JP2022523517A - ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体薬物の技術分野に関連し、特に抗Ａβモノクローナル抗体及びその使用に関連する。本発明において提供されるヒト化抗Ａβモノクローナル抗体は、Ａβモノマーの重合を阻害し、Ａβに対するマクロファージの食作用を促進し、Ａβ毒性から神経細胞を保護し、アルツハイマー症等のアミロイドーシスに関連する疾患及び症状の治療及び診断に使用され得る。【選択図】なし
Description
本出願は、２０１９年２月１日に中国特許庁に提出された中国特許出願の優先権を主張し、出願番号第２０１９１０１０４３１３．４号及び「ヒト化－抗Ａβモノクローナル抗体及びその使用」の発明タイトルを有し、その全内容は 参照により本出願に組み込まれる。
本開示は、抗体医薬品の技術分野、特にヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体及びその使用に関する。
Ａβ
アミロイドβ（Ａβ）は、ヒト２１番染色体遺伝子によってコードされ、３９～４３アミノ酸を含み、βシート構造を有し、疎水性であり、そして４ＫＤａの分子量を有する。Ａβは、タンパク質分解酵素によるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の断片化によって生成される残基ポリペプチドに由来する。ＡＰＰはα－、β－及びγ－プロテアーゼによって分解され得、そして分解後の生成物は異なる生物学的機能を有する。それらの中で、Ａβはβ－プロテアーゼ及びγ－プロテアーゼの継続的な作用によって産生される。ＡβのＣ末端はγ－プロテアーゼによって生成され、そして３９－４３アミノ酸の多数の残基サブタイプが膜貫通領域でＡＰＰを切断することによって生成される。全ての残基サブタイプの中で最も一般的なのはＡβ４０及びＡβ４２である。前者は通常、小胞体でＡＰＰを切断することによって形成されるが、後者はトランスゴルジネットワークで形成される。
アミロイドβ（Ａβ）は、ヒト２１番染色体遺伝子によってコードされ、３９～４３アミノ酸を含み、βシート構造を有し、疎水性であり、そして４ＫＤａの分子量を有する。Ａβは、タンパク質分解酵素によるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の断片化によって生成される残基ポリペプチドに由来する。ＡＰＰはα－、β－及びγ－プロテアーゼによって分解され得、そして分解後の生成物は異なる生物学的機能を有する。それらの中で、Ａβはβ－プロテアーゼ及びγ－プロテアーゼの継続的な作用によって産生される。ＡβのＣ末端はγ－プロテアーゼによって生成され、そして３９－４３アミノ酸の多数の残基サブタイプが膜貫通領域でＡＰＰを切断することによって生成される。全ての残基サブタイプの中で最も一般的なのはＡβ４０及びＡβ４２である。前者は通常、小胞体でＡＰＰを切断することによって形成されるが、後者はトランスゴルジネットワークで形成される。
Ａβの病理学的メカニズム
中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、星状細胞、ミクログリア、及び内皮細胞を含む全ての神経細胞がＡＰＰを発現し、そしてＡβを産生できることは現在知られている。通常の生理学的条件下で、ＡＰＰはα-セクレターゼによって加水分解され、可溶性のｓＡＰＰαフラグメントが生成される。このフラグメントは、ＡＰＰの細胞外領域及び、細胞膜上にある８３個のアミノ酸を有するＣ末端を含む。ｓＡＰＰαは、ニューロンの興奮性を調節し、シナプスの可塑性、学習、記憶を改善し、そして酸化的及び代謝的ストレスに対するニューロンの耐性を高めることができる。神経病理学的条件下で、ＡＰＰは最初にβ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ）によって加水分解され、ｓＡＰＰβフラグメント、及び細胞膜に連結された９９アミノ酸（Ｃ９９）を有するペプチドフラグメントが生成される。 続いて、Ｃ９９ペプチドはγ－セクレターゼの作用を受けてＡβを産生する。ｓＡＰＰαとは異なり、Aβは神経シナプス機能の喪失を引き起こし、ニューロンの可塑性を低下させ、細胞エネルギー代謝を変化させ、酸化ストレス応答及びミトコンドリア機能障害を誘発し、それによって細胞内カルシウムイオンの不均衡を引き起こす可能性がある。Ａβ、特にＡβ４２の形成、蓄積、及び沈着は、神経毒性及び神経変性疾患を引き起こす可能性があり、そしてまた、アルツハイマー病（ＡＤ）の病因にも重要な役割を果たす。
中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、星状細胞、ミクログリア、及び内皮細胞を含む全ての神経細胞がＡＰＰを発現し、そしてＡβを産生できることは現在知られている。通常の生理学的条件下で、ＡＰＰはα-セクレターゼによって加水分解され、可溶性のｓＡＰＰαフラグメントが生成される。このフラグメントは、ＡＰＰの細胞外領域及び、細胞膜上にある８３個のアミノ酸を有するＣ末端を含む。ｓＡＰＰαは、ニューロンの興奮性を調節し、シナプスの可塑性、学習、記憶を改善し、そして酸化的及び代謝的ストレスに対するニューロンの耐性を高めることができる。神経病理学的条件下で、ＡＰＰは最初にβ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ）によって加水分解され、ｓＡＰＰβフラグメント、及び細胞膜に連結された９９アミノ酸（Ｃ９９）を有するペプチドフラグメントが生成される。 続いて、Ｃ９９ペプチドはγ－セクレターゼの作用を受けてＡβを産生する。ｓＡＰＰαとは異なり、Aβは神経シナプス機能の喪失を引き起こし、ニューロンの可塑性を低下させ、細胞エネルギー代謝を変化させ、酸化ストレス応答及びミトコンドリア機能障害を誘発し、それによって細胞内カルシウムイオンの不均衡を引き起こす可能性がある。Ａβ、特にＡβ４２の形成、蓄積、及び沈着は、神経毒性及び神経変性疾患を引き起こす可能性があり、そしてまた、アルツハイマー病（ＡＤ）の病因にも重要な役割を果たす。
Ａβ及びアルツハイマー病（ＡＤ）
アルツマー病の主要な脳内病理学的マーカータンパク質の1つとして、Aβの形成、沈着、及び分解は、ＡＤの病理学的プロセス全体を通過する。 Ａβは可溶性及び不溶性の２つのタイプに分けられる。可溶性Ａβ自体には神経毒性はないが、βシートによる糸状繊維凝集体の形成時に不溶性の沈殿物になった後、神経毒性を示す。 ヒトＡβの一次構造は神経毒性の決定因子である。文献の報告によれば、Ａβの神経毒性は主に次の４つの側面に反映される：コリン作動性ニューロンの損傷、神経細胞のアポトーシス、過酸化損傷及び炎症反応。
アルツマー病の主要な脳内病理学的マーカータンパク質の1つとして、Aβの形成、沈着、及び分解は、ＡＤの病理学的プロセス全体を通過する。 Ａβは可溶性及び不溶性の２つのタイプに分けられる。可溶性Ａβ自体には神経毒性はないが、βシートによる糸状繊維凝集体の形成時に不溶性の沈殿物になった後、神経毒性を示す。 ヒトＡβの一次構造は神経毒性の決定因子である。文献の報告によれば、Ａβの神経毒性は主に次の４つの側面に反映される：コリン作動性ニューロンの損傷、神経細胞のアポトーシス、過酸化損傷及び炎症反応。
１．コリン作動性ニューロンの損傷
海馬及び皮質に突出する前基底部の多数のコリン作動系ニューロン及び神経シナプスの損傷及び喪失が、ＡＤ患者の記憶及び認知能力の低下の主な理由である。ＡβはプロテインキナーゼＧＳＫ－３ /グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３βを活性化し、タウタンパク質及びミトコンドリアのピルビン酸デヒドロゲナーゼのリン酸化を引き起こし、酵素活性を低下させ、そしてピルビン酸のアセチル補酵素Ａ（アクチル補酵素Ａ）への変換を低下させ、それにより、アセチルコリン（ＡＣｈ）の合成を低め、コハク酸デヒドロゲナーゼを阻害し、エネルギー供給を低め、コリン作動性ニューロン及びシナプスの損傷、変性及び伝達伝達障害を引き起こし、そしてコリン作動性システムの活性を低める。ＡＣｈの減少は、Ａβの産生の増加につながり、それが悪循環を形成する。
海馬及び皮質に突出する前基底部の多数のコリン作動系ニューロン及び神経シナプスの損傷及び喪失が、ＡＤ患者の記憶及び認知能力の低下の主な理由である。ＡβはプロテインキナーゼＧＳＫ－３ /グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３βを活性化し、タウタンパク質及びミトコンドリアのピルビン酸デヒドロゲナーゼのリン酸化を引き起こし、酵素活性を低下させ、そしてピルビン酸のアセチル補酵素Ａ（アクチル補酵素Ａ）への変換を低下させ、それにより、アセチルコリン（ＡＣｈ）の合成を低め、コハク酸デヒドロゲナーゼを阻害し、エネルギー供給を低め、コリン作動性ニューロン及びシナプスの損傷、変性及び伝達伝達障害を引き起こし、そしてコリン作動性システムの活性を低める。ＡＣｈの減少は、Ａβの産生の増加につながり、それが悪循環を形成する。
２．神経細胞のアポトーシス
ＡＤの主な特徴は、皮質及び海馬のニューロン数の減少である。 Ａβが凝集してβシートの折り畳み構造になる場合、その神経毒性が大幅に増強され、そして神経細胞のアポトーシスを誘発する可能性がある。 これは、ＡＤに選択的なニューロン及びシナプスがないことの重要な理由である。線維性で凝集したＡβ及びＡＰＰ及び他の膜貫通受容体は、細胞表面の分泌経路を介して相互作用及び架橋し、シグナル伝達経路の阻害及び異常な活性化をもたらし、それによって神経細胞のアポトーシスを開始する。内部環境におけるＡβ誘発性のＣａ２＋不均衡は、フリーラジカル損傷効果を通じてＮＭＤＡ受容体を刺激するか、又は膜透過性を変化させ、Ｃａ２＋流入を引き起こし、グルタミン酸受容体を活性化し、そしてグルタミン酸作動性ニューロンの過剰興奮と死を引き起こす。 さらに、ＡβはＮＯ合成の増加も引き起こし、それによって神経細胞のアポトーシスを誘発する。
ＡＤの主な特徴は、皮質及び海馬のニューロン数の減少である。 Ａβが凝集してβシートの折り畳み構造になる場合、その神経毒性が大幅に増強され、そして神経細胞のアポトーシスを誘発する可能性がある。 これは、ＡＤに選択的なニューロン及びシナプスがないことの重要な理由である。線維性で凝集したＡβ及びＡＰＰ及び他の膜貫通受容体は、細胞表面の分泌経路を介して相互作用及び架橋し、シグナル伝達経路の阻害及び異常な活性化をもたらし、それによって神経細胞のアポトーシスを開始する。内部環境におけるＡβ誘発性のＣａ２＋不均衡は、フリーラジカル損傷効果を通じてＮＭＤＡ受容体を刺激するか、又は膜透過性を変化させ、Ｃａ２＋流入を引き起こし、グルタミン酸受容体を活性化し、そしてグルタミン酸作動性ニューロンの過剰興奮と死を引き起こす。 さらに、ＡβはＮＯ合成の増加も引き起こし、それによって神経細胞のアポトーシスを誘発する。
３．過酸化損傷
Ａβは多くの方法で酸化ストレスを引き起こす可能性がある。 Ａβによって誘発されるフリーラジカルの増加によって引き起こされる酸化ストレスは重要な理由です。 Ａβの毒性はＨ２Ｏ２によって媒介され、そしてＡβは終末糖化産物（ＲＡＧＥ）の受容体を介して体内のＨ２Ｏ２の蓄積を増加させ、酸化的損傷を引き起こし、そして細胞死を引き起こす。 さらに、酸化ストレスがミクログリアの増殖を引き起こし、そしてＡβ濃度勾配に沿って移動し、老人斑の周りにミクログリアの凝集を誘導し、神経突起プラークを形成し、そしてより活性酸素のフリーラジカルを生成する。 Ａβは脂質過酸化も増加させる可能性がある。 Ｈ２Ｏ２は、ヒドロキシルフリーラジカルの供給源であるだけでなく、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）タンパク質の異常な発現を増加させ、神経細胞膜の損傷を引き起こし、そして神経変性を引き起こす。
Ａβは多くの方法で酸化ストレスを引き起こす可能性がある。 Ａβによって誘発されるフリーラジカルの増加によって引き起こされる酸化ストレスは重要な理由です。 Ａβの毒性はＨ２Ｏ２によって媒介され、そしてＡβは終末糖化産物（ＲＡＧＥ）の受容体を介して体内のＨ２Ｏ２の蓄積を増加させ、酸化的損傷を引き起こし、そして細胞死を引き起こす。 さらに、酸化ストレスがミクログリアの増殖を引き起こし、そしてＡβ濃度勾配に沿って移動し、老人斑の周りにミクログリアの凝集を誘導し、神経突起プラークを形成し、そしてより活性酸素のフリーラジカルを生成する。 Ａβは脂質過酸化も増加させる可能性がある。 Ｈ２Ｏ２は、ヒドロキシルフリーラジカルの供給源であるだけでなく、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）タンパク質の異常な発現を増加させ、神経細胞膜の損傷を引き起こし、そして神経変性を引き起こす。
４．炎症反応
ＡＤ患者は通常、脳に炎症反応を起こす。 グリア細胞は、プラーク及び神経原線維変化の周りで増殖する。 Ａβは、強い神経毒性を持つ一連の炎症性タンパク質の放出を刺激する可能性がある。例えば、Ａβは星状細胞及びミクログリアを活性化し、炎症性サイトカイン、例えばＮＯ、インターロイキン－１（ＩＬ－１、ＩＬ－１は細胞骨格タンパク質-ニューロフィラメントタンパク質の産生に異常を引き起こし、それによってニューロンの機能を損なう可能性があります）、インターロイキン－６（ＩＬ－６、ＩＬ－６はＡＤＰの過剰発現を増加させ、Ａβの形成を促進するが、ＡβはミクログリアでＩＬ－６の発現を誘導し、それによってＡＤの免疫病理学的過程で悪循環を形成する可能性がある）、腫瘍壊死 因子－α（ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－αはＣＮＳの最も重要なアポリポタンパク質ＡｐｏＥを介してＡＤの病理学的プロセスに関与している）、γ－インターフェロン（γ－ＩＦＮ）、β－アンチトリプシン（ＡＣＴ）、補体Ｃ１、Ｃ３及び ケモカイン、接着因子などを活性化する。多くの炎症性因子が炎症を誘発し、フリーラジカルの生成、酸化ストレスを促進し、神経細胞の変性及び壊死を引き起こす。
ＡＤ患者は通常、脳に炎症反応を起こす。 グリア細胞は、プラーク及び神経原線維変化の周りで増殖する。 Ａβは、強い神経毒性を持つ一連の炎症性タンパク質の放出を刺激する可能性がある。例えば、Ａβは星状細胞及びミクログリアを活性化し、炎症性サイトカイン、例えばＮＯ、インターロイキン－１（ＩＬ－１、ＩＬ－１は細胞骨格タンパク質-ニューロフィラメントタンパク質の産生に異常を引き起こし、それによってニューロンの機能を損なう可能性があります）、インターロイキン－６（ＩＬ－６、ＩＬ－６はＡＤＰの過剰発現を増加させ、Ａβの形成を促進するが、ＡβはミクログリアでＩＬ－６の発現を誘導し、それによってＡＤの免疫病理学的過程で悪循環を形成する可能性がある）、腫瘍壊死 因子－α（ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－αはＣＮＳの最も重要なアポリポタンパク質ＡｐｏＥを介してＡＤの病理学的プロセスに関与している）、γ－インターフェロン（γ－ＩＦＮ）、β－アンチトリプシン（ＡＣＴ）、補体Ｃ１、Ｃ３及び ケモカイン、接着因子などを活性化する。多くの炎症性因子が炎症を誘発し、フリーラジカルの生成、酸化ストレスを促進し、神経細胞の変性及び壊死を引き起こす。
Ａβ標的介入のための薬物及び治療メカニズム
上記に基づいて、ニューロンに対するＡβの毒性は、ＡＤの発生における重要な要因です。 従って、Ａβの産生を阻害し、そしてそのクリアランスを促進することにより、ＡＤの疾患プロセスを停止することができ、そして疾患の症状を軽減することができる。 現在クリニックで開発され使用されている薬も、Ａβの産生とクリアランスのメカニズムに基づいており、以下の部分が含まれる。
上記に基づいて、ニューロンに対するＡβの毒性は、ＡＤの発生における重要な要因です。 従って、Ａβの産生を阻害し、そしてそのクリアランスを促進することにより、ＡＤの疾患プロセスを停止することができ、そして疾患の症状を軽減することができる。 現在クリニックで開発され使用されている薬も、Ａβの産生とクリアランスのメカニズムに基づいており、以下の部分が含まれる。
１． β－及びγ－セクレターゼの阻害
β－セクレターゼによるＡＰＰの加水分解は、アミロイド産生の初期段階である。 β－セクレターゼの活性の阻害は、Ａβの産生を阻害する可能性がありますが、より大きな副作用を引き起こす可能性がある。 ＡＰＰに加えて、β－セクレターゼには多数の基質があり、これらの基質の加水分解は、神経系のニューロンとシナプスの可塑性に重要な役割を果たしているためです。 臨床的には、β－セクレターゼ阻害剤、例えばＥ２６０９（臨床試験ＩＤ＃ＮＣＴ０１６００８５９）、ＭＫ－８９３１（ＮＣＴ０１７３９３４８）、及びＬＹ２８８６７２１（ＮＣＴ０１８０７０２６、ＮＣＴ０１５６１４３０）はすべて、ヒト脳脊髄液中のＡβレベルを８０～９０％低下させることができますが、現在は まだ市場にβ－セクレターゼ阻害剤はありません。
β－セクレターゼによるＡＰＰの加水分解は、アミロイド産生の初期段階である。 β－セクレターゼの活性の阻害は、Ａβの産生を阻害する可能性がありますが、より大きな副作用を引き起こす可能性がある。 ＡＰＰに加えて、β－セクレターゼには多数の基質があり、これらの基質の加水分解は、神経系のニューロンとシナプスの可塑性に重要な役割を果たしているためです。 臨床的には、β－セクレターゼ阻害剤、例えばＥ２６０９（臨床試験ＩＤ＃ＮＣＴ０１６００８５９）、ＭＫ－８９３１（ＮＣＴ０１７３９３４８）、及びＬＹ２８８６７２１（ＮＣＴ０１８０７０２６、ＮＣＴ０１５６１４３０）はすべて、ヒト脳脊髄液中のＡβレベルを８０～９０％低下させることができますが、現在は まだ市場にβ－セクレターゼ阻害剤はありません。
γ－セクレターゼによるＡＰＰの加水分解は、Ａβ４０及びＡβ４２フラグメントを直接生成するアミロイド生成の最後の工程です。 従って、γ－セクレターゼの阻害は、ＡＤを治療する目的を達成するために、Ａβの産生を効果的に阻害する可能性があるとも考えられる。 ただし、ＡＰＰの加水分解に加えて、γ－セクレターゼはＮｏｔｃｈタンパク質を含む他の基質タンパク質も加水分解する。Ｎｏｔｃｈタンパク質は、細胞の増殖、分化及び細胞間シグナル伝達のために重要です。γ－セクレターゼ阻害剤としてのセマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）は、３，０００人の患者で臨床的に試験されている（ＮＣＴ００７６２４１１、ＮＣＴ０１０３５１３８、ＮＣＴ００７６２４１１）。試験の結果は、被験者の認知力は改善されなかったが悪化し、体重減少、皮膚癌の可能性の増加、感染のリスクが高いなどの副作用を伴うことを示した。他のγ-セクレターゼ阻害剤、例えばアバガセスタットも臨床試験で失敗している（ＮＣＴ００８１０１４７、ＮＣＴ００８９０８９０、ＮＣＴ００８１０１４７、ＮＣＴ０１０７９８１９）。選択的γ－セクレターゼモジュレーター（ＳＧＳＭ）は、理論的にはγ－セクレターゼの完全な阻害によって引き起こされる副作用を回避し、Ｎｏｔｃｈタンパク質の加水分解などの他のシグナルチャネルに干渉することなくＡＰＰの加水分解経路を単に阻害する。 いくつかの非ステロイド性抗炎症薬物、例えばイブプロフェン、スリンダク、インドメタシン、及びフルルビプロフェンは、γ－セクレターゼのレベルを調節し、インビボ及びインビトロの活性実験でＡβ４２のレベルを低下させることができる。このような薬物は軽度の認知障害を軽減し、脳脊髄液中の炎症性因子のレベルを低下させることが示されているが、ＡＤの治療のための非ステロイド性抗炎症薬の長期使用は依然として臨床的に検証する必要がある。
２． Ａβ凝集の阻害
老人斑の抑制は、Ａβの蓄積を妨害又は拮抗することによって達成することができる。例えば、３－アミノ－１－プロパンスルホン酸（３－ＡＰＳ、アルゼメド、トラミプロセート）は、溶解性Ａβと内因性アミノデキストランとの相互作用を妨害し、ここで後者はＡβアミロイド線維の形成と沈殿を促進し、それによって Ａβの蓄積を阻害する。しかし、３－ＡＰＳの第III相臨床試験の結果は満足のいくものではなかったため、試験は中止された。コロストリニンを含む他の抗－Ａβ凝集薬も第II相及び第III相臨床試験で失敗し、これは、インビトロ試験でマウスの認知能力を改善することもできたが、臨床第II相試験では満足のいく結果は得られなかった。 Scyllo－イノシトール（ＥＬＮＤ００５）は、経口抗－Ａβ凝集薬であり、そしてマウス実験では、Scyllo－イノシトールがＡβの毒性を軽減できることが示されているが、軽度から中等度のＡＤを有する患者を対象とした１８か月の第II相臨床試験では期待される結果が得られなかった。
老人斑の抑制は、Ａβの蓄積を妨害又は拮抗することによって達成することができる。例えば、３－アミノ－１－プロパンスルホン酸（３－ＡＰＳ、アルゼメド、トラミプロセート）は、溶解性Ａβと内因性アミノデキストランとの相互作用を妨害し、ここで後者はＡβアミロイド線維の形成と沈殿を促進し、それによって Ａβの蓄積を阻害する。しかし、３－ＡＰＳの第III相臨床試験の結果は満足のいくものではなかったため、試験は中止された。コロストリニンを含む他の抗－Ａβ凝集薬も第II相及び第III相臨床試験で失敗し、これは、インビトロ試験でマウスの認知能力を改善することもできたが、臨床第II相試験では満足のいく結果は得られなかった。 Scyllo－イノシトール（ＥＬＮＤ００５）は、経口抗－Ａβ凝集薬であり、そしてマウス実験では、Scyllo－イノシトールがＡβの毒性を軽減できることが示されているが、軽度から中等度のＡＤを有する患者を対象とした１８か月の第II相臨床試験では期待される結果が得られなかった。
