KR102584663B1 - 타우 응집을 방지하기 위한 모노클로날 항-알파-시누클레인 항체 - Google Patents

타우 응집을 방지하기 위한 모노클로날 항-알파-시누클레인 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모노클로날 항-알파-시누클레인(alpha-synuclein) 항체의 신규 용도에 관한 것이다. 이러한 항체는 타우(tau) 응집을 방지하고, 이로써 알츠하이머병과 같은 타우병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

타우 응집을 방지하기 위한 모노클로날 항-알파-시누클레인 항체
본 발명은 알츠하이머병(AD)과 같은 타우-병증(tau-pathy)의 치료에서 알파-시누클레인(alpha-synuclein)에 면역특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 신규 용도, 뿐만 아니라 이들 분자 및 이들의 알파-시누클레인 결합 단편의 이용 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조:
본 출원에는 37 C.F.R. 1.821 et seq .에 따른 하나 이상의 서열 목록이 포함되며, 이는 종이 및 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체 둘 다에 개시되고, 이러한 종이 및 컴퓨터로 읽을 수 있는 개시물은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
알츠하이머병(AD) 및 치매와 같은 연령-관련 신경퇴행성 질병은 오늘날 가장 큰 사회적 문제점 중 하나이다. 세계보건기구는 노인의 돌봄 비용이 계속 증가할 것이며, 치매 진단 사례의 수가 2050년에는 3배가 될 것이라고 추정하고 있다(세계보건기구 및 알츠하이머병 국제 - 상태 보고서(2012) 치매: 공중 보건 우선순위, WHO). AD에 대한 제1 치료는 아세틸콜린 에스터라제 억제제 및 NMDA 조정자와 같은 신경 전달 물질 조정자였다. 이들 요법은 2000년대에 들어서 이용 가능하게 되었으며, 여전히 치매 및 AD와 관련된 기억 결함의 증상 완화를 위한 초석을 형성하고 있다. 그러나, 이들 약물은 AD의 근본 원인, 아밀로이드-β(Aβ) 펩타이드 및 타우 단백질 응집물의 축적, 및 이와 연관된 신경 시냅스 및 결국 신경 세포의 소실을 표적으로 하지 않는다.
대규모 게놈-전반 연관 연구(문헌[Lambert, J.C. et al. (2013) Nat. Genet. 45, 1452-1458])와 더불어 노인의 종단, 지역사회-전반 연구(문헌[Weiner, M.W. et al. (2014) ADNI; Breteler, M.M. et al. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 23-28; Launer, L.J. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 2-13])는, AD가, 진행된(advanced) AD 환자의 최대 10%가 아밀로이드 병리가 결여된, 치매들의 불균질한 혼합임을 보여주었다(문헌[Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 128, 755-766]). 더욱이, Braak & Braak에 의한 중대한 병리학적 연구(문헌[Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12])는 부검 전 신경원섬유 다발 병리의 정도와 인지 상태 사이의 명확한 상관관계를 입증했다. 이들 관찰은 몇몇 연구자들에 의해 보강되어 왔으며(문헌[Nelson, P.T. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381]), 최근의 종단 바이오마커 연구는, 타우 및 포스포-타우의 뇌척수액(CSF) 수준이 질병의 초기 및 후기 단계 동안 내내 증가함을 나타낸다(문헌[Jack, C.R., Jr. et al. (2013) Lancet Neurol. 12, 207-216]).
상기 나타난 바와 같이, 미세소관-연관 단백질인 타우 및 이의 과인산화된 버전은 AD의 주요 특질 중 하나인 세포내 신경원섬유 다발의 주요 구성분을 형성한다. 더욱이, 타우의 특이적인 유전적 변이체는 가족성 형태(familial form)의 전두측두엽 치매(FTD; fronto-temporal dementia)와 연관이 있다. AD에서 타우병리의 출현은 별개의 공간적 패턴에서 발생하는데, 내후각 피질에서 출발하여 뒤이어 해마 및 피질 영역에서 발생한다(문헌[Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12]). 타우병리의 특이적인 단계는 또한, 인지 능력과 밀접한 상관관계가 있다(문헌[Nelson, P.T. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381; Braak, E. et al. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl 3, 14-22]). 종합해서, 이는, AD에 대한 타우-기반 가설의 근거를 형성한다. 타우의 세포내 축적은 미세소관 변성 및 척추 붕괴(collapse)를 초래한다는 것이 수반된다. 그 결과, 신경 세포 기능 부전과 세포 사멸 사이의 소통이 이어진다. 최근, 하나의 세포로부터 다음 세포로 신경퇴행을 전달할 수 있는 엔도-병원체(endo-pathogenic) 종(species)을 타우 자체가 형성할 수 있는 것으로 나타났다(문헌[Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913]).
엔도-병원체로서의 타우
Clavaguera 및 동료들은 타우 자체가 엔도-병원체로서 작용할 수 있다는 것을 입증했다(문헌[Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913]). 저스핀 뇌 추출물은 P301S 타우 트랜스제닉 마우스로부터 단리되었으며(문헌[Allen, B. et al. (2002) J. Neurosci. 22, 9340-9351]), 희석되고, 어린 ALZ17 마우스의 해마 및 피질 영역 내로 주사되었다. ALZ17 마우스는 후기 병리만 발병시키는 타우 트랜스제닉 마우스 라인이다(문헌[Probst, A. et al. (2000) Acta Neuropathol. 99, 469-481]). 주사된 ALZ17 마우스는 고형 필라멘트성 병리를 빠르게 발병시켰고, P301S 마우스로부터의 면역-결핍된 뇌 추출물 또는 야생형 마우스로부터의 추출물의 투여는 타우병리를 유도하지 않았다. 가용성(S1) 및 사코실-불용성 타우(P3)에서 뇌 추출물의 분획화(문헌[Sahara, N. et al. (2013) J. Alzheimer's. Dis. 33, 249-263]) 및 ALZ17 마우스 내로의 이들의 주사는, P3 분획이 병리의 유도에 있어서 가장 유능함을 입증했다. P3 분획은 대부분의 세포내 과인산화된 필라멘트성 타우를 함유한다. P301S 추출물을 야생형 마우스의 뇌 내로 주사할 때 대다수의 병리가 또한 유도될 수 있을 것이지만, 어떠한 NFT도 형성되지 않았다. 후속 연구에서, Clavaguera 등은, 다른 타우병증(은친화성 입자병(AGD; Argyrophilic Grain Disease), 진행성 핵상 마비(PSP; Progressive Supranuclear Palsy) 및 피질기저핵 변성(CBD; Corticobasal Degeneration))의 사후 뇌 조직으로부터 추출된 인간 타우 또한, ALZ17 모델에서 타우병리를 유도할 수 있음을 보여주었다(문헌[Clavaguera, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 9535-9540]). 이들 데이터의 제시 이후, 몇몇 다른 타우 접종 및 전파 모델이 보고되었다(문헌[Ahmed, Z. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 667-683; Walker, L.C. et al. (2013) JAMA Neurol. 70, 304-310]). 이들 연구로부터의 주요 결론은, 세포내 봉입물 내의 병원체성 타우가 세포로부터 원형질막주위 공간 내로 분비되는 기전을 가리킨다. 그 후에, 병리학적 타우 물질은 소포성 시스(vesicular sheath)를 따라 전방향 및 역방향 둘 다에서 수송되고, 후속해서 벌크 엔도사이토시스(bulk endocytosis)에 의해 이웃 세포에 흡수된다. 이러한 기전은, 인간 질병에서 관찰되는 병리의 전파가 별개의 해부학적 패턴을 따르는 이유를 설명해준다. 흥미롭게는, 병리학적 타우의 말초 투여(peripheral administration)는 ALZ17 마우스에서 타우병리의 형성을 가속화할 수 있다(문헌[Clavaguera, F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 299-301]).
알파- 시누클레인과 타우병리 사이의 관계
알파-시누클레인은 베타- 및 감마-시누클레인 및 시노레틴을 포함하는 단백질 패밀리의 구성원이다. 알파-시누클레인은 시냅스와 연관된 정상 상태에서 발현되며, 시냅스 소포 방출의 조절에 관여함으로써 신경, 유연성, 학습 및 기억에 영향을 미치는 것으로 여겨진다.
몇몇 연구는 알파-시누클레인이 파킨슨병(PD) 병리에서 중추적 역할을 갖는 것으로 시사하였다. 병리 상태에서는 단백질이 응집하여 세포내 불용성 원섬유를 형성할 수 있다. 예를 들어, 시누클레인은 레비 소체(LB)에 축적된다(문헌[Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8]). 알파-시누클레인 유전자에서의 돌연변이뿐만 아니라 유전자의 2중 복제 및 3중 복제는 파킨슨증의 희귀한 선천성 형태와 함께 분리된다(문헌[Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7]).
중요한 발견은 알파-시누클레인이 혈장 및 뇌척수액(CSF) 내로 분비될 수 있고 그곳에 존재할 수 있다는 것이었다. 몇몇 연구, 예를 들어 Pacheco 등(2015)의 연구 및 다른 연구(문헌[Conway et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J. Biochem. (2003) 42:7871-7878])에서는 세포외-시누클레인이 뇌에서 병리적 역할을 담당함을 제안하였다. 이들은 알파-시누클레인이, 세포외 시누클레인 올리고머에 직접적으로 노출된 뇌 신경 형질막에 대한 신경독성을 보유함을 입증했다. 시누클레인 분비 데이터에 기반한 다른 흥미로운 가설은 알파-시누클레인의 프리온-유사 전파가 파킨슨병 및 다른 시누클레인병증의 진행에 내재된다는 것이다(문헌[Lee et al., Hansen et al. (2011) J. Clin Invest 121:715-725]). 이들 발견은 세포외-시누클레인이 면역치료법에 의한 표적이 되고(문헌[Vekrellis et al. (2011), Lancet Neurol. 10:1015-1025]), 알파-시누클레인병증의 잠재적인 치료법이 될 수 있다는 희망을 불러일으켰다. 돌연변이에 부가하여, 알파-시누클레인 유전자의 대안적 스플라이싱 및 단백질의 번역 후 변형, 예컨대 인산화, 유비퀴틴화, 질산화, 및 절단은 알파-시누클레인의 응집 및/또는 독성 형태를 형성하는 능력이 증강된 알파-시누클레인 단백질 형태를 생성할 수 있다(문헌[Beyer and Ariza, Mol Neurobiol. 2013 Apr;47(2):509-24]). 그러나, 알파-시누클레인병증에서 알파-시누클레인의 정확한 병리적 종은 알려지지 않은 채로 남아있다. 올리고머부터 원섬유까지 범위의 다양한 미스폴딩/응집/분비 종, 및 상이한 번역-후 변형이 독성과 연관되었으나, 가장 중요한, 실제로 하나의 독성 종이 존재하는지에 대한 합의가 존재하지 않는다.
병리, 예를 들어 PD 환자의 서브세트에서 레비 소체, 아베타 플라크(Abeta plaque) 및 신경원섬유 다발, 또는 AD 환자의 서브세트에서 레비 소체의 공동-출현(문헌[Galpern and Lang, Ann. Neurol. (2008), 59: 449-458])은 응집-취약 단백질들이 어느 정도까지 서로 교차-접종될 수 있는지의 조사를 이끌었다. 알파-시누클레인 및 타우 단백질은 시험관내에서 공동-인큐베이션 시 각각의 원섬유화(fibrillization)를 유도할 수 있는 것으로 보고되었다(문헌[Giasson et al., (2003) Science 300: 636-640]). 세포 시스템에서, 알파-시누클레인 원섬유와 함께 타우의 교차-접종을 지지하는 증거 및 지지하지 않는 증거가 둘 다 존재한다. Holmes 등은 FRET 기반 타우 리포터 세포주에서 전장 알파-시누클레인으로부터 제조된 원섬유와 함께 타우의 교차-접종을 입증할 수 없었다(문헌[Holmes et al., (2014) PNAS doi/10.1073: E4376-E4385]). 다계통 위축(MSA) 환자로부터의 원섬유화된 전장 알파-시누클레인 A53T 또는 PTA-침전된(원섬유화된 알파-시누클레인에 대해 농화시키기 위해) 뇌 시료 중 어디에서도 타우 응집은 유도될 수 없었다(문헌[Woerman et al.,(2015) PNAS doi/10.1073: E4949-E4958]). 다른 이들은 일부 조건 하에 알파-시누클레인이 타우 응집을 유도할 수 있다고 보고하였으며, 예를 들어 N-말단 절단된(21~140) 알파-시누클레인으로부터 제조된 알파-시누클레인 원섬유는 QBI293 세포에서 타우 인산화를 유도하는 것으로 보여졌다(문헌[Waxman and Giasson (2011) J. Neurosci 31: 7604-7618]). 신경 세포 배양물에서, 전장 원섬유화된 알파-시누클레인은 타우 응집을 접종한다. 그러나, 절단된 알파-시누클레인(1~120 또는 32~140)으로부터 제조된 원섬유화된 알파-시누클레인은 세포에서의 반복된 자가-접종을 거칠 수 있다(각각의 계대배양으로부터의 5% 또는 10%의 원섬유화된 알파-시누클레인은 후속 계대배양의 원섬유화에서 접종물(seed)로서 포함되었음)(문헌[Guo el at., (2013) Cell 154: 109-117]).
본 발명자들이 아는 한 어떠한 연구도, 일반적으로 가시적인 알파-시누클레인 봉입물과는 독립적으로 AD 또는 다른 타우병증의 조기 발병에서, 분비된 올리고머성 또는 원섬유화된 형태의 알파-시누클레인이 기여 인자일 수 있다고 가정하지 않았다. 알파-시누클레인과 함께 타우의 교차-접종을 입증한 보고서는, 일부 PD 환자에서 분명한 알파-시누클레인 응집(레비 소체)과 함께 신경원섬유 다발이 확인되는 이유를 설명하는 데 초점을 맞추었다. 이들 연구는, 타우 및 알파-시누클레인 침적물의 밀접한 생리학적 연관성이 존재하는 영역에서 교차-접종이 발생할 수 있다고 추측한다(문헌[Giasson et al., (2003) Science 300: 636-640; Waxman and Giasson (2011) J. Neurosci 31: 7604-7618; Guo el at., (2013) Cell 154: 109-117]). 레비 소체 또는 레비 신경돌기 형태의 세포내 응집물이 아니라 가용성 세포외 올리고머성/원섬유화된 형태의 알파-시누클레인이 타우 신경원섬유 다발의 발생에서 중요한 기여 인자라는 아이디어는 새롭다.
알파-시누클레인 면역요법
알파-시누클레인에 결합하는 항체는 레비 소체병(LBD)으로도 알려져 있는 시누클레인병증을 치료하기 위한 잠재적인 치료제로서 개발되어 왔다. 시누클레인병증은 단백질 알파-시누클레인이 주성분인, 레비 소체(LB) 및/또는 레비 신경돌기로서 현미경으로 볼 수 있는 세포내 단백질 응집물의 침적을 특징으로 한다(문헌[Jellinger, Mov Disord. 2012 Jan;27(1):8-30; McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24]). 시누클레인병증에는 파킨슨병(특발성 파킨슨병 포함) 및 광범위 레비 소체(DLB)병(레비 소체 함유 치매(DLB), 알츠하이머병의 레비 소체 변이(LBV), 복합 알츠하이머 및 파킨슨병(PD), 순수 자율신경 부전 및 다계통 위축(MSA; 예컨대, 올리브다리뇌소뇌 위축, 선조체흑색질 변성 및 샤이-드래거 증후군)로도 알려져 있음)이 포함된다.
알파-시누클레인에 대한 몇몇 상이한 항체는 전임상 동물 모델에서 치료 효과를 갖는 것으로 나타났다. 알파-시누클레인 잔기 91~99가 관여되는 에피토프를 표적으로 하는 항체 및 알파-시누클레인 잔기 118~126이 관여되는 에피토프를 표적으로 하는 항체는 모두 트랜스제닉 마우스에서 운동 및 인지 결함에 대한 효과를 갖는 것으로 나타났다(Games et al. 2014). 가장 개선된 이러한 항체는 알파-시누클레인 잔기 118~126이 관여되는 에피토프를 표적으로 하는 마우스 모노클로날 항체 9E4에 기반한 인간화 항체로, 현재 I상 임상 시험 중이다. 또한, 알파-시누클레인의 아미노-말단 에피토프를 표적으로 하는 항체는 마우스 프리온 유사 트랜스퍼 모델에서 병리의 전파 및 독성을 예방하는 데 있어서 가능한 치료적 잠재성을 갖는 것으로 보여졌으며(Tran et al. 2014), 알파-시누클레인 잔기 120~140이 관여되는 에피토프를 표적으로 하는 C-말단 항체 274(Bae et al. 2012) 또한 세포에서 세포로의 병리 전파에 대해 전임상 모델에서 효과를 갖는 것으로 보여졌다. 이에 부가하여, 알파-시누클레인의 입체형태 종, 예컨대 올리고머 및 원섬유를 표적으로 하는 항체는 적어도, 이러한 아마도 독성인 알파-시누클레인 종의 수준을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다(Lindstroem et al. 2014 및 Spencer et al. 2014). 생체내 알파-시누클레인 올리고머 수준을 낮추는 이러한 입체형태 항체, 예컨대 mab47도 아미노산 121~125로부터의, 알파-시누클레인의 C-말단에서의 에피토프를 표적으로 하는 것으로 나타났다(US20120308572). 다른 입체형태, 원섬유 및 올리고머 특이적 항체도 C-말단 서열을 표적으로 한다(문헌[Vaikath et al. Neurobiol Dis. 2015;79:81-99]). 중요하게는, 이들 알파-시누클레인 항체 중 어느 것도, 타우 응집을 방지할 수 있고 그 결과 타우병증을 잠재적으로 치료할 수 있는 것으로 주장되지 않았다.
