TW202222836A

TW202222836A - 特異性結合糖基化ceacam5的抗體

Info

Publication number: TW202222836A
Application number: TW110146455A
Authority: TW
Inventors: 牟男; 于躍; 袁紀軍
Original assignee: 大陸商上海吉倍生物技術有限公司
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-06-16
Also published as: TWI804099B

Abstract

本申請提供了特異性結合糖基化CEACAM5的抗體，其人源化抗體的製備及應用。

Description

特異性結合糖基化CEACAM5的抗體

本發明涉及單殖株抗體。更具體地，本申請涉及與糖基化CEACAM5特異性結合的單殖株抗體，其人源化抗體的製備及應用。

在中國，胃腸道相關腫瘤包含結直腸癌、胃癌、食管癌等每年新發數量為52萬、46萬和31萬（WHO，2018），因此胃腸道相關腫瘤已超過肺癌成為我國癌症發病率第一的癌種。目前，針對胃腸道腫瘤的治療方法，主要包括手術治療、化療、標靶治療和免疫治療。常用的化療藥物包括多西他賽、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、鉑類等；標靶治療藥物包括VEGFR單抗、Her2單抗等；免疫治療主要為PD1/PDL1抗體等。

人癌胚抗原細胞黏附因數（CEACAM）家族在上世紀60年代被發現，CEA家族在多種胃腸道及肺癌腫瘤中高度表現，例如結直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌等。CEACAM家族由CEACAM亞群和PSG家族構成，其特點為胞外區有IgV結構域串聯形成高度相似的結構並高度糖基化（糖基化占50%分子量），其胞外區由A1-B1-A2-B2-A3-B3結構串聯組成（A1-3或B1-3為高度同源結構）；常見CEA分子為CEACAM5（CD66e），藉由糖基磷脂醯肌醇（GPI）偶聯至細胞膜上，並可藉由酶降解GPI（例如磷脂酶C）釋放至血液中；CEACAM5分子參與細胞黏附（藉由CEA家族同源或異源二聚體，例如CEACAM6）、胞內訊號傳遞、腫瘤轉移和耐藥發生相關；同時CEACAM5與胃腸道大腸桿菌的黏附相關。

CEACAM5是高度糖基化的蛋白抗原，因此重組表現的CEACAM5（例如293系統）抗原可能與腫瘤細胞自身表現的CEACAM5蛋白的糖基化不同，因此本領域需要一種能夠識別天然CEACAM5抗原的抗體。另外，CEACAM5少量表現於正常組織例如消化道，其位於消化道的apical面；在腫瘤細胞中CEACAM5表現於apical和basolateral面， CEACAM5抗體藥物較難到達腫瘤部位，因此，本領域需要解決提高CEACAM5抗體藥物局部濃度的問題。

本發明的一個方面提供了針對糖基化CEACAM5的單殖株抗體抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段特異性結合糖基化CEACAM5的結構域A1-B1，A2-B2，和/或A3-B3。

在具體實施方案中，本發明的單殖株抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:2所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:3所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:5所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:6所示的CDR-L3； b. 該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:7所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:8所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:9所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:10所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:11所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:12所示的CDR-L3； c. 該重鏈可變區包含由SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:15所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:18所示的CDR-L3；或 d. 該重鏈可變區包含由SEQ ID NO:19所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:20所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:21所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO:22所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:23所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:24所示的CDR-L3。

在一個具體實施方式中，本發明的單殖株抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： a）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 25所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 26所示的多肽； b）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 27所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 28所示的多肽； c）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 29所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 30所示的多肽；或 d）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 31所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 32所示的多肽。

在一個方面，本發明提供了特異性結合糖基化CEACAM5的人源化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：該輕鏈可變區包含：選自SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:126的CDR-L1；選自SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:127的CDR-L2；和選自SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:128的CDR-L3，並且該重鏈可變區包含：選自SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:129的CDR-H1；選自SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:130的CDR-H2；和選自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:131的CDR-H3。

在一個具體實施方案中，本發明的人源化抗體的輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO: 68、70、72、74、76、78、80、82的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO: 69、71、73、75、77、79、81、83的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在較佳的技術方案中，本發明的人源化抗體包含：由選自SEQ ID NO:52、54、56、58、60、62、64、66的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區，以及由選自SEQ ID NO: 53、55、57、59、61、63、65、67的核苷酸序列編碼的重鏈可變區。

在較佳的技術方案中，本發明的人源化抗體包含選自SEQ ID NO: 68、70、72、74、76、78、80、82的輕鏈可變區和選自SEQ ID NO: 69、71、73、75、77、79、81、83的重鏈可變區。

在較佳的技術方案中，本發明的人源化抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中： a. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:84所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:85所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:86所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:87所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:88所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:89所示的CDR-L3； b. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:90所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:91所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:92所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:93所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:94所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:95所示的CDR-L3； c. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:96所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:97所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:98所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:99所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:100所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:101所示的CDR-L3； d. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:102所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:103所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:104所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:105所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:106所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:107所示的CDR-L3； e. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:108所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:109所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:110所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:111所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:112所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:113所示的CDR-L3； f. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:114所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:115所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:116所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:117所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:118所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:119所示的CDR-L3； g. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:120所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:121所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:122所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:123所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:124所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:125所示的CDR-L3；或 h. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:126所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:127所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:128所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:129所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:130所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:131所示的CDR-L3。

在另一個方面，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼特異性結合糖基化CEACAM5的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。

在另一個方面，本發明涉及包含編碼如本文所揭露的特異性結合糖基化CEACAM5的抗體的核酸分子的表現載體。

在另一個方面，本發明涉及包含本文揭露的表現載體的宿主細胞。

在另一個方面，本發明涉及包含至少一種本文揭露的特異性結合糖基化CEACAM5的抗體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。

在另一個方面，本發明涉及用於製備特異性結合糖基化CEACAM5的抗體的方法，其包括在宿主細胞中表現編碼如本文所揭露的特異性結合糖基化CEACAM5的抗體的核酸序列並從宿主細胞分離特異性結合糖基化CEACAM5的抗體。

