CN108250296B - 全人源抗人pd-l1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请的发明属于抗体药物领域，公开了全人源抗人PD‑L1单克隆抗体，并公开了包含编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及应用。本发明所述单克隆抗体作为抗人PD‑L1的新抗体，能够特异性结合人PD‑L1，可呈剂量依赖性阻断PD‑L1与人PD‑1的结合，促进T细胞的增殖，可抑制小鼠C57BL/6小鼠结肠癌肿瘤细胞的生长。通过阻断PD‑1/PD‑L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。本发明所述单克隆抗体可用于治疗与PD‑1相关的疾病包括但不局限于为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤。

Description

全人源抗人PD-L1单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及全人源抗PD-L1单克隆抗体及其应用。
背景技术
程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中利用 削减杂交的方法得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。目前发现 的PD-1的配体被证实有两个，分别是PD-L1(又称B7-H1，属于B7超家族)和PD-L2(又称B7-DC)。人PD-L1基因定位于染色体9P24，其开放阅读框编码一个含有290个氨基 酸的I型跨膜蛋白，由胞外区IgV、IgC结构域、疏水性跨膜结构域、30个氨基酸片段且 带电荷的胞内区组成。人PD-L1mRNA主要为4.2kb，此外还有1.8kb、3.7kb和7.2kb 等3种转录形式，但它们的编码产物基本相同。
PD-L1广泛表达在造血系统和非造血系统肿瘤细胞表面。最初的研究发现，PD-L1主 要表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，但是随着研究的深入，发 现除了淋巴细胞，PD-L1也表达于其他多种组织如胸腺、心脏、胎盘等的内皮细胞，以及 胰岛的β细胞等。在临床前的动物实验模型中，用针对PD-1和其配体PD-L1两个靶点的 单克隆抗体阻断PD-1通路，能激发细胞毒活性并抑制肿瘤细胞的生长。目前作用于 PD-1/PD-L1的这些药物虽然彼此在作用机制上有些许不同，但每个药物都设计为阻断PD-1 和它的配体的相互作用，从而使T细胞的“开关”保持在“开”的位置。
到目前为止，应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到 PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床病理特征及预后紧密相关。
分子免疫治疗是除手术及化学药物治疗之外的另一有效的治疗手段。目前生物治疗在 肿瘤治疗中的作用逐年提高，生物治疗在防止肿瘤复发、治疗晚期癌症及其并发症等诸多 方面具有诸多优势，但是安全性也是现在关注的重点。作为生物药物的重要组成部分，抗 体已经成为类别最大且发展最快的生物药物。而单克隆抗体更是由于其针对靶点的高度特 异性而在临床上成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种 疾病。期中抗PD-L1单抗是临床上非常具有前景的单抗之一。
随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也被严格考量，如免疫原性、亲和力、稳 定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等。在抗体药物发展初期，鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用，随着抗体人源化技术的发展，多种人源化抗体成为可能。
Roche公司的MPDL3280A的作用靶点为PD-L1，其针对多种肿瘤均表现出了令人满意的疗效，同时耐受性良好。该药物于2016年5月18日上市，被认为是最有前途的新一 代免疫疗法之一。研究人员表示，抗PD-L1药物比抗PD-1药物具有更高的选择性，并可 能减少肺脏及其他器官的炎症。
MSB0010718C是一种实验性全人源化IgG1单克隆抗体，靶向结合PD-L1。通过竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，恢复肿瘤抗原特异性T细胞的免疫功能。该产 品由默克雪兰诺公司开发，于2014年7月已经进入II期临床的研究阶段，主要评价其治 疗转移性Merkel细胞癌的疗效以及安全性，研究的主要疗效终点是总缓解率。其I期临床 的研究结果表明MSB0010718C对多个实体瘤的疗效和安全性较好。该药物于2017年3月 以优先审评的方式获得FDA加速批准上市，成为第一个获批治疗转移性默克尔细胞癌的 PD-L1单抗。
MedImmune公司开发的作用于PD-L1靶点的全人源化的单克隆抗体，在2014年5月已经进入III期临床阶段，主要适应症为非小细胞肺癌(NSCLC)，这个临床试验在已完 成放化疗且无迹象表明肿瘤恶化的局部晚期、不可切除性(III阶段)NSCLC患者中开展， 重点考查MEDI4736相对于安慰剂对疾病无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的改善。 该临床试验是MEDI4736在这一患者群体中的首个关键研究。该药物于2017年5月获得 FDA加速批准上市，成为第一个获批治疗晚期或转移尿路上皮癌的PD-L1单抗。
BMS-936559是Bristol-Myers Squibb开发的全人源的针对PD-1配体PD-L1的IgG4单 克隆抗体。可以抑制PD-L1与PD-1和CD80+T细胞的结合，阻断活化的T细胞表面的 PD-1受体，通过抑制PD-1和PD-L1通路挽救耗竭的T细胞，增强抗肿瘤免疫力。I期临 床试验表明2周1次使用本药能引发持续的应答，尤其是对黑色素瘤患者。根据患者癌症 类型不同(晚期非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌或卵巢癌)客观应答率从6％到17％， 而且一些患者应答时间达到1年或更长。
尽管已经获得了一些在治疗上有很大优势的人源化单克隆抗体，但是筛选出具有所需 性质和功能的人源化单克隆抗体绝非易事，现实中依然存在对这类人源化单克隆抗体的迫 切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的氨基酸序列的全人源抗人PD-L1单克隆抗 体，编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可 变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明通过噬菌体展示技术筛选针对PD-L1的全人源抗体，并利用基因工程方法得到 完整抗体，从而提供用于抑制肿瘤细胞增殖的药物。具体的抗体的制造及相关检测方法如 下：首先构建阳性抗体P01表达载体pGS003-P01H和pGS003-P01L及抗原表达载体pGS003-hPD-L1-His，将重组质粒转染FreeStyleTM 293-E细胞培养表达，将细胞上清通过Protein A或镍柱进行纯化，得到纯化的蛋白即阳性抗体蛋白P01及抗原人PD-L1-His。取健康志愿者新鲜外周血，使用淋巴细胞分离液分离其中的淋巴细胞后提取总RNA，以总 RNA为模板，使用Oligo dT引物进行反转录合成第一链cDNA，设计引物进行PCR扩增 重链及轻链的可变区。然后进行人源VH和VL的单链抗体库的构建，构建步骤是先将VL 通过NheI和NotI克隆到pCANTAB5E-SF载体上，然后将VH通过NcoI和XhoI克隆到 上一步的载体上。将得到的单抗链体库进行噬菌体展示及淘选，经ELISA、竞争ELISA及 Octet初步筛选后，选定一个单链抗体，进行亲和力成熟，选定一组抗体构建为全长IgG 分子，完成亲和力，细胞活性，以及动物体内活性等一系列测定，再对这些抗体可变区特 别是CDR序列检索，确定具备抑制肿瘤细胞增殖作用的抗PD-L1的单克隆抗体的重链可 变区CDR序列和轻链可变区CDR序列。
在一些实施方案中，本发明所述抗PD-L1的单克隆抗体，其重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其中
(a)所述CDR1序列是SX1FX2FX3DSWIH；
(b)所述CDR2序列是AWISPYGGSX4YX5ADSX6X7X8KG；
(c)所述CDR3序列是AX9RHWPGGFDX10；
其中X1是G、Y或D，X2是T、P、A或S，X3是S或I；且X1是G或D时，X2不 是T，X3不是S；
X4是S、T或A，X5是Y或H，X6是V或M，X7是K、Q或R，X8是G或D；且 X4是S或T时，X5不是Y，X6不是V，X7不是K，X8不是G；
X9是R、T或K，X10是N、H或Y。
作为优选，所述单克隆抗体，其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列选择如下七组 中任一组：
H1、CDR1：SGFTFSDSWIH(SEQ ID NO:1)，CDR2：AWISPYGGSSYYADSVKG (SEQ ID NO:2)，CDR3：ARRHWPGGFDN(SEQ ID NO:3)；
H2、CDR1：SYFPFSDSWIH(SEQ ID NO:4)，CDR2：AWISPYGGSSYYADSVQD (SEQ ID NO:5)，CDR3：AKRHWPGGFDH(SEQ ID NO:6)；
H3、CDR1：SGFTFGDSWIH(SEQ ID NO:7)，CDR2：AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:8)，CDR3：ARRHWPGGFDY(SEQ ID NO:9)；