본 발명에서, 본 발명자들은 놀랍게도, 응집된/원섬유화된 알파-시누클레인이 타우의 응집을 유도할 수 있고, 알파-시누클레인에 결합하도록 발생된 몇몇 항체는 이러한 응집을 방지할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은, 상이한 알파-시누클레인 항체들의 패널: 추정상 독성 알파-시누클레인 단편 1~119/122에 결합하고(알파-시누클레인의 아미노산 112~117에 결합함) 이러한 절단된 형태의 알파-시누클레인을 중화시킬 수 있는 항체(GM37), 알파-시누클레인의 아미노산 136~140에 결합하는 항체(2E6), 알파-시누클레인의 아미노산 126~138에 결합하는 항체(GM63), 및 알파-시누클레인의 아미노산 118~126에 결합하는 항체 9E4가 모두 세포 모델에서 타우의 응집을 방지할 수 있음을 보여준다. 원섬유 형태의 알파-시누클레인이 초기 AD 병리에 기여할 수 있음을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 레비 소체 병리의 존재와는 독립적으로 AD 환자의 뇌에서 원섬유화된 알파-시누클레인의 존재를 입증할 것이다. 이는, 가용성 세포외 형태의 원섬유화된 알파-시누클레인이, 가시적인 알파-시누클레인 응집물(뇌 이미징 또는 사후 염색에 의해 결정됨)을 특징으로 하는 환자에서뿐만 아니라 모든 AD 환자와 같이 타우병증에서의 타우-병증에 기여하는 역할을 잠재적으로 수행할 수 있음을 뒷받침한다.
본 발명은 타우의 응집을 억제하기 위한, 알파-시누클레인 결합 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.
본원 및 청구항에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 알츠하이머병 환자, 또는 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 일차 연령-관련 타우병증(PART; Primary age-related tauopathy), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매(Neurofibrillary tangle-predominant senile dementia), 권투선수 치매(dementia pugilistica), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행(neurodegeneration in relation to parkinson's disease), 염색체 연관 파킨슨증(Parkinsonism linked to chromosome), 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종(Ganglioglioma) 및 신경절세포종(gangliocytoma), 뇌막혈관종증(Meningioangiomatosis), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 헌팅턴병, 납 뇌병증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 및 리포푸신증(lipofuscinosis)과 같은 타우병증 환자의 치료에 이용될 수 있다. 보다 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 하이브리도마의 생성을 위한 면역화 프로토콜을 나타낸다. 표는 GM37 및 GM285의 확인을 위해 이용된 면역원 및 마우스 계통의 차이를 개략한다. 상이한 HCo17-Balb/c 및 HCo12/Balb/c 마우스를 독립적으로 면역화하였다(이들 마우스의 설명은 아래에 제공됨). GM37을 발현하는 하이브리도마는 아미노산 1~140 원섬유를 함유하는 전장 알파-시누클레인으로 면역화되고 전장(FL) 알파-시누클레인(SEQ ID No: 10)의 절단된 알파-시누클레인 단편 1~60 및 1~119로 추가접종된 마우스로부터 확인되었다. 항체 GM285를 발현하는 하이브리도마는 HCo12-Balb/c 마우스가 전장 단량체성 알파-시누클레인, 아미노산 1~140으로 면역화된 후 전장 원섬유성 알파-시누클레인으로 추가접종된 면역화 프로토콜로부터 수득하였다(실시예 1).
도 2(패널 a~c)는 알파 시누클레인, 알파-시누클레인 동족체 및 오르소로그로의 결합에 대한 GM37의 스크리닝을 나타낸다.
a) 무세척 용액 기반 ELISA(FMAT)를 이용한 알파-시누클레인에 대한 항체 GM37의 결합.
b) GM37의 SPR(Fortebio) 결합의 이용은 알파-시누클레인(알파 패널)에 특이적이며, 다른 관련된 시누클레인 패밀리 단백질인 베타-시누클레인(베타 패널) 및 감마-시누클레인(감마 패널)에는 결합하지 않는다. 측정은 SPR(Fortebio Octetred)을 이용하여 수행되었고 GM37은 게먹이 원숭이(Cyno 패널) 및 마우스(마우스 패널)로부터의 알파-시누클레인에 대해 유사한 결합을 나타낸다(실시예 1).
c) 항체 GM285의 SPR(Fortebio Octetred) 결합의 이용은 알파-시누클레인에 특이적이며, 다른 관련된 시누클레인 패밀리 단백질인 베타-시누클레인 및 감마-시누클레인에는 결합하지 않는다. 측정은 SPR(Fortebio Octetred)을 이용하여 수행하였고, 게먹이 원숭이(Cyno) 및 마우스(마우스)로부터의 알파-시누클레인에 대한 GM285의 결합과 유사한 결합을 나타낸다(실시예 1).
도 3(패널 a~c)은 GM37의 실시간 결합 친화도를 나타낸다.
a) SPR(BIAcore® 3000)에 의해 결정되는 경시적인(X-축) RU(상대 단위)(y-축)로 측정되는 알파-시누클레인에 대한 항체 GM37의 결합. 염소 항-인간 IgG를 CM5 칩 상에 고정화하였다. GM37을 염소 항-인간 IgG 고정화 칩 상에 포착하고 인간 알파-시누클레인의 농도 시리즈(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM)를 표면으로의 결합에 대해 시험하였다. 센서 표면은 각 사이클 사이에 재생시켰다.
b) 상이한 농도에서의 결합으로부터의 신호를 결합 곡선으로 전환하였다.
c) 항체 GM37(hlgG1-6004-037-C106S로 표시됨)의 계산된 결합 상수(실시예 2).
도 4(패널 a~c)는 GM285의 실시간 결합 친화도를 나타낸다.
a) SPR(BIAcore® 3000)에 의해 결정되는 경시적인(X-축) RU(y-축)로 측정되는 알파-시누클레인에 대한 항체 GM285의 결합. 염소 항-인간 IgG를 CM5 칩 상에 고정화하였다. GM285를 염소 항-인간 IgG 고정화 칩 상에 포착하고 인간 알파-시누클레인의 농도 시리즈(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM)를 표면으로의 결합에 대해 시험하였다. 센서 표면은 각 사이클 사이에 재생시켰다.
b) 상이한 농도에서의 결합으로부터의 신호를 결합 곡선으로 전환하였다.
c) 항체 GM285(hlgG1-6004-285로 표시됨)의 계산된 결합 상수(실시예 2).
도 5(패널 a~c)는 비교물질 항체 9E4의 실시간 결합을 나타낸다.
a) SPR(BIAcore® 3000)에 의해 결정되는 경시적인(X-축) RU(y-축)로 측정되는 알파-시누클레인에 대한 9E4의 결합을 나타낸다. 염소 항-인간 IgG를 CM5 칩 상에 고정화하였다. 9E4를 칩에 고정화된 염소 항-인간 IgG로의 그 결합에 의해 칩 상에 포착하였다. 인간 알파-시누클레인의 농도 시리즈(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM)를 표면으로의 결합에 대해 시험하였다. 센서 표면은 각 사이클 사이에 재생시켰다.
b) 상이한 농도에서의 결합으로부터의 신호를 결합 곡선으로 전환하였다.
c) 항체 9E4에 대해 계산된 결합 상수(실시예 2).
도 6(패널 a~b)은 항체 GM37 및 GM285의 에피토프 맵핑을 나타낸다. 알파-시누클레인 아미노산 서열 95~132에서 유래되는 순차적 펩타이드(20머)에 대한 항체 결합의 상대적 수준을 나타내는 ELISA 데이터(다른 비결합 펩타이드는 나타내지 않음).
a) GM37 에피토프는 완전 결합을 위해 펩타이드 서열 ILEDMP(SEQ ID NO:9)를 필요로 한다.
b) GM285는 완전 결합을 위해 펩타이드 ILED(SEQ ID NO:19)를 필요로 한다(실시예 3).
도 7은 고정화된 재조합 인간 알파-시누클레인에 대한 GM37 및 변이체 1~3의 결합 속도 동역학 파라미터를 비교하는 표를 나타낸다. 결합은 SPR을 이용해서 측정하고, 속도는 1:1 결합 알고리즘(BIAcore® T200)을 이용하여 결정하였다.
도 8은 알파-시누클레인 시드에 의해 유도되는 타우 응집이 알파-시누클레인 항체에 의해 방지됨을 나타낸다. 도 7 상위 패널은, 타우 응집을 방해하는 작용제의 효과를 평가하는 데 보편적으로 사용되는 유형의 세포 모델에서 타우 응집이 알파-시누클레인 시드(원섬유화된 재조합 알파-시누클레인)에 의해 효율적으로 유도될 수 있음을 보여준다. 알파-시누클레인 시드 유도 타우 응집은 일반적으로 - 9E4(Elan, Prothena) 및 Lundbeck 항체 HLD1, GM37("37") 및 GM63("63")에 의해 예시되는 알파-시누클레인 항체에 의해 방지될 수 있다. 세린 396 상에서 인산화된 타우에 대한 항체(D1.2, C10.2 및 인간화(h) c10.2, 및 Lu0041G로 지칭되는 또 다른 타우 항체), 및 알파-시누클레인에 대해 친화성이 없는 대조군 항체는 타우 응집에 대해 효과를 갖지 않으며, 이는 내인성 단백질이 아니라 접종 화학종과 상호작용하는 치료 항체의 중요성을 지지한다(실시예 12). 도 8의 하위 패널은 HEK293 세포에서 응집 검정법의 개요를 보여준다. 세포는, P301L 돌연변이를 갖는 인간 전장 타우를 인코딩하는 cDNA로 형질감염된다. 24시간 후, 세포는 항체와 조합된 알파-시누클레인 시드로 처리된다. 48시간 후, 타우 응집의 수준은 세포 균질물 내에서 생화학적 검정법을 이용하여 측정된다(실시예 5).
도 9는 모든 50개의 AD 사례 - 중기(Braak III/IV) 및 후기(Braak V/VI) AD로 나뉘어진 그룹으로부터 전두 피질 내 알파-시누클레인 응집물의 존재를 나타낸다. 2개의 DLB 시료가 대조군으로서 포함된다(A에서 2개의 상위 라인). AD 시료에서 알파-시누클레인-세린129 인산화는 검출되지 않는다. 레비 소체 치매(DLB) 시료는 양성 대조군으로서 포함된다.
A 및 B는 생화학적 방법에 의해 측정된 50명의 AD 환자의 전두 피질 내에서 응집된 알파-시누클레인의 존재를 나타낸다. 환자들은 임상적으로 AD 진단을 받았고 진단은 타우 및 아베타에 대한 사후 조직학적 염색에 의해 확인되었다. 어떠한 환자도 레비 소체 병리(응집된 세린129 인산화된 알파-시누클레인)를 제시하지 않았다, 도 9c. 모든 환자에서 알파-시누클레인 응집물의 존재 및 세린129 인산화된 알파-시누클레인(레비 소체에 대한 마커)의 부재는, 알파-시누클레인 병리가 레비 소체로서 분명해지기 전에, 응집된 형태의 알파-시누클레인이 모든 AD 환자에 존재한다는 가설을 지지한다. 본 발명자들은, 이들 응집된 - 예비-레비 소체 형태의 알파-시누클레인이 타우병리를 유도하는 데 있어서 기여 인자로서 작용할 수 있음을 제안한다(도 8). 요약하자면 본 발명자들은, 알파-시누클레인 응집물(시드)을 중화시킬 수 있는 임의의 알파-시누클레인 항체, 또는 알파-시누클레인 응집물이 신경 세포 또는 신경 교세포에 들어가서 타우의 응집을 촉진하는 것을 방지하는 다른 수단이 타우병증을 치료하기 위한 치료적 잠재성을 가질 것임을 가정한다.
정의
본원에서 이용되는 용어 "알파-시누클레인"은 "알파-시누클레인 단백질"과 동의어이며, 임의의 알파-시누클레인 단백질 이소형을 나타낸다(예를 들어, UniProt에서 P37840, 1~3에서 확인됨). 알파-시누클레인의 아미노산 넘버링을 아래에 나타내는 SEQ ID NO:10에 대해 나타내며, 메티오닌(M)이 아미노산 잔기 1이다:
본 발명은 알파-시누클레인, 특히 인간 알파-시누클레인에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 일 구현예에서는 인간 알파-시누클레인의 아미노산 110~140 내의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 능력을 나타내는 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 이러한 항체는 인간 알파-시누클레인의 아미노산 112~117, 112~115, 118~126, 126~138 또는 136~140 내의 에피토프에 결합한다.
"타우병증"이라는 용어는 전형적으로, 타우의 병리학적 응집과 연관된 신경퇴행성 질병으로서 지칭된다. 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 일차 연령-관련 타우병증(PART), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행, 염색체 연관 파킨슨증, 라이티코-보디그병(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병 및 리포푸신증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 및 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "항체"(Ab)라는 용어는 면역글로불린 분자 또는 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 분자("항원")의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자의 단편을 나타낸다. 자연 발생 항체는 전형적으로 보통 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 이루어지는 사량체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭) 및 보통 3개 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어지는 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄에는 카파 사슬 및 람다 사슬이 포함된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 전형적으로 항원 인식에 관여하는 반면, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 효과기 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"(FR)으로 명명되는 보다 보존된 서열 영역이 분산된, "상보성 결정 영역"으로 명명되는 고가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 도메인 및 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 자연에서 발생할 수 있는 것과 구별되는 물리적 환경에서 존재하기 위해 "단리된" 또는 아미노산 서열이 자연 발생 항체와 상이하도록 변형된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이 특히 관련된다.
본원에서 이용되는 "항체의 에피토프-결합 단편"이라는 용어는 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편을 의미한다. 에피토프-결합 단편은 이러한 항체의 CDR 도메인 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 함유할 수 있고, 이러한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있지만, 이러한 에피토프에 대해 이러한 항체와 상이한 면역특이성, 친화도 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 그러나 바람직하게는, 에피토프-결합 단편은 이러한 항체의 CDR 도메인 6개 모두를 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬(예컨대, scFv)일 수 있거나, 각각 아미노-말단 및 카복실 말단을 갖는, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬일 수 있다(예컨대, 디아바디, Fab 단편, Fab2 단편 등). 에피토프-결합력을 나타내는 항체의 단편은, 예를 들어, 온전한 항체의 프로테아제 절단에 의해 수득될 수 있다. 보다 바람직하게는, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH가 별도 유전자에 의해 인코딩되지만, 이러한 유전자 서열 또는 이들의 인코딩 cDNA는 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 연합하여 1가 에피토프-결합 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조될 수 있도록 하는 가요성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예컨대, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883] 참고). 대안적으로, 단일 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 영역이 함께 연합하도록 하기에 너무 짧은(예컨대, 약 9개 잔기 미만인) 가요성 링커를 채택함으로써, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 유사한 분자를 형성할 수 있다(여기서 2개의 이러한 폴리펩타이드 사슬은 함께 연합하여 2가 에피토프-결합 분자를 형성함)(예를 들어, 디아바디의 설명에 대해서는 문헌[PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)] 참고). 본 발명 내에서 포괄되는 에피토프-결합 단편의 예에는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편, 또는 WO2007059782에 기재된 바와 같은 1가 항체; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 본질적으로 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) 본질적으로 VH 도메인으로 구성되며 또한 도메인 항체로 불리는 dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)])(문헌[Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;2i(ll) :484-90]); (vi) 카멜리드 또는 나노바디(문헌[Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5_(l): l ll-24]) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH가 별도 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 페어링하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해, 연결될 수 있다(단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음, 예를 들어 문헌[Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참고). 본 발명의 맥락에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편이 본원에서 추가로 논의된다. 또한 항체라는 용어에는, 달리 명시되지 않는 한, 또한 항체-유사 폴리펩타이드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지된 기법, 예컨대 효소 절단, 펩타이드 합성, 및 재조합 기법에 의해 제공되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편(항원-결합 단편)이 포함됨이 이해되어야 한다. 생성되는 항체는 임의의 이소형을 보유할 수 있다. 본원에서 이용되는 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 클래스(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)를 나타낸다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적 기법을 이용하여 수득된다; 원하는 에피토프에 결합할 수 있는 적합한 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있다.
