CN112961250A

CN112961250A - 抗体融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112961250A
Application number: CN202110224046.1A
Authority: CN
Inventors: 金磊; 王思勤; 王涛; 郭洪瑞; 闫宏博; 刘宁; 刘爽
Original assignee: GeneScience Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: GeneScience Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2021-03-01
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-03-01
Also published as: CN116940599A; WO2022184015A1; CN112961250B

Abstract

本发明涉及药物领域，尤其涉及抗体融合蛋白及其应用。该抗体融合蛋白表达量高，哺乳动物细胞293E中瞬时转染表达量100‑150mg/L；装配率高，正确装配率超过95％；亲和力高，单边抗体/融合蛋白和抗原结合KD值与阳性对照单克隆抗体/融合蛋白和抗原结合KD值相当；同时具有后续便于纯化的优点，使用Protein A或Protein L一步纯化纯度即可达到95％以上。药效学实验证明，该抗体融合蛋白具有良好的细胞学活性和体内药效活性，效果显著优于对照上市药物。

Description

抗体融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，尤其涉及抗体融合蛋白及其应用。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)蛋白质及其受体(VEGFR)在血管发生(从早期分化的内皮细胞发育胚胎脉管系统)、血管生成(从已有的血管形成新血管的过程)和淋巴管生成(形成新淋巴管的过程)中起重要作用。血小板源性生长因子 (PDGF)蛋白质及其受体(PDGFR)参与调节几种细胞类型的细胞增殖、存活和迁移。

内皮细胞调节系统的功能障碍是癌症和与异常的血管发生、血管生成和淋巴管生成有关的各种疾病的关键特征。血管生成发生在胚胎发育和正常组织的生长、修复和再生、女性生殖周期、妊娠的建立和维持、伤口和骨折的修复中。除了发生在健康个体中的血管生成，血管生成事件还参与许多病理过程，尤其是肿瘤生长和转移，以及其中血管增生(尤其是微血管系统的血管增生)增加的其它病状，诸如糖尿病性视网膜病变、牛皮癣和关节病。抑制血管生成可用于预防或减轻这些病理过程或减缓它们的进展。

新生血管性眼科疾病的病因复杂，机制尚不完全明确。Anti-VEGF类药物在临床治疗中取得了显著疗效，已取代激光光凝(PDT)成为一线疗法。国际原研的雷珠单抗、艾力雅均已获CFDA批准在国内上市，成都康弘药业的康柏西普也于2013年上市，这3种药物可使约半数以上的初治病人视力获得显著的改善，但仍存在约15％的病人根本不应答和约15％～20％的病人在anti-VEGF治疗后出现脱敏、疗效丧失脱敏。研究发现，VEGF-A被中和后VEGF-C的代偿性增加，是导致wAMD病人anti-VEGF治疗脱敏的重要因素。

双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody,BsAb)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。本领域中双或多特异性抗体能够结合2种以上抗原，可以利用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生。最近己经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Co1oma,M.J.,等,Nature Biotech.15(1997) 159-163；WO2001077342；和Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007) 1233-1234)。此外，还开发了能够结合2种以上抗原的诸多其他新型形式，其中抗体中心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再保持如双抗体、三链抗体或四链抗体、minibodies和若干单链形式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.,等， Nature Biotech.23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobio1ogy 74(2007)3-14；Shen,J.，等，Journa1 of Immunogica1 Methods 318(2007)65-74； Wu,C.，等.,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

然而，现有技术报道的双特异性抗体蛋白的表达量较低、亲和力和装配率也不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种抗体融合蛋白及其应用，该抗体融合蛋白表达量高、装配率高和亲和力均较高，同时具有后续便于纯化的优点，使用 Protein A或Protein L一步纯化纯度即可达到95％以上。