H4、CDR1：SDFAFSDSWIH(SEQ ID NO:10)，CDR2：AWISPYGGSAYYADSVRD (SEQ ID NO:11)，CDR3：AKRHWPGGFDN(SEQ ID NO:12)；
H5、CDR1：SGFTFIDSWIH(SEQ ID NO:13)，CDR2：AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:14)，CDR3：ARRHWPGGFDH(SEQ ID NO:15)；
H6、CDR1：SGFTFSDSWIH(SEQ ID NO:16)，CDR2：AWISPYGGSTYHADSVKG (SEQ ID NO:17)，CDR3：ARRHWPGGFDY(SEQ ID NO:18)；
H7、CDR1：SGFSFSDSWIH(SEQ ID NO:19)，CDR2：AWISPYGGSSYYADSMQD (SEQ ID NO:20)，CDR3：ATRHWPGGFDN(SEQ ID NO:21)。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1的单克隆抗体，其轻链可变区包含CDR、CDR2、CDR3序列，其中
(a)所述CDR1序列是X11AX12X13DVX14TAVA；
(b)所述CDR2序列是SASX15X16X17X18；
(c)所述CDR3序列是CQQYX19YX20PX21T；
其中X11是R或S，X12是S或N，X13是Q、S、H或R，X14是T、F、A或S；且 X12是S时，X13不是Q，X14不是S；
X15是F或Y，X16是L、K、P或T，X17是Y、H或N，X18是S、I或R；且X15是F 时，X16不是L，X17不是Y，X18不是S；
X19是L或M，X20是H或Q，X21是A、T或S；且X19是L时，X20不是H，X21不 是A或T。
作为优选，所述单克隆抗体，其轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列选择如下八组 中任一组：
L1、CDR1：RASQDVTTAVA(SEQ ID NO:22)，CDR2：SASFLYS(SEQ ID NO:23)， CDR3：QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)；
L2、CDR1：RASSDVFTAVA(SEQ ID NO:25)，CDR2：SASFKHI(SEQ ID NO:26)， CDR3：QQYMYHPTT(SEQ ID NO:27)；
L3、CDR1：RANQDVATAVA(SEQ ID NO:28)，CDR2：SASFLYS(SEQ ID NO:29)， CDR3：QQYLYHPAT(SEQ ID NO:30)；
L4、CDR1：SASQDVTTAVA(SEQ ID NO:31)，CDR2：SASYPYS(SEQ ID NO:32)， CDR3：QQYMYHPST(SEQ ID NO:33)；
L5、CDR1：SASQDVTTAVA(SEQ ID NO:34)，CDR2：SASFPYR(SEQ ID NO:35)， CDR3：QQYMYHPST(SEQ ID NO:36)；
L6、CDR1：RASHDVTTAVA(SEQ ID NO:37)，CDR2：SASFPYR(SEQ ID NO:38)， CDR3：QQYMYQPST(SEQ ID NO:39)；
L7、CDR1：RASRDVTTAVA(SEQ ID NO:40)，CDR2：SASFPNR(SEQ ID NO:41)， CDR3：QQYMYHPTT(SEQ ID NO:42)；L8、CDR1：RASRDVTTAVA(SEQ ID NO:43)， CDR2：SASFTNI(SEQID NO:44)，CDR3：QQYMYHPTT(SEQ ID NO:45)。
本发明所述单克隆抗体还包含CDR1、CDR2、CDR3之间的重链可变区骨架序列和/或CDR1、CDR2、CDR3之间的轻链可变区骨架序列。
作为优选，所述骨架序列为人共有骨架序列。
在一些实施方案中，所述单克隆P437重链可变区骨架序列的FR1及FR2区序列同IGHV3-23*04(IMGT)，FR3区序列同IGHV3-64*04(IMGT)有三个氨基酸差异；轻链 可变区骨架序列中FR1区序列同IGKV1-NL1*01(IMGT)，FR2区序列同IGKV1-13*02 (IMGT)，FR3区序列同IGKV1-13*02(IMGT)。
作为优选，其重链可变区选自如SEQ ID NO:50～SEQ ID NO:56所示氨基酸序列，轻 链可变区选自SEQ ID NO:57～SEQ ID NO:64氨基酸序列。
进一步的，作为优选，所述单克隆抗体其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：
1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示；
2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示；
3)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示；
4)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示；
5)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；
6)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示。
本发明所述的单克隆抗体不仅包括可变区，还包括恒定区。
优选的，所述重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。更优选的，所述重链的恒定区为人IgG1的恒定区。
优选的，所述轻链的恒定区为κ型或λ型。更优选的，所述轻重链的恒定区为人κ链的恒定区。
根据全长抗体的表达量和与人PD-L1结合亲和力值筛选出最好的6个单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H2所示，轻链可变区的CDR序列如L5所示，命名为047HAb-1。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H2所示，轻链可变区的CDR序列如L7所示，命名为047HAb-2。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H2所示，轻链可变区的CDR序列如L8所示，命名为047HAb-3。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H4所示，轻链可变区的CDR序列如L4所示，命名为047HAb-4。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H4所示，轻链可变区的CDR序列如L6所示，命名为047HAb-5。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体其重链可变区的CDR序列如H7所示，轻链可变区的CDR序列如L2所示，命名为047HAb-6。
进一步对优选抗体均进行了剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD1的结合测试，以及混合淋巴细胞反应(MLR)，同时对优选的6个抗体进行C57BL/6小鼠结肠癌模型的治疗疗 效实验。根据测试的实验数据，筛选出5个可以进行成药研究的抗人PD-L1单克隆抗体， 047HAb-1、047HAb-2、047HAb-3、047HAb-4、047HAb-5。这5个全人源化抗体在体外与 人PD-L1具有良好的结合活性，能够阻断人PD-L1与PD-1的结合，同时能够促进免疫 细胞的增殖和活化，可有效的抑制小鼠结肠癌肿瘤的生长。
本发明所述的单克隆抗体是全人源的。
本发明还提供了编码所述抗PD-L1单克隆抗体的核苷酸。
本发明提供了一种表达载体，包含编码所述单克隆抗体的核苷酸。
本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由本发明所述的表达载体转化或转染 而来，为原核细胞或真核细胞。
本发明还提供了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的所述抗人PD-L1 单克隆抗体。
其中，所述化学标记包括但不限于同位素、免疫毒素、化学药物。
优选的，所述免疫毒素为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。
所述生物标记包括但不限于生物素、亲和素或酶标记。
优选的，所述酶标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
本发明还提供了一种偶联物，其由所述抗人PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物与固 体介质或半固体介质偶联形成。
优选的，所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。
本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗人PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物 和/或所述偶联物。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述抗人PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物和/或 所述偶联物。
