CN115772225B - 靶向TNF-α和IL-23的双特异性纳米抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及经亲和力成熟的抗TNF‑α和抗IL‑23的双特异性纳米抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。

Description

靶向TNF-α和IL-23的双特异性纳米抗体及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及经亲和力成熟的抗TNF-α和抗IL-23的双特异性纳米抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。

背景技术

炎症性肠病(IBD)是一种原因未明的慢性复发性炎症，患者常常会有腹痛、腹泻、便血、肛瘘、营养不良等肠功能受损的临床表现，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。近年来，该病在我国的发病率呈明显的上升趋势，发病年龄也日趋年轻化。长期患病的状态使得患者本人的健康、经济状况和生命质量以及家庭受到严重的影响。

炎症性肠病发病的诱因尚不明确，由环境、遗传、肠道屏障功能障碍或免疫应答失调等多因素相互作用所导致。先天性和适应性免疫反应失调是炎症性肠病的一大诱因。在致病微生物的刺激下,肠黏膜被破坏，其通透性增强，进而上调炎性细胞因子的表达，调节性T细胞和辅助性T细胞失衡推动肠道免疫系统紊乱，肠道内环境动态平衡失调。

目前临床用于治疗IBD所使用的靶向生物制剂旨在通过阻断和抑制炎性细胞因子相关的下游通路，进而抑制疾病的发生和发展。IL-23和TNF-α都是IBD疾病发展过程中的关键促炎性细胞因子。其中，肿瘤坏死因子(TNF)是一种与免疫细胞增殖、活化、分化和凋亡相关的多效细胞因子，在免疫调节和宿主防御方面发挥积极作用。在炎症性肠病的发生和发展过程中具有促炎作用。TNF-α与其受体结合激活IKK/NF-κB和MAPK/AP-1信号通路，上调炎症细胞因子和趋化因子表达，进而诱导其他炎性细胞因子推动炎症性肠病的发生和进展。

抗TNF-α单抗类药物的使用改变了IBD治疗的格局。其中英夫利昔单抗(IFX)作为一种人-鼠嵌合的抗TNF-α抗体是最早用于治疗IBD的生物制剂，和全人源单克隆抗体阿达木单抗(Adalimumab)是IBD生物治疗的主要药物，在中重度CD和UC中可诱导和维持病情缓解。然而超过三分之一的患者存在原发性无应答，并且每年使用英夫利昔单抗治疗的患者丧失应答的风险约为13％，阿达木单抗治疗为20％。最终，大约40％的最初应答者会失去对英夫利昔单抗治疗的应答。尽管可以通过英夫利昔单抗与硫唑嘌呤、巯基嘌呤及甲氨蝶呤的联合用药、增加剂量或缩短治疗间隔等方式来对抗原发性和继发性无应答，但抗TNF-α单抗短期和长期治疗疗效仍存在缺陷。

白介素23(IL-23)由p19亚基和p40亚基共价键合而成，在细菌和真菌的刺激下由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)等免疫细胞产生，并诱导初始T细胞向Th1和Th17分化。IL-23能够通过与细胞膜表面的受体IL-23R结合，激活Th17产生特异性转录因子ROR-γt，从而进一步地刺激Th17细胞扩增，最终导致促炎细胞因子风暴。

抗IL-12/23p40亚基的单抗类药物乌司奴单抗(Ustekinumab)对肠道炎性反应和肠外炎性反应都有很好的抑制作用，其治疗伴有肠外及全身表现的中重度CD的疗效优于抗TNF-α治疗。

2017年Desmyter等人筛选得到针对hIL-23的p19亚基的纳米抗体37D5(Aline D,Silvia S,Carlo B,et al..Front Immunol,2017,8:884.)，同年比利时学者也筛选的到针对TNF-α的纳米抗体VHH2(Beirnaert E,et al.Front Immunol.2017Jul 31；8:867.doi:10.3389/fimmu.2017.00867.)；然而，所述两种抗体未经后续的体内或体外亲和力成熟过程，其成药性亟待提高。

发明内容

抗体通常需要经历一个或多个亲和力成熟周期来提高亲和力，这使得传统的亲和力成熟办法显得捉襟见肘。本申请的发明人利用计算机辅助的体外亲和力成熟技术，在纳米抗体VHH2的基础上进一步获得了对TNF-α亲和力提高的纳米抗体突变体，在纳米抗体37D5的基础上进一步获得了对IL-23亲和力提高的纳米抗体突变体。

