CN117777292A - 抗整合素α4β7纳米抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学领域,具体而言,本发明涉及特异性结合整合素α4β7的纳米抗体或其抗原结合片段,编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞,所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物,以及它们用于疾病治疗的用途。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域,具体而言,本发明涉及特异性结合整合素α4β7的纳米抗体或其抗原结合片段,编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞,所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物,以及它们用于疾病治疗的用途。
技术背景
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类与免疫相关病因尚不完全明确的慢性炎症性肠道疾病,主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。传统治疗IBD的药物为氨基水杨酸,类固醇和免疫抑制剂等。这些药物虽然能一定程度上改善症状,但不能阻止潜在的炎症过程,也不能改变疾病进程。随着人们对人体免疫系统和IBD发病机制研究的不断深入,众多新型生物制剂被开发出来。这些新型生物制剂针对不同的靶点达到不同程度的临床诱导及缓解。
整合素是一类重要的细胞表面受体,主要介导细胞与胞外基质的黏附。整合素α4β7主要表达于记忆性T淋巴细胞,其配体MAdCAM-1(mucosal addressin cell adhesionmolecule-1)主要表达于肠道黏膜相关淋巴组织及固有层的血管内皮细胞上,α4β7通过与MAdCAM-1的相互作用,介导淋巴细胞穿越内皮细胞间隙,渗入胃肠道炎症部位,对IBD的慢性炎症获得进展有重要影响。Hesterberg等人利用人类溃疡性结肠炎的绢毛猴模型,证明了整合素α4β7在结肠炎发病机制中的作用。通过分别给予抗整合素α4β7的单克隆抗体和无关的对照单克隆抗体,发现前者可以改善炎症活性,并迅速改善血便等症状。此外,通过对粘膜活检样本的形态计量分析,抗体治疗降低了α4β7+淋巴细胞和α4β7中性粒细胞和巨噬细胞的粘膜密度(P<0.05),证实了抗α4β7单克隆抗体是治疗胃肠道炎症的有效药物。维得利珠单抗,是一种人源化的IgG1型单克隆抗体,2014年,EMA和FDA批准其用于治疗中重度UC和CD,自此作为一线生物制剂或用于对TNF-α拮抗剂治疗应答不充分,失应答或不耐受的中重度UC和CD,并于2020年3月12日获得中国药品监督管理局批注上市。一系列临床试验结果表明,维得利珠单抗治疗组均高于安慰剂组。此外一些研究表明维得利珠单抗对抗TNF药物治疗失败的CD患者有效,但起效较慢。多项研究证实维得利珠单抗在中重度活动性UC或CD患者中,长期治疗耐受性良好,安全性可接受。
由此可见,选择性的抑制α4β7与MAdCAM-1作用是治疗炎症性肠病的良好选择。然而目前除了维得利珠单抗之外,在该领域的研究还很少。并且,由于单克隆抗体分子量较大,在肠道组织中的组织穿透性较差,临床研究表明维得利珠单抗起效较慢。因此,开发高亲和结合α4β7的分子量小且组织穿透性高的抗体药物是十分必要的。
发明内容
纳米抗体(即VHH),是一种由重链抗体的可变区基因克隆得到的重组单域抗体,是目前已知的能与抗原结合的最小片段。纳米抗体作为小型化抗体的杰出代表,大小仅为全长抗体的1/10,具有组织穿透能力优异、结构稳定、耐高温、耐pH、耐渗透压的特性。此外,VHH具有与人类VHs高度同源的氨基酸序列,使其免疫原性低且易于人源化。
本申请发明人采用重组整合素α4β7免疫羊驼,建立纳米抗体噬菌体文库,筛选得到能够高亲和结合整合素α4β7的纳米抗体。本发明的纳米抗体能够高效阻断整合素α4β7与MAdCAM-1的相互作用从而抑制炎症反应,由此完成了以下发明。
纳米抗体
在一个方面,本发明提供了特异性结合整合素α4β7的纳米抗体或其抗原结合片段。纳米抗体通常包括由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成的VHH,称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4,所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分,该部分足以赋予该片段特异性结合整合素α4β7的能力。本发明所述的纳米抗体也可以在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4,或缺少那些骨架区中的一个或两个,只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
在某些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段包含:
(1)如SEQ ID NO:13所示的CDR1、如SSX1GNY(SEQ ID NO:28)所示的CDR2、以及如NVVQTGX2WGLRTY(SEQ ID NO:29)所示的CDR3;其中,X1选自G或R;X2选自D或G;
(2)如SEQ ID NO:17所示的CDR1、如SEQ ID NO:18所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:19所示的CDR3;或,
(3)如SEQ ID NO:21所示的CDR1、如SEQ ID NO:22所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:23所示的CDR3。
在某些实施方案中,(1)中所述的纳米抗体或其抗原结合片段包含:
(i)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:15所示的CDR3;
(ii)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:16所示的CDR3;或
(iii)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、以及SEQ ID NO:15所示的CDR3。
在某些实施方案中,上述任一实施方案中所述CDR由Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NOs:1、3、7、11、5、9任一项所示的重链可变区(VHH)中含有的CDR1、CDR2以及CDR3。在某些实施方案中,所述CDR由Chothia、Kabat或IMGT编号系统定义。
在一些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。
在另一些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如,人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区),所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
在某些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NOs:1、3、7、11、5、9任一项所示的VHH序列,或与其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的序列,或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;在某些实施方案中,所述置换是保守置换。本领域技术人员理解,在VHH序列的N端包含或不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列均在本发明的保护范围内。