在另一個方面，本發明提供了本發明的抗體在製備用於治療胃腸道相關腫瘤的藥物中的用途。

在另一個方面，本發明提供了一種治療胃腸道相關腫瘤的方法，包括向有此需要的受試者施用本發明的抗體。單殖株抗體的製備及篩選

可以如下來製備單殖株抗體。首先用免疫原(必要時候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動物。免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點注射或腹腔注射。可將免疫原預先偶聯到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制劑上，以增強抗原在宿主內的免疫原性。佐劑可以是弗氏佐劑或MPL-TDM等。動物在接受免疫後，體內將產生分泌特異性結合免疫原的抗體的淋巴細胞。另外，淋巴細胞也可以利用體外免疫獲得。收集目的淋巴細胞，並用合適的融合劑，如PEG，使其與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996)。較佳的骨髓瘤細胞應該具有融合率高，抗體分泌能力穩定，對HAT培養液敏感等特徵。生長雜交瘤細胞的培養液用於檢測針對特異抗原的單抗的產生。測定雜交瘤細胞產生的單抗的結合特異性的方法包括例如，免疫沉澱或體外結合試驗，如放射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal. Biochem. 107: 220 (1980)描述的Scatchard分析法來測定單抗的親和力。當確定了雜交瘤產生的抗體的特異性、親和力和反應性之後，目的細胞株可以藉由(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996)所描述的標準的有限稀釋法進行次選殖化。合適的培養液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，雜交瘤細胞還可以腹水瘤的形式在動物體內生長。利用傳統的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將次選殖細胞分泌的單抗從細胞培養液、腹水或血清中分離出來。

還可以藉由基因工程重組技術獲得單殖株抗體。利用特異性結合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進行PCR擴增，可以從雜交瘤細胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。將所得的DNA分子插入表現載體內，然後轉染宿主細胞(如E. coli細胞、COS細胞、CHO細胞、或其它不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞)，並在合適的條件下進行培養，可以獲得重組表現的目標抗體。

本發明採用CEACAM5高表現的腫瘤細胞系（例如Lovo）進行小鼠免疫，以獲取識別天然CEACAM5抗原的抗體。

藉由CRISPR技術利用sgRNA引導Cas9對目標基因組進行切割，高效敲除基因表現，建構了CEACAM5敲除細胞系，用於高效篩選特異性CEACAM5抗體。本發明篩選得到的抗體同時結合CEACAM5三個結構域（A1-B1，A2-B2，A3-B3），因此可提高CEACAM5高表現腫瘤細胞的表面結合量，從而提高其局部濃度，提高藥效。人源化抗體

對篩選得到鼠源抗體進行人源化設計和篩選可能降低臨床應用中HAMA（Human Anti Mouse Antibody）效應，降低患者體內中和抗體產生，提高藥物的血藥濃度從而提高藥效。

“人源化抗體”是包含人源化VH結構域和人源化VL結構域中的一者或兩者的抗體。一個或多個免疫球蛋白恆定區無需存在，但如果存在的話，那麼其完全或大體上來自人類免疫球蛋白恆定區。

人源化抗體是基因工程改造的抗體，其中來自非人類“供體”抗體的CDR接枝至人類“接受體”抗體序列中(參見例如Queen，US 5,530,101和5,585,089；Winter，US 5,225,539；Carter，US 6,407,213；Adair，US 5,859,205；以及Foote，US 6,881,557)。接受體抗體序列可為例如成熟人類抗體序列、此類序列的複合物、人類抗體序列的共有序列或生殖區序列。可選擇人類接受體序列以使可變區構架與供體序列具有高程度序列同一性，以匹配接受體CDR與供體CDR之間的典型形式和其它準則。因此，人源化抗體是CDR完全或大體上來自供體抗體和可變區構架序列並且恆定區(如果存在的話)完全或大體上來自人類抗體序列的抗體。類似地，人源化重鏈通常具有完全或大體上來自供體抗體重鏈和重鏈可變區構架序列的所有三個CDR以及大體上來自人類重鏈可變區構架和恆定區序列的重鏈恆定區(如果存在的話)。類似地，人源化輕鏈通常具有完全或大體上來自供體抗體輕鏈和輕鏈可變區構架序列的所有三個CDR以及大體上來自人類輕鏈可變區構架和恆定區序列的輕鏈恆定區(如果存在的話)。當各別CDR之間對應的殘基(如依Kabat編號定義)的至少約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同時或其中對應的殘基(如依Kabat編號定義)的約100％相同，人源化抗體中的CDR大體上來自非人類抗體中的對應的CDR。當對應的殘基(可變區依Kabat編號定義並且恆定區依EU編號定義)的至少約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同或對應的殘基(可變區依Kabat編號定義並且恆定區依EU編號定義)的約100％相同時，抗體鏈的可變區構架序列或抗體鏈的恆定區分別大體上來自人類可變區構架序列或人類恆定區。

雖然人源化抗體常常合併有來自小鼠抗體的所有六個CDR(較佳如依Kabat或IMGT定義)，但人源化抗體還可由來自小鼠抗體的少於所有六個CDR(例如，至少3個、4個或5個)CDR組成(例如，Pascalis等,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。

當個別CDR之間對應的殘基(如依Kabat或IMGT)定義)的至少60％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同時，人源化抗體中的CDR“大體上來自”非人類抗體中的對應的CDR。在CDR大體上來自非人類免疫球蛋白的人源化VH或VL結構域的特定變化中，人源化VH或VL結構域的CDR相對於對應的非人類VH或VL CDR跨越所有三個CDR具有不多於六個(例如，不多於五個、不多於四個、不多於三個、不多於兩個或不多於一個)氨基酸取代(較佳保守性取代)。當對應的殘基(可變區依Kabat編號定義並且恆定區依EU編號定義)的至少約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同或對應的殘基(可變區依Kabat編號定義並且恆定區依EU編號定義)的約100％相同時，抗體VH或VL結構域的可變區構架序列或免疫球蛋白恆定區的序列(如果存在的話)分別“大體上來自”人類VH或VL構架序列或人類恆定區。因此，人源化抗體的所有部分(CDR除外)通常完全或大體上來自天然人類免疫球蛋白序列的對應部分。一般性術語定義

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

如本文中所使用的，術語“抗體”是指，通常由兩對多肽鏈（每對具有一條輕鏈和一條重鏈）組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，並且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區藉由大約12或更多個氨基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(CDR))，其間散佈有較保守的稱為構架區(FR)的區域。各VH和VL由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗體結合部位。氨基酸至各區域或結構域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))，或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人 (1989) Nature 342:878-883的定義。術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，重組抗體、單殖株抗體和多殖株抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG (例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文藉由引用合併入本文，用於所有目的。可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。

可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體獲得抗體的抗原結合片段(例如，上述抗體片段)，並且以與用於完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。

