos foram purificados através de eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Misturaram-se 100 μg de cada oligo com 2 volumes de corante de carga (95% formamida, 20 mM EDTA, 0,05% azul de bromofenol, 0,05% xileno cianol FF) , aquecidos durante 2 minutos a 65°C, e operados em IX TBE durante aproximadamente 3 horas a 250 V. 0 gel foi manchado com brometo de etídio e observado sob luz ultravioleta. Os oligos de comprimento correto foram então cortados fora do gel, colocados em tubulação de diálise com água e eletroeluados. Os oligos foram extraídos duas vezes com volumes iguais de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1 v/v) (Gibco/BRL) e precipitados pela adição de 0,1 volume de acetato de potássio 3,0 M (pH 6) e 2 volumes de etanol frio. Após centrifugação, as pastilhas foram lavadas uma vez com etanol a 70%, secadas a vácuo, e resuspensas em 50 μΐ de água.

Oligos complementares foram temperados ao misturar quantidades molares iguais (aproximadamente 100 μg em 50 μΐ de água) do oligo purificado com um volume igual (100 μΐ) de 2X tampão de têmpera (2X = 1M NaCl, 40 mM Tris-HCl a pH 7,5, 2 mM EDTA). Os oligos foram desnaturados por aquecimento a 95QC durante 10 minutos, seguido de uma incubação de 8 horas a 65aC. Os oligos desnaturados foram então precipitados em etanol, como descrito anteriormente, e resuspensos em 40 μΐ de água. A extensão dos oligos temperados foi realizada pela adição de 2 μΐ de Polimerase I de DNA de Fragmento Grande (Klenow), 5 μΐ de 2,5 mM dNTPs e 5 μΐ 10 x Tampão (10X = 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2/ 1 mM DTT, pH 7,9 a 25fiC), levando o volume final a 52 μΐ. A mistura foi incubada durante uma hora à temperatura ambiente. Adicionaram-se mais 1 μΐ de dNTPs e 1 μΐ de Klenow com incubação de meia hora a 27BC. Note-se que o fragmento A de cadeia pesada não necessitava ser estendido.

Os fragmentos temperados e estendidos foram purificados a partir de material não temperado de fileira única por eletroforese através de um gel de poliacrilamida nativa a 12%. O gel foi manchado com brometo de etídio e observado sob luz ultravioleta. Os fragmentos de comprimento correto foram cortados fora e recuperados por eletroelução em tubulação de diálise, como descrito acima. Os fragmentos foram lavados duas vezes com volumes iguais de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, precipitados em etanol e resuspensos em 10 μΐ de água.

Os três fragmentos de cadeia leve (LA, LB & LC) e cinco fragmentos de cadeia pesada (Designados HA-HE) foram ligados independentemente em pCR-Script™ e transformados, exceto como descrito abaixo, em Células Supercompetentes XL-1 Blue, usando um protocolo recomendado pelo fabricante. Os fragmentos pCR-LA e pCR-LB foram transformados em células competentes DM1 (Gibco/BRL) para evitar a metilase de Dem que provocaria a digestão de blocos com a enzima de restrição Msc I. Coletaram-se colônias em branco, e o DNA miniprep foi sequenciado usando o kit de polimerase de DNA Sequenase T7, de acordo com o protocolo recomendado do fabricante. Imprimadores T3 e T7, que se temperam em lados opostos da inserção, foram usados para o sequenciamento. A subclonagem de compilação dos fragmentos de região variável de cadeia pesada e de região variável de cadeia leve humanizadas foi realizada usando locais de restrição específicos incorporados à sequência durante a síntese. Os fragmentos de cadeia pesada HA-HD incluem um local de restrição Age I adicional na extremidade de cada sequência, permitindo a subclonagem seqüencial dos fragmentos, como descrito abaixo. DNA miniprep de pCR-HA e pCR-HB foi digerido com as enzimas de restrição Spe I e Age I. O DNA foi submetido a eletroforese em um gel de agarose a 1%. 0 fragmento HB de 141 pb foi recuperado do gel e ligado em pCF-HA nos locais Spe I e Age I, dando origem a pCR-HAB. A seguir, o fragmento HC de 112 pb foi liberado de pCR-HC usando Xba I e Age I e ligado aos locais Xba I e Age I em pCR-HAB, resultando no plasmida pCR-AC. Os fragmentos HD (141 pb) e HC (132 pb) foram ligados da mesma maneira seqüencial, usando os locais de restrição Nhe I e Age I para o Fragmento HD, e BstE II e Age I para o fragmento E. O plasmida final, contendo todos os cinco fragmentos de região variável de cadeia pesada em pCR-Script, foi designado pCR-HAE. Todas as digestões foram realizadas usando DNA miniprep com incubações a 372C durante pelo menos duas horas, exceto em relação aos usando BstE II, que tem uma temperatura de incubação ideal de 65QC. As ligações foram feitas durante a noite a 16SC, usando ligase de DNA T4 com uma razão de vetor para inserção de 1:10, e transformadas no dia seguinte em células competentes de eficiência de subclonagem DH50t (Gibco/BRL), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A região variável de cadeia pesada humanizada de Act-1 em pCR-Script™ foi liberada pela digestão e pCR-HAE com HindIII e Age I. Este fragmento de 411 pb foi usado para substituir as sequências de região variável de camundongo de pEE5mhACTlHchi (Exemplo 1), que haviam sido digeridas com HindIII e Age I, gerando o gene de cadeia pesada ACT-1 humanizado em pEE5hCMV-B. 0 plasmida resultante é designado pEE5hACTlH. A seqüência de DNA correta foi determinada por sequenciamento. O fragmento de cadeia leve A em pCR-Script™ foi digerido com BspE I e Mscl. Este fragmento de 153 pb foi então usado para substituir a porção de camundongo de BspE I a Mscl da cadeia leve variável de camundongo em pCR-Script™. Este plasmida é designado pCR-LhAmBC. 0 fragmento de cadeia leve B, digerido com Msc I e Nru I, e o fragmento de cadeia leve C, digerido com Nru I e Kas I, foram triplamente ligados aos locais Mscl e Kas I de pCR-LhAmBC, substituindo a seqüência de camundongo remanescente. As digestões, ligações e transformações usaram os mesmos procedimentos anteriormente declarados, exceto que utilizaram-se células competentes DM1 em todas as transformações, exceto a final. A região variável de cadeia leve humanizada em pCR-Script™ e o plasmida pEE12mhACTlLchi (Exemplo 1) foram digeridos com Hind III e Kas I. O fragmento de região variável de cadeia leve de 3 60 pb e a região constante de cadeia leve de 315 pb foram purificados em gel e triplamente ligados ao local de restrição Hind III de pEE12, para resultar em pEE12hACTlL. Realizou-se sequenciamento para confirmar a orientação e seqüência de ácidos nucléicos corretas.

Um vetor de expressão contendo ambos os genes de cadeia pesada e leve humanizados foi construído usando o mesmo método descrito em relação ao anticorpo quimérico (vide Exemplo 1, Expressão de uma Imunoglobulina Quimérica), com a seguinte exceção. Devido a um local de restrição Bgl II adicional na região variável de cadeia pesada humanizada, utilizou-se uma digestão parcial ao cortar com Bgl II para obter o fragmento correto. 0 vetor contendo ambos os genes de cadeia pesada e leve humanizados é designado pEE12HACTlLH. A expressão transiente de todas as construções de anticorpos humanizados e o tingimento de células foi realizada usando os mesmos protocolos que os usados em relação ao anticorpo quimérico (vide Exemplo 1, Expressão de uma Imunoglobulina Quimérica). A figura 14 mostra os resultados de tingimento de HuT 78 usando o anticorpo Act-1 quimérico de camundongo-humano ou o anticorpo Act-1 humanizado, comparado com um anticorpo de controle irrelevante, coincidente com isotipo (IgGl, kappa). Transfectantes estáveis de células NSO, uma linha de células de mieloma (Methods in Enzymol. 73 (B):3-46 (1981); European Collection o f Animal Cell Cultures, PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, ECACC NQ 85110503), foram obtidos por eletroporação de células NSO com pEE12hACTlLH.