本发明提供的抗体融合蛋白，包括：

a)特异性结合VEGFC的抗体；

b)特异性结合VEGFA的蛋白质；和

c)连接a)与b)的柔性肽；

所述特异性结合VEGFC的抗体为特异性结合VEGFC的完整抗体、单链抗体或VEGFC抗原结合片段。

一些实施方案中，所述特异性结合VEGFC的抗体包括轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3中的一个或多个。

一些具体实施例中，所述所述特异性结合VEGFC的抗体为特异性结合 VEGFC的完整抗体，即本发明对天然人源库淘筛得到的P01-H1L4抗体。

一些具体实施例中，所述特异性结合VEGFC的抗体包括轻链可变区和轻链恒定区，所述特异性结合VEGFA的蛋白质为Trap蛋白，所述抗体融合蛋白为VL-CL-linker-Trap，如图2所示的抗体融合蛋白C031。。

一些具体实施例中，所述特异性结合VEGFC的抗体包括重链可变区和重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3，所述特异性结合VEGFA的蛋白质为Trap蛋白，所述抗体融合蛋白为VH-CH1-CH2-CH3-linker-Trap，如图1 所示的抗体融合蛋白C003。

一些实施方案中，所述柔性肽为(G4S)n，其中n为大于0的整数；优选地，n为1、2、3、4或5。

一些实施方案中，所述特异性结合VEGFC的抗体中，轻链CDR1、CDR2 和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO： 15所示；重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示。

一些实施方案中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一些优选的实施方案中，

(I)、所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示；

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示；

或(II)、在(I)所述序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的与(I)所示的氨基酸序列具有相同或相似功能的氨基酸序列；

(III)、与(I)所述序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

一些具体实施例中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；或

所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明还提供了编码所述抗体融合蛋白的核酸，具有：

(IV)、编码如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区的核苷酸序列；编码如SEQ ID NO：3所示的重链可变区的核苷酸序列；或

(V)、与(IV)所述序列90％以上同源性的核苷酸序列。

本发明还提供一种结合物，由本发明所述的抗体融合蛋白与同位素、免疫毒素、化学药物连接而成。

本发明还提供一种偶联物，由本发明所述的抗体融合蛋白与固体介质或半固体介质偶联而成，或由。由本发明所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联而成。

本发明还提供了所述抗体融合蛋白或所述的结合物或所述的偶联物在制备治疗或诊断疾病的药物中的应用。

所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴瘤白血、病神经胶质瘤、黑素瘤、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、息肉状脉络膜血管病变、糖尿病性视网膜病变、病理性近视继发的脉络膜新生血管、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、早产儿新生血管病变、新生血管性青光眼、特发性黄斑下新生血管病变、外层渗出性视网膜病变或玻璃体视网膜手术前辅助用药。

本发明还提供一种药物组合物，包含本发明所述的抗体融合蛋白、或所述的结合物或所述的偶联物。

本发明还提供一种试剂盒，包含本发明所述的抗体融合蛋白、或所述的结合物或所述的偶联物。

本发明提供的抗体融合蛋白，表达量高，哺乳动物细胞293E中瞬时转染表达量100-150mg/L；本发明优选的双特异性融合蛋白所具有的结构，该结构的装配率高，正确装配率超过95％；本发明获得的双特异性融合蛋白的亲和力高，单边抗体/融合蛋白和抗原结合KD值与阳性对照单克隆抗体/融合蛋白和抗原结合KD值相当；本发明所公开的双特异性融合蛋白由于其结构特点也带来蛋白质后续便于纯化的优点，使用Protein A或Protein L一步纯化纯度即可达到95％以上。本发明所述的双特异性融合蛋白还具有良好的细胞学活性和体内药效活性，细胞学活性和体内药效活性均优于对照上市药物。