双特异性抗体或多特异性抗体
另一方面,本发明提供了一种双特异性或多特异性抗体,其包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。为产生所述双特异性或多特异性抗体,可以将本发明的纳米抗体或其抗原结合片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
在某些实施方案中,所述双特异性或多特异性抗体特异性结合整合素α4β7,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中,所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
抗体的制备
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备,例如通过噬菌体文库展示技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的DNA分子,将所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本发明的抗体。本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。
另一方面,本发明提供了一种分离的核酸分子,其编码本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性或多特异性抗体。在某些实施方案中,所述分离的核酸分子包含SEQ ID NOs:2、4、8、12、6、10任一项所示的序列或由遗传密码的简并性形成的与上述序列相关的DNA序列。
另一方面,本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体),其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。
另一方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。
另一方面,提供了制备本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体的方法,其包括,在允许蛋白表达的条件下,培养如上所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体。
缀合物
另一方面,本发明还提供了缀合物,其本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体以及偶联部分。
在某些实施方案中,本发明的纳米抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述偶联部分缀合。
在某些实施方案中,所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的,其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素,并且本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的蛋白标签(例如,纯化标签、检测标签或示踪标签)。在某些示例性实施方案中,本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的C端连接有纯化标签。
在某些实施方案中,所述偶联部分选自可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质,如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中,此类标记能够适用于免疫学检测(例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中,可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的纳米抗体或其抗原结合片段,以降低潜在的位阻。
在某些实施方案中,所述偶联部分选自治疗剂,例如抗炎药物或免疫抑制剂。
在某些实施方案中,所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。
药物组合物
另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其含有本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中,所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中,所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。
在某些实施方案中,在所述药物组合物中,本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此,本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些实施方案中,所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物。“预防有效量”是指,足以预防,阻止,或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化:待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
治疗应用
另一方面,本发明提供了在受试者中预防和/治疗与整合素α4β7有关的疾病的方法,其包括向有此需要的受试者施用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物。本发明还涉及所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或药物组合物用于制备药物的用途,所述药物用于在受试者中预防和/治疗与整合素α4β7有关的疾病。
在某些实施方案中,所述与整合素α4β7有关的疾病以整合素α4β7表达升高和/或过度的整合素α4β7活性为特征。
在某些实施方案中,所述与整合素α4β7有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中,所述与整合素α4β7有关的疾病为炎症性肠病(例如,克罗恩病、溃疡性结肠炎)。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在某些实施方案中,所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或药物组合物单独使用,或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型,例如,片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如,可通过下述方法来制备无菌注射溶液:在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段,以及任选地,同时掺入其他期望的成分(包括但不限于,pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,等渗剂、防腐剂、稀释剂,或其任何组合),随后过滤除菌。此外,可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如,通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中,例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用,包括但不限于,口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如,粉剂、药膏或滴剂),或鼻腔途径。但是,对于许多治疗用途而言,优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注,皮下注射,腹膜内注射,肌内注射)。技术人员应理解,给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中,本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物通过静脉注射或推注给予。
