CN111518205B - 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用。本发明提供的人源化抗Aβ单克隆抗体能够抑制Aβ单体聚合，促进巨噬细胞对Aβ的吞噬，保护神经细胞免受Aβ的毒性，可用于治疗和诊断淀粉样变性相关的疾病和病症，如阿尔茨海默病。

Description

人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用。

背景技术

Aβ

β淀粉样蛋白(Aβ)由人的第21号染色体基因编码，包含39-43个氨基酸，呈β-片层结构，疏水，分子量为4KDa。Aβ来源于蛋白淀粉样蛋白前体(Amyloid precursor protein，APP)经蛋白水解酶作用后断裂产生的残基多肽。APP可以被α-，β-，γ-蛋白酶分解，分解后的产物具有不同的生物学功能。其中β-蛋白酶和γ-蛋白酶的连续作用产生Aβ。γ-蛋白酶产生Aβ的C端，切断在APP跨膜区然后可以产生大量39-43个氨基酸的残基亚型。所有残基亚型中最常见的是Aβ40和Aβ42。前者是典型的APP在内质网被切断所形成的，而后者是在跨高尔基网络内形成的。

Aβ的病理学机制

目前已知中枢神经系统(CNS)中所有神经细胞包括神经元、星形细胞、小胶质细胞和内皮细胞均可表达APP并产生Aβ。在正常生理条件下，APP由α-分泌酶水解产生可溶性的sAPPα片段。该片段包含APP的胞外区以及位于胞膜上的83个氨基酸的C末端。 sAPPα能够调节神经元的兴奋性，提高突触的可塑性，学习和记忆能力，并增强神经元对氧化和代谢应激的抵抗力。在神经病理的条件下，APP首先被β-分泌酶1(BACE)水解，产生sAPPβ片段和一段细胞膜连接的99个氨基酸的肽段(C99)。随后，C99肽段经由γ- 分泌酶作用，产生Aβ。不同于sAPPα，Aβ可以引起神经突触功能的丧失，降低神经元的可塑性，改变细胞能量代谢，诱导氧化应激反应以及线粒体的功能紊乱，从而造成细胞内钙离子的失衡。Aβ，尤其是Aβ42的形成，聚集和沉积可以引发神经毒性和神经退行性疾病，也是阿尔茨海默病(AD)发病机制中的重要一环。

Aβ与阿尔茨海默病(AD)

Aβ作为阿尔茨默海病脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解贯穿了 AD的整个病理过程。Aβ分为可溶性的和不可溶性的两种，可溶性的Aβ本身并无神经毒性，当β-折叠形成丝状纤维聚集物变为不溶性沉淀后则具有神经细胞毒性作用，人Aβ的一级结构是神经细胞毒性作用的决定因素。根据文献报道，Aβ的神经毒性主要体现在以下4个方面：胆碱性神经元损伤、神经细胞凋亡、过氧化损伤和炎性反应。

1、胆碱性神经元损伤

向海马区与皮质投射的基底前区胆碱能系统神经元及神经突触的大量损伤、丧失是 AD患者记忆、认知能力减退的主要原因。Aβ激活蛋白激酶GSK-3/糖原合成酶激酶-3β，引起tau蛋白及线粒体丙酮酸脱氢酶磷酸化，使酶活性降低，致丙酮酸转化为乙酰辅酶A(actyl coenzyme A)减少，从而使乙酰胆碱(ACh)合成减少，琥珀酸脱氢酶抑制，供能减少，造成胆碱能神经元及突触损伤、退变、递质传递障碍，胆碱能系统活性下降。而ACh 的减少又导致Aβ的产生增多，进而形成恶性循环。

2.神经细胞凋亡

AD的主要发病特征是皮质和海马区神经元数量的减少。Aβ聚集成β-片层折叠结构时神经毒性明显增强，可诱导神经细胞凋亡。这是AD中选择性神经元和突触缺乏的重要原因。纤维状聚集的Aβ与APP等跨膜受体在细胞表面通过分泌途径相互作用、交联，导致信号传导通路的抑制与反常激活，从而启动神经细胞死亡程序。Aβ致内环境中Ca2+失衡刺激NMDA受体或者通过自由基的损伤作用导致膜通透性改变，致Ca2+内流引起谷氨酸受体激活，使谷氨酸能神经元过度兴奋而死亡。另外，Aβ也可导致NO合成增加引起神经细胞凋亡。

3.过氧化损伤

Aβ可通过多种途径引起氧化应激。Aβ诱发自由基增加引起氧化应激是重要原因。Aβ的毒性是通过H2O2介导的,Aβ通过进展性糖基化终产物受体(receptor of advancedglycation endoproduct，RAGE)增加体内H2O2的累积，产生氧化损伤，引起细胞死亡。此外，氧应激使小胶质细胞增殖，顺Aβ浓度梯度迁移，导致老年斑周围小胶质细胞聚集，形成神经炎斑，产生更多活性氧自由基。Aβ还可以增加脂质过氧化，H2O2不但是羟自由基的来源，而且增加快反应转录核因子(Nuclear FactorκB，NF-κB)蛋白的异常表达，产生神经细胞膜损伤，导致神经元变性。

4.炎性反应

AD患者脑内有炎性反应。在斑块和神经元纤维缠结周围有胶质细胞增生，Aβ可刺激释放一系列具有强烈神经毒性的炎性蛋白，如Aβ激活星形胶质细胞和小胶质细胞释放炎症细胞因子。如NO、白细胞介素-1(IL-1，IL-1能使细胞骨架蛋白-神经丝蛋白生成异常，损害神经元的功能)、白细胞介素-6(IL-6，IL-6增加ADP的过高基因表达。促进Aβ形成，Aβ又可诱导小胶质细胞IL-6的表达，形成AD免疫病理过程中的恶性循环)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，TNF-α通过CNS最主要的载脂蛋白ApoE参与AD的病理过程)、γ- 干扰素(γ-IFN)，β-抗胰蛋白酶(ACT)、补体C1、C3及趋化因子、黏附因子等。诸多炎性因子诱导炎症反应，促进自由基生成、氧化应激，使神经细胞变性、坏死。

针对Aβ靶点介入的药物及治疗机理

基于如上所述，Aβ对神经元的毒性是造成AD发生的重要因素。因此，通过抑制Aβ产生和加速其清除将能够终止AD疾病进程并缓解疾病症状。目前正在开发并应用在临床上的药物，也都是基于Aβ的产生和清除机理，包括以下几个部分：

1.抑制β-和γ-分泌酶

β-分泌酶水解APP是淀粉样蛋白产生的初始阶段。抑制β-分泌酶的活性虽然能够抑制 Aβ的产生，但是却能够造成较大的副作用。因为除了APP之外，β-分泌酶还有众多的底物，而这些底物的水解对于神经系统内神经元和突触的可塑性具有重要的作用。临床上β-分泌酶的抑制剂，如E2609(clinical trial ID#NCT01600859)，MK-8931(NCT01739348) 和LY2886721(NCT01807026，NCT01561430)都能够将人脑脊液中的Aβ水平减低80-90％，但是目前仍没有任何的β-分泌酶抑制剂上市。

γ-分泌酶水解APP是产生淀粉样蛋白的最后一个步骤，直接产生Aβ40和Aβ42片段。因此，抑制γ-分泌酶也被认为可以有效地抑制Aβ的产生，从而达到治疗AD的目的。然而，γ-分泌酶除了水解APP外，也水解其它底物蛋白，包括Notch蛋白。Notch蛋白对细胞增殖，分化和细胞间信号传导有重要意义。Semagacestat(LY450139)作为γ-分泌酶抑制剂，曾进行了3000人的临床试验(NCT00762411，NCT01035138，NCT00762411)。试验结果表明，应试者的认知非但没有得到改善，反而有所恶化，并且伴随有体重减轻，皮肤癌概率上升和高感染风险的副作用。其它γ-分泌酶的抑制剂，比如Avagacestat，也在临床实验(NCT00810147，NCT00890890，NCT00810147，NCT01079819)中失败。选择性的γ-分泌酶调节剂(SGSM)在理论上可以避免因γ-分泌酶被全部抑制产生的副作用，只抑制APP的水解途径而不干扰其它信号通道，比如Notch蛋白的水解。一些非固醇类抗炎药物，比如布洛芬、舒林酸、吲哚美辛和氟比洛芬可以调节γ-分泌酶的水平，并且在体内外活性实验中可以降低Aβ42的水平。虽然该类药物曾显示出能够缓解轻度认知障碍并可以降低脑脊液中炎性因子的水平，但是长期使用非固醇类抗炎药治疗AD仍需在临床上进行验证。

2.抑制Aβ的聚集

抑制老年斑的产生可以通过干扰或拮抗Aβ的聚集达成。如3-氨基-1-丙烷磺酸(3-APS, Alzhemed,tramiprosate)就是通过干扰可容性Aβ和内生氨基葡聚糖的相互作用，后者能够促进Aβ淀粉状纤维的形成和沉淀，从而抑制Aβ的聚集。但是3-APS的III期临床试验结果并不理想，从而导致试验中止。其它抗Aβ聚集的药物也都在II期和III期临床上失败，包括Colostrinin，其在体外试验上可以抑制Aβ聚集并且中和Aβ的神经毒性，在体内试验中也可以提高小鼠的认知能力，但在临床II期试验中并没有取得满意的结果。Scyllo-inositol (ELND005)是一种口服的抗Aβ聚集的药物，小鼠实验显示Scyllo-inositol可以降低Aβ的毒性，但在为期18个月，针对轻中度AD患者的II期临床实验中并没有取得预期的效果。

3.促进Aβ沉积和聚合物的清除

Aβ沉积和聚合物的清除主要有三个途径：激活淀粉样斑块降解酶的活性；调节Aβ在脑和外周循环中的运输和抗Aβ的免疫疗法。

Aβ的沉积和聚合物可以被多种蛋白水解酶降解，包括纤溶酶，内皮素转换酶,血管紧张素转换酶，金属蛋白酶等。这些酶类在AD患者脑内水平较低，但由于作用于这些酶类缺乏特异性，使得目前没有该类药物进入临床。

Aβ在中枢神经系统和外周循环系统之间的运输由载脂蛋白进行调节。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-1)能够促进Aβ由脑流入血液。晚期糖基化终产物受体(RAGE)可以协助Aβ通过血脑屏障。这种治疗机制就是通过限制Aβ进入外周循环，从而达到降低脑内淀粉样蛋白负荷的目的。目前为止，只有RAGE的抑制剂/调节剂进入了临床试验，包括PF-0449470052和TTP4000，前者在II期临床上失败，而后者也并没有可靠的数据表明在I期临床实验中取得预期的结果。

抗Aβ抗体可以中和Aβ的毒性，并在能够提高转基因动物的认知，抗Aβ抗体目前已经成为了AD治疗的热门。抗Aβ抗体主要针对AD的早期治疗，以及轻中度的AD治疗。这也和Aβ的致病机制有关，一旦神经元受到伤害，则很难再进行逆转和修复，因此早期 Aβ的清除能够更有效的治疗和缓解AD.