３． Ａβ沈着及びポリマーのクリアランスの促進
Ａβ沈着及びポリマーを除去する主な方法は３つある：アミロイド斑分解酵素の活性を活性化； 脳及び末梢循環におけるＡβの輸送の調節； 及び抗－Ａβ免疫療法。
Ａβ沈着及びポリマーを除去する主な方法は３つある：アミロイド斑分解酵素の活性を活性化； 脳及び末梢循環におけるＡβの輸送の調節； 及び抗－Ａβ免疫療法。
Ａβの沈着及びポリマーは、プラスミン、エンドセリン変換酵素、アンジオテンシン変換酵素、メタロプロテイナーゼなどを含む種々のタンパク質分解酵素によって分解され得る。ＡＤ患者の脳内のそれらの酵素のレベルは比較的低いですが、 これらの酵素に対する特異性の欠如のために、そのような薬物は現在クリニックに入っていません。
中枢神経系と末梢循環系の間のＡβの輸送は、アポリポタンパク質によって調節される。 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ－１）は、脳から血液へのＡβの流れを促進することができる。高度な糖化最終産物（ＲＡＧＥ）の受容体は、Ａβが血液脳関門を通過するのを助けることができる。 この治療メカニズムは、Ａβが末梢循環に入るのを制限することにより、脳内のアミロイドの負荷を減らすことである。これまでのところ、ＰＦ－０４４９４７００５２及びＴＴＰ４０００を含むＲＡＧＥ阻害剤/調節剤のみが臨床試験に参加して来た。 前者は第ＩＩ相臨床試験で失敗したが、後者は第Ｉ相臨床試験で期待される結果が達成されたことを示す信頼できるデータが存在しなかった。
抗－Ａβ抗体は、Ａβの毒性を中和し、トランスジェニック動物の認知を改善することができる。 抗－Ａβ抗体はＡＤ治療のホットトピックになっている。 抗－Ａβ抗体は、主にＡＤの早期治療、及び軽度から中等度のＡＤの治療を目的としている。これは、Ａβの病原性メカニズムにも関連している。すなわち、ニューロンが損傷すると、それらを元に戻して修復することは困難である。従がって、Ａβを早期に除去すると、ＡＤをより効果的に治療及び軽減することができる。
４． 現在臨床試験中のＡβ標的抗体
現在、１５の抗－Ａβ抗体薬が臨床試験を受けている。 それに比べて、アデュカヌマブ、ガンテネルマブ、及びソラネズマブは急速に進歩し、そして第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。 メカニズムで述べたように、種々の企業がその適応症として軽度のアルツハイマー病を標的にしている。
現在、１５の抗－Ａβ抗体薬が臨床試験を受けている。 それに比べて、アデュカヌマブ、ガンテネルマブ、及びソラネズマブは急速に進歩し、そして第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。 メカニズムで述べたように、種々の企業がその適応症として軽度のアルツハイマー病を標的にしている。
アルツハイマー病の治療及び予防の分野には一定の理論的知識があるが、それでも、疾患の治療及び／又は予防のための組成物及び方法を改善する必要があり、Ａβを標的にできる抗体及び治療が必要である。治療上の大きな利点を有するいくつかのヒト化モノクローナル抗体が得られているが、必要な特性及び機能を備えたヒト化モノクローナル抗体をスクリーニングすることは簡単な作業ではない。 実際には、そのようなヒト化モノクローナル抗体の緊急の必要性がまだある。
これを考慮して、本開示によって解決されるべき技術的問題は、ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体及びその使用を提供し、また、モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド及びその使用のためのベクター及び宿主細胞を提供することである。本開示に関与する抗体遺伝子の可変領域の配列から、クリニックでアミロイドーシス関連疾患及び障害（例えば、アルツハイマー病）の治療及び診断のための薬剤として使用できる完全長抗体分子が構築され得る。
本開示の上記の目的を達成するために、本開示は、以下の技術的解決策を提供する。
本開示は、
（Ｉ）前記モノクローナル抗体の３つのＨ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１、２及び３で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＩＩ）前記モノクローナル抗体の３つのＬ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＩＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＩＶ）前記アミノ酸配列が、（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、抗－Ａβヒト化モノクローナル抗体を提供する。
（Ｉ）前記モノクローナル抗体の３つのＨ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１、２及び３で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＩＩ）前記モノクローナル抗体の３つのＬ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＩＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＩＶ）前記アミノ酸配列が、（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、抗－Ａβヒト化モノクローナル抗体を提供する。
さらに、本開示のモノクローナル抗体は、Ａβ１４～２９の抗原結合エピトープを有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、本開示は、ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体を提供し、
ここで、そのＨ鎖は３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ領域の少なくとも１つは、配列番号１、２又は３に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有し;
そのＬ鎖は３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ領域の少なくとも１つは、配列番号４、５又は６に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
ここで、そのＨ鎖は３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ領域の少なくとも１つは、配列番号１、２又は３に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有し;
そのＬ鎖は３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ領域の少なくとも１つは、配列番号４、５又は６に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
本開示において、モノクローナル抗体の３つのＨ鎖ＣＤＲ領域は、それぞれ配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有し；
モノクローナル抗体の３つのＬ鎖ＣＤＲ領域は、それぞれ配列番号４、５及び６に示されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する。
モノクローナル抗体の３つのＬ鎖ＣＤＲ領域は、それぞれ配列番号４、５及び６に示されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する。
その中で、配列番号１に示される配列はＮＹＮＩＨであり；
配列番号２に示される配列はＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧであり；
配列番号３に示される配列はＧＤＷＤＷＦＡＹであり；
配列番号４に示される配列はＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹであり；
配列番号５に示される配列はＲＭＳＮＬＡＳであり；
配列番号６に示される配列はＡＱＭＬＥＲＰＬＴである。
配列番号２に示される配列はＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧであり；
配列番号３に示される配列はＧＤＷＤＷＦＡＹであり；
配列番号４に示される配列はＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹであり；
配列番号５に示される配列はＲＭＳＮＬＡＳであり；
配列番号６に示される配列はＡＱＭＬＥＲＰＬＴである。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、本開示は、
（Ｖ）前記モノクローナル抗体の４つのＨ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号７、８、９及び１０で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＶＩ）前記モノクローナル抗体の４つのＬ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１、１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＶＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＶＩＩＩ）前記アミノ酸配列か、（Ｖ）、（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、モノクローナル抗体を提供する。
（Ｖ）前記モノクローナル抗体の４つのＨ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号７、８、９及び１０で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＶＩ）前記モノクローナル抗体の４つのＬ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１、１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＶＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＶＩＩＩ）前記アミノ酸配列か、（Ｖ）、（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、モノクローナル抗体を提供する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、そのＨ鎖は４つのＦＲ領域を含み、ここで、ＦＲ領域の少なくとも１つは、配列番号７、８、９又は１０に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有し;
そのＬ鎖は４つのＦＲ領域を含み、ここで、ＦＲ領域の少なくとも１つは、配列番号１１、１２、１３又は１４に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
そのＬ鎖は４つのＦＲ領域を含み、ここで、ＦＲ領域の少なくとも１つは、配列番号１１、１２、１３又は１４に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、前記モノクローナル抗体の４つのＨ鎖ＦＲ領域は、それぞれ、配列番号７、８、９又は１０に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有し;
前記モノクローナル抗体の４つのＬ鎖ＦＲ領域は、それぞれ、配列番号１１、１２、１３又は１４に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
前記モノクローナル抗体の４つのＬ鎖ＦＲ領域は、それぞれ、配列番号１１、１２、１３又は１４に示されるようなアミノ酸配列であるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
その中で、配列番号７に示される配列はＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴであり；
配列番号８に示される配列はＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧであり；
配列番号９に示される配列はＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
配列番号１０に示される配列はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳであり；
配列番号１１に示される配列はＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣであり；
配列番号１２に示される配列はＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹであり；
配列番号１３に示される配列はＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣであり；
配列番号１４に示される配列はＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫである。
配列番号８に示される配列はＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧであり；
配列番号９に示される配列はＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
配列番号１０に示される配列はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳであり；
配列番号１１に示される配列はＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣであり；
配列番号１２に示される配列はＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹであり；
配列番号１３に示される配列はＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣであり；
配列番号１４に示される配列はＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫである。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体
に関して、
（ＩＸ）そのＨ鎖可変領域が、配列番号１５～１９のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；そして（Ｘ）そのＬ鎖可変領域が、配列番号２０～２４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介して（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列を有し、そして（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＸＩＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、（ＩＸ）、（Ｘ）又は（ＸＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である。
に関して、
（ＩＸ）そのＨ鎖可変領域が、配列番号１５～１９のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；そして（Ｘ）そのＬ鎖可変領域が、配列番号２０～２４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介して（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列を有し、そして（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；
さらに、この機能は、Ａβ重合の阻害、Ａβに対するマクロファージの食作用の促進、並びに細胞毒性保護活性から成る群から選択される２つ又は３つの機能を含み；又は
（ＸＩＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、（ＩＸ）、（Ｘ）又は（ＸＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、そのＨ鎖可変領域が配列番号１５～１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２２０～２４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体は、以下を含む：
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２０に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２１に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２２に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２０に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２１に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２２に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有し；
Ｈ鎖可変領域が配列番号１５、１６、１７、１８又は１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてＬ鎖可変領域が配列２４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体に関して、
（ＸＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２４に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２０に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２１に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２２に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
（ＸＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２４に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２０に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２１に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２２に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
本開示によれば、少なくとも９７％の配列相同性を有する配列は、元の配列に基づいて1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加により得られるアミノ酸配列であり、ここでより多くのアミノ酸は２、３、４又は５のアミノ酸を指す。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、本開示のモノクローナル抗体はさらに定常領域を含み、ここで前記モノクローナル抗体はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つであるＨ鎖定常領域を有し；そして前記モノクローナル抗体がκ型又はλ型であるＬ鎖定常領域を有する。
本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１であるＨ鎖定常領域及び、ヒトκ鎖の定常領域であるＬ鎖定常領域を有する。