Expressão Estável em Células NSO 40 μg de pEE12hACTlLH para transfecção estável foram linearizados por digestão com enzima de restrição Sall, que corta dentro da porção de plasmida bacteriano da construção. 0 DNA linearizado foi precipitado da solução usando dois volumes de etanol mais 1/10 volume de acetato de sódio, lavado em etanol a 70%, secado e resuspenso em água estéril.

As células NSO com multiplicação exponencial foram mantidas em Meio Não Seletivo (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco) (elevado teor de glicose), com 2 mM de L-glutamina, sem piruvato de sódio, com 4500 mg/L de glicose, e com 25 mM de tampão HEPES (GIBCO/BRL, Nfi de Catálogo 12430-021), mais Serum Fetal Bovino a 10% (Gibco/BRL, NQ de Catálogo 16000-044)). As células NSO foram centrifugadas, lavadas e resuspensas em PBS frio, de modo que, após a adição do DNA, as células estivessem em uma concentração de 10' células/ml. 0 DNA de plasmida linearizado (40 μg) foi adicionado a 10^ células em uma cubeta de eletroporação em gelo. As células e o DNA foram misturados suavemente, de modo a evitar a geração de bolhas e a mistura foi deixada em gelo durante 10 minutos. O exterior da cubeta foi secado e aplicaram-se dois pulsos consecutivos a 1500 V, 3 μΕ, usando um Gene Pulser (Bio-Rad). A cubeta foi devolvida ao gelo durante 10 minutos.

As células fransfectadas foram transferidas para placas de 96 poços, a densidades de 3 x 10^, 7,5 x 10^ e 1,5 x 10^ células/ml em 50 μΐ de meio não seletivo e incubadas a 37aC durante 24 horas. Subseqüentemente, adicionou-se a todos os poços 150 μΐ de Meio Seletivo (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco Livre de Glutamina, com 4500 mg/L de glicose, com 4 mg/L de piridozina HC1, com 110 mg/L de piruvato de sódio, sem nitrato férrico, sem L- glutamina (JRH BioSciences, NB de Catálogo 51435-78P), mais IX Suplemento GS (50X Suplemento GS obtido da JRH BioSciences, Na de Catálogo 58672-77P), mais Serum Fetal Bovino Dializado a 10% (Gibco/BRL, NQ de Catálogo 25300-061)). As placas foram devolvidas ao incubador, até ter ocorrido uma substancial morte de células, e terem surgido colônias sobreviventes discretas. Assim que colônias de transfectantes independentes de glutamina podiam ser observadas, selecionaram-se poços com colônias únicas e os sobrenadantes de culturas de tecido gastas foram coletados e ensaiados quanto à secreção de IgG humano, através de ELISA, como descrito abaixo. Obteve-se desta maneira um clone produtor de anticorpo designado 3A9, que foi usado em estudos subsequentes. Uma segunda transfecção foi realizada como descrito acima, exceto que a seleção foi realizada na presença de sulfoximina de L-metionina (MSX, um inibidor de sintetase de glutamina).

As colônias positivas foram examinadas através de ELISA quanto à secreção de IgG humano, como segue. Placas ELISA (NUNC Maxisorp) foram revestidas durante a noite a 4aC com 100 μΐ de fragmento de IgG anti-humano de jumento AffiniPure F(ab')2 (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 2,5 μg/ml em tampão de carbonato, pH 9,5. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS Tween 20 e bloqueadas durante 2 horas a 37QC com 200 μΐ PBS, 1% BSA. As placas foram lavadas e incubadas durante 15 minutos a 37SC com 100 μι de sobrenadante de NSO transfectado estável. Utilizou-se como padrão IgGl kappa a 1 mg/ml em PBS 1% BSA. Meio NSO novo (DME + Suplemento GS) foi usado como controle negativo. As placas foram lavadas e incubadas durante 15 minutos a 372C com 100 μΐ de IgG anti-humano de jumento AffiniPure F(ab')2 conjugado com peroxidase (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 0,05 μg/ml em PBS (sem Ca^+/Mg^+) Um tablete de 5 mg de dihidrocloreto de 0-fenilenodiamina (OPD) (Sigma) foi dissolvido em 12 ml de tampão de citrato (0,1 M, pH 5,0), e adicionaram-se 12 μΐ de peróxido de hidrogênio a 30% após o tablete ter-se dissolvido. Após lavagem para remover o anticorpo secundário, adicionaram-se 100 μΐ de substrato OPD dissolvido. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 12,5% e as placas foram lidas em uma Leitora de Placas Dynatech a 490 nm. Os poços positivos foram clonados por diluição limitadora a 2, 1 e 0,5 células por poço. Quando todos os poços de uma única clonagem apresentaram resultado positivo quanto à produção de anticorpos por ELISA, a linha era considerada clonada. A purificação de anticorpo ACT-1 humanizado dos sobrenadantes de cultura de células de culturas transfectantes de células transientes ou estáveis foi realizada por cromatografia de afinidade de Proteína A (Poros A/M 4,6/100 mm, 5 mL/min usando uma estação de trabalho Bio-Cad (Perseptive Biosystems, Inc.). A coluna foi equilibrada com PBS, seguido de aplicação do sobrenadante de cultura de células, que havia sido previamente filtrado através de filtros de 0,2 micron. 0 volume de sobrenadante de cultura de células aplicado em cada corrida variou de acordo com a concentração de anticorpos. Normalmente, não mais que 15 mg de anticorpos eram aplicados à coluna em uma dada corrida. A taxa de fluxo era de 5 ml/min durante todo o procedimento de purificação. Após a ligação, a coluna era primeiramente lavada amplamente com PBS até DC^go nm = 0. A coluna era subseqüentemente lavada com um mínimo de 50 volumes de coluna. A coluna era então subseqüentemente lavada ccom acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0. A elução era realizada por lavagem com Citrato de Na 0,1 M, pH 3,5. 0 eluado era coletado em frações de 5 ml e o pH era neutralizado pela adição de 200 μΐβ de Na2Cog 1,5 M, pH 12. As frações contendo anticorpos eram então combinadas e concentradas até a concentração desejada, através de ultrafiltragem (centricon, corte de 30.000 kDa, Amicon).

Construção de uma Variante com Mutação Fc Uma versão não ligante de Fc (com mutação de Fc) do anticorpo Act-1 humanizado também foi construída. Este anticorpo tem as mesmas regiões variáveis que o anticorpo Act-1 humanizado (figura 11 e figura 12), e uma região constante IgGl humana idêntica, com a exceção de duas substituições de aminoácidos na região constante de cadeia pesada de IgGl, projetada para abrogar o reconhecimento de FcR e eliminar a ligação a Fc (isto é, uma substituição Leu235 Ala^5 e uma substituição Gly^? -> Ala^·^). O ácido nucléico codificando a cadeia pesada do derivado com mutação Fc foi construído como segue. Uma construção designada 3678 (obtida do Dr. Herman Waldmann, Universidade de Oxford), que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo anti-CD18 humanizado (WO 93/02191 (Publicado em 04 de Fevereiro de 1993); Sims, M.J., et ai., J. Immunol. 151(4): 2296-2308 (1993)) em um vetor de expressão pEE12, porém no qual duas substituições de aminoácidos foram introduzidas na região constante de cadeia pesada de IgGl, através de mutagênese direcionada a local (LeuZJ3 —>

Ala235 e uma substituição Gly^37 —> Ala^^^), foi digerida com Age I e EcoRI para liberar um fragmento de 900 pb contendo o mutante de região constante gama. Este fragmento foi então utilizado para substituir a região constante gama um de tipo silvestre da cadeia pesada nos locais Agel/EcoRI em pEE6hACTlH, dando origem a pee6hACTlH/FCmut. De maneira análoga à descrita acima em relação a outras construções compreendendo ambas as cadeias, preparou-se uma única construção (pEE12hACTlLH/FCmut) contendo o gene de cadeia leve remodelado e o gene de cadeia pesada remodelado com mutação Fc.