检测应用
另一方面,本发明提供了检测整合素α4β7在样品中的存在或其量的方法,其包括使用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物。
在某些实施方案中,所述方法是免疫学检测,例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中,用于所述方法的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。
在某些实施方案中,用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中,用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。因此,所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物接触;
(2)检测所述纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物与α4β7之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
所述复合物的形成表明存在α4β7或表达α4β7的细胞。
所述方法可以用于诊断目的,或者非诊断目的(例如,所述样品是细胞样品,而非来自患者的样品)。
在某些实施方案中,所述方法用于诊断受试者是否患有与α4β7有关的疾病。在此类实施方案中,所述方法还可以包括:将所述α4β7在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是α4β7在来自已知不具有与α4β7有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如,如果α4β7在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时,则指示所述受试者患有与α4β7有关的疾病。
在某些实施方案中,所述与α4β7有关的疾病以α4β7表达升高和/或过度的α4β7活性为特征。在某些实施方案中,所述与α4β7有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中,所述与α4β7有关的疾病为炎症性肠病(例如,克罗恩病、溃疡性结肠炎)。
在某些实施方案中,所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。
在某些实施方案中,所述α4β7是人α4β7。
另一方面,提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物在制备检测试剂中的用途,所述检测试剂用于检测整合素α4β7在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与整合素α4β7有关的疾病。
在某些实施方案中,用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。
在某些实施方案中,用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中,用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。在此类实施方案中,所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的其他试剂(如第二抗体)。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子生物学、生物化学、核酸化学、免疫学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时,这些术语将不被认为是限制性术语,而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾,否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
如本文中所使用的,术语“整合素α4β7”“α4β7”是指由α4亚单位(CD49d)和β7亚单位组成的整合素,主要表达于记忆性T淋巴细胞,其与配体粘膜地址素细胞粘附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)相互作用可使淋巴细胞进入胃肠道。α4β7的序列是本领域技术人员公知的,其中,α4亚基序列可参见例如NCBI Gene ID:3676、UniProt ID:P13612-1,β7亚基序列可参见例如NCBI Gene ID:3695、UniProt ID:P26010-1。
如本文中所使用的,术语“驼源抗体”是指,经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知,在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(Camelid heavy-chain antibody,HCAb),这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomain of heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区,并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性,VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的,术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段,通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地,纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成,具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4,或缺少那些骨架区中的一个或两个,只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb),两者可互换使用。
