BR112014010198B1

BR112014010198B1 - Anticorpos humanizados que reconhecem alfa-sinucleína

Info

Publication number: BR112014010198B1
Application number: BR112014010198-1A
Authority: BR
Inventors: Jose Saldanha; Tarlochan S. Nijjar
Original assignee: Prothena Biosciences Limited
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2022-12-06
Also published as: HRP20230065T1; JP2015502341A; MY165038A; IL272615B; CN104334184B; RS63930B1; ES2937409T3; CN107880123A; SI2771031T1; RU2014121325A; US20180201669A1; EP3378535B1; CA2853531A1; CA2853531C; JP6592059B2; JP2018046836A; US10723792B2; JP6234511B2; SG11201401857WA; RU2016101137A3

Abstract

ANTICORPOS HUMANIZADOS QUE RECONHECEM ALFA-SINUCLEÍNA. Trata-se de anticorpos 9E4 humanizados. Os anticorpos se ligam à alfa=sinucleína humana e podem ser usados para a imunoterapia de doença de corpos de Lewy.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade de Pedido de Patente Provisório No. U.S. 61/553.131, depositado em 28 de outubro de 2011, e Pedido de Patente Provisório No. U.S. 61/711.208, depositado em 8 de outubro de 2012, cada um está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] A Listagem de Sequência gravada no arquivo 424859SEQLIST.txt possui 34 kilobytes e foi criada em 24 de outubro de 2012. As informações contidas nesse arquivo estão aqui incorporadas a título de referência.

ANTECEDENTES

[0003] Sinucleinopatias também conhecidas como doenças de corpos de Lewy (LBDs), são caracterizadas pela degeneração do sistema dopaminérgico, alterações motoras, comprometimento cognitivo, e formação de corpos de Lewy (LBs) e/ou neuritos de Lewy. (McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). As sinucleinopatias incluem doença de Parkinson (inclusive doença de Parkinson idiopática), Doença Difusa de Corpos de Lewy (DLBD) também conhecida como Demência com Corpos de Lewy (DLB) , variante de corpo de Lewy de doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e Parkinson combinada, insuficiência autonômica pura e atrofia de múltiplos sistemas (MSA; por exemplo, Atrofia Olivopontocerebelar, Degeneração Estriatonigral e Síndrome de Shy-Drager). Vários sinais e sintomas não motores são prodrômica das doenças (isto é, o período pré-sintomático, subclínico, pré-clínico, ou pré-motor). Esses sinais iniciais incluem, por exemplo, distúrbio de comportamento do sono REM (RBD), perda de olfato e constipação (Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). As doenças de corpos de Lewy continuam a ser uma causa comum de distúrbios de movimento e deterioração cognitiva na população idosa (Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95).

[0004] A alfa-sinucleína faz parte de uma grande família de proteínas que inclui beta- e gama- sinucleína e sinoretina. A alfa-sinucleína é expressa no estado normal associado a sinapses e acredita-se que exerça uma função em plasticidade neuronal, aprendizagem e memória. Vários estudos implicaram a alfa-sinucleína com uma função em patogênese PD. A proteína pode se agregar para formar fibrilas insolúveis em condições patológicas. Por exemplo, a sinucleína se acumula em LBs (Spillantini et al. , Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). As mutações no gene de alfa-sinucleína são co-segregadas com formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger et al. , Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). A superexpressão de alfa-sinucleína em camundongos transgênicos (Masliah et al. , Science (2000) 287:1265-9) e Drosophila (Feany et al. , Nature (2000) 404:394-8) simula vários aspectos patológicos de doença de corpos de Lewy. Ademais, foi sugerido que oligômeros solúveis de sinucleína podem ser neurotóxicos (Conway KA, et al . , Proc Natl Acad Sei USA (2000) 97:571-576; VollesMJ, Lansbury PT, Jr Biochemistry (2003) 42:7871-7878). O acúmulo de alfa- sinucleína com alterações morfológicas e neurológicas similares em espécies e modelos animais tão diversos como humanos, camundongos, e moscas sugere que essa molécula contribui para o desenvolvimento de doença de corpos Lewy.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA

[0005] A invenção proporciona anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada humanizada madura que compreende as três CDRs de Kabat da SEQ ID NO: 11, e que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 11, e uma cadeia leve humanizada que compreende as três CDRs de Kabat da SEQ ID NO:4, e que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:4. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:11 e a região variável de cadeia leve madura é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:4. Em alguns anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) pode ser ocupada por Y ou F, a posição L83 (numeração de Kabat) pode ser ocupada por F ou L, a posição H73 (numeração de Kabat) pode ser ocupada por N ou D e a posição H93 (numeração de Kabat) pode ser ocupada por A ou S. Em alguns desses anticorpos, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada madura é diferente daquela da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve madura é diferente daquela da SEQ ID NO:4.

[0006] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve NO: 3. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 4 . Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:3. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:9 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:4. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:9 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:10 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:3. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:10 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:4. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:11 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:3. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:11 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:4. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:11 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5.

[0007] A invenção fornece ainda um anticorpo que compreende uma cadeia pesada humanizada que compreende as três CDRs de Rabat da SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve humanizada que compreende as três CDRs de SEQ ID NO:4 desde que a posição L36 (numeração de Kabat) seja ocupada por F ou Y e/ou a posição L83 (numeração de Kabat) seja ocupada por L ou F e/ou a posição H7 3 (numeração de Kabat) seja ocupada por D ou N, e/ou posição H93 (numeração de Kabat) seja ocupada por S ou A. Em alguns desses anticorpos, a posição L3 6 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por F. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 é ocupada por L. Em alguns desses anticorpos posição H73 é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição H93 é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por F e a posição L83 é ocupada por L. Em alguns desses anticorpos, a posição L3 6 é ocupada por F e a posição H73 é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição L3 6 é ocupada por F e a posição H93 é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por F, a posição L83 é ocupada por L e a posição H73 é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por F, a posição L83 é ocupada por L e a posição H93 é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L 36 é ocupada por F, a posição L83 é ocupada por L, a posição H73 é ocupada por D e a posição H93 é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, os resíduos nas posições L36, L83, H73 e H93 (numeração de Kabat) são ocupados por aminoácidos como indicado na Tabela 1 é ocupada por F e a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por N. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L>, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F ,posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S.

[0008] Em qualquer um dos anticorpos acima, uma região variável de cadeia pesada madura pode ser fundida com uma região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve madura pode ser fundida com uma região constante de cadeia leve.

[0009] Em qualquer um dos anticorpos acima, a região constante de cadeia pesada pode ser uma forma mutante de região constante humana natural que reduziu a ligação a um receptor Fcy relativo à região constante humana natural.