4.正在进行临床试验的Aβ靶点抗体

目前有15个正在进行临床试验的抗Aβ抗体的药物，比较来说，Aducanumab，Gantenerumab和Solanezumab的进展较快，已经进入III期临床，正如机理所诉，各公司都将适应症定位在轻度老年痴呆。

虽然目前对治疗和预防阿尔茨海默病领域已经具备一定理论知识，但仍需改善治疗和 /或预防该病的组合物和方法，存在对于能够靶向Aβ的抗体和治疗的需要。尽管已经获得了一些在治疗上有很大优势的人源化单克隆抗体，但是筛选出具有所需性质和功能的人源化单克隆抗体绝非易事，现实中依然存在对这类人源化单克隆抗体的迫切需求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用。并提供编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥治疗和诊断淀粉样变性相关的疾病和病症(如阿尔茨海默病)的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了人源化抗Aβ的单克隆抗体，

(I)、所述单克隆抗体的重链的三个CDR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；且(II)、所述单克隆抗体的轻链的三个CDR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；

或

(III)、(I)或(II)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

进一步的，所述功能为抑制Aβ聚合、促进巨噬细胞对Aβ的吞噬和细胞毒保护活性中的两种或三种功能；

或

(IV)、与(I)、(II)或(III)所述氨基酸序列具有97％以上同源性的氨基酸序列。

进一步的，本发明的所述单克隆抗体的抗原表位为Aβ_14～29。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体：

其重链包含三个CDR区，其中至少一个CDR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:1、 2或3所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列；

其轻链包含三个CDR区，其中至少一个CDR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:4、 5或6所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列。

本发明中，所述单克隆抗体的重链的三个CDR区的氨基酸序列分别具有如SEQ IDNO:1、2和3所示的氨基酸序列；

所述单克隆抗体的轻链的三个CDR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO:1所示的序列为NYNIH；

SEQ ID NO:2所示的序列为AIYPGNGDTTYNQKVKG；

SEQ ID NO:3所示的序列为GDWDWFAY；

SEQ ID NO:4所示的序列为SSSKSLLHSNGITYLY；

SEQ ID NO:5所示的序列为RMSNLAS；

SEQ ID NO:6所示的序列为AQMLERPLT。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的单克隆抗体，

(V)、所述单克隆抗体的重链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:7、8、9和10所示的氨基酸序列；且(VI)、所述单克隆抗体的轻链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:11、12、13和14所示的氨基酸序列；

或

(VII)、(V)或(VI)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(V)或(VI)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

进一步的，所述功能为抑制Aβ聚合、促进巨噬细胞对Aβ的吞噬和细胞毒保护活性中的两种或三种功能；

或

(VIII)、与(V)、(VI)或(VII)所述氨基酸序列具有97％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，其重链包含4个FR区其中至少一个FR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:7、8、9或10所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列；

其轻链包含4个FR区，其中至少一个FR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:11、12、13或14所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体的重链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:7、8、9或10所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列；

所述单克隆抗体的轻链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:11、12、13或14所示的氨基酸序列，或者与其具有97％以上同源性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO:7所示的序列为QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT；

SEQ ID NO:8所示的序列为WVRQAPGQRLEWIG；

SEQ ID NO:9所示的序列为KATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR；

SEQ ID NO:10所示的序列为WGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO:11所示的序列为DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC；

SEQ ID NO:12所示的序列为WYLQKPGQSPRLLIY；

SEQ ID NO:13所示的序列GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC；

SEQ ID NO:14所示的序列为FGQGTKVDIK；

在本发明的一些具体实施方案中，所述的单克隆抗体，

(IX)、其重链可变区具有如SEQ ID NO:15～19中任一项所示的氨基酸序列，且(X)、其轻链可变区具有如SEQ ID NO:20～24中任一项所示的氨基酸序列；

或

(XI)、(IX)或(X)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IX)或(X)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

进一步的，所述功能为抑制Aβ聚合、促进巨噬细胞对Aβ的吞噬和细胞毒保护活性中的两种或三种功能；

或

(XII)、与(IX)、(X)或(XI)所述氨基酸序列具有97％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，其重链可变区具有如SEQ ID NO:15～19中任一项所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:20～24中任一项所示的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述人源化抗Aβ单克隆抗体具有：

氨基酸序列为SEQ ID NO:15,16,17,18,19的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO: 20的轻链可变区；

氨基酸序列为SEQ ID NO:15,16,17,18,19的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO: 21的轻链可变区；

氨基酸序列为SEQ ID NO:15,16,17,18,19的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO: 22的轻链可变区；

氨基酸序列为SEQ ID NO:15,16,17,18,19的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO: 23的轻链可变区；

氨基酸序列为SEQ ID NO:15,16,17,18,19的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO: 24的轻链可变区；

在本发明的一些具体实施方案中，所述的单克隆抗体，

(XIII)、其重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；

或(XIV)其重链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；

或(XV)其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；

或(XVI)其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；

或(XVII)其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；

或(XVIII)其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。

本发明中，所述与具有至少97％序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个或5个。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述单克隆抗体的轻链的恒定区为κ型或λ型。

本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体的重链恒定区为人IgG1，轻链恒定区为人κ链的恒定区。

本发明提供的人源化抗Aβ单克隆抗体能够结合人Aβ；在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用Ka(结合常数)、Kd(解离常数)、KD(平衡解离常数)来表征，本发明提供抗体的KD值不高于5.96nM；本发明提供的人源化抗Aβ单克隆抗体可抑制Aβ单体聚合，促进巨噬细胞对Aβ的吞噬，保护神经细胞免受Aβ的毒性。

本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核苷酸。

本发明提供了编码所述单克隆抗体重链的核苷酸序列。

本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列。

本发明提供了编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

其中，编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:25～29所示或为 SEQ ID NO:25～29的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与SEQ ID NO:25～29中任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与SEQ ID NO:25～29中任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述SEQ ID NO:25～29中任一项所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个或5个。

本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

其中，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:30～34所示或为 SEQ ID NO:30～34的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与SEQ ID NO:30～34中任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与SEQ ID NO:30～34中任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述SEQ ID NO:30～34中任一项所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个或5个。

本发明提供的表达载体，包括编码所述抗Aβ单克隆抗体的核苷酸。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

本发明所述抗Aβ单克隆抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞、诱导抗Aβ单克隆抗体的表达。

本发明还提供了经化学标记或生物标记的所述抗Aβ单克隆抗体。

所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；

所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。

所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

本发明所述抗Aβ单克隆抗体或其结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。

本发明还提供了所述的单克隆抗体、所述的结合物和/或所述的偶联物在制备抗认知缺损的作用剂、用于阿尔茨海默氏病的治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于抑制老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒剂、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂和/或抗突触毒性的作用剂中的应用。

本发明还提供了所述人源化抗Aβ单克隆抗体、结合物和/或偶联物在制备防治疾病的药物中的应用；

所述疾病包括淀粉样变性，这是与淀粉状蛋白质相关的疾病和异常，所述淀粉样变性包括继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，所述疾病包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病。

本发明还提供了药物，包括所述人源化抗Aβ单克隆抗体、其结合物和/或偶联物。

本发明还提供了疾病的预防和/或治疗方法，给予本发明所述的药物；所述疾病和病症包括淀粉样变性，这是与淀粉状蛋白质相关的疾病和异常，包括继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病。

本发明提供的人源化抗Aβ单抗可抑制Aβ单体聚合，促进巨噬细胞对Aβ的吞噬，保护神经细胞免受Aβ的毒性，可用于治疗和诊断淀粉样变性相关的疾病和病症，如阿尔茨海默病。

本发明还提供了所述人源化抗Aβ单克隆抗体、结合物和/或偶联物在制备检测Aβ表达的产品中的应用。

实验表明，本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体能够与Aβ单体相结合。故而，本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体能够用于Aβ单体的检测。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述人源化抗Aβ单克隆抗体、其结合物和/或偶联物。

检测Aβ单体或聚合体混合物的试剂盒中，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。

所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液。

所述洗涤液中包括PBS、Tween、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾。

所述封闭液中包括PBS和BSA。

所述显色液包括TMB溶液、底物缓冲液和终止液。

所述底物缓冲液包括柠檬酸和磷酸氢二钠。

所述终止液为过氧化氢水溶液。

检测表面表达Aβ的细胞的试剂盒中，还包括PBS、羊抗鼠IgG Fc和TITC二抗。

一种疾病的诊断方法，以本发明提供的试剂盒检测Aβ表达，根据Aβ的表达量判断是否患有疾病；所述疾病和病症包括淀粉样变性，这是一组与淀粉状蛋白质相关的疾病和异常，包括继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病。