纳米抗体可通过本领域熟知的各种方法获得。示例性的方法可以包括以下流程:羊驼免疫,噬菌体文库构建,抗体筛选,表达纯化以及验证阶段。免疫抗体文库需要具有强免疫原性的抗原进行免疫,从库容量较小(106-108)的免疫抗体文库中就可以筛选到亲和力和特异性都较高的抗体。然后通过噬菌体表面表达的技术,将抗体分子的可变区基因通过基因工程手段与噬菌体的基因融合,使抗体分子与噬菌体的衣壳蛋白一融合蛋白的形式在噬菌体表面表达。获得文库后,即可开始进行筛选工作。将抗原靶蛋白固相化,固定在固相介质(如免疫管、培养皿等)上。随后加入文库,使文库和抗原充分作用。此时表达了正确特异性配体的噬菌体克隆会与固相化的抗原相结合,而其他不含特异性配体的噬菌体克隆则会被洗掉。筛选到的噬菌体克隆可以在E.coli中进行扩增,扩增后的噬菌体可以用于下一轮的筛选过程。经过三到五轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,就可以最终获得特异性较强的噬菌体克隆(其中第一轮筛选采用非特异性条件,后几轮筛选需提高特异性)。最后,使用酸性缓冲液或游离的抗原分子来洗脱含有相应配体的噬菌体克隆。随后使用分子生物学手段进行测序,即可得到蛋白基序,最终可以将所得的噬菌体进行扩增表达,纯化得到纳米抗体。
如本文中所使用的,术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽,其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。在一些实施方案中,所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4,或缺少那些骨架区中的一个或两个,只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段,并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“纳米抗体”时,其不仅包括完整纳米抗体,而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。在本发明中,如无特殊说明,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Chothia编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990;59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中,可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的,术语“噬菌体展示”技术是在各种生物学科中广泛应用的技术。噬菌体展示特别可用于肽(即,多肽)文库筛选方案,例如筛选肽配体和单克隆抗体。在这种技术中,DNA文库被克隆为与编码噬菌体衣壳蛋白基因的遗传融合。当融合蛋白被表达并整合到病毒衣壳时,多肽文库被“展示”在病毒的表面。这种配置在展示的肽和它的编码DNA之间建立了物理连接,允许在细菌宿主中扩增文库,并在几轮靶标定向选择后进行便捷的肽序列测定。噬菌体展示技术的应用包括亲和选择(例如,靶受体选择),表位作图及模拟,鉴定新受体和天然配体,发现药物,发现表位用于疫苗开发和诊断及研究DNA-结合蛋白质。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,稀释剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,防腐剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水,水性缓冲液(如缓冲盐水),醇和多元醇(如甘油)等。
如本文中所使用的,术语“预防”是指,为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如,与α4β7有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的,术语“治疗”是指,为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的,有益或所需的临床结果包括但不限于,减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即,不再恶化)疾病的状态,延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部),无论是可检测或是不可检测的。此外,“治疗”还可以指,与期望的存活期相比(如果未接受治疗),延长存活期。
如本文中使用的,术语“受试者”是指哺乳动物,例如灵长类哺乳动物,例如人。在某些实施方式中,所述受试者(例如人)患有与α4β7有关的疾病。
发明的有益效果
整合素在药物研发和临床治疗方面,是重要的药物靶点。在IBD发生发展进程中伴随着整合素α4β7表达含量的升高和对配体结合构想的异常活化,活化后的α4β7通过与其配体MAdCAM-1相互作用后向下游的信号传递会加重炎症的发展。目前国际上仅维得利珠单抗可以特异性结合α4β7获批,但是由于单克隆抗体分子量较大,在肠道组织中的组织穿透性较差。临床研究表明维得利珠单抗起效较慢。
本发明提供了对α4β7具备高亲和力的纳米抗体,其能够有效阻断MAdCAM-1对T细胞的黏附,并且作为纳米抗体,其免疫原性低、分子量小、组织穿透性强、结构稳定,是治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的潜在治疗方案,具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1:羊驼PBMC总RNA琼脂糖凝胶电泳结果。
图2:细菌文库随机菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果。
图3:TransB表达纯化SDS-PAGE电泳结果。
图4:SPR测定纳米抗体亲和力常数。
图5:qPCR检测纳米抗体的熔解曲线。
图6:纳米抗体阻断MAdCAM-1对T细胞黏附实验结果。
序列信息
表1:本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中:
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具体实施方式
现在于以下非限制性实施例中描述本发明。
本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:Anti-α4β7纳米抗体的免疫、建库以及筛选
免疫羊驼(深圳康体生命科技有限公司)的抗原选择Human integrin alpha4beta7heterodimer蛋白(ACRO,IT7-H52W4)。将抗原在羊驼颈部淋巴结附近左右两侧注射,每七天免疫一次,每次抽取免疫后的羊驼外周血5mL,分离血浆进行抗体效价测定。
1-1.RNA提取和反转录
(1)将用Trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5mL的离心管,加入1/5体积的氯仿混匀;
(2)室温静置5分钟后4℃12000g离心15分钟;
(3)将离心后的上清液转移到新的离心管,加入等体积的异丙醇;
(4)室温静置10分钟后,4℃,12000g离心10分钟;
(5)用1mL 75%乙醇清洗沉淀,7500g离心5分钟后,去除乙醇,干燥后,合并所有样品,得到总RNA;
(6)对提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,实验结果如图1所示,提取的总RNA完整性好;
(7)使用Takara反转录试剂盒(Takara(宝生物),PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time))对得到的总RNA进行反转录。将总RNA样品分为两份,一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物CALL 002,另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物CALL 001,将得到的总RNA反转录成cDNA,分别保存到2个离心管中。