Exemplo 4 Caracterização de LDP-02, um Anticorpo ACT-1 Humanizado Estudos de caracterização iniciais foram realizados usando o anticorpo produzido a partir de células COS-7 transientemente transfectadas com pEE12hACTlLH/FCmut. Este preparado de anticorpo foi produzido e purificado como descrito acima, e é denominado abaixo como "1SHÜM ACT-1", seguido do número de lote apropriado.

Ensaios adicionais foram realizados usando o anticorpo produzido a partir de um transfectante estável da linha de células murinas NSO, como descrito acima (transfectadas com pEE12hACTlLH/FCmut). Este preparado de anticorpo é denominado abaixo "LDP-02/3A9/Lote 1". 0 anticorpo "LDP-02/3A9/Lote 1" foi usado nos seguintes estudos descritos abaixo: SDS-PAGE, Análise de Mancha Western, Focalização Isoelétrica, Análise de Composição de Aminoácido, Reatividade Cruzada de Espécies, Titulação, Ensaios de Lise Mediada por Complemento, Ensaios ADCC, e Ensaios de Inibição de Ligação. O "1SHUM ACT-1 Lote NQ 7" foi usado nos Ensaios de Afinidade Ne 1-2, o laHUM ACT-1 Lote NQ 8/9 foi usado nos Ensaios de Afinidade Ns 3-5, e o 12HUM ACT-1 Lote Na 8/9 foi usado nos Ensaios de Ligação Clq. A. Propriedades Físico-Químicas 1. SDS-PAGE

Para auxiliar no estabelecimento da identidade, caracterizar o primeiro preparado, e avaliar a pureza, o lote LDP-02/3A9/Lote NQ 1 foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida de sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE) sob condições não redutoras e redutoras e manchado com Azul de Coomassie Coloidal.

Adicionaram-se a um microconcentrador 80 μΐ de LDP-02/3A9/Lote Na 1 a uma concentração nominal de 0,82 mg/ml. O tampão de citrato, no qual o anticorpo foi dissolvido, foi trocado três vezes com 160 μΐ de tampão Tris (0,5 mM, pH 8,8). O volume final da amostra após a troca de tampão era de 135 μΐ, resultando em uma concentração de proteína de 0,486 mg/ml. Esta solução foi diluída duas vezes com ambos os tampões não redutor e redutor, para obter uma concentração de 0,243 mg/ml. Uma alíquota de 13 μΐ da solução a 0,243 mg/ml, contendo 3,16 μg de proteína, foi carregada sobre as pistas de amostra designadas do gel SDS. Realizou-se a SDS-PAGE, e os artigos de controle incluíam os Padrões de Peso Molecular Mark 12 (Novex, Na LC5677).

Sob condições não redutoras, uma faixa majoritária com um peso molecular aparente de ligeiramente menos que 200.000 Daltons estava presente em LDP-02/3A9/Lote N2 1. Vários componentes minoritários foram observados entre 116.300 e 200.000 Daltons. Três componentes minoritários adicionais com pesos moleculares aproximados de 97.400 Daltons, ligeiramente maior que 55,400 Daltons, e menos de 31.000 Daltons também foram observados. A varredura do gel usando densitometria a laser permitiu a análise quantitativa das faixas de polipeptídeos manchadas e então o cálculo da área percentual associada a cada faixa visível (Tabela 5) . Os dados obtidos a partir da análise quantitativa indicam que o componente majoritário observado a aproximadamente 200.000 Daltons representava 84,4% das faixas totais manchadas na pista de amostra de ensaio. Esta faixa majoritária representava o anticorpo intacto, ao passo que as outras faixas a 55.000 e 31.000 Daltons representavam as cadeias pesada e leve singulares, respectivamente.

Sob condições redutoras, dois componentes majoritários foram observados no gel de eletroforese. 0 peso «molecular de um dos componentes era de aproximadamente 55.400 Daltons e representava 68,6% das faixas manchadas totais visualizadas na pista de gel, ao passo que o segundo componente correspondendo a ligeiramente menos que 31.000 Daltons, representava 30,5% das faixas manchadas totais (Tabela 5). Os pesos moleculares destes dois componentes concordam bem com os pesos moleculares esperados das cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina G. Estes dados indicam que aproximadamente 99% do preparado consistia quer do anticorpo intacto, quer de cadeias singelas pesada ou leve da cadeia de imunoglobulina. Além dos dois componentes majoritários, observou-se também um um componente minoritário a ligeiramente menos de 66.300 Daltons.

Por estas análises, uma espécie de elevado peso molecular, consistente com a de imunoglobulina G intacta, está presente como faixa principal em LDP-02/3A9/Lote Na 1. Várias faixas minoritárias também estão presentes em LDP-02/3A9/Lote NQ 1. Após redução, observaram-se duas faixas majoritárias apresentando migrações eletroforéticas consistentes com as das cadeias pesada e leve de uma molécula de imunoglobulina G. 2. Análise por Mancha Western As amostras e padrões foram analisados por SDS-PAGE, como descrito acima. Em resumo, as amostras não reduzidas e reduzidas foram analisadas em um gel de Tris-Glicina a 4-20%. Padrões de Peso Molecular Novex Mark 12 também foram processados no gel. Volumes de 2,1 μΐ e alíquotas de 4,5 μΐ da solução a 0,2143 mg/ml, resultando em 0,51 e 1,09 μg de proteína, respectivamente, foram carregados nas pistas de amostra designadas do gel SDS.

Após SDS-PAGE, as proteínas de amostra foram transferidas do gel para nitrocelulose, de acordo com as instruções do Aparelho de Transferência Western da Novex. O tampão de transferência usado era tampão de Tris-Glicina IX em Metanol a 20%. Após aproximadamente 2 horas, a mancha de nitrocelulose foi removida do aparelho de transferência e enxaguada com água DDI. A mancha de nitrocelulose foi então bloqueada a 37BC durante 35 minutos em tampão Tris (20 mM), contendo 3% de gelatina e 0,1% de Tween 20. A mancha foi removida da solução bloqueadora e lavada duas vezes com tampão Tris. Solução de IgG de cabra anti-camundongo, que havia sido preparada ao diluir 1000 vezes solução de estoque de anticorpo IgG anti-camundongo com solução 20 mM Tris-3% BSA, foi adicionada à mancha e incubada a 2-8fiC durante a noite. Após a incubação, a mancha foi lavada com quatro trocas de tampão Tris durante 5 minutos cada. Solução conjugada de fosfatase alcalina de IgG anti-cabra, preparada ao diluir 5000 vezes conjugado de fosfatase alcalina de IgG anti-cabra em solução 20 mM Tris-3% BSA, foi adicionada à mancha e incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a incubação, a mancha foi lavada com quatro trocas de tampão Tris durante 5 minutos cada. Substrato BCIP/NBT (sal de 5-Bromo-4-Cloro-3'-Indolil Fosfato p-Toluidina/Cloreto de Tetrazolio Nitro-Azul) foi adicionado à mancha, a 10 ml de cada vez. A mancha foi revelada à temperatura ambiente, com agitação. A reação foi interrompida ao enxaguar a mancha com tampão Tris. O procedimento acima foi então repetido usando IgG de cabra anti-humano, ao invés de IgG anti-camundcngo Sob ambas as condições não redutora e redutora usando o reagente IgG anti-camundongo, as amostras de 0,51 μg e de 1,09 μg foram claramente detectadas na mancha de nitrocelulose. A intensidade das faixas aumentou com o aumento da concentração. Sob condições não redutoras, foi detectada uma faixa majoritária, migrando ligeiramente mais rápido que o marcador de 200.000 Daltons. Várias faixas mais fracas também foram detectadas. Duas destas faixas migravam mais lentamente que a faixa majoritária e aproximadamente três outras faixas migravam mais rapidamente. Sob condições redutoras, foram detectadas duas faixas, características das cadeias pesada e leve de imunoglobulina G.