如本文中所使用的，術語“單抗”和“單殖株抗體”是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片段，也即，除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多殖株抗體是相對於單殖株抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。單殖株抗體通常可採用Kohler等首次報導的雜交瘤技術獲得(Nature, 256:495 ,1975)，但也可採用重組DNA技術獲得(如參見U.S.P 4,816,567)。

例如，可以如下來製備單殖株抗體。首先用免疫原(必要時候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動物。免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點注射或腹腔注射。可將免疫原預先偶聯到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制劑上，以增強抗原在宿主內的免疫原性。佐劑可以是弗氏佐劑或MPL-TDM等。動物在接受免疫後，體內將產生分泌特異性結合免疫原的抗體的淋巴細胞。另外，淋巴細胞也可以利用體外免疫獲得。收集目的淋巴細胞，並用合適的融合劑，如PEG，使其與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996)。上述製備的雜交瘤細胞可以接種到合適的培養液中生長，培養液中較佳含有一種或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細胞生長的物質。例如，對於缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉移酶(HGPRT或HPRT)的母體骨髓瘤細胞，在培養液中添加次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培養基)等物質將可以抑制HGPRT-缺陷細胞的生長。較佳的骨髓瘤細胞應該具有融合率高，抗體分泌能力穩定，對HAT培養液敏感等特徵。其中，骨髓瘤細胞首選鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠腫瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)，和SP-2/0或X63-Ag8-653細胞株(American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA)。另外也有研究報導，利用人骨髓瘤和人鼠異源骨髓瘤細胞株製備人單抗(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)。生長雜交瘤細胞的培養液用於檢測針對特異抗原的單抗的產生。測定雜交瘤細胞產生的單抗的結合特異性的方法包括例如，免疫沉澱或體外結合試驗，如放射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal. Biochem. 107: 220 (1980)描述的Scatchard分析法來測定單抗的親和力。當確定了雜交瘤產生的抗體的特異性、親和力和反應性之後，目的細胞株可以藉由(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996)所描述的標準的有限稀釋法進行次選殖化。合適的培養液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，雜交瘤細胞還可以腹水瘤的形式在動物體內生長。利用傳統的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將次選殖細胞分泌的單抗從細胞培養液、腹水或血清中分離出來。

如本文中所使用的，術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984))。

如本文中所使用的，術語“人抗體”是指人源化抗體，人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分CDR區被一非人源抗體(供體抗體)的CDR區替換後得到的抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是具有預期特異性、親和性或反應性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗體。此外，受體抗體的構架區(FR)的一些氨基酸殘基也可被相應的非人源抗體的氨基酸殘基替換，或被其他抗體的氨基酸殘基替換，以進一步完善或優化抗體的性能。關於人源化抗體的更多詳細內容，可參見例如，Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992);和Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)。

如本文中所使用的，術語“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。“表位”在本領域內也稱為“抗原決定簇”。表位元或抗原決定簇通常由分子的化學活性表面基團例如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。例如，表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的氨基酸，其可以是“線性的”或“構象的”。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G. E. Morris，Ed. (1996)。在線性表位元中，蛋白質與相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用的點沿著蛋白質的一級氨基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的蛋白質氨基酸殘基而存在。

如本文中所使用的，術語“表位肽”是指，抗原上能夠用作表位的肽段。在一些情況下，單獨的表位肽即能夠被針對該表位的抗體特異性識別/結合。在另一些情況下，可能需要將表位元肽與載體蛋白融合，以便表位肽能夠被特異性抗體識別。如本文中所使用的，術語“載體蛋白”是指這樣的蛋白，其可以充當表位肽的載體，即，其可以在特定位置處(例如蛋白內部，N端或C端)插入表位肽，以便該表位肽能夠呈現出來，從而該表位肽能夠被抗體或免疫系統識別。此類載體蛋白是本領域技術人員熟知的，包括例如，HPV L1蛋白(可以將表位肽插入在該蛋白的第130-131位氨基酸之間或在第426-427位氨基酸之間，參見Slupetzky, K.等 Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J]. J Gen Virol,2001, 82: 2799-2804；Varsani, A.等 Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003, 77: 8386-8393)，HBV核心抗原(可以用表位肽替換該蛋白的第79-81位氨基酸，參見Koletzki, D., et al. HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein[J]. Biol Chem,1999, 380: 325-333)，土撥鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替換該蛋白的第79-81位氨基酸，參見Sabine König, Gertrud Beterams and Michael Nassal，J. Virol. 1998, 72(6):4997)，CRM197蛋白(可以將表位肽連接至該蛋白或其片段的N末端或C末端)。任選地，可以在表位肽與載體蛋白之間使用連接體(例如柔性或剛性連接體)，以促進二者各自的折疊。

可使用本領域技術人員已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原(例如，流感病毒血凝素蛋白)的結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利申請WO 03/48731中。因此，可使用本領域技術人員已知的常規技術，獲得與本發明的單殖株抗體競爭結合流感病毒血凝素蛋白上的相同表位的抗體及其抗原結合片段(即，抗原結合部分)。

如本文中使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小於大約10 ^-5M，例如小於大約10 ^-6M、10 ^-7M、10 ^-8M、10 ^-9M或10 ^-10M或更小的親和力(K _D)結合該抗原。

如本文中所使用的，術語“K _D”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。可以使用多種方法測定，例如使用表面等離子體共振術(SPR)在BIACORE儀中測定。

如本文中所使用的，術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”可互換使用，並且當提及術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”時，其還包括雜交瘤的次選殖和後代細胞。例如，當提及雜交瘤細胞株2F4時，其還指雜交瘤細胞株2F4的次選殖和後代細胞。