在本发明的一些具体实施方案中，根据Aβ的表达量判断是否患有疾病的标准为：正常人600～1000pg/ml，AD病人200～450pg/ml，检测灵敏度要求<20pg/ml。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology (Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3 字母和/或1字母代码。

“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。

“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。

“人源化抗体”是指一种抗体，其包含来源于非人源抗体的CDR区、并且该抗体分子的其他部分来源于一种(或几种)人抗体。而且，为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为FR)区段的一些残基。

所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。

所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

本文使用的“CDR区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabat etal. 所定义(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5thEd.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，以及以后版本)。存在三个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。

本发明提供了一种抗体人源化改造方法，在参考多摸板进行FR移植来进行合理的抗体人源化设计，得到亲和力和鼠源抗体相当的人源化抗体。

本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体的制备方法包括：

步骤1：鼠源杂交瘤制备，通过5’RACE，获得抗体序列；

步骤2：抗体人源化，通过NCBI工具上进行序列比对，完成人源化改造，对改造抗体进行筛选。

具体的，该方法包括：

所述所述人源化抗Aβ的单克隆抗体的制备方法为：以鼠源抗体066-5.4.1为模板，PCR 扩增获得抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，将其翻译成氨基酸序列，然后将氨基酸序列在NCBI数据库中人抗体序列进行比对，分别选择与可变区VH和VL相似性最高的5条人抗体序列，作为人源化改造的参考模板，确定鼠源抗体066-5.4.1的CDR 区，保留CDR区不变，将上述VH和VL分别5条参考模板中的FR区移植至066-5.4.1 中得到人源化序列，经密码子优化后分别构建瞬转表达载体；表达载体转至293E细胞中表达，获得与Aβ特异性结合的人源化抗体；对人源化抗体经过亲和力测定、与抗原结合 EC50值测定、抑制Aβ聚合作用检测、促巨噬细胞吞噬Aβ活性检测及细胞毒保护作用检测，最终获得人源化Aβ抗体。

本发明提供的人源化抗Aβ的单克隆抗体可抑制Aβ单体聚合，促进巨噬细胞对Aβ的吞噬，保护神经细胞免受Aβ的毒性，可用于治疗和诊断淀粉样变性相关的疾病和病症，如阿尔茨海默病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示Aβ单体及聚合体混合物SDS-PAGE及WB检测；泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：Aβ单体；泳道2：Aβ聚合体混合物；图1(A)：Aβ单体及聚合体混合物SDS-PAGE 检测图；图1(B)：Aβ单体及聚合体混合物WB检测图；

图2示SDS-PAGE电泳检测纯化的阳性抗体；泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：066-P01非还原电泳；泳道2：066-P01还原电泳；泳道3：066-P02非还原电泳；泳道4：066-P02还原电泳；其中，图2(A)：纯化的阳性抗体066-P01的SDS-PAGE电泳检测结果；图2(B)：纯化的阳性抗体066-P02的SDS-PAGE电泳检测结果；

图3示抗Aβ单克隆抗体抑制Aβ聚合检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为相对荧光强度，066-4.22.1、066-4.26.14、066-5.4.1等抗Aβ单克隆抗体均可抑制Aβ聚合；其中，图3(A) 示加样组分别为IgG、066-P01、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2抗A β单克隆抗体抑制Aβ聚合检测结果；图3(B)示加样组分别为PBS、IgG、066-4.21.13、 066-4.26.14、066-4.6.8、066-4.22.1、066-4.18.2、066-P01抗Aβ单克隆抗体抑制Aβ聚合检测结果；

图4示抗Aβ单克隆抗体促巨噬细胞吞噬Aβ活性检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为荧光强度，066-5.4.1、066-7.17.2抗Aβ单克隆抗体具有促进巨噬细胞吞噬Aβ活性；

图5示抗Aβ单克隆抗体细胞毒保护活性检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为LDH释放相对值，066-4.26.14、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2、066-7.17.2 抗体均具有细胞毒保护作用，且保护作用与066-P02相当；其中，图5(A)示加样组分别为Vehicle、IgG、066-4.21.13、066-4.17.28、066-4.6.8、066-4.22.1、066-4.26.14、066-4.18.2、 066-P02抗Aβ单克隆抗体细胞毒保护活性检测结果；图5(B)示加样组分别为Vehicle、IgG、 066-6.2.1、066-7.17.2、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.7.2、066-P02抗Aβ单克隆抗体细胞毒保护活性检测结果；

图6示Morris水迷宫实验检测结果；横坐标为治疗后的时间(第1、2、3、4、5天)，纵坐标为找到水面下隐藏平台的时间(单位：Sec)；

图7示总RNA琼脂糖凝胶电泳检测；泳道M：DL2000分子量标记；泳道1：066-5.4.1总RNA电泳条带；

图8示PCR扩增候选抗体重链可变区和轻链可变区琼脂糖凝胶电泳检测；泳道M：DL2000分子量标记；泳道1：066-5.4.1重链可变区PCR产物电泳条带；泳道2：066-5.4.1轻链可变区电泳条带；其中，图8(A)示066-5.4.1重链可变区PCR结果；图8(B)示066-5.4.1 轻链可变区PCR结果；

图9示SDS-PAGE电泳检测纯化的鼠人嵌合抗体066-5.4.1-chAb；泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：鼠人嵌合抗体066-5.4.1-chAb非还原电泳；泳道2：鼠人嵌合抗体 066-5.4.1-chAb还原电泳；

图10示SDS-PAGE电泳检测纯化的亲人源化候选抗体；泳道M：蛋白质分子量标记；图10(A)中：泳道1-6分别为人源化抗体066-5.4.1H1L4、066-5.4.1H2L5、066-5.4.1H5L1、066-5.4.1H5L2、066-5.4.1H5L3、066-5.4.1H5L4非还原电泳；图10(B)中：泳道1-6分别为人源化抗体066-5.4.1H1L4、066-5.4.1H2L5、066-5.4.1H5L1、066-5.4.1H5L2、 066-5.4.1H5L3、066-5.4.1H5L4还原电泳；

图11示人源化Aβ抗体抑制Aβ聚合作用检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为相对荧光强度，066-5.4.1人源化抗体均可抑制Aβ聚合；

图12示人源化Aβ抗体促巨噬细胞吞噬Aβ活性检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为荧光强度，066-5.4.1人源化候选抗体均具有促进巨噬细胞吞噬Aβ活性，其中066-5.4.1H5L3 表现最优；

图13示人源化Aβ抗体细胞毒保护活性检测；横坐标为不同加样组，纵坐标为LDH释放相对值，066-5.4.1人源化候选抗体均具有细胞毒保护作用，且保护作用与066-P02相当。

具体实施方式

本发明公开了一种人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1Aβ抗原及阳性对照抗体的制备

Aβ单体及聚合体混合物制备

Aβ_1-42、Aβ_1-16、Aβ_14-29多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成。Aβ_1-42多肽氨基酸序列为：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID:35)，Aβ_1-16多肽氨基酸序列为：DAEFRHDSGYEVHHQK(SEQ ID:36)，Aβ_14-29多肽氨基酸序列为： HQKLVFFAEDVGSNKGA(SEQID:37)。

Aβ_1-42单体(简写Aβ单体)制备方法：向1mg Aβ_1-42多肽干粉中加入1ml六氟异丙醇(HFIP)，涡旋震荡1min，水浴超声处理1-5min至完全溶解；置于37℃，200rpm振荡培养箱中振荡1.5h；利用真空旋转干燥仪挥发尽六氟异丙醇；向干燥的Aβ_1-42多肽中加入192μl无水二甲基亚砜(DMSO)，溶解多肽，再加入27μl 20×PBS溶液，54μl 2％SDS， 267μl ddH₂O，混匀，小量分装，储存于-80℃冰箱中，即为Aβ_1-42单体；通过SDS-PAGE 及WB(利用具有特异识别Aβ_1-42聚合体的阳性抗体066-P02进行杂交检测)检测(见图1)。

Aβ_1-42聚合体混合物(简写Aβ聚合体混合物)制备方法：向1mgA_β1-42多肽干粉中加入1ml六氟异丙醇(HFIP)，涡旋震荡1min，水浴超声处理1-5min至完全溶解；置于 37℃，200rpm振荡培养箱中振荡1.5h；利用真空旋转干燥仪挥发尽六氟异丙醇；向干燥的Aβ_1-42多肽中加入192μl DMSO，溶解多肽，再加入27μl 20×PBS溶液，54μl 2％SDS， 267μl ddH₂O，混匀，置于37℃水浴中18-24h；向其中加入1.62ml ddH₂O，混匀，置于 37℃水浴中18-24h；利用10KDa超滤浓缩管置换缓冲液至PBS中，小量分装，储存于-80℃冰箱中，即为Aβ_1-42聚合体混合物；通过SDS-PAGE及WB(利用具有特异识别Aβ_1-42聚合体的阳性抗体066-P02进行杂交检测)检测(见图1)。

2.阳性对照抗体表达载体构建

分别选择pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作为构建抗人Aβ阳性抗体(066-P01：Solanezumab，Eli lily、066-P02：Aducanumab，Biogen)的重链和轻链的表达载体，对阳性抗体可变区氨基酸序列进行密码子优化后，使用酶切方法将阳性抗体VH和VL基因分别克隆到pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL得到阳性抗体的重链及轻链瞬转表达载体 pGS003-066-P02VH-hIgG1CH和pGS003-066-P02VL-hIgKCL。066-P01阳性抗体重链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID:38)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYSMSWVRQAPGKGLELVAQINSVG NSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS

066-P01阳性抗体轻链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID:39)：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLIYSDGNAYLHWFLQKPGQSPRLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK

066-P02阳性抗体重链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID:40)：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFD GTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYM DVWGKGTTVTVSS

066-P02阳性抗体轻链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID:41)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK

3.瞬转表达

pGS003-066-P01VH-hIgG1CH和pGS003-066-P01VL-hIgKCL；

pGS003-066-P02VH-hIgG1CH和pGS003-066-P02VL-hIgKCL进行瞬时表达。

使用FreeStyle^TM293E细胞在Freestyle培养基中进行瞬转表达。转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞30ml，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养。转染时先取60微升的293E Fectin加入到1ml的Opti-MEM中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组载体总质粒DNA的量为30μg，溶于1ml的Opti-MEM中。然后将质粒DNA和293EFectin充分混合，总体积为2ml，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞培养孔中，混匀，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养7天。将培养液进行高速离心后取上清进行微孔滤膜抽真空过滤。

4.蛋白纯化

根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier 10， GE)、镍柱进行纯化，得到纯化的阳性抗体066-P01、066-P02。如图2。

实施例2抗Aβ单克隆杂交瘤制备

免疫BALB/c小鼠

将Aβ1-42多肽抗原和弗氏完全佐剂按剂量涡旋混匀，完全乳化后对6周龄BALB/c雌性小鼠进行首次免疫。每只小鼠腹腔注射200μg抗原，共免疫3组小鼠，每组5只。首次免疫两周后对小鼠进行第二次腹腔免疫，使用弗氏不完全佐剂，免疫抗原剂量首次免疫相同。此后每月两次对小鼠进行腹腔免疫，佐剂和抗原剂量和第二次免疫相同。

首次免疫后每六周对小鼠进行眼眶少量采血并进行血清效价检测，经间接ELISA方法检测血清效价滴度达到1:200000或者以上后，对用于融合的小鼠进行加强免疫。

准备融合用骨髓瘤细胞

提前三周复苏用于融合的骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653，并用含1×8-氮鸟嘌呤和10％胎牛血清的DMEM培养基培养两周，融合一周换用10％胎牛血清的DMEM培养，维持P3X63Ag8.653的密度为70％-80％至融合当天。

细胞融合及HA筛选

脾细胞的获取和制备：取加强免疫后的小鼠2只，采集免疫血清后处死并浸泡于75％酒精中2-3分钟。剪开免疫小鼠的腹部侧面的皮肤和腹膜，暴露脾脏。用剪尖剔除周围组织获取脾脏，用研磨棒研磨后，经细胞筛网过滤后制备成单细胞悬液。离心后弃上清，

细胞融合前处理：收集培养瓶内的P3X63Ag8.653，1000rpm/5min离心后弃上清，重悬后进行骨髓瘤活细胞计数。将脾细胞悬液离心弃上清，加入ACK裂解液，孵育后离心弃上清去除红细胞，用DMED重悬并进行脾活细胞计数。

细胞融合：按脾细胞：P3X63Ag8.653＝1:2的比例混合细胞，2000rpm/5min离心后弃上清，震散细胞沉淀，按400μl/1×10⁸脾细胞加入1mg/ml Pronase，孵育15秒后加入10ml胎牛血清终止反应，补加电转溶液(ECF)至50ml，2500rpm离心5分钟，弃上清，ECF 重悬并进行活细胞计数，将脾细胞密度调至2×10⁶/ml。将调整好密度的细胞悬液加入到电融合槽中，运行电转仪进行细胞融合，融合结束后将细胞悬液从融合槽转移到1/2HA培养基中，静置3小时后进行细胞铺板。

HA培养基筛选：配制含1/2HA、1×青-链霉素、20％胎牛血清和80％DMEM培养基的AT筛选培养基。用上述的1/2HA筛选培养基重悬鼠杂交瘤细胞，充分混匀。按200μl/ 孔,1×10⁶脾细胞/板，将细胞悬液加到96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中培养。培养1周后，用1/2HA培养基进行第一次换液，并置于37℃细胞培养箱中继续培养，培养3天后，用1/2HA培养基进行第二次换液。

阳性细胞株的筛选

融合后2周，取细胞上清进行ELISA实验，检测细胞上清与人Aβ_1-42的结合情况，筛选出ELISA结果为阳性的细胞后，进行第二次ELISA实验的复测。取复测结果为阳性的细胞上清进行亚克隆和扩大培养。

扩大培养

将ELISA检测为阳性的细胞株从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm²培养瓶中培养。

有限稀释法亚克隆

吹打混匀阳性细胞株，并吸取少量进行活细胞计数。吸取约200个细胞加入80ml完全培养基中混匀，铺板4块。另吸取约400个细胞加入80ml完全培养基中混匀，铺板4 块。另吸取约1000个细胞加入20ml完全培养基中混匀，铺板1块。共以3个不同的细胞密度铺板9块，分别为0.5细胞/孔、1细胞/孔、10细胞/孔。将96孔板置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

克隆检测和扩大培养

取单克隆细胞孔上清进行ELISA检测，分别检测细胞克隆抗体与Aβ1-42全长、Aβ1-42 N端和中间肽段的结合情况。

包被：将Streptavidin用CBS(pH 9.6)稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μl，2-8℃孵育过夜。

封闭：用PBST洗板一次后，用1％BSA封闭，每孔200μl，室温下孵育1小时。

抗原：用PBST洗板三次后，分别取生物素化的Aβ_1-42、Aβ_1-16、Aβ_14-29多肽，用PBS (pH7.2)稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μl，室温下孵育1小时。

加一抗：用PBST洗板三次后，加入鼠源候选抗体，50μl/孔，室温下孵育2小时。

加二抗：用PBST洗板三次后，加入抗鼠IgG Fc-HRP抗体，1:5000稀释液，50μl/孔，室温下孵育1小时。

显色：用PBST洗板六次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色10分钟。

终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。

检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。

数据处理：将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。具体数据见表1。结果显示，12个鼠源候选抗体含有三种不同表位，分别为N端(Aβ_1-16)、C端(Aβ_30-42)、中间(Aβ_14-29)肽段。其中，066-5.4.1表位分组为Aβ_1-42中间肽段。

将ELISA检测为阳性的细胞株从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm²培养瓶中培养。

表1、鼠源候选抗体表位分组检测结果

抗体名称	Aβ<sub>1-42</sub>全长	Aβ<sub>1-16</sub>(N端肽段)	Aβ<sub>14-29</sub>(中间肽段)	表位
					066-4.6.8	1.2944	0.0561	0.5115	中间肽段
066-4.17.28	1.4540	0.0690	1.1238	中间肽段
					066-4.18.2	1.0925	1.2210	0.0848	N端肽段
066-4.21.13	1.3647	0.056	1.1457	中间肽段
					066-4.22.1	1.2517	0.0773	1.0401	中间肽段
066-4.26.14	1.9312	0.0602	0.0674	C端肽段
					066-5.4.1	1.2483	0.0540	1.1566	中间肽段
066-6.1.1	1.3752	0.1001	0.1180	C端肽段
					066-6.1.3	1.3665	0.0618	0.0803	C端肽段
066-6.2.1	1.3085	0.0975	0.1003	C端肽段
					066-6.7.2	1.4707	1.6608	0.3058	N端肽段
066-7.17.2	1.0833	0.9197	0.0612	N端肽段

亚类的鉴定

包被羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM和IgGA，50ng/100μl/孔，4℃过夜，BSA室温封闭，加入待测细胞上清，室温孵育2小时，加入酶标二抗羊抗鼠IgG、κ、λ，显色，终止，450nm读数，判断所测细胞株的亚类为IgG1，κ或IgG2a，κ或IgG2b，κ，结果见表2。其中，066-5.4.1的重链恒定区为鼠IgG1，轻链恒定区为鼠κ链的恒定区。

表2、鼠源候选亚型检测结果

抗体名称	亚型
		066-4.6.8	IgG1，Kappa
066-4.17.28	IgG1，Kappa
		066-4.18.2	IgG2b，Kappa
066-4.21.13	IgG1，Kappa
		066-4.22.1	IgG1，Kappa
066-4.26.14	IgG2a，Kappa
		066-5.4.1	IgG1，Kappa
066-6.1.1	IgG2a，Kappa
		066-6.1.3	IgG2a，Kappa
066-6.2.1	IgG2a，Kappa
		066-6.7.2	IgG2a，Kappa
066-7.17.2	IgG1，Kappa

细胞冻存

冻存液配制：90％胎牛血清，10％DMSO。

重悬培养瓶内细胞，细胞计数后，以1000rpm/min离心5min后弃上清，用含10％DMSO的胎牛血清进行吹打悬浮，以5×10⁶细胞/管冻存于冻存盒内，-80℃过夜，次日转入液氮中。

单克隆杂交瘤基因保存

收集阳性单克隆细胞株，加入TRizol裂解细胞并提取RNA，反转录成cDNA，于-80℃保存。

采用体外培养法制备抗体

对制得的杂交瘤细胞株进行复苏，方法为将含有10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM 培养基复苏并使用小瓶培养，待细胞汇合度约90％后，进行传代扩培，扩培至细胞培养上清共约200ml，收集上清，离心过滤后送纯化。

实施例3抗Aβ单克隆抗体抑制Aβ聚合检测

用8.2％DMSO/DPBS溶液(DMSO：sigma；DPBS：Hyclone)溶解Aβ干粉至1mg/ml， DPBS稀释Aβ溶液至33μg/ml，抗Aβ单克隆抗体066-4.6.8、066-4.18.2、066-4.22.1、 066-4.26.14、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2稀释至450μg/ml(IC100)，超纯水稀释ThT(sigma)至20μM。取50μl抗体稀释液加入96孔黑板中(corning)，再向其中加入50μl Aβ稀释液，最后加入100μl ThT，室温避光孵育24小时，多功能酶标仪检测荧光强度(Ex/Em＝440/485)。横坐标为不同加样组，纵坐标为相对荧光强度，结果见图3，图3(A)中，当IgG组的相对荧光强度为1.0时，抗Aβ单克隆抗体066-5.4.1组的相对荧光强度为0.59；图3(B)中，当PBS组的相对荧光强度为1.0时，抗Aβ单克隆抗体066-4.22.1组的相对荧光强度为0.44，抗Aβ单克隆抗体066-4.26.14组的相对荧光强度为0.46；可见，066-4.22.1、066-4.26.14、066-5.4.1等抗Aβ单克隆抗体均可抑制Aβ聚合。