Usando o reagente IgG anti-humano sob ambas condições não redutora e redutora, as amostras de IgG 0,51 μg e de 1,09 μg foram claramente detectadas na mancha de nitrocelulose. Sob condições não redutoras foi detectada uma faixa majoritária, correspondendo a uma espécie tendo um marcador de peso molecular aparente ligeiramente menor que 200.000 Daltons. As faixas mais fracas observadas na mancha, detectadas com IgG anti-camundongo, também foram detectadas. A intensidade da mancha imunológica era maior em relação a todas as faixas quando detectada com IgG anti-humano. Detectaram-se várias faixas adicionais, não observadas na outra mancha. É provável que estas faixas correspondam a fragmentos de IgG carecendo de epitopos que são reconhecidos pelo IgG anti-camundongo. Sob condições redutoras, detectou-se uma faixa característica da cadeia pesada de uma imunoglobulina G. Visto que o anticorpo era específico para a porção Fc do IgG humano, a cadeia leve não foi detectada. Várias faixas minoritárias, não observadas na mancha revelada com IgG anti-camundongo, foram observadas quando a detecção era realizada com o IgG anti-humano. Esta diferença entre as duas manchas pode ser o resultado da presença de fragmentos IgG carecendo de epitopos para ligação de IgG anti-camundongo. 3. Focalização Isoelétríca LDP-02/3A9/Lote Ne 1 foi submetido a Focalização isoelétríca (IEF) e manchado com Azul de Coomassie Coloidal. Os resultados obtidos em relação a LDP-02/3A9/Lote Ns foram comparados com padrões de IEF, que foram focalizados no mesmo gel.

Adicionaram-se a um microconcentrador 80 μΐ de LDP-02/3A9/Lote NQ1 a uma concentração nominal de 0,82 mg/ml. O tampão de citrato no qual estava o anticorpo foi trocado três vezes por 160 μΐ de tampão Tris (0,5 mM, pH 8,8). O volume final da amostra era de 135 μΐ. A concentração final foi calculada como sendo de 0,486 mg/ml. Esta solução foi diluída duas vezes com 2 X tampão de amostra IEF, para obter uma concentração de 0,243 mg/ml. Uma alíquota de 13 μΐ da solução de 0,243 mg/ml, resultando em 3,16 μg de proteína, foi carregada na amostra designada do gel de IEF. Os artigos de controle incluíam os Padrões de IEF 3.6-9.3 (Sigma, Cat NQ 1-3018) .

Uma tabulação padrão foi gerada ao criar um gráfico da média de migração em distância relativa de oito Padrões de IEF versus o pi conhecido de cada uma destas proteínas padrão. A coincidência linear destes dados resultou em uma inclinação negativa de 0,03459 e uma interceptação de 8,91857. O da coincidência era igual a 0,99206. A Tabela 6 contém as distâncias médias de migração dos seis padrões de IEF e de LDP-02/3A9/Lote Ns 1. os pis calculados para LDP-02/32A9/Lote Ns 1 também estão mostrados nesta tabela.

Usando os parâmetros de regressão linear da tabulação padrão, os pis aproximados para as cinco faixas de LDP-02/3A9/Lote NQ 1 foram calculados como sendo 7,88, 7,95, 8,09, 8,26 e 8,43, com o pico predominante representado por um pi de 8,09 (Tabela 6). 0 pi deste pico principal compara-se favoravelmente com um pi previsto de 7,91, com base na sequência de aminoácidos primária. TABELA 6 * Média 1 Com base na curva padrão (pi vs. Distância de Migração), onde: pi da Amostra = Interceptação - Inclinação (Distância de migração da amostra) 4. Análise de Composição de Aminoácido A análise de composição de aminoácido foi realizada para determinar o teor de proteínas e a composição de aminoácidos de LDP-02/3A9/Lote Nfi 1 e confirmar a identidade.

Alíquotas de 45 μΐ em triplicata foram primeiramente removidas para hidrólise. A hidrólise foi realizada a 165QC durante 60 minutos, usando vapores de 6N HC1. Como controle, o recipiente de hidrólise continha uma proteína padrão que foi hidrolizada simultaneamente com a LDP- 02/3A9/Lote NQ 1. Os artigos de controle incluíam Albumina de Serum Bovino (Tektagen Solution Control:310:197A) como proteína padrão e Mistura de Hidrolizado de Aminoácido (Tektagen Solution Control:310:199A) como padrão de aminoácido. 0 método de ensaio empregou a análise de hidrolisado de proteína resuspenso ou solução de aminoácido por HPLC de intercâmbio de íons com reação de ninhidrina pós-coluna e monitoração de absorbância em dois comprimentos de onda. A absorbância em dois comprimentos de onda foi quantificada através de comparação com uma tabela de calibração obtida ao analisar padrões de aminoácido em triplicata. A composição do aminoácido é apresentada na Tabela 7. A concentração de proteínas de LDP-02/3A9/Lote Nc 1 foi determinada como sendo de 0,709 mg/mL. Após correção quanto à falta de quantificação de W e C, a concentração de proteína foi revisada para 0,740 mg/mL. Os dados e cálculos pertinentes estão sumarizados na Tabela 8.

Em relação a LDP-02/3A9/Lote N3 1, realizou-se um único ponto de tempo de hidrólise (60 min.) a 165QC, usando vapores de 6N HC1. Fatores de correção, que foram derivados da proteína padrão (BSA), foram aplicados às determinações do teor de proteínas (Tabela 8).