序列資訊

本申請涉及的部分序列資訊描述於下表中，其餘描述於實施例中。

SEQ ID NO:	描述
1	M19重鏈可變區 CDR1
2	M19重鏈可變區 CDR2
3	M19重鏈可變區 CDR3
4	M19輕鏈可變區 CDR1
5	M19輕鏈可變區 CDR2
6	M19輕鏈可變區 CDR3
7	M7重鏈可變區CDR1
8	M7重鏈可變區 CDR2
9	M7重鏈可變區 CDR3
10	M7輕鏈可變區 CDR1
11	M7輕鏈可變區 CDR2
12	M7輕鏈可變區 CDR3
13	M17重鏈可變區CDR1
14	M17重鏈可變區 CDR2
15	M17重鏈可變區 CDR3
16	M17輕鏈可變區 CDR1
17	M17輕鏈可變區 CDR2
18	M17輕鏈可變區 CDR3
19	M18重鏈可變區CDR1
20	M18重鏈可變區 CDR2
21	M18重鏈可變區 CDR3
22	M18輕鏈可變區 CDR1
23	M18輕鏈可變區 CDR2
24	M18輕鏈可變區 CDR3
25	M19重鏈可變區
26	M19輕鏈可變區
27	M7重鏈可變區
28	M7輕鏈可變區
29	M17重鏈可變區
30	M17輕鏈可變區
31	M18重鏈可變區
32	M18輕鏈可變區
33	抗體hMN14輕鏈可變區
34	抗體hMN14重鏈可變區
35	CEACAM5 KO1 sgRNA序列
36	CEACAM5 KO2 sgRNA序列
37	CEACAM5 KO3 sgRNA序列
38	M19重鏈可變區核苷酸序列
39	M19輕鏈可變區核苷酸序列
40	M7重鏈可變區核苷酸序列
41	M7輕鏈可變區核苷酸序列
42	M17重鏈可變區核苷酸序列
43	M17輕鏈可變區核苷酸序列
44	M18重鏈可變區核苷酸序列
45	M18輕鏈可變區核苷酸序列
46	胞外結構域A1-B1-His核苷酸序列
47	胞外結構域A1-B1-His氨基酸序列
48	胞外結構域A2-B2-His核苷酸序列
49	胞外結構域A2-B2-His氨基酸序列
50	胞外結構域A3-B3-His核苷酸序列
51	胞外結構域A3-B3-His氨基酸序列
52	人源化抗體hAb-009輕鏈可變區核苷酸序列
53	人源化抗體hAb-009重鏈可變區核苷酸序列
54	人源化抗體hAb-003輕鏈可變區核苷酸序列
55	人源化抗體hAb-003重鏈可變區核苷酸序列
56	人源化抗體hAb-005輕鏈可變區核苷酸序列
57	人源化抗體hAb-005重鏈可變區核苷酸序列
58	人源化抗體hAb-006輕鏈可變區核苷酸序列
59	人源化抗體hAb-006重鏈可變區核苷酸序列
60	人源化抗體hAb-010輕鏈可變區核苷酸序列
61	人源化抗體hAb-010重鏈可變區核苷酸序列
62	人源化抗體hAb-013輕鏈可變區核苷酸序列
63	人源化抗體hAb-013重鏈可變區核苷酸序列
64	人源化抗體hAb-016輕鏈可變區核苷酸序列
65	人源化抗體hAb-016重鏈可變區核苷酸序列
66	人源化抗體hAb-017輕鏈可變區核苷酸序列
67	人源化抗體hAb-017重鏈可變區核苷酸序列
68	人源化抗體hAb-009輕鏈可變區氨基酸序列
69	人源化抗體hAb-009重鏈可變區氨基酸序列
70	人源化抗體hAb-003輕鏈可變區氨基酸序列
71	人源化抗體hAb-003重鏈可變區氨基酸序列
72	人源化抗體hAb-005輕鏈可變區氨基酸序列
73	人源化抗體hAb-005重鏈可變區氨基酸序列
74	人源化抗體hAb-006輕鏈可變區氨基酸序列
75	人源化抗體hAb-006重鏈可變區氨基酸序列
76	人源化抗體hAb-010輕鏈可變區氨基酸序列
77	人源化抗體hAb-010重鏈可變區氨基酸序列
78	人源化抗體hAb-013輕鏈可變區氨基酸序列
79	人源化抗體hAb-013重鏈可變區氨基酸序列
80	人源化抗體hAb-016輕鏈可變區氨基酸序列
81	人源化抗體hAb-016重鏈可變區氨基酸序列
82	人源化抗體hAb-017輕鏈可變區氨基酸序列
83	人源化抗體hAb-017重鏈可變區氨基酸序列
84	人源化抗體hAb-009輕鏈可變區CDR1序列
85	人源化抗體hAb-009輕鏈可變區CDR2序列
86	人源化抗體hAb-009輕鏈可變區CDR3序列
87	人源化抗體hAb-009重鏈可變區CDR1序列
88	人源化抗體hAb-009重鏈可變區CDR2序列
89	人源化抗體hAb-009重鏈可變區CDR3序列
90	人源化抗體hAb-003輕鏈可變區CDR1序列
91	人源化抗體hAb-003輕鏈可變區CDR2序列
92	人源化抗體hAb-003輕鏈可變區CDR3序列
93	人源化抗體hAb-003重鏈可變區CDR1序列
94	人源化抗體hAb-003重鏈可變區CDR2序列
95	人源化抗體hAb-003重鏈可變區CDR3序列
96	人源化抗體hAb-005輕鏈可變區CDR1序列
97	人源化抗體hAb-005輕鏈可變區CDR2序列
98	人源化抗體hAb-005輕鏈可變區CDR3序列
99	人源化抗體hAb-005重鏈可變區CDR1序列
100	人源化抗體hAb-005重鏈可變區CDR2序列
101	人源化抗體hAb-005重鏈可變區CDR3序列
102	人源化抗體hAb-006輕鏈可變區CDR1序列
103	人源化抗體hAb-006輕鏈可變區CDR2序列
104	人源化抗體hAb-006輕鏈可變區CDR3序列
105	人源化抗體hAb-006重鏈可變區CDR1序列
106	人源化抗體hAb-006重鏈可變區CDR2序列
107	人源化抗體hAb-006重鏈可變區CDR3序列
108	人源化抗體hAb-010輕鏈可變區CDR1序列
109	人源化抗體hAb-010輕鏈可變區CDR2序列
110	人源化抗體hAb-010輕鏈可變區CDR3序列
111	人源化抗體hAb-010重鏈可變區CDR1序列
112	人源化抗體hAb-010重鏈可變區CDR2序列
113	人源化抗體hAb-010重鏈可變區CDR3序列
114	人源化抗體hAb-013輕鏈可變區CDR1序列
115	人源化抗體hAb-013輕鏈可變區CDR2序列
116	人源化抗體hAb-013輕鏈可變區CDR3序列
117	人源化抗體hAb-013重鏈可變區CDR1序列
118	人源化抗體hAb-013重鏈可變區CDR2序列
119	人源化抗體hAb-013重鏈可變區CDR3序列
120	人源化抗體hAb-016輕鏈可變區CDR1序列
121	人源化抗體hAb-016輕鏈可變區CDR2序列
122	人源化抗體hAb-016輕鏈可變區CDR3序列
123	人源化抗體hAb-016重鏈可變區CDR1序列
124	人源化抗體hAb-016重鏈可變區CDR2序列
125	人源化抗體hAb-016重鏈可變區CDR3序列
126	人源化抗體hAb-017輕鏈可變區CDR1序列
127	人源化抗體hAb-017輕鏈可變區CDR2序列
128	人源化抗體hAb-017輕鏈可變區CDR3序列
129	人源化抗體hAb-017重鏈可變區CDR1序列
130	人源化抗體hAb-017重鏈可變區CDR2序列
131	人源化抗體hAb-017重鏈可變區CDR3序列