附图说明

图1示C003双特异性抗体融合蛋白示意图；

图2示C031双特异性抗体融合蛋白示意图；

图3示抗体融合蛋白瞬转表上清SDS-PAGE检测结果：M为Maker；泳道1、 2、3、4分别为C003、C031、C002和C004；

图4示抗体融合蛋白纯化后SDS-PAGE检测结果：M为Maker；泳道1、2 分别为C003、C031、C002和C004；

图5示抗体融合蛋白结合hVEGFA Elisa检测结果；

图6示抗体融合蛋白结合hVEGFC Elisa检测结果；

图7示抗体融合蛋白结合hVEGFA和hVEGFC夹心Elisa检测结果；

图8示抗体融合蛋白细胞学阻断hVEGFA活性报告基因法检测结果；

图9示抗体融合蛋白细胞学阻断hVEGFC活性报告基因法检测结果；

图10示抗体融合蛋白细胞学阻断hVEGFA和hVEGFC活性报告基因法检测结果；

图11示抗体融合蛋白阻断hVEGFA抑制HUVEC细胞增值法检测结果；

图12示抗体融合蛋白阻断hVEGFC抑制HUVEC细胞增值法检测结果；

图13示抗体融合蛋白阻断hVEGFA和hVEGFC抑制HUVEC细胞增值法检测结果。

具体实施方式

本发明提供了抗体融合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，Eylea为再生元公司上市抗hVEGFA药物；

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：双特异性抗体融合蛋白制备

1、天然人源单链抗体展示文库进行hVEGFC抗体P01-H1L4淘筛

无菌抽取健康志愿者新鲜外周血，使用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞，用Invitrogen公司的

reagent(15596-026)提取100×106个细胞的总RNA。选择pCANTAB5E作为噬菌体展示载体。其中，建库方案参见专利CN 106928354 A。

人源抗体库的噬菌体展示及筛选。取100倍库容量的上述人源VH和VL单链抗体库菌液接种880ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml 2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。将上一步培养物 10000g、4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置 1h；12000g、4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用2ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g、4℃离心10min；转移上清到新的 15ml离心管中，加入终浓度为3％BSA，即获得第一轮起始噬菌体。以 hVEGFC-His为抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封闭；然后加入1013的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用1ml Glycine-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，将洗脱下来的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。

将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝ 0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用2YT-AI培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和 1mM IPTG)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％BSA，获得单克隆噬菌体样品。以hVEGFC-His为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆噬菌体样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBS稀释液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入 200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H2SO4终止显色；使用酶标仪测定OD450值。依据单克隆噬菌体ELISA数据选定860个ELISA测定阳性样品，进行竞争性ELISA筛选，将阳性对照抗体稀释至200μg/ml，取50μl稀释液与50μl单克隆噬菌体样品混合后，进行上面步骤的ELISA，结果显示其中有18个单克隆与阳性对照抗体存在表位竞争，选定这些克隆进行测序。

通过全长抗体瞬时转染表达载体的构建和、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测。根据表达量及抗体与IL-1β结合的ELISA检测值，选择相对低的EC50值、相对高的ELISA Rmax值确定了P01-H1L4。P01-H1L4轻链可变区及CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16。P01-H1L4重链可变区及CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20

2、双特异性抗体融合蛋白瞬时转染表达载体的构建

材料

结合人VEGFA的Trap(SEQ ID No.1)序列来自再生元公司的上市药物 “Eylea”(序列见中国专利CN103349781B序列表中﹤210﹥6)；抗人VEGFC 的单克隆抗体来自于P01-H1L4的VL(SEQ ID No.2)和VH(SEQ ID No.3) 的序列。

方法

选择pGS003构建双特异性抗体融合蛋白C003和C031(结构示意图分别见图1、图2)的重链和轻链的表达载体。根据VEGFR1 Domain2和VEGFR2 Domain3的编码核苷酸，抗人VEGFC单克隆抗体P01-H1L4的编码核苷酸， IgG1重链恒定区的编码核苷酸，和Kappa链恒定区的核苷酸序列及载体中的多克隆位点设计引物。经PCR扩增后，使用体外重组的方法(南京金斯瑞， CloneEZ PCR Cloning Kit)将2个重链编码序列和2个轻链编码序列克隆至pGS003，如表3。测序鉴定目的基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养16小时。使用ZymoResearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1mL超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和OD260/280。 OD260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒DNA。

表3、重链和轻链瞬时转染表达载体列表

重链表达载体名称	重链氨基酸序列	轻链表达载体名称	轻链氨基酸序列
				C003H1	SEQ ID No.4	C003L1	SEQ ID No.6
C031H2	SEQ ID No.5	C031L2	SEQ ID No.7

3、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测

将上述2个重链表达载体和2个轻链表达载体组合后进行2ml 293E体系的瞬时转染表达评估。检测表达量及抗体正确组装率，结果见图3、表4。C003 和C031的表达为100-150mg/L、组装率大于95％。C002和C004为另外两个结构的抗体融合蛋白。

使用293E在Freestyle培养基中进行C003和C031的放大瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞300ml， 37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将C003和C031 所用到的表达质粒总量各300μg使用OPtiMEM稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养7天。

表4、C003和C031的瞬时转染表达量

抗体名称	C003	C031
			表达量(mg/L)	100	150

实施例2：双特异性抗体融合蛋白的纯化及检测

2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过Mabselect Sure(GE)层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0 洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图4。

实施例3：双特异性抗体融合蛋白结合人VEGF-A及人VEGFC的ELISA检测

(一)双特异性抗体融合蛋白结合人VEGFA的ELISA检测

1、抗原包被：人VEGFA-His(金赛自构，SEQ ID No.10)用PBS稀释成1μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。

2、封闭：洗板三次后用3％BSA封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2 小时。

3、加候选抗体：洗板3次后，加入起始浓度为10mg/ml 2倍稀释12个浓度梯度候选抗体样品或阳性对照或阴性对照。每孔50μl，25℃条件下孵育1 小时。

4、加二抗：洗板3次后，加入HRP标记链霉亲和素(1:10000)，每孔 50μl，25℃条件下孵育1小时。

5、显色：洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色10 分钟。

6、终止：直接加入50μl每孔的终止液终止反应。

7、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD 值，保存原始数据整理。结果见图5。结果显示C003和C031与阳性对照药物 Eylea活性相当。

(二)双特异性抗体融合蛋白结合人VEGFC的ELISA检测

1、抗原包被：人VEGFC-His(金赛自构，SEQ ID No.11)用PBS稀释成1μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。

6、终止：直接加入50μl每孔的终止液终止反应。

7、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD 值，保存原始数据整理。结果见图6。结果显示C003和C031与阳性对照抗体 P01-H1L4活性相当，优于C002和C004。

(三)双特异性抗体融合蛋白结合人VEGFA和人VEGFC的ELISA检测

1、第一抗原包被：人VEGFA-His(金赛自构，SEQ ID No.10)用PBS 稀释成1μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，4下℃孵育过夜。

4、加入第二抗原：洗板三次后，人VEGFC-mFc(金赛自构，SEQ ID NO: 12)用PBS稀释成10μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，25℃条件下孵育1h。

5、加二抗：洗板3次后，加入HRP标记链霉亲和素(1:10000)，每孔 50μl，25℃条件下孵育1小时。

6、显色：洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色10 分钟。

7、终止：直接加入50μl每孔的终止液终止反应。

8、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD 值，保存原始数据整理。结果见图7。

结果显示，C003和C031均具与双抗原结合的活性，且活性优于C002和 C004，而对照药物Eylea和对照抗体P01-H1L4不具备与双抗原结合的活性。

实施例4：双特异性抗体融合蛋白亲和力测定

使用Biacore T200仪器检测FabT和FTF结构的亲和力。具体方法如下：将人VEGFC-His(金赛自构，SEQ ID No.11)及人VEGFA-His金赛自构，SEQ ID NO.10)偶联在CM5生物传感芯片(GE)上，将不同浓度的抗体以30μl/min 流速流过芯片，抗原与候选抗体进行结合，结合时间为120s，解离时间为300 s。用BIAevalution软件(GE)进行动力学拟合，获得亲和力常数结果如下表 5表6，C003和C031与VEGFC亲和力分别为5.76E-10M和3.27E-09M；C003和C031与VEGFA的亲和力分别为3.74E-09M和5.62E-09M。