1-2.PCR扩增
1-2-1.第一轮PCR扩增
以cDNA为模板进行第一轮PCR反应,使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶(vazyme(诺唯赞))进行PCR扩增,按照下表2、表3配置并进行PCR反应体系:
表2:第一轮PCR试剂及用量
表3:第一轮PCR程序
(1)反应结束后,取20μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量,将所有cDNA按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应;
(2)将所有PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带;
(3)将所有一轮PCR纯化回收产物收集至一个离心管,即为第一轮PCR扩增产物,-20℃保存。
1-2-2.第二轮PCR扩增
将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应,按照下表4、表5配置并进行PCR反应体系:
表4:第二轮PCR试剂及用量
表5:第二轮PCR程序
(1)反应结束后,取20μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为400bp左右的模板量为最佳模板量,将已获得的第一轮PCR扩增产物的约1/5体积共288个反应按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应后使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化;
(2)将回收产物收集至一个离心管中,即为第二轮PCR扩增产物。
1-3.酶切和连接
1-3-1.载体与PCR产物酶切
(1)使用pComb3XSS(Addgene,#63890)作为噬菌体质粒载体,用限制性内切酶SpeI、Sac I分别酶切12μg pComb3XSS载体和4μg第二轮PCR扩增产物,37℃孵育4h;
(2)使用DNA回收纯化试剂盒对pComb3XSS载体和第二轮PCR扩增产物进行纯化,4℃保存。
1-3-2.连接
载体和片段进行连接,按照下表6配制连接反应体系:
表6:连接反应试剂及用量
(1)将连接反应4℃过夜(约16h)孵育;
(2)使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液,检测回收产物的浓度,4℃保存。
1-4.细菌文库和噬菌体文库构建
1-4-1.验证连接产物转化率
(1)取一支50μL的TG1感受态细胞(北京全式金生物,Trans1-T1)在冰上放置5-10min融化;
(2)加入100ng连接产物,转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中,1800V点击转化;
(3)等待电转完成后立即加入1mL 37℃预热的SOC培养液,混匀后37℃,220rpm摇菌复苏1h;
(4)从复苏后的菌液中取100μL进行10倍梯度稀释并涂板,根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目,即为连接产物的转化效率;
(5)同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落PCR,PCR产物有在400bp左右的单一条带认为是阳性克隆,由此估算单克隆阳性率。
1-4-2.细菌文库构建
(1)取24个100ng连接体系按上述方法使用24管感受态进行电转反应;
(2)37℃复苏1h后从中取100μL进行10梯度稀释后涂板,37℃过夜培养;
(3)收集剩下所有菌液并均匀涂布到5个245mm方形培养板(2×YT含有100μg/mLAmp,2%葡萄糖,2%琼脂糖)中,37℃正置培养过夜;
(4)根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目,即为细菌文库的库容量;
(5)同时从梯度稀释板中随机挑选48个单克隆进行菌落PCR,验证细菌文库的克隆阳性率,检测结果如图2所示,克隆阳性率在95%以上;
(6)将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2×YT液体培养基刮下,置于50mL离心管,测量其OD600值,添加终浓度20%甘油,-80℃保存。
1-4-3.噬菌体文库制备
(1)根据细菌文库的OD600计算在100mL 2×YT液体培养基需要加入的细菌文库体积,根据计算结果接种细菌文库到100mL 2×YT液体培养基(含有100μg/mL Amp)中,37℃,220rpm培养直至OD600为0.5-0.55;
(2)根据辅助噬菌体效价,按照1:20(细菌个数:噬菌体数)的比例加入辅助噬菌体,37℃,220rpm孵育30-60min;
(3)加入终浓度为50μg/mL Kana,30℃,220rpm过夜培养;
(4)将过夜培养的菌液4℃,8000rpm离心10min,将上清液转移到新的50mL离心管中;
(5)加入1/4的预冷PEG/NaCl储存液,混合均匀,冰上静置孵育30min;
(6)4℃,8000rpm离心10min后,弃上清,倒置控干;
(7)加入5mL PBS重悬至新的离心管,4℃,8000rpm离心10min;
(8)离心后转移上清至新的离心管中,再次加入1/4体积的预冷PEG/NaCl储存液,混合均匀,冰上孵育10min;
(9)4℃,8000rpm,10min离心,弃上清,用1mL PBS重悬后,8000rpm离心10min,转移上清至新的离心管,-80℃保存,即为纯化后的噬菌体文库。
1-5.免疫筛选
1-5-1.第一轮筛选
(1)从-80℃冰箱中取出筛选抗原,冰上放置解冻;
(2)将筛选抗原包被免疫管(50μg/管,包被液为PBS,2mL/管),同时平行包被milk对照,4℃缓慢旋转包被过夜;
(3)将过夜包被的免疫管中的液体弃掉,加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次,每次旋转5min;
(4)加入2mL封闭液(3%脱脂奶粉)溶液,室温旋转封闭2h;
(5)先将封闭后的免疫管中液体丢弃,并加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管3次,每次旋转5min;
(6)弃掉免疫管中的清洗液,加入2mL PBS,按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库作为第一轮筛选输入噬菌体文库,室温旋转孵育1h:
其中,V为加入的噬菌体体积(单位μL),Tlibrary为噬菌体效价;
(7)弃掉免疫管中的液体,加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管20次,每次旋转5min;
(8)将免疫管内液体弃掉,尽量去除残余液体,加入1mL 0.25mg/mL Trypsin溶液,室温旋转洗脱30min;
(9)加入10μL 10% AEBSF终止洗脱,将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中,即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
1-5-2.第一轮噬菌体洗脱液效价检测
(1)将-80℃冰箱保存的TG1菌株(北京全式金生物,Trans1-T1)在2×YT固体培养基进行单菌落划线,37℃过夜培养(4℃保存一周),从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL的2×YT培养基,37℃过夜培养;