实施例4抗Aβ单克隆抗体促巨噬细胞吞噬Aβ活性检测

贴壁3天状态良好的小鼠原代腹腔巨噬细胞，0.25％胰蛋白酶消化、计数，用含10％血清胎牛血清的DMEM培养液(Gibco)调整细胞密度至2×10⁵/ml，接种96孔细胞培养板，100μl/孔；1％胎牛血清的DMEM培养基稀释066-4.6.8、066-4.17.28、066-4.18.2、066-4.21.13、066-4.22.1、066-4.26.14、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2、 066-7.17.2抗Aβ单克隆抗体至20μg/ml作为工作液，Aβ稀释至240μg/ml，超纯水稀释 ThT(sigma)至20μM。弃掉培养板中培养基，先加入50μl抗体稀释液，再加入50μl Aβ稀释液，设置复孔；37℃，5％CO₂培养箱中培养6小时；取50μl上清，加入96孔黑板中，再加入50μlThT，多功能酶标仪检测荧光强度(Ex/Em＝440/485)。横坐标为不同加样组，纵坐标为荧光强度，结果见图4。其中，抗Aβ单克隆抗体066-5.4.1组的荧光强度为650000，抗Aβ单克隆抗体066-7.17.2组的荧光强度为600000。可见，066-5.4.1、066-7.17.2抗Aβ单克隆抗体具有促进巨噬细胞吞噬Aβ活性。

实施例5抗Aβ单克隆抗体细胞毒保护活性检测

对数生长期SHSY5Y细胞，0.25％胰蛋白酶消化、计数，用含10％胎牛血清的EMEM培养液(ATCC)调整细胞密度至3×104/ml，接种96孔细胞培养板，100μl/孔；1％胎牛血清的EMEM培养基稀释066-4.6.8、066-4.17.28、066-4.18.2、066-4.21.13、066-4.22.1、 066-4.26.14、066-5.4.1、066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2、066-7.17.2抗Aβ单克隆抗体至200μg/ml(IC100)，作为工作液，Aβ稀释至240μg/ml。弃掉培养板中培养基，先加入50μl抗体稀释液，再加入50μl Aβ稀释液，设置复孔；37℃5％CO₂培养箱中培养 48小时；取50μl上清，加入新96孔板中，再加入50μl LDH assay buffer，室温避光作用 30min，加入50μl stop solution，多功能酶标仪检测吸光值。横坐标为不同加样组，纵坐标为LDH释放相对值，结果见图5。其中，当Vehicle组的LDH释放相对值为1.0时，抗 Aβ单克隆抗体066-4.26.14组的相对荧光强度为1.2，抗Aβ单克隆抗体066-5.4.1组的LDH 释放相对值为1.37，抗Aβ单克隆抗体066-6.1.1组的LDH释放相对值为1.43，抗Aβ单克隆抗体066-6.1.3组的LDH释放相对值为1.35，抗Aβ单克隆抗体066-6.2.1组的LDH 释放相对值为1.34，抗Aβ单克隆抗体066-6.7.2组的LDH释放相对值为1.44，阳性对照抗体066-P02组的LDH释放相对值为1.26(A)、1.53(B)。可见，066-4.26.14、066-5.4.1、 066-6.1.1、066-6.1.3、066-6.2.1、066-6.7.2、066-7.17.2抗体均具有细胞毒保护作用，且保护作用与066-P02相当。

实施例6 Morris水迷宫实验

1.实验方法及步骤：

实验动物3×Tg小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，委托吉林大学医学院实验动物中心饲养。分组情况如下：

按照注射药物不同分为抗体066-4.26.14治疗组，抗体066-5.4.1治疗组，抗体066-7.17.2 治疗组，3×Tg空白对照组，野生型PBS注射组，阳性抗体066-P02对照组，每组8只。

参考文献(Nabeshima，2007)的方法，以单抗066-4.26.14，066-5.4.1，066-7.17.2腹腔注射6月龄雄性3×Tg小鼠(500g/只)，每周一次，连续注射10周，注射8周以后，进行Morris水迷宫检测。

Morris水迷宫检测步骤：

(1)设计特制的水迷宫主要由圆柱形水池和可移动位置的平台组成。水池高45cm,直径100cm，平台直径9cm，高度15-40cm可调，水池上空通过一个数字摄像机与计算机相连接。

(2)预先在水池中注入清水，池壁及池底均为黑色，池水中加入食品用白色素，使小鼠不能看到水面下的平台，水深30cm，水面高出平台1cm。

(3)水温控制在19±1℃，在水池上平台所在象限以外的象限标记入水点。每个象限对应的侧壁上粘贴不同形状的标记物。实验过程中保持平台位置不变。

(4)每次实验在隔音的房间内进行，水池，光源，鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。

(5)第8周给药后第3天开始训练，实验共历时5天(水迷宫-Hidden platformtest)，每天测4次。小鼠入水时脸朝水池壁面，轻轻地放入水中。每天5次训练(实验)在设置平台象限以外的区域随机进行，实验的前两天的前两次做为练习。小鼠60秒内找到平台，让其在平台上停留15秒，小鼠60秒内找不到平台(潜伏期记为60秒)，则由实验者将其引导至平台，在平台上停留15秒。每日以小鼠四次潜伏期的平均值做为小鼠当日的成绩。

2.实验结果(见图6)：

Hidden platform test第2天，所有抗体给药组对照3×Tg空白组找到水面下隐藏平台的时间(逃离潜伏期)显著缩短，有统计学意义。第3天，抗Aβ单克隆抗体066-7.17.2 组逃离潜伏期所需时间为18s，抗Aβ单克隆抗体066-4.26.14组逃离潜伏期所需时间为27 s，抗Aβ单克隆抗体066-5.4.1组逃离潜伏期所需时间为30s，空白对照组逃离潜伏期所需时间为39s，066-7.17.2和066-4.26.14给药组对照3×Tg空白组逃离潜伏期显著缩短，有统计学意义。可见，抗Aβ单克隆抗体066-7.17.2，066-4.26.14有一定的改善阿尔茨海默痴呆模型小鼠认知学习记忆能力的作用，066-5.4.1未显示有明显的改善阿尔茨海默痴呆模型小鼠认知学习记忆能力的作用。

实施例7单克隆抗体基因测序和嵌合抗体制备

1.单克隆抗体基因测序

经免疫、融合及单克隆化后，基于结合表位、抑制Aβ聚合检测、促巨噬细胞吞噬A β活性检测、细胞毒保护活性检测、Morris水迷宫等实验结果选取066-5.4.1单克隆抗体细胞株进行总RNA提取，并反转录成cDNA，然后以cDNA为模板PCR扩增抗体的重链可变区和轻链可变区。

采用Invitrogen公司的TRIzol reagent试剂盒(15596-026)，按照其说明书进行066-5.4.1 单克隆抗体细胞株总RNA提取，结果见图7。

接着采用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(D315)，以总RNA为模板，试剂盒中的随机引物进行反转录为第一链cDNA，然后重链以恒定区设计引物mIgGR (5’-CTCAGGGAARTARCCYTTGAC-3’，SEQ ID NO:42)和试剂盒中的接头引物进行PCR 扩增，轻链以恒定区设计引物mIgKR(5’-TCACTGCCATCAATCTTCCAC-3’，SEQ ID NO:43)和试剂盒中的接头引物进行PCR扩增，结果见图8。

琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段进行TA克隆后挑单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物为M13F(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，SEQ ID NO:44)和M13R(5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’，SEQ ID NO:45)，鉴定正确菌株中选取部分样品送至 Invitrogen测序。最终确定重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:46，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:47，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:48，轻链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO:49，见表3。

表3、066-5.4.1抗体重链可变区和轻链可变区具体序列

066-5.4.1抗体重链可变区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:46)：

CAGGTGCAACTACAGCAGCCTGGGGCTGCGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGT GCAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAATTACAATATACACTGGGT AAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATCTATCCAGGAAATG GTGATACTACCTACAATCAGAAGGTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAA TCCTCCAGCACAGCCTACTTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTC TACTACTGTGCAAGAGGGGACTGGGACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCT GGTCACTGTCTCTGCA

066-5.4.1抗体轻链可变区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:47)：

GATATTGTGATGACGCAGGCTGTATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCA GCTTCCATCTCTTGCAGTTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATT TGTATTGGTATCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGT CCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGAT TTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCT CAAATGCTAGAACGCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

066-5.4.1抗体重链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:48)：

QVQLQQPGAALVKPGASVQMSCKASGYTFTNYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPG NGDTTYNQKVKGKATLTADKSSSTAYLQLSSLTSEDSAVYYCARGDWDWFAYWGQG TLVTVSA

066-5.4.1抗体轻链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:49)：

DIVMTQAVFSNPVTLGTSASISCSSSKSLLHSNGITYLYWYLQRPGQSPQLLIYRMS NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQMLERPLTFGAGTKLELK

2.066-5.4.1鼠人嵌合抗体表达载体构建

分别选择pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作为构建抗人Aβ鼠人嵌合抗体的重链和轻链的表达载体。以合成的066-5.4.1鼠源序列为模板，进行PCR扩增后，使用酶切连接的方法将VH和VL鼠源抗体基因分别克隆到pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL得到鼠人嵌合抗体的重链及轻链瞬转表达载体pGS003-066-066-5.4.1-chAb-hIgG1CH和 pGS003-066-066-5.4.1-chAb-hIgKCL。