[0010] Em qualquer um dos anticorpos acima, a região constante de cadeia pesada pode ser de isotipo IgGl humano. Em alguns anticorpos, o alótipo é Glm3. Em alguns anticorpos, o alótipo é Glml.

[0011] A invenção proporciona ainda um ácido nucleico que codifica qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada maduras mencionadas acima e/ou qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve maduras, por exemplo, SEQ ID N0:15, 17, 18, 19, e 20.

[0012] A invenção proporciona ainda uma célula hospedeira que compreende um vetor que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos descritos acima.

[0013] A invenção proporciona ainda um método de tratar um paciente que possui ou encontra-se em risco de uma doença de corpos de Lewy, que compreende administrar ao paciente um regime eficaz de qualquer um dos anticorpos mencionados acima. Em alguns métodos, a doença é doença de Parkinson. Em alguns métodos, o declínio da função cognitiva no paciente é inibido. Em alguns métodos, os agregados de alfa sinucleína neuríticos e/ou axônicos são reduzidos. Em alguns métodos, a distrofia neurítica no paciente é reduzida. Em alguns métodos, a densidade sináptica e/ou dendrítica é preservada. Em alguns métodos, o método preserva a sinaptofisina e/ou MAP2 no paciente.

[0014] A invenção proporciona ainda um método de tratar um paciente que possui ou encontra-se em risco de sinucleinopatia, que compreende administrar ao paciente um regime eficaz de qualquer um dos anticorpos mencionados acima. Em alguns métodos, a doença é doença de Parkinson. Em alguns métodos, a doença é distúrbio de comportamento do sono REM (RBD). Em alguns métodos, a doença é Demência com Corpos de Lewy (DLB) ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Em alguns métodos, o declínio da função cognitiva no paciente é inibido. Em alguns métodos, os agregados de alfa sinucleína neuríticos e/ou axônicos são reduzidos. Em alguns métodos, a distrofia neurítica no paciente é reduzida. Em alguns métodos, a densidade sináptica e/ou dendrítica é preservada. Em alguns métodos, o método preserva a sinaptofisina e/ou MAP2 no paciente.

[0015] A invenção proporciona ainda métodos de detectar corpos de Lewy em um paciente que possui ou está em risco de uma doença de corpos de Lewy, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos mencionados acima, em que o anticorpo se liga aos corpos de Lewy e o anticorpo ligado é detectado. Em alguns métodos, a doença é doença de Parkinson. Em alguns métodos, a doença é Demência com Corpos de Lewy (DLB) ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Em alguns métodos, o anticorpo é marcado.

[0016] A invenção proporciona ainda um método de reduzir a formação de corpos de Lewy em um paciente que possui ou encontra-se em risco de uma doença de corpos de Lewy, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos mencionados acima. Em alguns métodos, a doença é doença de Parkinson. Em alguns métodos, a doença é Demência com Corpos de Lewy (DLB) ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Em alguns métodos, o declínio da função cognitiva no paciente é inibido. Em alguns métodos, os agregados de alfa sinucleína neuríticos e/ou axônicos são reduzidos. Em alguns métodos, a distrofia neurítica no paciente é reduzida. Em alguns métodos, a densidade sináptica e/ou dendrítica é preservada. Em alguns métodos, o método preserva a sinaptofisina e/ou MAP2 no paciente.

[0017] A invenção proporciona ainda um método de inibir a agregação de sinucleína ou remover os corpos de Lewy ou agregados de sinucleína em um paciente que possui ou encontra-se em risco de uma doença de corpos de Lewy, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos mencionados acima. Em alguns métodos, a doença é doença de Parkinson. Em alguns métodos, a doença é Demência com Corpos de Lewy (DLB) ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Em alguns métodos, o declínio da função cognitiva no paciente é inibido. Em alguns métodos, os agregados de alfa sinucleína neuríticos e/ou axônicos são reduzidos. Em alguns métodos, a distrofia neuritica no paciente é reduzida. Em alguns métodos, a densidade sináptica e/ou dendrítica é preservada. Em alguns métodos, o método preserva a sinaptofisina e/ou MAP2 no paciente.

[0018] A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos mencionados acima.

[0019] A invenção proporciona ainda um método de produzir um anticorpo, que compreende cultivar as células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo, de modo que a célula secrete o anticorpo; e purificar o anticorpo a partir do meio de cultura celular; em que o anticorpo é qualquer um dos anticorpos descritos acima.

[0020] A invenção proporciona ainda um método de produzir uma linhagem celular que produz um anticorpo, que compreende introduzir um vetor que codifica as cadeias pesadas e leves de um anticorpo e um marcador selecionável nas células; propagar as células sob condições para selecionar as células que possuem um número de cópia aumentado do vetor; isolar as únicas células da célula selecionada; e inserir as células clonadas no banco de dados de uma única célula selecionada com base no rendimento de anticorpo; em que o anticorpo é qualquer um dos anticorpos descritos acima. Alguns desses métodos compreendem ainda propagar as células sob condições seletivas e classificar as linhagens celulares que expressam e secretam naturalmente pelo menos 100 mg/L/106 células/24 h.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0021] A Figura 1 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos do mAh murídeo parental (referido como m9E4) com a região variável madura de cadeia pesada 9E4 humanizada. 1791009Hu9E4VHFr (SEQ ID NO:7) é a sequência VH aceitadora humana. As regiões CDR de acordo com a definição de Kabat estão sublinhadas e em negrito.

[0022] A Figura 2 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos do mAb murídeo parental (referido como m9E4) com a região variável madura de cadeia leve 9E4 humanizada. Hu9E4VLFr (SEQ ID NO:2) é a sequência VL aceitadora humana. As regiões CDR de acordo com a definição de Kabat estão sublinhadas e em negrito.

[0023] A Figura 3 mostra os resultados de imunoterapia passiva com 9E4 em desempenho de memória em uma porção de sonda do teste do labirinto aquático de Morris.

[0024] A Figura 4 mostra os resultados de imunoterapia passiva com 9E4 em velocidade e erros no teste de trave redonda.

[0025] A Figura 5 mostra a imunoprecipitação de várias versões de anticorpos 9E4 humanizados dirigidas a seu antígeno obtido do tecido doente. Ch9E4: 9E4 quimérico; H1L3 : Hu9E4VHvl- Hu9E4VLv3; H3L2: Hu9E4VHv3- Hu9E4VLv2; H3L3: Hu9E4VHv3- Hu9E4VLv3; N.S.= não específico.

[0026] A Figura 6 mostra o ensaio Western blotting de sinucleína humana recombinante com camundongo, anticorpos 9E4 quiméricos e humanizados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0027] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácido

[0028] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VLFr.

[0029] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VLvl.

[0030] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VLv2.

[0031] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VLv3.

[0032] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácido de região variável m9E4VH.

[0033] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VHFr.

[0034] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VHvl.

