CN114957467B - 特异性结合TNF-α的纳米抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及经亲和力成熟的抗TNF‑α的纳米抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。

Description

特异性结合TNF-α的纳米抗体及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及经亲和力成熟的抗TNF-α的纳米抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种累及回肠、直肠、结肠的特发性慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。IBD是由易感基因、不利环境和免疫系统功能紊乱等多因素共同导致的过度活跃的炎症反应，黏膜屏障受损和管腔菌群紊乱最终导致肠道免疫系统的连续失调。在过去的二十年中，我国IBD的发病率明显上升，已经成为亚洲高发病率地区。预计到2025年，我国的IBD患者可达150万人，将给国家医疗卫生系统带来巨大的经济挑战。
目前针对IBD的治疗措施旨在调节炎症反应，以减轻肠道炎症，促进黏膜愈合。早期非生物疗法如氨基水杨酸盐、硫嘌呤和类固醇等小分子药物可缓解炎症性肠病的症状，但不会改变整个病程的发展，且副作用明确。近年来炎症性肠病的治疗目标已经从症状控制转向逆转病程发展，越来越多的IBD患者寻求生物制剂的有效治疗，其中尤以anti-TNF-α单抗生物制剂应用最为广泛。以英夫利昔单抗(Infliximab,IFX)、阿达木单抗(Adalimumab,ADA)为代表的anti-TNF-α单克隆抗体通过结合肠道固有层中CD14+巨噬细胞表面上的mTNF-α，阻断其与CD4+T细胞间的mTNF-α-TNFR2共刺激通路，进而诱导T细胞凋亡、减缓炎症因子风暴引起的肠黏膜损伤。但给药后肠道结构性损伤仍然持续存在，纤维化狭窄无法通过药物逆转，通常需要内镜治疗或手术干预。此外，作为使用最广泛的IBD生物制剂，抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应(Antibody-Dependent Cell-mediatedCytotoxicity,ADCC)使严重感染风险增加或导致白细胞破裂性血管炎，造成部分患者因不良反应终止治疗。
此外，现有传统抗体生物制剂均存在组织穿透性差、免疫原性强等问题，造成患部药物浓度低于治疗浓度并导致二次应答缺失，从而影响持续疗效。基于现有IBD治疗生物制剂的局限性，小型化、人源化、理性设计优化的抗体药物的开发和应用是今后IBD治疗的发展方向。
纳米抗体(nanobody)又称为单域抗体(sdAb)，是从骆驼科动物或鲨鱼的血清中分离出的一种抗体，单域抗体仅由重链构成，具有分子量小，稳定性好等特点。加拿大学者EISBerinaert进行骆驼免疫，再进行建库、噬菌体表面展示技术后，得到了的抗TNF-α的纳米抗体序列(Beirnaert E,et al.Front Immunol.2017Jul 31；8:867.doi:10.3389/fimmu.2017.00867.)，但该抗体序列未经后续的体内或体外亲和力成熟过程，其成药性亟待提高。
发明内容
抗体通常需要经历一个或多个亲和力成熟周期来提高亲和力，这使得传统的亲和力成熟办法显得捉襟见肘。本申请的发明人利用计算机辅助的体外亲和力成熟技术，在纳米抗体VHH2的基础上进一步获得了对TNF-α亲和力提高的纳米抗体突变体，与亲本抗体相比其不仅具备更高的亲和力，还具备更优的中和活性和显著提高的热稳定性，由此完成了以下发明。
纳米抗体
在一个方面，本发明提供了特异性结合TNF-α的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VHH)中所包含的CDR1、CDR2和CDR3，所述VHH与SEQ ID NO:1所示的序列相比在氨基酸位置E50和/或T53中包含置换。
在某些实施方案中，所述在氨基酸位置E50的置换选自E50M、E50Q、E50V。
在某些实施方案中，所述在氨基酸位置T53的置换选自T53F、T53W。
本文中所述的纳米抗体通常包括由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成的VHH，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4，所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合TNF-α的能力。在一些实施方案中，本发明所述的纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
在某些实施方案中，所述VHH中所包含的CDR1、CDR2和CDR3通过Kabat编号系统确定。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:11所示的CDR1、如X1INX2NGLITKYPDSVKG(SEQ ID NO:18)所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:17所示的CDR3；其中，X1选自M，Q或V；X2选自F或W。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段不包含下述CDR区：SEQ IDNO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:12所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；
在某些实施方案中，所述VHH与SEQ ID NO:1所示的序列相比包含(i)E50M和T53F、(ii)E50M和T53W、(iii)E50Q和T53W、或(iv)E50V和T53W。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:15所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；或，