下面將結合實施例對本申請的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列實施例僅用於說明本申請，而不是對本申請的範圍的限定。根據較佳實施方案的下列詳細描述，本申請的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說將變得顯然。實施例1. 單殖株抗體的製備

本實施例利用表現CEACAM5的腫瘤細胞系免疫小鼠製備單殖株抗體。 1. SJL小鼠免疫/雜交瘤融合

高表現CEACAM5的Lovo細胞系ATCC CCL-229培養於含10% FBS RPMI1640培養基中，將Lovo細胞用TrypLE胰酶消化後，重懸於DPBS溶液中，每隻SJL小鼠皮下多點免疫，每次免疫10 ⁷Lovo細胞，每週免疫一次，共5次。將經過血清滴度檢測的小鼠處死後，取脾臟研磨過篩，按標準融合流程融合SP20骨髓瘤細胞，獲得雜交瘤細胞。 2. Lovo CEACAM5 KO細胞系的建構及篩選 2.1 Lovo CEACAM5高表現單殖株細胞系篩選

將Lovo細胞用抗CEACAM5抗體hMN14（Immunomedics，Phase2藥物，經重組表現，序列如下＞hMN14 VH EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ＞hMN14 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC標記後，加入抗鼠Fc-PE螢光標記二抗，用BD FACS Aria分選至96孔板，並培養單殖株後，用MN14檢測單殖株CEACAM5表現，結果如下：

殖株	CEACAM5 陽性比例 %	CEACAM5 陽性 MFI
Lovo+ 二抗	0.3%	NA
1-1	90.5%	1105790
1-2	95.6%	783976
2-1	95.6%	1009535
2-2	96.4%	999722
3-1	97.8%	915297
3-2	95.9%	974630
4-1	93.7%	904109
4-2	82.7%	1142303
5-1	76.6%	513840
5-2	96.9%	1053108
6-1	98.6%	1470927
6-2	88.1%	751552
7-1	93.9%	759412
7-2	96.9%	990410
8-1	97.9%	1188614
8-2	96.8%	1099974

以上結果表明:6-1號殖株相比其他殖株純度更高，達到98.6%，且其CEACAM5表現MFI顯著高於其他殖株，因此挑選6-1號殖株進行CEACAM5敲除。 2.2 Lovo CEACAM5 KO細胞系篩選

將Lovo 6-1殖株用CRISPR方法進行CEACAM5基因敲除，並篩選Lovo CEACAM5 KO細胞系（以下簡稱Lovo CEA KO細胞系）。將攜帶CRISPR及sgRNA載體包裝為慢病毒載體（CEACAM5 KO1-3），並轉導Lovo 6-1細胞，轉導後藉由FACS檢測CEACAM5表現（MN14抗體），藉由鼠Fc-APC二抗檢測MN14結合。結果如圖1所示。結果表明，CEACAM5 KO1-3均可對CEACAM5敲除，其中CEACAM5 KO3號載體敲除效率更高，表現為CEACAM5陰性群體更加清晰。標靶CEACAM5三條sgRNA的序列如下：

No	sgRNA
CEACAM5 KO1	GATCTGACTTTATGACGTGT
CEACAM5 KO2	GATGACTGAATCACTGCGCC
CEACAM5 KO3	CAGGGGATGCACCATCTGTG

如圖2所示，Lovo 6-1殖株經CRISPR方法敲除CEACAM5後，其細胞群體中出現CEACAM5敲除群體，占比為100%-29.3%，表明成功進行了CEACAM5敲除。 3. 雜交瘤殖株及篩選

將Lovo細胞及Lovo CEA KO細胞按每孔10 ⁴接種於96孔板中過夜培養，將雜交瘤上清1-10μl分別加入Lovo/Lovo CEA KO細胞培養板中，孵育1小時，將上清棄掉，加入抗鼠Fc-FITC螢光二抗，孵育1小時後，棄掉上清，加入含有2% BSA的DPBS溶液，於Celigo中讀取和分析螢光訊號及FITC染色區域面積。

篩選得到M19（2F4）、M7（11B6）、M17（6A8）、M18（7G1）四個殖株。

殖株	Lovo結合百分比	Lovo CEA KO結合百分比
M7	54.6%	0.5%
M17	34.7%	1.1%
M18	89.5%	0.7%
M19	78.4%	0.3%

4. 雜交瘤測序/重組表現載體建構

篩選得到M19（2F4）、M7（11B6）、M17（6A8）、M18（7G1）四個殖株。將挑取的雜交瘤殖株按照標準的雜交瘤測序方法進行雜交瘤測序得到所挑取殖株的重鏈及輕鏈可變區（VH和VL）。將VH和VL經全基因合成的方式合成並連接human IgG1及kappa鏈恆定區，將重鏈及輕鏈序列連接至pcDNA3.4載體中並於293系統中暫態表現並進行protein A/G純化。所得到的嵌合重組抗體經超濾進行緩衝液置換為PBS溶液。測序結果如下表所示。