[0035] SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VHv2.

[0036] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VHv3.

[0037] SEQ ID NO:11 é a sequência de aminoácido de região variável Hu9E4VHv4.

[0038] SEQ ID NO:12 é a sequência de aminoácido de alfa-sinucleína tipo selvagem humana natural.

[0039] SEQ ID NO:13 é a sequência de aminoácido de região cons tante de cadeia leve 9E4 humanizada, com Arginina na N- -terminação.

[0040] SEQ ID NO:14 é a sequência de aminoácido de região constante de cadeia pesada humanizada

[0041] SEQ ID NO: 15 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VLvl.

[0042] SEQ ID NO: 16 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VLv2.

[0043] SEQ ID NO: 17 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VLv3.

[0044] SEQ ID NO: 18 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VHvl.

[0045] SEQ ID NO: 19 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VHv2.

[0046] SEQ ID NO: 20 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VHv3.

[0047] SEQ ID NO: 21 é a sequência de nucleotídeo de região variável Hu9E4VHv4.

[0048] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácido de peptideo de sinal Hu9E4VL.

[0049] SEQ ID NO:23 é a sequência de nucleotídeo de peptideo de sinal Hu9E4VL.

[0050] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácido de peptideo de sinal Hu9E4VH.

[0051] [0001] SEQ ID NO:25 é a sequência de nucleotídeo de peptideo de sinal Hu9E4VH.

[0052] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácido consenso Hu9E4VL.

[0053] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácido consenso Hu9E4VH.

[0054] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácido de região constante de cadeia leve 9E4 humanizada, sem a Arginina na N-terminação.

[0055] Seq Id No: 29 É A Sequência De Aminoácido Da Versão 3 De Cadeia Leve 9e4 Humanizada Que Compreende (A) Uma Região Variável E (B) Uma Região Constante Com Arginina Na N-terminação.

[0056] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácido da versão 3 da cadeia leve 9E4 humanizada que compreende (a) uma região variável e (b) uma região constante sem a Arginina na N-terminação.

[0057] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácido da versão 3da cadeia pesada 9E4 humanizada que compreende uma região variável e uma região constante.

[0058] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácido da versão BIP de região constante de alótipo Glm3 de cadeia pesada 9E4 humanizada

DEFINIÇÕES

[0059] Os anticorpos monoclonais são tipicamente fornecidos sob a forma isolada. Isso significa que um anticorpo é tipicamente pelo menos 50% w/w puro de proteínas e outras macromoléculas que surgem de sua produção ou purificação, porém não excluem a possibilidade que o anticorpo monoclonal é combinado com um excesso de carreador(es) farmaceuticamente aceitável(is) ou outro veículo destinado para facilitar seu uso. Às vezes, os anticorpos monoclonais são pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95 ou 99% w/w puros de proteínas e outras macromoléculas a partir da produção ou purificação.

[0060] A ligação específica de um anticorpo monoclonal a seu antígeno alvo significa uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 109, ou 1010 M'1. A ligação específica é detectavelmente maior em magnitude e distinguível da ligação não específica que ocorre em pelo menos um alvo não relacionado. A ligação específica pode ser o resultado de formação de ligações entre grupos funcionais particulares ou ajuste espacial particular (por exemplo, tipo lock and key) enquanto a ligação não especifica é geralmente o resultado de forças de van der Waals. Entretanto, a ligação específica não indica necessariamente que um anticorpo monoclonal liga um e somente um alvo.

[0061] A unidade estrutural de anticorpo básico é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par possui uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa) . A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Essa região variável é inicialmente expressa ligada a um peptídeo de sinal clivável. A região variável sem o peptídeo de sinal às vezes é referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura de cadeia leve significa uma região variável de cadeia leve sem o peptídeo de sinal de cadeia leve. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora.

[0062] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. (Veja de forma geral, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos)).

[0063] As regiões variáveis maduras de cada par de cadeias leves/pesadas formam o sítio de ligação ao anticorpo. Assim, um anticorpo intacto possui dois sítios de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são iguais. Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo a ligação a um epítopo específico. A partir da N-terminação até C-terminal, as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878- 883 (1989). Kabat também fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração de Kabat) em que os resíduos correspondentes entre cadeias pesadas diferentes ou entre cadeias leves diferentes são atribuídos com o mesmo número (por exemplo, H83 significa a posição 83 pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada madura; também a posição L36 significa a posição 36 pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve madura).

[0064] 0 termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação desses. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto a partir do qual esses são derivados para ligação específica ao alvo inclusive cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab' , F(ab')2, F(ab)c, anticorpos divalentes, Dabs, nanocorpos, e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" também inclui um anticorpo biespecífico e/ou um anticorpo humanizado. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial que possui dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes (veja, por exemplo, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)). Em alguns anticorpos biespecíficos, os dois pares de cadeia pesada/leve diferentes incluem um par de cadeia pesada/cadeia leve 9E4 humanizado e um par de cadeia pesada/leve específico para um epítopo diferente em alfa sinucleína daquele ligado por 9E4. Os anticorpos humanizados são geralmente discutidos abaixo na Seção IV B.

[0065] O termo "epítopo" se refere a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por enovelamento terciário de uma ou mais proteínas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos mediante a exposição a solventes desnaturantes enquanto os epítopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos durante o tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Os métodos de determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

[0066] Os anticorpos que reconhecem epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados em um imunoensaio simples que mostra a capacidade de um anticorpo competir com a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. O epitopo de um anticorpo também pode ser definido por cristalografia de raio x do anticorpo ligado a seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, dois anticorpos possuem o mesmo epitopo se todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos possuem epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro.

[0067] A competição entre os anticorpos é determinada por um ensaio em que um anticorpo sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (veja, por exemplo, Junghans et al. , Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibir a ligação do anticorpo de referência por pelo menos 50%, porém preferivelmente 75%, 90% ou 99% como medido em um ensaio de ligação competitiva. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos concorrentes) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o impedimento estérico ocorra.

[0068] Um "paciente" inclui um humano ou outro mamífero que recebe tratamento profilático ou terapêutico.

[0069] Para propósitos de classificar as substituições de aminoácidos como conservadoras ou não conservadoras, os aminoácidos são agrupados da seguinte maneira: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação de cadeia) : gly, pro; and Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservadoras envolvem substituições entre aminoácidos na mesma class. As substituições não conservadoras constituem trocar um elemento de uma dessas classes por um elemento de outra.

[0070] As porcentagens de identidade de sequência são determinadas com sequências de anticorpo maximamente alinhadas pela convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo de indivíduo (por exemplo, toda a região variável madura de cadeia pesada ou leve) estiver sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a porcentagem de identidade de sequência entre as regiões de indivíduo e anticorpo de referência é o número de posições ocupado pelo mesmo aminoácido na região de indivíduo e de anticorpo de referência dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para se converter na porcentagem.