항체 GM37, 37 또는 GM37wt(본원에서 호환되어 이용됨)는 CDR1~3 SEQ ID No:1~3에 주어지는 중쇄 및 SEQ ID No:4~6에 주어지는 경쇄 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하려는 것이다.
GM37의 변이체 1, 2 및 3은:
GM37 변이체 1 중쇄 CDR2 SEQ ID NO:33
GM37 변이체 2 중쇄 CDR2 SEQ ID NO:34
GM37 변이체 3 중쇄 CDR2 SEQ ID NO:35
에 주어진 바와 같이 중쇄의 CDR 2 서열에서의 차이(들)에 의해 G37과 상이하다.
항체 GM285 또는 IgG-6004-285(본원에서 호환되어 사용됨)는 CDR1~3 SEQ ID No:20~22에 주어지는 중쇄 및 SEQ ID No:23~25에 주어지는 경쇄 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하려는 것이다.
항체 GM63 또는 63(본원에서 호환되어 사용됨)은 CDR1~3 SEQ ID No:51~53에 주어지는 중쇄 및 SEQ ID No:54~56에 주어지는 경쇄 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하려는 것이다.
항체 9E4는 CDR1~3 SEQ ID No:44~46에 주어지는 중쇄 및 SEQ ID No:47~49에 주어지는 경쇄 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하려는 것이다.
항체 2E6 또는 m2E6은 CDR1~3 SEQ ID No:62~64에 주어지는 중쇄 및 SEQ ID No:65~676에 주어지는 경쇄 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하려는 것이다.
2E6의 변이체, ch2E6, 2E6-HLD1, 2 또는 3은 2E6과 비교하여 CDR 영역 밖의 이들의 중쇄 및 경쇄에서 차이를 가진다.
ch2E6은 중쇄 SEQ ID NO:70을 포함하거나 이로 구성되고, 경쇄 SEQ ID NO:71을 포함하거나 이로 구성된다.
2E6-HLD-1은 중쇄 SEQ ID NO:72를 포함하거나 이로 구성되고, 경쇄 SEQ ID NO:73을 포함하거나 이로 구성된다.
2E6-HLD-2는 중쇄 SEQ ID NO:74를 포함하거나 이로 구성되고, 경쇄 SEQ ID NO:75를 포함하거나 이로 구성된다.
2E6-HLD-3은 중쇄 SEQ ID NO:76을 포함하거나 이로 구성되고, 경쇄 SEQ ID NO:77을 포함하거나 이로 구성된다.
HLD1: 7A10, 5A1, 9D7, 9G11, 7C4, L3, 8D9, 9C12 또는 6B6의 친화도 성숙 형태는 서열 목록 및 청구항에서 정의된 바와 같이 2E6과 비교하여 이들의 CDR 영역에서 차이를 가진다.
항체 "6B6"은 경쇄 SEQ ID NO:120 및 중쇄 SEQ ID NO:121로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "5A1"은 경쇄 SEQ ID NO:104 및 중쇄 SEQ ID NO:105로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "9D7"은 경쇄 SEQ ID NO:106 및 중쇄 SEQ ID NO:107로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "9G11"은 경쇄 SEQ ID NO:108 및 중쇄 SEQ ID NO:109로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "L3"은 경쇄 SEQ ID NO:112 및 중쇄 SEQ ID NO:113으로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "7A10"은 경쇄 SEQ ID NO:114 및 중쇄 SEQ ID NO:115로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "8D9"는 경쇄 SEQ ID NO:116 및 중쇄 SEQ ID NO:117로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "9C12"는 경쇄 SEQ ID NO:118 및 중쇄 SEQ ID NO:119로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
항체 "7C4"는 경쇄 SEQ ID NO:110 및 중쇄 SEQ ID NO:111로 구성된 항체를 의미하려는 것이다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, 이러한 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 IMGT, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 따른다.
상기 언급된 항체는 알츠하이머병 환자, 또는 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 일차 연령-관련 타우병증(PART), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행, 염색체 연관 파킨슨증, 라이티코-보디그병(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병 및 리포푸신증과 같은 타우병증 환자의 치료에 이용될 수 있다. 보다 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
"항-알파-시누클레인 항체"는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인 단편에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본원에서 이용되는 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래되는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하려는 것이다. 본 발명의 인간 항체에는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 또는 생체내 유전자 재배열 동안 또는 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)가 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자 조제물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명의 항체, 및 이들의 알파-시누클레인 에피토프-결합 단편은 바람직하게는, 특히 치료 목적으로 이용된다면 "인간화"될 것이다. "인간화"라는 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린에서 유래되는 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반하는 나머지 면역글로불린 구조를 가지는, 일반적으로 재조합 기법을 이용해서 제조되는 키메라 분자를 나타낸다. 항원-결합 부위는 인간 불변 도메인에 융합된 전체 비-인간 항체 가변 도메인, 또는 인간 가변 도메인의 적절한 인간 프레임워크 영역에 그래프팅된 이러한 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 이러한 인간화 분자의 프레임워크 잔기는 야생형일 수도 있고(예컨대, 완전 인간) 또는 이들은 그 서열이 인간화를 위한 기본으로 작용한 인간 항체에서 확인되지 않는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 변형될 수도 있다. 인간화는 분자의 불변 영역이 인간 개체에서 면역원으로서 작용할 가능성을 경감시키거나 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성은 남아 있다(문헌[LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224]). 다른 접근은 인간-유래 불변 영역을 제공할 뿐만 아니라 이들을 최대한 인간 형태에 가깝게 재형상화하기 위해 가변 영역도 변형하는 데 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역은 주어진 종에서 비교적 보존되고 CDR에 대한 골격을 제공하는 것으로 추정되는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 인접하는, 관심 항원에 대해 반응하여 변하며 결합능을 결정하는 3개의 상보성-결정 영역(CDR)을 함유하는 것으로 알려져 있다. 특정 항원에 대해 비인간 항체가 제조되는 경우, 가변 영역은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비인간 항체에서 유래되는 CDR을 그래프팅하여 "재형상화" 또는 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 상기 접근의 적용은 문헌[Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154]에 보고되었다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 모든 6개 CDR을 함유하는 인간화 마우스 항체). 다른 구현예에서, 인간화 항체는 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"에서 유래되는" 하나 이상의 CDR로도 명명되는, 원래 항체에 대해 변경되는 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 갖는다. 항원을 인간화하는 능력은 널리 공지되어 있다(예컨대, US 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557 참고).
본원에서 이용되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 항원-결합 단편은 이것이 대안적 에피토프 대비 해당 에피토프와 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도 또는 결합력으로 반응하거나 연합하는 경우, 다른 분자의 영역(즉, 에피토프)과 "면역특이적으로" 결합하는 것으로 언급된다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 항원-결합 단편은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음이 이해된다. 본원에서 이용되는 소정 항원에 대한 항체 결합의 맥락에서의 "결합"이라는 용어는, 예를 들어 리간드로서 항원을 및 분석물질로서 항체를 이용하는 BIAcore® 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정되는 경우, 전형적으로 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하의 KD에 대응하는 친화도를 갖는 결합을 나타내며, 소정 항원 또는 가깝게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예컨대, BSA, 카제인)으로의 결합에 대한 그 친화도보다 적어도 10배 미만, 예컨대 적어도 100배 미만, 예를 들어 적어도 1,000배 미만, 예컨대 적어도 10,000배 미만, 예를 들어 적어도 100,000배 미만인 KD에 대응하는 친화도로 소정 항원에 결합한다. 친화도가 더 낮은 양은 항체의 KD에 의존하며, 이에 따라 항체의 KD가 매우 낮은(즉, 항체가 매우 특이적인) 경우, 비특이적 항원에 대한 친화도보다 항원에 대한 친화도가 더 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다.
본원에서 이용되는 "kd"(초-1 또는 1/s)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 상기 값은 koff값으로도 불린다.
본원에서 이용되는 "ka"(M-1×초-1 또는 1/M)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 연합 속도 상수를 나타낸다.
본원에서 이용되는 "KD"(M)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타낸다.
본원에서 이용되는 "KA"(M-1 또는 1/M)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 연합 평형 상수를 나타내며, ka를 kd로 나누어 수득된다.
일부 항체에서, CDR의 일부, 즉 SDR로 명명되는, 결합을 위해 요구되는 CDR 잔기의 서브세트만이 인간화 항체에서 결합을 보유하기 위해 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR에 있지 않는 CDR 잔기는 이전 연구(예를 들어 CDR H2에서의 잔기 H60~H65가 종종 요구되지 않음)에 기반하여 Chothia 고가변 루프 밖에 놓인 Kabat CDR 영역으로부터(문헌[Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917] 참고), 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로, 또는 문헌[Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity," Mol. Immunol. 41:863-872]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 이러한 인간화 항체에서, 하나 이상의 공여체 CDR 잔기가 부재하거나 전체 공여체 CDR이 생략되는 위치에서, 그 위치를 점유하는 아미노산은 수신체 항체 서열에서 대응하는 위치(Kabat 넘버링에 의해)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함될 CDR에서의 공여체 아미노산에 대한 수신체의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 밸런스를 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고 이에 따라 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도 변화를 유도할 수 있고, 친화도의 현저한 감소가 바람직하게 회피된다. CDR 내의 치환 위치 및 치환할 아미노산은 또한 실험적으로 선택될 수 있다.
CDR 잔기의 단일 아미노산 변경이 기능적 결합의 손실을 일으킬 수 있다는 사실(문헌[Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983])은 대안적인 기능적 CDR 서열의 체계적 확인 수단을 제공한다. 이러한 변이체 CDR을 수득하기 위한 하나의 바람직한 방법에서, CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 돌연변이되어(예를 들어 무작위 돌연변이화를 통해 또는 부위-지정 방법(예컨대, 돌연변이된 유전자위를 인코딩하는 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄-매개 증폭)에 의해) 치환된 아미노산 잔기를 갖는 CDR을 제조한다. 원래의 (기능적) CDR 서열에서 관련 잔기의 정체를 치환된(비기능적) 변이체 CDR 서열의 정체와 비교함으로써, 그 치환에 대한 BLOSUM62.iij 치환 스코어가 확인될 수 있다. BLOSUM 시스템은 신뢰되는 정렬을 위해 서열 데이터베이스를 분석하여 생성되는 아미노산 치환 매트릭스를 제공한다(문헌[Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol. 219, 555-565]). 현재, 가장 진보된 BLOSUM 데이터베이스는 BLOSUM62 데이터베이스(BLOSUM62.iij)이다. 표 1은 BLOSUM62.iij 치환 스코어를 제공한다(스코어가 높을수록 치환이 더 보존적이며, 이에 따라 치환이 기능에 영향을 미치지 않을 가능성이 더 높다). 예를 들어, 생성되는 CDR을 포함하는 항원-결합 단편이 ROR1에 결합하지 못하는 경우, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 불충분하게 보존적인 것으로 간주되고, 더 높은 치환 스코어를 갖는 새로운 후보 치환이 선택되어 제조된다. 따라서 예를 들어, 원래 잔기가 글루타메이트(E)이고, 비-기능적 치환 잔기가 히스티딘(H)인 경우, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 0일 것이고, 보다 보존적인(예컨대 아스파르테이트, 아스파라긴, 글루타민, 또는 라이신으로의) 변화가 바람직하다.
[표 1]
따라서 본 발명은 개선된 CDR을 확인하기 위한 무작위 돌연변이화의 이용을 고려한다. 본 발명의 맥락에서, 보존적 치환은 다음 3개 표 중 하나 이상에서 반영되는 아미노산 클래스 내의 치환에 의해 정의될 수 있다.
[표 2]
[표 3]
[표 4]
보다 보존적인 치환 그룹에는 발린-류신-이소류신, 페닐알리닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이 포함된다.
아미노산의 추가 그룹은 또한, 예컨대 문헌[Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W. H. Freeman and Company]에 기재된 원리를 이용하여 제형화될 수 있다.
파지 디스플레이 기술이 CDR 친화도를 증가시키기 위해(또는 감소시키기 위해) 대안적으로 이용될 수 있다. 친화도 성숙으로 불리는 상기 기술은 돌연변이화 또는 "CDR 워킹"을 채택하며 재선택은 최초 또는 모체 항체와 대비되는 경우, 항원에 대해 더 높은(또는 더 낮은) 친화도로 결합하는 CDR을 갖는 항체를 확인하기 위해 표적 항원 또는 이의 항원성 항원-결합 단편을 이용한다(예컨대, 문헌[Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903] 참고). 단일 뉴클레오티드가 아닌 전체 코돈의 돌연변이화는 아미노산 돌연변이의 반-무작위화 레퍼토리를 생성한다. 라이브러리는 단일 CDR에서 단일 아미노산 변경에 의해 상이하며 각각의 CDR 잔기에 대한 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유하는 각각의 변이체 클론의 풀로 구성되어 구축될 수 있다. 항원에 대해 증가된(또는 감소된) 결합 친화도를 갖는 돌연변이체는 고정화된 돌연변이체를 표지된 항원과 접촉시켜 스크리닝될 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 스크리닝 방법이 항원에 대해 증가되거나 감소된 친화도를 갖는 돌연변이체 항체를 확인하기 위해 이용될 수 있다(예컨대, ELISA)(문헌[Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994] 참고). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹이 가능하게 이용될 수 있다(문헌[Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551] 참고).
이러한 친화도 성숙을 달성하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌[Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144; 및 Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034]에 기재되어 있다.
따라서, 포괄된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 CDR 변이체의 서열은 치환; 예를 들어, 치환된 4개 아미노산 잔기, 3개 아미노산 잔기, 2개 아미노산 잔기 또는 1개 아미노산 잔기를 통해 모체 항체의 CDR의 서열과 상이할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, CDR 영역에서의 아미노산이 상기 3개 표에 정의된 바와 같은, 보존적 치환으로 치환될 수 있음이 또한 고려된다. 예를 들어, 산성 잔기 Asp는 항체의 결합 특징에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 Glu로 치환될 수 있다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 면역특이적 결합을 할 수 있는 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹핑으로 구성되고, 통상 특이적인 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 형태(conformational) 및 비형태(nonconformational) 에피토프는, 변성 용매의 존재 시 비형태 에피토프에의 결합은 그렇지 않지만 형태 에피토프에의 결합은 상실된다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우세 구성성분으로도 불림), 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적으로 항원 결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 잔기는 특이적으로 항원 결합 펩타이드의 풋프린트 내에 존재함)를 포함할 수 있다.
"트랜스제닉 비-인간 동물"이라는 용어는 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스유전자 또는 트랜스염색체(동물의 천연 게놈 DNA 내에 통합되거나 통합되지 않음)를 갖고 전장 인간 항체를 발현할 수 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스유전자 및 인간 중쇄 트랜스유전자 또는 인간 중쇄 트랜스염색체를 가질 수 있으며, 따라서 이러한 마우스는 알파-시누클레인 항원 및/또는 알파-시누클레인을 발현하는 세포로 면역화될 때 인간 항-알파-시누클레인 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스유전자는 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스, 예컨대 HCo7 또는 HCol2 마우스의 경우에서와 같이 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있거나, 인간 중쇄 트랜스유전자는 WO02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스크로모조말(transchromosomal) KM 마우스의 경우에서와 같이 염색체외에서 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조말 마우스(본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 통칭됨)는 V-D-J 재조합 및 이소형 스위칭을 수행함으로써, 주어진 항원에 대한 인간 모노클로날 항체의 다수의 이소형(예컨대 IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)을 생성할 수 있다.
트랜스제닉, 비인간 동물은 또한, 이러한 특이적인 항체를 인코딩하는 유전자를 도입함으로써, 예를 들어 동물의 젖에서 발현되는 유전자에 유전자를 작동적으로 연결함으로써 특이적인 항원에 대한 항체의 생성에 사용될 수 있다.
본원에서 이용되는 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 질환 또는 장애의 진행 또는 중증도의 완화, 지연 또는 역전, 또는 이러한 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 부작용의 완화, 지연 또는 역전을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, "치료" 또는 "치료하는"은 추가로 유익하거나 요망되는 임상 결과를 수득하기 위한 접근을 의미하며, 여기서, "유익하거나 요망되는 임상 결과"에는 비제한적으로, 부분적이건 전체적이건, 검출 가능하건 검출 불가능하건 무관하게, 증상의 경감, 장애 또는 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않은) 질환 또는 장애 상태, 질환 또는 장애 상태의 진행 지체 또는 지연, 질환 또는 장애 상태의 완화 또는 억제, 및 질환 또는 장애의 차도가 포함된다.
