CN111699006B - Il17抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种抗体、其抗原结合片段，其以6×10‑9M以下的KD值与IL17蛋白相结合。所述的抗体、其抗原结合片段对于IL17蛋白的特异性识别结合能力强、可抑制IL17蛋白和IL17受体的结合和/或抑制免疫细胞分泌细胞因子。本申请还提供了所述的抗体、其抗原结合片段在治疗或预防与IL17的不当或过度产生相关的疾病中的用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种IL17抗体及其应用。
背景技术
白介素17(IL17)，亦称CTLA-8，是由T细胞产生的促炎细胞因子，可刺激各种非免疫细胞分泌各种各样的其他细胞因子。IL17主要由活化记忆T细胞产生并通过与遍布的细胞表面受体(IL17R)结合而发挥作用(Yao等，Cytokine，9，794-800(1997))。
IL17作为促炎细胞因子，其不当或过度的产生会导致多种疾病。例如，类风湿性关节炎(Witowski等，Cell Mol Life Sci，61：567-579(2004))、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥(Antonysamy等，J Immunol162，577-584(1999)；van Kooten等，J Am SocNephrol 9，1526-1534(1998))、败血症、败血症性或内毒素性休克、变态反应、哮喘(Molet等，JAllergy Clin Immunol 108，430-438(2001))、骨丢失、银屑病(Teunissen等，J.Invest Dermatol 111，645-649(1998))、局部缺血、系统性硬化症(Kurasawa等，Arthritis Rheum 43，2455-2463(2000))、中风和其他炎性病症。
已有研究显示，靶向IL-17的抗体(例如，secukinumab、Ixekizumab)可用于预防和/或治疗银屑病(例如，斑块状银屑病)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎等与IL17的不当或过度产生相关的疾病或病症。然而，仍然需要对IL17蛋白特异性识别结合能力强、可抑制IL17蛋白与IL17受体的结合和/或抑制免疫细胞分泌细胞因子的新型抗IL17抗体。
发明内容
本申请提供了一种IL17抗体、其抗原结合片段，其具有下列性质中的一种或多种：1)能够以较高的亲和力和特异性结合IL17蛋白；2)能够抑制IL17蛋白与IL17受体的结合，如IL17A蛋白或IL17F蛋白；3)能够抑制细胞因子，尤其是趋化因子(例如CXCL1)的表达；和4)能够用于治疗自身免疫疾病。本申请还提供所述IL17抗体、其抗原结合片段的制备方法和应用。
一方面，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段，其以6×10-9M或更低的KD值与IL17蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段其抑制IL17蛋白与IL17受体的结合。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，其抑制细胞因子的表达。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，所述细胞因子包括：白介素和趋化因子。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，所述趋化因子包括：CXCL1。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，其可缓解或治疗与IL17的不当或过度产生相关的疾病或病症。在某些实施方式中，所述疾病或病症包括：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包括：Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或VhH。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段，其与参比抗体竞争结合所述IL17蛋白，其中所述参比抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:40；所述LCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:41；以及，所述LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:6、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:131；且，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:37；所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:38；以及，所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:130。
在某些实施方式中，所述参比抗体的LCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96。在某些实施方式中，所述参比抗体的LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:102。
在某些实施方式中，所述参比抗体的HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。在某些实施方式中，所述参比抗体的HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:93；在某些实施方式中，所述参比抗体的HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:132；且，所述参比抗体的重链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:133。
在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:109。
在某些实施方式中，所述参比抗体的重链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120。
在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:136；且，所述参比抗体的重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:137。
在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:90、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:110。在某些实施方式中，所述参比抗体的重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:121。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:40。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段中所述LCDR1的氨基酸序列包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:41。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24和SEQID NO:131。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:102。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。在某些实施方式中，所述框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4选自以下组中任一项：人共有框架序列和人种系序列。
在某些实施方式中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:47。
在某些实施方式中，所述L-FR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:97。在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:48。在某些实施方式中，所述L-FR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:98。在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49。在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:50。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:132。
在某些实施方式中，所述轻链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:109。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区或鼠恒定区。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igκ或Igλ恒定区。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:136。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:110。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体重链或其片段。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:37。在某些实施方式中，所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR2，且所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:38。在某些实施方式中，所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:93。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:130。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR2和H-FR4。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组中任一项：人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:43。在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:44。在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:129、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:45。在某些实施方式中，所述H-FR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:99。在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:10、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:46。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:133。
在某些实施方式中，其中所述重链可变区VH包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区或鼠恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG恒定区。在某些实施方式中，IgG恒定区包含人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:137。
在某些实施方式中，所述重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:118和SEQ ID NO:121。
在某些实施方式中，所述IL7蛋白为人IL17蛋白。在某些实施方式中，所述IL7蛋白包括IL17A蛋白和/或IL17F蛋白。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得本申请所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。在某些实施方式中，其任选地包含收获所述抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。在某些实施方式中，所述疾病或病症包括：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
在某些实施方式中，其用于预防或治疗疾病或病症。在某些实施方式中，所述疾病或病症包括：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
另一方面，本申请提供了一种预防或治疗疾病的方法，其包括施用本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的宿主细胞和/或本申请所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
另一方面，本申请提供了一种抑制IL17蛋白和IL17配体结合的方法，其包括施用本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的宿主细胞和/或本申请所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种抑制IL17蛋白生物学活性的方法，其包括施用本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的宿主细胞和/或本申请所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了抑制趋化因子表达的方法，其包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的宿主细胞和/或本申请所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述趋化因子包括CXCL1。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1A-1C显示的是本申请中的IL17抗体的重链可变区和轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比。
图2A-2C显示的是本申请中的IL17抗体抑制IL17A蛋白与IL17受体的结合。
图3显示的是本申请中的IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HT-29细胞产生趋化因子CXCL1。
图4显示的是本申请中的IL17抗体与IL17F蛋白的结合活性。
图5显示的是本申请中的IL17抗体抑制IL17A蛋白与IL17蛋白受体的结合。
图6A-6C显示的是本申请中的IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HT-29细胞产生CXCL1。
图7A-7C显示的是本申请中的IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HS-27细胞产生IL-8。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“抗体”通常是指能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”在本文中可互换使用。基本的四链抗体单元是异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元连同额外的被称为J链的多肽组成，并包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个基本的四链单元，其可聚合形成与J链组合的多价装配物。在IgG的情况中，四链单元通常是约150，000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于H链的同种型。每个H和L链还具有规律间隔的链内二硫键。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每条α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定结构域(CH)。人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。与多克隆抗体制剂(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明该抗体的特征为从抗体的基本上同质的群中获得，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制成，包括例如杂交瘤法(例如，可参见Kohler和Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第二版1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas，563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(例如，可参见美国专利US4，816，567)、噬菌体展示技术(例如，可参见Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1992)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004))、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(例如，可参见WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol，7：33(1993)；美国专利US5，545，807；US5，545，806；US5，569，825；US5，625，126；US5，633，425和US5，661，016，Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnol.，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev Immunol，13：65-93(1995))。