Sob as condições deste método, os valores de porcentagem molar para prolina (Tabela 7) podem ser ligeiramente elevados, devido à presença de um pico de cisteína co-eluente. Consequentemente, a precisão da quantificação de prolina é dependente da amostra, com base na quantidade de cisteína presente nos hidrolisados da amostra. Em relação a esta análise, o teor de prolina foi corrigido usando um fator de correção derivado de BSA (Tabela 8). A precisão desta correção é dependente da amostra, com base nas quantidades relativas de cisteína no BSA (6,0%) e na amostra. A composição de aminoácidos prevista de LDP-02 como porcentagem relativa (porcentagem de frequência ou molar) com base na seqüência de nucleotídeos das cadeias pesada e leve ((% Prevista), e os resultados reais da análise de aminoácido (% Real) estão apresentadas na tabela 9. A comparação dos valores previstos versus reais mostra uma boa correlação, exceto quanto à prolina que, como anteriormente descrito, é provavelmente elevada por artefato, devido a um pico de cisteína co-eluente. TABELA 7 1 - 0 fator de correlação é de 0,958, o qual está baseado no teor de W e C de 1,8% e 2,4%, respectivamente. 1 0 teor de proteína não está corrigido em correção a cisteína e triptófano. 2Um fator de correção derivado de BSA foi aplicado a cada aminoácido detectado. 3Total de ng hidrolizado = Total de ng injetado x volume de reconstituição)/Volume de injeção (50 μΐ). TABELA 9 Composição de Aminoácido 5. Análise MANDI-TOF MS A LDP-02/3A9/Lote Ns 1 foi analizada por MALDI-TOF MS para determinar o peso molecular. Detectou-se um pico principal com uma massa centralizada em 149.808 Da. O pico centralizado em 74,927 Da representava o íon +2 da espécie encontrada no pico principal. Deve-se notar que a massa do íon +2 não é exatamente a metade do íon Μ +H; esta ligeira disparidade é provavelmente causada pela imprecisão experimental, que está dentro de +/- 0,2% do valor medido. Com base na sequência prevista primária do anticorpo, a massa molecular esperada deveria ser de 147.154 Da. A diferença de massa de 2.654 Da entre as massas moleculares do IgG previsto pode mais provavelmente ser atribuída à glicosilação da molécula. Esta diferença observada representa um nível de glicosilação de aproximadamente 1,8%. B. Afinidade Primeiramente, realizou-se a titulação de LDP-02/3A9/Lote Nfi 1 e ACT-1 murino (Lote Nfi 2) usando citometria de fluxo em células HUT-78 derivadas de humanos. Em resumo, 1,0 x 106 células HUT-78 foram suspensas em um volume de 100 μΐ AVT-1 murino biotinilado (Lote NQ 2), IgGl murino biotinilado (Lote Na 1 produzido na Leukosite, Inc.), LDP-02/3A9/Lote Na 1 biotinilado, ou IgG humano biotinilado (Jackson ImmunoResearch, Avondale, PA; Lote 24784) durante 20 minutos a 4SC, após o que removeram-se os anticorpos. A menos que indicado de outro modo, todos os reagentes foram diluídos em 0,15 PBS/1,0% FCS/0,1% azeto de sódio. As variadas concentrações para ambos os anticorpos incluíram 30 μg/ml (apenas ACT-1 murino), 15 μΐ/ml, 7,5 μg/ml, e subsequentes diluições 1:10 de cada. Após a remoção dos anticorpos primários, as células foram então suspensas em 100 μΐ de streptavidin ficoeritrina (Dako Corp.; Carpinteria, CA), diluída a 1:200. Após lavagem em 200 μΐ de PBS, as células foram resuspensas em 0,5 ml de PBS/1% formalina e refrigeradas até serem analisadas. As amostras foram analisadas em um FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando um laser a 488 nm para excitar a ficoeritrina. Em relação a cada amostra, analisou-se um mínimo de 10.000 células e calculou-se a fluorescência de canal médio meio-máximo (MCF). Todas as amostras foram realizadas em duplicata.

Estes estudos de titulação indicaram que a concentrações de aproximadamente 1,0 μ9/πι1, chegava-se à fluorescência máxima ao usar ambos ACT-1 murino e LDP-02/3A9/Lote Ne 1 (figura 15). A fluorescência de canal médio meio-máximo foi obtida a concentrações mais baixas de LDP-02 do que em relação a ACT-1 murino (0,1 μg/ml para ACT-1 murino biotinilado Lote N® 2, e 0,02 μg/ml para LDP-02/3A9/Lote N2, respectivamente.

As avaliações relativas de afinidade (e especificidade) foram realizadas citometria de fluxo e ligação de competitividade cruzada de LDP-02 e do anticorpo Act-1 murino, e vice-versa, em células HuT-78 derivadas de humanos. Em resumo, 1,0 x 10^ células HuT-78 foram suspensas em 100 μΐ de Act-1 murino biotinilado (Lote Ne 2) a 0,1 μg/ml com variadas concentrações de 1BHUM ACT-1 ou Act-1 murino não conjugado durante 20 minutos a 4SC, após o que removeram-se os anticorpos. Em uma experiência separada, 100 μΐ de LDP-02/3A9/Lote Ne 1 biotinilado a 0,02 μg/ml foram usados com variadas concentrações de Act-1 murino não conjugado (Lote N° 2) e LDP-02/3A9/Lote Nfl 1 não conjugado. A concentração de anticorpos biotinilados manteve-se constante onde as concentrações resultantes em fluorescência de canal médio meio-máximo (MCF) em células HUT-78 manchadas sob condições, como demonstrado acima. A menos que indicado de outro modo, todos os reagentes foram diluídos em 0,15 M PBS/1,0% FCS/0,1% azeto de sódio. As variadas concentrações para ambos os anticorpos variaram em incrementos de meio-log, de 2,0 x 10"^M a 5,0 x ΙΟ’^Μ. Após remoção dos anticorpos primários, as células foram então suspensas em 100 μΐ de streptavidin ficoeritrina (Dako Corp., Carpinteria, CA), diluídas a 1:200. Após lavagem em 200 μΐ de PBS, as células foram resuspensas em 0,5 ml de PBS/1% formalina e refrigeradas até serem analisadas. As amostras foram analisadas em um FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA), usando um laser a 488 niu para excitar a f icoeritrina. Em relação a cada amostra, analisou-se um mínimo de 10.000 células e calculou-se o MCF. Todas as amostras foram realizadas em duplicata. A Cl^g foi determinada como sendo a concentração de anticorpo não conjugado produzindo uma redução de 50% no MCF do anticorpo homólogo biotinilado.