[0071] As composições ou métodos que "compreendem" um ou mais elementos citados podem incluir outros elementos não especificamente citados. Por exemplo, uma composição que compreende um anticorpo pode conter o anticorpo individualmente ou em combinação com outros ingredientes.

[0072] A designação de uma faixa de valores inclui todos os números inteiros dentro ou definindo a faixa, e todas as subfaixas definidas por números inteiros dentro da faixa.

[0073] Exceto onde evidente de outro modo a partir do contexto, o termo "cerca de" inclui valores dentro do SEM de um valor declarado.

[0074] Um indivíduo se encontra em risco aumentado de uma doença se o indivíduo possuir pelo menos um fator de risco conhecido (por exemplo, genético, bioquímico, histórico familiar, exposição situacional) expondo os indivíduos com esse fator de risco a um risco estatisticamente significativamente maior de desenvolver a doença do que os indivíduos sem o fator de risco.

[0075] O termo "sintoma" se refere a uma evidência subjetiva de uma doença, como marcha alterada, como percebido pelo paciente. Um "sinal" se refere a uma evidência obj etiva de uma doença como observado por um médico.

[0076] Média de significância estatística p<0,05.

[0077] "Função cognitiva" se refere a processos mentais como atenção, memória, produzir e entender linguagem, resolver problemas, e interesse pelo meio que vive e cuidado pessoal.

[0078] "Função cognitiva melhorada" ou "função cognitiva aprimorada" se refere à melhora relativa a uma linha de base, por exemplo, diagnose ou início de tratamento. "Declínio de função cognitiva" se refere a uma redução na função relativa a essa linha de base.

[0079] Em sistemas de modelo animal como rato ou camundongo, a função cognitiva pode ser medida por métodos que utilizam um labirinto em que os indivíduos usam informações espaciais (por exemplo, labirinto aquático de Morris, labirinto circular de Barnes, labirinto de braço radial elevado, labirinto em T e outros), condicionamento de medo, esquiva ativa, campo aberto iluminado, medidor de atividade no escuro, labirinto em cruz elevado, teste exploratório de dois compartimentos ou teste de nado forçado.

[0080] Em humanos, a função cognitiva pode ser medida por um ou vários testes padronizados. Exemplos de um teste ou ensaio de função cognitiva foram descritos (Ruoppila, 1. and Suutama, T. Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53,44-65, 1997) e incluem testes psicométricos padronizados (por exemplo, Wechsler Memory Scale, the Wechsler Adult Intelligence Scale, Raven's Standard Progressive Matrices, Schaie- Thurstone Adult Mental Abilities Test), testes neuropsicológicos (por exemplo, Luria-Nebraska), autoavaliações metacognitivas (por exemplo, Metamemory Questionnaire), testes de rastreio visual-espacial (por exemplo, Poppelreuter1s Figures, Clock Recognition, Honeycomb Drawing and Cancellation), testes de rastreio cognitivo (por exemplo, Folstein's Mini Mental State Test) e teste de tempo de reação. Outros testes padrão de desempenho cognitivo incluem a sub-escala cognitiva de Escala de Avaliação de Doença de Alzheimer (ADAS-cog); a impressão global clínica de escala de mudança (escala CIBIC-plus); as Atividades de Estudo Cooperativo de Doença de Alzheimer de Escala de Vida Diária (ADCS-ADL) ; o Mini- Exame do Estado Mental (MMSE); o Inventário Neuropsiquiátrico (NPI); a Escala de Avaliação Clínica de Demência (CDR); a bateria de testes Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) ou Sandoz Clinical Assessment-Geriatric (SCAG), Teste de Stroop, Trail Making, Wechsler Digit Span, e o teste cognitivo computadorizado CogState. Ademais, a função cognitiva pode ser medida utilizando técnicas de formação de imagens como Tomografia por Emissão de Positrons (PET), imagem de ressonância magnética funcional (fMRI), Tomografia Computadorizada por Emissão Fóton Único (SPECT), ou qualquer outra técnica de formação de imagens que permita medir a função cerebral.

DESCRIÇÃO DETALHADA Geral

[0081] A invenção proporciona anticorpos 9E4 humanizados. Os anticorpos são úteis para o tratamento e diagnóstico de uma doença de corpos de Lewy.

Moléculas alvo

[0082] A alfa-sinucleína tipo selvagem humana natural é um peptídeo de 140 aminoácidos que possui a seguinte sequência de aminoácido: MDVFMKGLSK AKEGWAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGWH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO:12)

[0083] (Ueda et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90:11282-6) .; número de acesso GenBank: P37840) . A proteína possui três domínios reconhecidos, um domínio de repetição KTKE que abrange os aminoácidos 1-61, um domínio NAC (Componente não-amiloide) que varia de cerca de aminoácidos 60-95, e um domínio acídico C-terminal que varia de cerca de aminoácidos 98 a 140.

[0084] Exceto onde evidente de outro modo a partir do contexto, a referência à alfa-sinucleína ou seus fragmentos inclui a sequência de aminoácidos tipo selvagem humana natural indicada acima, e variantes alélicas humanos dessa, particularmente aqueles associados à doença de corpos de Lewy (por exemplo, E46K, A30P e A53T, com a primeira letra indicando o aminoácido na SEQ ID NO:12, o número é a posição de códon na SEQ ID NO: 12, e a segunda letra é o aminoácido na variante alélica). Essas variantes podem estar opcionalmente presentes individualmente ou em qualquer combinação em qualquer aspecto da invenção descrito abaixo. As mutações induzidas E83Q, A90V, A76T, que aumentam a agregação de alfa sinucleína, também podem as outras e/ou variantes alélicas humanas E46K, A30P e A53T.

III. Doenças de Corpos de Lewy

[0085] As Doenças de Corpos de [0002] Lewy (LBD) são caracterizadas pela degeneração do sistema dopaminérgico, alterações motoras, comprometimento cognitivo, e formação de corpos de Lewy (LBs). (McKeith et al. , Neurology (1996) 47:1113-24). Os Corpos de Lewy são depósitos de proteínas esféricas encontrados em células do nervo. A presença desses no cérebro atrapalha a função normal do cérebro interrompendo a ação de mensageiros químicos incluindo acetilcolina e dopamina. As doenças de Corpos de Lewy incluem doença de Parkinson (inclusive doença de Parkinson idiopática), Doença Difusa de Corpos de Lewy (DLBD) (também conhecida como Demência com Corpos de Lewy DLB), variante de Corpos de Lewy de doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e Parkinson Combinada e como atrofia de múltiplos sistemas (MSA; por exemplo, Atrofia Olivopontocerebelar, Degeneração Estriatonigral e Síndrome de Shy-Drager). A DLBD compartilha sintomas de doença de Alzheimer e Parkinson. A DLBD se difere de doença de Parkinson principalmente pela localização de Corpos de Lewy. Em DLBD, os Corpos de Lewy se formam principalmente no córtex. Em doença de Parkinson, esses se formam principalmente na substância negra. Outras doenças de Corpos de Lewy incluem Falência Autonômica Pura, disfagia de corpos de Lewy, LBD Incidental, e LBD Herdada (por exemplo, mutações do gene alfa-sinucleína, PARK3 e PARK4).