进一步，本申请的发明人基于所述突变体获得了可同时靶向TNF-α和IL-23的双特异性抗体，其能够有效中和TNF-α和IL-23的生物活性，从而能够有效避免抗TNF-α单抗治疗方案中存在的免疫逃逸，具有治疗抗TNF-α难治性患者的潜力，为IBD的治疗提供新的思路。

双特异性抗体

在一个方面，本发明提供了一种特异性结合TNF-α和IL-23(例如IL-23的p19亚基)的双特异性抗体，其包含对TNF-α特异性的第一抗原结合结构域和对IL-23(例如IL-23的p19亚基)特异性的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域是VHH；

其中，

a).所述第一抗原结合结构域包括包含如SEQ ID NO:3或其变体所示的CDR1、如SEQ ID NO:4或其变体所示的CDR2、如SEQ ID NO:5或其变体所示的CDR3的重链可变区(VHH)；和/或，

b).所述第二抗原结合结构域包括包含如SEQ ID NO:8或其变体所示的CDR1、如SEQ ID NO:9或其变体所示的CDR2、如SEQ ID NO:10或其变体所示的CDR3的重链可变区(VHH)；

其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)。

在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。

本文中所述的第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通常包括由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成的VHH，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些实施方案中，本发明所述的第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

在某些实施方案中，所述VHH中所包含的CDR1、CDR2和CDR3通过Kabat编号系统确定。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自独立地包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域包含源自驼源重链抗体的框架区。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:11所示的FR1、SEQID NO:12所示的FR2、SEQ ID NO:13所示的FR3、以及SEQ ID NO:14所示的FR4。

在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:15所示的FR1、SEQID NO:16所示的FR2、SEQ ID NO:17所示的FR3、以及SEQ ID NO:18所示的FR4。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:11所示的FR1、SEQID NO:12所示的FR2、SEQ ID NO:13所示的FR3、以及SEQ ID NO:14所示的FR4；所述第二抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:15所示的FR1、SEQ ID NO:16所示的FR2、SEQ ID NO:17所示的FR3、以及SEQ ID NO:18所示的FR4。

在某些实施方案中，所述所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2或其变体所示的序列；和/或，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7或其变体所示的序列；

其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2所示的序列；和/或，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示的序列。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域任选地通过接头连接。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的N端或C端。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的C端。

在某些实施方案中，所述接头为肽接头(例如，刚性肽接头或柔性肽接头)。在某些实施方案中，所述肽接头由9至25个(例如，10-25个、10-20个、10至17个、10至15个)氨基酸残基组成。

在某些实施方案中，所述肽接头选自：(GGGGS)₃、GGGSGGGGS、(GGGGS)₅、(EAAAK)₂、A(AEAAK)₃A、(EAAAK)₅或其组合。

在某些实施方案中，所述肽接头为(GGGGS)₃。

在某些实施方案中，所述双特异性抗体包含如SEQ ID NO:20-26任一项所示的序列。在某些实施方案中，所述双特异性抗体包含如SEQ ID NO:22所示的序列。此处所示序列在其N端不包含起始密码子(如ATG)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(Met))。本领域技术人员理解，在通过基因工程制备蛋白的过程中，由于起始密码子的作用，所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如Met)。本发明的双特异性抗体不仅囊括在其N末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列，也囊括在其N末端包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的N端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列也在本发明的保护范围内。

在本发明中，本发明的双特异性抗体可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的双特异性抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的双特异性抗体的生物学功能(例如特异性结合TNF-α和IL-23，中和TNF-α或IL-23的生物活性)。

例如，在一些实施方案中，所述变体与其所源自的双特异性抗体相比，可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

多特异性抗体

另一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，其包含本发明的双特异性抗体。为产生所述多特异性抗体，可以将本发明的双特异性抗体连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。

在某些实施方案中，所述多特异性抗体特异性结合TNF-α和IL-23，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

在某些实施方案中，所述多特异性抗体还包含至少一种具有针对第三靶标的第三结合特异性的第三抗体。

抗体的制备

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的双特异性抗体或多特异性抗体。

另一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

另一方面，提供了制备本发明的双特异性抗体或多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体或多特异性抗体。

缀合物

另一方面，本发明还提供了缀合物，其本发明的双特异性抗体或多特异性抗体以及偶联部分。

在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体或多特异性抗体任选地通过接头与所述偶联部分缀合。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些示例性实施方案中，本发明的双特异性抗体的C端连接有His标签(例如6×His)。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的双特异性抗体，以降低潜在的位阻。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。