在本申请中，术语“框架区”(FR)通常是指CDR残基之外的那些可变结构域残基。
在本申请中，术语“人共有框架”通常是指人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等指出的免疫目的蛋白序列(参见Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，国家健康研究所，Bethesda，MD(1991))中记载的亚型。实例包括，对于VL，该亚型可以是如Kabat等记载的亚型κI，κII，κIII或κIV。另外，对于VH，该亚型可以是如Kabat等记载的亚型I、亚型II或亚型III。备选地，可如上所述获得人共有框架，其中特定残基，如人框架残基基于其与供体框架的同源性进行选择，该选择通过将供体框架与多种人框架序列的集合的比对来进行。接纳体人框架“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含预先存在的氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目可以是10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下或2以下(例如，1个)。在某些实施方式中，所述的氨基酸序列的变化可以包括置换或删除指定残基，或在指定残基附近插入至少一个氨基酸残基。在指定残基“附近”插入的意思是在其邻近的一至两个残基内插入。插入可以在指定残基的N末端或C末端。在本申请中，所述氨基酸修饰可以是置换。
在本申请中，术语“单链抗体”(scFv)通常是指是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接子(linker)连接而成的分子。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指使用遗传工程技术将衍生自非人物种(例如小鼠或大鼠)的抗体、免疫球蛋白结合蛋白和多肽对人体的免疫原性降低，同时仍保留原始抗体的抗原结合特性的改造抗体。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.，Nature321:522(1986))；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen，et al.，1988 Science 239:1534-1536；Riechmann，et al.，1988 Nature 332:323-337；Tempest，et al.，Bio/Technol 19919:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen，et al.，1989 Proc Natl AcadSci USA 86:10029-10033；Co，et al.，1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co，et al.，1992 J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark，et al.，“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In:Metcalf B W，Dalton B J，eds.Cellular adhesion:moleculardefinition to therapeutic potential.New York:Plenum Press，1994:291-312)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指抗体所有全部(包括抗体的恒定区部分，CH和CL区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区和/或可变区。在某些实施方式中，所述抗原结合片段可包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或VhH。在某些实施方式中，本申请所述的抗体可包括双链抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。由木瓜蛋白酶消化具有完整结构的抗体后(例如，去除了Fc区和铰链区)而产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段。Fab片段由完整的轻链、重链可变区(VH)和重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即它具有单一的抗原结合位点。F(ab)2抗体片段最初作为成对的Fab片段产生，在它们之间有半胱氨酸相连接。由胃蛋白酶消化具有完整结构的抗体后产生单一的大的F(ab')2片段，其粗略地相当于两个通过二硫键相连具有不同的抗原结合活性的Fab片段，且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。
在本申请中，术语“IL17蛋白”通常是指白细胞介素17。迄今为止，已有六个IL17家族成员被发现:IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17E(亦命名为IL-25)和IL17F。IL17A是IL17家族的原型，IL17F与IL17A有最高的同源性(约50％)，而且其编码基因定位于染色体的同一区段6p12。例如，人IL17A的GenBank登记号可以为NP_002181。例如，所述IL17蛋白可包含参见UniProtKB数据库中登录号Accession No.Q16552所示的氨基酸序列。又例如，所述IL17F蛋白可包含参见NCBI数据库中登录号NP_443104.1所示的氨基酸序列。IL17家族成员以同源二聚体或异源二聚体的形式行使功能。IL17A是一个促炎症因子，跟IL-1Rs与TLRs受体类似，IL17A也通过激活NF-κB、MAPK诱导下游基因。IL17可以介导磷酸化级联反应来使C/EBPb失活。IL17蛋白可通过IL17RA的SEFIR-TILL结构域激活Erk。IL17蛋白与自身免疫疾病相关，如多发性/系统性硬化症(MS)、风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病(IBD)、银屑病、骨关节炎、骨植入物松动、强直性脊柱炎。IL17蛋白也与宿主防御相关，尤其在肺、肠、口腔等粘膜的位置(例如，中风、哮喘、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性、变态反应、局部缺血和内毒素性休克等)。IL-17蛋白能够诱导介导防御反应的IL-6、IL-1b、TNFα等促炎症因子。IL-17蛋白还能诱导促进多形核白细胞增殖与存活的细胞因子(G-CSF)及趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5)来调节嗜中性粒细胞。此外，IL-17蛋白还能通过诱导对淋巴细胞、树突状细胞及其它免疫细胞有趋化活性的蛋白(CXCL9、CXCL10、CCL20)将这些细胞靶向到粘膜表面；通过诱导CCL2与CCL7招募单核细胞。
在本申请中，术语“IL17受体”(IL17R)通常是指IL17受体家族的成员，包括IL17RA至IL17RE。例如，人IL17R的GenBank登记号可以为CAJ86450.1。所有的家族成员都是一型单次跨膜蛋白，具有保守结构基序，包括一个胞外的类纤维结合素III(fibronectin III-like)结构域和一个胞内的SEF/IL17R(SEFIR)结构域。IL17受体家族成员之间可组合为不同的受体复合物，其中IL17RA作为这个家族里迄今为止最大的分子，是至少四个配体的传递信号的通用亚基。近来研究表明，阻断PI3K通路能够上调IL17RA，这有可能增强IL17信号。
在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。所述细胞因子可具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。在本申请中，所述细胞因子可包括白细胞介素和趋化因子。例如，所述细胞因子为趋化因子。
在本申请中，术语“CXCL”通常是指CXC趋化因子家族配体。其包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL12、CXCL14等。其中CXCL1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1)由巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞表达，具有中性粒细胞趋化活性，CXCL1通过抑制少突胶质细胞前体的迁移在脊髓发育中起作用，并参与血管生成、动脉生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生过程。
在本申请中，术语“KD”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指哺乳动物中的机体(例如，细胞或其组成部分)在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的赘生物。在本申请中，肿瘤可以包括直肠腺癌。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。
在本申请中，当描述序列中氨基酸残基的取代时，表述“XnY”通常表示序列中第n位的残基X被残基Y取代。例如，氨基酸取代“R175L”表示，序列中第175位的残基R被残基L取代。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
抗体、其抗原结合片段
与参比抗体竞争结合
在某些实施方式中，本申请所述抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合所述IL17蛋白，其中所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述参比抗体的轻链可变区可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申请中，所述LCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:40；所述LCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:41；以及，所述LCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:131；且，所述参比抗体的重链可变区可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:37；所述HCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:38；以及，所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:130。
例如，所述参比抗体的LCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96。
例如，所述参比抗体的LCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:102。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。
例如，所述参比抗体的HCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:93。
例如，所述参比抗体的HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:132；且，所述参比抗体的重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:133。
例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:109。
例如，所述参比抗体的重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120。
例如，所述参比抗体的轻链可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:136；且，所述参比抗体的重链可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:137。
例如，所述参比抗体的轻链可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:110。
例如，所述参比抗体的重链可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:118和SEQ ID NO:121。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-008或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:16；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:15。例如，该参比抗体可包括抗体YN-008或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQID NO:64所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:62所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-008或与其具有相同的轻链及重链。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:22；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:23，LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:24；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:19；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:20；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:21。例如，该参比抗体可包括抗体YN-009或与其具有相同LCDR1-3和HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:34；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33。例如，该参比抗体可包括抗体YN-009或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:68所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:66所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-009或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:42；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-010或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:51。例如，该参比抗体可包括抗体YN-010或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:72所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:70所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-010或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-011或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:12；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-011或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:18；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:17。