IV. Anticorpos da Invenção A. Especificidade de Ligação e Propriedades Funcionais

[0086] Os anticorpos humanizados da invenção se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana. A afinidade de alguns anticorpos humanizados (isto é, Ka) está preferivelmente dentro de um fator de cinco ou dois daquele do anticorpo de camundongo 9E4. Alguns anticorpos humanizados possuem a afinidade que é igual (dentro do erro experimental) ou maior que aquela do anticorpo 9E4 de camundongo. Os anticorpos humanizados preferidos se ligam ao mesmo epítopo e/ou competem com o anticorpo de camundongo 9E4 para ligação à alfa-sinucleína humana.

[0087] Em alguns anticorpos, o 9E4 humanizado forma um braço de um anticorpo biespecífico, o outro braço desse é um anticorpo que se liga a um receptor expresso na barreira hematoencefálica, como um receptor de insulina, um receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), um receptor de leptina, ou um receptor de lipoproteína, ou preferivelmente um receptor de transferrina (Friden et al., PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden et al. , Science 259:373-377, 1993). Esse anticorpo biespecífico pode ser transferido através da barreira hematoencefálica por transcitose mediada por receptor. A captação cerebral do anticorpo biespecífico pode ser adicionalmente aumentada ao elaborar o anticorpo biespecífico para reduzir sua afinidade com o receptor da barreira hematoencefálica. A afinidade reduzida do receptor resultou em uma maior distribuição no cérebro (veja, por exemplo, Atwal. et al. Sei. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al. Sei. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).

[0088] Os anticorpos biespecíficos exemplificativos também podem ser (1) um anticorpo de domínio variável duplo (DVD-Ig), onde cada cadeia leve e cadeia pesada contém dois domínios variáveis em tandem através de uma ligação de peptídeo curta (Wu et al. , Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) urn Tandab, que é uma fusão de dois anticorpos bivalentes de cadeia simples que resulta em um anticorpo biespecífico tetravalente que possui dois sítios de ligação para cada antígeno alvo; (3) um flexibody, que é uma combinação de scFvs com um anticorpo bivalente que resulta em uma molécula multivalente; (4) uma denominada molécula "dock and lock", baseada no "domínio de dimerização e docking" em Proteína Quinase A, que, quando aplicado a Fabs, pode produzir uma proteína de ligação biespecífica trivalente que consiste em dois fragmentos Fab idênticos ligados a um fragmento Fab diferente; (5) uma denominada molécula Scorpion, que compreende, por exemplo, dois scFvs fundidos com ambas as terminações de uma região Fc humana. Exemplos de plataformas úteis para preparar anticorpos biespecíficos incluem, porém sem caráter limitativo, BiTE (Micromet), DART (MacroGenics) , Fcab e Mab2 (F-star) , IgGl elaborado por Fc (Xencor) ou DuoBody (baseado na troca de braço Fab, Genmab).

B. Anticorpos Humanizados

[0089] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente elaborado em que as CDRs de um anticorpo "doador" não-humano são enxertadas em sequências de al., US5,530,101 and 5,585,089; Winter et al., US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 6,881,557, Foote, US 6,881,557). As sequências de anticorpo aceitador podem ser, por exemplo, uma sequência de região variável de anticorpo humano madura, um composto dessas sequências, uma sequência consenso de sequências de anticorpo humano (por exemplo, sequências consenso de região variável de cadeia leve e pesada de Kabat, 1991, supra), ou uma sequência de região variável de linha germinativa. Uma sequência aceitadora preferida para a cadeia pesada é a região variável humana de cadeia pesada madura com código de acesso NCBI AAC50998 (GI: 1791009) ou outra região variável de cadeia pesada madura derivada da linha germinativa IGHV3-7'01 ou IGHV3-7'02 (nome de clones V3-7 ou VH3-11) (Glas et al., Clin Exp Immunol. 107:372-80, 1997) ou uma sequência de região variável de cadeia pesada madura que incorpora uma dessas sequências de linha germinativa. Para a cadeia leve, uma sequência aceitadora preferida é a região variável de cadeia leve madura com código de acesso NCBI AAY33350 (GI:63102889) ou outra sequência de cadeia leve madura derivada da linha germinativa IGKV1D-39 ou IGKV1-39 (nome de clone 02 ou 012) (Kramer et al. , Eur J Immunol. 35:2131-45, 2005) ou uma sequência de região variável madura de cadeia leve que incorpora uma dessas sequências de linha germinativa. Assim, um anticorpo humanizado da invenção é um anticorpo que possui três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada como definido por Kabat do anticorpo 9E4 doador e sequências de estrutura de região variável madura e regiões sequências de anticorpo humano. Também, uma cadeia pesada humanizada é uma cadeia pesada que possui três CDRs de cadeia pesada como definido por Kabat da cadeia pesada do anticorpo 9E4, e uma sequência variável de cadeia pesada madura e uma sequência de região constante de cadeia pesada, se presente, total ou substancialmente de sequência de cadeia pesada de anticorpo humano. Também, uma cadeia leve humanizada é uma cadeia leve que possui três CDRs de cadeia leve como definido por Kabat da cadeia leve do anticorpo 9E4, e uma sequência variável de cadeia leve madura e uma sequência de região constante de cadeia leve, se presente, total ou substancialmente de sequência de cadeia leve de anticorpo humano. As sequências de estrutura de região variável madura de uma cadeia de anticorpo ou a sequência de região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência de estrutura de região variável madura humana ou sequência de região constante humana respectivamente quando pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de resíduos correspondentes definidos por Kabat forem idênticos.

[0090] Alguns aminoácidos dos resíduos de estrutura de região variável madura humana podem ser selecionados para substituição com base em sua possível influência sobre a conformação de CDR e/ou ligação ao antígeno. A investigação dessas possíveis influências é realizada por modelagem, exame das características dos aminoácidos em localizações particulares, ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de aminoácidos particular.

[0091] Por exemplo, quando um aminoácido se difere entre um resíduo de estrutura de região variável madura de murídeo e um resíduo de estrutura de região variável madura humana selecionado, o aminoácido de estrutura humana pode ser substituído pelo aminoácido de estrutura equivalente do anticorpo de camundongo quando espera-se razoavelmente que o aminoácido: se ligue de maneira não covalente diretamente ao antígeno, esteja adjacente a uma região CDR, interaja de outro modo com uma região CDR (por exemplo, dentro de cerca de 6 Â de uma região CDR) medeie a interação entre as cadeias pesadas e leves.