本发明还提供了所述抗人PD-L1单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物和/或所 述药物组合物在制备治疗PD-1相关的疾病的药物中的应用。
其中，所述与PD-1相关的疾病包括但不局限于乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤。
本发明还提供了一种诊断的试剂盒，所述试剂盒包含所述抗人PD-L1单克隆抗体和/ 或所述结合物和/或所述偶联物。
本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人 PD-L1单克隆抗体，并公开了包含编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及应用 用途。本发明所述单克隆抗体作为抗人PD-L1的新抗体，能够特异性结合人PD-L1，可呈剂量依赖性阻断PD-L1与人PD-1的结合，促进T细胞的增殖，可抑制小鼠C57BL/6小鼠 结肠癌肿瘤细胞的生长。通过阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增 殖，发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。本发明所述单克隆抗体可用于治疗与PD-1相关的疾 病包括但不局限于为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱 癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为噬菌粒载体pCANTAB5E-SF载体图谱；
图2为人PBMC总RNA琼脂糖电泳检测结果，泳道M：DL2000分子量标记；1： 人PBMC总RNA；
图3为人VH、VL PCR扩增产物琼脂糖电泳检测结果，泳道1：人VH的PCR产物； M：Marker DL2000分子量标记；2：人VL的PCR产物；
图4为噬菌体展示筛选的21个克隆分别同hPD-L1及mPD-L1的ELISA检测结果；
图5为SDS-PAGE检测6个优选抗体300ml瞬时转染表达纯化产物结果；其中图5-A示还原样品，泳道M：蛋白质分子量标记；1：047HAb-1；2：047HAb-2；3：047HAb-3； 4：047HAb-5体；5：047HAb-5；6：047HAb-6；图5-B示非还原样品，泳道M：蛋白质 分子量标记；1：047HAb-1；2：047HAb-2；3：047HAb-3；4：047HAb-5；5：047HAb-5； 6：047HAb-6；
图6为047HAb-1、047HAb-2、047HAb-3、047HAb-4、047HAb-5、047HAb-6抗体抗 原表位竞争ELISA结果；
图7-A为047HAb-1、047HAb-2、047HAb-3、047HAb-4抗体剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD-1结合的ELISA结果，图7-B为047HAb-5、047HAb-6抗体剂量依赖性阻断人PD-L1 与人PD-1结合的ELISA结果；
图8为047HAb-1、047HAb-2、047HAb-3、047HAb-4、047HAb-5、047HAb-6抗体对 T细胞的效应，从上到下、从左到右依次为鼠IgG1同型对照、人IgG4阴性对照、keytruda，047HAb-1，keytruda，047HAb-2，keytruda，047HAb-3，keytruda，047HAb-4，keytruda，047HAb-5，keytruda，047HAb-6对T细胞的效应图；
图9为优选抗体在治疗C57BL/6结肠癌小鼠第15天肿瘤体积图；A：047HAb-1；B：047HAb-2；C：047HAb-3；D：PBS阴性对照；E：047P01；F：047HAb-5；G：WX-mPD-L1 阳性对照；H：人IgG1同型对照；
图10为047优选抗体对C57BL/6小鼠结肠癌模型的治疗疗效图；A：047HAb-1；B：047HAb-2；C：047HAb-3；D：PBS阴性对照；E：047P01；F：047HAb-5；G：WX-mPD-L1 阳性对照；H：人IgG1同型对照。
具体实施方式
本发明公开了全人源抗PD-L1单克隆抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法 进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本领域技术人员将知晓的是，本发明上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地 影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知 晓，根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其的核苷酸序列，并且针对不同的表达宿 主对该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可以与同 位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接，还可以与固体介质、半固体介质偶联，还可以使 用本发明的抗体的功能性片段，这在本领域中是已知的。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购 买获得。
实施例1：阳性对照抗体及抗原的制备
1、阳性抗体(P01)基因合成及表达载体构建
P01(Tecentriq FDA批准上市药)重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46和 SEQ ID NO:47所示：
P01H，SEQ ID NO:46：
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVR QAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
P01L，SEQ ID NO:47：
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2、将上述抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞生物科 技有限公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57-Simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中，获得pUC57-Simple-P01H和pUC57-Simple-P01L质粒。
3、将质粒pUC57simple-P01H，pUC57simple-P01L进行酶切(HindIII和EcoRI)后，琼脂糖凝胶电泳回收得到基因片段P01H、P01L并分别与pGS003载体进行连接反应重组 构建获得pGS003-P01H和pGS003-P01L表达载体。
4、将上面构建的重组质粒pGS003-P01H和pGS003-P01L共转染FreeStyleTM293-E细胞7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，得到纯化后的抗体P01。
5、人PD-L1-His抗原表达载体构建
5.1、人PD-L1-His合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示：
aagcttaattgccgccaccatgaggatatttgctgtctttatattcatgacctactggcatttgctgaacgcatttactgtcacggttccca aggacctatatgtggtagagtatggtagcaatatgacaattgaatgcaaattcccagtagaaaaacaattagacctggctgcactaattgtctat tgggaaatggaggataagaacattattcaatttgtgcatggagaggaagacctgaaggttcagcatagtagctacagacagagggcccgg ctgttgaaggaccagctctccctgggaaatgctgcacttcagatcacagatgtgaaattgcaggatgcaggggtgtaccgctgcatgatcagctatggtggtgccgactacaagcgaattactgtgaaagtcaatgccccatacaacaaaatcaaccaaagaattttggttgtggacccagtcac ctctgaacatgaactgacatgtcaggctgagggctaccccaaggccgaagtcatctggacaagcagtgaccatcaagtcctgagtggtaag accaccaccaccaattccaagagagaggagaagctcttcaatgtgaccagcacactgagaatcaacacaacaactaatgagattttctactg cacttttaggagattagatcctgaggaaaaccatacagctgaattggtcatcccagaactacctctggcacatcctccaaatgaaaggacttc cggaggtggaggttcccatcaccatcaccaccatcattgaattc
5.2、将上述抗原序列所对应的核苷酸序列进行合成，克隆到pUC57-Simple(金斯瑞 生物科技有限公司提供)载体中，获得pUC57-Simple-hPD-L1-His质粒。
5.3、将质粒pUC57-Simple-hPD-L1-His进行酶切(HindIII和EcoRI)后，琼脂糖凝胶 电泳回收得到基因片段hPD-L1-His与pGS003载体进行连接反应。重组构建获得pGS003-hPD-L1-His表达载体。