表5、C003和C031与VEGFC的亲和力测定结果

表6、C003和C031与VEGFA的亲和力测定结果

实施例5：双特异性抗体融合蛋白阻断细胞VEGFA/VEGFC信号通路活性测定

报告基因法

NFAT-RE-luc 2P-KDR-HEK293细胞(金赛自构，在HEK293细胞表面表达KDR)30000/well接种于96孔板，置于培养箱中孵育。BA006样品初始浓度1000nM，3倍稀释，10个浓度点，孵育1h。加入VEGFA或VEGFC或 VEGFA+VEGFC(当VEGFA/VEGFC识别KDR受体启动信号通路后，生成的NFAT能够启动荧光酶的表达，加入底物后产生化学放光；抗VEGFA/C或 KDR抗体通过阻断VEGFA/C与受体KDR的结合,可降低荧光素酶的表达及相应活性)浓度50ng/ml，孵育4h，裂解后加入Luciferase检测液，检测。结果见图8-10，C003和C031对于VEGFA信号的阻断活性与上市对照药物Eylea 相当，C003和C031对于VEGFC信号的阻断活性与对照抗体P01-H1L4相当，并且C003和C031能同时阻断VEGFA和VEGFC通路，而Eylea和P01-H1L4均不能同时阻断VEGFA和VEGFC通路。

抑制细胞增殖活性法

HUVEC细胞30000/well接种于96孔板，置于培养箱中贴壁3.5h。BA006 样品，初始浓度1.5μM，4倍稀释，10个浓度点，孵育1.5h。VEGFA浓度0.1μg/ml 或VEGFC浓度0.75μg/ml或VEGFA+VEGFC浓度23+300ng/ml，孵育92h。加入CCK8，孵育3.5h，检测。结果见图11-13，C003和C031对于VEGFA 信号的阻断活性与上市对照药物Eylea相当，C003和C031对于VEGFC信号的阻断活性与对照抗体P01-H1L4相当，并且C003和C031能同时阻断VEGFA 和VEGFC通路，而Eylea和P01-H1L4均不能同时阻断VEGFA和VEGFC通路。

实施例6：双特异性抗体融合蛋白动物药效测定

模型：MC38(结直肠癌细胞)，2×10⁵cells/mouse，皮下接种C57BL/6 小鼠。

给药：皮下瘤体积约100-150mm³时将小鼠随机分组，每组6只，腹腔给药，每周给药2次，共给药3周；P01-H1L4，3mg/kg；Eylea，2mg/kg；联合用药1，P01-H1L4+Eylea,3mg/kg+2mg/kg，早晚给药；联合用药2，抗体VC4.5(参见GENENTECH专利US9102720B2)+Eylea,3mg/kg+2mg/kg，早晚给药；C003，3.8mg/kg；C031，3.8mg/kg。

结果如表7所示，上市对照药物Eylea单药抑瘤率为24.58％，P01-H1L4 和Eylea联合用药抑瘤率为13.9％，VC4.5和Eylea联合用药抑瘤率为10.87％，双特异性抗体融合蛋白C003和C031的抑瘤率分别达到37.81％和34.82％，活性优于C002。由此可见，P01-H1L4活性优于VC4.5，本发明双特异性融合蛋白C003和C031的活性明显优于单药和其他联合用药组。

表7、C003和C031抑瘤率

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长春金赛药业有限责任公司

<120> 抗体融合蛋白及其应用

<130> MP2119539

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro

20 25 30

Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu

35 40 45

Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr

50 55 60

Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys

65 70 75 80

Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr

85 90 95

Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His

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Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile

115 120 125

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

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Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