[0092] A invenção proporciona formas humanizas do anticorpo 9E4 de camundongo inclusive três regiões variáveis maduras de cadeia leve humanizada exemplificadas (Hu9E4VLvl-v3; SEQ ID NOs:3-5) e quatro regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizada exemplificadas (Hu9E4VHvl-v4; SEQ ID NOS:8-11). SEQ ID NO:4 inclui as três CDRs de Kabat da cadeia leve de 9E4 de camundongo e das estruturas de região variável madura de AAY33350. SEQ ID NOS. 3 e 5 incluem retromutações como mostrado na Tabela 2. SEQ ID NO. 11 inclui as três CDRs de Kabat de 9E4 de camundongo e as estruturas de região variável madura de AAC50998. SEQ ID N0s:8-10 inclui retromutações como mostrado na Tabela 3.

[0093] A invenção proporciona variantes do anticorpo 9E4 humanizado em que a região variável madura de cadeia pesada humanizada mostra pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade à SEQ ID NOs:8-ll e a região variável madura de cadeia leve humanizada mostra pelo menos 90, 95 ou 99% de sequência identidade à SEQ ID NOs:3-5, porém em que qualquer variação da SEQ ID NO. designada ocorre em uma estrutura de região variável madura exceto em uma CDR de Kabat. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por Y ou F, e/ou a posição L83 é ocupada por F ou L, e/ou a posição H73 é ocupada por N ou D e/ou a posição H93 é ocupada por A ou S (todas as posições aqui, como em outros lugares, nesse pedido são por numeração de Kabat). Em alguns desses anticorpos, algumas ou todas as retromutações em Hu9E4VLvl-v3 e Hu9E4VHvl-v4 são mantidas. Em outras palavras, uma ou ambas as posições H73 e H93 de cadeia pesada são ocupadas por D e A respectivamente. Também, em alguns anticorpos uma ou ambas as posições L36 e L83 de cadeia leve são ocupadas por F e L respectivamente. Em alguns anticorpos, 1, 2, 3 ou todas as quatro posições H73, H93, L36 e L83 é/são ocupada (s) por D, A, F e L respectivamente. Em alguns anticorpos, 0, 1, ou 2 posições são alteradas na estrutura de região variável madura de cadeia pesada em relação à SEQ ID NO: 11, e 0, 1, ou 2 posições são alteradas na estrutura de região variável madura de cadeia leve em relação à SEQ ID NO:4.

[0094] Alguns anticorpos compreendem uma cadeia pesada humanizada que compreende as três CDRs de Kabat da SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve humanizada que compreende as três CDRs de Kabat da SEQ ID NO:4 desde que a posição L3 6 (numeração de Kabat) seja ocupada por F ou Y e/ou a posição L83 (numeração de Kabat) seja ocupada por L ou F e/ou a posição H73 (numeração de Kabat) seja ocupada por D ou N, e/ou a posição H93 (numeração de Kabat) seja ocupada por S ou A. Em alguns desses anticorpos, a posição L3 6 (numeração de Kabat) é ocupada por F. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, e a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 é ocupada por F, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L3 6 (numeração de Kabat) é ocupada por F, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L e a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição L83 (numeração de Kabat) é ocupada por L, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D, e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por D e a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição H73 (numeração de Kabat) é ocupada por Dea posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por S. Em alguns desses anticorpos, a posição H93 (numeração de Kabat) é ocupada por A. Em alguns desses anticorpos, a posição L36 é ocupada por Y, a posição L83 é ocupada por F, a posição H73 é ocupada por N e a posição H93 é ocupada por S. Alguns anticorpos exemplificativos com os resíduos desejados nas posições L36, L83, H73, e H93 e combinações desses esta listados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Anticorpos exemplificativos com os resíduos desejados nas posições L36, L83, H73, e H93 (numeração de Kabat).

[0095] Em alguns anticorpos, a região variável madura de cadeia pesada possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:10. Em alguns anticorpos, a região variável madura de cadeia leve possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:3. Em alguns desses anticorpos, a região variável madura de cadeia pesada possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:10, e a região variável madura de cadeia leve possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:3. Em alguns desses anticorpos, a região variável madura de cadeia pesada possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:10, e a região variável madura de cadeia leve possui uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO:5.

[0096] Outras substituições de aminoácido podem ser feitas na estrutura de região variável madura, por exemplo, em resíduos que não estão em contato com as CDRs. Geralmente, as substituições feitas nas sequências humanizadas variantes são conservadoras em relação aos aminoácidos substituídos. Em alguns anticorpos, as substituições relativas a Hu9E4VLvl-v3 e Hu9E4VHvl-v4 (sejam ou não conservadoras) não exercem efeito substancial sobre a afinidade de ligação ou potência do anticorpo resultante em relação a Hu9E4VLvl-v3 e Hu9E4VHvl-v4, isto é, sua capacidade de se ligarem à alfa-sinucleína humana.

[0097] As variantes tipicamente se diferem das sequências de região variável madura de cadeia pesada ou leve de Hu9E4VLvl-v3 e Hu9E4VHvl-v4 por um número pequeno (por exemplo, tipicamente não maior que 1, 2, 3, 5 ou 10 em cada estrutura de região variável madura de cadeia leve ou cadeia pesada, ou ambas) de substituições, deleções ou inserções.

C. Seleção de Região Constante

[0098] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A seleção de região constante depende, em parte, se a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo, fagocitose celular dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento forem desejadas. Por exemplo, os isotipos humanos IgGl e IgG3 possuem citotoxicidade dependente de complemento e os isotipos humanos IgG2 e IgG4 não. IgGl e IgG3 humanos também induzem as funções efetoras medidas por célula mais forte do que IgG2 e IgG4 humanos. As regiões constantes de cadeia leve podem ser lambda ou kappa. Uma região constante kappa de cadeia leve humana exemplificativa possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:13. Algumas dessas regiões constantes kappa de cadeia leve podem ser codificadas por uma sequência de ácido nucleico. A arginina N-terminal da SEQ ID NO:13 pode ser omitida, nesse caso a região constante kappa de cadeia leve possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:28. Algumas dessas regiões constantes kappa de cadeia leve podem ser codificadas por uma sequência de ácido nucleico. Uma região constante de cadeia pesada IgGl humana exemplificativa possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 (com ou sem a lisina C-terminal). Algumas dessas regiões constantes de cadeia pesada podem ser codificadas por uma sequência de ácido nucleico. Os anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros que contêm duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, como cadeias pesadas, cadeias leves separadas, como Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, ou como anticorpos de cadeia única em que os domínios variáveis maduros de cadeia pesada e leve são ligados através de um espaçador.