例如，该参比抗体可包括抗体YN-011或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:78所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:76所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-011或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:22；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:23；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:24；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:19；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:20；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:21。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-012或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:36；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35。例如，该参比抗体可包括抗体YN-012或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:84所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:82所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-012或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:42；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-013或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该参比抗体可包括抗体YN-013或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:53。例如，该参比抗体可包括抗体YN-013或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:90所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:88所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-013或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:102；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:100。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-065或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该参比抗体可包括抗体YN-065或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:103；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:105。例如，该参比抗体可包括抗体YN-065或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:104所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:106所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-065或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:102；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:101。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-066或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该参比抗体可包括抗体YN-066或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:103；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:107。例如，该参比抗体可包括抗体YN-066或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:104所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:108所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-066或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:91；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-067或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该参比抗体可包括抗体YN-067或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:111。例如，该参比抗体可包括抗体YN-067或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:110所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:112所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-067或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:95。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-068或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该参比抗体可包括抗体YN-068或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:114。例如，该参比抗体可包括抗体YN-068或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:110所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:115所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-068或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:92；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-069或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该参比抗体可包括抗体YN-069或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:117。例如，该参比抗体可包括抗体YN-069或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:110所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:118所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-069或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
例如，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与参比抗体竞争结合IL17蛋白(例如，人IL17蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:6；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:91；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:93；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，所述参比抗体可包括抗体YN-070或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。例如，所述参比抗体可包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:99；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该参比抗体可包括抗体YN-070或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:109；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:120。例如，该参比抗体可包括抗体YN-069或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:110所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:121所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-070或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
本申请所述抗体、其抗原结合片段
在一个方面，本申请提供了一种抗体、其抗原结合片段，其以6×10-9M以下(例如，所述KD的值可为不高于约6×10-9M、不高于约1×10-9M、不高于约9×10-10M、不高于约8×10-10M、不高于约7×10-10M、不高于约6×10-10M、不高于约5×10-10M、不高于约4×10-10M、不高于约3×10-10M、不高于约2×10-10M、不高于约1×10-10M或不高于约1×10-11M或以下)的KD值与IL17蛋白相结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可与IL17配体竞争对IL17蛋白的结合。在某些情形中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可抑制细胞因子的表达。例如，所述细胞因子可选自以下组：白介素和趋化因子。例如，所述趋化因子可以包含CXCL1。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段可缓解或治疗与IL17的不当或过度产生相关的疾病或病症。例如，所述疾病或病症可以选自以下组：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
本申请所述的IL17蛋白可包括人IL17A蛋白。例如，所述IL17蛋白可包含参见UniProtKB数据库中登录号Accession No.Q16552所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所述的IL17蛋白可包括IL17F蛋白(例如，人IL17F蛋白)。例如，所述IL17F蛋白可包含参见NCBI数据库中登录号NP_443104.1所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合片段可选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scfv和/或VhH。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含抗体轻链或其片段。在某些实施方式中，所述抗体包括：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。例如，所述抗体轻链或其片段可以包含人恒定区，所述人恒定区可包含人Igκ或Igλ恒定区。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段还可包括LCDR1-3。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:40。
在本申请中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列：
RSSQSLLHSNGYNYLX16(SEQ ID NO:126)；其中，X16＝D或E。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:4所示抗体的LCDR1相比，所述LCDR1至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X16处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:4所示抗体的LCDR1相比，所述抗体LCDR1至少包含在至少包含在X16处的氨基酸取代，其中，X16处的氨基酸可被取代为D或E。
例如，所述LCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:41。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3，所述LCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:131。
在本申请中，所述LCDR3可包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列：
QTWDX5X6TSKYV(SEQ ID NO:131)；其中，X5＝H或Y；X6＝G或W。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:42所示的抗体的LCDR3相比，所述LCDR3至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X5和/或X6处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:42所示的抗体的LCDR3相比，所述LCDR3包含在至少包含在X5和/或X6处的氨基酸取代，其中，X5处的氨基酸可被取代为H或Y，X6处的氨基酸可被取代为G或W。
例如，所述LCDR3可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:102。
在本申请所述的抗体、其抗原结合片段中，抗体轻链或其片段还可包括框架区L-FR1-4。在本申请中，所述框架区L-FR1-4可以选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
在本申请中，所述L-FR1的C末端可与所述LCDR1的N末端可直接或间接相连，所述L-FR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:47。
在本申请中，所述L-FR1可包含SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列：
DIVMTQSPLSLX12VTPGEPASISC(SEQ ID NO:127)；其中，X12＝P或H。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:11所示的抗体的L-FR1相比，所述L-FR1至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X12处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:11所示的抗体的L-FR1相比，所述L-FR1至少包含在至少包含在X12处的氨基酸取代，其中，X12处的氨基酸可被取代为P或H。
例如，所述L-FR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:97。
在本申请中，所述L-FR2可位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:48。
在本申请中，所述L-FR2可包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列：
WYLQKPGQSPQX12LIY(SEQ ID NO:128)；其中，X12＝L或P。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:12所示的抗体的L-FR2相比，所述L-FR2至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X12处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，与SEQ ID NO:12所示的抗体的L-FR2相比，所述L-FR2至少包含在至少包含在X12处的氨基酸取代，其中，X12处的氨基酸可被取代为L或P。
例如，所述L-FR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:98。