066-5.4.1鼠人嵌合抗体重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:50)：

QVQLQQPGAALVKPGASVQMSCKASGYTFTNYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPG NGDTTYNQKVKGKATLTADKSSSTAYLQLSSLTSEDSAVYYCARGDWDWFAYWGQG TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

066-5.4.1鼠人嵌合抗体轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:51)：

DIVMTQAVFSNPVTLGTSASISCSSSKSLLHSNGITYLYWYLQRPGQSPQLLIYRMS NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQMLERPLTFGAGTKLELKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

3.瞬转表达

pGS003-066-5.4.1-chAbVH-hIgG4CH和pGS003-066-5.4.1-chAbVL-hIgKCL进行瞬时表达。

使用FreeStyle^TM293E细胞在Freestyle培养基中进行瞬转表达。转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞30ml，37℃5％CO₂温箱中130rpm 摇床培养。转染时先取60微升的293E Fectin加入到1ml的Opti-MEM中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组载体总质粒DNA的量为30μg，溶于1ml的Opti-MEM中。然后将质粒DNA和293EFectin充分混合，总体积为2ml，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞培养孔中，混匀，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养7天。将培养液进行高速离心后取上清进行微孔滤膜抽真空过滤。

4.蛋白纯化

根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier 10， GE)、镍柱进行纯化，得到纯化的鼠人嵌合抗体066-5.4.1-chAb，如图9。

实施例8抗体人源化

选取鼠源抗体066-5.4.1进行人源化，人源化过程包括主要为人源模板搜索及移植。

人源化改造的主要目标是可变区中FR序列。以鼠源抗体066-5.4.1VH及VL的氨基酸为模板，在NCBI网站上进行序列比对，找到人源化参考序列5条，作为抗体FR区人源化改造的参考模板设计人源化改造序列。

CDR区具体序列见表4，保留FR区移植后的人源化抗体序列见表5。

表4、066-5.4.1抗体CDR区具体序列

表5、066-5.4.1抗体人源化序列

>066-5.4.1H1(SEQ ID NO:25)

caggtgcagctggtgcagtcaggagcagaagtgaagaagcccggagccagcgtgaaagtgtcttgcaaggccagcggctacaccttca ccaactacaacatccattgggtccggcaggctccaggacagggactggagtggatgggagcaatctacccaggcaacggcgacaccac ctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgaccagagacaccagcaccagcaccgtgtacatggagctgagcagcctgaggagc gaggatacagccgtgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc

>066-5.4.1H2(SEQ ID NO:26)

cagatgcagctggtgcagagcggaccagaagtgaagaagcccggaaccagcgtgaaggtgtcttgcaaggccagcggctacaccttca ccaactacaacatccattgggtccggcaggccagaggacagagactggagtggatcggagccatctacccaggcaacggcgacaccac ctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgaccagagacatgagcaccagcaccgcctacatggagctgtctagcctgaggagc gaggacacagccgtgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc

>066-5.4.1H3(SEQ ID NO:27)

gaagtgcagctggtgcagagcggagcagaagtgaagaagcccggcgagtccctgaagatctcttgcaagggcagcggctacaccttca ccaactacaacatccattgggtccggcagatgccaggcaaaggactggagtggatgggagcaatctacccaggcaacggcgacaccac ctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgagcgccgataagagcatcagcaccgcctacctgcagtggtctagcctgaaggcca gcgataccgccatgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc

>066-5.4.1H4(SEQ ID NO:28)

caggtgcagctgcagcagccaggagccgacctggtcatgccaggagcccccgtgaagctgtcctgcctggcctctggctacaccttcaca aactataatatccactgggtgaagcagaggccaggaagaggactggagtggatcggagccatctaccccggcaacggcgacaccacata taatcagaaggtgaagggcaaggccaccctgacagccgataagagctcctctaccgcctacatccagctgagctccctgacatctgaggat agcgccgtgtactattgtgcccggggcgactgggattggtttgcctattggggccagggcaccctggtgacagtgtccgcc

>066-5.4.1H5(SEQ ID NO:29)

caggtgcagctggtgcagagcggagccgaggtgaagaagccaggggccagcgtgaaggtgtcctgcaaggcctctggctacaccttca caaactataatatccactgggtgcggcaggcccccggacagagactggagtggatcggagccatctaccctggcaacggcgacaccaca tataatcagaaggtgaagggcaaggccaccctgacagccgataagtccgcctctaccgcctacatggagctgagctccctgaggtccgag gacacagccgtgtactattgtgcccggggcgactgggattggtttgcctattggggccagggcaccctggtgacagtgtctagc

>066-5.4.1L1(SEQ ID NO:30)

gacatcgtgatgacccagtctcccctgagcctgcctgtgacactgggacagccagccagcatctcctgcagctcctctaagtccctgctgca ctctaacggcatcacctacctgtattggtaccagcagaggccaggacagtctccaaggctgctgatctatagaatgagcaatctggcctccg gagtgcctgaccggttctctggcagcggctccggaaccgacttcaccctgaagatctccagggtggaggccgaggatgtgggcgtgtact attgtgcccagatgctggagaggccactgaccttcggccagggaacaaggctggagatcaag

>066-5.4.1L2(SEQ ID NO:31)

gacatcgtgatgacccagacaccactgagcctgtccgtgaccccaggacagcctgcctctatcagctgcagctcctctaagagcctgctgc actccaacggcatcacatacctgtattggtacaggcagaagccaggacagtccccacagctgctgatctataggatgtctaatctggccagc ggagtgcctgaccgcttcgtgggctccggctctggaaccgacttcaccctgcggatctctagagtggaggccgaggacgtgggcttctact attgtgcccagatgctggagaggccactgacctttggcggcggcacaaaggtggatctgaag

>066-5.4.1L3(SEQ ID NO:32)

gacatcgtgatgacccagacacctctgtctctgccagtgacccctggagagccagccagcatctcctgcagctcctctaagtctctgctgca cagcaacggcatcacatacctgtattggtacctgcagaagcccggccagagccctaggctgctgatctatcgcatgtccaatctggcctctg gagtgccagaccggttctctggcagcggctccggaaccgacttcaccctgcggatctccagagtggaggccgaggacgtgggcgtgtac tattgtgcccagatgctggagaggcccctgaccttcggccagggaacaaaggtggatatcaag

>066-5.4.1L4(SEQ ID NO:33)

gacatcgtgatgacccagtctccacctagcctggccgtgacaccaggagagccagccagcatctcctgcagctcctctaagtccctgctgc actctaacggcatcacctacctgtattggtacctgcagaagcctggccaggccccacagctgctgatctatcggatgagcaatctggcctcc ggcgtgcccgacagattctctggcagcggctccggaaccgacttcaccctgaagatctctagggtggaggccgaggatgtgggcgtgtac tattgtgcccagatgctggagcggcctctgaccttcggccagggaacaaagctggagatcaag

>066-5.4.1L5(SEQ ID NO:34)

gacatcgtgatgacccagtctcccctgttcctgccagtgacacctggagaggcagccagcctgtcctgcagctcctctaagtctctgctgca cagcaacggcatcacctacctgtattggtacctgcagaggccaggacagacaccaaggctgctgatctatagaatgtccaatctggcctctg gcgtgcctgacaggttctctggcagcggctccggaaccgacttcaccctgaagatcagccgcgtggagtccgacgatgtgggcacctact attgtgcccagatgctggagaggccactgacctttggccagggcacaaaggtggagatcaag

实施例9 Aβ人源化全长抗体的制备

1.全长抗体瞬时转染表达载体的构建

分别选择pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作为构建抗人Aβ全长抗体的重链和轻链的表达载体。对066-5.4.1人源化抗体序列进行密码子优化，经PCR扩增后，重链使用HindⅢ及NheⅠ进行酶切，轻链使用HindⅢ及NarⅠ进行酶切，然后将5个VH和5个VL 抗体基因分别克隆到pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL，如表6。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时。使用Zymo Research的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和OD_260/280。OD_260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒DNA。

表6、重链和轻链瞬时转染表达载体列表

重链表达载体名称	轻链表达载体名称
		H1	L1
H2	L2
		H3	L3
H4	L4
		H5	L5

2.在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测

分别将上述066-5.4.1人源化的5个重链表达载体和5个轻链表达载体两两组合(共 25种组合)后进行2ml 293E体系的瞬时转染表达评估，对25种组合进行表达量和ELISA值评估，具体数值见表7，优选出6个全长抗体，分别为066-5.4.1-H1L4、066-5.4.1-H2L5、066-5.4.1-H5L1、066-5.4.1-H5L2、066-5.4.1-H5L3、066-5.4.1-H5L4。

表7、066-5.4.1人源化5×5组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量及EC50检测值

注：表中“--”表示无结合。

使用293E在Freestyle培养基中进行6个候选抗体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞300ml，37℃5％CO₂温箱中120 rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的Opti-MEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各300μg使用Opti-MEM稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养7天。

3.抗体的纯化及检测

2000g 20min离心细胞培养液，收集上清，用Octet检测上清中抗体表达量，见表8。

表8、6个候选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测

抗体名称	重链序列	轻链序列	瞬时转染表达量(mg/L)
				066-5.4.1H1L4	066-5.4.1H1	066-5.4.1L4	150
066-5.4.1H2L5	066-5.4.1H2	066-5.4.1L5	95
				066-5.4.1H5L1	066-5.4.1H5	066-5.4.1L1	147
066-5.4.1H5L2	066-5.4.1H5	066-5.4.1L2	78
				066-5.4.1H5L3	066-5.4.1H5	066-5.4.1L3	123
066-5.4.1H5L4	066-5.4.1H5	066-5.4.1L4	137