5.4、将上面构建的重组质粒pGS003-hPD-L1-His转染FreeStyleTM293-E细胞7天后， 将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用镍柱(蛋白 纯化液相色谱系统/AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，得到纯化后的抗原人PD-L1-His。
实施例2：天然人源单链抗体噬菌体展示文库的构建
1、噬菌粒载体的构建
选择pCANTAB5E作为噬菌体展示载体，根据克隆及噬菌体展示需要进行载体改造，改造结果如图1。将SfiI-NcoI-XhoI+Linker+NheI-NotI序列(SED ID NO:49)进行基合成，然后用SfiI和NotI进行酶切，并与pCANTAB5E载体进行连接反应重组构建获得改造后 载体pCANTAB5E-SF。
SED ID NO:49：
ggcccagccg gccatggcct aaggatccta aaccgtctcg agcggtggtg gcggtagtggcggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgc tagcgacatc ctgcagtgaa aggcggccgc
2、PBMC分离及总RNA抽提
无菌抽取健康志愿者新鲜外周血，使用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞， 用Invitrogen公司的
Figure BDA0001550377280000102
reagent(15596-026)提取100×106个细胞的总RNA，结果如 图2所示。结果显示提取的总RNA三条带型清晰，可知所提取的RNA质量良好。
3、抗体库引物设计、合成及RT-PCR
根据Kabat、V-base2及IMGT网站公布的抗体基因序列信息，设计用于扩增人抗体重 链和轻链的引物及正确的酶切位点，金斯瑞生物科技有限公司进行引物合成，PAGE纯化， 引物序列见表1和表2：
表1、扩增人重链可变区的引物
引物名称 序列(5’→3’)
h-vh_F1 CCAATTggcccagccggccATGGCCGAGGTACARCTSGTGGAGTCYG
h-vh_F2 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGWKCAGCTGGKGSAGTCTG
h-vh_F3 CCAATTggcccagccggccATGGCCVVAGTGCAGCTGGTGSAGTCTGGG
h-vh_F4 CCAATTggcccagccggccATGGCCSARATGCAGCTGGTRSAGTCTGG
h-vh_F5 CCAATTggcccagccggccATGGCCCAGGWCCAGYWRGTGCARTCTGGG
h-vh_F6 CCAATTggcccagccggccATGGCCCAGRTACARCTKCAGSAGTCRGG
h-vh_F7 CCAATTggcccagccggccATGGCCGAGGCCCAGCTTACAGAGTCTGGG
h-vh_F8 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGTHCAGCTGDTGSAGHCTKG
h-vh_F9 CCAATTggcccagccggccATGGCCGRGGTGCAGMTGGWGGAGTCTB
h-vh_F10 CCAATTggcccagccggccATGGCCGAGRYGCADCTGGTVGAGTCTGGG
h-vh_F11 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGTGCAGCTGKTGSAVTCTGGS
h-vh_F12 CCAATTggcccagccggccATGGCCCAGGTGCAGCTRCARSAGTBGGGC
h-vh_F13 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGTDCAGCTGGTGSAGTCYG
h-vh_F14 CCAATTggcccagccggccATGGCCCRGSTGCRGCTGCAGGASTCSGGC
h-vh_F15 CCAATTggcccagccggccATGGCCGARGTGCAGCTGKTGCAGTCYG
h-vh_F16 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG
h-vh_F17 CCAATTggcccagccggccATGGCCSAGGTHCAGCTKGTRCAGTCTGGG
h-vh_F18 CCAATTggcccagccggccATGGCCGAGGTGSAGCTGATWGAGYCCAYA
h-vh_F19 CCAATTggcccagccggccATGGCCYRGRTCACCTTGARGGAGTCTGGT
h-vh_R1 ACCGCCACCACCgCTCGAGACRGTGACCAGGGTBCC
h-vh_R2 ACCGCCACCACCgCTCGAGACGGTGACCRTKGTCCC
注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G /T
表2、扩增人轻链可变区的引物
Figure BDA0001550377280000101
Figure BDA0001550377280000111
注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G /T
采用Takara公司的PrimeScriptTMII第一链cDNA合成试剂盒(6210A)中的Oligo dT引物，以从PBMC中抽提的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，使用上述引物通 过PCR技术扩增得到抗体基因的重链可变区和轻链可变区，PCR扩增的条件为95℃5min， 按下列参数循环25次：95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，最后一个循环72℃ 延伸3min。扩增完成后电泳检测，见图3。结果表明VH及VL扩增片段均为单一条带， 特异性良好。
4、人源VH和VL单链抗体库的构建
人源VH和VL单链抗体库的构建步骤是先将VL通过NheI和NotI克隆到 pCANTAB5E-SF载体上，然后将VH通过NcoI和XhoI克隆到上一步的载体上。具体操作 如下：
将pCANTAB5E-SF载体及扩增纯化好的人轻链可变区PCR产物用NheI和NotI进行酶切。将酶切好的4.4μg载体与1μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到10支200 μlTG1电转感受态细胞(2.5kV，2mm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取 少量复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到10个Φ15cm平板上，过夜培养； 第二天计算库容量为2.2×108单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取轻链抗体库， 取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。
将上述轻链抗体库质粒及扩增纯化好的人重链可变区PCR产物用NcoI和XhoI进行酶 切。将酶切好的5.8μg载体与1.2μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到20支200 μlTG1电转感受态细胞(2.5kV，2mm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取部 分复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到20个Φ15cm平板上，过夜培养；第 二天计算库容量为5.6×108单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取人源VH和VL 单链抗体库，取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保 存于-80℃。
实施例3：人源抗体库的噬菌体展示及筛选
1、抗体库的噬菌体展示和淘选
取100倍库容量的上述人源VH和VL单链抗体库菌液接种880ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密 度100倍的辅助噬菌体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml 2YT-AK培养基(含100μg/ml 氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。
将上一步培养物10000g 4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰 上静置1h；12000g 4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用2 ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g 4℃离心10min；转移上清到新的15ml离心管 中，加入终浓度为3％BSA，即获得第一轮起始噬菌体。以人PD-L1-His(实施例1制备) 为抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封闭；然后加入1013的第一轮起始噬菌体进行抗体 抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用pH3.0的洗脱液洗脱并用PH8.0的Tris-Hcl 中和，将洗脱得到的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，第二天，收集上清并 PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。第二轮、第三轮、第四轮分别以mPD-L1-His (购自义翘神州)、cPD-L1-His(购自义翘神州)、人PD-L1-His(实施例1制备)为抗 原包被免疫管进行淘筛，共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依 次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。