在本申请中，所述L-FR3可位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49。
在本申请中，所述L-FR4的N末端可与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:50。
本申请中，所述的抗体、其抗原结合片段中的抗体轻链或其片段可包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:132。
在某些实施方式中，所述轻链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:54、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:109。
在本申请中，所述抗体轻链可变区可包含SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列：
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDDLGSKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDDQRPSGIPER FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQTWDX92X93TSKYVFGPGTKLTVLG(SEQ ID NO:132)；其中，X92＝H或Y；X93＝G或W。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:54所示抗体的轻链可变区相比，所述抗体轻链可变区或其片段至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：在X92和/或X93处的氨基酸取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:54所示抗体的轻链可变区相比，所述抗体轻链可变区或其片段至少包含在X92和/或X93处的氨基酸取代，其中，X92处的氨基酸可被取代为H或Y；X93处的氨基酸可被取代为G或W。
例如，所述抗体轻链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:103。
在本申请中，所述抗体轻链可变区可包含SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列：
DIVMTQSPLSLX12VTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLX39WYLQKPGQSPQX51LIYLG SNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPTFGGGTKLEIKR；
其中，X12＝P或H；X39＝D或E；X51＝L或P。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:18所示抗体的轻链可变区相比，所述抗体轻链可变区或其片段可至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：在X12、X39和/或X51处的氨基酸取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:18所示抗体的轻链可变区相比，所述抗体轻链或其片段可至少包含在X12、X39和/或X51处的氨基酸取代，其中，X12处的氨基酸可被取代为P或H；X39处的氨基酸可被取代为D或E；X51处的氨基酸可被取代为L或P。
例如，所述抗体轻链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:109。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段还可包含人恒定区或鼠恒定区。在本申请中，所述人恒定区可包括人Igκ或Igλ恒定区。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:136。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:110。在某些实施方式中，所述抗体轻链结合片段(例如，所述抗原结合片段可为Fab)可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:110。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列：
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDDLGSKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDDQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQTWDX92X93TSKYVFGPGTKLTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:136)。
其中，X92＝H或Y；X93＝G或W。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:90所示抗体的轻链相比，所述抗体轻链或其片段至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：在X92和/或X93处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:90所示抗体的轻链相比，所述抗体轻链或其片段至少包含在X92和/或X93处的氨基酸取代，其中，X92处的氨基酸可被取代为H或Y；X93处的氨基酸可被取代为G或W。
例如，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:104。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含SEQ ID NO:138所示的氨基酸序列：
DIVMTQSPLSLX12VTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLX39WYLQKPGQSPQX51LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:138)。
其中，X12＝P或H；X39＝D或E；X51＝L或P。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:78所示抗体的轻链相比，所述抗体轻链或其片段至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：在X12、X39和/或X51处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:78所示抗体的轻链相比，所述抗体轻链或其片段至少包含在X12、X39和/或X51处的氨基酸取代，其中，X12处的氨基酸可被取代为P或H；X39处的氨基酸可被取代为D或E；X51处的氨基酸可被取代为L或P。
例如，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:110。
在本申请中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含抗体重链或其片段，所述重链或其片段可包括HCDR1-3。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含HCDR1，所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:37。在某些实施方式中，所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。
在本申请中，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列：
DYAX4X5(SEQ ID NO:123)；其中，X4＝M或I；X5＝S或N。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1所示抗体的HCDR1相比，所述HCDR1至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：
(1)在X5处的氨基酸的取代；
(2)在X4和/或X5处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1所示抗体的HCDR1相比，所述HCDR1至少包含在X5处的氨基酸取代，其中，X92处的氨基酸可被取代为M或I。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1所示抗体的HCDR1相比，所述HCDR1至少包含在X4和/或X5处的氨基酸取代，其中，X92处的氨基酸可被取代为M或I，X5处的氨基酸可被取代为S或N。
例如，所述HCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含HCDR2，所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:38。在某些实施方式中，所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:93。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列：
FIRSKAYGGTTEYAX15SVKG(SEQ ID NO:124)；其中，X15＝T或A。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示抗体的HCDR2相比，所述HCDR2至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：在X15处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示抗体的HCDR2相比，所述HCDR2至少包含在X15处的氨基酸取代，其中，X15处的氨基酸可被取代为T或A。
例如，所述HCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:93。
在本申请中，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:130。在本申请中，所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
在本申请中，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:125所示的氨基酸序列：
DGSDX5IRYX9DWLFNYWYFDL(SEQ ID NO:125)；其中，X5＝G或E，X9＝F或L。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:3所示抗体的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：
(1)在X5处的氨基酸的取代；
(2)在X5和/或X9处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:3所示抗体的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在X5处的氨基酸取代，其中，X5处的氨基酸可被取代为G或E。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:3所示抗体的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在X5和/或X9处的氨基酸取代，其中，X5处的氨基酸可被取代为G或E，X9处的氨基酸可被取代为F或L。
例如，所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95。
在本申请中，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列：
GX2X3SX5X6X7FDY(SEQ ID NO:130)。
其中X2＝R或G；X3＝Y或N；X5＝G或D；X6＝W或F；X7＝Y或N。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:39所示抗体的重链相比，所述HCDR3可至少包含在选自以下任一组的氨基酸取代：
(1)在X2、X3、X5和/或X7处的氨基酸的取代；
(2)在X3、X6和/或X7处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:39所示抗体的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在X5处的氨基酸取代，其中，X2处的氨基酸可被取代为R或G，X3处的氨基酸可被取代为Y或N，X5处的氨基酸可被取代为G或D，X7处的氨基酸可被取代为Y或N。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:39所示抗体的HCDR3相比，所述抗体HCDR3可至少包含在X3、X6和/或X7处的氨基酸取代，其中，X3处的氨基酸可被取代为Y或N，X6处的氨基酸可被取代为W或F，X7处的氨基酸可被取代为Y或N。
例如，所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段中的抗体重链或其片段还可以包括框架区H-FR1-4。在本申请中，所述框架区可以选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端可与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:43。
在某些实施方式中，所述H-FR2可位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:44。
在某些实施方式中，所述H-FR3可位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:45。例如，所述H-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:99。
在本申请中，所述H-FR3可包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列：
RFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTX23DTAVYYCAR(SEQ ID NO:129)；其中X23＝E或Q。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:9所示抗体的H-FR3相比，所述H-FR3至少包含在选自以下的氨基酸取代：在X23处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:9所示抗体的H-FR3相比，所述H-FR3至少包含在X5处的氨基酸取代，其中，X23处的氨基酸可被取代为E或Q。
例如，所述H-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:99。
在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端可与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:46。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:133。在某些实施方式中，所述重链可变区VH可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120。
在本申请中，所述抗体重链可变区可包含SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列：
QVTLKESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNHMSWVRQAPGKGLEWVSIIYSDGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGX99X100SX102X103X104FDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:133)；其中X99＝R或G；X100＝Y或N；X102＝G或D；X103＝W或F；X104＝Y、N或S。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:53所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在选自以下至少一种的氨基酸取代：
(1)在X99，X100，X102和/或X104处的氨基酸的取代；
(2)在X100，X103和/或X104处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:53所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X99，X100，X102和/或X104处的氨基酸取代，其中，X99处的氨基酸可被取代为R或G，X100处的氨基酸可被取代为Y或N，X102处的氨基酸可被取代为G或D，X103处的氨基酸可被取代为W或F，X104处的氨基酸可被取代为Y或N。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:53所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X100，X103和/或X104处的氨基酸取代，其中，X100处的氨基酸可被取代为Y或N，X103处的氨基酸可被取代为W或F，X104处的氨基酸可被取代为Y或S。