将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过MabSelectSuRe亲和层析柱(GE)，20mM 枸橼酸-枸橼酸纳，pH 3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性，加入10×PBS调节成等渗溶液。4～20％梯度胶(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图10。

实施例10人源化候选抗体EC50值测定

包被：将人Aβ42单体用CBS(pH 9.4)稀释成1μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔 50μl，2～8℃下孵育过夜。

封闭：用PBST洗板三次后，用3％BSA封闭，每孔200μl，25℃下孵育1小时。

样品处理：分别取人源化候选抗体及嵌合抗体，以10μg/ml为起始浓度进行2倍梯度稀释(2⁰～2^-11)，50μl/孔，25℃孵育1h。

加抗体：用PBST洗板四次后，加入抗人IgG(H+L)-HRP抗体，1:5000稀释液，50 μl/孔，25℃孵育1h。

显色：洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色3分钟。

终止：直接加终止液终止反应，每孔50μl。

检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。

数据处理：将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。具体数据见表 9。结果显示，6个人源化候选抗体与人Aβ的结合能力与嵌合抗体相当。

表9、6个候选抗体同抗原结合EC50值

抗体名称	Aβ42单体EC50值
		066-5.4.1H1L4	0.1696
066-5.4.1H2L5	0.1816
		066-5.4.1H5L1	0.0873
066-5.4.1H5L2	0.1046
		066-5.4.1H5L3	0.0782
066-5.4.1H5L4	0.1005
		066-5.4.1-chAb	0.6153

实施例11人源化候选抗体KD值的测定

应用Biacore-T200检测，使用ProteinA芯片捕获候选抗体或阳性抗体，用不同浓度的人Aβ抗原流经芯片，根据采集数据进行拟合分析。将抗原样品按2倍浓度梯度稀释法，使用HBS-EP+Buffer稀释至400nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L、6.25nmol/L、3.125nmol/L、1.56nmol/L、0.78nmol/L、0nmol/L浓度梯度溶液。以25nmol/L为重复浓度检测样品。检测条件为：捕获时间30s；抗原结合时间120s；解离时间900s；流速30μl/min，再生条件为20mM NaOH溶液，流速：30μl/min。具体实验结果见表10。由实验结果可知，相对于鼠人嵌合抗体，人源化抗体KD值可同鼠源抗体保持相当水平。

表10、6个候选抗体KD值检测

抗体名称	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				066-5.4.1H1L4	4.33E+04	2.22E-04	5.14E-09
066-5.4.1H2L5	4.80E+04	2.74E-04	5.70E-09
				066-5.4.1H5L1	5.43E+04	2.17E-04	3.99E-09
066-5.4.1H5L2	6.37E+04	2.66E-04	4.17E-09
				066-5.4.1H5L3	5.36E+04	3.20E-04	5.96E-09
066-5.4.1H5L4	6.03E+04	2.42E-04	4.01E-09
				066-5.4.1-chAb	3.73E+04	1.88E-04	5.03E-09

注：E+04：×10⁴；E-04：×10^-4；E-09：×10^-09。

实施例12人源化Aβ抗体抑制Aβ聚合作用检测

用8.2％DMSO/DPBS溶液(DMSO：sigma；DPBS：Hyclone)溶解Aβ干粉至1mg/ml， DPBS稀释Aβ溶液至33μg/ml，066-5.4.1人源化候选抗体稀释至450μg/ml(IC100)，超纯水稀释ThT(sigma)至20μM。取50μl候选抗体稀释液加入96孔黑板中(corning)，再向其中加入50μlAβ稀释液，最后加入100μlThT，室温避光孵育24小时，多功能酶标仪检测荧光强度(Ex/Em＝440/485)。横坐标为不同加样组，纵坐标为相对荧光强度，结果见图11。hIgG的相对荧光强度为1.00，066-5.4.1-mAb组的相对荧光强度为0.84， 066-5.4.1-chAb组的相对荧光强度为0.68，066-5.4.1H1L4组的相对荧光强度为0.61， 066-5.4.1H2L5组的相对荧光强度为0.64，066-5.4.1H5L1组的相对荧光强度为0.59， 066-5.4.1H5L2组的相对荧光强度为0.68，066-5.4.1H5L3组的相对荧光强度为0.55， 066-5.4.1H5L4组的相对荧光强度为0.58。可见，066-5.4.1人源化抗体均可抑制Aβ聚合。

实施例13人源化Aβ抗体促巨噬细胞吞噬Aβ活性检测

贴壁3天状态良好的小鼠原代腹腔巨噬细胞，0.25％胰蛋白酶消化、计数，用含10％血清胎牛血清的DMEM培养液(Gibco)调整细胞密度至2×10⁵/ml，接种96孔细胞培养板，100μl/孔；1％胎牛血清的DMEM培养基稀释066-5.4.1人源化候选抗体至50μg/ml(EC50)和200μg/ml(EC100)作为工作液，Aβ稀释至240μg/ml，超纯水稀释ThT(sigma) 至20μM。弃掉培养板中培养基，先加入50μl候选抗体稀释液，再加入50μl Aβ稀释液，设置复孔；37℃，5％CO₂培养箱中培养6小时；取50μl上清，加入96孔黑板中，再加入50μlThT，多功能酶标仪检测荧光强度(Ex/Em＝440/485)。横坐标为不同加样组，纵坐标为荧光强度，结果见图12。Aβ的荧光强度为1.00，066-5.4.1-mAb 50μg/ml组的荧光强度为0.93，066-5.4.1-mAb200μg/ml组的荧光强度为0.81，066-5.4.1-chAb 50μg/ml组的荧光强度为0.67，066-5.4.1-chAb 200μg/ml组的荧光强度为0.41，066-5.4.1H1L4 50μg/ml 组的荧光强度为0.56，066-5.4.1H1L4 200μg/ml组的荧光强度为0.25，066-5.4.1H2L5 50 μg/ml组的荧光强度为0.61，066-5.4.1H2L5 200μg/ml组的荧光强度为0.30，066-5.4.1H5L1 50μg/ml组的荧光强度为0.54，066-5.4.1H5L1 200μg/ml组的荧光强度为0.37， 066-5.4.1H5L2 50μg/ml组的荧光强度为0.55，066-5.4.1H5L2 200μg/ml组的荧光强度为 0.28，066-5.4.1H5L350μg/ml组的荧光强度为0.54，066-5.4.1H5L3 200μg/ml组的荧光强度为0.23，066-5.4.1H5L4 50μg/ml组的荧光强度为0.59，066-5.4.1H5L4 200μg/ml组的荧光强度为0.39。可见，066-5.4.1人源化候选抗体均具有促进巨噬细胞吞噬Aβ活性，其中 066-5.4.1H5L3表现最优。

实施例14人源化Aβ抗体细胞毒保护活性检测

对数生长期SHSY5Y细胞，0.25％胰蛋白酶消化、计数，用含10％胎牛血清的EMEM培养液(ATCC)调整细胞密度至3×10⁴/ml，接种96孔细胞培养板，100μl/孔；1％胎牛血清的EMEM培养基稀释066-5.4.1人源化候选抗体至200μg/ml(IC100)，作为工作液，Aβ稀释至240μg/ml。弃掉培养板中培养基，先加入50μl候选抗体稀释液，再加入50μl Aβ稀释液，设置复孔；37℃5％CO₂培养箱中培养48小时；取50μl上清，加入新96孔板中，再加入50μl LDHassay buffer，室温避光作用30min，加入50μl stop solution，多功能酶标仪检测吸光值。横坐标为不同加样组，纵坐标为LDH释放相对值，结果见图13。 Vehicle的LDH释放相对值为1.00，066-P02组的LDH释放相对值为1.53，066-5.4.1-mAb 组的LDH释放相对值为1.37，066-5.4.1-chAb组的LDH释放相对值为1.34，066-5.4.1H1L4 组的LDH释放相对值为1.39，066-5.4.1H2L5组的LDH释放相对值为1.41，066-5.4.1H5L1 组的LDH释放相对值为1.46，066-5.4.1H5L2组的LDH释放相对值为1.43，066-5.4.1H5L3 组的LDH释放相对值为1.35，066-5.4.1H5L4组的LDH释放相对值为1.44。可见，066-5.4.1 人源化候选抗体均具有细胞毒保护作用，且保护作用与066-P02相当。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长春金赛药业有限责任公司

<120> 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用

<130> MP1828744

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 重链的CDR区(CDR region of heavy chain)

<400> 1

Asn Tyr Asn Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 重链的CDR区(CDR region of heavy chain)

<400> 2

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 重链的CDR区(CDR region of heavy chain)

<400> 3

Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 轻链的CDR区(CDR region of the light chain)

<400> 4

Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 轻链的CDR区(CDR region of the light chain)

<400> 5

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 轻链的CDR区(CDR region of the light chain)

<400> 6

Ala Gln Met Leu Glu Arg Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 重链的FR区(FR region of heavy chain)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 重链的FR区(FR region of heavy chain)

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> 重链的FR区(FR region of heavy chain)

<400> 9

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 重链的FR区(FR region of heavy chain)

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 轻链的FR区(FR region of light chain)

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 轻链的FR区(FR region of light chain)

<400> 12

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 轻链的FR区(FR region of light chain)

<400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 轻链的FR区(FR region of light chain)

<400> 14

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 H1

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 H2

<400> 16

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 H3

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 H4

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Met Pro Gly Ala

1 5 10 15

Pro Val Lys Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 19

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 H5

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 L1

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 L2

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Val Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 L3

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 L4

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 L5

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Phe Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Thr

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ser Asp Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 H1