(4)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:19所示的FR1、SEQ ID NO:20所示的FR2、SEQ ID NO:21所示的FR3、以及SEQ ID NO:22所示的FR4。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NOs:9、7、5、3任一项所示的序列。此处所示序列在其N端不包含起始密码子(如ATG)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(Met))。本领域技术人员理解，在通过基因工程制备蛋白的过程中，由于起始密码子的作用，所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如Met)。本发明的纳米抗体或其抗原结合片段不仅囊括在其N末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列，也囊括在其N末端包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的N端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列也在本发明的保护范围内。
在本发明中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的纳米抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的纳米抗体或其抗原结合片段的生物学功能(例如特异性结合TNF-α，中和TNF-α的生物活性)。
双特异性或多特异性抗体
另一方面，本发明提供了一种双特异性或多特异性抗体，其包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。为产生所述双特异性或多特异性抗体，可以将本发明的纳米抗体或其抗原结合片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合TNF-α，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
抗体的制备
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:4,6,8,10任一项所示的序列或由遗传密码的简并性形成的与上述序列相关的DNA序列。
另一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。
另一方面，提供了制备本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体。
缀合物
另一方面，本发明还提供了缀合物，其本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体以及偶联部分。
在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述偶联部分缀合。
在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些示例性实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的C端连接有His标签(例如6×His)。
在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，
Figure BDA0003705798860000061
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的纳米抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
在某些实施方案中，所述偶联部分选自治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。
在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。
药物组合物
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
治疗应用
另一方面，本发明提供了在受试者中预防和/治疗与TNF-α有关的疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物。本发明还涉及所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗与TNF-α有关的疾病。
在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病以TNF-α表达升高和/或过度的TNF-α活性为特征。
在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物通过静脉注射或推注给予。
检测应用
另一方面，本发明提供了检测TNF-α在样品中的存在或其量的方法，其包括使用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，用于所述方法的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。
在某些实施方案中，用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中，用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。因此，所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；
(2)检测所述纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物与TNF-α之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
所述复合物的形成表明存在TNF-α或表达TNF-α的细胞。