殖株	VL and VH序列（CDR Kabat Numbering，底線表示CDR區域）
M19（2F4）	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACTTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCCTTGGATTCACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGACGCAGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCTGAGCACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSYIHWYQQKPGKSPKPWIH GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYC QQWSSNLSTFGQGTKLEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTTCATGAATTGGGTCCGGCAGGCCCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGCTGGGACAGATGCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGAAAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACATCAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYFMNWVRQAPGKALEWLG QMRNKVNGDTTEYAESVEGRFTISRDISKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
M7（11B6）	＞VL CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCTTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGCCACCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITC SATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC QQRSSYPLTFGAGTKLELK
＞VH GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGTTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACTCAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTTTTATCTACTATGTTAATCCTCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTVSGFNIK DDYMHWVKQRPEQGLEWIG WIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNSAYLQLSSLTSEDTAVYYCTF IYYVNPHYYAMDYWGQGTSVTVSS
M17（6A8）	＞VL CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGATTTATACCACATCCACCCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTTTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAAAGGAGTAGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITC SASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY TTSTLASGVPARFSGSGSGTSYFLTISRMEAEDAATYYC HQRSSYPLTFGAGTKLELK
＞VH GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCTGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACCATTTATTACTACGGTAGTAGAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK DDYMHWVKQRPEQGLEWIG WIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLLLSSLTSEDTAVYYCTT IYYYGSRGAMDYWGQGTSVTVSS
M18（7G1）	＞VL GACATCCAGATGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGACAAGCCAAGACATTAACAAGTTTATGGCTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATACGTTACACATCTACATTACAGCCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGGAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTATTGTCTACAGTATGATGATCTTACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC KTSQDINKFMAWYQHKPGKGPRLLIR YTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSIRNLEPEDIATYYC LQYDDLTWTFGGGTKLEI
＞VH CAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTTACAACCTATGGAATGACCTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATATTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGGAAGAAAGGATCTACTTGGTTTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT TYGMTWVKQAPGKGLKWMG WINTYSGVPTYIDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCGR KDLLGFMDYWGQGTSVTVSS

實施例2. 抗原結合ELISA實驗

將重組CEACAM5抗原（Sinobiological，11077-H08H）用DPBS溶液稀釋至1μg/ml，並按照每孔100μl加入96孔板中，於2-8℃包被過夜；將包被液棄掉，並用PBS溶液清洗2次，加入含2% BSA的PBS溶液，室溫封閉2小時；將封閉液棄掉，加入濃度梯度稀釋的抗體，於37℃孵育1小時；將抗體溶液棄掉，並用含有0.05% Tween20的PBS溶液（PBST溶液）清洗4次；加入抗人IgG Fc-HRP二抗並於37℃孵育30分鐘；用PBST溶液清洗4次，加入TMB顯色底物，顯色5-10分鐘後，等體積1M H ₂SO4終止反應；於酶標儀讀取450nm光吸收。以上四個抗體M7、M17、M18、M19對CEACAM5重組蛋白的結合結果如圖3和下表所示。結果表明：以上4個抗體均可結合CEACAM5-His重組蛋白。

抗體	EC50 μg/ml
M7	0.008
M17	0.013
M18	0.016
M19	0.055

實施例3. 抗體Epitope結合實驗

將CEACAM5分子，按照其胞外結構域（A1-B1-A2-B2-A3-B3）進行拆分，分別建構A1-B1-His Tag、A2-B2-His Tag、A3-B3-His Tag表現載體，並於293系統表現後，利用Ni柱進行純化，序列如下表所示：

胞外結構域	核苷酸序列/氨基酸序列（底線為訊號肽）
A1-B1-His	ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACACAGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCACACCATCACCATCACCATTGAGTCTAGA
KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAHHHHHH
A2-B2-His	ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAGGAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGCACCATCACCATCACCATTGAGTCTAGA
EPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAHHHHHH
A3-B3-His	ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTCACCATCACCATCACCATTGAGTCTAGA
ELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAHHHHHH

將上述CEACAM5片段，以DPBS溶液稀釋至1μg/ml並按照每孔100μl加入96孔板中，於2-8℃包被過夜；將包被液棄掉，並用PBS溶液清洗2次，加入含2% BSA的PBS溶液，室溫封閉2小時；將封閉液棄掉，加入濃度梯度稀釋的抗體，於37℃孵育1小時；將抗體溶液棄掉，並用含有0.05% Tween20的PBS溶液（PBST溶液）清洗4次；加入抗人IgG Fc-HRP二抗並於37℃孵育30分鐘；用PBST溶液清洗4次，加入TMB顯色底物，顯色5-10分鐘後，等體積1M H ₂SO4終止反應；於酶標儀讀取450nm光吸收。結果如圖4所示。

上述四種抗體M7、M17、M18、M19結合CEACAM5分子的表位如下：

抗體	CEACAM5結構域
M7	A1-B1
M17	A1-B1
M18	A1-B1
M19	A1-B1，A2-B2，A3-B3

以上結果表明，M19抗體可以識別並結合所有三個CEACAM5結構域，其中對A2-B2結構域結合EC50最小（EC50=0.003μg/ml），遠小於A1-B1（EC50=0.95μg/ml）和A3-B3（EC50=3.23μg/ml）結構域結合；這說明，M19抗體主要結合位置位於CEACAM5分子的A2-B2結構域，但同時也可以結合A1-B1和A3-B3結構域，可能結合B1-A2和B2-A3結構域。實施例4. 抗原結合FACS實驗

將LS174T細胞和KATO3細胞（CEACAM5高表現；ATCC, CL-188）培養於含10% FBS RPMI1640培養基，將細胞用TrypLE胰酶消化後，離心重懸於含2% BSA的DPBS溶液（FACS緩衝液，4℃）中，按照5×10 ⁵/100μl/孔加入U型底96孔板中，並加入濃度梯度稀釋的抗體，於4℃孵育1小時，離心後棄掉上清；每孔加入100μl含有抗人IgG Fc-APC二抗並於4℃孵育1小時後，用FACS緩衝液清洗1次，重懸於200μl FACS緩衝液中，於BD CantoII讀取螢光訊號值。結果如圖5所示。結果表明：以上抗體均結合LS174T細胞和KATO3細胞。

抗體	LS174T細胞結合EC50μg/ml	KATO3細胞結合EC50μg/ml
M7	1.9	2.6
M17	1.5	2.7
M18	11.9	13.9
M19	6.5	10.8

實施例5. 人源化抗體設計與表現

將M19抗體（m2F4）與IMGT資料庫比對，選取與其VH/VL同源度最高的人源Framework序列，進行CDR graft，並進行計算化學類比維持其與抗原結合，人源化抗體設計如下表所示。