<400> 25

caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacaaca tccattgggt ccggcaggct 120

ccaggacagg gactggagtg gatgggagca atctacccag gcaacggcga caccacctac 180

aaccagaagg tcaagggcaa ggtcaccctg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcgc caggggcgat 300

tgggattggt tcgcctattg ggggcaggga acactggtga cagtgtccag c 351

<210> 26

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 H2

<400> 26

cagatgcagc tggtgcagag cggaccagaa gtgaagaagc ccggaaccag cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacaaca tccattgggt ccggcaggcc 120

agaggacaga gactggagtg gatcggagcc atctacccag gcaacggcga caccacctac 180

aaccagaagg tcaagggcaa ggtcaccctg accagagaca tgagcaccag caccgcctac 240

atggagctgt ctagcctgag gagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggggcgat 300

tgggattggt tcgcctattg ggggcaggga acactggtga cagtgtccag c 351

<210> 27

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 H3

<400> 27

gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa gtgaagaagc ccggcgagtc cctgaagatc 60

tcttgcaagg gcagcggcta caccttcacc aactacaaca tccattgggt ccggcagatg 120

ccaggcaaag gactggagtg gatgggagca atctacccag gcaacggcga caccacctac 180

aaccagaagg tcaagggcaa ggtcaccctg agcgccgata agagcatcag caccgcctac 240

ctgcagtggt ctagcctgaa ggccagcgat accgccatgt actattgcgc caggggcgat 300

tgggattggt tcgcctattg ggggcaggga acactggtga cagtgtccag c 351

<210> 28

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 H4

<400> 28

caggtgcagc tgcagcagcc aggagccgac ctggtcatgc caggagcccc cgtgaagctg 60

tcctgcctgg cctctggcta caccttcaca aactataata tccactgggt gaagcagagg 120

ccaggaagag gactggagtg gatcggagcc atctaccccg gcaacggcga caccacatat 180

aatcagaagg tgaagggcaa ggccaccctg acagccgata agagctcctc taccgcctac 240

atccagctga gctccctgac atctgaggat agcgccgtgt actattgtgc ccggggcgac 300

tgggattggt ttgcctattg gggccagggc accctggtga cagtgtccgc c 351

<210> 29

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 H5

<400> 29

caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc caggggccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctctggcta caccttcaca aactataata tccactgggt gcggcaggcc 120

cccggacaga gactggagtg gatcggagcc atctaccctg gcaacggcga caccacatat 180

aatcagaagg tgaagggcaa ggccaccctg acagccgata agtccgcctc taccgcctac 240

atggagctga gctccctgag gtccgaggac acagccgtgt actattgtgc ccggggcgac 300

tgggattggt ttgcctattg gggccagggc accctggtga cagtgtctag c 351

<210> 30

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 L1

<400> 30

gacatcgtga tgacccagtc tcccctgagc ctgcctgtga cactgggaca gccagccagc 60

atctcctgca gctcctctaa gtccctgctg cactctaacg gcatcaccta cctgtattgg 120

taccagcaga ggccaggaca gtctccaagg ctgctgatct atagaatgag caatctggcc 180

tccggagtgc ctgaccggtt ctctggcagc ggctccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgtg cccagatgct ggagaggcca 300

ctgaccttcg gccagggaac aaggctggag atcaag 336

<210> 31

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 L2

<400> 31

gacatcgtga tgacccagac accactgagc ctgtccgtga ccccaggaca gcctgcctct 60

atcagctgca gctcctctaa gagcctgctg cactccaacg gcatcacata cctgtattgg 120

tacaggcaga agccaggaca gtccccacag ctgctgatct ataggatgtc taatctggcc 180

agcggagtgc ctgaccgctt cgtgggctcc ggctctggaa ccgacttcac cctgcggatc 240

tctagagtgg aggccgagga cgtgggcttc tactattgtg cccagatgct ggagaggcca 300

ctgacctttg gcggcggcac aaaggtggat ctgaag 336

<210> 32

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 L3

<400> 32

gacatcgtga tgacccagac acctctgtct ctgccagtga cccctggaga gccagccagc 60

atctcctgca gctcctctaa gtctctgctg cacagcaacg gcatcacata cctgtattgg 120

tacctgcaga agcccggcca gagccctagg ctgctgatct atcgcatgtc caatctggcc 180

tctggagtgc cagaccggtt ctctggcagc ggctccggaa ccgacttcac cctgcggatc 240

tccagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactattgtg cccagatgct ggagaggccc 300

ctgaccttcg gccagggaac aaaggtggat atcaag 336

<210> 33

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 L4

<400> 33

gacatcgtga tgacccagtc tccacctagc ctggccgtga caccaggaga gccagccagc 60

atctcctgca gctcctctaa gtccctgctg cactctaacg gcatcaccta cctgtattgg 120

tacctgcaga agcctggcca ggccccacag ctgctgatct atcggatgag caatctggcc 180

tccggcgtgc ccgacagatt ctctggcagc ggctccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240

tctagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgtg cccagatgct ggagcggcct 300

ctgaccttcg gccagggaac aaagctggag atcaag 336

<210> 34

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 L5

<400> 34

gacatcgtga tgacccagtc tcccctgttc ctgccagtga cacctggaga ggcagccagc 60

ctgtcctgca gctcctctaa gtctctgctg cacagcaacg gcatcaccta cctgtattgg 120

tacctgcaga ggccaggaca gacaccaagg ctgctgatct atagaatgtc caatctggcc 180

tctggcgtgc ctgacaggtt ctctggcagc ggctccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240

agccgcgtgg agtccgacga tgtgggcacc tactattgtg cccagatgct ggagaggcca 300

ctgacctttg gccagggcac aaaggtggag atcaag 336

<210> 35

<211> 42

<212> PRT

<213> Aβ1-42

<400> 35

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> Aβ1-16

<400> 36

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> Aβ14-29

<400> 37

His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-P01阳性抗体重链可变区(heavy chain variable region of 066-P01 positive antibody )

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-P01阳性抗体轻链可变区(light chain variable region of 066-P01 positive antibody )

<400> 39

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 124

<212> PRT

<213> 066-P02阳性抗体重链可变区(heavy chain variable region of 066-P02 positive antibody )

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 066-P02阳性抗体轻链可变区(light chain variable region of 066-P02 positive antibody )

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> mIgGR

<400> 42

ctcagggaar tarccyttga c 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> mIgKR

<400> 43

tcactgccat caatcttcca c 21

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> M13F

<400> 44

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> M13R

<400> 45

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 46

<211> 351

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 抗体的重链可变区(Heavy chain variable region of 066-5.4.1 antibody)

<400> 46

caggtgcaac tacagcagcc tggggctgcg ctggtgaagc ctggggcctc agtgcagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc aattacaata tacactgggt aaagcagaca 120

cctggacagg gcctggaatg gattggagct atctatccag gaaatggtga tactacctac 180

aatcagaagg tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct actactgtgc aagaggggac 300

tgggactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 47

<211> 336

<212> DNA

<213> 066-5.4.1 抗体的轻链可变区(Light chain variable region of 066-5.4.1 antibody)

<400> 47

gatattgtga tgacgcaggc tgtattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60

atctcttgca gttctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120

tatctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaatgct agaacgcccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336

<210> 48

<211> 117

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 抗体的重链可变区(Heavy chain variable region of 066-5.4.1 antibody)

<400> 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 49

<211> 112

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 抗体的轻链可变区(Light chain variable region of 066-5.4.1 antibody)

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Val Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 50

<211> 446

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 鼠人嵌合抗体重链( heavy chain of 066-5.4.1 murinechimeric antibody)

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Trp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 51

<211> 219

<212> PRT

<213> 066-5.4.1 鼠人嵌合抗体轻链( light chain of 066-5.4.1 murinechimeric antibody)

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Val Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met

85 90 95

Leu Glu Arg Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (19)

1.人源化抗Aβ的单克隆抗体，其特征在于，

所述单克隆抗体的重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；且所述单克隆抗体的轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所述的单克隆抗体能够结合人Aβ。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，

所述单克隆抗体的重链的FR1-4的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:7、8、9和10所示的氨基酸序列；且所述单克隆抗体的轻链的FR1-4的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:11、12、13和14所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，

其重链可变区具有如SEQ ID NO:15~19中任一项所示的氨基酸序列，且其轻链可变区具有如SEQ ID NO:20~24中任一项所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1或3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位均为人Aβ_14~29。

5.如权利要求1或3所述的单克隆抗体，其特征在于，

其重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；

或其重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1~3任意一项所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述单克隆抗体的轻链的恒定区为κ型或λ型。

7.如权利要求4所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述单克隆抗体的轻链的恒定区为κ型或λ型。

8.如权利要求5所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述单克隆抗体的轻链的恒定区为κ型或λ型。

9.编码如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体的核苷酸。

10.一种表达载体，包括编码如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体的核苷酸。

11.转化或转染如权利要求10所述的表达载体的宿主细胞。

12.如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体的制备方法，包括：培养如权利要求11所述的宿主细胞、诱导人源化抗Aβ的单克隆抗体的表达。

13.结合物，其特征在于，包含经化学标记或生物标记的如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体。

14.如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体或如权利要求13所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

15.权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体、权利要求13所述的结合物和/或权利要求14所述的偶联物在制备抗认知缺损的作用剂、用于阿尔茨海默氏病的治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于抑制老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒剂、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂和/或抗突触毒性的作用剂中的应用。

16.权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体、权利要求13所述的结合物和/或权利要求14所述的偶联物在制备防治疾病的药物中的应用；

所述疾病包括淀粉样变性，所述淀粉样变性包括继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，所述疾病包括神经疾病，所述神经疾病包括阿尔茨海默病。

17.药物，其特征在于，包括如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体、如权利要求13所述的结合物和/或如权利要求14所述的偶联物。

18.权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体、权利要求13所述的结合物和/或权利要求14所述的偶联物在制备检测Aβ表达的产品中的应用。

19.试剂盒，包括如权利要求1~8任一项所述的单克隆抗体、如权利要求13所述的结合物和/或如权利要求14所述的偶联物。

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