所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在某些实施方案中，所述方法用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关的疾病。在此类实施方案中，所述方法还可以包括：将所述TNF-α在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是TNF-α在来自已知不具有与TNF-α有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果TNF-α在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与TNF-α有关的疾病。
在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病以TNF-α表达升高和/或过度的TNF-α活性为特征。在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与TNF-α有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。
在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。
在某些实施方案中，所述TNF-α是人TNF-α。
另一方面，提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测TNF-α在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关的疾病。
在某些实施方案中，用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。
在某些实施方案中，用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中，用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。在此类实施方案中，所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的其他试剂(如第二抗体)。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(Camelid heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomain of heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)，两者可互换使用。
如本文中所使用的，术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与TNF-α有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与TNF-α有关的疾病。
发明的有益效果
靶向中和固有层中的TNF-α能有效抑制IBD患者病程的发展，然而单克隆抗体组织穿透性差，稳定性差，对pH变化耐受较低，到达有效部位的剂量小，且免疫原性高容易引起继发性耐药和抗药抗体的产生。
本发明提供了对TNF-α具备高亲和力的纳米抗体，其能够高效中和TNF-α的生物活性，并且具备优良的热稳定性。此外，本申请的纳米抗体作为纳米抗体，其免疫原性低、分子量小、组织穿透性强、结构稳定，是治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的潜在治疗方案，具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1：VHH2与hTNF-α对接的复合物结构，紫色为抗原结构，绿色为纳米抗体结构，红色、黄色、蓝色分为CDR1、CDR2、CDR3区。
图2：VHH2单点突变的亲和力预测结果。
图3：VHH2单点突变体的表达纯化。M：蛋白Marker；1-8：N31F,N31W,E50V,E50I,E50M,E50Q,E53F,E53W。
图4：VHH2和突变体对hTNF-α的ELISA结果。
图5：VHH2及其突变体对hTNF-α的SPR结果。
图6：VHH2及其突变体的熔解曲线。
图7：VHH2及其突变体VHH2-M3抑制hTNF-α与其受体的结合。
图8：VHH2及突变体VHH2-M3中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性。
序列信息
表1：本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：
Figure BDA0003705798860000181
Figure BDA0003705798860000191
Figure BDA0003705798860000201
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：纳米抗体突变体的设计
1、纳米抗体突变位点的确定
本研究中，通过对纳米抗体VHH2(参见Beirnaert E,et al.FrontImmunol.2017Jul 31；8:867.doi:10.3389/fimmu.2017.00867.)进行亲和力成熟，进一步获得亲和力提高的纳米抗体突变体。通过使用InterProSurf对VHH2纳米抗体(氨基酸序列SEQ ID NO:1，核苷酸序列SEQ ID NO:2)与抗原形成的抗原-抗体复合物的PDB结构(5M2J)进行分析，确定纳米抗体与抗原的结合区域，并进一步使用Pymol软件对抗原-抗体复合物进行分析，以确定参与对接界面的氨基酸。确定抗原-抗体复合物对接界面间氨基酸有助于缩小和准确定位抗体氨基酸突变范围，也有助于体外亲和力成熟实验的进行。从PDB蛋白结构数据库中下载5M2J文件，进而获得抗原和抗体的结晶体结构。纳米抗体中CDR区主要负责与抗原的结合，所以选择CDR区作为引入氨基酸突变区域。
通过InterProSurf和PyMol两种方法来分析确定VHH2与TNF-α结合的氨基酸位点共涉及CDR1、CDR2和CDR3中的13个位点，分别为：N31,Y32,W33,Y35,E50,T53,N54,L56,I57,K59,R98,S99,F103。VHH2和TNF-α对接结构如图1所示。
2、突变前的结构预处理
确定突变位点后，还需对复合物结构进行预处理：使用Pymol去除复合物结构中的结晶水和盐离子；使用MOL probity在线服务器向复合物结构中添加缺失的H离子，并优化H键网络。
3、体外亲和力成熟