본 발명의 항체에 적용되는 경우 "유효량"은 필요한 투여량 및 시기 동안, 비제한적으로 임상 결과를 포함하는 의도되는 생물학적 효과 또는 요망되는 치료 결과를 달성하기 위해 충분한 양을 나타낸다. 본 발명의 항체에 적용되는 경우 "치료 유효량"이라는 어구는 장애 또는 질환 상태의, 또는 장애 또는 질환 증상의 진행 완화, 억제, 안정화, 역전, 지연 또는 지체를 위해 충분한, 항체의 양을 표시하려는 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 다른 화합물과의 조합으로, 항체의 투여를 제공한다. 이러한 경우, "유효량"은 의도되는 생물학적 효과를 유도하기 충분한 조합의 양이다.
본 발명의 항-알파-시누클레인 항체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요인, 및 항-알파-시누클레인 항체가 개체에서 요망되는 반응을 일으키는 능력에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 치료적으로 유익한 효과가 능가하는 양이다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 특히 인간 알파-시누클레인의 아미노산 110~140 내의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 항체는 알파-시누클레인의 112~117 에피토프로의 결합에 대해 항체 GM37과 경쟁할 수 있다. 또 다른 구현예에서 항체는 알파-시누클레인의 112~115 에피토프에 결합하기 위해 항체 GM285와 경쟁할 수 있으며, 또 다른 구현예에서 항체는 알파-시누클레인의 126~138 에피토프에 결합하기 위해 항체 GM63과 경쟁할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 알파-시누클레인의 126~140 에피토프에 결합하기 위해 항체 2E6과 경쟁할 수 있다. 보다 다른 구현예에서, 항체는 알파-시누클레인의 118~126 에피토프에 결합하기 위해 항체 9E4와 경쟁할 수 있다.
항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 항체는 청구항에서 더 정의된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료 유효량을, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 타우 다발(Tau tangle) 형성을 감소시키는 방법을 제공한다.
나아가, 항체는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 안정화제와 함께 조성물에 존재할 수 있다. 본 발명의 항체는 치료법에 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 항체는 타우병증의 치료에 이용될 수 있다. 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 일차 연령-관련 타우병증(PART), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행, 염색체 연관 파킨슨증, 라이티코-보디그병(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병 및 리포푸신증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 및 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상으로부터 선택될 수 있다.
치료는 만성일 수 있고, 환자는 적어도 2주, 예컨대 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 치료받을 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어 문헌[Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 최초 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되는 모노클로날 항체일 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 적합한 원천으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체는, 예를 들어, 표면 상에 항원, 또는 관심 항원을 인코딩하는 핵산을 발현하는 세포 형태로, 관심 항원으로 면역화된 마우스로부터 수득되는 쥐과 비장 B 림프구 세포로부터 제조되는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유류, 예컨대 래트, 토끼, 개, 양, 염소, 영장류 등의 항체-발현 세포에서 유래되는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 알파-시누클레인에 대해 유도되는 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조말 마우스에는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 불리는 마우스가 포함되고, 본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 통칭된다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ 및 K 사슬 유전자위를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 및 불변(μ 및 Y) 및 경쇄 가변 및 불변(K) 사슬 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자위를 함유한다(문헌[Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)]). 따라서, 이러한 마우스는 마우스 IgM 또는 IgK의 감소된 발현을 나타내며, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자가 클래스 스위치 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgG, κ 모노클로날 항체를 생성한다(Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌; 문헌[Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) 및 Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)]에서 리뷰로 다뤄짐). HuMAb 마우스의 제조는 문헌[Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 상세히 기재되어 있다. 또한, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187을 참고한다.
HCo7 마우스는 이의 내인성 경쇄(카파) 유전자에 JKD 손상(문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기재됨), 이의 내인성 중쇄 유전자에 CMD 손상(disruption)(WO 01/14424의 실시예 1에 기재됨), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스유전자(문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재됨), 및 HCo7 인간 중쇄 트랜스유전자(US 5,770,429에 기재됨)를 갖는다.
HCol2 마우스는 이들의 내인성 경쇄(카파) 유전자에 JKD 손상(문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기재된 바와 같음), 이들의 내인성 중쇄 유전자(WO 01/14424의 실시예 1에 기재된 바와 같음), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스유전자(문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같음) 및 HCol2 인간 중쇄 트랜스유전자(WO 01/14424의 실시예 2에 기재된 바와 같음)에 CMD 손상을 가진다.
KM 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었고 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었다. 상기 마우스 계통은 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자, KCo5를 수반한다. 상기 마우스 계통은 또한 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체 14 단편 hCF(SC20)로 이루어진 인간 중쇄 트랜스염색체를 수반한다.
이러한 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포는 널리 공지된 기법에 따라 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 인간 모노클로날 항체, 또는 다른 종에서 유래되는 본 발명의 항체는 또한 관심 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 트랜스제닉인 다른 비-인간 포유류 또는 식물의 생성 및 이로부터 회수 가능한 형태로의 항체 제조를 통해 트랜스유전자를 이용해서 생성될 수 있다. 포유류에서의 트랜스제닉 제조에 관해, 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유류의 모유에서 제조되고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 및 US 5,741,957을 참고한다.
본 발명의 항체는 임의의 이소형일 수 있다. 이소형의 선택은 전형적으로 요망되는 효과기 기능, 예컨대 ADCC 유도에 의해 가이드될 것이다. 예시적 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다가 이용될 수 있다. 요망되는 경우, 본 발명의 항-알파-시누클레인 항체의 클래스는 공지된 방법에 의해 스위치될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이던 본 발명의 항체는 본 발명의 IgG 항체로 클래스 스위치될 수 있다. 또한, 클래스 스위칭 기법은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 서브클래스로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 효과기 기능은, 예컨대, 다양한 치료 용도를 위해 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체로의 이소형 스위칭에 의해 변화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체, 예를 들어 IgG1, κ이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 특히 IgG1, κ 항체이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
항체 단편은, 예컨대 통상적 기법을 이용하여 단편화에 의해 수득될 수 있고, 이러한 단편은 전체 항체에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 생성되는 F(ab')2 단편은 이황화 가교를 환원시키도록 처리되어 Fab' 단편을 제조할 수 있다. Fab 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리하여 수득될 수 있다; Fab' 단편은 IgG 항체의 펩신 소화로 수득될 수 있다. F(ab') 단편은 또한 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 후술되는 Fab'의 결합에 의해 제조될 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 절단하여 수득되는 항체 단편이다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편을 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리하여 수득될 수 있다. 항체 단편은 또한 재조합 세포에서 이러한 단편을 인코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)] 참고). 예를 들어, F(ab')2 단편 부분을 인코딩하는 키메라 유전자에는 CH1 도메인 및 H 사슬의 힌지 영역을 인코딩하는 DNA 서열에 이어, 번역 중지 코돈이 포함되어, 이러한 절단된 항체 단편 분자를 산출할 수 있다.
하나의 구현예에서, 항-알파-시누클레인 항체는 1가 항체, 바람직하게는 힌지 영역이 결실된 WO2007059782(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 1가 항체이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 1가 항체이며, 여기서 상기 항-알파-시누클레인 항체는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 구축된다: i) 상기 1가 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로, 상기 구축물은 선택된 항원 특이적 항-알파-시누클레인 항체의 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 선택된 항원 특이적 항체의 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동 가능하게 연결되고, IgG1 서브타입의 경우, CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 CL 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 또는 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 CL 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 이황화 결합 또는 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산을 함유하지 않도록 변형되는 단계; ii) 상기 1가 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로, 상기 구축물은 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Ig의 불변 CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 힌지 영역에 대응하는 영역, 및 Ig 서브타입에 의해 요구되는 바에 따라 CH 영역의 다른 영역, 예컨대 CH3 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 또는 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 인간 Ig의 CH 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 이황화 결합 또는 공유 또는 안정한 비-공유 중쇄-간 결합의 형성에 참여하는 임의의 아미노산 잔기를 함유하지 않도록 변형되며, 상기 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동 가능하게 연결되는 단계; iii) 상기 1가 항체를 제조하기 위한 세포 발현 시스템을 제공하는 단계; iv) (iii)의 세포 발현 시스템의 세포에서 (i) 및 (ii)의 핵산 구축물을 공동 발현하여 상기 1가 항체를 제조하는 단계.
유사하게, 하나의 구현예에서, 항-알파-시누클레인 항체는 다음을 포함하는 1가 항체이다:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 영역 또는 상기 영역의 항원-결합 부분, 및
(ii) 면역글로불린의 CH 영역 또는 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이의 항원-결합 단편으로서, CH 영역 및 이의 항원-결합 단편은 힌지 영역에 대응하는 영역, 및 면역 글로불린이 IgG4 서브타입이 아닌 경우, CH 영역의 다른 영역, 예컨대 CH3 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 동일한 CH 영역과 이황화 결합 또는 동일한 CH 영역과 다른 공유 또는 안정한 비-공유 중쇄간 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않도록 변형된 영역.
추가 구현예에서, 1가 항-알파-시누클레인 항체의 중쇄는 전체 힌지가 결실되도록 변형되었다.
다른 추가 구현예에서, 상기 1가 항체의 서열은 이것이 N-연결 글리코실화를 위한 임의의 수신체 부위를 포함하지 않도록 변형되었다.
본 발명의 항-알파-시누클레인 항체에는 또한 단일쇄 항체가 포함된다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 단일쇄 Fv(scFv)를 제공하며, 여기서 본 발명의 항-알파-시누클레인 항체의 Fv 내 중쇄 및 경쇄는 단일 펩타이드 사슬에서 가요성 펩타이드 링커(전형적으로 약 10, 12, 15개 이상의 아미노산 잔기)로 연결된다. 이러한 항체의 제조 방법은, 예를 들어 문헌[US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)]에 기재되어 있다. 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL만 이용되는 경우 1가, 2개의 VH 및 VL이 이용되는 경우 2가, 또는 2개를 초과하는 VH 및 VL이 이용되는 경우 다가일 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재되는 항-알파-시누클레인 항체는 임의의 적합한 수의 변형된 아미노산의 도입 및/또는 이러한 공액된 치환제와의 연합에 의해 변형될 수 있다. 상기 맥락에서의 적합성은 일반적으로 비-유도체화된 모체 항-알파-시누클레인 항체와 연관되는 알파-시누클레인 선택성 및/또는 항-알파-시누클레인 특이성을 적어도 실질적으로 보유하는 능력에 의해 결정된다. 하나 이상의 변형된 아미노산의 도입은, 예를 들어, 폴리펩타이드 혈청 반감기의 증가, 폴리펩타이드 항원성의 감소, 또는 폴리펩타이드 보관 안정성의 증가에서 유리할 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합적 제조 동안 번역과 함께 또는 번역 후에 변형(예컨대, 포유류 세포에서 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 글리코실화)되거나 합성 수단에 의해 변형된다. 변형된 아미노산의 비제한적 예에는 글리코실화 아미노산, 황산화 아미노산, 프레닐화(예컨대, 파네실화, 게라닐게라닐화) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 아실화 아미노산, PEG화 아미노산, 바이오틴화 아미노산, 카복실화 아미노산, 인산화 아미노산 등이 포함된다. 아미노산의 변형에서 당업자를 가이드하기 적절한 참고문헌은 문헌을 통해 제공된다. 예시적 프로토콜은 문헌[Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ]에서 확인된다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 바이오틴화 아미노산, 지질 모이어티에 공액된 아미노산, 또는 유기 유도체화제에 공액된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
항-알파-시누클레인 항체는 또한, 예를 들어 이의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 공액에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적 중합체, 및 이를 펩타이드에 부착하는 방법은, 예를 들어 US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 및 US 4,609,546에 예시된다. 추가적인 예시적 중합체에는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예컨대, 분자량 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2,000 내지 약 20,000, 예컨대 약 3,000~12,000 g/mol을 갖는 PEG)이 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은
- 본원에서 정의된 바와 같은 항-알파-시누클레인 항체, 및
- 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 통상적 기법에 따른 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제, 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2005]에 개시된 것들과 함께 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제는 본 발명의 선택된 화합물 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 약학적 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 본 발명의 선택된 화합물 또는 약학적 조성물의 요망되는 생물학적 특성에 대한 현저한 부정적 영향의 부재(예컨대, 항원 결합에 대한 실질적 영향 미만(10% 이하 상대 억제, 5% 이하 상대 억제 등))에 기반하여 결정된다.
본 발명의 약학적 조성물에는 또한 희석제, 충전에, 염, 완충제, 세제(예컨대, 비이온성 세제, 예컨대 Tween-20 또는 Tween-80), 안정화제(예컨대, 당 또는 단백질-비함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 약학적 조성물 내 도입에 적합한 다른 물질이 포함될 수 있다. 희석제는 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학적 조성물 또는 제형물에는 또한 다른 담체, 또는 무독성, 비치료, 비-면역원성 안정화제 등이 포함될 수 있다. 조성물에는 또한 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 예컨대 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예컨대, 라텍스 작용화 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 액체 응집물(예컨대, 오일 액적 또는 리포좀)이 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 채택되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 채택되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 다른 약물, 채택되는 특정 조성물과 병용되는 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 등 의학 분야에 널리 공지된 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 근거할 것이다.
약학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 비경구, 국소, 경구 또는 비강내 수단을 포함하는 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여된다. 본원에서 이용되는 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이라는 어구는 보통 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 낭내, 안구내, 심장내, 피내, 복강내, 힘줄내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 두개내, 흉강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
생체내 및 시험관내 본 발명의 화합물 투여의 추가적인 적합한 경로는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
약학적으로 허용 가능한 담체에는 본 발명의 화합물과 생리적으로 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 채택될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 및 참기름, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트래거캔스 고무 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충액이 포함된다. 다른 담체는 약학 분야에 널리 공지되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 이용은 당분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 이용이 고려된다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 비설페이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페놀 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 조성물에 등장화제, 예컨대 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 나트륨 클로라이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 선택된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 아주반트, 예컨대 보존제, 수화제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 함유할 수 있고, 이는 약학적 조성물의 보관 수명 또는 효과를 증강시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형물로 제조될 수 있다. 이러한 담체에는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다중무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 단독으로 또는 왁스 또는 당분야에 널리 공지된 다른 물질과 함께 포함될 수 있다. 이러한 제형물의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 이용은 당분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 이용이 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 내로 포함될 수 있다.
주사용 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로-에멀젼, 리포좀, 또는 다른 규칙화된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질, 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 여러 경우에서, 바람직하게는 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시켜 일으킬 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 성분, 예컨대 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 포함시킨 후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 요구되는 다른 성분, 예컨대 상기 열거된 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 포함시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중 요구되는 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 포함시킨 후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
상기 치료 및 이용 방법에서의 투여량 요법은 최적의 요망되는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 시사되는 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 이용되는 투여량 단위 형태는 치료받을 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적 개별 단위를 나타낸다; 각각의 단위는 요구되는 약학적 담체와 연합되어 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 사양은, (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성 치료를 위한 이러한 활성 화합물 배합 분야에 내재적인 제한에 의해 지정되고, 이에 직접 의존한다.
항 알파-시누클레인 항체에 대한 유효 투여량 및 투여량 요법은 치료될 질환 또는 상태에 의존하며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량이 주어지는 임의의 주어진 날에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg, 및 보다 일반적으로 약 0.01 내지 약 5 mg/kg 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/체중kg 또는 10 mg/체중kg 또는 1~10 mg/체중kg 범위 내일 수 있다. 따라서 예시적인 투여량에는 약 0.1 내지 약 10 mg/kg/체중, 약 0.1 내지 약 5 mg/kg/체중, 약 0.1 내지 약 2 mg/kg/체중, 약 0.1 내지 약 1 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.15 mg/kg/체중, 약 0.2 mg/kg/체중, 약 0.5 mg/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 1.5 mg/kg/체중, 약 2 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 또는 약 10 mg/kg/체중이 포함된다.
당분야의 일반 숙련도를 갖는 의사 또는 수의사는 요구되는 약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준에서 약학적 조성물에 채택되는 항-알파-시누클레인 항체 용량으로 시작하고 요망되는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 전술된 요인에 근거할 것이다. 투여는, 예컨대, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하일 수 있고, 예를 들어 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 요망되는 경우, 약학적 조성물의 유효 1일 용량은 선택적으로 단위 투여량 형태로, 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 별도 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 하위용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독 투여될 수 있지만, 화합물을 전술된 바와 같은 약학적 조성물로 투여하는 것이 바람직하다.