2、单克隆的诱导表达及ELISA筛选
将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜后；挑取单克隆于分装有0.5ml/ 孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/ 孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用 2YT-AI培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二 天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％BSA，获得单克隆phage样品。
以人PD-L1-His(实施例1制备)为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆phage样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液， 重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBS稀释液50μl，25℃孵育1h；然后 向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB 显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H2SO4终止显色；使用酶标仪测定OD450值。依据单克隆phage ELISA数据选定288个ELISA 测定阳性样品，进行竞争性ELISA筛选，将hPD1-hIgG1Fc(购自ACRO)稀释至20μg/ml， 取50μl稀释液与50μl单克隆phage样品混合后，进行上面步骤的ELISA，结果显示其中 有21个单克隆与PD1存在表位竞争，选定这些克隆进行测序。分别将抗原人PD-L1-His (实施例1制备)及mPD-L1-His(购自义翘神州)包被96酶标版，重复以上ELISA检测 实验，验证21个单克隆的ELISA值，具体实验结果见图4。选取最优克隆P437，对应序 列为H1L1。H1L1的轻重链框架区(FR)为天然框架区。其中重链的FR1及FR2区序列 同IGHV3-23*04(IMGT)，FR3区序列同IGHV3-64*04(IMGT)有三个氨基酸差异；轻 链框架区中，FR1区序列同IGKV1-NL1*01(IMGT)，FR2区序列同IGKV1-13*02(IMGT)， FR3区序列同IGKV1-13*02(IMGT)，为进一步提高抗体亲和力，对H1L1进行亲和力成 熟。
3、亲和力成熟
为了提高该抗体的亲和力，以构建的单链抗体scFv为模板，进行随机突变，构建随机 突变库，并将突变的单链抗体库进行噬菌体展示，然后通过ELISA筛选得到更高亲和力的 抗体。
采用Statgene公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒(200550)，以P437 质粒为模板，以VH正向引物和VL反向引物进行易错PCR扩增，将扩增好的PCR产物 进行纯化、酶切、连接到pFL249载体上，然后电转化到TG1感受态细胞中，涂布平板， 37℃过夜培养，获得随机突变体库。
取100倍突变体库容量的菌液接种880ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌 体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml 2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75 μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。
将上一步培养物10000g 4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置1h；12000g 4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽； 用2ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g 4℃离心10min；转移上清到新的15ml离 心管中，加入终浓度为3％BSA，即获得第一轮起始噬菌体。以人PD-L1-His(实施例1 制备)为抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封闭；然后加入1013的第一轮起始噬菌体进 行抗体抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用pH3.0的洗脱液洗脱并用PH8.0的 Tris-Hcl中和，将洗脱得到的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，培养过夜后收 集上清，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选， 抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。
将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜后；挑取单克隆于分装有0.5ml/ 孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/ 孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用 2YT-AI培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二 天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％BSA，获得单克隆phage样品。
以人PD-L1-His(实施例1制备)为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆phage样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液， 重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBS稀释液50μl，25℃孵育1h；然后 向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB 显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H2SO4终止显色；使用酶标仪测定OD450值。依据单克隆phage ELISA数据选定288个 ELISA测定阳性样品，进行竞争性ELISA筛选，将hPD1-hIgG1Fc(购自ACRO)稀释至 20μg/ml，取50μl稀释液与50μl单克隆phage样品混合后，进行上面步骤的ELISA，结 果显示其中有21个单克隆与PD1存在表位竞争，选定这些克隆进行测序；取上述在96孔 板深孔板2YT-AG培养基中的过夜培养菌液，进行测序分析。其中重复序列以1条计，最 终获得独特的单克隆抗体序列有7条重链8条轻链，CDR区具体序列见表3所示SEQ ID NO:1～45。包含骨架区的重链可变区及轻链可变区的具体序列见表4所示SEQ ID NO: 50～64。
表3单克隆抗体CDR区具体序列
Figure BDA0001550377280000141
表4单克隆抗体可变区具体序列
Figure BDA0001550377280000151
实施例4：全长抗体制备
1、全长抗体瞬时转染表达载体的构建
分别选择pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作为构建抗人PD-L1全长抗体的重链和轻链的表达载体。根据VH、VL的基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。经PCR 扩增后，使用体外重组的方法将7个VH和8个VL抗体基因分别克隆到pGS003-hIgG1CH 和pGS003-hIgKCL，如表5。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆 菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养 16小时。使用ZymoResearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯 水，用分光光度计测定质粒浓度和OD260/280。OD260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒 DNA。
表5、重链和轻链瞬时转染表达载体列表
重链表达载体名称 轻链表达载体名称
H1 L1
H2 L2
H3 L3
H4 L4
H5 L5
H6 L6
H7 L7
L8
2、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测