使用VIMAS平台(Min Hu等人,In vitro affinity maturation to improve theefficacy of a hypoxia-inducible factor 1αsingle-domain intrabody,Biochemicaland Biophysical Research Communications,Volume 529,Issue 4,2020,Pages 936-942)对纳米抗体序列VHH2进行计算机辅助的体外亲和力成熟，该平台涉及到3三种算法mCSM-AB、FoldX和OSPRY。鉴于二硫键对纳米抗体稳定性的影响以及脯氨酸自身结构的原因，所以将每个待突变的氨基酸突变成除半胱氨酸和脯氨酸外的其他的17个氨基酸。VHH2，第一轮共选择了13个氨基酸进行单点突变，共计算评估了221个突变。分别使用上述的亲和力预测模拟软件进行突变预测，根据每个软件输出的结果确定最终合适的单点突变。结果如图2所示。
在VHH2中，第一轮突变后的结果显示，一共涉及到VHH2的3个氨基酸的共8种突变，这三个氨基酸为：Asn 31，Glu 50，Thr 53。
4、突变后可溶性预测
点突变将改变纳米抗体的等电点及亲疏水性进而影响其溶解性，然而抗体需要在可溶状态下才能发挥结合抗原和治疗疾病的作用，部分突变体有自聚集的倾向，所以在重组蛋白的表达中，蛋白质的溶解性是必须要考虑的因素。通过对点突变后可溶性的预测有助于为后续的开发提供便利。Camsol在线服务器可以分析蛋白质序列中每一个氨基酸残基的溶解度贡献度，分数大于1的区域表示为高溶性区域，分数小于-1时，表示为低溶性区域。VHH2及其突变体的分数如表2所示。经过Camsol对溶解度的评分，发现VHH2中除了E50Q这一突变体，其余都是由极性氨基酸突变为非极性氨基酸，从intrinsic solubility score可以看出，这些突变对溶解度的影响很大，尤其是N31W和N31F这两个突变体，溶解度分数小于0，使得纳米抗体变得不溶。
表2 VHH2的溶解度分数
Figure BDA0003705798860000231
实施例2：纳米抗体突变体的表达纯化
1、CPEC法构建单点突变
(1)首先使用引物对纳米抗体的碱基序列引入点突变，以实验室保存的pET-32a为模板，使用snapgene软件设计突变位点上下游引物，并且在突变位点大致对称的位置在质粒上设计上下游引物，通过PCR的方式对目的蛋白进行扩增。质粒上的上游引物序列如SEQID NO:23所示，质粒上的下游引物序列如SEQ ID NO:24所示。
(2)纳米抗体VHH2单点突变所用引物(下划线碱基为引入突变氨基酸的碱基序列)：
N31W上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:25和26；N31F上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:27和28；E50V上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:29和30；E50I上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:31和32；E50Q上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:33和34；E50M上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:35和36；T53W上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:37和38；T53F上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO:39和40。
(3)PCR反应结束后，用核酸凝胶电泳验证结果，然后使用DNA凝胶快速纯化试剂盒对PCR产物进行切胶回收。对纯化后的PCR产物进行CPEC环化，构建环形质粒。
(4)从-80℃冰箱中取出Trans 5α感受态细胞置于冰上，静置10min，随后在无菌操作台中使用移液枪吸取10μL CPEC连接产物，缓慢地加入到感受态细胞中，在无菌超净台中静置30min，静置结束后在42℃的水浴锅中热激45s，热激后迅速置于冰上静置2min，最后向其中加入500μL LB培养基复苏1h，最后4000rpm离心2min菌体，弃掉400μL上清液，用移液枪重悬菌体后，转移至Amp抗性的平板中，涂布均匀，在37℃培养箱中倒置过夜培养，次日，挑取单克隆菌落在试管中培养，培养10-12h后保存成甘油菌，由苏州金唯智生物科技有限公司测序，验证氨基酸单点突变是否引入成功。
(5)将单点突变引入成功的质粒化转至Trans B感受态细胞中，化转方式同上，测序成功后，甘油菌置于-20℃冰箱中备用。
2、VHH2纳米抗体突变体的表达纯化
测序正确的菌株在LB培养基中进行发酵培养，收集菌体，进行超声破碎，过0.45μmPES滤膜备用。使用AKTA prime plus蛋白纯化仪对单点突变纳米抗体进行纯化，将收集的所有组分用过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定分析，结果如图3所示。
3、尺寸排阻纯化
为进一步提高抗体纯度，可以使用AKTA pure蛋白纯化仪以及SuperdexTM75increase 10/300GL预装柱对上述纯化得到的突变体进一步SEC纯化，以提高后续实验的准确性。
4、双点突变体的设计
通过可溶性预测和表达纯化评价，经过溶解度筛选，去除VHH2的N31F和N31W突变体，对VHH2进行第二轮突变，对VHH2的6个单点突变进行组合，形成了8个双点突变。用FoldX对双点突变体的抗原-抗体结合能进行计算，其结果如表3所示，由表中数据可以看出VHH2的双点突变体的结合自由能均小于该点单点突变时的结合能。
表3 VHH2第二轮结合能计算结果
Figure BDA0003705798860000241
经过两轮突变，选择8个结合自由能变化最大的双点突变作为VHH2的突变体，即E50M&T53F、E50M&T53W、E50Q&T53W、E50V&T53W、E50Q&T53F、E50V&T53F、E50I&T53F、E50I&T53W。因E50Q&T53F、E50V&T53F、E50I&T53F、E50I&T53W表达量较低，不利于后续的工程化开发，不予进行进一步评价和分析。