145 150 155 160

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

165 170 175

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

180 185 190

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

195 200 205

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

210 215 220

Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

260 265 270

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295 300

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

305 310 315 320

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

325 330 335

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

355 360 365

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

370 375 380

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

405 410 415

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

420 425 430

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

435 440 445

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Tyr Gly Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Gln Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Pro Ala Gly Gly Phe Gly Pro Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 667

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Gln Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Pro Ala Gly Gly Phe Gly Pro Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp

450 455 460

Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile

465 470 475 480

His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser

485 490 495

Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile

500 505 510

Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile

515 520 525

Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr

530 535 540

Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr

545 550 555 560

Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu

565 570 575

Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu

580 585 590

Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln

595 600 605

His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu

610 615 620

Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser

625 630 635 640

Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys

645 650 655

Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys

660 665

<210> 5

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Gln Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Pro Ala Gly Gly Phe Gly Pro Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Tyr Gly Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 7

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Tyr Gly Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val

225 230 235 240

Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg

245 250 255

Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr

260 265 270

Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile

275 280 285

Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys

290 295 300

Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr

305 310 315 320

Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val

325 330 335

Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu

340 345 350

Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe

355 360 365

Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn

370 375 380

Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser

385 390 395 400

Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr

405 410 415

Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val

420 425 430

Arg Val His Glu Lys

435

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Gln Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Pro Ala Gly Gly Phe Gly Pro Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Tyr Gly Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 10

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser His

115 120 125

His His His His His His

130

<210> 11

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg

20 25 30

Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr

35 40 45

Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys

50 55 60

Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro

85 90 95

Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys

100 105 110

Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Asp Asp Asp

115 120 125

Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 12

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg

20 25 30

Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr

35 40 45

Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys

50 55 60

Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro

85 90 95

Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys

100 105 110

Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Asp Asp Asp

115 120 125

Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

130 135 140

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

180 185 190

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

210 215 220

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

225 230 235 240

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

245 250 255

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

260 265 270

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

275 280 285

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

290 295 300

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

325 330 335

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

340 345 350

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr Ser Val Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Gln Tyr Gly Pro Trp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Arg Ser Thr Met Ala

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ser Ile Ser Ala Gln Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Leu Pro Ala Gly Gly Phe Gly

1 5

Claims

1.一种抗体融合蛋白，其特征在于，包括：

a)特异性结合VEGFC的抗体；

b)特异性结合VEGFA的蛋白质；和

c)连接a)与b)的柔性肽；

2.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合VEGFC的抗体包括轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3中的一个或多个。

3.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合VEGFC的抗体包括轻链可变区和轻链恒定区，所述特异性结合VEGFA的蛋白质为Trap蛋白，所述抗体融合蛋白为VL-CL-linker-Trap。

4.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合VEGFC的抗体包括重链可变区和重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3，所述特异性结合VEGFA的蛋白质为Trap蛋白，所述抗体融合蛋白为VH-CH1-CH2-CH3-linker-Trap。

5.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽为(G4S)n，其中n为大于0的整数；优选地，n为1、2、3、4或5。

6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合VEGFC的抗体中，轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15所示；重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18所示。

7.根据权利要求6所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

8.根据权利要求1-7任一项所述的抗体融合蛋白，其特征在于，

(I)、所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示；

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示；

(III)、与(I)所述序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；或

10.编码权利要求1～9任一项所述抗体融合蛋白的核酸，其特征在于，具有：

(V)、与(IV)所述序列90％以上同源性的核苷酸序列。

11.一种结合物，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的抗体融合蛋白与同位素、免疫毒素、化学药物连接而成。

12.一种偶联物，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的抗体融合蛋白或权利要求11所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联而成。

13.权利要求1～9任一项所述的抗体融合蛋白或权利要求11所述的结合物或权利要求12所述的偶联物在制备治疗或诊断疾病的药物中的应用；

14.一种药物组合物，其特征在于，包含权利1-9所述的抗体融合蛋白、或权利要求11所述的结合物或权利要求12所述的偶联物。

15.一种试剂盒，其特征在于，包含权利1-9所述的抗体融合蛋白、或权利要求11所述的结合物或权利要求12所述的偶联物。