例如，所述抗体重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107。
在本申请中，所述抗体重链可变区可包含SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDYAX34X35WFRQAPGKGLEWVGFIRSKAYGGTTEYAX54SVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTX91DTAVYYCARDGSDX105IRYX109DWLFNYWYFDLWGRGTLVTVSS(SEQID NO:135)，其中X34＝M或I；X35＝S或N；X54＝A或T；X91＝E或Q；X105＝G或E；X109＝F或L。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:17所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区至少包含在选自以下至少一种的氨基酸取代：
(1)在X35和/或X105处的氨基酸的取代；
(2)在X105和/或X109处的氨基酸的取代；
(3)在X34、X35和/或X105处的氨基酸的取代；
(4)在X35、X91和/或X105处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:17所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:17所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X105和/或X109处的氨基酸取代，其中，X105处的氨基酸可被取代为G或E，X109处的氨基酸可被取代为F或L。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:17所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X34、X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X34处的氨基酸可被取代为M或I，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:17所示抗体的重链可变区相比，所述重链可变区可至少包含在X34、X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X91处的氨基酸可被取代为E或Q，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
例如，所述抗体重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120。
在本申请所述的抗体、其抗原结合片段中，所述抗体重链或其片段还可以包含人恒定区，且所述人恒定区可以包括人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:137。
在某些实施方式中，所述重链可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQID NO:118和SEQ ID NO:121。在某些实施方式中，所述抗体重链的抗原结合片段(例如，所述抗原结合片段可为Fab)可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:122。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含SEQ ID NO:137所示的氨基酸序列：
QVTLKESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNHMSWVRQAPGKGLEWVSIIYSDGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGX99X100SX102X103X104FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:137)。
其中X99＝R或G；X100＝Y或N；X102＝G或D；X103＝W或F；X104＝Y、N或S。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:88所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在选自以下至少一种的氨基酸取代：
(1)在X99，X100，X102和/或X104处的氨基酸的取代；
(2)在X100，X103和/或X104处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:88所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X99，X100，X102和/或X104处的氨基酸取代，其中，X99处的氨基酸可被取代为R或G，X100处的氨基酸可被取代为Y或N，X102处的氨基酸可被取代为G或D，X103处的氨基酸可被取代为W或F，X104处的氨基酸可被取代为Y或N。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:88所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X100，X103和/或X104处的氨基酸取代，其中，X100处的氨基酸可被取代为Y或N，X103处的氨基酸可被取代为W或F，X104处的氨基酸可被取代为Y或S。
例如，所述抗体重链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含SEQ ID NO:139所示的氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDYAX34X35WFRQAPGKGLEWVGFIRSKAYGGTTEYAX54SVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTX91DTAVYYCARDGSDX105IRYX109DWLFNYWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:139)。
其中X34＝M或I；X35＝S或N；X54＝A或T；X91＝E或Q；X105＝G或E；X109＝F或L。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:76所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在选自以下至少一种的氨基酸取代：
(1)在X35和/或X105处的氨基酸的取代；
(2)在X105和/或X109处的氨基酸的取代；
(3)在X34、X35和/或X105处的氨基酸的取代；
(4)在X35、X91和/或X105处的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:76所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:76所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X105和/或X109处的氨基酸取代，其中，X105处的氨基酸可被取代为G或E，X109处的氨基酸可被取代为F或L。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:76所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X34、X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X34处的氨基酸可被取代为M或I，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO:76所示抗体的重链相比，所述抗体重链或其片段可至少包含在X34、X35和/或X105处的氨基酸取代，其中，X35处的氨基酸可被取代为S或N，X91处的氨基酸可被取代为E或Q，X105处的氨基酸可被取代为G或E。
例如，所述抗体重链或其片段可包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:121。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3。例如，所述抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-008或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:16；且其重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:15。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-008或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:64所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:62所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-008或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:22；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:23；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:24；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:19；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:20；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:21。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-009或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:34；且其重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-009或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-009或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:42；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-010或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:52；且其可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:51。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-010或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-010或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-011或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:12；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-011或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:18；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:17。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-011或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:78所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-011或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:22；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:23；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:24；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:19；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:20；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:21。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-012或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:29；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:25；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:26；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:27；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:28。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-012或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:36；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-012或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:84所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-012或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:42；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-013或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-013或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:53。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-013或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:90所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-013或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:102；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:100。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-065或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-065或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:103；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:105。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-065或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQID NO:104所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:106所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-065或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:40；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:102；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:38；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:101。