本開示によって提供されるヒト化抗Ａβモノクローナル抗体は、ヒトＡβに結合することができ； いくつかの実施形態によれば、抗体とその標的との間の親和性は、Ｋａ（会合定数）、Ｋｄ（解離定数）、及びＫＤ（平衡解離溶液）によって特徴付けられ； そして、本開示によって提供される抗体のＫＤ値は、５．９６ｎＭ以下である。本開示によって提供されるヒト化抗Ａβモノクローナル抗体は、Ａβモノマーの重合を阻害し、Ａβに対するマクロファージの食作用を促進し、神経細胞をＡβの毒性から保護する。
本開示はまた、モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを提供する。
本開示は、モノクローナル抗体のＨ鎖をコードするヌクレオチド配列を提供する。
本開示は、モノクローナル抗体のＬ鎖をコードするヌクレオチド配列を提供する。
本開示は、モノクローナル抗体のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
その中で、モノクローナル抗体のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５～２９に示されているか、又は配列番号２５～２９の相補的配列である。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、ヌクレオチドは、1つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を介して配列番号２５～２９のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列から得られ、そして配列番号２５～２９のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と同じか又は類似の機能を有するヌクレオチド配列を有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加を介して配列番号２５～２９のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から得られるヌクレオチド配列について、より多くのヌクレオチドは、２、３、４又は５のヌクレオチドを指す。
本開示は、モノクローナル抗体のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
その中で、モノクローナル抗体のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０～３４に示されているか、又は配列番号３０～３４の相補的配列である。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、ヌクレオチドは、1つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を介して配列番号３０～３４のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列から得られ、そして配列番号３０～３４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と同じか又は類似の機能を有するヌクレオチド配列を有する。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加を介して配列番号３０～３４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から得られるヌクレオチド配列について、より多くのヌクレオチドは、２、３、４又は５のヌクレオチドを指す。
本開示によって提供される発現ベクターは、抗－Ａβモノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを含む。
本開示はまた、発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本開示の抗－Ａβモノクローナル抗体の調製方法は、宿主細胞を培養し、抗－Ａβモノクローナル抗体の発現を誘導することを含む。
本開示はまた、化学的又は生物学的に標識された抗Ａβモノクローナル抗体を提供する。
化学標識は、同位体、免疫毒素、及び/又は化学薬品である。
生物学的標識は、ビオチン、アビジン、又は酵素標識である。
酵素標識は、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである。
免疫毒素は、好ましくは、アフラトキシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、ミストレットレクチン、ボルケンシン毒素、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン又はルフィンである。
本開示はまた、抗Ａβモノクローナル抗体又はそのコンジュゲートを固体培地又は半固体培地とカップリングすることによって調製されるカップリング生成物を提供する。
固体培地又は非固体媒体は、コロイド金、ポリスチレンプレート又はビーズから選択される。
本開示はまた、認知機能障害と戦うための薬剤、アルツハイマー病を治療するための薬剤、アルツハイマー病の進行を阻害するための薬剤、老人斑の形成を阻害するための薬剤、Ａβ蓄積を阻害するための薬剤、神経毒性と戦うための薬剤、Ａβアミロイド線維の形成を阻害するための薬剤、及び/又はシナプス毒性と戦うための薬剤の製造への、前記モノクローナル抗体、前記コンジュゲート及び/又は前記カップリング生成物の使用を提供する。
本開示はまた、疾患の予防及び治療のための薬剤の製造におけるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体、コンジュゲート及び／又はカップリング生成物の使用を提供し；
前記疾患は、アミロイドタンパク質に関連する疾患及び異常であるアミロイドーシスを含み、アミロイドーシスは、続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、疾患には、アルツハイマー病などの神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。
前記疾患は、アミロイドタンパク質に関連する疾患及び異常であるアミロイドーシスを含み、アミロイドーシスは、続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、疾患には、アルツハイマー病などの神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本開示はまた、ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体、そのコンジュゲート及び／又はカップリング生成物を含む薬剤を提供する。
本開示はまた、本開示の薬剤を投与することを含む、疾患の予防及び／又は治療のための方法を提供し；前記疾患及び障害は、アミロイドタンパク質に関連する疾患及び異常であるアミロイドーシスを含み、アミロイドーシスは、続発性アミロイドーシスおよび加齢性アミロイドーシス、並びにアルツハイマー病などの神経疾患を含むがこれらに限定されない。
本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体は、Ａβモノマーの重合を阻害し、Ａβに対するマクロファージの食作用を促進し、神経細胞をＡβの毒性から保護することができ、そしてアルツハイマー病などのアミロイドーシスに関連する疾患や障害の治療及び診断に使用できる。
本開示はまた、Ａβ発現を検出するための生成物の製造におけるヒト化抗Ａβモノクローナル抗体、コンジュゲート及び／又はカップリング生成物の使用を提供する。
実験は、本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体がＡβモノマーに結合できることを示している。 従がって、本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体は、Ａβモノマーの検出に使用することができる。
本開示はまた、ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体、そのコンジュゲート及び／又はカップリング生成物を含むキットを提供する。
前記Ａβモノマー又はポリマー混合物を検出するためのキットは、コーティング緩衝液、洗浄溶液、ブロッキング溶液及び／又は発色溶液をさらに含む。
コーティング緩衝液は炭酸塩緩衝液である。
洗浄溶液は、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムを含む。
ブロッキング溶液は、ＰＢＳ及びＢＳＡを含む。
発色溶液は、ＴＭＢ液、基質緩衝液、及び停止液を含む。
基質緩衝液は、クエン酸及びリン酸水素二ナトリウムを含む。
停止液は、過酸化水素水溶液である。
Ａβの表面発現を伴う細胞を検出するためのキットは、ＰＢＳ、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ及びＴＩＴＣ二次抗体をさらに含む。
本開示はまた、本開示によって提供されるキットを使用してＡβの発現を検出し、そしてＡβの発現量に基づいて疾患があるかどうかを決定することを含む、疾患を診断するための方法を提供し；前記疾患及び障害は、アミロイドタンパク質に関連する疾患及び異常の群であるアミロイドーシスを含み、アミロイドーシスは、続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、アルツハイマー病などの神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの特定の実施形態によれば、Ａβの発現量に基づいて疾患があるかどうかを判断するための基準は、正常な人では６００～１０００ ｐｇ / ｍｌ、ＡＤ患者では２００～４５０ ｐｇ / ｍｌであり、必要な検出感度は＜２０ ｐｇ / ｍｌである。
特にことわらない限り、本明細書で使用されるすべての科学的及び技術的用語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。 この分野の定義及び用語については、専門家は分子生物学の現在のプロトコル（Ausubel）を参照できます。 アミノ酸残基の略語は、一般的に使用される２０個のＬ－アミノ酸のうちの１つを指すために当技術分野で使用される標準的な３文字及び／又は１文字のコードである。
「抗体」とは、抗原に特異的に結合することができる１つ又は複数のポリペプチドから構成されるタンパク質を指す。 抗体の一形態は、抗体の基本的な構造単位を構成する。 この形態は四量体であり、それぞれがＬ鎖及びＨ鎖を持つ２対の同一の抗体鎖で構成されている。抗体鎖の各ペアでは、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域が共同で抗原の結合に関与し、定常領域が抗体のエフェクター機能に関与する。
抗体のＨ鎖又はＬ鎖の「可変領域」は、鎖のＮ末端成熟領域です。 現在知られている抗体タイプには、κ及びλＬ鎖、並びにα、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、及びμＨ鎖又はそれらの他のタイプの同等物が含まれる。全長免疫グロブリン「Ｌ鎖」（約２５ ｋＤａ又は約２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２末端の約１１０個のアミノ酸によって形成される可変領域及び、ＣＯＯＨ末端のκ又はλ定常領域を含む。全長免疫グロブリン「Ｈ鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６個のアミノ酸）もまた、可変領域（約１１６個のアミノ酸）及びγ（約３３０個のアミノ酸）などのＨ鎖定常領域の1つを含む。
「抗体」は、任意のアイソタイプ抗体又は免疫グロブリン、又は抗原への特異的結合を保持する抗体フラグメントを含み、これには、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及び抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が含まれるが、それらだけには限定されない。抗体は標識して検出することができます。 たとえば、放射性同位元素、酵素、蛍光タンパク質、ビオチンなどによって標識及び検出され、検出可能な物質を生成することができます。 抗体はまた、ポリスチレンプレート又はビーズを含むが、これらに限定されない固体担体に結合することができる。
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体を指し、抗体分子の他の部分は、1つ（又は複数）のヒト抗体に由来する。 さらに、結合親和性を保持するために、フレームワーク（ＦＲと呼ばれる）セグメントのいくつかの残基を改変することができる。
「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成を有する抗体分子の調製物を指す。 モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示します。
薬剤は、少なくとも１つの機能性成分を含み、さらに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、医薬的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの等張塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリプロピレンなどのポリアルキレングリコール グリコール、トリグリセリドなどである。使用される医薬的に許容される担体のタイプは、特に、本開示による組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内投与用に処方されるかどうかに依存する。 本開示による組成物は、添加剤として、湿潤剤、乳化剤、又は緩衝物質を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 及び1991年以降のバージョン)により定義されるように、免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖の超可変領域を指す。３つのＨ鎖ＣＤＲ及び３つのＬ鎖ＣＤＲが存在する。状況に応じて、本明細書で使用される1つまたは複数のＣＤＲという用語は、これらの領域の1つ、又はこれらの領域のいくつか又はすべてを示すために使用され、 それらは、抗原又はその認識エピトープへの抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基のほとんどを含む。
本開示は、ＦＲ移植を実施するためにマルチテンプレートを参照することによって合理的な抗体ヒト化設計を実施し、それによってマウス抗体と同等の親和性を有するヒト化抗体を得る抗体ヒト化修飾の方法を提供する。
本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体の調製方法は、以下を含む：
工程１：マウス由来のハイブリドーマを調製し、５‘ＲＡＣＥを介して抗体配列を取得し；
工程２：抗体のヒト化、ＮＣＢＩツールで配列アラインメントを実行してヒト化の修飾を完了し、修飾された抗体をスクリーニングする。
工程１：マウス由来のハイブリドーマを調製し、５‘ＲＡＣＥを介して抗体配列を取得し；
工程２：抗体のヒト化、ＮＣＢＩツールで配列アラインメントを実行してヒト化の修飾を完了し、修飾された抗体をスクリーニングする。
具体的には、この方法は以下を含む。
ヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体を調製するための方法は、以下を含む：マウス抗体０６６－５．４．１をテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅を行って抗体のＨ鎖可変領域遺伝子ＶＨとＬ鎖可変領域遺伝子ＶＬを取得し、それらをアミノ酸配列に翻訳し、そして次に、アミノ酸配列をＮＣＢＩデータベース内のヒト抗体配列とアラインメントし、可変領域のＶＨ及びＶＬと最も類似性の高い５つのヒト抗体配列をヒト化修飾の参照テンプレートとして選択し、マウス抗体０６６－５．４．１のＣＤＲ領域を決定し、ＣＤＲ領域を変更せずに、上記のＶＨ及びＶＬの５つの参照テンプレートからそれぞれＦＲ領域を０６６－５．４．１に移植して、これらはコドン最適化され、その後、一過性トランスフェクション用の発現ベクターの構築に個別にかけられ；発現ベクターを293E細胞に移して発現させ、Ａβに特異的に結合するヒト化抗体を取得し； ヒト化抗体を親和性測定、抗原結合ＥＣ５０値測定、Ａβ重合阻害試験、Ａβに対するマクロファージの食作用を促進する活性の試験及び細胞毒性保護試験に供し、そして最終的に、ヒト化Ａβ抗体を取得することを含む。
本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体は、Ａβモノマーの重合を阻害し、Ａβに対するマクロファージの食作用を促進し、神経細胞をＡβの毒性から保護し、 そしてアルツハイマー病などのアミロイドーシス関連の疾患及び障害の治療及び診断に使用され得る。
本開示の例又は先行技術の技術的解決策をより明確に説明するために、以下では、例又は先行技術の説明に使用する必要のある図面について簡単に説明する。
本開示は、ヒト化抗Ａβモノクローナル抗体およびその使用を開示し、当業者は、本開示の内容を学習し、プロセスパラメータを適切に改善することによってそれらを実現することができる。特に、すべての同様の置換及び改変は当業者には明らかであり、それらはすべて本開示に含まれるとみなされることを指摘すべきである。本開示の方法及び使用は、好ましい実施例を通して説明されており、当業者は、本開示の技術を達成し、適用するために、内容、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び使用に変更または適切な変更及び組み合わせを行うことができることは明らかである。
本開示によって提供されるヒト化抗－Ａβモノクローナル抗体、並びに使用に使用される原材料及び試薬はすべて市販されていた。
本開示は、以下の実施例と併せてさらに説明される。
実施例１：Ａβ抗原及び陽性対照抗体の調製
Ａβモノマー及びポリマーの混合物の調製
Ａβ１－４２、Ａβ１－１６、及びＡβ１４－２９ポリペプチドが、Ji’er Biochemical (Shanghai) Co., Ltd.により合成された。Ａβ１－４２ポリペプチドはＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号３５）であり、Ａβ１－１６ポリペプチドのアミノ酸配列はＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号３６）であり、そしてＡβ１４－２９ポリペプチドのアミノ酸配列はＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ（配列番号 ３７）であった。
Ａβモノマー及びポリマーの混合物の調製
Ａβ１－４２、Ａβ１－１６、及びＡβ１４－２９ポリペプチドが、Ji’er Biochemical (Shanghai) Co., Ltd.により合成された。Ａβ１－４２ポリペプチドはＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号３５）であり、Ａβ１－１６ポリペプチドのアミノ酸配列はＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号３６）であり、そしてＡβ１４－２９ポリペプチドのアミノ酸配列はＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ（配列番号 ３７）であった。
Ａβ１－４２モノマー（Ａβモノマーと略す）の調製方法：１ｍｌのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を１ｍｇのＡβ１－４２ポリペプチド乾燥粉末に加え、1分間ボルテックス及び振盪し、そして溶解が完結するまで水浴中で１～５分間超音波処理し；３７℃、２００ｒｐｍでの振盪インキュベーターに入れ、そして１．５時間振盪し；真空ロータリードライヤーを使用して、ヘキサフルオロイソプロパノールを揮発させ；１９２μlの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、乾燥したＡβ１－４２ポリペプチドに添加し、ポリペプチドを溶解し、次に２７μlの２０×ＰＢＳ溶液、５４μlの２％ＳＤＳ、２６７μlのｄｄＨ２Ｏと共に添加し、良く混合し、少量でサブパッケージし、－８０℃の冷蔵庫に保存し、これはＡβ１－４２モノマーであった；そしてその検出はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷＢにより行った（ハイブリダイゼーション検出はＡβ１－４２を特異的に認識する陽性抗体０６６－Ｐ０２を用いて行った）（図１参照のこと）。