Figure 112019063425341-pct00006
Figure 112019063425341-pct00007
Figure 112019063425341-pct00008
본 발명의 추가의 구현예
1. 타우의 응집을 억제하는 데 사용하기 위한 알파-시누클레인 결합 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 항목 1에 있어서, 항체가, 응집된 가용성 형태의 알파-시누클레인에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 타우 응집의 억제가 생체내 또는 시험관내에서인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가 알츠하이머병 환자에게 투여되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 환자가 알츠하이머병의 레비 소체 변이 또는 복합 파킨슨 및 알츠하이머병을 갖지 않는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 일차 연령-관련 타우병증(PART), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행, 염색체 연관 파킨슨증, 라이티코-보디그병(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병 및 리포푸신증을 포함하는 군으로부터 선택되는 타우병증 환자에게 투여되고; 보다 전형적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가 알파-시누클레인의 C-말단부에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
8. 항목 7에 있어서, 항체가 인간 알파-시누클레인의 C-말단 아미노산 110~140 내의 에피토프에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
9. 항목 7 또는 8에 있어서, 상기 에피토프가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 아미노산 112~117, 112~115, 118~126, 126~138 또는 136~140 내에 존재하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 항체가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 아미노산 112~117(SEQ ID NO:9(ILEDMP)) 내의 에피토프에 결합하는, 모노클로날 항체, 또는 상기 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO:8의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:7 , 30, 31 또는 32의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 상기 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 항체가 아미노산 112~115(인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 SEQ ID NO:19(ILED)) 내의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체, 또는 상기 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO:26의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 상기 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
14. 항목 9에 있어서, 상기 항체가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 아미노산 118~126(예컨대 SEQ ID NO:36(NEAYE)) 내의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 상기 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편.
15. 항목 9에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO:42의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:43의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 상기 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
16. 항목 9에 있어서, 상기 항체가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 아미노산 126~138(SEQ ID NO:50(EMPSEEGYQD YEP)) 내의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 상기 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편.
17. 항목 9에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO:57의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:58의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 상기 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
18. 항목 9에 있어서, 상기 항체가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID NO:10)의 아미노산 126~140(SEQ ID NO:61(EMPSEEGYQD YEPEA)) 내의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 상기 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편.
19. 항목 18에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO:68의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:69의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 상기 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 온전한 항체를 포함하거나 이로 구성되는, 모노클로날 항체.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 모노클로날 항체가 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 모노클로날 항체
22. 항목 1 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, Fv 단편(예를 들어 단일쇄 Fv 및 이황화-결합 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체(예를 들어 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
23. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 하기 특성들:
a) 알파-시누클레인에 대한 0.5~10 nM, 예컨대 1~5 nM 또는 1~2 nM에서의 결합 친화도(KD);
b) 알파-시누클레인 원섬유의 프로테아제 절단을 억제시키는 능력;
c) F28-snca 트랜스제닉 마우스에서 기저 시냅스 전달의 손상을 역전시키는 능력;
d) 생체내 미세투석에 의해 측정된 바와 같이 마우스 해마에서 알파-시누클레인의 수준을 감소시키는 능력;
e) 파킨슨병의 래트 모델에서 만성 투여 시, 운동 기능을 회복시키는 능력;
f) 알파-시누클레인의 접종(예컨대 파킨슨병의 시험관내 및/또는 마우스 모델에서 불용성 인산화된 알파시누클레인의 축적)을 방지하는 능력; 및/또는
g) 인간 뇌 내의 절단된 알파-시누클레인에 결합하는 능력
중 하나 이상을 나타내는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
24. 항목 1 내지 23 중 어느 한 항목에 있어서, 인간, 인간화, 재조합 또는 키메라 항체인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
25. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 이의 단편이:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
26. 항목 25에 있어서, SEQ ID NO:7의 중쇄 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:8의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
27. 항목 25에 있어서, SEQ ID NO:7의 가변 도메인으로 구성된 중쇄 및 SEQ ID NO:8의 가변 도메인으로 구성된 경쇄를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
28. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 이의 단편이:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
29. 항목 28에 있어서, SEQ ID NO:30의 중쇄 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:8의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
30. 항목 28에 있어서, SEQ ID NO:30의 가변 도메인으로 구성된 중쇄 또는 SEQ ID NO:8의 가변 도메인으로 구성된 경쇄를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
31. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 이의 단편이:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
32. 항목 31에 있어서, SEQ ID NO:31의 중쇄 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:8의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
33. 항목 31에 있어서, SEQ ID NO:31의 가변 도메인으로 구성된 중쇄 및 SEQ ID NO:8의 가변 도메인으로 구성된 경쇄를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
34. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 이의 단편이:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
35. 항목 34에 있어서, SEQ ID NO:32의 중쇄 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:8의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
36. 항목 34에 있어서, SEQ ID NO:32의 가변 도메인으로 구성된 중쇄 및 SEQ ID NO:8의 가변 도메인으로 구성된 경쇄를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
37. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 항체 또는 이의 단편이:
(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
38. 항목 37에 있어서, SEQ ID NO:26의 중쇄 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
39. 항목 37에 있어서, SEQ ID NO:26의 가변 도메인으로 구성된 중쇄 및 SEQ ID NO:27의 가변 도메인으로 구성된 경쇄를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
40. 항목 1 내지 9 및 항목 16 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
(a) SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
41. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:57의 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NO:58의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
42. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:57의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:58의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
43. 항목 1 내지 9 및 항목 14 내지 15 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
(a) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
44. 항목 43에 있어서, SEQ ID NO:42의 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NO:43의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
45. 항목 43에 있어서, SEQ ID NO:42의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:43의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
46. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:94 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
47. 항목 46에 있어서, SEQ ID NO:94, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
48. 항목 46 또는 47에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:97 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:63 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:64 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
49. 항목 48에 있어서, SEQ ID No:97, 63 및 64의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
50. 항목 46 또는 47에 있어서, SEQ ID NO:110의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
51. 항목 48 또는 49에 있어서, SEQ ID NO:111의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
52. 항목 50 및 51에 있어서, SEQ ID NO:110의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:111의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
53. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:95 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
54. 항목 53에 있어서, SEQ ID NO:95, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
55. 항목 53 또는 54에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:63 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:103 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
56. 항목 55에 있어서, SEQ ID NO:62, 63 및 103의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
57. 항목 53 또는 54에 있어서, SEQ ID NO:114의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
58. 항목 55 또는 56에 있어서, SEQ ID NO:115의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
59. 항목 57 및 58에 있어서, SEQ ID NO:114의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:115의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
60. 항목 53 또는 54에 있어서, SEQ ID NO:116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
61. 항목 55 및 56에 있어서, SEQ ID NO:117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
62. 항목 60 및 61에 있어서, SEQ ID NO:116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
63. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:65 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:96 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
64. 항목 63에 있어서, SEQ ID NO:65, 66 및 96의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
65. 항목 63 또는 64에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:63 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:64 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
66. 항목 65에 있어서, SEQ ID NO:62, 63 및 64의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
67. 항목 63 또는 64에 있어서, SEQ ID NO:112의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
68. 항목 65 또는 66에 있어서, SEQ ID NO:113의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
69. 항목 67 및 68에 있어서, SEQ ID NO:112의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:113의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
70. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:65 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
71. 항목 70에 있어서, SEQ ID NO:65, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
72. 항목 70 또는 71에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:98 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:101 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
73. 항목 72에 있어서, SEQ ID NO:62, 98 및 101의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
74. 항목 70 또는 71에 있어서, SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
75. 항목 72 또는 73에 있어서, SEQ ID NO:105의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
76. 항목 74 및 75에 있어서, SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:105의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
77. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:65 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
78. 항목 77에 있어서, SEQ ID NO:65, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
79. 항목 77 또는 78에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:99 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:64 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편
80. 항목 79에 있어서, SEQ ID NO:62, 99 및 64의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
81. 항목 77 또는 78에 있어서, SEQ ID NO:108의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
82. 항목 79 또는 80에 있어서, SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
83. 항목 81 및 82에 있어서, SEQ ID NO:108의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
84. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:65 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
85. 항목 84에 있어서, SEQ ID NO:65, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
86. 항목 84 또는 85에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:100 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:64 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편
87. 항목 86에 있어서, SEQ ID NO:62, 100 및 64의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
88. 항목 84 또는 85에 있어서, SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
89. 항목 86 또는 87에 있어서, SEQ ID NO:119의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
90. 항목 88 및 89에 있어서, SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:119의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
91. 항목 1 내지 9 및 항목 18 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알파-시누클레인 항체가:
o SEQ ID NO:65 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:66 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:67 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
92. 항목 91에 있어서, SEQ ID NO:65, 66 및 67의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
93. 항목 91 또는 92에 있어서, 하기 CDR:
o SEQ ID NO:62 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
o SEQ ID NO:63 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 및
o SEQ ID NO:102 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
94. 항목 93에 있어서, SEQ ID NO:62, 63 및 102의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
95. 항목 91 또는 92에 있어서, SEQ ID NO:106의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
96. 항목 93 또는 94에 있어서, SEQ ID NO:107의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
97. 항목 95 또는 96에 있어서, SEQ ID NO:106의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:107의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
98. 항목 25 내지 97 중 어느 한 항목에 따른 항체 또는 단편을 인코딩하는 핵산.
99. 항목 1 내지 98 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
100. 대상체에서 항목 5 또는 6에 따른 질병을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 97 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
101. 항목 100에 있어서, 치료가 만성인, 방법.
102. 항목 101에 있어서, 만성 치료가 적어도 2주 동안인, 방법.
103. 항목 100에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
104. 항목 100에 따른 방법에 사용하기 위한, 항목 1 내지 97 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
105. 항목 5 또는 6에 있어서, 항목 1 내지 97 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체가 검출 가능하게 표지된 것인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
106. 항목 105에 있어서, 상기 검출 가능한 표지가 형광 표지, 화학발광 표지, 상자성 표지, 방사성 동위원소 표지 또는 효소 표지인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
107. 항목 105 또는 106에 있어서, 대상체의 뇌 또는 임의의 다른 기관 또는 체액에서 상기 알파-시누클레인의 존재 또는 양을 검출하거나 측정하는 데 사용하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
108. 항목 105 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 알파-시누클레인에 결합된 상기 항-시누클레인 항체의 생체내 이미징 단계를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
109. 항목 105 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 알파-시누클레인에 결합된 상기 항-시누클레인 항체 또는 이의 상기 항원 결합 단편의 생체외 이미징 단계를 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
110. 항목 5 또는 6에 따른 질병의 치료, 진단 또는 이미징을 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 항목 1 내지 97 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
111. 환자에서 항목 5 또는 6에 따른 질병의 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 97 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항체를 투여함으로써 상기 환자에서 병리학적 타우 단백질의 축적을 감소시키거나 약화시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시예
실시예 1: 항체 스크리닝
1. 면역원 및 리간드 제조
다음 단백질을 도 1에 나타낸 면역원으로서 이용하기 위해 획득하거나 제조하였다. 마우스를 3가지 면역원: 전장 재조합 인간 알파-시누클레인 원섬유; 아미노산 1~60을 함유하는 인간 알파-시누클레인 재조합 단백질(RPeptide, Bogart, Georgia) 및 아미노산 1~119를 함유하는 인간 알파-시누클레인 재조합 단백질로 면역화하였다. 전장 알파-시누클레인으로부터 원섬유를 제조하기 위해, RPeptide, Bogart, Georgia의 동결건조 산물(카탈로그 번호 S-1001-2)을 이용하였다. 이를 1 mg/ml 단백질 농도로 20 mM tris 및 300 mM NaCl 완충액에 용해시켰다. 원섬유를 제조하기 위해, 단백질 용액을 7일 동안 37℃에서 Vortemp 56 진탕장치 인큐베이터(Labnet International, Edison, NJ, USA)에서 200 rpm으로 각 웰 내 70 ㎛ 지름 세라믹 비드를 포함하는 96웰 플레이트에서 170 ㎕ 분취물을 인큐베이션하고, 원섬유 형성 후 티오플라빈 T를 첨가하고 하나의 웰에서 형광을 측정하였다. 아미노산 1~60을 함유하는 재조합 알파-시누클레인을 수중 용해시켜 1 mg/ml의 농도를 수득하였다.
아미노산 1~119를 함유하는 재조합 알파-시누클레인을 다음 구축물을 이용하여 제조하였다: 6개 아미노산 히스티딘 태그를 코딩하는 합성 유전자에 이어 인자 Xa 절단 부위 및 인간 알파-시누클레인 아미노산 1~119를 코딩하는 서열:
을 Genscript에 의해 합성하고 pET24a(+) 발현 벡터(Novagen) 내 NdeI-XhoI 부위 내로 클로닝하였다.
발현 벡터를 대장균 BL21 내로 형질전환하고 Novagen의 하룻밤 발현 자가유도 시스템(사용자 프로토콜 TB383 rev. H1005)을 이용하여 단일 콜로니를 발현에 대해 피킹(picking)하였다. 규모는 500 ml의 최종 배양 부피였다. 6000 g에서 10분 원심분리하여 세포를 수확한 후 BugBuster 단백질 추출 시약(사용자 프로토콜 TB245 Rev. 0304)을 이용하여 용해시켰다. 용해 후, 시료를 원심분리에 의해 청정화하고 상층액을 추가 정제를 위해 이용하였다.
His-태그화 단백질을 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.5, 1 M NaCl(A-완충액) 중에 평형화된 5 ml HisTrap 컬럼(GE healthcare) 상에서 정제하였다. 시료 적용 및 A-완충액을 이용한 세척 후, 단백질을 20 컬럼 부피에 걸쳐 A-완충액 중 0.25 M 이미다졸로의 구배로 용출하였다. 5 ml 분획을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 관심 단백질 함유 분획을 풀링하고, 농축하고, 10 mM tris pH 7.4, 300 mM NaCl 중 S200(26/60) 크기 배제 컬럼(GE healthcare)에 적용하였다. 다시 분획을 SDS-PAGE에서 예상 크기를 갖는 밴드의 존재에 따라 풀링하였다.
N-말단 태그를 제거하기 위해, 정제된 his-태그화 알파-시누클레인 1~119를 Novagen 키트(69037-3FRX)를 이용해서 1:50비로 인자 Xa와 인큐베이션하였다. 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 인자 Xa를 Xarrest 아가로스를 이용하여 배치식으로 제거하였다. 절단된 알파-시누클레인 1~119를 전술된 바와 같이 허용성 HisTrap 크로마토그래피에 의해 최종 정제하였다. 플로우 스루로부터, 정제된 알파-시누클레인 1~119를 수득하고, centricon 농축 장치를 이용하여 약 400 ㎍/ml로 농축하였다.
알파-시누클레인(RPeptide)을 2 mg/ml로 PBS 중에 재수화하고 퍼옥시니티라이트(100 ㎕/단백질mg)를 혼합하면서 적가하였다. 이어서 니트로실화 알파-시누클레인을 5 L PBS 중에 투석하고 -20℃에서 보관하였다.
도파민을 이용하여 알파-시누클레인을 산화시켰다. 10 mM PBS, pH 7.4 중 제조된 동일 부피의 도파민-HCL(Sigma P5244)의 200 μM 용액 및 10 mM PBS, pH 7.4 중 알파-시누클레인(RPeptide)의 28 μM 용액을 조합하였다. 생성된 14 μM 알파-시누클레인/100 μM 도파민을 37℃에서 O/N(하룻밤 동안) 인큐베이션하였다. 이어서 산화 알파-시누클레인을 PBS 중에 투석하고 -20℃에서 보관하였다.
항-알파-시누클레인 항체의 다양한 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상이한 원상태 및 키메라 버전의 시누클레인 단백질을 제조하였다. 스크리닝 구축물에는 인간, 마우스, 래트 및 게먹이 원숭이 알파-시누클레인, 인간 베타-시누클레인, 인간 감마-시누클레인 및 마지막으로 알파-시누클레인의 잔기 120~140이 없는 알파-시누클레인 유도체가 포함되었다. 또한, 4개 셔플 구축물 시리즈: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP(SEQ ID No:11 ~ 14)를 제조하였다. 이들 구축물은 인간 알파-시누클레인(A), 인간 베타-시누클레인(B) 및 닭 알파-시누클레인(K)의 선형 연신물을 함유하였다. 각각의 리간드의 부위 특이적 바이오틴화를 촉진하기 위해, 리간드의 C-말단에 융합된 바이오틴 수신체 펩타이드(BAP) 태그를 함유하는 유전자를 클로닝하였다. 바이오틴화는 가용성 ELISA 포맷에서 이용되는 비드에 대한 리간드의 부착을 허용하였다. 상이한 알파-시누클레인 BAP 태그 융합 구축물(ASynBAP)을 수반하는 포유류 발현 벡터를 구축하였다. 리간드를 일시적 형질감염(Genmab A/S)을 이용하여 HEK 293 세포에서 발현하였다.
2. 면역화
완전 쥐과인 항체 발현을 방지하는, 마우스 면역글로불린(Ig) 중쇄 및 마우스 카파 경쇄에 대해 이중 녹아웃인 HuMAb 마우스 계통 HCo17-BALB/c 및 HCo12-BALB/c 마우스의 면역화로 항체 HuMab-시누클레인을 유도하였다(인간 모노클로날 항체; Medarex Inc., San Jose, CA, USA). 인간 Ig 중쇄 및 인간 Ig 카파 경쇄 유전자위의 삽입에 의해 트랜스제닉이고 인간 VH(중쇄의 가변 도메인) 및 VL(경쇄의 가변 도메인) 유전자의 수가 상이한 다양한 마우스 계통을 만들었다.