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-066或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:48；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:49；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:43；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:44；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:45；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-066或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:103；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:107。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-066或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQID NO:104所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:108所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-066或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:91；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-067或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-067或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:111。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-067或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:110所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-067或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:95。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-068或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-068或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:114。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-068或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:110所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:115所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-068或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:92；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:2；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-069或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-069或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:117。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-069或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:110所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:118所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-069或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:96；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:91；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO:93；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:94。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-070或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。本申请所述的抗体、其抗原结合片段中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:97；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:98；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:99；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-070或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:109；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:120。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-070或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:110所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示。例如，该抗体、其抗原结合片段可包括抗体YN-070或与其具有相同的轻链及重链的抗体。
在本申请中涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CD38蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CD38蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体、其抗原结合片段。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体、其抗原结合片段，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述宿主细胞可以为COS、CHO、NSO、sf9、sf21、DH5a、BL21(DE3)或TG1。
在另一个方面，本申请提供了制备本申请所述的抗体、其抗原结合片段的方法。所述方法可包括，在使得所述抗体、其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括收获(例如分离和/或纯化)，本申请所述的抗体、其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体、其抗原结合片段。例如，还可以通过使用高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
药物组合物、应用
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗体、其抗原结合片段，以及任选地药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制或延缓疾病或病症的发展或进展，和/或可以减轻和/或稳定疾病或病症的状态。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗体、其抗原结合片段。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了所述抗体、其抗原结合片段在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
另一方面，本申请提供的所述抗体、其抗原结合片段，可用于预防或治疗疾病或病症。另一方面，本申请提供了预防或治疗疾病或病症的方法，其包括施用(例如，向有需要的受试者施用)本申请所述的抗体、其抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述疾病或病症可选自以下组：强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥、呼吸道炎症、炎性肠病、败血症、败血症性或内毒素性休克、骨丢失、银屑病、变态反应、局部缺血、系统性硬化症、中风和哮喘。
另一方面，本申请提供了抑制IL17蛋白与IL17配体结合的方法，其包括施用本申请所述的抗体、其抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如，所述方法可以为体外或离体方法。
另一方面，本申请提供了抑制IL17蛋白生物学活性的方法，其包括施用本申请所述的抗体、其抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如，所述方法可以为体外或离体方法。
另一方面，本申请提供了抑制趋化因子表达的方法，其包括施用所述的抗体、其抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如，所述的趋化因子可以包括CXCL1。例如，所述方法可以为体外或离体方法。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
下面显示的实施例意在说明本发明的具体实施方案，并且不意在以任何方式限制本说明书或权利要求书的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)MolecμLarCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1利用噬菌体抗体文库筛选抗IL17抗体
利用重组人IL17A蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)为抗原用于噬菌体天然人源性抗体文库(原能细胞医学技术有限公司)分选。酶联免疫管中使用CBS缓冲液包被抗原IL17A蛋白1ml，IL17A蛋白的浓度为20μg/ml(第一、二轮)或10μg/ml(第三、四轮)，4℃过夜；次日用含10％的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管；将1ml的封闭过的噬菌体加入到免疫管中，室温孵育1h；PBST洗涤10次(第一、二轮)或15次(第三、四轮)；加入pH2.2的Gly-HCl缓冲液800μL洗脱，立即加400μL的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和；加入到20ml对数生长期OD约0.8的E.coli SS320中，混匀37℃静置1h；取出500μL用来测定噬菌体滴度及甘油保菌；剩余菌液涂平板，培养箱中37℃过夜培养；第二天刮下平板的菌，按一定比例接入80ml的2YT-Amp培养基中，使OD等于0.2，培养数小时以OD达到0.8时，加入160μL的helper噬菌体，然后混匀37℃静置1h；加入IPTG、卡那霉素，250rpm，30℃，振荡培养过夜；收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中；重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选，4轮淘洗之后，观察到显著的富集。利用ELISA对淘选得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定：在96孔ELISA板上包被人IL17A蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司，12047-HNAS)，浓度1μg/ml，4℃过夜。然后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，37℃孵育2小时。充分洗涤后，加入(GE healtcare，27-9421-01)，37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值。
通过ELISA鉴定获得了3株能特异性结合人IL17A的噬菌体抗体克隆1F10、1B6、1F3。
实施例2抗IL17A全人源完整抗体的表达和纯化
将噬菌体抗体克隆1F10重新设计成完整IgG1，κ抗体：设计引物对噬菌体抗体的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NEM载体；设计引物对噬菌体抗体的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-κ载体。测序正确后将重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化，将1F10的完整IgG1，κ抗体命名为YN-008。
将噬菌体抗体1B6、1F3分别重新设计成完整IgG1，κ抗体，并进行表达纯化，表达纯化的方法与1F10相同。将1B6的完整IgG1，κ抗体命名为YN-009；将1F3的完整IgG1，κ抗体命名为YN-010。
使用确定CDR区的Kabat系统分析YN-008、YN-009和YN-010的VH序列和VL序列，从而确定H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3以及L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列。
测序结果显示，抗IL17A全人源抗体YN-008的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示；抗体YN-008的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；对应的核苷酸序列如SEQID NO.55所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.61所示。
抗IL17A全人源抗体YN-009的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.67所示；抗体YN-009的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQID NO.21所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
抗IL17A全人源抗体YN-010的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41和SEQ ID NO.42所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.71所示；抗体YN-010的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38和SEQID NO.39所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示。
实施例3：抗IL17A全人源抗体YN-008、YN-009、YN-010的种系形式(germlinedversion)
将抗IL17A全人源抗体YN-008重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列对比，证实YN-008的重链利用来自人种系IGHV3-49*03的VH节段、来自人种系IGHD3-9*01的D节段以及来自人种系IGHJ2*01的JH节段。
将YN-008轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列对比，证实YN-008轻链利用来自人种系IGKV2-28*01的VL节段，来自人种系IGKJ4*01的JL节段。
将抗IL17A全人源抗体YN-009重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列对比，证实YN-009重链利用来自人种系IGHV1-46*01的VH节段、来自人种系IGHD3-22*01的D节段及来自人种系IGHJ3*02的JH节段。
将YN-009轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列对比，证实YN-009轻链利用来自人种系IGKV3-1*01的VL节段，来自人种系IGLJ1*01的JL节段。
将抗IL17A全人源抗体YN-010重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列对比，证实YN-010重链利用来自人种系IGHV3-53*01的VH节段、来自人种系IGHD6-19*01的D节段及来自人种系IGHJ4*02的JH节段。
将YN-010轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列对比，证实YN-010轻链利用来自人种系IGLV3-1*01的VL节段，来自人种系IGLJ1*01的JL节段。
(1)为了使YN-008的免疫原性最小化，可将一些氨基酸残基突变回到种系序列。YN-011是YN-008的一种种系形式(germlined version)，其通过将YN-008重链可变区的FR1区中的3个氨基酸返回为种系序列，并且将YN-008轻链可变区中FR1区中1个氨基酸回复为种系序列而制备(参见图1A)。抗IL17A全人源抗体YN-011的重链表达载体在上述构建的YN-008的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。YN-011轻链表达载体是在YN-008轻链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。