将上述7个重链表达载体和8个轻链表达载体两两组合(共56种组合)后进行2ml293E 体系的瞬时转染表达评估，对56种组合进行表达量评估，对表达量评估后将56种表达上 清均稀释至100ng/mL后进行ELISA测定评估，具体数值见表6，优选H2L5、H2L7、H2L8、H4L4、H4L6、H7L2这6个全长抗体，命名为047HAb-1(H2L5)、047HAb-2(H2L7)、 047HAb-3(H2L8)、047HAb-4(H4L4)、047HAb-5(H4L6)、047HAb-6(H7L2)。
表6、7×8组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量及ELISA检测值
Figure BDA0001550377280000161
Figure BDA0001550377280000171
使用293E细胞在Freestyle培养基中进行6个优选抗体的瞬时转染表达。转染前24小 时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/ml的293E细胞300ml，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的OPtiMEM中，充分混 匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各300μg使用OPtiMEM稀释至6ml。 将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细 胞中，混匀，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养7天。
3、抗体的纯化及检测
2000g 20min离心细胞培养液，收集上清，用Octet检测上清中抗体表达量，见表7。
表7、6个优选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测
抗体名称 重链序列 轻链序列 瞬时转染表达量(mg/L)
047HAb-1 H2 L5 130.67
047HAb-2 H 2 L7 94.33
047HAb-3 H 2 L8 135.67
047HAb-4 H 4 L4 122.00
047HAb-5 H 4 L6 106.67
047HAb-6 H 7 L2 146.67
将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过MabSelect SuRe亲和层析柱(GE)，20mM 枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性，加入10×PBS调节成等 渗溶液。4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结 果见图5。
实施例5：优选抗体KD值的测定
应用Biacore-T200检测，使用ProteinA芯片捕获优选抗体或阳性抗体，用不同浓度的 hPD-L1，mPD-L1流经芯片，根据采集数据进行拟合分析。检测样品浓度分别200nmol/L、 100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L、6.25nmol/L、3.125nmol/L、1.56nmol/L、0.78nmol/L、0.39nmol/L、0.195nmol/L、0nmol/L，其中以12.5nmol/L样品为重复检测样品。检测条件为：捕获时间，30s；结合时间120s；解离时间900s；流速30μl/min，再 生条件为3M MgCl2/30μl/min/30s。具体实验结果见表8。结果表明相对于阳性对照抗体， 6个优选抗体均与抗原有较强的特异性结合。
表8、6个优选抗体KD值检测
抗体名称 hPD-L1KD(M) mPD-L1KD(M)
047HAb-1 2.039E-10 2.764E-10
047HAb-2 2.996E-10 2.865E-10
047HAb-3 2.444E-10 2.236E-10
047HAb-4 1.148E-10 1.462E-10
047HAb-5 1.008E-10 1.287E-10
047HAb-6 1.487E-10 1.629E-10
047P01 2.286E-9 3.322E-9
注：E-9：×10-9；E-10：×10-10
实施例6：优选抗体抗原表位竞争ELISA
包被：将hPD-L1-His用PBS稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μl，2～8℃孵育过夜。
封闭：用PBST洗板三次后，用3％BSA封闭，每孔200μl，25℃下孵育1小时。
样品处理：取50μl 047HAb 1～6号纯化抗体，以150μg/ml为起始浓度进行2倍梯度稀释(20～2-7)，分别按1:1与P01-生物素化(1μg/ml)混合均匀，100μl/孔，25℃孵育1 h。
加抗体：用PBST洗板四次后，加入抗生物素-HRP抗体，1:8000稀释，50μl/孔，25℃孵育1h。
显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色2分钟。
终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。
检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。
数据处理：将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。具体数据图见 图6和表9。结果显示6个优选抗体均可竞争人PD-L1与人PD-1的结合。
表9、6个优选抗体抗原表位竞争ELISA值
Figure BDA0001550377280000181
Figure BDA0001550377280000191
实施例7：剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD-1的结合(ELISA)
包被：hPD1-hIgG1Fc(购自ACROBiosystems，Cat.#PD1-H5257)用PBS稀释成1μg/ml， 加至酶标板96孔中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。
封闭：洗板三次后用1％BSA封闭，每孔300μl，37℃下孵育2小时。
加抗体：抗体2633ng/ml起始浓度按1.5倍稀释并与hPDL1-mIgG1Fc(购自ACROBiosystems，Cat.#PD1-H52A3)1μg/ml 1:1(V/V)混合，37℃20min。每孔100μl 25℃下孵育1小时。
加二抗：洗板三次后，分别对应加入羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(1:5000)，每孔50μl， 25℃下孵育1小时。
显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色5分钟。
终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。
检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。
数据处理：将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。具体结果见图 7和表10。结果显示6个优选抗体均可阻断PD-L1与人PD-1的结合且成剂量依赖性(6个优选抗体分两次做了检测，一次做了047HAb-1～047HAb-4 4个样品，一次做了047HAb-5 和047HAb-6 2个样品，分别与同批次的047P01阳性抗体比较)。
表10、6个优选抗体剂量依赖性阻断人PD-L1与人PD-1的结合EC50值
Figure BDA0001550377280000192
实施例8：混合淋巴细胞(MLR)方法检测抗体的效用
用混合淋巴细胞方法检测6个优选抗体对T细胞的刺激作用。T细胞的活性通过IL-2 (Human IL2HTRF kit，Cisbio，Cat#64IL2PEB)的检测体现。取超过20名健康献血者的 血液，用淋巴细胞分离液对血液进行梯度离心制备外周血细胞，使用CD4+T细胞分离试 剂盒(Miltenyi Biotec，Cat#130-096-533)纯化CD4+T细胞；使用单核细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Cat#130-096-537)纯化树突状(DC)细胞。将CD4+T细胞及DC细胞 置于CO2培养箱中培养。1000rpm，3min收集效应细胞(CD4+T细胞)；用检测缓冲液 梯度稀释抗体样品，终浓度依次为50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml,0.67μg/ml、0.22μg/ml、 0.07μg/ml、0.02μg/ml和0.01μg/ml；将抗体样品加入96孔检测板然后添加测试样品；1000 rpm，3min收集靶细胞(树突状细胞)；向96孔板中加入靶细胞，轻轻混匀，启动反应； 将培养板置于CO2培养箱中培养3天；通过96孔板的读数检测人IL-2的数值。实验结果 见图8。
由此结果可知6个优选抗体均能够有效的刺激T细胞，而小鼠IgG1及人IgG4无此效应。此实验中Keytruda对T细胞的活性作为抗体效应的对照样品，小鼠IgG1及人IgG4 作为阴性对照。6个优选抗体在对T细胞效应上的EC50值分别为047HAb-1(H2L5)0.06291 μg/ml、047HAb-2(H2L7)0.1213μg/ml、047HAb-3(H2L8)0.08032μg/ml、047HAb-4(H4L4) 0.06041μg/ml、047HAb-5(H4L6)0.07253μg/ml和047HAb-6(H7L2)0.07935μg/ml。6 个优选抗体实验时Keytruda对T细胞效应上的EC50值分别为0.2091μg/ml、0.1585μg/ml、 0.1002μg/ml、0.1251μg/ml、0.1314μg/ml、0.1545μg/ml。从以上数据可知，6个优选抗体 的细胞活性都优于Keytruda。