48마리 마우스를 14일 간격으로, 동일한 면역원을 이용하여, 20 ㎍ 항원으로 복강내(IP) 및 피하(SC, 꼬리기부에서)로 교대하며 면역화하였다. 4회 IP 및 4회 SC의 최대 8회 면역화를 수행하였다.
최초 면역화는 완전 프로인트 아주반트(CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 중 알파-시누클레인 면역원으로 수행하였고, 이후 면역화는 불완전 프로인트 아주반트(IFA) 중에 수행하였다. 혈청 역가가 충분한 것으로 나타나면(적어도 2회 순차적으로, 2주 1회, 스크리닝 이벤트에서 본원에 상술된 항원 특이적 스크리닝 검정에서 1/50 이하의 혈청 희석이 양성으로 나타나면), 마우스를 추가로 융합 4일 및 3일 전에, 100 ㎕ PBS 중 10 ㎍ 알파-시누클레인 면역원 단백질로 정맥내(IV) 2회 추가접종하였다.
면역화 프로토콜을 도 1에 나타낸다.
항체 GM37은 아미노산 1~60 및 1~119를 갖는 알파-시누클레인 C-말단 절단된 형태를 교대하여, 인간 전장 α-시누클레인-원섬유가 이용되는 면역화 프로토콜에서 수득하였다.
항체 GM285는 인간 α-시누클레인-단량체 1~140을 최초 4회 면역화를 위해 이용한 면역화 프로토콜에서 수득하였다. 역가가 없는 경우, 원섬유로 면역화를 계속하였고(ip/sc), 다른 경우 단량체로 계속하였다.
3. HuMab 하이브리도마 생성
상기 정의된 바와 같이 충분한 항원-특이적 역가가 발생한 HuMAb 마우스를 희생시키고, 복부 대동맥 및 대정맥에 인접한 비장 및 림프절을 수집하였다. 비장세포 및 림프절 세포와 마우스 골수종 세포주의 융합을 본질적으로 제조업체의 지침에 따라, CEEF 50 Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA)을 이용하여 전기융합에 의해 수행하였다. 융합된 세포를 HyQ mADCF-Mab(Perbio) 중 10% 태아 클론 I 소 혈청(Perbio), 1 mM 나트륨 피루베이트(Cambrex), 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신(Cambrex), 50 μM 2-머캅토에탄올(Invitrogen), 600 ng/mL 인터류킨 6(IL-6)(Strathmann), 1 x HAT(Sigma) 및 0.5 mg/mL 카나마이신(Invitrogen)을 함유하는 융합 배지 중에 접종하였다. 10일 후, 상층액을 수확하고, 세포를 HyQ mADCF-Mab 중 10% 태아 클론 I 소 혈청, 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신, 600 ng/mL IL-6 및 1 x proHT(Cambrex)를 함유하는 수확 배지로 리프레시화하였다. 하이브리도마 배양 상층액을 일차 스크리닝 검정에 의해 스크리닝하였다. 상층액을 8개의 상이한 리간드로의 결합에 대해 특성규명하였다. 이들에는 6가지 오르소로그: 인간, 마우스, 래트 및 게먹이 원숭이 알파-시누클레인, 인간 베타 시누클레인 및 인간 감마-시누클레인(SEQ ID No:37~41)이 포함되었고 마지막으로 이들을 알파-시누클레인의 잔기 120~140이 없는 인간 알파-시누클레인 유도체에 결합하는 이의 능력에 대해 시험하였다.
항-알파-시누클레인 항체의 스크리닝을 자동화 액체 취급 시스템(Genmab A/S)을 이용하여 고처리량 현탁 ELISA 포맷을 이용하여 수행하였다. 플레이트 판독은 2가지 시스템에 의해 수행하여, Applied Biosystems의 FMAT 8200은 384웰 플레이트를 판독하기 위해 이용하였고 Molecular Devices의 ImageXpress Velos Cytometer는 1536웰 플레이트를 판독하기 위해 이용하였다.
일차 스크리닝에서, 클론을 8개의 상이한 리간드에 결합하는 이의 능력에 의해 특성규명하였다. 이들에는 4개의 셔플 구축물 시리즈: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP(SEQ ID No:11 ~14), 알파-시누클레인 120~140 결실-BAP, 질산화 인간 알파-시누클레인-BAP 및 산화 인간 알파-시누클레인-BAP가 포함되었다.
요약하면, 알파-시누클레인 특이적 항체를 잠재적으로 함유하는 혈청 또는 상층액을 비드에 첨가하여 알파-시누클레인 및/또는 알파-시누클레인 유래 구축물로의 결합을 허용하였다. 항-알파-시누클레인 항체의 결합을 형광 공액체, DyLight649 공액된 염소 항인간 IgG, Fc 특이적 물질을 이용해서 검출한다. 2개의 공지된 마우스 항-알파-시누클레인 항체, LB509 및 Syn211이 양성 대조군으로 스크리닝에 포함되었다. 알파-시누클레인 항체의 특이적 검출을 보장하기 위해, 항-알파-시누클레인 혈청 풀을 384웰 포맷 역가 스크리닝에서 음성 대조군으로 이용한 반면, 인간 ChromPure IgG를 1536웰 포맷 8-비드 기반 검정에서 이용하였다.
최적 일차 웰로부터의 하이브리도마 세포를 40% CloneMedia(Genetix, Hampshire, UK) 및 60% HyQ 2x 완전 배지(Hyclone, Waltham, USA)로 제조된 반고체 배지 중에 접종하였다. 각각의 일차 웰에 대해, Genetix 검은색 6-웰 플레이트의 한 웰에 접종하였다. 각각의 웰로부터, 25개 서브클론을 ClonePix 시스템(Genetix)을 이용하여 피킹하였다. 서브클론을 수확 배지 중에서 피킹하였다. 7일 후, 서브클론 상층액을 다시 시누클레인-특이적 인간 IgG 결합에 대해 스크리닝하고, 인간 IgG 농도를 Octet(Fortebio, Menlo Park, USA)를 이용하여 측정하였다. 각각의 일차 웰로부터, 최적 서브클론을 선택하여 600 ng/mL IL-6, 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신 및 1 x proHT만 함유하는 증식 배지 중에 증식시켰다. 서브클론을 하나의 96웰 플레이트 웰로부터 하나의 24웰 플레이트 웰로, 4개의 24웰 플레이트 웰로, 6개의 6웰 플레이트 웰로 증식시켰다. 상기 공정에 의해 유도된 클론을 일차 클론(PC)으로 명명하였다.
추가적인 항체 결합 연구를 Octet 384RED(Fortebio, Menlo Park, USA)를 이용하여 수행하였다. 2 ㎍/ml의 HuMab 항체 용액을 시료 희석제(ForteBio, art. No. 18-5028) 중 희석에 의해 제조하였다. 아민 반응성 센서(ForteBio, art.no. 18-0008)를 HuMab의 면역화를 위해 이용하였다. 아민 반응성 센서로의 커플링 전에, HuMab를 MES pH 6.0 완충액(18-5027) 중에 희석하였다. 커플링은 다음과 같이 30℃ 및 1000 rpm에서 수행하였다: 아민 반응성 센서를 PBS 중에 사전 수화시킨 후 EDC/NHS(ForteBio. Art.no. 18-1033/18-1034) 활성화 용액(제조업체의 지침에 따라)으로 300초 동안 활성화하였다. 활성화 센서를 600초 동안 HuMab으로 고정화하였다.
재조합 인간, 게먹이 원숭이 및 마우스 알파-시누클레인에 대한 Octet 중 GM37 및 GM285의 결합, 및 인간 베타- 또는 감마-시누클레인에 대한 결합의 부재를 도 2에 나타낸다.
4. 시누클레인 -특이적 HuMab 가변 도메인의 서열 분석 및 발현 벡터 내 클로닝
총 RNA를 0.2 내지 5x106 하이브리도마 세포로부터 제조하고 5'-RACE-상보성 DNA(cDNA)를 SMART RACE cDNA Amplification 키트(Clontech)를 이용하여 100 ng 총 RNA로부터 제조하였다. VH 및 VL 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭하고, 결찰 독립적 클로닝에 의해 p33G1f 및 p33Kappa 발현 벡터(인간 IgG1/카파 불변 도메인 인코딩 서열 함유) 내에 인 프레임으로 직접 클로닝하였다(문헌[Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74]). 각각의 항체에 있어서, 16개의 VL 클론 및 16개의 VH 클론을 시퀀싱하였다. 정확한 개방 해독틀(ORF)을 갖는 클론을 추가 연구 및 발현을 위해 선택하였다. 모든 조합의 중쇄 및 경쇄의 벡터를 293fectin을 이용하여 FreestyleTM 293-F 세포에서 일시적으로 공동-발현하였다.
GM37의 경우, VH 영역의 시퀀싱으로 위치 106에서 CDR3 도메인에서 추가 시스테인을 확인하였다. 이황화 결합 형성으로 인한 미스폴딩 가능성 및 항체 활성의 잠재적 손실을 제거하기 위해, 위치 106에서 시스테인을 세린으로 돌연변이시켰다.
비교인자 항체 9E4를 하이브리도마 PTA-8221(US 특허 20080175838)에서 유래되는 VH 및 VL 서열(SEQ ID No:42 및 43)에 기반하여 생성하였다.
5. 항체의 발현/정제
항체를 pTT5 벡터 및 일시적 형질감염제로서 PEIpro를 이용하여 HEK293 6E 세포에서 형질감염에 의해 제조하였다(National Research Council of Canada). 요약하면, 중쇄 및 경쇄를 PEIpro(VWR)를 이용하여 HEK293 세포 내로 형질감염하고, 형질감염 24시간 후 세포에 TN1(Sigma)을 보충하였다. 생활성이 50%에 접근할 때까지 세포를 성장시키고, 항체 수율을 easy IgG titre(Thermo)에 의해 측정하였다. 배양 상층액을 0.2 ㎛ 데드-엔드 필터를 통해 여과하고, 5 mL 단백질 A 컬럼(rProtein A FF, Amersham Bioscience) 상에 로딩하고, 0.1 M 시트르산-NaOH, pH 3으로 용출하였다. 용출액을 2 M Tris-HCl, pH 9로 즉시 중화하고, 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4(B.Braun)로, O/N 투석하였다. 투석 후, 시료를 0.2 ㎛ 데드-엔드 필터를 통해 멸균 여과하였다. 순도를 SDS-PAGE에 의해 결정하고, 농도를 혼탁측정 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 분취하고 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: 표면 플라즈몬 공명을 이용한 항체 특성규명
알파-시누클레인에 대한 항체의 실시간 결합을 BIAcore® 3000을 이용하여 측정하였다. 포착 표면을 CM5 칩(BIAcore®)의 제1 플로우 셀(Fc1) 및 제2 플로우 셀(Fc2)에서 폴리클로날 토끼 항-마우스 항체(마우스 항체 Capture Kit의 일부, GE Healthcare, 카탈로그 번호: BR-1008-38)의 아민-커플링에 의해 제조하였다. 마우스 항체를 500 RU 근처의 리간드 수준을 달성하기 위해 요구되는 농도에서 Fc2에서 포착하였다. 기준선이 10분 동안 안정화하도록 둔 후 30 ㎕/분으로 Fc1~2 중 분석물질(ASynBAP)을 주입하였다. ASynBAP을 각각 100~3200 nM 및 25~3200 RU로 수행하였다. 각각의 적정 시리즈에서의 최고 농도를 2개씩 수행하였다. 표면을 10 mM 글리신-HCl, pH 1.7(30초 주사)로 재생하여 각 사이클 말기에 포착된 마우스 항체 및 분석물질을 제거하였다. HBS-EP(GE Healthcare, 카탈로그 번호: BR-1001-88)를 모든 실험에서 수행 완충액 및 시료 희석제로 이용하였고 검정을 25℃에서 수행하였다. 모든 시료를 획득 전까지 4℃에서 유지하였다.
포착 항체가 고정화되었지만 알파-시누클레인 항체는 포착되지 않은 Fc1에 기록된 반응을 Fc2에서의 반응으로부터 감산하였다. 1:1 또는 2:1 결합 알고리즘을 BIAevaluation 소프트웨어 버전 4.1.1.을 이용하여 데이터세트에 피팅하였다. 결과는 인간 알파-시누클레인에 대한 항체 GM37, GM285 및 9E4의 결합을 나타내는 도 3, 4 및 5에서 확인할 수 있다.
실시예 3: 에피토프 맵핑
알파-시누클레인에 대한 항체의 에피토프 맵핑을 Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC Lelystad, The Netherlands)에서 중복되는 선형 펩타이드 어레이로 수행하였다. 각각의 합성된 20머 펩타이드에 대한 항체의 결합을 Pepscan 기반 ELISA에서 시험하였다. 알파-시누클레인의 전체 코딩 서열을 커버하는 선형 펩타이드 어레이뿐만 아니라 산화 메티오닌 또는 니트로실화 티로신을 포함하는 모든 펩타이드를 일차 항체 용액과 인큐베이션하였다(4℃에서 하룻밤 동안). 세척 후, 펩타이드 어레이를 25℃에서 1시간 동안 항체 퍼옥시다제 공액체(SBA, cat. nr. 2010-05)의 1/1000 희석액과 인큐베이션하였다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 2 ㎕/ml의 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 발색을 측정하였다. 발색을 전하 커플링 장치(CCD) - 카메라 및 이미지 프로세싱 시스템으로 정량하였다. 데이터 프로세싱을 위해, 표준 96웰 플레이트 ELISA-판독장치와 유사하게, 0 내지 3000 mAU 범위의 CCD 카메라로부터 값을 수득하였다. 결과를 정량하고 Peplab 데이터베이스 내에 저장하였다. 때때로, 웰이 위양성 값을 생성하는 기포를 함유하여, 카드를 수동 검사하고 기포에 의해 유도된 임의의 값을 0으로 스코어링한다. 각각 서열 ILEDMP 또는 ILED를 함유하는 펩타이드에 대한 항체 GM37 및 GM285의 결합 데이터는 도 6에서 확인할 수 있다.
실시예 4: GM37 및 GM37 변이체
환자에서의 이용을 위한 임상 등급 물질의 제조를 위해 이용될 제조 조건을 모사하는 조건 하에 포유류 세포 배양에서 항체를 제조하였다. 상기 방식으로 제조된 단백질은 항체의 치료 효능뿐만 아니라 경시적으로 항체의 안정성에 영향을 미치는 생물리적 속성에 모두 영향을 미칠 수 있는 번역-후 변형을 거치는 것으로 널리 공지되어 있다. 수 십여 년의 연구로부터 확인된 실험적 지식으로 특정 분자의 개발 가능성에 대해 위험을 제공하는 것으로 공지된 번역-후 변형 세트를 확인하였다. 이들 번역-후 변형은 중쇄 및 경쇄 단백질의 일차 서열에 존재하는 아미노산 스트링과 연관된 것으로 나타났다. 이러한 서열을 확인하고 치료 항체의 제조 가능성 및 개발 가능성에 대해 가질 잠재적 위험을 결정할 수 있는 알고리즘이 생성되었다.
항체의 일차 서열의 컴퓨터내 분석은 치료제로 개발될 그 가능성을 위해 분자의 위험을 제거하기 위해 이용될 수 있다. 특히, VH 및 VL 영역의 상세 분석은 분자 활성에 대해 중요하게 간주되지만 경시적으로 그 안정성에 대해 잠재적 위험일 수 있는 독특한 아미노산을 확인할 수 있다. 서열 특이적 탈아미드화는 단백질 구조에 대한 잠재 위험으로 확인되었다. 단백질 탈아미드화는 글루타민 또는 아스파라긴 잔기의 아미드 측쇄 상에서 일어나서 이를 카복실레이트기로 변환할 수 있다(문헌[Lorenzo et al. PLOSone, DOI:10.1371, Dec. (2015)]). 중성 pH에서의 비효소적 탈아미드화는 아스파라긴에서 더 빠르게 일어나므로, 글루타민에 비해 더 높은 위험으로 간주된다. 활성은 서열에서 후속 아미노산에 의해 추가로 영향을 받으며, 수 일 또는 수 년의 속도로 일어날 수 있다. 탈아미드화를 거치는 단백질의 실제 운명은 그 안정성 및 활성 모두에 대한 변화의 영향을 결정하기 위해 실험적으로 평가되어야 한다.
본 발명자들은 GM37의 VH 도메인 내의 탈아미드화 부위를 확인하였다. 아미노산 잔기 54는 아스파라긴(N)이고 위치 55에 글리신(G)이 뒤따른다. N54는 자발적 탈아미드화에 대한 위험이 높다. 상기 위험을 경감시키기 위해, 아스파라긴(N)을 세린(S), 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)으로 대체하는 3개의 변이체 세트를 생성하였다. 모든 3개 변이체를 일시적 형질감염 방법을 이용하여 포유류 세포 배양에서 제조하였다. 모든 3개 변이체는 GM37wt과 유사한 발현 및 정제 특성을 나타내었다.