结果显示，YN-011的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.77所示；YN-011的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.73所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示。
YN-011抗体的表达、纯化的方法步骤参照YN-008抗体。
(2)为了使YN-009的免疫原性最小化，可将一些氨基酸残基突变回到种系序列。YN-012是YN-009的一种种系形式(germlined version)，其通过将YN-009重链可变区的FR1区中的2个氨基酸返回为种系序列，并且将YN-009轻链可变区中FR2区中1个氨基酸恢复为种系序列而制备(参见图1B)。抗IL17A全人源抗体YN-012的重链表达载体在上述构建的YN-009的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。YN-012轻链表达载体是在YN-009轻链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。
结果显示，YN-012的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.83所示；YN-012的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.79所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
YN-012抗体的表达、纯化的方法步骤参照YN-008抗体。
(3)为了使YN-010的免疫原性最小化，可将一些氨基酸残基突变回到种系序列。YN-013是YN-010的一种种系形式(germlined version)，其通过将YN-010重链可变区的FR1区中的1个氨基酸和FR3区中的1个氨基酸返回为种系序列，以及将YN-010轻链可变区中FR1区中1个氨基酸、FR2区中3个氨基酸、FR3区中1个氨基酸返回为种系序列而制备(参见图1C)。抗IL17A全人源抗体YN-013的重链表达载体在上述构建的YN-010的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。YN-013轻链表达载体是在YN-010轻链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。
结果显示，YN-013的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.90所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.89所示；YN-013的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示；对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.85所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示；对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；
YN-013抗体的表达、纯化的方法步骤参照YN-008抗体。
实施例4：IL17抗体的结合亲和力检测
通过使用Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)测量IL17抗体YN-008、YN-009、YN-010、YN-011、YN-012和YN-013针对重组人IL17A蛋白的结合亲和力。首先，用生物素(EZ-Link SμLfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人IL17A蛋白。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪，来进行抗原抗体之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原与SA传感器固定，1500rpm/min，结合10分钟；然后再与对倍稀释的抗体溶液(100nM-0nM)结合10min，1500rpm/min。最后进行解离10分钟，1500rpm/min。残留的抗体将通过甘氨酸脉冲再生。得到的结果将通过octet Data Analysis 9.0软件(fortebio)进行数据分析，来计算出抗原与抗体的结合强度，得到KD值、Ka(1/Ms)值和Kd(1/s)值(R2值>0.95为可信结果)。
测得的结果参见表1。
表1 IL17抗体与人IL17A的亲和力
实施例5：IL17抗体抑制人IL17A蛋白和人IL17R之间的结合
使用Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)评估IL17抗体YN-008、YN-009、YN-010、YN-011、YN-012、YN-013阻断人IL17A和人IL17受体结合的能力。首先，用生物素(EZ-Link SμLfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人IL17RA/Fc蛋白(北京百普赛斯生物科技有限公司，H5257)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪，来进行IL17抗体抑制人IL17A蛋白和人IL17受体之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为100nM经过生物素偶联的重组的人IL17RA与SA传感器固定，1500rpm/min，结合10min；终浓度100nM的人IL17A蛋白与三倍比稀释的抗体溶液(2000nM-0nM)混合，孵育60分钟后上机结合10分钟，1500rpm/min。最后进行解离10分钟，1500rpm/min。残留的抗原抗体复合物将通过甘氨酸脉冲再生。得到的结果将通过octet Data Analysis 9.0软件(fortebio)进行数据分析，来计算出抗体对抗原与配体的抑制强度。结果参见图2，其中图2A-2C依次显示IL17抗体YN-011、YN-012、YN-013抑制人IL17A蛋白和人IL17受体结合的结果，横坐标为该抗体的浓度(单位Log nM)，纵坐标为RU值。图2的结果显示，IL17抗体YN-011、YN-012和YN-013可有效抑制人IL17A蛋白与人IL17受体结合。
实施例6：IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HT-29细胞产生趋化因子CXCL1
HT-29细胞是人结直肠腺癌上皮细胞(中科院上海细胞库)，其天然表达IL17受体。HT-29细胞与人IL17A蛋白一起温育会导致趋化因子CXCL1的产生，所述CXCL1可以使用ELISA进行检测。
2×105个/ml的HT-29细胞加入96孔板中，在37℃培养12小时。将2nM的IL17A与梯度浓度的IL17抗体(YN-011、YN-012或YN-013)或对照抗体(IgG Fc)的混合物在37℃温育1小时后加入到以上96孔板中，与HT-29细胞在37℃共温育48小时，然后用CXCL1的ELISA试剂盒(R&D公司)检测细胞培养上清中的CXCL1的水平。结果参见图3，横坐标为抗体的浓度，纵坐标则为CXCL1的浓度。图3的结果显示，IL17抗体YN-011、YN-012、YN-013可有效抑制HT-29细胞产生趋化因子CXCL1。
实施例7：与IL-17F蛋白的交叉结合活性
将IL-17F蛋白(ACRObiosystems公司产品)用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释成2μg/ml，50μL/孔，4℃包被过夜。5％脱脂奶室温封闭2小时后，分别加入不同浓度的各IL-17抗体，50μL/孔，室温孵育2小时。弃上清液，PBST洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的羊抗人IgG单抗(KPL公司产品)，50μL/孔，室温孵育45min。PBST充分洗涤后，TMD显色后，置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK公司)中测定450nm吸光度(OD450)值。实验结果如图4所示，结果表明抗体YN008和YN011能交叉结合IL17F蛋白。
实施例8：IL-17抗体YN013的亲和力成熟
设计引物利用重叠PCR构建IL-17抗体YN-013的单链抗体(scFv)基因，并将其克隆到pDF噬菌粒载体，记作pDF-YN-013scFv。以pDF-YN-013scFv为模板设计简并引物利用重叠PCR对抗体YN-013的六个CDR区(图1C)分别进行随机化。
将重叠PCR获得的CDR区随机化后的scFv基因片段用BssHII和NheI双酶切后，与经BssHII和NheI双酶切的pDF噬菌粒载体连接，将1μg连接产物电穿孔转入TG1电转感受态细胞中，倍比稀释后凃2YT+AG平板，次日将菌苔从平板上刮下，扩大至300ml 2YT+Amp培养基，37℃培养至OD 0.8左右，加入helper phage混匀后静置1小时，加入终浓度为1mM IPTG，50μg/ml的卡那霉素，30℃振摇过夜。次日离心收上清，0.45滤膜过滤除菌，加入1/5体积的PEG-NaCl沉淀phage，离心取沉淀，1/10体积的PBS重悬沉淀，测OD260计算噬菌体pfu，4℃保存，该噬菌体抗体库可直接用于后期淘选。
利用重组人IL17A蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)为抗原用于以上噬菌体抗体库分选。酶联免疫管中使用CBS缓冲液包被抗原1ml，抗原浓度为100nM(第一、二轮)或5nM(第三轮)，4℃过夜；次日用含10％的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管；将1ml的封闭过的phage加入到免疫管中，室温孵育1h；PBST洗涤20次(第一轮)、50次(第二轮)或100次(第三轮)；加入pH2.2的Gly-HCl缓冲液800μl洗脱，立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和；加入到20ml对数生长期OD约0.8的E.coli TG1中，混匀37℃静置1h；取出500μl用来测定噬菌体滴度及甘油保菌；剩余菌液涂平板，培养箱中37℃过夜培养；第二天刮下平板的菌，按一定比例接入80ml的2YT-Amp培养基中，使OD等于0.2，培养数小时以OD达到0.8时，加入160μl的helper phage，然后混匀37℃静置1h；加入IPTG、Kan抗生素，250rpm，30℃，振荡培养过夜；收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中；重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选，3轮淘选之后，观察到显著的富集。利用ELISA对淘选得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定：在96孔ELISA板上包被人IL17A蛋白，浓度1μg/ml，4℃过夜。然后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，37℃孵育2小时。充分洗涤后，加入HRP标记的抗M13抗体(GE healtcare，27-9421-01)，37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值，选择OD450值高的噬菌体抗体克隆进行测序。获得各噬菌体抗体克隆的重、轻链可变区基因序列后，将各噬菌体抗体重新设计成全长IgG1，κ抗体：设计引物对各噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NDL抗体重链表达载体；设计引物对各噬菌体抗体克隆的的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-κ抗体轻链表达载体。测序正确后分别将各抗体的重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过ProteinA柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCAProtein Assay Kit定量(Pierce，23225)。
通过使用Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)测量IL17抗体针对重组人IL17A蛋白的结合亲和力。首先，用生物素(EZ-Link SμLfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人IL17A-Fc蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪，来进行抗原抗体之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原与SA传感器固定，1500rpm/min，结合5分钟；然后再与对倍稀释的抗体溶液(100,50，25，12.5，6.25，3.125，1.56nM)结合5min，1500rpm/min。最后进行解离10分钟，1500rpm/min。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。经过多轮筛选和组合，将亲和力最高的2个YN-013抗体突变体克隆分别命名为YN-065抗体、YN-066抗体。这2个抗体通过以上方法测定获得的亲和力数值参见表2。亲和力数据显示YN-065和YN-066的亲和力分别为secukinumab的14倍和12倍。
表2 IL-17抗体与人IL-17A的亲和力
YN-065抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.104所示；YN-065抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.105所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.106所示；
YN-066抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.104所示；YN-066抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.107所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.108所示；
实施例9：IL-17抗体YN011的亲和力成熟
设计引物利用重叠PCR构建IL-17抗体YN-011的单链抗体(scFv)基因，并将其克隆到pDF噬菌粒载体，记作pDF-YN-011scFv。以pDF-YN-011scFv为模板设计引物通过随机突变试剂盒(Agilent，Cat.200552)对scFv序列进行随机化。
将随机化后的scFv基因片段用BssHII和NheI双酶切后，与经BssHII和NheI双酶切的pDF噬菌粒载体连接，将1μg连接产物电穿孔转入TG1电转感受态细胞中，倍比稀释后凃2YT+AG平板，次日将菌苔从平板上刮下，扩大至300ml 2YT+Amp培养基，37℃培养至OD 0.8左右，加入helper phage混匀后静置1小时，加入终浓度为1mM IPTG，50μg/ml的卡那霉素，30℃振摇过夜。次日离心收上清，0.45滤膜过滤除菌，加入1/5体积的PEG-NaCl沉淀phage，离心取沉淀，1/10体积的PBS重悬沉淀，测OD260计算噬菌体pfu，4℃保存，该噬菌体抗体库可直接用于后期淘选。