殖株	hAb	V region Nt
m2F4	mM19	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACTTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCCTTGGATTCACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGACGCAGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCTGAGCACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSYIHWYQQKPGKSPKPWIH GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYC QQWSSNLSTFGQGTKLEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTTCATGAATTGGGTCCGGCAGGCCCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGCTGGGACAGATGCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGAAAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACATCAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYFMNWVRQAPGKALEWLG QMRNKVNGDTTEYAESVEGRFTISRDISKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-1	hAb-003	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACTTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCCCCTGATCTACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGACGCAGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCTGAGCACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSYIHWYQQKPGKSPKPLIY GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC QQWSSNLSTFGQGTKLEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTTCATGAATTGGGTCCGGCAGGCCCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGACAGATGCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGAGAGCGTGGAGGGAAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYFMNWVRQAPGKALEWVG QMRNKVNGDTTEYAESVEGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-3	hAb-005	＞VLATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACTTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGACGCAGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCTGAGCACCTTTGGCCAGGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSYIHWYQQKPGKSPKPWIY GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYC QQWSSNLSTFGQGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACACCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCACCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGCTTCATCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACAGCGACAGCGTGGAGGGAAGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCAGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYTMSWVRQAPGKALEWVG FIRNKVNGDTTEYSDSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-4	hAb-006	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGACATCGTGCTGTCTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTCTGTCTCCAGGAGAGAGAGCCACCCTGTCTTGTAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCTAGACCTTGGATTCACGGCACAAGCAATCTGGCCAGCGGAATCCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCAGACTGGAGCCAGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSDIVLSQSPGTLSLSPGERATLSC RASSSVSYIHWYQQKPGQAPRPWIH GTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGAATTGGGTCCGGCAGGCCCCAGGAAAAGGACTCGAGTGGCTGGGCTTCATCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACCGAGTACAGCGCCAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGGGACATCAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMNWVRQAPGKGLEWLG FIRNKVNGDTTEYSASVKGRFTISRDISKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-7	hAb-009	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCGCTTCTCCAGGAGAGAGAGCCACACTGTCTTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTAGGCCTTGGATTCACGGCACAAGCAATCTGGCCACCGGAGTGCCAGCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGACGCAGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSASPGERATLSC RASQSVSYIHWYQQKPGQSPRPWIH GTSNLATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGAATTGGGTCCGGCAGGCCCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGCTGGGCTTCATCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGCCAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMNWVRQAPGKALEWLG FIRNKVNGDTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-8	hAb-010	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCGCTTCTCCAGGAGAGAGAGCCACACTGTCTTGCAGAGCCAGCTCTAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAGACCCCTGATCTACGGCACCAGCAACAGAGCCACAGGCGTGCCAGCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGACGCAGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSASPGERATLSC RASSSVSYIHWYQQKPGQSPRPLIY GTSNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGGATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGCTTCATCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGCCAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMDWVRQAPGKALEWVG FIRNKVNGDTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-11	hAb-013	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCCAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCGCTTCTCCAGGAGAGAGAGCCACACTGTCTTGCAGAGCCAGCTCTAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGAGCCCTAGACCTCTGATCTACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGACGCAGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSQIVLTQSPATLSASPGERATLSC RASSSVSYIHWYQQKPGQSPRPLIY GTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGGATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGCTTCACCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGCCAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMDWVRQAPGKALEWVG FTRNKVNGDTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-14	hAb-016	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGGCACACTGAGCGCTTCTCCAGGAGAGAGAGCCACACTGTCTTGCAGAGCCAGCTCTAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGAGCCCTAGACCTCTGATCTACGGCACCAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGACAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCAGACTGGAGCCAGAGGACGCAGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPGTLSASPGERATLSC RASSSVSYIHWYQQKPGQSPRPLIY GTSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDAAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGGATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGCTTCACCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGCCAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMDWVRQAPGKALEWVG FTRNKVNGDTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS
hM19-15	hAb-017	＞VL ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCGCTTCTCCAGGAGAGAGAGCCACACTGTCTTGCAGAGCCAGCTCTAGCGTGTCCTACATCCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAGACCTCTGATCTACGGCGCCAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGACGCAGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCTGAGCACCTTTGGCGGCGGAACCAAGGTGGAGATCAAG MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSASPGERATLSC RASSSVSYIHWYQQKPGQSPRPLIY GASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAAVYYC QQWSSNLSTFGGGTKVEIK
＞VH ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTCGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTTACATTCACCGACTACTACATGGATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAAGCACTCGAGTGGGTCGGCTTCACCCGGAACAAGGTCAACGGCGACACCACAGAGTACGCCGCCAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGACAAGGGCATCGCCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT DYYMDWVRQAPGKALEWVG FTRNKVNGDTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR DKGIAYYFDYWGQGTLVTVSS

將以上抗體VH與VL區域連結human IgG1 Fc區域及kappa恆定區，並將抗體的重鏈和輕鏈序列插入pcDNA3.4載體，暫態表現於293細胞，藉由protein A或G進行抗體純化。實施例6. 人源化抗體ELISA結合實驗

將重組CEACAM5抗原（Sinobiological，11077-H08H）用DPBS溶液稀釋至1μg/ml，並按照每孔100μl加入96孔板中，於2-8℃包被過夜；將包被液棄掉，並用PBS溶液清洗2次，加入含2% BSA的PBS溶液，室溫封閉2小時；將封閉液棄掉，加入濃度梯度稀釋的人源化抗體，於37℃孵育1小時；將抗體溶液棄掉，並用含有0.05% Tween20的PBS溶液（PBST溶液）清洗4次；加入抗人IgG Fc-HRP二抗並於37℃孵育30分鐘；用PBST溶液清洗4次，加入TMB顯色底物，顯色5-10分鐘後，等體積1M H ₂SO4終止反應；於酶標儀讀取450nm光吸收。以上人源化抗體對CEACAM5重組蛋白的結合結果如圖6所示。結果表明：除hAb-005抗體，其他人源化抗體均可結合CEACAM5-His抗原。

人源化抗體	EC50 μg/ml
M2F4	3.53
hAb-003	3.69
hAb-005	No binding
hAb-006	3.11
hAb-009	2.87
hAb-010	3.56
hAb-013	6.10
hAb-016	4.32
hAb-017	7.05

實施例7. 人源化抗體細胞結合實驗

將KATO3細胞（CEACAM5高表現）培養於含10% FBS RPMI1640培養基，將細胞用TrypLE胰酶消化後，離心重懸於含2% BSA的DPBS溶液（FACS緩衝液，4℃）中，按照5×10 ⁵/100μl/孔加入U型底96孔板中，並加入濃度梯度稀釋的抗體，於4℃孵育1小時，離心後棄掉上清；每孔加入100μl含有抗人IgG Fc-APC二抗並於4℃孵育1小時後，用FACS緩衝液清洗1次，重懸於200μl FACS緩衝液中，於BD C6 plus讀取螢光訊號值。結果如圖7所示。