As estimativas de afinidade foram realizadas em cinco experiências de competitividade cruzada independentes entre LDP-02 (ls HUM ACT-1) e ACT-1 murino. Quando Act-1 murino biotinilado era usado como anticorpo mantido constante no ensaio, os valores CI50 médios (± 1 SEM) para LDP-02 (5,43 ± 0,86 nM) foram estatisticamente inferiores aos de ACT-1 murino (7,94 + 1,17 nM; p= 0,02, ensaio-t de duas extremidades; duas amostras em par para médias), ao passo que o IgGl humano ou o IgGl murino não tinha qualquer efeito competitivo (todas as experiências sumarizadas na Tabela 10; uma experiência mostrada na figura 16). De maneira similar, quando LDP-02/3A9/Lote Ne 1 era o anticorpo mantido constante no ensaio, era necessária uma maior concentração de Act-1 murino não conjugado do que de LDP-02/3A9/Lote Na 1 para competir LDP-02 para fora das membranas celulares de HuT-78 (CI5Q = 6,3 nM vs. 4,3 nM, respectivamente). Em cada experiência, LDP-02 tinha uma CI5Q mais baixa do que Act-1 murino. Estes resultados demonstram que LDP-02 era específico para o epitopo reconhecido pelo Act-1 murino, e que sua afinidade de ligação era melhor do que a do anticorpo murino. TABELA 10 Avaliação de Afinidade de ACT-1 Murino e ACT-1 Humanizado (LDP-02) ρ = 0,02 Ensaio-T de duas extremidades: Duas Amostras em Pares para Médias C. Reatividade Cruzada entre Espécies Utilizou-se citometria de fluxo para avaliar a reatividade cruzada entre espécies. Adicionaram-se aos tubos FACS 100 μΐ de EDTA-anti sangue coagulado removido quer de ser humano, cão, gato, cobaia, ou rato. Removeu-se o plasma e as pastilhas sanguíneas foram então resuspensas em 100 μΐ de LDP-02/3A9/Lote Ne 1 biotinilado, IgG humano biotinilado irrelevante (Jackson immunoResearch, Avondale, PA), Act-1 Lote Na 2 murino biotinilado, ou IgGl Murino biotinilado irrelevante (Dako Corp., Carpinteria, CA) a uma concentração de 15 μρ/πιΐ. A menos que indicado de outro modo, todos os reagentes foram diluídos em 0,15 M PBS/1,0% FCS/0,1% azeto de sódio. As amostras foram incubadas com anticorpos durante 20 minutos a 4QC, após o que os anticorpos foram removidos por lavagem. As células foram então incubadas com 100 μΐ de strepavidin ficoeritrina diluída a 1:200 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL), durante 20 minutos a 4SC. As hemácias foram então lisadas usando um reagente lisante comercial (Solução Lisante FACS, Becton Dickinson, San Jose, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Após lavagem em PBS, as células foram resuspensas em 0,5 ml de PBS/1% formalina e refrigeradas até serem analisadas. As amostras foram analisadas em um FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando um laser de 488 nm para excitar a ficoeritrina. A comporta de aquisição de linfócitos foi ajustada em parâmetros à vante e 90 graus de dispersão de luz. Em relação a cada amostra, analisaram-se 10.000 células. O LDP-02/3A9/Lote N2 1 biotinilado reconheceu uma subpopulação de linfócitos humanos com um padrão de manchas heterogêneo, similar ao produzido com Act-1 murino, e distinto do padrão produzido ao manchar com controles coincidentes com isotipo humano ou murino. Ademais, quando examinado em relação a linfócitos de cão ou gato, ambos o LDP-02/3A9/Lote Na 1 e o Act-1 murino produziram um padrão de manchas heterogêneo similar ao derivado com o uso de linfócitos humanos. 0 LDP-02/3A9/Lote Nfi 1 ou o Act-1 murino não reconheceram linfócitos de rato ou cobaia sob estas condições. D. Ligação de Clq Utilizou-se citometria de fluxo para avaliar o potencial de LDP-02 para ligar-se ao componente de complemento humano Clq, usando uma técnica descrita anteriormente (Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151:2296-2308 (1993)). Células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMCs) foram isoladas por separação de densidade Ficoll padrão. 375.000 células foram primeiramente bloqueadas com serum de coelho normal a 10%/PBS durante 10 minutos a 4QC. Após remoção por lavagem, as células foram incubadas com 100 μΐ quer de (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, Reino Unido), (b) IgG humano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), (c) LDP-1 (um derivado do anticorpo anti-CD18 descrito em WO 93/02191 (publicado em 04 de Fevereiro de 1993) e Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151(4):2296-2308 (1993), que contém duas substituições de aminoácidos na região constante de cadela pesada de IgGl (Leu^35 -4 Ala^35 e dy237 Ala^·^^), também denominado "FcRmut CD18", Therapeutic Antibody Center, Cambridge, Reino Unido), ou (d) LDP-02 (Ia HUM ACT-1 Lote Na 8/9) a 10 μg/ml durante 20 minutos a 4SC. CAMPATH-1H serviu como anticorpo de controle positivo, ao passo que LDP-01 e IgGl humano foram usados como anticorpos de controle negativo. Todos os reagentes foram diluídos em 2% BSA/PBS. Como controle negativo adicional, 2% BSA/PBS também foi adicionado sozinho. O anticorpo foi então removido por lavagem, e as células foram resuspensas em 50 μΐ de componente de complemento humano Clq (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a 10 μg/ml durante 30 minutos a 4QC. As células foram então lavadas e resuspensas em 100 μΐ de anticorpo Clq de coelho anti-humano conjugado com FITC (Dako Corp., Carpinteria, CA) a 20 μg/ml durante 20 minutos a 4aC. Após lavagem em 200 μΐ de PBS, as células foram resuspensas em 0,5 ml de PBS/formalina a 1% e refrigeradas até serem analisadas. As amostras foram analisadas em um FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA), usando um laser a 488 nm para excitar o FITC. Em relação a cada amostra, analisou-se um mínimo de 10.000 células e calculou-se a fluorescência de canal médio (MCF).

Os PBMCs incubaram-se com CAMPATH-1H em Clq humano ligado, resultando em um desvio significativo em MCF, ao passo que os padrões de mancha criados pela incubação de PBMCs com LDP-01, BSA, ou IgGl humano eram todos similares e caracterizados por mancha de fundo relativamente baixo. O padrão de manchas produzido por pré-incubação de PMBC com LDP-02 era idêntico ao produzido nestas amostras de controle negativo, demonstrando que o LDP-02 não se liga a Clq sob estas condições. E. Lise Mediada por Complemento A capacidade de LDP-02/3A9/Lote Na 1, de paiticipar de lise celular mediada por complemento foi examinada usando um protocolo descrito anteriormente em Bindon, C.I., et al. , (Transplantation, 40:538-544 (1985)). Sangue humano heparinizaddo foi extraído assepticamente, e o plasma foi coletado e imediatamente colocado em gelo. Células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMCs) foram isoladas por centrifugação durante 15 minutos sobre uma camada de Ficoll-Hypaque, densidade de 1,077 g/ml, e foram lavadas duas vezes em meio completo consistindo de RPMI 1640/FCS a 10%/100 U/ml penicilina/100 μg/ml estreptomicina/2,0 mM L-glutamina. Incubaram-se então 25 milhões de células a 37SC durante 1 hora em 150 μΟί -^cromato de sódio em solução salina estéril (E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc. , Wilmington, DE) . As células foram lavadas duas vezes em meio e resuspensas a 10^/ml. 50 μΐ da suspensão (5,0 x 10^ células) foram então adicionadas a poços de uma placa de microtitulação com fundo em "U" contendo 100 μΐ quer de (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Center, Cambridge, Reino Unido), (b) CAMPATH-1G (Therapeutic Center, Cambridge, Reino Unido), (c) IgGl humano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), (d) LDP-02/3A9/Lote N° 1, ou (3) LDP-01 (FcRmut CD18, Therapeutic Antibody Center, Cambridge, Reino Unido (vide acima)), a concentrações de 50, 25, 5, 2,5 e 0,5μg/ml em meio. Os anticorpos CAMPATH-1 foram usados como anticorpos de controle positivo no ensaio, ao passo que IgGl e LDP-01 foram usados como controles negativos. Poços adicionais continham células suspensas em 100 μΐ de Triton-X-100 a 0,1% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) em meio completo. As células incubadas com Triton-X-100 foram usadas para medir a liberação total, ao passo que os poços de controle sem anticorpos foram usados para medir a liberação espontânea. Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, 50 μΐ de plasma autólogo, como fonte de complemento, foram adicionados a cada poço, até uma concentração final de 20%. As células foram incubadas durante 45 minutos a 37aC, então centrifugadas a 100 g durante 2 minutos, e coletaram-se 100 μΐ dos sobrenadantes. 0 ~^Cr liberado foi medido em um contador gama Cobra II (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Todas as amostras foram realizadas em duplicata. A porcentagem de liberação específica de ^Cr foi calculada usando a fórmula: lespontânea-ensaio^xlOO% liberação específica = total-espontânea Como relatado anteriormente por Bindon et al. , (Transplantatíon, 40:538-544 (1995)), ambos CAMPATH-1H e CAMPATH-1G induziram até 35% de lise de PBMCs humanas mediada por complemento, de maneira dependente de dosagem. Ademais, como esperado, os controles IgGl humano e LDP-01 (Fc-mut CD18) não induziram qualquer lise celular detectável. LDP-02 não mediou a lise celular em qualquer uma das concentrações examinadas, até e incluindo 25 μg/ml (figura 17). F. Citotoxicidade mediada por Célula, Dependente de Anticorpo (ADCC).