(2)取过夜培养菌液500μL转接到含5mL 2×YT液体培养基中,37℃,220rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55;
(3)取第一轮噬菌体洗脱液10μL,在1.5mL离心管中10倍梯度稀释,共稀释10个梯度至10-10,振荡混匀;
(4)在每个稀释离心管中加入90μL的TG1菌液,混匀后37℃孵育30min;
(5)从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中,37℃倒置过夜培养;
(6)统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量,并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量,即噬菌体文库效价:
T(pfu/mL)=N×D×400
其中,T为噬菌体效价(单位pfu/mL),D为稀释倍数,N为相应稀释倍数上单菌落个数。
1-5-3.第一轮噬菌体洗脱液的扩增
(1)预先将-80℃冰箱保存的TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线,37℃过夜培养(4℃保存一周),从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL2×YT培养基,37℃过夜培养;
(2)取过夜培养菌液500μL转接到含5mL 2×YT液体培养基中,37℃,220rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55;
(3)加入500μL第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至OD600为0.5-0.55的菌液中;
(4)37℃,220rpm继续培养30min;
(5)将全部菌液均匀涂布到含有100μg/mL Amp和2%葡萄糖的2%琼脂糖的245mm方形培养基平板中,37℃过夜培养;
(6)取过夜培养的方形板,在培养板表面加入6mL 2×YT液体培养基,用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15mL离心管中,即为扩增后的细菌子文库,同时使用分光光度计测量菌液OD600值,加入终浓度为20%的甘油,即为第一轮细菌文库。
(7)将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量,转接至100mL 2×YT液体培养基中(含100μg/mL Amp),以使初始OD600为0.1:
其中,V为转接菌液的体积(单位μL),OD600为构建的洗脱液细菌文库的OD600;
(8)37℃,220rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55;
(9)按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数:噬菌体数=1:20:
其中,V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL),T_(helper-phage)为使用的辅助噬菌体效价;
(10)37℃,220rpm继续培养30min;
(11)分别加入终浓度为50μg/mL Kana,30℃,220rpm过夜培养。
1-5-4.第一轮噬菌体纯化
(1)将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中,4000rpm,4℃离心10min;
(2)将离心后的上清液转移至新的50mL离心管中,加入1/4体积的4℃预冷的20%PEG/2.5M NaCl,充分混匀后冰上放置30min;
(3)4000rpm,4℃离心20min,弃上清,并在纸上倒置2min;
(4)加入1mL PBS重悬沉淀,将重悬液移至新的1.5mL离心管,13000rpm,4℃离心20min;
(5)将离心后的上清转移至新的1.5mL离心管,加入1/4体积预冷的20%PEG/2.5MNaCl溶液,混匀后冰上放置10min;
(6)13000rpm,4℃离心10min,弃上清,加入1mL PBS重悬沉淀;
(7)13000rpm,4℃离心2min,将上清转移到新的1.5mL离心管中,即为第一轮筛选噬菌体子文库;
(8)第一轮筛选噬菌体子文库效价检测。
1-5-5.多轮筛选
筛选方法同第一轮,输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库,作为第二轮筛选输入噬菌体文库,得到第二轮筛选噬菌体洗脱液。依次进行第二轮噬菌体洗脱液效价检测、扩增、纯化,检测筛选噬菌体子文库效价后进行第三轮筛选。
1-5-6.单克隆ELISA检测
(1)预先将-80℃冰箱保存的TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线,37℃过夜培养(4℃保存一周),从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL2×YT培养基,37℃过夜培养;
(2)取过夜培养菌液500μL转接到含5mL的2×YT液体培养基中,37℃,220rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55;
(3)取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μL,在1.5mL离心管中10倍梯度稀释,共稀释12个梯度,振荡混匀;
(4)每个稀释离心管中加入90μL OD600值为0.5-0.55的菌液,混合均匀;
(5)37℃,220rpm继续培养30min;
(6)将菌液均匀涂布到含有100μg/mL Amp的固体培养基平板,37℃过夜培养;
(7)从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(P1-P2)中,每孔加入100μl 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp),37℃过夜静置培养;
(8)取过夜培养的菌液2μL转接至每孔220μl 2×YT液体培养基(含有100μg/mLAmp)的新96孔细胞培养板中,37℃静置培养3h;
(9)按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数:噬菌体数=1:20:
其中,V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL),T_(helper-phage)为使用的辅助噬菌体效价;
(10)37℃孵育30min,加入终浓度为50μg/mL的Kana,30℃静置过夜培养;
(11)将过夜培养后的96孔培养板4℃,4000rpm离心10min,4℃保存备用;
(12)将筛选抗原包被酶标板(1ng/μL,包被液为pH9.4的CBS,100μL/孔),同时平行包被BSA作对照,4℃包被过夜;
(13)将过夜包被的酶标板内液体弃掉,每孔加入200μL PBS缓冲液,室温清洗酶标板3次,每次10min;
(14)每孔加入200μL封闭液(3% BSA)封闭酶标板,室温封闭1h;
(15)弃封闭液,每孔加入200μL PBST(1×PBS加0.1% Tween20,下同)缓冲液,室温清洗酶标板3次,每次10min;
(16)每孔加入120μL 3% BSA后再加入80μL步骤(2)、(13)、(11)中离心后的上清液,室温孵育2h;
(17)弃掉酶标板内液体,每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次,每次10min;
(18)每孔加入M13Bacteriophage Antibody(HRP),Mouse Mab,1:8000稀释于封闭液中,100μL/孔,室温孵育1h;