实施例9：筛选抗体对C57BL/6小鼠结肠癌模型的治疗疗效
从6个优选抗体中选出4个047HAb-1，047HAb-2，047HAb-3，047HAb-5进行动物 实验。实验动物采用C57BL/6小鼠，体重18～22g，鼠龄6～8周。体外培养MC38肿瘤细 胞，常规传代培养指数期内收集肿瘤细胞计数。将MC38肿瘤细胞置于PBS及基质胶(PBS： 基质胶＝50μl：50μl)溶液中对小鼠进行皮下注射，刺激肿瘤生长，接种肿瘤后5天，肿 瘤平均大小达到65毫米。此时将80只肿瘤小鼠随机分成A、B、C、D、E、F、G、H共8 组，其中每组10只。其中A组为047HAb-1抗体治疗组；B为047HAb-2抗体治疗组；C 为047HAb-3抗体治疗组；D为PBS阴性对照组；E为阳性对照047P01抗体治疗组；F为 047HAb-5抗体；G为WX-mPD-L1阳性对照组；H为人IgG1同型对照抗体；分别于第0、 3、6、9、13、15给予药物治疗，治疗剂量为10mg/kg，同时监测记录小鼠的体重及肿瘤 大小。治疗疗效标准为是否可以延迟或治愈小鼠的肿瘤生长。
由实验结果可知，随机分组后第15天，PBS对照组小鼠肿瘤平均体积达到2715mm3。而A、B、C、E、F、G组产生显著的抑制肿瘤生长效果，第15天肿瘤的平均体积分别为 450、476、705、578、778、637mm3(见图9)，肿瘤抑制率分别为83％,82％,74％,79％, 71％，77％。通过方差分析，A、B、C、F四种优选抗体相对于对照组，其P值<0.001， 具有显著性差异，表现出显著的抗肿瘤疗效，其中组A的疗效最为显著，结果见图10。
序列表
<110> 长春金赛药业股份有限公司
<120> 全人源抗人PD-L1单克隆抗体及其应用
<130> MP1727046
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Gln Asp
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Ser Asp Phe Ala Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Arg Asp
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Ser Gly Phe Thr Phe Ile Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr His Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Met
1 5 10 15
Gln Asp
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Ala Thr Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Asn
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Arg Ala Ser Ser Asp Val Phe Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Ser Ala Ser Phe Lys His Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Thr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Arg Ala Asn Gln Asp Val Ala Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
Ser Ala Ser Tyr Pro Tyr Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Arg Ala Ser His Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
Gln Gln Tyr Met Tyr Gln Pro Ser Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Arg Ala Ser Arg Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Ser Ala Ser Phe Pro Asn Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Thr Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
Arg Ala Ser Arg Asp Val Thr Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
Ser Ala Ser Phe Thr Asn Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Thr Thr
1 5
<210> 46
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 47
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
35 40 45
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr
100 105 110
His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 48
<211> 782
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
aagcttaatt gccgccacca tgaggatatt tgctgtcttt atattcatga cctactggca 60
tttgctgaac gcatttactg tcacggttcc caaggaccta tatgtggtag agtatggtag 120
caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa ttagacctgg ctgcactaat 180
tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt gtgcatggag aggaagacct 240
gaaggttcag catagtagct acagacagag ggcccggctg ttgaaggacc agctctccct 300
gggaaatgct gcacttcaga tcacagatgt gaaattgcag gatgcagggg tgtaccgctg 360
catgatcagc tatggtggtg ccgactacaa gcgaattact gtgaaagtca atgccccata 420
caacaaaatc aaccaaagaa ttttggttgt ggacccagtc acctctgaac atgaactgac 480
atgtcaggct gagggctacc ccaaggccga agtcatctgg acaagcagtg accatcaagt 540
cctgagtggt aagaccacca ccaccaattc caagagagag gagaagctct tcaatgtgac 600
cagcacactg agaatcaaca caacaactaa tgagattttc tactgcactt ttaggagatt 660
agatcctgag gaaaaccata cagctgaatt ggtcatccca gaactacctc tggcacatcc 720
tccaaatgaa aggacttccg gaggtggagg ttcccatcac catcaccacc atcattgaat 780
tc 782
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20 25 30
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asp Val Phe Thr Ala
20 25 30
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Asp Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Pro Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Asn Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Asn Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (10)

1.一种抗PD-L1的单克隆抗体，其具有如下重链可变区和轻链可变区：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:61所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述轻链的恒定区为κ型或λ型。
3.编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核苷酸。
4.一种表达载体，包括编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核苷酸。
5.一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由权利要求4所述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。