Ａβ１－４２ポリマー混合物（Ａβポリマー混合物と略す）の調製方法：１ｍｌのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を１ｍｇのＡβ１－４２ポリペプチド乾燥粉末に加え、1分間ボルテックス及び振盪し、そして溶解が完結するまで水浴中で１～５分間超音波処理し；３７℃、２００ｒｐｍでの振盪インキュベーターに入れ、そして１．５時間振盪し；真空ロータリードライヤーを使用して、ヘキサフルオロイソプロパノールを揮発させ；１９２μlのＤＭＳＯを、乾燥したＡβ１－４２ポリペプチドに添加し、ポリペプチドを溶解し、次に２７μlの２０×ＰＢＳ溶液、５４μlの２％ＳＤＳ、２６７μlのｄｄＨ２Ｏと共に添加し、良く混合し、そして３７℃の水浴に１８～２４時間入れ；１．６２ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加え、良く混合し、そして３７℃の水浴に１８～２４時間入れ；緩衝液交換のために１０ＫＤａ限外濾過チューブを使用してＰＢＳに移し、少量でサブパッケージし、－８０℃の冷蔵庫に保存し、これはＡβ１－４２ポリマー混合物であった；そしてその検出はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷＢにより行った（ハイブリダイゼーション検出はＡβ１－４２を特異的に認識する陽性抗体０６６－Ｐ０２を用いて行った）（図１参照のこと）。
２.陽性対照抗体発現ベクターの構築
ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを、抗ヒトＡβ陽性抗体（０６６－Ｐ０１：Solanezumab, Eli lily; ０６６－Ｐ０２：Aducanumab, Biogen）のＨ鎖及びＬ鎖を構築するための発現ベクターとして別々に選択し；陽性抗体可変領域のアミノ酸配列のコドン最適化後、陽性抗体のＨ鎖及びＬ鎖の一過性トランスフェクション発現ベクターｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ、 ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ、 ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ 及びｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを得るために、制限酵素消化法を使用して、陽性抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子を、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬに別々にクローン化した。陽性抗体０６６－Ｐ０１のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（配列番号３８）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを、抗ヒトＡβ陽性抗体（０６６－Ｐ０１：Solanezumab, Eli lily; ０６６－Ｐ０２：Aducanumab, Biogen）のＨ鎖及びＬ鎖を構築するための発現ベクターとして別々に選択し；陽性抗体可変領域のアミノ酸配列のコドン最適化後、陽性抗体のＨ鎖及びＬ鎖の一過性トランスフェクション発現ベクターｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ、 ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ、 ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ 及びｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを得るために、制限酵素消化法を使用して、陽性抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子を、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬに別々にクローン化した。陽性抗体０６６－Ｐ０１のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（配列番号３８）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
陽性抗体０６６－Ｐ０１のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（配列番号３９）：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
陽性抗体０６６－Ｐ０２のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（配列番号４０）：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＦＤＧＴＫＫＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＴＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＧＡＲＲＧＰＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＦＤＧＴＫＫＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＴＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＧＡＲＲＧＰＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
陽性抗体０６６－Ｐ０２のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（配列番号４１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
３.一過性トランスフェクションによる発現
ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及び ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ;ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ 及び ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを一過性発現した。
ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及び ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０１ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ;ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ 及び ｐＧＳ００３－０６６－Ｐ０２ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを一過性発現した。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３Ｅ細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地での一過性トランスフェクションによる発現に使用した。トランスフェクションの２４時間前、３０ｍｌの２９３Ｅ細胞を１２５ｍｌ三角フラスコに０．５×１０６細胞/ ｍｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１３０ｒｐｍのシェーカーで培養した。トランスフェクション中、最初に６０μlの２９３E Ｆｅｃｔｉｎを取り、そして１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、良く混合し、そして室温で５分間インキュベートし；一方、一過性トランスフェクション発現ベクター（組換えベクター）の合計３０μgのプラスミドＤＮＡを１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに溶解した。次に、プラスミドＤＮＡ及び２９３E Ｆｅｃｔｉｎを総量２ ｍｌで完全に混合し、室温で１５分間インキュベートし、そして、次に、全ての混合物を細胞培養ウェルに添加し、混合し、そして３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内のシェーカーで１３０ｒｐｍで７日間インキュベートした。培養液を高速で遠心分離し、上澄み液を取り、そしてミクロポーラス膜で真空濾過した。
４.タンパク質の精製
製造元が提供する操作方法に従い、図２に示すように、プロテインＡカラム（タンパク質精製液体クロマトグラフィーシステム/ ＡＫＴＡ Purifier 10、GE）及びニッケルカラムを精製に使用して、精製された陽性抗体０６６－Ｐ０１及び０６６－Ｐ０２を得た。
製造元が提供する操作方法に従い、図２に示すように、プロテインＡカラム（タンパク質精製液体クロマトグラフィーシステム/ ＡＫＴＡ Purifier 10、GE）及びニッケルカラムを精製に使用して、精製された陽性抗体０６６－Ｐ０１及び０６６－Ｐ０２を得た。
実施例２：抗‐Ａβモノクローナルハイブリドーマの調製
ＢＡＬＢ /ｃマウスの免疫化
Ａβ１－４２ポリペプチド抗原及びフロイントアジュバントをボルテックスし、用量に応じて混合し、乳化が完了した後、６週齢のＢＡＬＢ /ｃ雌マウスに最初の免疫化を行った。各マウスに２００μgの抗原を腹腔内注射し、合計３グループのマウスを免疫化し、各グループには５匹のマウスが存在した。最初の免疫化の２週間後、マウスに２回目の腹腔内免疫化を行い、ここでフロイントの不完全アジュバントを使用しましたが、免疫抗原の用量は最初の免疫化と同じであった。その後、マウスを月に２回腹腔内免疫し、アジュバント及び抗原の投与量は２回目の免疫化と同じあった。
ＢＡＬＢ /ｃマウスの免疫化
Ａβ１－４２ポリペプチド抗原及びフロイントアジュバントをボルテックスし、用量に応じて混合し、乳化が完了した後、６週齢のＢＡＬＢ /ｃ雌マウスに最初の免疫化を行った。各マウスに２００μgの抗原を腹腔内注射し、合計３グループのマウスを免疫化し、各グループには５匹のマウスが存在した。最初の免疫化の２週間後、マウスに２回目の腹腔内免疫化を行い、ここでフロイントの不完全アジュバントを使用しましたが、免疫抗原の用量は最初の免疫化と同じであった。その後、マウスを月に２回腹腔内免疫し、アジュバント及び抗原の投与量は２回目の免疫化と同じあった。
最初の免疫化後、マウスの軌道から少量の血液を採取し、６週間ごとに血清力価を試験した。 間接ＥＬＩＳＡ法により血清力価が１：２０００００以上に達した後、融合に使用したマウスを追加免疫化した。
融合のための骨髄腫細胞の調製
融合に使用した骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を３週間前に蘇生し、１×８－アザグアニン及び１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で２週間培養し、そして融合の１週間前に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで培養し、 ここでＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の密度は融合の日まで７０％～８０％に維持された。
融合に使用した骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を３週間前に蘇生し、１×８－アザグアニン及び１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で２週間培養し、そして融合の１週間前に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで培養し、 ここでＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の密度は融合の日まで７０％～８０％に維持された。
細胞融合及びＨＡスクリーニング
脾臓細胞の取得及び調製：追加免疫後２匹のマウスを採取し、免疫血清の収集後に犠牲にし、７５％アルコールに２～３分間浸した。免疫化したマウスの腹部の皮膚及び腹膜を切断して脾臓を露出させた。脾臓は、はさみの先端で周囲の組織を除去し、粉砕棒で粉砕し、細胞篩を通して濾過して単一細胞懸濁液を調製することによって得られた。 遠心分離後、上澄み液を廃棄した。
脾臓細胞の取得及び調製：追加免疫後２匹のマウスを採取し、免疫血清の収集後に犠牲にし、７５％アルコールに２～３分間浸した。免疫化したマウスの腹部の皮膚及び腹膜を切断して脾臓を露出させた。脾臓は、はさみの先端で周囲の組織を除去し、粉砕棒で粉砕し、細胞篩を通して濾過して単一細胞懸濁液を調製することによって得られた。 遠心分離後、上澄み液を廃棄した。
細胞融合前の処理：培養フラスコ中のＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を回収し、１０００ｒｐｍ/５分で遠心分離した後、上清液を捨て、細胞を再懸濁し、そして生骨髄腫細胞をカウントした。脾臓細胞懸濁液を遠心分離し、上清液を廃棄し、ＡＣＫ溶解物を添加し、インキュベート及び遠心分離し、上清液を廃棄し、赤血球を除去し、ＤＭＥＤに再懸濁し、そして生存脾臓細胞をカウントした。
細胞融合：細胞を脾臓細胞：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ ＝ １：２の比率で混合し、２０００ｒｐｍ/ ５分で遠心分離し、上清液を捨て、振盪し、細胞ペレットを分散させ、400μl/ １×１０８脾臓細胞で１ｍｇ /ｍｌプロナーゼを添加し; １５秒間インキュベートした後、１０ｍｌのウシ胎児血清を添加し、反応を停止させ、エレクトロポレーション溶液（ＥＣＦ）を５０ｍｌに補充し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を廃棄し、ＥＣＦで再懸濁し、生細胞をカウントし、ｓおして脾臓細胞密度を２×１０６ / ｍｌに調整した。密度が十分に調整された細胞懸濁液を電気融合タンクに添加し、そして細胞融合のためにエレクトロポレーターを実行した。 融合後、細胞懸濁液を融合タンクから１／２ＨＡ培地に移し、３時間静置した後、細胞プレーティングを行った。
ＨＡ培地の選択：１／２ ＨＡ、１×ペニシリン-ストレプトマイシン、２０％ウシ胎児血清及び８０％ＤＭＥＭ培地を含むＡＴ選択培地を調製した。 マウスハイブリドーマ細胞を上記の1 / 2ＨＡ選択培地に再懸濁し、十分に混合した。細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに２００μl/ウェル、１×１０６個の脾臓細胞/プレートで添加し、細胞インキュベーターに入れ、３７℃で培養した。 １週間の培養後、１／２ ＨＡ培地を最初の培地更新に使用し、３７℃の細胞インキュベーターで培養を続けた。 ３日間の培養後、１／２ＨＡ培地を２回目の培地更新に使用した。
陽性細胞系のスクリーニング
融合の２週間後、細胞上清液を採取し、ＥＬＩＳＡ実験を行イ、細胞上清液のヒトＡβ１－４２への結合を検出し、ＥＬＩＳＡ結果が陽性の細胞をスクリーニングした後、２回目のＥＬＩＳＡ実験を再試験した。 再試験結果が陽性の細胞上清液をサブクローニング及び増殖培養のために採取した。
融合の２週間後、細胞上清液を採取し、ＥＬＩＳＡ実験を行イ、細胞上清液のヒトＡβ１－４２への結合を検出し、ＥＬＩＳＡ結果が陽性の細胞をスクリーニングした後、２回目のＥＬＩＳＡ実験を再試験した。 再試験結果が陽性の細胞上清液をサブクローニング及び増殖培養のために採取した。
拡張培養
ＥＬＩＳＡ試験結果が陽性の細胞系を９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移し、プレート全体に細胞が増殖した後、培養し、２５ｃｍ２の培養フラスコに移して培養した。
ＥＬＩＳＡ試験結果が陽性の細胞系を９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移し、プレート全体に細胞が増殖した後、培養し、２５ｃｍ２の培養フラスコに移して培養した。
限界希釈法によるサブクローニング
陽性細胞系を叩いてピペッティングすることにより十分に混合し、その少量をピペッティングして生細胞を数えた。 約２００個の細胞をピペットで取り、８０ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、４枚のプレートにプレーティングした。 さらに、約４００個の細胞をピペットで取り、８０ ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、４枚のプレートにプレーティングした。さらに、約１０００個の細胞をピペットで取り、２０ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、１枚のプレートにプレーティングした。 合計９枚のプレートを、それぞれ０．５細胞/ウェル、１細胞/ウェル、及び１０細胞/ウェルの３つの異なる細胞密度でプレーティングした。 ９６ウェルプレートを培養のために３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにプレーティングした。
陽性細胞系を叩いてピペッティングすることにより十分に混合し、その少量をピペッティングして生細胞を数えた。 約２００個の細胞をピペットで取り、８０ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、４枚のプレートにプレーティングした。 さらに、約４００個の細胞をピペットで取り、８０ ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、４枚のプレートにプレーティングした。さらに、約１０００個の細胞をピペットで取り、２０ｍｌの完全培地に添加し、良く混合し、１枚のプレートにプレーティングした。 合計９枚のプレートを、それぞれ０．５細胞/ウェル、１細胞/ウェル、及び１０細胞/ウェルの３つの異なる細胞密度でプレーティングした。 ９６ウェルプレートを培養のために３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにプレーティングした。
クローンの検出及び拡張培養
モノクローナル細胞ウェルの上清液をＥＬＩＳＡに使用して、クローン化された抗体のＡβ１－４２の全長、Ａβ１－４２のＮ末端、及び中間ペプチドフラグメントへの結合をそれぞれ検出した。
モノクローナル細胞ウェルの上清液をＥＬＩＳＡに使用して、クローン化された抗体のＡβ１－４２の全長、Ａβ１－４２のＮ末端、及び中間ペプチドフラグメントへの結合をそれぞれ検出した。
コーティング：ストレプトアビジンをＣＢＳ（ｐＨ ９．６）で１μｇ/ ｍｌに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり５０μlを添加し、２～８℃で一晩インキュベートした。
ブロッキング：プレートをＰＢＳＴで1回洗浄した後、１％ＢＳＡによりり、ウェル当たり２００μlでブロックし、室温で1時間インキュベートした。
抗原：プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ビオチン化Ａβ１－４２、Ａβ１－１６、及びＡβ１４－２９ポリペプチドをそれぞれ採取し、ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）で１μg/ ｍｌに希釈し、酵素標識された９６に、ウェル当たり５０μlで添加し、そして室温で１時間インキュベートした。
一次抗体の添加：プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、マウス候補抗体を５０μl/ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。
二次抗体の添加：プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１：５０００希釈液中の抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ抗体を５０μl/ウェルで添加し、室温で1時間インキュベートした。
発色：プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液をウェル当たり５０μl加え、そして暗所で室温で１０分間発色させた。
停止：停止溶液をウェル当たり５０μlで直接添加し、反応を停止させた。
検出：反応を停止した後、マイクロタイタープレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、ＯＤ値を４５０ ｎｍで測定し、元のデータを保存した。