药物组合物

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。

在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

治疗应用

另一方面，本发明提供了在受试者中预防和/或治疗与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物。本发明还涉及所述双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病。

在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病以TNF-α表达升高和/或过度的TNF-α活性为特征。

在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病以IL-23表达升高和/或过度的IL-23活性为特征。

在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。

在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。

在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。

在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。

本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。

一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物通过静脉注射或推注给予。

检测应用

另一方面，本发明提供了检测TNF-α和/或IL-23在样品中的存在或其量的方法，其包括使用本发明的双特异性抗体或缀合物。

在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

在某些实施方案中，用于所述方法的缀合物包含本发明的双特异性抗体以及可检测的标记。

在某些实施方案中，用于所述方法的双特异性抗体带有可检测的标记。

在某些实施方案中，用于所述方法的双特异性抗体不带有可检测的标记。因此，所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的双特异性抗体。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)将所述样品与本发明的双特异性抗体或缀合物接触；

(2)检测所述双特异性抗体或缀合物与抗原之间复合物的形成或检测所述复合物的量。

所述复合物的形成表明存在抗原或表达抗原的细胞；

其中，所述抗原选自TNF-α或IL-23。

所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在某些实施方案中，所述方法用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关和/或IL-23的疾病。在此类实施方案中，所述方法还可以包括：将所述TNF-α和/或IL-23在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是TNF-α和/或IL-23在来自已知不具有与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果TNF-α和/或IL-23在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病。

在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病以TNF-α表达升高和/或过度的TNF-α活性为特征。在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。

在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病以IL-23表达升高和/或过度的IL-23活性为特征。在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与IL-23有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病。

在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。

在某些实施方案中，所述TNF-α是人TNF-α。

在某些实施方案中，所述IL-23是人IL-23。

另一方面，提供了本发明的双特异性抗体或缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测TNF-α和/或IL-23在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的双特异性抗体以及可检测的标记。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的双特异性抗体带有可检测的标记。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的双特异性抗体不带有可检测的标记。在此类实施方案中，所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的双特异性抗体的其他试剂(如第二抗体)。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。

如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(Camelid heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomain of heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。

如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)，两者可互换使用。

如本文中所使用的，术语“双特异性抗体”是指对两种不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。双特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的两种抗原结合结构域，从而能够结合两个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，不同抗原结合结构域通过肽接头连接。

术语“多特异性抗体”是指对至少两种(例如两种、三种或四种)不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。多特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的多个抗原结合结构域，从而能够结合至少两个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，各个抗原结合结构域通过肽接头连接。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数K_D(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量K_D、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与TNF-α有关的疾病，与IL-23有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与TNF-α有关的疾病。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与IL-23有关的疾病。

发明的有益效果

抗TNF-α单抗类生物制剂的应用，彻底改变了IBD治疗的格局。抗TNF-α抗体治疗能够缓解患者的病情，修复肠粘膜的损伤。然而超过三分之一的患者，并且大约40％的最初应答者会失去对抗TNF-α生物制剂治疗的应答。进一步的研究发现，抗TNF-α难治性患者中抗凋亡的IL-23R阳性T细胞会扩张。

本发明提供的双特异性纳米抗体可同时靶向TNF-α和IL-23，其能够有效中和TNF-α和IL-23的生物活性，从而能够有效避免免疫逃逸，具有治疗抗TNF-α难治性患者的潜力，为IBD的治疗提供新的思路。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1：ELISA验证纳米抗体的亲和力。(a)VHH2及其突变体的ELISA结果；(b)37D5及其突变体的ELISA结果。

图2：Bsn1和Bsn3与IL-23的平均力势图。

图3：Bsn1和Bsn3与TNF-α的平均力势图。

图4：Bsn2、Bsn3和Bsn4与TNF-α的平均力势图。

图5：Bsn5、Bsn6和Bsn7与TNF-α的平均力势图。

图6：Bsn3和Bsn6与TNF-α的平均力势图。

图7：纳米抗体SPR结果。

图8：双特异性纳米抗体抑制IL-23依赖的细胞增殖实验。

图9：双特异性纳米抗体中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性。

序列信息

本申请涉及的序列的描述提供于下表中。

表1：序列信息

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具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：纳米抗体的设计