6.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体。
7.一种偶联物，其由权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体或权利要求6所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
8.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物。
9.权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体和/或如权利要求6所述的结合物和/或如权利要求7所述的偶联物和/或如权利要求8所述的药物组合物在制备治疗与PD-1相关的疾病的药物中的应用，所述与PD-1相关的疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤。
10.一种诊断的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的抗PD-L1单克隆抗体或如权利要求6所述的结合物或如权利要求7所述的偶联物。
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA42971A (fr) 2015-03-13 2018-08-15 Cytomx Therapeutics Inc Anticorps anti-pdl1, anticorps anti-pld1 activables, et leurs procédés d'utilisation
WO2018222949A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
CN109053891B (zh) * 2018-09-17 2021-12-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用
CN111378044B (zh) * 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
CN111378038A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 复旦大学 针对人细胞程序化死亡受体-1的人源单克隆抗体及其应用
CN111378045B (zh) * 2018-12-28 2022-08-02 长春金赛药业有限责任公司 二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物
CN111518205B (zh) * 2019-02-01 2022-03-29 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN111518207B (zh) * 2019-02-01 2022-03-29 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN111518206B (zh) * 2019-02-01 2022-03-29 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN109776678A (zh) * 2019-03-08 2019-05-21 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种人源化pd-l1单克隆抗体、其制备方法和应用
CN111662383B (zh) * 2019-03-08 2024-06-14 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
CN109748965A (zh) * 2019-03-13 2019-05-14 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 全人源pd-l1单克隆抗体及其制备方法和应用
CN112409483A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 浙江道尔生物科技有限公司 抗pd-l1纳米抗体
CN114341180B (zh) * 2019-08-23 2023-09-22 上海药明生物技术有限公司 抗pd-l1的人源化抗体
CN112759647B (zh) * 2019-10-21 2024-03-26 上海宏成药业有限公司 一种抗pd-l1的抗体及其制药用途
US20230073067A1 (en) * 2020-02-24 2023-03-09 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science Humanized monoclonal antibody for 2019 novel coronavirus and use thereof
CN113372445B (zh) * 2020-03-10 2023-09-12 鲁南制药集团股份有限公司 一种抗pd-1单克隆抗体
EP4126938A4 (en) * 2020-03-27 2024-04-10 Biosion Inc ANTIBODIES BINDING TO SIGLEC15 AND THEIR USES
CN113150153B (zh) * 2021-04-15 2022-05-10 博奥信生物技术（南京）有限公司 一种抗人pdl1单克隆抗体及其用途
CN113150155B (zh) * 2021-04-22 2022-04-08 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-l1人源化单克隆抗体及其应用
CN113336850B (zh) * 2021-06-02 2023-06-23 河南中医药大学 一种抗人pd-l1单克隆抗体及其应用
CN113354736B (zh) * 2021-07-05 2022-05-20 艾柏森(江苏)生物科技有限公司 靶向人pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用
CN113896793B (zh) * 2021-09-30 2023-05-26 港科鹏禾生物(苏州)有限公司 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用
CN114380913B (zh) * 2022-03-24 2022-06-21 上海济煜医药科技有限公司 一种全人源抗pd-l1抗体及其应用
CN115010807B (zh) * 2022-06-29 2023-10-17 广东赛尔生物科技有限公司 单克隆抗体和载药的干细胞在制备治疗宫颈癌的药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105061597A (zh) * 2015-06-09 2015-11-18 北京东方百泰生物科技有限公司 一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法
CN105968200A (zh) * 2016-05-20 2016-09-28 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人pd-l1人源化单克隆抗体及其应用
CN106008714A (zh) * 2016-05-24 2016-10-12 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人pd-1人源化单克隆抗体及其应用
CN107151269A (zh) * 2016-03-04 2017-09-12 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl‑1抗体、其药物组合物及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105061597A (zh) * 2015-06-09 2015-11-18 北京东方百泰生物科技有限公司 一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法
CN107151269A (zh) * 2016-03-04 2017-09-12 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl‑1抗体、其药物组合物及其用途
CN105968200A (zh) * 2016-05-20 2016-09-28 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人pd-l1人源化单克隆抗体及其应用
CN106008714A (zh) * 2016-05-24 2016-10-12 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人pd-1人源化单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PD-1 抗体在肿瘤治疗中的应用;曹佳彬;《中国生物制品学杂志》;20140630;第27卷(第6期);第856-861页 *
免疫检查点ＰＤ－１及其抗体在肿瘤中的研究进展;谢璐鸿;《检验医学与临床》;20170531;第14卷(第9期);第1353-1356页 *
抗PD － 1 抗体的抗肿瘤效应及机制;廉阳秧;《广东医学》;20170131;第38卷(第2期);第186-190页 *

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