[0099] As regiões constantes humanas mostram a variação alotípica e a variação isoalotípica entre diferentes indivíduos, isto é, as regiões constantes podem se diferir em indivíduos diferentes em uma ou mais posições polimórficas. Os isoalótipos se diferem de alótipos pelo fato que os soros que reconhecem um isoalótipo se ligam a uma região não polimórfica de um ou mais outros isotipos. Assim, por exemplo, outra região constante de cadeia pesada é do alótipo IgGl Glm3 e possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:32. Ainda outra região constante de cadeia pesada possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:32 exceto que essa é desprovida da lisina C-terminal.

[00100] [0003] Um ou vários aminoácidos na terminação amino ou carbóxi da cadeia leve e/ou pesada, como a lisina C-terminal da cadeia pesada, podem estar ausentes ou derivatizados em uma proporção ou todas as moléculas. Substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora como a citotoxicidade mediada por complemento ou ADCC (veja, por exemplo, Winter et al. , Patente No. US 5.624.821; Tso et al., Patente No. US 5.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia- vida em humanos (veja, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). As substituições exemplificativas incluem uma Gin na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428 (a numeração de EU é usada nesse parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. A substituição em qualquer ou todas as posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduz a afinidade a receptores Fey, particularmente receptor FcyRI (veja, por exemplo, US 6.624.821). Alguns anticorpos possuem a substituição de alanina nas posições 234, 235 e 237 de IgGl humano para reduzir as funções efetoras. Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 em IgG2 humano são substituídas por alanina e a posição 235 por glutamina (veja, por exemplo, US 5.624.821).

D. Expressão de Anticorpos Recombinantes

[00101] Os anticorpos podem ser produzidos por expressão recombinante. Os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos podem ser códon-otimizados para a expressão no tipo de célula desejado (por exemplo, CHO ou Sp2/0). As construções de ácido nucleico recombinante tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão ligada às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, inclusive regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Uma vez que o vetor foi incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para uma expressão de alto nível das sequências de nucleotídeo, e a coleção e purificação dos anticorpos de reação cruzada. 0 vetor ou vetores que codificam as cadeias de anticorpo também podem conter um gene selecionável, como diidrofolato reductase, para permitir a amplificação de número de cópia dos ácidos nucleicos que codificam as cadeias de anticorpo.

[00102] E. coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para expressar anticorpos, particularmente fragmentos de anticorpo. Micróbios, como levedura também são úteis para a expressão. Sacharomicetos é um hospedeiro de levedura preferido, adequados que possuem sequências de controle de expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação e similares como desejado. Os promotores típicos incluem 3- fosfoglicerato quinase e outras enzimas glicolíticas. Os promotores de levedura induzíveis incluem, entre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocromo C, e enzimas responsáveis por utilizações de maltose e galactose.

[00103] Células de mamíferos podem ser usadas para expressar segmentos de nucleotídeo que codificam imunoglobulinas ou fragmentos dessas. Veja, Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987) . Inúmeras linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem linhagens celulares CHO, várias linhagens celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L, e mielomas produtores de não anticorpo que incluem Sp2/0 e eNSO. Pode ser vantajoso utilizar células não humanas. Os vetores de expressão dessas células podem incluir sequências de controle de expressão, como uma origem de replicação, um promotor, um potenciador (Queen et al. , Immunol. Rev. 89:49 (1986)), e sítios de informações de processamento necessários, como sítios de ligação de ribossomo, sítios de splice de RNA, sítios de poliadenilação, e sequências terminadoras transcricionais. As sequências de controle de expressão adequadas são promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovirus, papilomavírus bovino, e similares. Veja, Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

[00104] Ao introduzir vetor(s) que codifica(m) cadeias pesadas e leves de anticorpo na cultura celular, grupos de células podem ser classificados quanto a produtividade de crescimento e qualidade de produto em meios isentos de soro. Grupos de células produtoras Top podem ser então submetidos à clonagem de única célula baseada em FACS para gerar linhagens monoclonais. Produtividades específicas acima de 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem a títulos de produto maiores que 7,5 g/L de cultura, podem ser vantajosas. Os anticorpos produzidos por clones de única célula também podem ser testados quanto à turvação, propriedades de filtração, PAGE, IEF, UV scan, HP-SEC, mapeamento de carboidrato-oligossacarídeo, espectrômetro de massa, e ensaio de ligação, como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode ser então colocado no banco de dados em múltiplos frascos e armazenado congelado para uso subsequente.

[00105] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, inclusive captura de proteína A, cromatografia em coluna (por exemplo, interação hidrofõbica ou troca iônica), baixo pH para inativação virai e similares (veja, geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)) .

[00106] A metodologia para a produção comercial de anticorpos que incluem a otimização de códon, seleção de promotores, elementos de transcrição, e terminadores, clonagem de única célula isenta de soro, inserção de células em banco de dados, uso de marcadores de seleção para a amplificação de número de cópias, terminador CHO, clonagem de única célula isenta de soro, aprimoramento de títulos de proteínas (veja, por exemplo, US 5.786.464, US 6.114.148, US 6.063.598, US 7.569.339, W02004/050884, W02008/012142, W02008/012142, W02005/019442, WO2008/107388, and WO2009/027471, e US 5.888.809).

V. Ácidos Nucleicos

[00107] A invenção proporciona ainda ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias pesadas e leves descritas acima. Tipicamente, os ácidos nucleicos também codificam um peptideo de sinal fundido com as cadeias pesadas e leves maduras (por exemplo, peptídeos de sinal que possuem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 22 e 24 que podem ser codificadas por SEQ ID NOS: 23 e 25). As sequências de codificação nos ácidos nucleicos podem estar em ligação operável com as sequências reguladoras para garantir a expressão das sequências de codificação, como um promotor, potenciador, sítio de ligação ao ribossomo, sinal de terminação transcricional e similares. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves podem se apresentar sob a forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados, por exemplo, por síntese em estado sólido ou PCR de oligonucleotídeos sobrepostos. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves podem ser unidos como um ácido nucleico contíguo, por exemplo, dentro de um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, clonados em seu próprio vetor de expressão.