基于上述结果，最终选择4个双点突变体用于后续的理化性质的验证，即E50M&T53F、E50M&T53W、E50Q&T53W、E50V&T53W，为方便描述，命名为VHH2M1(氨基酸序列SEQ IDNO:3，核苷酸序列SEQ ID NO:4)、VHH2M2(氨基酸序列SEQ ID NO:5，核苷酸序列SEQ ID NO:6)、VHH2M3(氨基酸序列SEQ ID NO:7，核苷酸序列SEQ ID NO:8)、VHH2M4(氨基酸序列SEQ IDNO:9，核苷酸序列SEQ ID NO:10)；上述各纳米抗体的C端融合表达6×His标签(HHHHHH,CACCACCACCACCACCAC)，以供纯化需要。
实施例3：纳米抗体突变体的结合活性
间接法ELISA可以粗略地评估抗原-抗体的结合能力，可用于验证突变体较野生型，亲和力是否得到提高，具体实验方法如下：
(1)使用Nanodrop测定抗原的浓度，然后使用包被缓冲液将抗原稀释至10μg/mL，每孔100μL加入到96孔板，BSA做阴性对照，4℃过夜包被；
(2)次日弃去包被液，每孔中加入200μL PBST溶液，洗涤3次，每次5min；
(3)向每孔中加入100μL封闭液，37℃培养箱中封闭1h；
(4)弃去封闭液，向每孔中加入200μL PBST溶液，共洗涤5次，每次5min；
(5)设置纳米抗体浓度为：200,150,100,12.5,1.5625,0.1953,0.0244,0.003μg/mL，向每孔加入100μL纳米抗体溶液，每个浓度设置三个平行，37℃培养箱中孵育2h；
(6)弃去孔内液体，每孔中加入200μL PBST溶液，洗涤5次，每次5min；
(7)向每孔内加入100μL 1:10000稀释的带HRP标记的鼠源anti-HIS单克隆抗体(武汉三鹰，6*His,His-Tag antibody(66005-1-Ig))，37℃培养箱中孵育1h；
(8)弃去孔内液体，向每孔中加入200μL PBST溶液，共洗涤3次，每次10min，再向每孔内加入200μL PBS溶液，洗涤3次，每次5min；
(9)向每孔内加入100μL先配的TMB显色液(A液和B液1:1混合)，室温避光孵育15min；
(10)继续向孔内加100μL终止液，反应5min后，使用酶标仪测定每孔在OD450下的吸光度。
结果如图4所示，突变体相对于亲本对抗原的结合活性均有所提高。
实施例4：纳米抗体突变体的亲和力测定
使用Biacore T200测定抗体的结合常数KD：
1、氨基偶联法捕获抗原：
(1)在仪器上安装CM5芯片，使用仪器自带的pH 4.0、4.5、5.0的醋酸钠溶液稀释TNF-α抗原(abcam重组人TNF alpha蛋白(Active)，ab259410)至5μg/mL，使用manual run程序，流速为10μL/min，进样时间为120s，对抗原进行预富集，选择最合适的醋酸钠溶液；
(2)使用pH 4.0的醋酸钠溶液将TNF-α稀释至5μg/mL。使用Wizard程序，TNF-α的target level设置成1000RU。按照程序放置好抗原稀释液、50mM NaOH再生液、碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺溶液、乙醇胺溶液，运行程序；
(3)RU值到target level时，抗原成功偶联至CM5芯片上，将芯片置于PBS-EP+溶液中，4℃保存备用。
2、Kinect and affinity程序测定抗体KD值：
(1)使用PBS-EP+溶液将VHH2及突变体VHH2M1-M4梯度稀释成200-1.5625nM，对VHH2及其突变体，流速为30μL/min，进样时间为100s，解离时间为600s，再生液为pH 2.5的甘氨酸-盐酸溶液，再生时间为30s；
(2)使用Biacore T200 Evaluation Software进行分析，选择5-6个浓度进行拟合分析，按照1.1:1Binding模型分析动力学数据，计算KD值。
结果如图5所示，分析后的Kd值如表4所示。突变体相对于亲本对抗原的结合活性均有所提高。
表4 VHH2及突变体对hTNF-α的KD值
Figure BDA0003705798860000271
实施例5：纳米抗体突变体的热稳定性测定
使用Roche的LightCycler480 II测量纳米抗体的Tm值。实验步骤如下：
(1)启动仪器等待仪器自检，自检完成后将96孔板放入样品架中；
(2)进入LightCycler 480程序界面，设定实验参数，激发波长为465nm，发射波长为580nm，温度梯度设定为25-95℃。Acquisition Mode设为Continuous，变化率设为0.01℃/s，Acquisitions(per℃)设为50；
(3)实验结束后，导出数据，使用热稳定性插件进行分析，计算纳米抗体的Tm值。结果如图6所示，突变体相对于亲本的热稳定性均有所提高。
实施例6：纳米抗体突变体抑制hTNF-α与其受体结合的活性测定
ELISA检测VHH2及突变体抑制hTNF-α与其受体的结合，步骤如下：
(1)使用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，在5％CO2,37℃的培养箱中培养L929细胞系(ATCC CCL-1TM NCTC clone 929[L cell,L-929])，待细胞生长至对数生长期后，收集细胞，计数，重悬制备细胞悬液；
(2)将细胞悬液用预冷的PBS buffer洗涤两次，细胞重悬于含有0.05％叠氮化钠和1mM EDTA的PBS buffer，冻融两次，12000rpm离心60分钟，弃去上清。
(3)沉淀重悬于含有0.05％叠氮化钠和1mM EDTA的PBS buffer中，超声破碎直至溶液清亮。
(4)12000rpm离心30分钟，取上清，使用nanodrop one测定蛋白浓度，储存备用。
(5)将提取的TNFR受体蛋白包被于96孔ELISA板中，10μg/孔，4℃过夜，使用4％脱脂奶粉封闭包被孔2小时。
(6)反应板加入梯度稀释的anti-TNF-α纳米抗体VHH2及其突变体VHH2M3，加入终浓度为1μg/mL的TNF-α，37℃孵育两个小时，使用实验室保存的anti-CD47纳米抗体Nb02作为阴性对照，设置空白对照。
(7)PBST洗涤三次，每次一分钟，将反应板中的反应液加入到包被板中，37℃孵育两个小时。
(8)每孔加入终浓度为0.5μg/孔的anti-TNF-α一抗(abcam Anti-TNF alpha抗体，ab6671)，37℃孵育两个小时。