1、纳米抗体突变位点的确定

本研究中，通过对抗TNF-α纳米抗体VHH2(参见Beirnaert E,et al.FrontImmunol.2017Jul 31；8:867.doi:10.3389/fimmu.2017.00867.)和抗IL-23纳米抗体37D5(参见Aline D,Silvia S,Carlo B,et al..Front Immunol,2017,8:884.doi:10.3389/fimmu.2017.00884.)进行亲和力成熟，进一步获得亲和力提高的纳米抗体突变体。通过使用InterProSurf对VHH2纳米抗体(氨基酸序列SEQ ID NO:1)以及37D5纳米抗体(氨基酸序列SEQ ID NO:6)各自与抗原形成的抗原-抗体复合物的PDB结构(复合物的PDB ID分别为5M2J和4GRW)进行分析，确定纳米抗体与抗原的结合区域，并进一步使用Pymol软件对抗原-抗体复合物进行分析，以确定参与对接界面的氨基酸。确定抗原-抗体复合物对接界面间氨基酸有助于缩小和准确定位抗体氨基酸突变范围，也有助于体外亲和力成熟实验的进行。从PDB蛋白结构数据库中下载5M2J和4GRW文件，进而获得抗原和抗体的结晶体结构。纳米抗体中CDR区主要负责与抗原的结合，所以选择CDR区作为引入氨基酸突变区域。

通过InterProSurf和PyMol两种方法来分析确定VHH2和37D5各自与抗原结合的氨基酸残基，并将其作为在抗体序列引入突变的位点。

2、突变前的结构预处理

确定突变位点后，还需对复合物结构进行预处理：使用Pymol去除复合物结构中的结晶水和盐离子；使用MOL probity在线服务器向复合物结构中添加缺失的H离子，并优化H键网络。

3、体外亲和力成熟

使用VIMAS平台(Min Hu等人,In vitro affinity maturation to improve theefficacy of a hypoxia-inducible factor 1αsingle-domain intrabody,Biochemicaland Biophysical Research Communications,Volume 529,Issue 4,2020,Pages 936-942)对纳米抗体VHH2和37D5序列进行计算机辅助的体外亲和力成熟，该平台涉及到3三种算法mCSM-AB、FoldX和OSPRY。鉴于二硫键对纳米抗体稳定性的影响以及脯氨酸自身结构的原因，所以将每个待突变的氨基酸突变成除半胱氨酸和脯氨酸外的其他的17个氨基酸。对于VHH2，VIMAS平台第一轮共对13个氨基酸残基进行单点突变，每个氨基酸被突变成其余17种氨基酸，共计算评估了221个突变，对于37D5，第一轮共对10个氨基酸残基进行单点突变，共计算评估了170个突变。分别使用上述的亲和力预测模拟软件进行突变预测，根据每个软件输出的结果确定最终合适的单点突变。

在VHH2中，第一轮突变后的结果显示，一共涉及到VHH2的3个氨基酸的共8种突变，这三个氨基酸为：Asn 31，Glu 50，Thr 53。在37D5中，第一轮突变后，一共涉及到37D5的3个氨基酸的共3种突变，涉及到的氨基酸为Thr 28，Tyr 31，Tyr 108。接着评估单点突变对纳米抗体整体溶解性的影响。

4、突变后可溶性预测

Camsol在线服务器可以分析蛋白质序列中每一个氨基酸残基的溶解度贡献度，分数大于1的区域表示为高溶性区域，分数小于-1时，表示为低溶性区域。

选取可溶单点突变进入下一轮筛选，对VHH2进行第二轮突变，使用FoldX软件将上述8种单点突变中的6种可溶单点突变体进行组合突变结合能计算，根据突变结果确定最终的8种双点突变体；对37D5进行第二轮突变，3种突变共组成3种双点突变，使用FoldX对其进行计算评估。

综合亲和力及可溶性分析结果，最终从纳米抗体VHH2突变体中选择双点突变体E50Q&T53W(命名为VHH2^M3)用于后续的活性验证；从纳米抗体37D5突变体中选择双点突变体Y31W&Y108W(命名为37D5^M4)用于后续的活性验证；上述各纳米抗体的C端可选择性融合表达6×His标签(HHHHHH,CACCACCACCACCACCAC)，以供纯化需要。