データ処理：生データは、データ処理のためにソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ６．２．１に入力された。 特定のデータについては、表１を参照のこと。結果は、１２のマウス候補抗体が３つの異なる抗原結合エピトープ、すなわちＮ末端（Ａβ１－１６）、Ｃ末端（Ａβ３０－４２）、及び中間（Ａβ1４－２９）ペプチドフラグメントを含むことを示し、ここで、０６６－５．４．１の抗原結合エピトープはＡβ１－４２中鎖ペプチドフラグメントにグループ化された。
ＥＬＩＳＡの結果が陽性の細胞系を９６ウェルプレートから24ウェルプレートに移して培養し、細胞をプレート上で増殖させ、２５ｃｍ２の培養フラスコに移して培養した。
サブタイプの同定
ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及びＩｇＧＡを、５０ｎｇ /１００μl/ウェルで４℃で一晩、コーティングし、室温でＢＳＡでブロックし、試験される細胞上清液を添加し、室温で２時間インキュベートし、酵素標識二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ、κ、λを添加し、発色、停止、４５０ ｎｍでの読み取りの後、試験された細胞系はサブタイプＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ２ａ、κ又はＩｇＧ２ｂ、κであると判断された。結果を表２に示し、ここで抗体０６６－５．４．１の場合、そのＨ鎖定常領域はマウスＩｇＧ１であり、そのＬ鎖定常領域はマウスκ鎖の定常領域であった。
ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及びＩｇＧＡを、５０ｎｇ /１００μl/ウェルで４℃で一晩、コーティングし、室温でＢＳＡでブロックし、試験される細胞上清液を添加し、室温で２時間インキュベートし、酵素標識二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ、κ、λを添加し、発色、停止、４５０ ｎｍでの読み取りの後、試験された細胞系はサブタイプＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ２ａ、κ又はＩｇＧ２ｂ、κであると判断された。結果を表２に示し、ここで抗体０６６－５．４．１の場合、そのＨ鎖定常領域はマウスＩｇＧ１であり、そのＬ鎖定常領域はマウスκ鎖の定常領域であった。
細胞の凍結保存
凍結保存液の調製：９０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯ。
培養フラスコ内の細胞を再懸濁し； 細胞数を数えた後、細胞を１０００ｒｐｍ /分で５分間、遠心分離し、上清液を廃棄し、そして１０％ＤＭＳＯを含むウシ胎児血清でピペッティングすることにより懸濁液を叩き、－８０℃の凍結保存ボックスに５×１０６細胞/チューブで一晩保存し、そして翌日、液体窒素に移した。
凍結保存液の調製：９０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯ。
培養フラスコ内の細胞を再懸濁し； 細胞数を数えた後、細胞を１０００ｒｐｍ /分で５分間、遠心分離し、上清液を廃棄し、そして１０％ＤＭＳＯを含むウシ胎児血清でピペッティングすることにより懸濁液を叩き、－８０℃の凍結保存ボックスに５×１０６細胞/チューブで一晩保存し、そして翌日、液体窒素に移した。
モノクローナルハイブリドーマ遺伝子の保存
陽性のモノクローナル細胞系を収集し、ＴＲＩｚｏｌを添加し、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを抽出し、これをｃＤＮＡに逆転写し、そして－８０℃で保存した。
陽性のモノクローナル細胞系を収集し、ＴＲＩｚｏｌを添加し、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを抽出し、これをｃＤＮＡに逆転写し、そして－８０℃で保存した。
インビトロ培養法による抗体の調製
調製されたハイブリドーマ細胞系を以下の方法で蘇生させた。 ハイブリドーマ細胞系を、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で蘇生しそして、バイアルで培養し；細胞コンフルエンスが約９０％になった後、継代増殖を行い、細胞培養上清液の合計が約２００ｍｌになるまで増殖させた後、上清液を回収し、遠心分離し、そして濾過し、精製した。
調製されたハイブリドーマ細胞系を以下の方法で蘇生させた。 ハイブリドーマ細胞系を、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で蘇生しそして、バイアルで培養し；細胞コンフルエンスが約９０％になった後、継代増殖を行い、細胞培養上清液の合計が約２００ｍｌになるまで増殖させた後、上清液を回収し、遠心分離し、そして濾過し、精製した。
実施例３：Ａβ重合の阻害における抗‐Ａβモノクローナル抗体の検出
８．２％ＤＭＳＯ/ ＤＰＢＳ溶液（ＤＭＳＯ：sigma; ＤＰＢＳ：Hyclone）を使用して、Ａβ乾燥粉末を１ｍｇ/ｍｌに溶解し、Ａβ溶液をＤＰＢＳで３３μｇ/ ｍｌに希釈し、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２を４５０μg/ ml（ＩＣ1００）に希釈し、そしてＴｈＴ（sigma）を超純水で２０μＭに希釈した。５０ μlの抗体希釈液を取り、９６ウェルブラックプレート（corning）に添加し、次に５０ μlのＡβ希釈液を添加し、最後に１００ μlのＴｈＴを添加し、暗所で室温で２４時間インキュベートし、そして多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ / Ｅｍ = ４４０／４８５）を検出した。横軸は異なるサンプルグループを表し、そして縦軸は相対的な蛍光強度を表す。結果は図３に示される。図３（Ａ）においては、ＩｇＧグループの相対蛍光強度が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループの相対蛍光強度は０．５９であり；図３（Ｂ）においては、ＰＢＳグループの相対蛍光強度が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２２．１グループの相対蛍光強度は０．４４、抗－Ａβグループの相対蛍光強度は０．４４であり、そして モノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループの相対蛍光強度は０．４６であり；抗－Ａβモノクローナル抗体、例えば０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、及び０６６－５．４．１はすべてＡβ重合を阻害する可能性があることがわかった。
８．２％ＤＭＳＯ/ ＤＰＢＳ溶液（ＤＭＳＯ：sigma; ＤＰＢＳ：Hyclone）を使用して、Ａβ乾燥粉末を１ｍｇ/ｍｌに溶解し、Ａβ溶液をＤＰＢＳで３３μｇ/ ｍｌに希釈し、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２を４５０μg/ ml（ＩＣ1００）に希釈し、そしてＴｈＴ（sigma）を超純水で２０μＭに希釈した。５０ μlの抗体希釈液を取り、９６ウェルブラックプレート（corning）に添加し、次に５０ μlのＡβ希釈液を添加し、最後に１００ μlのＴｈＴを添加し、暗所で室温で２４時間インキュベートし、そして多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ / Ｅｍ = ４４０／４８５）を検出した。横軸は異なるサンプルグループを表し、そして縦軸は相対的な蛍光強度を表す。結果は図３に示される。図３（Ａ）においては、ＩｇＧグループの相対蛍光強度が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループの相対蛍光強度は０．５９であり；図３（Ｂ）においては、ＰＢＳグループの相対蛍光強度が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２２．１グループの相対蛍光強度は０．４４、抗－Ａβグループの相対蛍光強度は０．４４であり、そして モノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループの相対蛍光強度は０．４６であり；抗－Ａβモノクローナル抗体、例えば０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、及び０６６－５．４．１はすべてＡβ重合を阻害する可能性があることがわかった。
実施例４：Ａβのマクロファージ食作用の促進における抗－Ａβモノクローナル抗体の活性の検出
付着培養の３日後に良好な状態にあったマウス初代腹腔マクロファージを０．２５％トリプシンで消化し、そしてカウントした。細胞密度を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Gibco）で２×１０５ / ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに１００μl/ウェルで接種し；抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１７．２８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２１．１３、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－ ６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２を１％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で２０ μg / ｍｌに希釈し、そして作業溶液として使用し、Ａβを２４０μg / mlに希釈し、ＴｈＴ（sigma）を超純水で２０ μＭに希釈した。培養プレート内の培地を廃棄し、最初に５０ μｌの抗体希釈液を添加し、次に５０ μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し；インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間行い；５０ μｌの上清液を取り、９６ウェルブラックプレートに添加し、次に５０ μｌのＴｈＴを添加し、多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ / Ｅｍ ＝ ４４０／４８５）を検出した。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸は蛍光強度を表す。 結果を図４に示す。このうち、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループの蛍光強度は６５０，０００であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２グループの蛍光強度は６００，０００であった。 抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１、０６６－７．１７．２は、マクロファージによるＡβの食作用を促進する活性を持っていることがわかった。
付着培養の３日後に良好な状態にあったマウス初代腹腔マクロファージを０．２５％トリプシンで消化し、そしてカウントした。細胞密度を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Gibco）で２×１０５ / ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに１００μl/ウェルで接種し；抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１７．２８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２１．１３、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－ ６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２を１％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で２０ μg / ｍｌに希釈し、そして作業溶液として使用し、Ａβを２４０μg / mlに希釈し、ＴｈＴ（sigma）を超純水で２０ μＭに希釈した。培養プレート内の培地を廃棄し、最初に５０ μｌの抗体希釈液を添加し、次に５０ μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し；インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間行い；５０ μｌの上清液を取り、９６ウェルブラックプレートに添加し、次に５０ μｌのＴｈＴを添加し、多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ / Ｅｍ ＝ ４４０／４８５）を検出した。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸は蛍光強度を表す。 結果を図４に示す。このうち、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループの蛍光強度は６５０，０００であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２グループの蛍光強度は６００，０００であった。 抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１、０６６－７．１７．２は、マクロファージによるＡβの食作用を促進する活性を持っていることがわかった。
実施例５：細胞毒性に対する抗－Ａβモノクローナル抗体の保護活性の検出
対数増殖期ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を、０．２５％トリプシンで消化し、カウントし、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）により３×１０４ / ｍｌの細胞密度に調整し、９６ウェル細胞培養プレートを１００ μｌ/ウェルで接種し；抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１７．２８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２１．１３、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－ ６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２を、１％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地で２００μｇ/ｍｌ（ＩＣ１００）に希釈し、 そして作業溶液として使用し、Ａβを２４０μｇ/ｍｌに希釈した。培養プレートの培地を廃棄し、５０ μｌの抗体希釈液を添加し、次に５０ μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し； インキュベーションを３７℃C、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間行い；５０ μｌの上清液を取り、新しい９６ウェルプレートに添加し、次に５０ μｌのＬＤＨアッセイ緩衝液を添加し、暗所で室温で３０分間反応させ、５０ μｌの停止溶液を加え、吸光度値を多機能マイクロプレートリーダーで測定した。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸はＬＤＨ放出の相対値を表わす。 結果を図５に示す。なかでも、ビークルグループのＬＤＨ放出の相対値が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループの相対蛍光強度は１．２であり、抗－Ａβモノクローナル抗体のＬＤＨ放出の相対値は１．２であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３７であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．１．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４３であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．１．３グループＬＤＨ放出の相対値は１．３５であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．２．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３４であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．７．２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４４であり、陽性対照抗体０６６－Ｐ０２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．２６（Ａ）及び１．５３（Ｂ）であった。抗体０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２はすべて 細胞毒性に対する保護効果を有し、そして保護効果は０６６－Ｐ０２のそれと同等でした。
対数増殖期ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を、０．２５％トリプシンで消化し、カウントし、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）により３×１０４ / ｍｌの細胞密度に調整し、９６ウェル細胞培養プレートを１００ μｌ/ウェルで接種し；抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．６．８、０６６－４．１７．２８、０６６－４．１８．２、０６６－４．２１．１３、０６６－４．２２．１、０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－ ６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２を、１％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地で２００μｇ/ｍｌ（ＩＣ１００）に希釈し、 そして作業溶液として使用し、Ａβを２４０μｇ/ｍｌに希釈した。培養プレートの培地を廃棄し、５０ μｌの抗体希釈液を添加し、次に５０ μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し； インキュベーションを３７℃C、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間行い；５０ μｌの上清液を取り、新しい９６ウェルプレートに添加し、次に５０ μｌのＬＤＨアッセイ緩衝液を添加し、暗所で室温で３０分間反応させ、５０ μｌの停止溶液を加え、吸光度値を多機能マイクロプレートリーダーで測定した。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸はＬＤＨ放出の相対値を表わす。 結果を図５に示す。なかでも、ビークルグループのＬＤＨ放出の相対値が１．０の場合、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループの相対蛍光強度は１．２であり、抗－Ａβモノクローナル抗体のＬＤＨ放出の相対値は１．２であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３７であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．１．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４３であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．１．３グループＬＤＨ放出の相対値は１．３５であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．２．１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３４であり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－６．７．２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４４であり、陽性対照抗体０６６－Ｐ０２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．２６（Ａ）及び１．５３（Ｂ）であった。抗体０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－６．１．１、０６６－６．１．３、０６６－６．２．１、０６６－６．７．２、０６６－７．１７．２はすべて 細胞毒性に対する保護効果を有し、そして保護効果は０６６－Ｐ０２のそれと同等でした。