Blastos CD3+ humanos foram usados como células alvo para avaliar a capacidade de LDP-02, de participar de citotoxicidade mediada por célula, dependente de anticorpo (ADCC). Os blastos CD3 + foram gerados em placas de 24 poços revestidas com o anticorpo RT66 anti-CD3, a uma concentração de 5 μg/ml/ diluídos em PBS. Células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMCS) foram isoladas por centrifugação durante 15 minutos sobre uma camada de Ficoll-Hypaque, densidade de 1,077 g/ml, lavadas e resuspensas em meio completo, como descrito na seção anterior. Adicionaram-se então 2 milhões de células a cada poço da placa de 24 poços e incubou-se a 37aC, 5% CC>2 durante 4 dias. As células foram então transferidas para um frasco de cultura e incubadas a 37eC, 5% CC>2 em meio com IL-2 recombinante humano (Genzyme Corp., Cambridge, MA) a uma concentração de 10 unidades/ml. Após três dias em cultura, 10,0 x 10^ blastos CD3 foram então incubados a 37aC durante 45 minutos em 150 μΟί -^cromato de sódio em solução salina estéril (E.I. du Pont de Nemours & Co. Inc., Wilmington, DE; Lote NB 95M682). Após duas lavagens em meio completo, as células foram resuspensas a 2 x 10^ células/ml, e 50 μΐ (10.000 células) da suspensão foram adicionados a poços de uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo em "U". Os poços continham 50 μΐ quer de CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, Reino Unido), quer de LDP-02/3A9/Lote Ne 1 a concentrações finais de 50, 5, 2,5, 0,5, 0,25 ou 0,05 μρ/ιηΐ em meio. As células foram incubadas com anticorpos durante 30 minutos à temperatura ambiente, após o que 0,5 x 10^ PBMC's recém isoladas (gradiente ficoll-hypaque, 2 lavagens em meio completo a 37SC) de um doador diferente foram adicionadas a cada poço como células efetoras (razão de efetorcalvo de 50:1). A poços adicionais, acrescentaram-se 100 μΐ de Triton-X-100 a 5% em meio (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) . As células incubadas com Triton-X-100 foram usadas para medir a liberação total, ao passo que os controles sem anticorpos e células efetoras foram incluídos para medir a liberação espontânea de radioatividade. As células foram centrifugadas a 100 g durante 2 minutos à temperatura ambiente e incubadas durante 20 horas a 37QC, 5% CO2, após o que as células foram transferidas para uma placa de 96 poços com fundo em "V" e pastilhadas à temperatura ambiente. Coletaram-se 100 μΐ de sobrenadantes, e mediu-se a radioatividade liberada em um contador gama Cobra II (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Todas as amostras foram realizadas em duplicata. A porcentagem de liberação específica de ^Cr foi calculada usando a fórmula: (ensaio-espontânea^ x 100% liberação específica = total-espontânea Como demonstrado anteriormente por Sims, M.J. et al., J. Immunol., 151(4):2296-2308 (1993), CAMPATH-1H participou de ADCC de maneira dependente da dosagem, produzindo até 30% de liberação específica de 51çr a concentrações > 5,0 μg/ml. Não foi detectada liberação específica em poços contendo LDP-02 em qualquer uma das concentrações examinadas. G. Inibição de Adesão a MAdCAM-1 A capacidade de LDP-02, de inibir a ligação de α4β7 a MAdCAM-1 foi avaliada usando α4β7+ células RPM1 8866 rotuladas fluorescentemente (uma célula B de linfoma humano) e uma quimera MAdCAM-1 compreendendo todo o domínio extracelular de MAdCAM-1 humano fundido à região Fc de um IgGl humano (uma região constante derivada da mesma construção usada para produzir a região constante de LDP-02 com mutação Fc).

1. Construção de Quimera MAdCAM-IgG

Um clone de MAdCAM-1 Humano designado pcDhuMAd4 (cDNA de clone 4 em pCDNA3. Shyjan, A.M. et al. , J. Immunol., 156:2851-2857 (1996); cujos ensinamentos são integralmente incorporados ao presente através de referência) foi usado como matriz para amplificação PCR de regiões extracelulares de MAdCAM-1 humano a serem fundidas com a região constante de IgGl humano, como descrito no Pedido Internacional Na PCT/US96/02153 (WO 96/24673), depositado em 12 de Fevereiro de 1996, que é uma continuação parcial do Ns de Série dos E.U.A. 08/523.004, depositado em 01 de Setembro de 1995, que é uma continuação parcial do Na de Série dos E.U.A. 08/386.857, depositado em 10 de Fevereiro de 1995. Para construir a quimera MAdCAM-IgG, sintetizou-se o imprimador HUMADIG4/2 (SEQ ID N2 61), que contém a extremidade 5' da seqtiência codificadora de MAdCAM-1 humano (Codon ATG, em negrito): HindIII 5'-GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-31 Este imprimador 5' foi usado em conjunto com um imprimador 3' designado HUMADIG3 para amplificar uma região codificando todo o domínio extracelular de MAdCAM-1. O imprimador HUMADIG3 (SEQ ID NQ 63) tem a seguinte seqüência: Spel 5'-GGACTAGTGGTTTGGACGAGCCTGTTG-3' Os imprimadores foram projetados com um local HindIII em 5' ou locais Spel em 3', como indicado. Estes imprimadores foram usados para amplificar por PCR um fragmento MAdCAM usando um kit otimizador de PCR da Invitrogen (San Diego, CA). Os produtos PCR foram digeridos com as enzimas HindIII e Spel para gerar extremidades para clonagem, e foram purificados por eletroforese em gel, usando o sistema de isolação de DNA Glassmax (Gibco, Bethesda, MD).