实施例2：纳米抗体突变体的表达纯化

将含纳米抗体及其突变体编码序列的质粒转化Trans B感受态细胞，并挑取单克隆进行测序验证。测序正确的菌株在LB培养基中进行发酵培养，收集菌体，进行超声破碎，过0.45μm PES滤膜备用。使用AKTA prime plus蛋白纯化仪对单点突变纳米抗体进行纯化。

实施例3：纳米抗体突变体的结合活性

间接法ELISA可以粗略地评估抗原-抗体的结合能力，可用于验证突变体较野生型，亲和力是否得到提高，具体实验方法如下：

(1)使用Nanodrop测定抗原的浓度，然后使用包被缓冲液将抗原稀释至10μg/mL，每孔100μL加入到96孔板，BSA做阴性对照，4℃过夜包被；

(2)次日弃去包被液，每孔中加入200μL PBST溶液，洗涤3次，每次5min；

(3)向每孔中加入100μL封闭液，37℃培养箱中封闭1h；

(4)弃去封闭液，向每孔中加入200μL PBST溶液，共洗涤5次，每次5min；

(5)设置纳米抗体浓度为：200,150,100,12.5,1.5625,0.1953,0.0244,0.003μg/mL，向每孔加入100μL纳米抗体溶液，每个浓度设置三个平行，37℃培养箱中孵育2h；

(6)弃去孔内液体，每孔中加入200μL PBST溶液，洗涤5次，每次5min；

(7)向每孔内加入100μL 1:10000稀释的带HRP标记的鼠源anti-HIS单克隆抗体(武汉三鹰，6*His,His-Tag antibody(66005-1-Ig))，37℃培养箱中孵育1h；

(8)弃去孔内液体，向每孔中加入200μL PBST溶液，共洗涤3次，每次10min，再向每孔内加入200μL PBS溶液，洗涤3次，每次5min；

(9)向每孔内加入100μL先配的TMB显色液(A液和B液1:1混合)，

室温避光孵育15min；

(10)继续向孔内加100μL终止液，反应5min后，使用酶标仪测定每孔在OD450下的吸光度。

结果如图1所示，突变体相对于亲本对抗原的结合活性均有所提高。其中突变体VHH2^M3和37D5^M4具有优于亲本的亲和活性，用于后续的双特异性纳米抗体的构建。

实施例4：双特异性纳米抗体的设计

1、双特异性纳米抗体三维模型构建

(1)如表2所示，共设计和构建8条双特异性纳米抗体，将氨基酸序列上传至Colabfold服务器进行建模。

在Colabfold中依次输入Bsn1-Bsn7的氨基酸序列，每条序列输出10个模型，最终输出70个模型，并利用SAVE v6.0在线服务器对这些模型进行评估，来确定每一个双特异性纳米抗体的最终构像，为下一步分子动力学模拟实验做准备。

(2)使用Gromacs 2019.5软件对构建的模型进行分子动力学模拟，进而对模型进行松弛

表2双特异性纳米抗体序列

(3)使用获得的三维结构进行后续的分子对接

1)分子对接

使用PyMol去除pdb文件中带有水分子和盐离子，对接前再检查抗原和抗体的分子结构以及坐标信息，添加缺失的氢原子。

使用HADDCOK v2.2在线服务器进行分子对接，HADDOCK需要指令两个对接分子的活性位点。选择抗体的CDR区作为抗体的活性位点；再根据5M2J和37D5与各自抗原的对接复合物来判断TNF-α和IL-23的活性位点。

HADDOCK运算完后生成了10个聚类，这些集群中含有若干个对接结构，并且每个聚类会输出最好的4个对接结构，HADDOCK会输出HADDCOK分数、范德华能、静电能、Z-score等。主要根据Z-score来选择最终的对接复合物，Z-score越低越好。根据Z-score的大小选出最合适的对接复合物模型用于下一步伞状抽提取样实验。

2)抗原-抗体对接复合物结合能测定

使用伞状采样实验分析结合物的自由能，过程共分为拉伸步骤和伞状采样模拟步骤。在拉伸步骤时，抗原的所有原子被约束在原地，施加一个力将抗体拉离抗原，在此过程中会生成501个构型。以自定义的窗口间距，选取其中一部分构像作为伞状采样窗口的初始构像，并进行伞状采样模拟。