(9)PBST洗涤三次，每次一分钟，加入二抗(武汉三鹰，SA00001-2)，37℃孵育两个小时。
(10)PBST洗涤五次，每次一分钟，加入显色液，避光显色两个小时，每孔加入50μL2M H2SO4终止反应，使用酶标仪读取490nm处的吸光度值，根据下列公式计算抑制率：
Inhibition＝[(ODag-ODag/ab)/(ODag-ODpbs)]*100％；
其中，ODag表示没有加入抗体的阳性对照组的吸光度值；ODab表示加入了抗体的实验组的吸光度值；ODag/ab表示ODag与ODab的比值，ODpbs表示PBS阴性对照组的OD的吸光度值。
结果如图7所示，anti TNF-α纳米抗体VHH2及其突变体VHH2M3，均可有效抑制TNF-α与其受体的结合，这一现象在阴性对照中并未出现；此外，这种抑制效应与纳米抗体呈剂量依赖关系；突变体VHH2M3在同浓度下较亲本具有更好的抑制率。
实施例7：纳米抗体突变体中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性测定
CCK-8法检测VHH2及突变体中和hTNF-α对L929细胞的细胞毒性作用，步骤如下：
(1)使用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，在5％CO2,37℃的培养箱中培养L929细胞系(ATCC CCL-1TM)，待细胞生长至对数生长期后，收集细胞，计数，重悬制备细胞悬液；
(2)将2000个细胞接种到96孔板中，在5％CO2,37℃的培养箱中培养，过夜贴壁；
(3)另取反应板，加入梯度稀释的anti-TNF-α纳米抗体VHH2及其突变体VHH2M3，加入终浓度为1μg/mL的TNF-α和终浓度为1μg/mL的放线菌素D，37℃孵育两个小时，使用实验室保存的anti-CD47纳米抗体Nb02作为阴性对照，设置空白对照；
(4)弃去细胞培养板中的培养液，将反应板中的反应液加入到第一块板中，5％CO2,37℃培养24小时，使用CCK-8试剂盒测定活细胞数量，使用酶标仪读取570nm处的吸光度值，根据下列公式计算抑制率：
Inhibition＝[(ODag-ODag/ab)/(ODnc-ODag)]*100％；
其中，ODag表示没有加入抗体的阳性对照组的吸光度值；ODab表示加入了抗体的实验组的吸光度值；ODag/ab表示ODag与ODab的比值；ODnc表示阴性对照组的吸光度值。
结果如图8所示，anti TNF-α纳米抗体VHH2及其突变体VHH2M3，在不同浓度下均可有效抑制TNF-α对L929细胞系的细胞毒性，这一现象在阴性对照中并未出现；此外，抑制效应与抗体浓度呈现出剂量效力依赖关系；在同浓度下突变体VHH2M3较亲本具有更好的抑制效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 特异性结合TNF-α的纳米抗体及其用途
<130> IDC220128
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH2 VHH氨基酸序列
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<212> DNA
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<223> VHH2 VHH核苷酸序列
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ccggacagcg tgaaaggccg cttcaccatc agccgcgata acgccaagaa cacgctgtat 240
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<223> VHH2-M4 VHH氨基酸序列
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caagttcagc tggttgaaag cggcggtggt ctggttcagc cgggcggcag tctgcgtctg 60
agttgtgcgg cgagcggctt caccttcagc aactactgga tgtactgggt tcgccaagcc 120
ccgggcaaag gtctggagtg ggtgagcgtc atcaactgga acggtctgat caccaagtac 180
ccggacagcg tgaaaggccg cttcaccatc agccgcgata acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctcaa gccggaagat acggcgctgt actactgcgc ccgcagccca 300
agcggcttta atcgcggcca aggcacccaa gttaccgtta gcagc 345
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1（VHH2/VHH2-M1/VHH2-M2/VHH2-M3/VHH2-M4）
<400> 11
Asn Tyr Trp Met Tyr
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2（VHH2）
<400> 12
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2（VHH2-M1）
<400> 13
Met Ile Asn Phe Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2（VHH2-M2）
<400> 14
Met Ile Asn Trp Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2（VHH2-M3）
<400> 15
Gln Ile Asn Trp Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2（VHH2-M4）
<400> 16
Val Ile Asn Trp Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3（VHH2/VHH2-M1/VHH2-M2/VHH2-M3/VHH2-M4）