(19)弃掉ELISA板内液体,每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次,每次10min;
(20)每孔加入100μL TMB单组份显色液,避光显色2-3min,每孔加入100μL 1M Hcl终止,用酶标仪读取OD450值,记录并保存。检测结果如下表7所示。
表7:单克隆第一次ELISA检测结果
1-5-7.阳性克隆ELISA二次验证
为了排除假阳性结果,将初步认定为阳性的克隆进行ELISA二次验证。检测结果如下表8所示。
表8:单克隆第二次ELISA检测结果
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1-5-8.阳性克隆测序
根据ELISA检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆(P1-1F、P1-9D、P1-11D、P1-11F、P2-10F、P2-12B)。
从单克隆ELISA检测板中取阳性克隆菌液5μl接种至1mL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp),37℃,220rpm培养直至OD600至0.8-1.0(约6-8h),取0.5mL菌液测序,其余菌液4℃保存。
1-5-9.序列分析
经测序的序列使用GENtle软件进行序列比对分析,并使用GENtle软件将抗体序列翻译成氨基酸,纳米抗体P1-1F、P1-9D、P1-11D、P1-11F、P2-10F、P2-12B的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:1、3、5、7、9、11所示。
实施例2:纳米抗体序列的发酵纯化
(1)将测序后的序列进行用AbRSA进行抗体CDR区分隔,然后用MEGA11进行序列比对;
(2)将序列由北京安升达公司合成,插入到pET-32a质粒(索莱宝,P3100)上的Xbal、Xhol位点之间,构建重组质粒;
(3)将重组质粒转化入TransB细胞(购于北京全式金公司)中表达和纯化,对纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳,结果如图3所示,所有候选单克隆抗体蛋白纯化结果良好;
(4)挑取单克隆进行测序,并保存测序正确的菌株甘油菌;
(5)接种菌液与5mL LB培养基中,37℃过夜培养;以1:100转接至含1:1000Amp的5mL LB试管中,37℃过夜培养;以1:100比例转接至2瓶500mL的LB培养基中(含Amp抗性),37℃、220rpm培养至OD600=0.6~0.8;加入终浓度为1mM的IPTG,16℃、160rpm诱导16h;
(6)4℃、8,000rpm离心30min收集菌体,并用PBS溶液洗涤沉淀2~3次;
(7)对离心收集的菌体加入1:20的PBS溶液进行重悬,并进行超声破碎;破碎条件为:破2s停3s,共破碎35min;
(8)4℃、10,000rpm离心30min收集破碎溶液上清,用注射器吸取上清液,并过0.45μm PES滤膜备用;
使用AKTA pure蛋白纯化仪对单点突变纳米抗体进行纯化,具体步骤如下:
(1)开机,选择机器自带的System Wash程序,用去离子水冲洗机器内的乙醇;
(2)程序结束后,将5mL镍柱安装到机器上,用30mL的去离子水冲洗柱内的乙醇至基线平衡;流速设为5mL/min,压强上限设为0.5MPa;
(3)换上平衡缓冲液冲洗平衡柱子;流速设为3mL/min;
(4)待基线平衡后开始上样,流速为0.8~1.0mL/min;上样完成后先用10mL平衡缓冲液缓慢冲洗(流速同上样),再用3mL/min流速冲洗至基线平衡;
(5)换洗脱缓冲液进行洗脱,接取洗脱峰蛋白,流速设为3mL/min;待所有蛋白被完全洗脱后,用去离子水冲洗镍柱至离子浓度基线为零,流速设为5mL/min;
(6)用50mL 20%的乙醇溶液继续冲洗,使镍柱完全浸泡在乙醇中,之后关机。对洗脱峰蛋白进行SDS-PAGE电泳。
进行尺寸排阻实验对蛋白进行进一步纯化,步骤如下:
(1)使用超滤管对上一步纯化获得的组分进行浓缩,4℃、4000rpm浓缩至750μL,将浓缩后的溶液过0.22μm PES滤膜;
(2)使用system wash method对AKTA pure蛋白纯化仪内部管道进行清洗;
(3)清洗完成后,将SuperdexTM 75increase 10/300GL预装柱装至仪器上,并在仪器上安装500μL的进样环,设置流速为0.4mL/min,压力上限为2.8MPa;
(4)使用Load模式,用1-2个柱体积的去离子水清洗柱子置基线走平,后换成PBS溶液,1-2个柱体积平衡柱子,同时使用注射器吸取5mL PBS溶液通过inject孔对进样环进行清洗;
(5)用1mL注射器吸取样品,通过inject孔将样品注射进进样环中,将Load模式改为Inject模式;
(6)当检测器出现紫外吸收峰时,开始收集,直至所有的峰都收集完,将Inject模式换回Load模式,继续冲洗柱子和管路,再使用去离子水冲洗,置基线走平;
(7)使用20%乙醇冲洗系统,30mL后卸下柱子4℃保存,关闭仪器;
(8)进行SDS-PAGE凝胶电泳实验分析纯化收集的组分。
实施例3:表面等离子体共振验证纳米抗体的抗原结合活性
SPR实验常用于准确测定抗原抗体反应的亲和力常数KD。本实验所用仪器为Cytiva公司生产的BIAcore T200,芯片型号为CM-5。实验分为两步:
氨基偶联法捕获抗原:
(1)在仪器上安装CM5芯片,使用仪器自带的pH4.0、4.5、5.0的醋酸钠溶液稀释抗原至50μg/mL,使用manual run程序,流速为10μL/min,进样时间为120s,对抗原进行预富集,选择最合适的醋酸钠溶液;
(2)使用pH4.0的醋酸钠溶液将α4β7稀释至50μg/mL,使用Wizard程序,targetlevel设置成2500RU,按照程序放置好抗原稀释液、50mM NaOH再生液、碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺溶液、乙醇胺溶液,运行程序;
(3)RU值到target level时,抗原成功偶联至CM5芯片上。
Kinect and affinity程序测定抗体KD值:
(1)使用PBS溶液将抗体梯度稀释成1000-15.625nM,设置程序进行上样。芯片再生液为10mM甘氨酸溶液(pH 2.5);
(2)实验结束后下机,将所得数据导入仪器配套软件进行分析,数据拟合后计算亲和力常数KD值。
实验结果如图4所示,纳米抗体P1-1F、P1-9D、P1-11D、P1-11F、P2-10F、P2-12B与抗原的结合力均良好。
实施例4:荧光实时定量PCR验证纳米抗体的热稳定性
通过设定温度梯度,检测蛋白质羟基的暴露程度,分析蛋白质空间结构随温度改变而产生的变化,从而评估蛋白质的热稳定性。对纳米抗体的热稳定性评价通过实时荧光定量PCR完成,所用仪器为Roche公司生产的Roche LightCycler 480II。每个样品设置5个重复。PCR完成后将数据导入仪器配套的软件分析计算纳米抗体的Tm值。实验结果如图5所示,纳米抗体的热稳定性良好。
实施例5:T细胞黏附实验
本领域已知α4β7通过与MAdCAM-1的相互作用,介导淋巴细胞穿越内皮细胞间隙,渗入胃肠道炎症部位,对IBD的慢性炎症获得进展有重要影响。基于此,本实施例考察了纳米抗体对MAdCAM-1对T细胞黏附的阻断能力。T细胞黏附实验流程如下:
(1)向96孔板的每个孔中添加100μL含20μg/mL重组人MAdCAM-1(购自R&D,6056-MC-050),4℃下包被过夜;
(2)第二天弃去包被液,甩净孔内液体,每孔加入200μL洗含0.1%BSA的PBS洗涤缓冲液,震荡清洗4min,重复2次;