伞状采样中，抗原抗体的结合能(ΔGbind)可由PMF曲线平衡后的值与PMF最低点值的差值表示，如图2所示，Bsn1和Bsn3与IL-23的ΔGbind分别为-12.5、-15Kcal/mol，结果表明当37D5^M4处于双特异性纳米抗体的N端与C端时，两者对IL-23的ΔGbind差异不大。37D5^M4处于N端时(Bsn3)，与IL-23的结合能略高一些，为不影响双特异性纳米抗体对IL-23的结合，37D5^M4优选设计为处于双特异性纳米抗体的N端；如图3所示，Bsn1与Bsn3与TNF-α的ΔGbind分别为-14、-35Kcal/mol，当VHH2^M3处于双特异性纳米抗体N/C两端时，两者对TNF-α的ΔGbind差异巨大，当VHH2^M3处于C端时(Bsn3)，其与TNF-α结合能更大，所以VHH2^M3优选设计为处于双特异性纳米抗体C端。

在确定双特异性纳米抗体的形式为37D5^M4-linker-VHH2^M3后，使用不同的linker来探究linker的长度和种类对抗体结合能的影响。图4表明当时用柔性linker时，使用(GGGGS)₃linker的Bsn3的与TNF-α的结合能远大于分别使用GGGSGGGGS和(GGGGS)₅的Bsn2和Bsn4(Bsn2、Bsn3和Bsn4与TNF-α的ΔGbind分别为-13、-35、-12.5Kcal/mol)；图5表明使用刚性linker时，使用中等长度刚性linker的Bsn6与TNF-α的ΔGbind为-21Kcal/mol，而使用(EAAAK)₂和(EAAAK)₅linker的ΔGbind仅为-17.5和-15Kcal/mol，结果表明，较长或较短的linker都会对处于C端的抗体与抗原结合的能力造成影响；图6探究的是使用linker种类对C端抗体ΔGbind的影响，Bsn3和Bsn6使用的是长度最为合适的柔性和刚性linker，他们的ΔGbind为-35和-21Kcal/mol。本实验验证了Bsn3是最适宜的双特异性纳米抗体结构。

使用FoldX加载抗原-抗体对接复合物。首先使用repair object功能对复合物结构进行修改，该命令通过重排氨基酸残基的侧链来实现能量最小化。然后对修正过的结果使用interaction energy of molecules命令计算抗原-抗体的结合能以及主链氢键键能(ΔEbh)、侧链氢键键能(ΔEsh)、范德华力(ΔEvdw)、静电相互作用(ΔEele)、极性溶剂自由能(ΔGpb)和非极性溶剂自由能(ΔGnb)。结果如表3所示，表3中的能量数值为正时，表示为不利于抗原-抗体的结合，数值为负时，有利于抗原-抗体的结合。对比所有能量在双特异性纳米抗体与TNF-α的结合自由能的贡献，可以看出氢键键能和范德华力相互作用能的减小是促进Bsn3与TNF-α结合的主要因素，对比Bsn1和Bsn3与IL-23的结合，发现其中起到关键影响作用的是溶剂自由能，Bsn3与IL-23结合时，溶剂自由能比Bsn1-IL-23小5.03Kcal/mol。

表3双特异性纳米抗体的结合自由能

将FoldX的结果和伞状抽提结果进行分析，发现依旧是37D5^M4处于双特异性纳米抗体N端和VHH2^M3处于C端时，Bsn3与两个抗原具有更大的结合能力，并且使用同种类型linker时，Bsn3和Bsn6具有最大的与TNF-α结合能力，而Bsn3的结合自由能小于Bsn6，结果与伞状采样相符。验证了Bsn3是最适宜的双特异性纳米抗体结构。

实施例5：双特异性纳米抗体的结合活性

使用Biacore T200测定抗体的结合常数KD：

1、氨基偶联法捕获抗原：

(1)在仪器上安装CM5芯片，使用仪器自带的pH 4.0、4.5、5.0的醋酸钠溶液稀释两种抗原至5μg/mL，使用manual run程序，流速为10μL/min，进样时间为120s，对抗原进行预富集，选择最合适的醋酸钠溶液；

(2)使用pH 4.0的醋酸钠溶液将hTNF-α稀释至5μg/mL，使用pH 4.5的醋酸钠溶液将hIL-23稀释至5μg/mL。使用Wizard程序，hTNF-α的target level设置成1000RU，hIL-23设置成1500RU。按照程序放置好抗原稀释液、50mM NaOH再生液、碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺溶液、乙醇胺溶液，运行程序；