実施例６：モリス水迷路実験
1. 実験方法及び手順：
実験動物３×ＴｇマウスはBeijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.から購入し、そしてthe Experimental Animal Center of Medical College of Jilin Universityによって飼育された。グループ化の状況は次の通りであった：注射する異なる薬剤に応じて、抗体０６６－４．２６．１４治療グループ、抗体０６６－５．４．１治療グループ、抗体０６６－７．１７．２治療グループ、３×Ｔｇブランク対照グループ、野生型ＰＢＳ注射グループ、陽性抗体０６６－Ｐ０２対照グループに分けられ、各グループには８匹の動物から成る。
1. 実験方法及び手順：
実験動物３×ＴｇマウスはBeijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.から購入し、そしてthe Experimental Animal Center of Medical College of Jilin Universityによって飼育された。グループ化の状況は次の通りであった：注射する異なる薬剤に応じて、抗体０６６－４．２６．１４治療グループ、抗体０６６－５．４．１治療グループ、抗体０６６－７．１７．２治療グループ、３×Ｔｇブランク対照グループ、野生型ＰＢＳ注射グループ、陽性抗体０６６－Ｐ０２対照グループに分けられ、各グループには８匹の動物から成る。
文献の方法（鍋島、２００７）を参照することにより、生後６ヶ月の雄３×Ｔｇマウス（５００ｇ /マウス）にモノクローナル抗体０６６－４．２６．１４、０６６－５．４．１、０６６－７．１７を腹腔内注射し、週に１回、１０週間連続注射し、そして注射後８週間でモリス水迷路試験を実施した。
モリス水迷路試験手順：
（１）特別に設計された水迷路は、主に円筒形のプール及び可動式のプラットフォームから構成された。 プールの高さは４５ｃｍ、直径は１００ｃｍ、プラットフォームの直径は９ｃｍ、高さは１５～４０ｃｍに調整可能で、そしてデジタルカメラをプールの上に取り付け、そしてコンピューターに接続した。
（１）特別に設計された水迷路は、主に円筒形のプール及び可動式のプラットフォームから構成された。 プールの高さは４５ｃｍ、直径は１００ｃｍ、プラットフォームの直径は９ｃｍ、高さは１５～４０ｃｍに調整可能で、そしてデジタルカメラをプールの上に取り付け、そしてコンピューターに接続した。
（２）事前にプールにきれいな水を入れておいた。 プールの壁と底はすべて黒でした。 マウスが水面下のプラットフォームを見るのを防ぐために、餌用の白い色素がプールの水に追加されました。 水深は３０ｃｍ、水面はプラットフォームより１ｃｍ高かった。
（３）水温は１９±１℃に制御され、プラットフォームが配置されている象限を除いて、プール上の他の象限には水が入るポイントがマークされた。 各象限に対応する側壁には、異なる形状のマーカーが接着された。 実験中、プラットフォームの位置は変更されなかった。
（４）各試験は防音室で実施され、プール、光源、ケージなどの実験対象物の位置は変更されなかった。
（５）8週目に、投与後３日目にトレーニングを開始した。 実験は１日４回、５日間（水迷路隠しプラットフォーム試験）続いた。 マウスが水に入ったとき、プールの壁に面し、そして穏やかに水に入った。プラットフォームが配置された象限以外の領域で、１日５回のトレーニングセッション（実験）がランダムに実行され、実験の最初の２日間の最初の２回のトレーニングセッションが演習として実行された。マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけた場合、１５秒間プラットフォーム上に留まることが許可された。 マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけることができなかった場合（潜伏期間は６０秒として記録された）、実験者はそれをプラットフォームに導き、そして１５秒間プラットフォームに留まる。 マウスの４つの潜伏期間の平均をマウスの毎日のパフォーマンスとして採用した。
２.実験結果（図6を参照のこと）：
隠しプラットフォーム試験の２日目に、水中に隠されたプラットフォームを見つける時間（潜伏期間を逃れる）は、統計的に有意であった３×Ｔｇブランクグループと比較して、すべての抗体投与グループで有意に短縮された。３日目に、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２グループは逃避潜伏期間に１８秒かかり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループは逃避潜伏期間に２７秒かかり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループは逃避潜伏期間に３０秒かかり、そしてブランク対照グループは逃避潜伏期間に３９秒かかり、ここで ０６６－７．１７．２及び０６６－４．２６．１４投与グループが３×Ｔｇブランクグループと比較して有意に短い逃避潜伏期間を有し、そして統計的に有意であった。抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２及び０６６－４．２６．１４は、アルツハイマー型認知症モデルマウスの認知学習及び記憶能力の改善に一定の効果があることがわかった。一方、０６６．５．４．１は、アルツハイマー型認知症モデルマウス認知学習及び記憶能力の改善に顕著な効果を示さなかった。
隠しプラットフォーム試験の２日目に、水中に隠されたプラットフォームを見つける時間（潜伏期間を逃れる）は、統計的に有意であった３×Ｔｇブランクグループと比較して、すべての抗体投与グループで有意に短縮された。３日目に、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２グループは逃避潜伏期間に１８秒かかり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－４．２６．１４グループは逃避潜伏期間に２７秒かかり、抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－５．４．１グループは逃避潜伏期間に３０秒かかり、そしてブランク対照グループは逃避潜伏期間に３９秒かかり、ここで ０６６－７．１７．２及び０６６－４．２６．１４投与グループが３×Ｔｇブランクグループと比較して有意に短い逃避潜伏期間を有し、そして統計的に有意であった。抗－Ａβモノクローナル抗体０６６－７．１７．２及び０６６－４．２６．１４は、アルツハイマー型認知症モデルマウスの認知学習及び記憶能力の改善に一定の効果があることがわかった。一方、０６６．５．４．１は、アルツハイマー型認知症モデルマウス認知学習及び記憶能力の改善に顕著な効果を示さなかった。
実施例７：モノクローナル抗体遺伝子配列決定及びキメラ抗体調製
１. モノクローナル抗体遺伝子配列決定
免疫化、融合、モノクローナル化の後、結合エピトープ、Ａβ重合阻害の検出、Ａβに対するマクロファージの食作用促進の活性の検出、細胞毒性に対する保護活性の検出、モリス水迷路などの実験結果に基づいて、０６６－５．４．１モノクローナル抗体細胞系を、ｃＤＮＡに逆転写され全ＲＮＡ抽出にために選択し、そして次に、そのｃＤＮＡを、抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして使用した。
１. モノクローナル抗体遺伝子配列決定
免疫化、融合、モノクローナル化の後、結合エピトープ、Ａβ重合阻害の検出、Ａβに対するマクロファージの食作用促進の活性の検出、細胞毒性に対する保護活性の検出、モリス水迷路などの実験結果に基づいて、０６６－５．４．１モノクローナル抗体細胞系を、ｃＤＮＡに逆転写され全ＲＮＡ抽出にために選択し、そして次に、そのｃＤＮＡを、抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして使用した。
InvitrogenのＴＲＩｚｏｌ試薬キット（１５５９６－０２６）を使用し、その指示に従って０６６－５．４．１モノクローナル抗体細胞系から全ＲＮＡを抽出した。 結果を図７に示す。
次に、Takaraの５‘ＲＡＣＥ ＦＵＬＬキット（Ｄ３１５）を使用し、キット内のランダムプライマーを使用して全ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに逆転写し、そして定常領域プライマーｍＩｇＧＲ（５'－ ＣＴＣＡＧＧＧＡＡＲＴＡＲＣＣＹＴＴＧＡＣ－３ '、配列番号４２）及びキット内のＲＡＣＥプライマーを使用してＨ鎖のＰＣＲ増幅を行ない、そしてＬ鎖のＰＣＲ増幅を、定常領域プライマーｍＩｇＫＲ（5'-ＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣ－３ '、配列番号４３）及びキット内のRACEプライマーを使用して実施した。 結果を図８に示す。
ＰＣＲフラグメントをアガロースゲル回収キットで回収し、ＴＡクローニングを行った後、コロニーＰＣＲ用に単一クローンをピックアップした。 コロニーＰＣＲプライマーは、Ｍ１３Ｆ（５'－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ－３ '、配列番号４４）及びＭ１３Ｒ（５'－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ－３'、配列番号４５）であった。同定時に正しい菌株から選択されたサンプルの一部を、配列決定のためにInvitrogenに送った。最終的に、Ｈ鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号４６であり、Ｌ鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号４７であり、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４８であり、そしてＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４９であることが決定された。表３を参照のこと。
０６６－５．４．１抗体のＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列は以下の通りであった（配列番号４６）：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
０６６－５．４．１抗体のＬ鎖可変領域のヌクレオチド配列は以下の通りであった（配列番号４7）：
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ
０６６－５．４．１抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りであった（配列番号４８）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＡＬＶＫＰＧＡＳＶＱＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＩＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＷＤＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＡＬＶＫＰＧＡＳＶＱＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＩＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＷＤＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
０６６－５．４．１抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りであった（配列番号４９）：
ＤＩＶＭＴＱＡＶＦＳＮＰＶＴＬＧＴＳＡＳＩＳＣＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＭＬＥＲＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＤＩＶＭＴＱＡＶＦＳＮＰＶＴＬＧＴＳＡＳＩＳＣＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＭＬＥＲＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
２. ０６６－５．４．１マウス-ヒトキメラ抗体発現ベクターの構築
抗－ヒトＡβマウス-ヒトキメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をそれぞれ構築するための発現ベクターとして、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを選択した。合成された０６６－５．４．１マウス抗体配列をテンプレートとして使用し、ＶＨ及びＶＬマウス抗体遺伝子をＰＣＲ増幅し、そして制限酵素消化及び連結法を使用してｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬにクローニングし、マウス-ヒトキメラ抗体の一過性トランスフェクション発現ベクターｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを取得した。
抗－ヒトＡβマウス-ヒトキメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をそれぞれ構築するための発現ベクターとして、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを選択した。合成された０６６－５．４．１マウス抗体配列をテンプレートとして使用し、ＶＨ及びＶＬマウス抗体遺伝子をＰＣＲ増幅し、そして制限酵素消化及び連結法を使用してｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬにクローニングし、マウス-ヒトキメラ抗体の一過性トランスフェクション発現ベクターｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを取得した。
０６６－５．４．１マウス－ヒトキメラ抗体のＨ鎖のアミノ酸配列は以下の通りであった（配列番号５０）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＡＬＶＫＰＧＡＳＶＱＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＩＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＷＤＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＡＬＶＫＰＧＡＳＶＱＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＩＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＱＫＶＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＷＤＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
０６６－５．４．１マウス－ヒトキメラ抗体のＬ鎖のアミノ酸配列は以下の通りであった（配列番号５１）：
ＤＩＶＭＴＱＡＶＦＳＮＰＶＴＬＧＴＳＡＳＩＳＣＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＭＬＥＲＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＡＶＦＳＮＰＶＴＬＧＴＳＡＳＩＳＣＳＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＭＬＥＲＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
３. 一過性トランスフェクションによる発現
ｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを一過性発現させた。
ｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＨ－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－０６６－５．４．１－ｃｈＡｂＶＬ－ｈＩｇＫＣＬを一過性発現させた。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３Ｅ細胞を使用し、Freestyle培地で一過性のトランスフェクション発現を行なった。トランスフェクションの２４時間前に、３０mlの２９３Ｅ細胞を１２５ｍｌ三角フラスコに０．５×１０６細胞/ ｍｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１３０ｒｐｍのシェーカーで培養した。トランスフェクション中、最初に６０μlの２９３Ｅ Ｆｅｃｔｉｎを取り、１ ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加え、良く混合し、室温で５分間インキュベートし； その間、３０μgの量の組換えベクターの全プラスミドＤＮＡを１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに溶解した。次に、プラスミドＤＮＡ及び２９３Ｅ Fectinを総量２ ｍｌで完全に混合し、室温で１５分間インキュベートした後、混合物全体を細胞培養ウェルに加え、混合し、そして３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でシェーカー上で１３０ｒｐｍで７日間インキュベートした。培養液を高速で遠心分離し、上澄み液を微多孔膜での真空濾過のために採取した。
４. タンパク質の精製
製造業者が提供する操作方法に従って、図９に示すように、プロテインＡカラム（プロテイン精製液体クロマトグラフィーシステム/ＡＫＴＡ精製器１０、ＧＥ）及びニッケルカラムを精製に使用して、精製されたマウス－ヒトキメラ抗体０６６－５．４．１－ｃｈＡｂを得た。
製造業者が提供する操作方法に従って、図９に示すように、プロテインＡカラム（プロテイン精製液体クロマトグラフィーシステム/ＡＫＴＡ精製器１０、ＧＥ）及びニッケルカラムを精製に使用して、精製されたマウス－ヒトキメラ抗体０６６－５．４．１－ｃｈＡｂを得た。
実施例８：抗体のヒト化
マウス抗体０６６－５．４．１をヒト化のために選択した。 ヒト化プロセスは、主にヒトテンプレート検索及び再形成で構成された。
マウス抗体０６６－５．４．１をヒト化のために選択した。 ヒト化プロセスは、主にヒトテンプレート検索及び再形成で構成された。
ヒト化の主な目標は、可変領域のＦＲ配列であった。マウス抗体０６６－５．４．１ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をテンプレートとして使用し、ＮＣＢＩ ウエブサイトで配列アラインメントを実行し、そしてヒト化配列を設計するために、抗体ＦＲ領域のヒト化のための参照テンプレートとして使用される５つのヒト化参照配列を見出した。
ＣＤＲ領域の特定の配列を表４に示し、そして再形成後のヒト化抗体の配列を表５に示す。
０６６－５．４．１Ｈ１ (配列番号２５)
caggtgcagctggtgcagtcaggagcagaagtgaagaagcccggagccagcgtgaaagtgtcttgcaaggccagcggctacaccttcaccaactacaacatccattgggtccggcaggctccaggacagggactggagtggatgggagcaatctacccaggcaacggcgacaccacctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgaccagagacaccagcaccagcaccgtgtacatggagctgagcagcctgaggagcgaggatacagccgtgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc
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＞０６６－５．４．１Ｈ２ (配列番号２６)