利用重组人IL17A蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)为抗原用于以上噬菌体抗体库分选。酶联免疫管中使用CBS缓冲液包被抗原1ml，抗原浓度为100nM(第一、二轮)或5nM(第三轮)，4℃过夜；次日用含10％的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管；将1ml的封闭过的phage加入到免疫管中，室温孵育1h；PBST洗涤20次(第一轮)、50次(第二轮)或100次(第三轮)；加入pH2.2的Gly-HCl缓冲液800μl洗脱，立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和；加入到20ml对数生长期OD约0.8的E.coli TG1中，混匀37℃静置1h；取出500μl用来测定噬菌体滴度及甘油保菌；剩余菌液涂平板，培养箱中37℃过夜培养；第二天刮下平板的菌，按一定比例接入80ml的2YT-Amp培养基中，使OD等于0.2，培养数小时以OD达到0.8时，加入160μl的helper phage，然后混匀37℃静置1h；加入IPTG、Kan抗生素，250rpm，30℃，振荡培养过夜；收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中；重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选，3轮淘选之后，观察到显著的富集。利用ELISA对淘选得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定：在96孔ELISA板上包被人IL17A蛋白，浓度1μg/ml，4℃过夜。然后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，37℃孵育2小时。充分洗涤后，加入HRP标记的抗M13抗体(GE healtcare，27-9421-01)，37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值，选择OD450值高的噬菌体抗体克隆进行测序。获得各噬菌体抗体克隆的重、轻链可变区基因序列后，我们将各噬菌体抗体重新设计成Fab片段：设计引物分别对噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增和对抗体重链表达载体pCMV-IgG1NDL上第一个抗体重链恒定区进行PCR扩增，通过重叠PCR构建VHCH1基因片段并将其通过重组克隆至经AgeI和BamH1双酶切的pCMV-IgG1NDL抗体重链表达载体；设计引物对各噬菌体抗体克隆的的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-κ抗体轻链表达载体。测序正确后分别将各Fab片段的重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过Protein G柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCA Protein Assay Kit定量(Pierce，23225)。通过Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)测量IL17抗体Fab片段针对重组人IL17A蛋白的结合亲和力。首先，用生物素(EZ-Link SμLfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人IL17A-Fc蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪，来进行抗原抗体之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原与SA传感器固定，1500rpm/min，结合5分钟；然后再与对倍稀释的抗体溶液(100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56nM)结合5min，1500rpm/min。最后进行解离10分钟，1500rpm/min。得到的结果将通过octet Data Analysis 9.0软件(fortebio)进行数据分析，来计算出抗原与抗体的结合强度，得到KD值、Ka(1/Ms)值和Kd(1/s)值。经过多轮筛选和组合，将亲和力最高的4个YN-011抗体突变体Fab分别命名为YN-067Fab、YN-068Fab、YN-069Fab、YN-070Fab。这4个Fab片段通过以上方法测定获得的亲和力数值参见表3。
YN-067Fab的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；YN-067Fab抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示。
YN-068Fab的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；YN-068Fab抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示。
YN-069Fab的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；YN-069Fab抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示。
YN-070Fab的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；YN-070Fab抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示。
我们还参照以上方法构建、表达、纯化了IL-17抗体secukinumab的Fab片段，命名为secukinumab-Fab，并通过上述亲和力测定方法测定了secukinumab-Fab的亲和力，亲和力数值参见表3。亲和力数据表明YN-067Fab、YN-068Fab、YN-069Fab、YN-070Fab的亲和力分别为secukinumab-Fab的8.8、3.0、8.4、27倍。
表3 IL-17抗体Fab片段与人IL-17A的亲和力
将噬菌体抗体重新设计成全长IgG1,κ抗体的方法如下：设计引物对各噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NDL抗体重链表达载体；设计引物对各噬菌体抗体克隆的的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-κ抗体轻链表达载体。测序正确后分别将各抗体的重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过Protein A柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCA ProteinAssay Kit定量(Pierce，23225)。YN-067-Fab、YN-068-Fab、YN-069-Fab、YN-070-Fab各自对应的全长IgG1,κ抗体分别命名为YN-067、YN-068、YN-069、YN-070。
YN-067抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.110所示；YN-067抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.111所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示。
YN-068抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.110所示；YN-068抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.114所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示。
YN-069抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.110所示；YN-069抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示。
YN-070抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.110所示；YN-070抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示。
实施例10：IL17抗体抑制人IL17A蛋白和人IL17R之间的结合
使用Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)评估IL17抗体YN-065、YN-066、YN-067、YN-068、YN-069、YN-070阻断人IL17A和人IL17受体结合的能力。首先，用生物素(EZ-Link SμLfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人IL17RA/Fc蛋白(北京百普赛斯生物科技有限公司，H5257)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪，对IL17抗体抑制人IL17A蛋白和人IL17受体之间的结合进行分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％Tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为100nM经过生物素偶联的重组的人IL17RA与SA传感器固定，1500rpm/min，结合10min；终浓度50nM的人IL17A蛋白与四倍比稀释的抗体溶液(1000，250，62.5，15.625，3.9，0.97，0nM)混合，孵育60分钟后上机结合10分钟，1500rpm/min。最后进行解离1分钟，1500rpm/min。得到的结果将通过octet Data Analysis 9.0软件(fortebio)进行数据分析，来计算出抗体对抗原与配体的抑制强度。图5显示IL17抗体YN-065、YN-066、YN-067、YN-068、YN-069、YN070抑制人IL17A蛋白和人IL17受体结合的结果，横坐标为该抗体的浓度，纵坐标为RU值。图5的结果显示，IL17抗体YN-065、YN-066、YN-067、YN-068、YN-069、YN070可有效抑制人IL17A蛋白与人IL17受体结合。
实施例11：IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HT-29细胞产生趋化因子CXCL1
HT-29细胞是人结直肠腺癌上皮细胞(中科院上海细胞库)，其天然表达IL17受体。HT-29细胞与人IL17A蛋白一起温育会导致趋化因子CXCL1的产生，所述CXCL1可以使用ELISA进行检测。
2×105个/ml的HT-29细胞加入96孔板中，在37℃培养12小时。将2nM的IL17A(北京义翘神州生物技术有限公司)与梯度浓度的IL17抗体或的对照抗体(IgG Fc)的混合物在37℃温育1小时后加入到以上96孔板中，与HT-29细胞在37℃共温育48小时，然后用CXCL1的ELISA试剂盒(R&D公司)检测细胞培养上清中的CXCL1的水平。结果参见图6，横坐标为抗体的浓度，纵坐标则为CXCL1的浓度。图6A和图6B的结果显示：IL17抗体YN-065、YN-066、YN-067、YN-068可有效抑制HT-29细胞产生趋化因子CXCL1，它们的抑制能力明显强于Secukinumab。图6C的结果显示YN069和YN070抑制HT-29细胞产生CXCL1的能力与YN068相似。
实施例12：IL17抗体抑制IL17A蛋白诱导HS-27细胞产生白细胞介素8(IL-8)
IL-17可诱导人HS-27细胞(ATCC#CRL-1634)分泌IL-8，所述IL-8可以使用ELISA进行检测。
2×105个/ml的HS-27细胞加入96孔板中，在37℃培养12小时。将100ng/ml的IL17A(北京义翘神州生物技术有限公司)与梯度浓度的IL17抗体或相对照抗体(IgG Fc)的混合物在37℃温育1小时后加入到以上96孔板中，与HS-27细胞在37℃共温育48小时，然后用IL-8的ELISA试剂盒(R&D公司)检测细胞培养上清中的IL-8的水平。结果参见图7，横坐标为抗体的浓度，纵坐标则为IL-8的浓度。图7A和图7B的结果显示：IL17抗体YN-065、YN-066、YN-067、YN-068可有效抑制HS-27细胞产生IL-8，它们的抑制能力均显著强于Secukinumab，图7C的结果显示YN069和YN070抑制HS-27细胞产生IL-8的能力与YN068相似。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (37)
1.抗体或其抗原结合片段，其能够与IL17蛋白相结合，所述抗体包含抗体轻链或其片段和抗体重链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述抗体重链或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中，所述抗原结合片段包括：Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv和/或di-scFv。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括：单克隆抗体、单链抗体和/或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括：嵌合抗体和/或全人源抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4选自以下组中任一项：人共有框架序列和人种系序列。
6.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示。
7.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR1的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:97。
8.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示。
9.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR2的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:98。
10.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
11.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:16和SEQ IDNO: 18。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区或鼠恒定区。
14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链或其片段包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igκ或Igλ恒定区。
15.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链或其片段的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:78。
16.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR2和H-FR4。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述框架区选自以下组中任一项：人共有框架序列和人种系序列。
18.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
19.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
20.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示。
21.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述H-FR3的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:99。
22.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
23.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:15和SEQ IDNO: 17。
24.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区或鼠恒定区。
25.根据权利要求24所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链或其片段包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG恒定区。
26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，所述IgG恒定区包含人IgG1恒定区。
27.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链或其片段的氨基酸序列如下述任一项所示：SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:76。
28.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述IL17蛋白为人IL17蛋白。
29.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述IL17蛋白包括IL17A蛋白和/或IL17F蛋白。
30.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
31.载体，其包含权利要求30所述的核酸分子。
32.宿主细胞，其包含权利要求30所述的核酸分子或权利要求31所述的载体。
33.制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得权利要求1-29中任一项所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求32所述的宿主细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其任选地包含收获所述抗体或其抗原结合片段。
35.药物组合物，其包含权利要求1-29中所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体或权利要求32所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
36.权利要求1-29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体、权利要求32所述的宿主细胞和/或权利要求35所述的药物组合物在制备用于抑制IL17蛋白和IL17配体结合的试剂中的用途。
37.权利要求1-29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体、权利要求32所述的宿主细胞和/或权利要求35所述的药物组合物在制备用于抑制趋化因子CXCL1表达的试剂中的用途。
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