(3)每孔加200μL含0.1% BSA的PBS封闭缓冲液,在37℃封闭1小时;
(4)向浓度2x106个/mL的HuT78细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司,CL-0364)悬液中,加入终浓度为2mM的MnCl2,并将100,000个细胞分装到96孔板的各孔中。将抗α4β7纳米抗体和不相关纳米抗体Nb02稀释,设置浓度梯度为50,20,10,1.25,0.15625,0.01953,0.00244,0.0003μg/mL,加入到细胞中,并将混合物在37℃、5% CO2下孵育30分钟;
(5)取出MAdCAM-1包被的板,弃孔内液体,清洗4次,每次5min;
(6)每孔加100μL预孵育的HuT78细胞和纳米抗体混合物,37℃、5%CO2下孵育1小时;
(7)弃孔内液体,清洗4次,每次10min;
(8)取等量CellTiter-Glo试剂加入细胞培养基,每孔加100μL混合物,使用定轨振荡器混合2分钟,将板置于室温条件下孵育10分钟;
(9)用酶标仪读取发光信号。使用GraphPad Prism 8中的曲线拟合对发光信号进行绘图。
实验结果如图6所示,纳米抗体P1-1F、P1-9D、P1-11D、P1-11F、P2-10F、P2-12B均能有效阻断MAdCAM-1对T细胞的黏附,从而具备抑制炎症反应并由此治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的潜力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (13)
1.特异性结合整合素α4β7的纳米抗体或其抗原结合片段,其包含:
(1)如SEQ ID NO:13所示的CDR1、如SSX1GNY(SEQ ID NO:28)所示的CDR2、以及如NVVQTGX2WGLRTY(SEQ ID NO:29)所示的CDR3;其中,X1选自G或R;X2选自D或G;
(2)如SEQ ID NO:17所示的CDR1、如SEQ ID NO:18所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:19所示的CDR3;
(3)如SEQ ID NO:21所示的CDR1、如SEQ ID NO:22所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:23所示的CDR3;或,
(4)SEQ ID NOs:1、3、7、11、5、9任一项所示的重链可变区(VHH)中含有的CDR1、CDR2以及CDR3;优选地,所述CDR由Chothia、Kabat或IMGT编号系统定义。
2.权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段,其中,(1)中所述的纳米抗体或其抗原结合片段包含:
(i)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:15所示的CDR3;
(ii)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:16所示的CDR3;或
(iii)SEQ ID NO:13所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、以及SEQ ID NO:15所示的CDR3。
3.权利要求1-2任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段,其中,所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NOs:1、3、7、11、5、9任一项所示的序列,或与其相比具有至少80%序列同一性的序列,或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加的序列;优选地,所述置换是保守置换。
4.双特异性或多特异性抗体,其包含权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述双特异性或多特异性抗体特异性结合整合素α4β7,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标;
优选地,所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
5.分离的核酸分子,其编码权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体。
6.载体,其包含权利要求5所述的核酸分子;优选地,所述载体为克隆载体或表达载体。
7.宿主细胞,其包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。
8.制备权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体的方法,其包括,在允许蛋白表达的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性抗体。
9.缀合物,其包含权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体以及偶联部分;
优选地,所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag),例如纯化标签;可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素;治疗剂,例如抗炎药物或免疫抑制剂;或,另外的生物活性多肽。
10.药物组合物,其包含权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求9所述的缀合物;以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;
优选地,所述药物组合物还包含另外的药学活性剂,例如抗炎药物或免疫抑制剂。
11.权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求9所述的缀合物、或权利要求10所述的药物组合物用于制备药物的用途,所述药物用于在受试者中预防和/治疗与整合素α4β7有关的疾病;
优选地,所述与整合素α4β7有关的疾病以整合素α4β7表达升高和/或过度的整合素α4β7活性为特征;
优选地,所述与整合素α4β7有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病;优选地,所述炎性疾病或自身免疫性疾病选自炎症性肠病(例如,克罗恩病、溃疡性结肠炎);
优选地,所述受试者为哺乳动物,例如人;
优选地,所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物单独使用,或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。
12.用于检测整合素α4β7在样品中的存在或其水平的方法,其包括使用权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述的缀合物;
优选地,所述方法是免疫学检测,例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
13.权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述的缀合物在制备用于检测整合素α4β7在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与整合素α4β7有关的疾病的检测试剂中的用途。
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