cagatgcagctggtgcagagcggaccagaagtgaagaagcccggaaccagcgtgaaggtgtcttgcaaggccagcggctacaccttcaccaactacaacatccattgggtccggcaggccagaggacagagactggagtggatcggagccatctacccaggcaacggcgacaccacctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgaccagagacatgagcaccagcaccgcctacatggagctgtctagcctgaggagcgaggacacagccgtgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc
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＞０６６－５．４．１Ｈ３ (配列番号２７)
gaagtgcagctggtgcagagcggagcagaagtgaagaagcccggcgagtccctgaagatctcttgcaagggcagcggctacaccttcaccaactacaacatccattgggtccggcagatgccaggcaaaggactggagtggatgggagcaatctacccaggcaacggcgacaccacctacaaccagaaggtcaagggcaaggtcaccctgagcgccgataagagcatcagcaccgcctacctgcagtggtctagcctgaaggccagcgataccgccatgtactattgcgccaggggcgattgggattggttcgcctattgggggcagggaacactggtgacagtgtccagc
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＞０６６－５．４．１Ｈ４ 配列番号２８)
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＞０６６－５．４．１Ｈ５ (配列番号２９)
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＞０６６－５．４．１Ｌ１ (配列番号３０)
gacatcgtgatgacccagtctcccctgagcctgcctgtgacactgggacagccagccagcatctcctgcagctcctctaagtccctgctgcactctaacggcatcacctacctgtattggtaccagcagaggccaggacagtctccaaggctgctgatctatagaatgagcaatctggcctccggagtgcctgaccggttctctggcagcggctccggaaccgacttcaccctgaagatctccagggtggaggccgaggatgtgggcgtgtactattgtgcccagatgctggagaggccactgaccttcggccagggaacaaggctggagatcaag
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＞０６６－５．４．１Ｌ２ (配列番号３１)
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＞０６６－５．４．１Ｌ３ (配列番号３２)
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＞０６６－５．４．１Ｌ４ (配列番号３３)
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＞０６６－５．４．１Ｌ５ (配列番号３４)
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実施例９：抗－Ａβヒト化完全長抗体の調製
１. 完全長抗体の一過性トランスフェクションのための発現ベクターの調製
抗－Ａβヒト化全長抗体のＨ鎖及びＬ鎖をそれぞれ構築するための発現ベクターとして、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを選択した。コドン最適化を、０６６－５．４．１ヒト化抗体配列に対して実行した。 ＰＣＲ増幅の後、Ｈ鎖をＨｉｎｄIII及びＮｈｅＩにより消化し、そしてＬ鎖をＨｉｎｄIII及びＮarＩにより消化し、そして表６に示されるように、５つのＶＨ及び５つのＶＬ抗体遺伝子をそれぞれｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬにクローン化した。抗体遺伝子の正しい挿入を確認するために配列決定した後、組換え発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ 'に形質転換し、そして単一のコロニーを選び、そして１００μg/ mlのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、そして37℃で１６時間。振盪しながら培養した。Zymo Researchのエンドトキシンフリー大規模抽出キットを使用してプラスミドを抽出し、そして最後にプラスミドを１ ｍｌの超純水に溶解し、そしてプラスミド濃度及びＯＤ２６０ /２８０を分光光度計で測定しました。 ＯＤ２６０ /２８０が１．８～１．９のプラスミドＤＮＡは比較的高純度であった。
１. 完全長抗体の一過性トランスフェクションのための発現ベクターの調製
抗－Ａβヒト化全長抗体のＨ鎖及びＬ鎖をそれぞれ構築するための発現ベクターとして、ｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬを選択した。コドン最適化を、０６６－５．４．１ヒト化抗体配列に対して実行した。 ＰＣＲ増幅の後、Ｈ鎖をＨｉｎｄIII及びＮｈｅＩにより消化し、そしてＬ鎖をＨｉｎｄIII及びＮarＩにより消化し、そして表６に示されるように、５つのＶＨ及び５つのＶＬ抗体遺伝子をそれぞれｐＧＳ００３－ｈＩｇＧ１ＣＨ及びｐＧＳ００３－ｈＩｇＫＣＬにクローン化した。抗体遺伝子の正しい挿入を確認するために配列決定した後、組換え発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ 'に形質転換し、そして単一のコロニーを選び、そして１００μg/ mlのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、そして37℃で１６時間。振盪しながら培養した。Zymo Researchのエンドトキシンフリー大規模抽出キットを使用してプラスミドを抽出し、そして最後にプラスミドを１ ｍｌの超純水に溶解し、そしてプラスミド濃度及びＯＤ２６０ /２８０を分光光度計で測定しました。 ＯＤ２６０ /２８０が１．８～１．９のプラスミドＤＮＡは比較的高純度であった。
２. 哺乳類細胞２９３Ｅにおけるトランスフェクション、発現及び検出
上記の０６６－５．４．１の５本のＨ鎖発現ベクター及び５本のＬ鎖発現ベクターをペアで組み合わせ（合計２５の組み合わせ）、そして次に、２ ｍｌの ２９３Ｅシステムでの一過性トランスフェクション発現を評価し、２５の組み合わせの発現レベル及びＥＬＩＳＡ値を評価した。 結果を表７に示す。それらの中で、それぞれ、０６６－５．４．１－Ｈ１Ｌ４、０６６－５．４．１－Ｈ２Ｌ５、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ１、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ２、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ３、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ４である６つの完全長抗体を好ましくは、選択した。
上記の０６６－５．４．１の５本のＨ鎖発現ベクター及び５本のＬ鎖発現ベクターをペアで組み合わせ（合計２５の組み合わせ）、そして次に、２ ｍｌの ２９３Ｅシステムでの一過性トランスフェクション発現を評価し、２５の組み合わせの発現レベル及びＥＬＩＳＡ値を評価した。 結果を表７に示す。それらの中で、それぞれ、０６６－５．４．１－Ｈ１Ｌ４、０６６－５．４．１－Ｈ２Ｌ５、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ１、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ２、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ３、０６６－５．４．１－Ｈ５Ｌ４である６つの完全長抗体を好ましくは、選択した。
２９３Ｅを、Freestyle培地での６つの候補抗体の一過性トランスフェクション及び発現に使用した。トランスフェクションの２４時間前に、３００ｍｌの２９３Ｅ細胞を１Ｌ細胞培養フラスコに０．５×１０６細胞/ ｍｌで接種し、１２０ｒｐｍのシェーカーを備えた３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。トランスフェクション中、最初に３００μlの２９３フェクチンを取り、５．７ ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、良く混合し、室温で２分間インキュベートし； 一方、３００μgのＨ鎖及びＬ鎖の発現プラスミドは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭにより、それぞれ６ｍｌに希釈された。上記で希釈されたトランスフェクション試薬及びプラスミドを完全に混合し、室温で１５分間インキュベートした後、混合物全体を細胞に添加し、十分に混合し、そして１２０ｒｐｍシェーカーを備えた３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７日間インキュベートした。
３. 抗体の精製及び検出
細胞培養液を２０００ｇで２０分間遠心分離し、上清液を回収し、そして上清中の抗体発現レベルをOctetで検出した。 表８を参照のこと。
細胞培養液を２０００ｇで２０分間遠心分離し、上清液を回収し、そして上清中の抗体発現レベルをOctetで検出した。 表８を参照のこと。
上清液を０．２２μmフィルターで濾過した後、MabSelect SuRe親和性クロマトグラフィーカラム（ＧＥ）に通し、２０ ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ塩基でｐＨを中性に調整し、そしてその溶液を １０×ＰＢＳを添加することにより、等張溶液に調整した。精製されたタンパク質を、４～２０％勾配ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd.)によって検出した。 結果を下の図10に示す。
実施例１０：ヒト化候補抗体のＥＣ５０値の決定
コーティング：ヒトＡβ４２モノマーをＣＢＳ（ｐＨ ９．４）で１μg/ ｍｌに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり５０μlで添加し、２～８℃で一晩インキュベートした。
コーティング：ヒトＡβ４２モノマーをＣＢＳ（ｐＨ ９．４）で１μg/ ｍｌに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり５０μlで添加し、２～８℃で一晩インキュベートした。
ブロッキング：プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、３％ＢＳＡを使用してブロッキングを行い、ウェル当たり２００μlを使用し、２５℃で１時間インキュベートした。
サンプル処理：ヒト化候補抗体及びキメラ抗体をそれぞれ採取し、開始濃度として10μg/ ml（２０～２－１１）、５０μl/ウェルを使用して２倍勾配希釈を行い、２５℃で 1時間インキュベートした。
抗体の添加：プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、１：５０００希釈液中の抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ抗体を５０μl/ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートしました。
発色：プレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液をウェル当たり５０μl添加し、室温で３分間暗所で発色させた。
停止：停止溶液を、ウェル当たり５０μl、直接加えて反応を停止させた。
検出：反応を停止した後、マイクロタイタープレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れて４５０ ｎｍでのＯＤ値を測定し、元のデータを保存しました。
データ処理：生データを、データ処理のためにソフトウェアSoftMax Pro6.2.1に入力した。 特定のデータについては、表９を参照のこと。 結果は、ヒトＡβに対する６つのヒト化候補抗体の結合能力がキメラ抗体のそれと同等であることを示した。
実施例１１：ヒト化候補抗体のＫＤ値の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ－Ｔ２００検出を実行し、ＰｒｏｔｅｉｎＡチップを使用して候補抗体又は陽性抗体を捕獲し、異なる濃度のヒトＡβ抗原を使用してチップを通過させ、収集したデータに基づいてフィッティング分析を実行した。抗原サンプルを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を使用して２倍勾配希釈にかけ、４００ｎｍｏｌ/Ｌ、２００ｎｍｏｌ /Ｌ、１００ｎｍｏｌ/Ｌ、５０ｎｍｏｌ/Ｌ、２５ｎｍｏｌ/Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ/Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ/Ｌ、３．１２５ｎｍｏｌ/Ｌ、１．５６ｎｍｏｌ/Ｌ、０．７８ｎｍｏｌ/Ｌ、０ｎｍｏｌ/Ｌの勾配濃度の溶液を得た。５ｎｍｏｌ/ Ｌのサンプルを、反復濃度検出に使用した。 検出条件は次の通りであった：捕獲時間：３０秒；抗原結合時間：１２０秒; 解離時間：９００秒; 流速：３０μl/分。 また、再生条件は、２０ ｍＭのＮａＯＨ溶液、流速：３０μl/分であった。具体的な実験結果を表１０に示す。実験結果から、マウス－ヒトキメラ抗体と比較して、ヒト化抗体のＫＤ値はマウス抗体と同等であることがわかった。
Ｂｉａｃｏｒｅ－Ｔ２００検出を実行し、ＰｒｏｔｅｉｎＡチップを使用して候補抗体又は陽性抗体を捕獲し、異なる濃度のヒトＡβ抗原を使用してチップを通過させ、収集したデータに基づいてフィッティング分析を実行した。抗原サンプルを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を使用して２倍勾配希釈にかけ、４００ｎｍｏｌ/Ｌ、２００ｎｍｏｌ /Ｌ、１００ｎｍｏｌ/Ｌ、５０ｎｍｏｌ/Ｌ、２５ｎｍｏｌ/Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ/Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ/Ｌ、３．１２５ｎｍｏｌ/Ｌ、１．５６ｎｍｏｌ/Ｌ、０．７８ｎｍｏｌ/Ｌ、０ｎｍｏｌ/Ｌの勾配濃度の溶液を得た。５ｎｍｏｌ/ Ｌのサンプルを、反復濃度検出に使用した。 検出条件は次の通りであった：捕獲時間：３０秒；抗原結合時間：１２０秒; 解離時間：９００秒; 流速：３０μl/分。 また、再生条件は、２０ ｍＭのＮａＯＨ溶液、流速：３０μl/分であった。具体的な実験結果を表１０に示す。実験結果から、マウス－ヒトキメラ抗体と比較して、ヒト化抗体のＫＤ値はマウス抗体と同等であることがわかった。
実施例１２：Ａβ重合を阻害するヒト化抗－Ａβ抗体の効果の検出
８．２％ＤＭＳＯ/ＤＰＢＳ溶液（ＤＭＳＯ：Sigma; DPBS：Hyclone）を使用してＡβ乾燥粉末を１ｍｇ/ｍｌに溶解し、ｄｐｂｓを使用してＡβ溶液を３３μg/ mlに希釈しそして、ヒト化候補抗体０６６－５．４．１を４５０μg/ ml（ＩＣ１００）に希釈し、そしてＴｈＴ（Sigma）を超純水で２０μＭに希釈した。５０μｌの候補抗体希釈液を取り、９６ウェルブラックプレート（corning）に添加し、次に５０μｌのＡβ希釈液を添加し、最後に１００μｌのＴｈＴを添加し、室温で２４時間暗所でインキュベートした。 多機能マイクロプレートリーダーで測定し、蛍光強度を測定した（Ｅｘ/Ｅｍ ＝４４０/４８５）。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸は相対的な蛍光強度を表す。 結果を図１１に示す。ｈＩｇＧの相対蛍光強度は１．００であり、０６６－５．４．１－ｍＡｂグループの相対蛍光強度は０．８４であり、０６６－５．４．１-ｃｈＡｂグループの相対蛍光強度は０．６８であり、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４グループの相対蛍光強度は０．６１であり、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５グループの相対蛍光強度は０．６４であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１グループの相対蛍光強度は０．５９であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２グループの相対蛍光強度は０．６８であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３グループの相対蛍光強度は０．５５であり、そして０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４グループの相対蛍光強度は０．５８であった。０６６－５．４．１のヒト化抗体がＡβ重合を阻害する可能性があることがわかった。
８．２％ＤＭＳＯ/ＤＰＢＳ溶液（ＤＭＳＯ：Sigma; DPBS：Hyclone）を使用してＡβ乾燥粉末を１ｍｇ/ｍｌに溶解し、ｄｐｂｓを使用してＡβ溶液を３３μg/ mlに希釈しそして、ヒト化候補抗体０６６－５．４．１を４５０μg/ ml（ＩＣ１００）に希釈し、そしてＴｈＴ（Sigma）を超純水で２０μＭに希釈した。５０μｌの候補抗体希釈液を取り、９６ウェルブラックプレート（corning）に添加し、次に５０μｌのＡβ希釈液を添加し、最後に１００μｌのＴｈＴを添加し、室温で２４時間暗所でインキュベートした。 多機能マイクロプレートリーダーで測定し、蛍光強度を測定した（Ｅｘ/Ｅｍ ＝４４０/４８５）。横軸は異なるサンプルグループを表し、縦軸は相対的な蛍光強度を表す。 結果を図１１に示す。ｈＩｇＧの相対蛍光強度は１．００であり、０６６－５．４．１－ｍＡｂグループの相対蛍光強度は０．８４であり、０６６－５．４．１-ｃｈＡｂグループの相対蛍光強度は０．６８であり、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４グループの相対蛍光強度は０．６１であり、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５グループの相対蛍光強度は０．６４であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１グループの相対蛍光強度は０．５９であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２グループの相対蛍光強度は０．６８であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３グループの相対蛍光強度は０．５５であり、そして０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４グループの相対蛍光強度は０．５８であった。０６６－５．４．１のヒト化抗体がＡβ重合を阻害する可能性があることがわかった。
実施例１３：Ａβに対するマクロファージの食作用の促進に対するヒト化抗－Ａβ抗体の活性の検出