<400> 17
Ser Pro Ser Gly Phe Asn
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Met，Gln或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自Phe或Trp
<400> 18
Xaa Ile Asn Xaa Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR1
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR2
<400> 20
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR3
<400> 21
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR4
<400> 22
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 质粒上的上游引物
<400> 23
taaagctcat cagcgtggtc gtgaagcgat 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 质粒上的下游引物
<400> 24
cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc 30
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N31W-F
<400> 25
ggcttcacct tcagctggta ctggatgtac tgggttcgcc 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N31W-R
<400> 26
ccagtacatc cagtaccagc tgaaggtgaa gccgctcgcc 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N31F-F
<400> 27
ggcttcacct tcagctttta ctggatgtac tgggttcgcc 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N31F-R
<400> 28
ccagtacatc cagtaaaagc tgaaggtgaa gccgctcgcc 40
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50V-F
<400> 29
gagtgggtga gcgtcatcaa caccaacggt ctgat 35
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50V-R
<400> 30
gttggtgttg atgacgctca cccactccag acctt 35
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50I-F
<400> 31
gagtgggtga gcatcatcaa caccaacggt ctgat 35
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50I-R
<400> 32
gttggtgttg atgatgctca cccactccag acctt 35
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50Q-F
<400> 33
gagtgggtga gccaaatcaa caccaacggt ctgat 35
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50Q-R
<400> 34
gttggtgttg atttggctca cccactccag acctt 35
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50M-F
<400> 35
gagtgggtga gcatgatcaa caccaacggt ctgat 35
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E50M-R
<400> 36
atcagaccgt tggtgttgat catgctcacc cactc 35
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T53W-F
<400> 37
agcgagatca actggaacgg tctgatcacc aagta 35
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T53W-R
<400> 38
gatcagaccg ttccagttga tctcgctcac ccact 35
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T53F-F
<400> 39
agcgagatca acttcaacgg tctgatcacc aagta 35
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T53F-R
<400> 40
gatcagaccg ttgaagttga tctcgctcac ccact 35

Claims (35)

1.特异性结合TNF-α的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:15所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:14所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3；或，
(4)SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、以及SEQ ID NO:17所示的CDR3。