8개 산물의 각각에 대해 최소 2주 동안 배양한 CHOK1SV GS-KO 세포를 이용하여 400 ml 일시적 형질감염을 수행하였다. 세포를 형질감염 전 24시간 동안 계대배양하였다. 모든 형질감염을 Gene Pulse XCell(Bio-Rad)을 이용하여 전기천공을 통해 수행하였다. 각각의 형질감염에 있어서, 생활성 세포를 6 mM L-글루타민이 보충된 사전-가온된 CD-CHO 배지 중에 2.86x107 세포/ml로 재현탁하였다. 적절한 중쇄 및 경쇄를 함유하는 각각의 확립된 SGV DNA 40 ㎍을 각각의 큐벳(Bio-Rad, GenePulser 큐벳, 0.4 cm 갭, 165-2088) 내로 분취하고 700 ㎕의 세포 현탁액을 첨가하였다. 세포를 300 V, 900 μF에서 전기천공하였다. 형질감염된 세포를 에를렌마이어 플라스크에서 사전-가온된 배지로 옮기고 사전 가온된 배지로 2회 헹군 큐벳 내용물도 플라스크로 옮겼다. 형질감염체 배양을 6일 동안 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm으로 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포 생활성을 Cedex HiRes 자동화 세포 카운팅 장치(Rosche)를 이용하여 수확 시 측정하였다.
인간 알파-시누클레인으로의 결합에서 잔기 54의 중요성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 2개의 상이한 실험에서 변이체가 결합하는 능력을 분석하였다. 경쟁 ELISA 포맷을 이용하여, 본 발명자들은 잔기 54에서의 변화가 용액 중 알파-시누클레인에 결합하는 GM37의 능력에 대해 가질 영향을 평가하였다. 시누클레인 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 항체의 결합을 억제할 수 있는 시누클레인의 농도를 평가함으로써, 본 발명자들은 모든 3개 변이체가 GM37wt과 동일한 결합을 유지하였으며 1~2 nM의 IC50을 생성하는 고친화도로 알파-시누클레인에 결합함을 나타내었다(도 7). 실온에서 60분 동안 0~1000 nM 범위의 인간 알파-시누클레인과 고정된 농도(0.3 ㎍/ml)의 각각의 다음 항체, GM37(GM 37wt로 명명됨), GM37 변이체 1, GM37 변이체 2 및 GM37 변이체 3의 사전 인큐베이션을 이용하여 경쟁 검정을 수행하였다. 잔여 미결합 항체를 포착하고 전기화학발광(MSD, Gathersburg, MD)에 의해 항-인간 검출 항체를 이용하여 100 ng/ml의 재조합 인간 알파-시누클레인으로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 측정하였다. 상호작용의 IC50은 각각 GM37 wt, GM37 변이체 1, GM37 변이체 2 및 GM37 변이체 3에 대해 1.9 nM, 1.6 nM, 2.1 nM 및 1.4 nM이다(Prism Graphpad®를 이용하여 결정됨).
표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여, 본 발명자들은 GM37 wt(2개 배치) 및 3개 변이체의 실시간 결합 동역학을 평가하였다(실시예 2). 인간 알파-시누클레인을 슬라이드로 포착하고(리간드) 항체를 각각 분석물질로서 여러 농도에서 시험하였다. 여러 농도에서 항체의 존재 하 결합 곡선의 분석은 항체가 완충액으로부터 제거된 경우와 유사하게, 온 속도가 모든 4개 항체에 대해 동일함을 나타내었고, 측정된 오프-속도는 항체 간 통계적 차이를 나타내지 않았다. 1:1 결합 알고리즘을 이용하여, 모든 4개 항체는 거의 동일한 결합 상수를 갖는다(도 7).
실시예 5: 알파-시누클레인 시드에 의해 유도되는 타우 응집은 알파-시누클레인에 대한 항체에 의해 방지될 수 있다
알파-시누클레인 원섬유(시드) 준비의 설명
알파-시누클레인의 원섬유화는 약간 상이한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. rPeptide사로부터 구매한 재조합 알파-시누클레인(카탈로그 번호 S-1001-2)을 제조업체의 권고사항에 따라 이중-증류수에 용해시켜, 20 mM Tris-HCL/100 mM NaCl 중 1 mg/ml 용액, pH = 7.4를 초래하였다. 알파-시누클레인 예비형성 원섬유(PFF)를 Virginia Lee/Kelvin Luk 프로토콜(문헌[Luk et al, Science, 2012, 16;338(6109):949-53])을 이용하여 단량체성 알파-시누클레인으로부터 발생시켰다. 1 mg/ml 용액을 37℃에서 교반(300 rpm)하면서 2일 동안 인큐베이션하고, 그 후 3일 동안 정지시킨 다음, 1일 동안 교반하고, 그 후 1일 동안 정지시킨 다음, 4일 동안 교반하였다. 그 후에, 원섬유를 수합하고, 사용 시까지 -20℃에서 유지시켰다. 원섬유를 세포 검정법에 사용할 때, 이들을 첨가 직전에 항상 5분, 세팅 5.50% 사이클에서 혼 프로브 소니케이터(horn probe sonicator)를 사용하여 소니케이션하였다.
대안적으로, 1 mg/ml 용액을 37℃에서 5 내지 7일 동안 일정하게 진탕한다(shaken). 최종 생성물을 "조정제(crude) 원섬유"라고 한다. 소니케이션 시, 이들을 "조정제 시드"라고 한다. 조정제 원섬유를 원심분리할 수 있고, 응집된 알파-시누클레인을 함유하는 펠렛을 신선한 PBS에 현탁시키고, "순수한 원섬유"라고 한다. 순수한 원섬유를 소니케이션함으로써 "순수한 시드"를 수득한다.
타우의 접종의 알파-시누클레인 항체-매개 억제
세포내 타우의 접종의 알파-시누클레인 항체 매개 억제의 효과를 보여주기 위해, HEK293 세포 기반 접종 검정법을 셋업하였다(도 8, 하위 패널은 검정법 셋업을 예시함). HEK293 세포를 100,000개 세포/웰로 24웰 플레이트에 평판배양하고, 평판배양 후 24시간 이내에 인간 타우-P301L-FLAG를 인코딩하는 cDNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간째에, 세포를 응집된 원섬유화된 알파-시누클레인(시드)과 함께 항체와 함께 또는 없이 24시간 동안 (Lipofectamine2000 형질감염을 이용하여) 접종하고, 후속해서 세포를 분할하고 재-평판배양한 다음, 추가의 24시간 후 수합하였다. 세포를 1% 트리톤 X, 포스-스탑(phos-stop) 및 완전 포스파타제 및 프로테아제 억제제(Roche) 완충제가 보충된 PBS에서 용해시키고 소니케이션하였다. 총 세포 용해물을 Cisbio사로부터의 타우 응집 검정법을 이용하여 분석하였다. 이러한 검정법은 FRET에서 공여자(Tb3+ 공액) 및 수여자(d2 공액) 항체 둘 다에 대해 동일한 항체를 사용하여 시간-해상 형광(time-resolved fluorescence)을 기반으로 한다. 10 μl 시료를 10 μl 항체 믹스와 혼합하고, 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Pherastar 플레이트 판독기 상에서 판독하여, 시간-해상 형광(여기광의 스위칭 후 측정/통합된 FRET 신호)을 평가하였다. 검정법은 AD 환자로부터의 인간 뇌 부검 물질, 타우 트랜스제닉 마우스(rTg4510)로부터의 뇌 물질, 및 접종된 HEK293 세포 둘 다에서 응집된 타우를 높은 특이성 및 민감도로 측정한다. 원섬유화된 타우 단백질의 상이한 조제물을 시드로서 이용하여, 이러한 유형의 HEK293 세포 기반 접종 검정법은 타우 항체 임상 후보물질을 선택하는 데 효율적으로 이용되어 왔다.
결과를 도 8의 상위 패널에 보여준다. 알파-시누클레인 시드(300 ng 조정제 시드)의 형질감염만으로도, 약 100의 상대 타우 응집(알파-Syn, 제3 막대)을 초래하며, 이는, 알파-시누클레인이 내인성 타우의 교차-접종을 강력하게 유도함을 가리킨다. 접조 효과는 B12(대조군 항체) 및 하기 Tau 항체(mC10-2, mD1.2, LU0041G라는 명칭의 타우 결합 항체 및 인간화(h) C10-2)에 의한 공동-형질감염에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 세포를 알파-시누클레인에 대한 4개의 상이한 항체 HLD1, GM37(37), GM63(63) 및 9E4와 함께 공동-인큐베이션함으로써, 타우 응집의 부분 역전이 존재하였으며, 예를 들어 항체 9E4는 상대 응집을 (비-처리된 대조군에서 100과 비교하여) 20까지 증가시킨다. 모든 항체를 조정제 시드(총 400 ul 부피 중 2.4 ug 항체 및 300 ng 시드)로 공동-형질감염시켰다.
실시예 6: 항체 발견 2E6 및 2E6 변이체
A. 면역화/하이브리도마 스크리닝
예를 들어 반응성 알데하이드와 가교된 상이한 시누클레인 응집물로 마우스를 면역화함으로써 알파-시누클레인에 대한 모노클로날 항체를 발생시켰다. 제1 항원을 RPeptide사(4241 Mars Hill Road, Bogart, GA 30622, USA)의 재조합 동결건조된 알파-시누클레인으로 제조하였다. 단백질을 PBS에 용해시켜, 70 uM 알파-시누클레인(1 mg/ml)의 용액을 만들어 이를 제조하였다. 상기 용액을 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하고, 100 ul 분취물에 냉동시켰다. 재조합 알파-시누클레인(RPeptide)을 20 mM Tris(pH=7.4), 0.15 M NaCl에서 70 microM으로 용해시킴으로써 제2 항원을 상기 재조합 알파-시누클레인(RPeptide)으로부터 유사하게 제조하였다. 반응성 알데하이드 ONE(4-옥소-2-노네날, 카탈로그 번호 10185, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI로부터)을 20:1의 몰비로 첨가하여, 알파-시누클레인의 올리고머를 공유 가교시켰다. 용액을 37℃에서 18시간 동안 (진탕 없이) 인큐베이션하였다. 미반응된 ONE를 Vivaspin500 스핀 컬럼(10 kDa MWCO)에 의해 제거하고, 시료를 20 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl에 대해 투석시키고, 분취물에서 냉동시켰다. 제3 항원은 재조합 알파-시누클레인 단편 아미노산 1~60(RPeptide)이었으며, 이는 동결건조된 분말(RPeptide사로부터의 본래의 물질)로서 보내졌다. 간략하게는, 3마리의 암컷 마우스(4 내지 7주령)를 면역화시키고, 최대 3회 동안 부스팅(boost)시켰다. 꼬리-채혈을 수행하고, 항원에 대한 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA)에 의해 항-시누클레인 항체에 대해 스크리닝하였다. 혈청 희석에 의해 역가를 정의하여, ELISA에서 기준선의 3배의 OD 판독을 달성한다. 대조군보다 1:50,000 초과의 역가를 보여주는 마우스를 융합에 선택하였다. 수합된 비장세포를 SP2/0 마우스 골수종 세포에 융합시키고, 희석시키고, 단일 세포 융합으로부터 평판배양하였다. 융합-후 14일째에 상층액을 수합하고, 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 시누클레인 ELISA를 이용하여, 50개의 양성 클론을 약 1000개 웰로부터 회수하였다. Clonotyping System/AP 키트를 면역글로불린 이소형(Southern Biotechnology, Birmingham, AL)에 이용하였다. 하기 SKMEL5 세포 검정법에서 atto-표지 알파-시누클레인 응집물의 축적의 감소에 대해 50개 항-알파-시누클레인 상층액을 스크리닝하였다. 상업적인 항체 LB509를 양성 대조군으로서 포함시켰다. 50개의 항혈청 중에서, 단지 4개의 항혈청만 알파-시누클레인의 세포내 축적을 감소시켰고, 이들 항체는 클로닝을 위해 채취된 것으로 확인되었다. 그 후에, 이들 4개의 항체를 검정법에서 용량 반응에서 시험하였다. 가장 큰 효과를 갖는 항체 2E6을 PD 관련 모델에서 추가의 특징화를 위해 선택하였다.
원섬유 준비의 설명
재조합 알파-시누클레인을 RPeptide사(카탈로그 번호 S-1001-2)로부터 주문하고, 제조업체의 권고사항에 따라 이중-증류수에 용해시켜, 20 mM Tris-HCL/100 mM NaCl 중 1 mg/ml 용액, pH = 7.4를 초래하였다. 알파-시누클레인을 Sigma사의 Atto488 단백질 표지 키트(#38371)를 이용함으로써 형광 표지시켰다. 그 후에, 30% Atto488-표지 및 70% 미표지 알파-시누클레인의 혼합물을 제조하고, 그 후에 이러한 혼합물을 37℃에서 교반(300 rpm)하면서 2일 동안 인큐베이션하고, 그 후 3일 동안 정지시킨 다음, 1일 동안 교반하고, 그 후 1일 동안 정지시킨 다음, 4일 동안 교반하였다. 그 후에, 원섬유를 수합하고, 사용 시까지 -20℃에서 유지시켰다. 원섬유를 세포 검정법에 사용할 때, 이들을 첨가 직전에 항상 5분, 세팅 5.50% 사이클에서 혼 프로브 소니케이터를 사용하여 소니케이션하였다.
SK-mel5 세포에서 축적의 항체-매개 억제
인간 골수종 세포주 SK-mel5(ATCC, HTB-70)를 ATCC-가이드라인에 따라 성장시켰다. 세포를 Falcon BD 96-웰 플레이트에 1개 웰 당 3000개 세포의 밀도로 평판배양하고, 하룻밤 부착되게 놔두었다. Atto488-표지 알파-시누클레인 원섬유를 m2E6 항체(0.01 mg/ml) 및 알파-시누클레인 펩타이드 113-125 또는 126-140(0.01 mg/ml)과 함께 세포(0.01 mg/ml)에 첨가하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 4% 파라포름알데하이드에 의해 고정시켰다. 그 후에, 세포를 Hoechst로 염색하고, Cellomics ArrayScan에서 판독하였다. 핵을 하나의 채널에서 검출하고, 유효 대상(valid object)의 수로서 정의하였다. Atto488-표지 원섬유를 핵을 둘러싼 예정된 고리-형성 영역에서 또 다른 채널에서 검출하였으며, 따라서, 세포의 세포질을 나타낸다. 알파-시누클레인 스팟을 함유하는 세포의 퍼센트를 정량화하였다. 그 결과는, 원섬유가 주어지지 않는 세포에서, 스팟-함유 세포의 매우 낮은 배경만 존재하였음을 보여준다(배경은 아마도 자가형광으로 인한 것이었음). 도 7c. 원섬유만 주어진 세포에서, 세포 중 75%가 세포내 스팟을 축적시켰다. 원섬유 및 m2E6 항체와 함께 공동-인큐베이션된 세포에서는, 단지 약 30%의 스팟-양성 세포가 존재하였다. 세포를 원섬유, m2E6 및 126-140 펩타이드와 함께 공동-인큐베이션시켰을 때, 약 60%의 양성 세포가 존재하였으며, 따라서 펩타이드는 m2E6의 효과를 유의하게 억제시켰다. 113~120 펩타이드와 원섬유 및 2E6의 공동-인큐베이션은 m2E6의 효과를 변화시키지 않았다. 펩타이드 113~120 또는 126~140과 함께 원섬유의 인큐베이션은 세포에서 원섬유의 축적에 아무런 효과를 갖지 않았다. 따라서, m2E6은 용액 내에서 알파-시누클레인 원섬유에 결합하고, 세포에서 이들 원섬유의 축적을 억제한다.
증가하는 용량의 2E6-HLD1의 처리는 스팟이 있는 세포의 퍼센트에서 용량-의존적 감소를 보여주었다. 관련없는 대조군 항체(B12)로 처리된 세포는 아무런 효과도 보이지 않았다.
B. 시누클레인 ELISA
항체-양성 융합은 항원-특이적 ELISA 검정법을 이용하여 결합에 대해 분석하였다. Corning 96웰 고 결합 플레이트를 100 ng의 응집된 시누클레인으로 코팅시켰다. 웰을 PBS 중 5% 밀크를 실온(RT)에서 1시간(hr) 동안 이용하여 차단시켰다. 플레이트를 PBS+1% Tween 20을 이용하여 3회 세척하였다. 100 마이크로리터의 하이브리도마 상층액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, HRP-공액 염소 항-마우스 IgG(H&L 사슬-특이적 또는 γ-사슬 특이적) 이차를 각각의 웰에 첨가하여, 결합된 항-시누클레인 항체의 존재를 검출하였다. 정량화를 위해 기질인 하나의 구성성분 TMB를 첨가하고, 플레이트를 OD620에서 측정하였다.