人源化抗體結合KATO3細胞EC50和Emax如下表所示

抗體	EC50 μg/ml	Emax
m2F4-hIgG1	5.3	100%
hAb-003	2.7	85.1%
hAb-005	3250	9.1%
hAb-006	5.7	118.2%
hAb-009	1.8	108.6%
hAb-010	1.3	60.6%
hAb-013	12.7	49.3%
hAb-016	3.2	48.4%
hAb-017	2.2	57.7%

以上結果表明，hAb-005丟失了與CEACAM5蛋白和KATO3細胞系結合；其中hAb-009人源化抗體對KATO3細胞結合能力最強，且保持了最大結合。實施例8. 抗體結合阻斷實驗

將KATO3細胞（CEACAM5高表現）培養於含10% FBS RPMI1640培養基，將細胞用TrypLE胰酶消化後，離心重懸於含2% BSA的DPBS溶液（FACS緩衝液，4℃）中，按照5×10 ⁵/100μl/孔加入U型底96孔板中，加入鼠單抗M19抗體（m2F4）至1μg/ml和濃度梯度稀釋的人源化抗體（50μg/ml，3倍稀釋），於4℃孵育1小時，離心後棄掉上清；每孔加入100μl含有抗鼠IgG Fc-APC二抗並於4℃孵育1小時後，用FACS緩衝液清洗1次，重懸於200μl FACS緩衝液中，於BD C6 plus讀取螢光訊號值。結果如圖8所示。

人源化抗體對鼠單抗M19抗體（m2F4）結合阻斷結果如下表所示

抗體	IC50 μg/ml	Emax Inhibition%
m2F4-hIgG1	6.6	43.7%
hAb-003	3.9	51.3%
hAb-005	ND	ND
hAb-006	6.9	47.2%
hAb-009	2.7	62.7%
hAb-010	2.3	75.0%
hAb-013	5.2	89.0%
hAb-016	6.4	73.2%
hAb-017	4.5	73.9%

以上結果表明，hAb-003、hAb-006、hAb-009、hAb-010、hAb-013、hAb-016、hAb-017抗體與m2F4抗體能夠產生競爭作用，表明其結合CEACAM5分子上的表位一致。

無。

圖1顯示了藉由CRISPR方法使用載體（CEACAM5 KO1-3）對高表現CEACAM5的細胞Lovo 6-1進行CEACAM5基因敲除的結果。圖2顯示了使用CEACAM5 KO3號載體對高表現CEACAM5的細胞Lovo 6-1進行CEACAM5基因敲除的結果。圖3顯示了鼠單殖株抗體對CEACAM5重組蛋白的結合結果。圖4顯示了鼠單殖株抗體對CEACAM5胞外結構域的結合。圖5顯示了鼠單殖株抗體對高表現CEACAM5的LS174T細胞和KATO3細胞的結合。圖6顯示了人源化抗體對重組CEACAM5抗原的結合。圖7顯示了人源化抗體對高表現CEACAM5的KATO3細胞的結合。圖8顯示了人源化抗體與鼠m2F4抗體對CEACAM5的競爭結合。

Claims

一種特異性結合糖基化CEACAM5的人源化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含一輕鏈可變區及一重鏈可變區，其中：該輕鏈可變區包含：選自SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:126的CDR-L1；選自SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:127的CDR-L2；和選自SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:128的CDR-L3，並且該重鏈可變區包含：選自SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:129的CDR-H1；選自SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:130的CDR-H2；和選自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:131的CDR-H3。
如請求項1所述的人源化抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO:68、70、72、74、76、78、80、82的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO:69、71、73、75、77、79、81、83的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列；較佳地，該抗體包含：由選自SEQ ID NO:52、54、56、58、60、62、64、66的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區，以及由選自SEQ ID NO: 53、55、57、59、61、63、65、67的核苷酸序列編碼的重鏈可變區；較佳地，該抗體包含選自SEQ ID NO: 68、70、72、74、76、78、80、82的輕鏈可變區和選自SEQ ID NO: 69、71、73、75、77、79、81、83的重鏈可變區；較佳地，該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中： a. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:84所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:85所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:86所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:87所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:88所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:89所示的CDR-L3； b. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:90所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:91所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:92所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:93所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:94所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:95所示的CDR-L3； c. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:96所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:97所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:98所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:99所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:100所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:101所示的CDR-L3； d. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:102所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:103所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:104所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:105所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:106所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:107所示的CDR-L3； e. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:108所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:109所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:110所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:111所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:112所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:113所示的CDR-L3； f. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:114所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:115所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:116所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:117所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:118所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:119所示的CDR-L3； g. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:120所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:121所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:122所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:123所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:124所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:125所示的CDR-L3；或 h. 該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:126所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:127所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:128所示的CDR-H3；同時該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:129所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:130所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:131所示的CDR-L3。
一種特異性結合糖基化CEACAM5的單殖株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，其中： a. 該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:2所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:3所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:5所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:6所示的CDR-L3； b. 該重鏈可變區包含：由SEQ ID NO:7所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:8所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:9所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含：由SEQ ID NO:10所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:11所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:12所示的CDR-L3； c. 該重鏈可變區包含由SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:15所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:18所示的CDR-L3；或 d. 該重鏈可變區包含由SEQ ID NO:19所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:20所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:21所示的CDR-H3；同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO:22所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:23所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:24所示的CDR-L3。
如請求項3所述的單殖株抗體或其抗原結合片段，其中： a）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 25所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 26所示的多肽； b）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 27所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 28所示的多肽； c）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 29所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 30所示的多肽；或 d）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 31所示的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 32所示的多肽。
如請求項3所述的單殖株抗體或其抗原結合片段，其中： a）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 38編碼的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 39所示的多肽； b）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 40編碼的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 41所示的多肽； c）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 42編碼的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 43所示的多肽；或 d）該重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 44編碼的多肽，同時該輕鏈可變區包含由SEQ ID NO: 45所示的多肽。
一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項6所述的核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項7所述的載體。
一種藥物組合物，其包含如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
一種製備特異性結合糖基化CEACAM5的抗體的方法，其包括在宿主細胞中表現請求項6所述的核酸分子並從宿主細胞分離特異性結合糖基化CEACAM5的抗體。
如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體在製備用於治療胃腸道相關腫瘤的藥物中的用途。
一種治療胃腸道相關腫瘤的方法，包括向有此需要的受試者施用請求項求1至請求項5中任一項所述的抗體。
如請求項求1至請求項5中任一項所述的抗體，用於治療胃腸道相關的腫瘤。