2.权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含驼源重链抗体的框架区或源自人免疫球蛋白的重链框架区。
3.权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:19所示的FR1、SEQ ID NO:20所示的FR2、SEQ ID NO:21所示的FR3、以及SEQ ID NO:22所示的FR4。
4.权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段的重链可变区(VHH)的序列如SEQ ID NOs:7、9、5、3任一项所示。
5.双特异性或多特异性抗体，其包含权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段。
6.权利要求5所述的双特异性或多特异性抗体，其中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合TNF-α，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
7.权利要求5所述的双特异性或多特异性抗体，其中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
8.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5-7任一项所述的双特异性或多特异性抗体。
9.载体，其包含权利要求8所述的核酸分子。
10.权利要求9所述的载体，其中，所述载体为克隆载体或表达载体。
11.宿主细胞，其包含权利要求8所述的核酸分子或权利要求9或10所述的载体。
12.制备权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5-7任一项所述的双特异性或多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求11所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性抗体。
13.缀合物，其包含权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5-7任一项所述的双特异性或多特异性抗体以及偶联部分。
14.权利要求13所述的缀合物，其中，所述偶联部分选自蛋白标签。
15.权利要求14所述的缀合物，其中，所述蛋白标签选自His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP。
16.权利要求13所述的缀合物，其中，所述偶联部分选自可检测的标记。
17.权利要求16所述的缀合物，其中，所述可检测的标记选自酶、放射性核素、荧光染料或生物素。
18.权利要求16所述的缀合物，其中，所述可检测的标记为化学发光物质。
19.权利要求13所述的缀合物，其中，所述偶联部分选自治疗剂。
20.权利要求19所述的缀合物，其中，所述治疗剂为抗炎药物或免疫抑制剂。
21.权利要求13所述的缀合物，其中，所述偶联部分选自生物活性多肽。
22.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求5-7任一项所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求8的分离的核酸分子、权利要求9或10的载体、权利要求11所述的宿主细胞、或权利要求13-21任一项所述的缀合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。
24.权利要求23所述的药物组合物，其中，另外的药学活性剂为抗炎药物或免疫抑制剂。
25.权利要求1-4任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求5-7任一项所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求8的分离的核酸分子、权利要求9或10的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求13-21任一项所述的缀合物、或权利要求22-24任一项所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗与TNF-α有关的疾病；所述与TNF-α有关的疾病为自身免疫性疾病。
26.权利要求25所述的用途，其中，所述与TNF-α有关的疾病选自炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、葡萄膜炎。
27.权利要求25所述的用途，其中，所述与TNF-α有关的疾病为克罗恩病或溃疡性结肠炎。
28.权利要求25所述的用途，其中，所述受试者为人。
29.权利要求25所述的用途，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。
30.权利要求29所述的用途，其中，所述另外的药学活性剂为抗炎药物或免疫抑制剂。
31.用于非诊断目的的检测TNF-α在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-4任一项的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求16-18任一项所述的缀合物。
32.权利要求31所述的方法，其中，所述方法是免疫学检测。
33.权利要求32所述的方法，其中，所述免疫学检测选自免疫印迹法、酶免疫测定法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
34.权利要求32所述的方法，其中，所述免疫学检测为化学发光免疫分析法。
35.权利要求1-4任一项的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求16-18任一项所述的缀合物在制备用于检测TNF-α在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与TNF-α有关的疾病的检测试剂中的用途；所述与TNF-α有关的疾病为自身免疫性疾病。
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