(3)RU值到target level时，抗原成功偶联至CM5芯片上，将芯片置于PBS-EP+溶液中，4℃保存备用。

2、Kinect and affinity程序测定抗体KD值：

(1)使用PBS-EP+溶液将VHH2、37D5、Bsn0和Bsn3梯度稀释成200-1.5625nM，流速为30μL/min，进样时间为100s，解离时间为600s，再生液为pH 2.5的甘氨酸-盐酸溶液，再生时间为30s；

(2)使用Biacore T200 Evaluation Software进行分析，选择5-6个浓度进行拟合分析，按照1.1:1Binding模型分析动力学数据，计算KD值。

结果如图7所示，分析后的Kd值如表4所示。

表4.纳米抗体的KD值

实施例6：双特异性纳米抗体的细胞增殖抑制实验

hIL-23能诱导(人淋巴T细胞系)Kit-225细胞(OTWO(华拓)，HTX2261)增殖，用以评价双特异性纳米抗体阻断IL-23与其受体结合的结合活性。具体实验步骤如下：

(1)使用含有10％血清的培养基洗涤细胞，去除原培养基中的IL-2。计数并制备细胞悬液，将4*10⁴个细胞接种到96孔板中；

(2)同时加入终浓度为2ng/mL的hIL-23(Abcam，重组人IL-23蛋白(Active)(ab109153))以及不同浓度的37D5、Bsn0和Bsn3，设置纳米抗体浓度为：200,150,100,12.5,1.5625,0.1953,0.0244,0.003μg/mL，细胞在37℃，5％CO₂的环境养，使用CCK-8试剂测量细胞数量。

(3)以未加入抗体和hIL-23的对照组作为空白对照，以仅加入hIL-23的对照组作为参照，计算抑制百分比，每组进行三次实验。

结果如图8所示，anti-IL-23纳米抗体能有效抑制hIL-23诱导的Kit-225细胞增殖，并且，进行亲和力成熟和结构优化设计的双特异性纳米抗体Bsn3相较于亲本37D5以及由亲本构建的双特异性纳米抗体Bsn0对抑制IL-23依赖的细胞增殖具有明显提升。

实施例7：双特异性纳米抗体中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性测定CCK-8法检测双特异性纳米抗体中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性作用，步骤如下：

(1)使用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，在5％CO₂,37℃的培养箱中培养L929细胞系(ATCC CCL-1^TM)，待细胞生长至对数生长期后，收集细胞，计数，重悬制备细胞悬液；

(2)将2000个细胞接种到96孔板中，在5％CO₂,37℃的培养箱中培养，过夜贴壁；

(3)另取反应板，加入梯度稀释的anti-TNF-α纳米抗体VHH2以及双特异性纳米抗体Bsn0、Bsn3，加入终浓度为1μg/mL的TNF-α和终浓度为1μg/mL的放线菌素D，37℃孵育两个小时，37D5作为阴性对照，设置空白对照；

(4)弃去细胞培养板中的培养液，将反应板中的反应液加入到第一块板中，5％CO2,37℃培养24小时，使用CCK-8试剂盒测定活细胞数量，使用酶标仪读取570nm处的吸光度值，更具下列公式计算抑制率；

Inhibition＝[(ODag-ODag/ab)/(ODnc-ODag)]*100％；

其中，ODag表示没有加入抗体的阳性对照组的吸光度值；ODab表示加入了抗体的实验组的吸光度值；ODag/ab表示ODag与ODab的比值；ODnc表示阴性对照组的吸光度值。

结果如图9所示，VHH2以及双特异性纳米抗体Bsn0和Bsn3在不同浓度下均可有效抑制TNF-α对L929细胞系的细胞毒性，这一现象在阴性对照中并未出现；此外，抑制效应与抗体浓度呈现出剂量效力依赖关系，并且，在同浓度下Bsn3较VHH2和Bsn0均具有更好的抑制效果。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (40)

1.一种特异性结合TNF-α和IL-23的双特异性抗体，其包含对TNF-α特异性的第一抗原结合结构域和对IL-23特异性的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域是VHH；

其中，

a).所述第一抗原结合结构域包括包含如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2、如SEQ ID NO:5所示的CDR3的重链可变区(VHH)；和，

b).所述第二抗原结合结构域包括包含如SEQ ID NO:8所示的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的CDR2、如SEQ ID NO:10所示的CDR3的重链可变区(VHH)。

2.权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自独立地包含驼源重链抗体的框架区或源自人免疫球蛋白的重链框架区。