C. 항체 HC 및 LC 가변 도메인의 DNA 서열의 결정
4개의 항-알파 시누클레인 양성 하이브리도마를 선택하고, mRNA를 세포 펠렛으로부터 추출하였다. 각각의 mRNA 프렙(prep)으로부터의 cDNA를 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 역-전사효소에 의해 발생시켰다. 후속적으로, 가변 도메인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하여, HC 및 LC 영역의 VH 및 VL 영역 둘 다를 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 아가로스 겔 상에서 분리하고, VH 및 VL 생성물을 둘 다 단리하고, 겔로부터 정제하고, pCR2.1(Invitrogen) 내로 클로닝한 다음, TOP10 세포 내로 형질변환시켰다. 최소 6개의 양성 콜로니를 선택하고, DNA 시퀀싱에 의해 분석하여, VH 및 VL 영역의 서열을 결정하였다.
실시예 7: 항체 조작
모노클로날 항체의 발현
하이브리도마 클론의 배양물을 증식(expand)시키고, 배양된 상층액으로부터 단백질 G 크로마토그래피를 이용하여 마우스 모노클로날 항체를 정제하였다. HEK293 세포 내로의 중쇄 및 경쇄 유전자의 일시적인 공동-형질감염, 배양물의 증식, 상층액의 수합 및 단백질 크로마토그래피에 의한 정제를 이용하여 재조합 마우스, 인간 및 키메라 항체를 생성하였다. 그램 양의 항체가 반복적으로 필요한 경우, 안정한 세포주가 CHO 세포에서 만들어졌다. 이들 안정한 세포주를 필요에 따라 증식시킬 수 있었고, 항체 정제를 이전과 같이 수행하였다.
재조합 항체의 클로닝
중쇄 및 경쇄 유전자(Geneart A/G)의 유전자 합성에 의해 재조합 모노클로날 항체를 발생시켰다. 후속해서, 합성된 유전자를 포유류 세포 배양물에서의 발현을 위해 표준 발현 벡터(예를 들어 pcDNA3.1) 내로 클로닝하였다.
인간화
m2E6의 인간화를 구조 기반 CDR 그래프팅에 의해 수행하였다. PDB 및 IMGT 데이터베이스에서 확인되는 모든 인간 항체 VL 및 VH 프레임워크 아미노산 서열에 대한 상동성에 대해 2E6 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열을 스크리닝하였다. PDB 데이터베이스로부터 20SL 항체를 사용하여 m2E6 Fv 영역 상에서 구조 모델링을 수행하였다. 20SL 아미노산 서열은 2E6 VH 및 VL 도메인과 각각 82.7% 및 83.2% 상동성이다. 중요하게는, 20SL에 대한 구조는 2.1 Å의 해상도(resolution)에서 결정하였다. 2E6 인간화 프레임워크와 20SL의 구조 정렬은 입체 장해 또는 입체 힘(steric force)을 통해 폴딩 또는 국소 구조에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 영역 내의 중요한 잔기를 결정할 수 있게 하였다. 인간화 항체의 이론적인 항체 구조 모델링을 이용하여, 결합 특이성 및 친화도를 유지하기 위해 2E6의 인간화 버전에서 본래의 마우스 아미노산으로서 특이적인 잔기를 유지하는 잠재적인 중요성을 지시하였다. 구조 모델링을 이용하여, 인간화 2E6의 활성을 최적화하였다.
VH CDR을 인간 생식선 유전자, IGHV1-46*01(69% 상동성)의 프레임워크 상으로 그래프팅함으로써 2E6 VH 영역의 인간화를 수행하였다. 마우스 2E6과 선택된 인간 프레임워크 영역 사이에 23개의 아미노산 차이가 존재한다. 구조 모델링은, 인간 잔기에의 변화가 2E6의 활성에 부정적인 영향을 미치는 잠재성을 가진 7개 아미노산 위치를 식별하였다. 이들 잔기를 본래의 마우스 아미노산으로 역-돌연변이화시켰다. 인간화 중쇄의 3개의 상이한 버전을 생성하였다. 인간화 HLD-1은 7개의 역돌연변이, M37V, I48M, A68V, L70M, V72R, K74T, A79V를 모두 함유하며, HLD-2는 I48M, A68V, L70M, V72R, K74T, A79V를 함유하고, HLD-3은 M37V, I48M, L70M, V72R, K74T, A79V를 함유한다.
VL CDR을 인간 생식선 유전자, IGKV3-11*01(64% 상동성)의 프레임워크 상으로 그래프팅함으로써 2E6 VL 영역의 인간화를 수행하였다. 마우스 2E6과 선택된 인간 프레임워크 영역 사이에 26개의 아미노산 차이가 존재한다. 구조 모델링은, 인간 잔기에의 변화가 2E6의 활성에 부정적인 영향을 미치는 잠재성을 가진 4개 아미노산 위치, R45L, W46L, V57I, Y70F를 식별하였다. HLD-1, HLD-2 및 HLD-3의 경우, 모든 4개의 잔기를 본래의 마우스 아미노산으로 역-돌연변이화시켰다.
HLD-1, HLD-2 및 HLD-3을 HEK 293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 항체를 배양된 상층액으로부터 정제하고, 후속해서 시누클레인 리간드 포맷을 이용하는 SPR(Biacore 3000)에 의해 시누클레인에의 결합에 대해 분석하였다(표 5).
[표 5]
경쇄 CDR3에서 코돈 기반 변성 PCR 프라이머에 의한 무작위 돌연변이, 및 유사하게는 중쇄 CDR3에서 코돈 기반 변성 PCR 프라이머에 의한 무작위 돌연변이에 의해, 및 오차-취약 PCR을 이용한 시험관내 발생을 이용하여 HLD1의 친화도 성숙을 수행하였다. 배양된 상층액으로부터 항체를 정제하고, 후속해서 CM5 칩 상에 고정된 항 인간 IgG Ab를 사용하여 포착된 IgG를 이용한 SPR(Biacore 3000)에 의해 시누클레인에의 합성에 대해 분석하였다(표 6).
[표 6]
제1회의 친화도 성숙 후, 본 발명자들은 4개의 돌연변이(A, B, C, D)를 구축하였다: A) 중쇄 CDR2(KYNVNFKT를 KYNVNIKT로 돌연변이화시킴) 및 중쇄 CDR3(LGHYGNLYAMDY를 LGHYGNLYAKDY로 돌연변이화시킴)에서 2개의 돌연변이를 조합함; B) 경쇄 CDR1 돌연변이(SASSSVSYMH를 SASSSVSYIH로 돌연변이화시킴)를 L3~11 경쇄 내로 혼입시킴; C) 경쇄 프레임워크 돌연변이(CDR2 바로 업스트림에서 PRRWIY를 PRRLIY로 돌연변이화시킴)를 L3~11 경쇄 내로 혼입시킴; 및 D) 경쇄 CDR1 돌연변이(SASSSVSYMH를 SASSSVSYIH로 돌연변이화시킴) 및 경쇄 프레임워크 돌연변이(PRRWIY를 PRRLIY로 돌연변이화시킴)를 L3-11 경쇄 내로 혼입시킴. Biacore 데이터 및 항체 서열을 기반으로, 본 발명자들은 다양한 조합의 경쇄 및 중쇄의 공동-발현을 시험하였다:
1. L3-11 경쇄 + 9C12 중쇄
2. L3-11 경쇄 + 8D9 중쇄
3. 7A10 경쇄 + 9C12 중쇄
4. L3-11 경쇄 + A
5. 7A10 경쇄 + A
9. B + 9C12 중쇄
10. C + 9C12 중쇄
11. D + 9C12 중쇄
12. B + 8D9 중쇄
13. C + 8D9 중쇄
14. D + 8D9 중쇄
15. B + 중쇄
16. C + 중쇄
17. D + 중쇄.
배양된 상층액으로부터 항체를 정제하고, 후속해서 CM5 칩 상에 고정된 항 인간 IgG Ab를 이용하여 포착된 IgG를 이용하는 SPR(Biacore 3000)에 의해 시누클레인에의 결합에 대해 분석하였다(표 7).
[표 7]
실시예 8
AD 환자로부터의 전두 피질을 얼음 냉각된 멸균 PBS에서 균질화시키고, 나이프 균질기에 의해 균질화시키고, Branson 소니파이어(sonifier)(5 펄스 0.9초, 출력 2)를 이용하여 소니케이션시키고, 3000 g에서 4℃에서 5분 동안 투명화시켰다(clear). 상층액을 수합하고, 단백질 농도를 BCA에 의해 결정하였다. 알파-시누클레인 응집물의 수준을 결정하는 데 사용된 시료는 2.1~4.8 ug/μl 단백질을 함유하였다. Cisbio사로부터 상업적으로 입수 가능한 알파-시누클레인 응집 검정법(카탈로그 번호 6FASYPEG)을 이용하여 알파-시누클레인 응집물을 측정하였다. Cisbio사로부터 상업적으로 입수 가능한 곧 출시될 시누클레인-p129 응집 검정법을 이용하여 레비 소체에 대한 마커인 세린129 상에서 인산화된 알파-시누클레인(시누클레인-p129)을 측정하였다. 2개의 검정법을 각각의 키트로부터의 각각의 완충제를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게는, 모든 10% 균질물을 용해 완충제에서 1:12 및 1:72로 단계 희석시키고, 10 μl 시료를 10 μl의 각각의 항체 믹스(5 μl Tb-크립테이트 항체 및 5 μl d2 공액체)와 혼합하고, 20시간 동안 인큐베이션하였다. 시간-해상 FRET를 Pherastar 플레이트 판독기 상에서 측정하고, 신호-대-노이즈 비율을 계산하고, 각각의 시료에 대해 단백질까지 정규화하였다.
AD 환자로부터의 전두 피질의 50개의 신선한 냉동 조직 시료를 미국 애리조나주 선시티 소재의 Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation 프로그램(BBDP)으로부터 수득하였다. 중기(Braak 기 III/IV) AD 환자로부터의 25개 시료 및 후기(Braak 기 V/VI) AD 환자로부터의 25개 시료를 수득하였다. 어떠한 시료도 알파-시누클레인 병리의 면역조직화학적 증거를 함유하는 것으로 보고되지 않았다.
결과를 도 9에서 보여준다. 알파-시누클레인 응집물은 모든 50개의 AD 사례에서 측정될 수 있다. 도 9a에서, 10% 뇌 균질물(W/V)의 12- 및 72-배 희석물로부터의 원 데이터는 농도 의존적 신호 세기를 보여준다. 레비 소체 함유 치매(DLB) 환자로부터의 2개 시료를 양성 대조군으로서 포함시켰다(도 9에서 적색 선). 도 9b에서, 1:12 희석으로부터의 데이터를 시료 내 총 단백질까지 정규화하여, 알파-시누클레인 응집물의 존재를 중기(Braak 기 III/IV) AD 및 후기(Braak 기 V/VI) AD 둘 다에서 유사한 수준으로 보여준다.
세린 129 상에서 인산화된 알파-시누클레인은 AD 시료 중 어떠한 시료에서도 검출되지 않은 반면, 이는 DLB 시료에서는 분명하게 존재하였다(도 9c). 세린 129 상에서 인산화된 알파-시누클레인은 분명한 레비 소체 병리에 대한 마커이고, 알파-시누클레인-세린129-포스포 항체를 사용한 사후 뇌의 조직학적 염색을 일상적으로 이용하여, 파킨슨병 및 DLB와 같은 시누클레인병증의 진단을 확인시킨다. 50개의 AD 시료에서 이러한 마커의 부재는, 알파-시누클레인 응집물이 항상 AD 뇌에 존재하고 - 시누클레인 응집물은 분명한 레비 소체 병리의 존재 없이 존재할 수 있음을 가리킬 것이다.
도 8에서의 확인과 조합하여 이들 확인을 기반으로, 본 발명자들은, 알파-시누클레인 응집물(시드)를 중화시킬 수 있거나, 다른 수단에 의해 알파-시누클레인 응집물이 신경 세포 또는 신경 교세포에 들어가서 타우의 응집을 촉진시키는 것을 방지하는 임의의 알파-시누클레인 항체가, 타우병증을 치료하기 위한 치료적 잠재성을 가질 것이라고 가정한다.
SEQUENCE LISTING <110> H. Lundbeck A/S <120> Monoclonal Anti-Alpha-Synuclein Antibodies for Prevent-ing Tau Aggregation <130> 1055 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR 1 Heavy Chain <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR2 Heavy Chain <400> 2 Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR3 Heavy Chain <400> 3 Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR1 Light Chain <400> 4 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR 2 Light Chain <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GM37 CDR 3 Light Chain <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> 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Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 210 215 220 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 340 345 350 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 405 410 415 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 420 425 430 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VL 7C4 <400> 94 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met His 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VL 7A10/8D9 <400> 95 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VL L3 <400> 96 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Phe 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VH 7C4 <400> 97 Arg Tyr Trp Met His 1 5 <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2 VH 5A1 <400> 98 Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 99 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2 VH 9G11 <400> 99 Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2 VH 9C12 <400> 100 Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile Lys 1 5 10 15 Thr <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VH 5A1 <400> 101 Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 VH 9D7 <400> 102 Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VH 7A10/8D9 <400> 103 Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr 1 5 10 <210> 104 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 5A1 VL <400> 104 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 105 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 5A1 VH <400> 105 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Gln Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Tyr Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Thr Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 106 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9D7 VL <400> 106 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9D7 VH <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 108 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9G11 VL <400> 108 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9G11 VH <400> 109 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Thr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 110 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 7C4 VL <400> 110 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 7C4 VH <400> 111 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 112 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> L3 VL <400> 112 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 113 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> L3 VH <400> 113 Gln Val Gln Leu Val Gln Gln Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 114 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 7A10 VL <400> 114 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Asn 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 115 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 7A10 VH <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 116 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 8D9 VL <400> 116 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 117 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 8D9 VH <400> 117 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 118 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9C12 VL <400> 118 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 119 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 9C12 VH <400> 119 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 120 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 6B6 VL <400> 120 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 121 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 6B6 VH <400> 121 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115

Claims (15)

  1. 하기 (A) ~ (D) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 타우(tau)의 응집을 억제하는 데 사용하기 위한 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 결합 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (A) 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    (B) 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    (C) 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    (D) 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
  2. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 것인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 것인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 것인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
    (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    (e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 것인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 응집된 가용성 형태의 알파-시누클레인에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    타우 응집의 억제가 생체내 또는 시험관내에서인, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파-시누클레인 항체가 알츠하이머병 환자에게 투여되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    환자가 알츠하이머병의 레비 소체 변이(Lewy body variant of Alzheimer's disease) 또는 복합 파킨슨 및 알츠하이머병(combined Parkinson and Alzheimer's disease)을 갖지 않는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파-시누클레인 항체가 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD; Argyrophilic Grain Disease), 정신병, AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매(Lewy body dementia) 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP; Progressive Supranuclear Palsy), 전두측두엽 치매(FTD; Frontotemporal dementia 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD; Corticobasal Degeneration), 픽병(Picks Disease), 일차 연령-관련 타우병증(PART; Primary age-related tauopathy), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매(Neurofibrillary tangle-predominant senile dementia), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행(neurodegeneration in relation to Parkinson's disease), 염색체 연관 파킨슨증(Parkinsonism linked to chromosome), 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합(Parkinson-dementia complex of Guam)), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증(Meningioangiomatosis), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 및 리포푸신증(lipofuscinosis)을 포함하는 군으로부터 선택되는 타우병증 환자에게 투여되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파-시누클레인 항체가 알파-시누클레인의 C-말단부에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서,
    항체가 인간 알파-시누클레인의 C-말단 아미노산 110~140 내의 에피토프에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 에피토프가 인간 알파-시누클레인(SEQ ID No:10)의 아미노산 112~117, 112~115, 118~126, 126~138 또는 136~140 내에 존재하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD; Argyrophilic Grain Disease), 정신병, AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매(Lewy body dementia) 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP; Progressive Supranuclear Palsy), 전두측두엽 치매(FTD; Frontotemporal dementia 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD; Corticobasal Degeneration), 픽병(Picks Disease), 일차 연령-관련 타우병증(PART; Primary age-related tauopathy), 신경원섬유 다발-지배 노인성 치매(Neurofibrillary tangle-predominant senile dementia), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병 관련 신경퇴행(neurodegeneration in relation to Parkinson's disease), 염색체 연관 파킨슨증(Parkinsonism linked to chromosome), 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합(Parkinson-dementia complex of Guam)), 신경절교종 및 신경절세포종, 뇌막혈관종증(Meningioangiomatosis), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 헌팅턴병, 납 뇌병증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 및 리포푸신증(lipofuscinosis)을 포함하는 군으로부터 선택되는 타우병증 치료용 약학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서,
    타우병증이 알츠하이머병, 은친화성 입자병(AGD), 정신병, AD로 인한 정신병 또는 AD 환자에서의 정신병, 레비 소체 치매 환자의 정신질환 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD, 또는 이의 변이), TBI(외상성 뇌손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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