マウス初代末梢血マクロファージを良好な条件下で接着培養で３日間維持し、０．２５％トリプシンで消化し、計数した。細胞密度を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で２×１０５／ｍｌに調整し、９６ウェル細胞培養プレート（１００μｌ／ウェル）に播種した。０６６－５．４．１ヒト化候補抗体を１％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で動作濃度５０μｇ／ｍｌ（ＥＣ５０）及び２００μｇ／ｍｌ（ＥＣ１００）に希釈し、Ａβを２４０μｇ／ｍｌに希釈し、ＴｈＴ（ｓｉｇｍａ）を超純水で２０μＭに希釈した。培養プレート中の培養培地を捨て、候補抗体希釈物５０μｌをまず添加し、続いてＡβ溶液５０μｌを加え、そして反復ウェルをセットした。これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間インキュベーションし、上澄み５０μｌを回収し、９６ウェル黒プレートに添加し、ＴｈＴ５０μｌを添加し、多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ／Ｅｍ＝４４０／４８５）を検出した。横座標はサンプルグループを表し、縦座標は蛍光強度を表し、結果を図１２に示す。Ａβの蛍光強度は１．００、０６６－５．４．１－ｍＡｂ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．９３、０６６－５．４．１－ｍＡｂ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．８１、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．６７、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．４１、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５６、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２５、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．６１、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３０、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５４、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３７、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５５、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２８、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５４、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２３、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５９、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３９であった。０６６－５．４．１のヒト化候補抗体は全てＡβに対するマクロファージの食作用促進活性を有していることが示され、就中０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３が最も良好な成績を示した。
マウス初代末梢血マクロファージを良好な条件下で接着培養で３日間維持し、０．２５％トリプシンで消化し、計数した。細胞密度を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で２×１０５／ｍｌに調整し、９６ウェル細胞培養プレート（１００μｌ／ウェル）に播種した。０６６－５．４．１ヒト化候補抗体を１％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で動作濃度５０μｇ／ｍｌ（ＥＣ５０）及び２００μｇ／ｍｌ（ＥＣ１００）に希釈し、Ａβを２４０μｇ／ｍｌに希釈し、ＴｈＴ（ｓｉｇｍａ）を超純水で２０μＭに希釈した。培養プレート中の培養培地を捨て、候補抗体希釈物５０μｌをまず添加し、続いてＡβ溶液５０μｌを加え、そして反復ウェルをセットした。これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間インキュベーションし、上澄み５０μｌを回収し、９６ウェル黒プレートに添加し、ＴｈＴ５０μｌを添加し、多機能マイクロプレートリーダーで蛍光強度（Ｅｘ／Ｅｍ＝４４０／４８５）を検出した。横座標はサンプルグループを表し、縦座標は蛍光強度を表し、結果を図１２に示す。Ａβの蛍光強度は１．００、０６６－５．４．１－ｍＡｂ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．９３、０６６－５．４．１－ｍＡｂ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．８１、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．６７、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．４１、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５６、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２５、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．６１、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３０、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５４、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３７、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５５、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２８、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５４、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．２３、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４ ５０ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．５９、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４ ２００ μｇ／ｍｌグループの蛍光強度は０．３９であった。０６６－５．４．１のヒト化候補抗体は全てＡβに対するマクロファージの食作用促進活性を有していることが示され、就中０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３が最も良好な成績を示した。
実施例１４：細胞毒性に対するヒト化抗－Ａβ抗体の保護活性の検出
対数増殖期のＳＨＳＹ５Ｙ細胞を０．２５％トリプシンで消化し、カウントし、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で調整し、細胞密度を３×１０４ /ｍｌにし、９６ウェル細胞培養プレートに１００μl/ウェルで接種し； ０６６－５．４．１のヒト化候補抗体を１％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地で２００ μｇ /ｍｌ（ＩＣ１００）に希釈し、作業溶液として使用し、Ａβを２４０ μｇ/ｍｌに希釈した。培養プレート内の培地を廃棄し、最初に５０μｌの候補抗体希釈液を添加し、次に５０μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し；インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間行い；５０μｌの上清液を取り、新しい９６ウェルプレートに添加し、次に５０μｌのＬＤＨアッセイ緩衝液を添加し、暗所で室温で３０分間反応させ、５０μｌの停止溶液を添加し、そして 吸光度を測定するための多機能マイクロプレートリーダーで測定した。横軸は異なるサンプルグループを表し、そして縦軸はＬＤＨ放出の相対値を表す。 結果は図１３に示される。ビヒクルのＬＤＨ放出の相対値は１．００であり、０６６－Ｐ０２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．５３であり、０６６－５．４．１－ｍＡｂグループのＬＤＨ放出の相対値は１．３７であり、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂグループのＬＤＨ放出の相対値は１．３４であり、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３９であり、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４１であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４６であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４３であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３５であり、そして０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４４であった。０６６－５．４．１のヒト化候補抗体はすべて細胞毒性に対する防御効果があり、そして０６６－Ｐ０２と同等の防御効果を示したことがわかった。
対数増殖期のＳＨＳＹ５Ｙ細胞を０．２５％トリプシンで消化し、カウントし、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で調整し、細胞密度を３×１０４ /ｍｌにし、９６ウェル細胞培養プレートに１００μl/ウェルで接種し； ０６６－５．４．１のヒト化候補抗体を１％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地で２００ μｇ /ｍｌ（ＩＣ１００）に希釈し、作業溶液として使用し、Ａβを２４０ μｇ/ｍｌに希釈した。培養プレート内の培地を廃棄し、最初に５０μｌの候補抗体希釈液を添加し、次に５０μｌのＡβ希釈液を添加し、複数のウェルを設定し；インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間行い；５０μｌの上清液を取り、新しい９６ウェルプレートに添加し、次に５０μｌのＬＤＨアッセイ緩衝液を添加し、暗所で室温で３０分間反応させ、５０μｌの停止溶液を添加し、そして 吸光度を測定するための多機能マイクロプレートリーダーで測定した。横軸は異なるサンプルグループを表し、そして縦軸はＬＤＨ放出の相対値を表す。 結果は図１３に示される。ビヒクルのＬＤＨ放出の相対値は１．００であり、０６６－Ｐ０２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．５３であり、０６６－５．４．１－ｍＡｂグループのＬＤＨ放出の相対値は１．３７であり、０６６－５．４．１－ｃｈＡｂグループのＬＤＨ放出の相対値は１．３４であり、０６６－５．４．１Ｈ１Ｌ４グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３９であり、０６６－５．４．１Ｈ２Ｌ５グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４１であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ１グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４６であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ２グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４３であり、０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ３グループのＬＤＨ放出の相対値は１．３５であり、そして０６６－５．４．１Ｈ５Ｌ４グループのＬＤＨ放出の相対値は１．４４であった。０６６－５．４．１のヒト化候補抗体はすべて細胞毒性に対する防御効果があり、そして０６６－Ｐ０２と同等の防御効果を示したことがわかった。
本開示によって提供されるヒト化抗Ａβモノクローナル抗体及びその使用は、上記で詳細に紹介されている。 本開示の原理及び実施は、特定の例で示されているが、上記の実施例の説明は、本開示の方法及びコアアイデアを理解するのを助けるためにのみ使用されている。当業者にとって、本開示の原理から逸脱することなく、本開示に対していくつかの改善及び修正を行うことができ、それらの改善及び修正もまた、本開示の特許請求の範囲の保護内にあることを指摘されたい。
Claims (20)
- 抗－Ａβヒト化モノクローナル抗体であって、
（Ｉ）前記モノクローナル抗体の３つのＨ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１、２及び３で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＩＩ）前記モノクローナル抗体の３つのＬ鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＩＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｉ）又は（ＩＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；又は
（ＩＶ）前記アミノ酸配列が、（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、モノクローナル抗体。 - （Ｖ）前記モノクローナル抗体の４つのＨ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号７、８、９及び１０で示されるアミノ酸配列であり；そして（ＶＩ）前記モノクローナル抗体の４つのＬ鎖ＦＲ領域のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１、１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列であり；又は
（ＶＩＩ）前記アミノ酸配列が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介しての（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列であり、そして（Ｖ）又は（ＶＩ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；又は
（ＶＩＩＩ）前記アミノ酸配列か、（Ｖ）、（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - （ＩＸ）そのＨ鎖可変領域が、配列番号１５～１９のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；そして（Ｘ）そのＬ鎖可変領域が、配列番号２０～２４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を介して（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸から得られるアミノ酸配列を有し、そして（ＩＸ）又は（Ｘ）のアミノ酸配列と同じ機能を有するアミノ酸配列であり；又は
（ＸＩＩ）そのＨ鎖可変領域又はそのＬ鎖可変領域が、（ＩＸ）、（Ｘ）又は（ＸＩ）のアミノ酸配列と少なくとも９７の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 前記モノクローナル抗体が、Ａβ１４－２９の抗原結合エピトープを有する、請求項１又は３に記載のモノクローナル抗体。
- （ＶＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＩＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２４に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２０に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２１に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２２に示されるようなアミノ酸配列を有し；又は
（ＸＶＩＩＩ）そのＨ鎖可変領域が配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、そしてそのＬ鎖可変領域が配列２３に示されるようなアミノ酸配列を有する、請求項１又は３に記載のモノクローナル抗体。 - 前記より多くのアミノ酸が、２、３、４又は５つのアミノ酸配列を指す、請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 定常領域をさらに含み、ここで前記モノクローナル抗体がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つであるＨ鎖定常領域を有し；そして前記モノクローナル抗体がκ型又はλ型であるＬ鎖定常領域を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換されるか、又はトランスフェクトされる宿主。
- 請求項１～７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体の調製方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、そしてヒト化抗－Aβモノクローナル抗体の発現を誘発することを含む方法。
- 化学的に又は生物学的に標識されている、請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含むことにより特徴付けられるコンジュゲート。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、又は請求項１２に記載のコンジュゲートを、固体培地又は半固体培地とカップリングすることにより調製されるカップリング生成物。
- 認知機能障害と戦うための薬剤、アルツハイマー病を治療するための薬剤、アルツハイマー病の進行を阻害するための薬剤、老人斑の形成を阻害するための薬剤、Ａβ蓄積を阻害するための薬剤、神経毒性と戦うための薬剤、Ａβアミロイド線維の形成を阻害するための薬剤、及び/又はシナプス毒性と戦うための薬剤の製造への、請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のコンジュゲート及び/又は請求項１３に記載のカップリング生成物の使用。
- 疾患の予防及び治療のための医薬品の製造への、請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のコンジュゲート及び/又は請求項１３に記載のカップリング生成物の使用であって、前記疾患がアミロイドーシスを含み、前記アミロイドーシスが続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、そして疾患が神経疾患,例えばアルツハイマー病を含むが、但し、それらに限定されない、使用。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のコンジュゲート及び/又は請求項１３に記載のカップリング生成物を含むことにより特徴づけられる医薬品。
- 請求項１６に記載の医薬品を投与することにより特徴づけられる、疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、前記疾患がアミロイドーシスを含み、前記アミロイドーシスが続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、そして疾患が神経疾患,例えばアルツハイマー病を含むが、但し、それらに限定されない、方法。
- Ａβ発現を検出するための製品の製造への、請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のコンジュゲート及び/又は請求項１３に記載のカップリング生成物の使用。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のコンジュゲート及び/又は請求項１３に記載のカップリング生成物を含むキット。
- 請求項１９に記載のキットによりＡβ発現を検出し、Ａβの発現量に従って疾患が存在するかどうかを判断することにより特徴付けられる、疾患の診断方法であって、ここで前記疾患がアミロイドーシスを含み、前記アミロイドーシスが続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシスを含み、そして疾患が神経疾患,例えばアルツハイマー病を含むが、但し、それらに限定されない、方法。
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