3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中，(a)所述第一抗原结合结构域包含：SEQ IDNO:11所示的FR1、SEQ ID NO:12所示的FR2、SEQ ID NO:13所示的FR3、以及SEQ ID NO:14所示的FR4；和/或，

(b)所述第二抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:15所示的FR1、SEQ ID NO:16所示的FR2、SEQ ID NO:17所示的FR3、以及SEQ ID NO:18所示的FR4。

4.权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2所示的序列；和/或，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示的序列。

5.权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域任选地通过接头连接。

6.权利要求5所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的N端或C端。

7.权利要求5所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的C端。

8.权利要求5所述的双特异性抗体，其中，所述接头为肽接头。

9.权利要求8所述的双特异性抗体，其中，所述肽接头为刚性肽接头或柔性肽接头。

10.权利要求8所述的双特异性抗体，其中，所述肽接头由9至25个氨基酸残基组成。

11.权利要求8所述的双特异性抗体，其中，所述肽接头选自：(GGGGS)₃、GGGSGGGGS、(GGGGS)₅、(EAAAK)₂、A(AEAAK)₃A、(EAAAK)₅或其组合。

12.权利要求8所述的双特异性抗体，其中，所述肽接头为(GGGGS)₃。

13.权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含如SEQ IDNO:20-26任一项所示的序列。

14.权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含如SEQ IDNO:22所示的序列。

15.多特异性抗体，其包含权利要求1-14任一项所述的双特异性抗体。

16.权利要求15所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体特异性结合TNF-α和IL-23，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

17.权利要求16所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体还包含至少一种具有针对第三靶标的第三结合特异性的第三抗体。

18.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-14任一项所述的双特异性抗体或权利要求15-17任一项所述的多特异性抗体的核苷酸序列。

19.载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸分子。

20.权利要求19所述的载体，其中，所述载体为克隆载体或表达载体。

21.宿主细胞，其包含权利要求18所述的分离的核酸分子或权利要求19或20所述的载体。

22.制备权利要求1-14任一项所述的双特异性抗体或权利要求15-17任一项所述的多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体或多特异性抗体。

23.缀合物，其包含权利要求1-14任一项所述的双特异性抗体或权利要求15-17任一项所述的多特异性抗体以及偶联部分。

24.权利要求23所述的缀合物，其中，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)，可检测的标记，治疗剂，或，另外的生物活性多肽。

25.权利要求24所述的缀合物，其中，所述蛋白标签(protein tag)选自His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP，所述可检测的标记选自酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素，和/或，所述治疗剂为抗炎药物或免疫抑制剂。

26.权利要求25所述的缀合物，其中，所述酶为辣根过氧化物酶。

27.药物组合物，其包含权利要求1-14任一项的双特异性抗体、权利要求15-17任一项的多特异性抗体、权利要求18的分离的核酸分子、权利要求19或20的载体、权利要求21所述的宿主细胞、或权利要求23-26任一项所述的缀合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

28.权利要求27所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。

29.权利要求28所述的药物组合物，其中，所述另外的药学活性剂为抗炎药物或免疫抑制剂。

30.权利要求1-14任一项的双特异性抗体、权利要求15-17任一项的多特异性抗体、权利要求18的分离的核酸分子、权利要求19或20的载体、权利要求21所述的宿主细胞、权利要求23-26任一项所述的缀合物、或权利要求27-29任一项所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病；其中，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。

31.权利要求30所述的用途，其中，所述疾病选自炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、葡萄膜炎。

32.权利要求30所述的用途，其中，所述疾病为克罗恩病、溃疡性结肠炎。

33.权利要求30所述的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。

34.权利要求30所述的用途，其中，所述受试者为人。

35.权利要求30-34任一项所述的用途，其中，所述双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。

36.权利要求35所述的用途，其中，所述另外的药学活性剂为抗炎药物或免疫抑制剂。

37.用于非诊断目的的检测TNF-α和/或IL-23在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-14任一项的双特异性抗体或权利要求23-26任一项所述的缀合物。

38.权利要求37所述的方法，其中，所述方法是免疫学检测。

39.权利要求38所述的方法，其中，所述免疫学检测为免疫印迹法、酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

40.权利要求1-14任一项的双特异性抗体或权利要求23-26任一项所述的缀合物在制备用于检测TNF-α和/或IL-23在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关和/或与IL-23有关的疾病的检测试剂中的用途；其中，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。