Um fragmento de ~1 kb abrangendo as regiões CHI, H (dobra), CH2 e CH3 foi excisado por digestão com Spel e EcoRI de uma construção codificando uma cadeia pesada γΐ de imunoglobulina humana tendo uma região constante humana com mutação Fc. A região constante humana nesta construção corresponde à obtida por amplificação de PCR da cadeia pesada CAMPATH-1H (Reichmann, L. et al., Nature, 322:323-327 (1988)), como descrito por Sims, M.J. et al. (J. Immunol., 151:2296-2308 (1993)) e Waldmann et al. (WO 83/02191, 04 de Fevereiro de 1993 (página 23)), cujos ensinamentos são integralmente incorporados ao presente através de referência. As mutações na região constante desta construção (Leu^^ ^ Ala^35 e Gly^7 —> Ala^'7) foram projetadas para reduzir a ligação a receptores Fcy humanos, e foram produzidas por mutagênese direcionada a oligonucleotídeo. Assim, a fusão MAdCAM-Ig produzida contém o fragmento de região constante Spel-EcoRI descrito por Sims et al. (J. Immunol151:2296-1308 (1993)) e Waldmann et al. (WO 93/02191), exceto quanto à introdução de mutações Leu^·^ —» Ala^S e Gly^3 7 Ala^7. 0 fragmento Spel-EcoRI de 1 kb codificando a região constante de IgGl com mutação Fc foi isolado por eletroforese em gel, usando o sistema de isolação de DNA Glassmax (Gibco, Bethesda, MD). Este fragmento de região constante e o fragmento HindIII-Spel contendo todo o domínio extracelular de MAdCAM foram ligados em uma ligação tríplice ao vetor pEEl2 (Stephens, P.L. e M.L. Cockett, Nucl. Acids Res., 17:7110 (1989) e Bebbington, C.R. e C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplifícation for the expression of cloned genes ín mammalian cells, (Academic Press, N.Y.), que havia sido digerido com HindIII e EcoRI. Obtiveram-se os transformantes da cepa bacteriana DH10B. Desenvolveram-se colônias e analisaram-se mini preparados de plasmida, através de mapeamento de restrição. Uma construção codificando uma proteína de fusão compreendendo todo o domínio extracelular de MAdCAM-1 (construção HuMAdIg21) fundida à região constante de IgGl com mutação Fc foi seqüenciada através de toda a porção MAdCAM-1, confirmando a fusão apropriada de segmentos e a ausência de mutações induzidas por PCR. A quimera foi produzida em células NSO e purificada por cromatografia de afinidade de proteína A padrão. 2. Ensaio de Adesão Uma placa de 96 poços de fundo plano e elevada adesão (Costar) foi revestida durante 1 hora a 37aC com 50 μΐ de quimera de MAdCAM-1 diluída até 2,5 μρ/ιηΐ em tampão de carbonato, pH 9,5. Os poços foram então lavados uma vez com tampão de lavagem (50 mM Tris HC1, 0,14 M NaCl, 1 mM MnCl2, pH 7,2) usando um auto-lavador de microplaca (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) e bloqueados durante 1,5 horas a 37aC com 100 μΐ de FBS a 10% diluído em PBS. Células RPMI 8866 (uma linha de linfoma de célula B humana, que expressa α4β7 (e não α4βΐ) (Erle, D.J., et al. , J. Immunol., 153:517 (1994); um presente de D. Erle)) foram primeiramente lavadas em 20 ml de PBS (4eC) e resuspensas até 4,0 x 10^ células/ml em PBS. BCECF (2',7'-bis-(2-carboxietil)-5- (e 6)-carboxi fluoresceína, éster acetoximetil; Molecular Probes, inc., Eugene, OR) foi reconstituído até 50 μg/ml em DMSO e adicionado à suspensão de células até uma diluição final de 1:500. Após incubar durante 30 minutos a 37SC, as células foram então lavadas em tampão de ensaio (HBSS com Serum Bovino Fetal a 2%, 25 mM HEPES, penicilina/estreptomicina, pH 7,2), e adicionaram-se 50.000 células a cada poço de uma placa de 96 poços e fundo em "V". As células foram então resuspensas em 100 μΐ quer de (a) Act-1 murino, (b) IgGl murino (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), (c) LDP-02/3A9/Lote Ns 1, ou (d) IgGl humano (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) a concentrações de 15,0 a 0,00075 \Lq/ml em tampão de ensaio durante 10 minutos à temperatura ambiente. A placa revestida com quimera MAdCAM foi lavada para remover o tampão bloqueador, e estas células RPMI 8866 rotuladas fluorescentemente foram então transferidas para cada poço. A placa foi colocada em um agitador de plataforma (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ) a 40 RPM durante 30 minutos à temperatura ambiente, enrolada em película de alumínio. As células não ligadas foram removidas por uma única etapa de lavagem e a fluorescência foi subseqüentemente medida (excitação a 485 nm, leitura a 535 nm) com um Analisador Concentrador de Fluorescência (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME), antes da, e após a lavagem. A porcentagem de células ligadas para cada poço foi calculada a partir de Unidades Fluorescentes Relativas (RFU) usando a fórmula: % de células ligadas = RFU antes da lavagem X 100 RFU após a lavagem Ambos LDP-02 e Act-1 murino inibiram a adesão de células RPMI 8866 a MAdCAM humano, de maneira dependente da dosagem (figuras 18A-18B). As concentrações que inibiram em 50% a adesão (CI50) eram relativamente similares em relação a Act-1 murino (0,0018 μg/ml) e LDP-02 (0,0014 μg/ml). Portanto, LDP-02 inibia funcionalmente a adesão mediada por α4β7 a MAdCAM-1, pelo menos tão eficazmente quanto o Act-1 murino.

Exemplo 5 Anticorpos Humanizados Adicionais Como descrito acima, várias variações do anticorpo remodelado projetado no Exemplo 2 podem ser feitas para melhorar a afinidade e/ou diminuir a antigenicidade do anticorpo remodelado. Tais construções incluem, porém não estão limitadas às que tenham uma ou mais das seguintes mutações: mutação M4V na cadeia leve, mutação R38K na cadeia pesada, mutação A40R na cadeia pesada, e retro-mutação I73T na cadeia pesada. Os mutantes podem ser produzidos individualmente (por exemplo, uma mutação em uma cadeia), ou em várias combinações.

Por exemplo, a figura 19 mostra os resultados de aplicação de mancha em HuT 78 usando o anticorpo remodelado (Projetado no Exemplo 2) ou um derivado tendo uma mutação adicional na cadeia leve (MV4) e duas mutações adicionais na cadeia pesada (R38K, A40R). Estes dois anticorpos apresentam padrões de mancha similares em células HuT 78 (figura 19). As mutações foram produzidas ao alterar a seqüência de ácido nucléico usando um Kit de Mutagênese Direcionado a Local Transformador (Clontech) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. As mutações de ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve foram feitas com fragmentos variáveis clonados em pCR-Script™. 0 trans oligo Sca I/Stu I (Clontech) foi usado como trans oligo. A seqüência dos oligos mutagênicos (SEQ ID Na 38-40) foram como segue: H/R38K (SEQ ID N2 38): 5'-C TGG CCA ACG H/I73T (SEQ ID Na 39): 5'-CAC ATT GAC TGT AGA CAC TTC CGC TAG CAC AGC C L/M4V (SEQ ID N2 40): 5'-CCG GAG GTG ATG TTG TGG TGA CTC Todas as outras manipulações, incluindo a subclonagem nos vetores de expressão pEE5hCMV-B e pEE12, e a construção de plasmidas de expressão contendo ambos os genes de cadeia pesada e leve, foram como descritas em relação ao anticorpo remodelado primário. As transfecções transientes e tingimento de células também foram como descrito em relação ao anticorpo remodelado primário.

EQUIVALENTES

Os especialistas na arte reconhecerão, ou poderão verificar usando não mais que experimentação rotineira, muitos equivalentes das incorporações específicas da invenção descritas especificamente no presente. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelo objeto das reivindicações que seguem.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, que se liga seletivamente a integrina α4β7, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizada pelo fato de a cadeia leve compreender a região variável da SEQ.ID.NO:21, e a cadeia pesada compreender a região variável da SEQ.ID.NO: 19.

2. Imunoglobulina humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma região constante humana do tipo gama.

3. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de compreender a região variável da cadeia leve, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 2.

4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender uma sequencia de nucleotídeo codificante das regiões variáveis da cadela leve, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Imunoglobulina humanizada de cadeia pesada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, caracterizada pelo fato de compreender as regiões variáveis de cadeia pesada, definidas em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

6. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeos que codifica a imunoglobulina humanizada de cadeia pesada ou o fragmento de qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de nucleotídeo que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

8. Método para preparar uma imunoglobulina humanizada de cadeia leve, fragmento de cadeia leve da imunoglobulina humanizada, cadeia pesada da imunoglobulina humanizada ou fragmento da cadeia pesada da imunoglobulina humanizada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: a manutenção de uma célula hospedeira, compreendendo o vetor de expressão que compreende a sequencia de nucleotídeos que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada ou leve 'codificantes das sequências SEQ ID NOs: 19 ou 21, sob condições apropriadas para expressão de uma imunoglobulina humanizada de cadeia leve ou de cadeia pesada, de modo que a cadeia leve da imunoglobulina humanizada, o fragmento da cadeia leve da imunoglobulina humanizada, a cadeia pesada da imunoglobulina humanizada ou o fragmento da cadeia pesada da imunoglobulina humanizada sejam expressos e produzidos e, opcionalmente, isolados.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma imunoglobulina humanizada ou fragmento ligante de antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, e um veiculo apropriado para uso como um medicamento.

10. Uso de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento ligante de antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizado pelo fato de ser utilizado na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença inflamatória ou uma doença associada com a infiltração de leucócitos nos tecidos, de modo que a doença seja inflamação da vesícula biliar, colangite, pericolangite, mastite, sinusite crônica, pancreatite ou diabete mielitus dependente de insulina.

11. Uso de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento ligante de antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizado pelo fato de ser utilizado para fabricação de um medicamento para tratamento de doença intestinal inflamatória.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a dita doença intestinal inflamatória ser selecionada do grupo consistindo de colite ulcerativa e doença de Crohn.

13. Uso de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligante de antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para tratar uma doença inflamatória associada com tecido de mucosa, de modo que a doença seja um enxerto versus uma doença hospedeira.