[00108] VI. Aplicações Terapêuticas

[00109] A invenção proporciona vários métodos de tratar ou realizar a profilaxia de doença de Corpos de Lewy em pacientes que sofrem de ou se encontram em risco dessa doença. Os pacientes receptivos ao tratamento incluem indivíduos que se encontram em risco de doença de uma LBD, porém não apresentam sintomas, bem como pacientes que atualmente apresentam sintomas ou os primeiros sinais de aviso de sinucleinopatias, por exemplo, redução do ritmo de EEG, manifestações neuropsiquiátricas (depressão, demência, alucinações, ansiedade, apatia, anedonia), mudanças autonômicas (hipotensão ortostática, perturbações da bexiga, constipação, incontinência fecal, sialorreia, disfagia, disfunção sexual, alterações no fluxo sanguíneo cerebral), alterações sensoriais (olfatória, dor, sensações anormais de discriminação de cor), distúrbios do sono (distúrbio do comportamento do sono REM (RBD), síndrome das pernas inquietas/movimentos periódicos das extremidades, hipersônia, insônia) e vários outros sinais e sintomas (fadiga, diplopia, visão embaçada, seborreia, perda/ganho de peso). Portanto, os presentes métodos podem ser administrados de maneira profilática a indivíduos que possuem um risco genético conhecido de uma LBD. Esses indivíduos incluem aqueles que possuem parentes que apresentaram essa doença, e aqueles cujo risco é determinado por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco de PD incluem mutações na alfa-sinucleína ou genes Parkin, UCHLI, e CYP2D6; particularmente mutações nas posições 30 e 53 do gene alfa-sinucleína. Os indivíduos que atualmente sofrem de doença de Parkinson podem ser identificados a partir de suas manifestações clínicas que incluem tremor, rigidez muscular, bradicinesia e instabilidade postural.

[00110] Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30). Geralmente, entretanto, não é necessário começar o tratamento até um paciente alcançar 40, 50, 60 ou 70. 0 tratamento tipicamente confere múltiplas dosagens durante um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado ao analisar o anticorpo, ou célula T ativada ou respostas de célula B a um agente terapêutico (por exemplo, uma forma truncada de peptídeo de alfa-sinucleína) ao longo do tempo. Se a resposta diminuir, uma dosagem de reforço é indicada.

[00111] Os anticorpos podem ser usados para tratar ou realizar a profilaxia de doença de Corpos de Lewy em pacientes através de administração sob condições que gerem uma resposta terapêutica benéfica em um paciente (por exemplo, redução de agregados de alfa-sinucleína neuríticos e/ou axônicos, redução de distrofia neurítica, melhora e/ou reversão da função cognitiva, tratar ou prevenir o declínio cognitivo) no paciente. Em alguns métodos, as áreas de distrofia neurítica no neurópilo de neocórtex e/ou gânglios basais podem ser reduzidas em média em pelo menos 10%, 20%, 3 0%, ou 4 0% em pacientes tratados em comparação com uma população de controle.

[00112] O comprometimento cognitivo, declínio progressivo de função cognitiva, alterações na morfologia cerebral, e alterações na função cerebrovascular são comumente observados em pacientes que sofrem de ou se encontram em risco de doença de Corpos de Lewy. A administração dos presentes anticorpos pode inibir ou atrasar o declínio de função cognitiva nesses pacientes.

[00113] A invenção também proporciona métodos de preservar ou aumentar a densidade sináptica e/ou densidade dendrítica. Um índice de alterações na densidade sináptica ou dendrítica pode ser medido por marcadores de formação de sinapse (sinaptofisina) e/ou dendritos (MAP2) . Em alguns métodos, a densidade sináptica ou dendrítica pode ser restaurada até o nível de densidade sináptica ou dendrítica em um indivíduo saudável. Em alguns métodos, o nível médio de densidade sináptica ou dendrítica em pacientes tratados pode ser elevado em 5%, 10%, 15%, 20%, 2 5%, 3 0% ou mais como comparado com uma população de pacientes de controle não tratados.

VII . Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento

[00114] Em aplicações profiláticas, um anticorpo ou agente para induzir um anticorpo ou uma composição farmacêutica desse é administrado a um paciente suscetível, ou de outro modo em risco de uma doença em um regime (dose, frequência e rota de administração) eficaz para reduzir o risco, reduzir a gravidade, ou atrasar o início de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em algumas aplicações profiláticas, o regime é eficaz para inibir ou atrasar o acúmulo de alfa-sinucleína e fragmentos truncados no cérebro, e/ou inibir ou atrasar seus efeitos tóxicos e/ou inibir e/ou atrasar o desenvolvimento de déficits comportamentais. Em aplicações terapêuticas, um anticorpo ou agente para induzir um anticorpo é administrado a um paciente suspeito de, ou que já está sofrendo de uma doença de corpos de Lewy em um regime (dose, frequência e rota de administração) eficaz para melhorar ou pelo menos inibir a deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em algumas aplicações terapêuticas, o regime é eficaz para reduzir ou pelo menos inibir o aumento adicional de níveis de alfa- sinucleína e fragmentos truncados, toxicidades associadas e/ou déficits comportamentais.

[00115] Um regime é considerado terapêutica ou profilaticamente eficaz se um paciente tratado obter um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população de controle de pacientes comparáveis não tratados pelos métodos da invenção, ou se um resultado mais favorável for demonstrado em pacientes tratados versus pacientes de controle em um exame clínico controlado (por exemplo, um exame de fase II, fase II/III ou fase III) no nível p < 0,05 ou 0,01 ou ainda 0,001.

[00116] As doses eficazes variam dependendo de muitos fatores diferentes, inclusive meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente inclusive tipo de doença de corpos de Lewy, se o paciente é um portador de ApoE, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico.

[00117] Uma faixa de dosagem exemplificativa de anticorpos é de cerca de 0,01 a 5 mg/kg, e mais geralmente 0,1 a 3 mg/kg ou 0,15-2 mg/kg ou 0,15-1,5 mg/kg, de peso corporal de paciente. 0 anticorpo pode ser administrado nessas doses diariamente, em dias alternativos, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, trimestralmente, ou de acordo com qualquer outro programa determinado por análise empírica. Um tratamento exemplificative exige a administração em múltiplas dosagens durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Regimes de tratamento exemplificativos adicionais exigem a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses.

[00118] Os anticorpos podem ser administrados através de uma rota periférica (isto é, um em que um anticorpo administrado ou induzido atravessa a barreira hematoencefálica para alcançar um sítio pretendido no cérebro. As rotas de administração incluem tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular. Algumas rotas de administração de anticorpos são intravenosas e subcutâneas. Esse tipo de injeção é mais tipicamente realizado nos músculos do braço ou perna. Em alguns métodos, os agentes são diretamente injetados em um tecido particular onde os depósitos se acumulam, por exemplo, injeção intracraniana.

[00119] As composições farmacêuticas para a administração parenteral podem ser estéreis e substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições de GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas em forma de dosagem unitária (isto é, a dosagem para uma única administração). As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando um ou mais carreadores, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis. A formulação depende da rota de administração selecionada. Para a injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de salina ou acetato fisiológico (para reduzir o desconforto no local de injeção). A solução pode conter agentes de formulação como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, os anticorpos podem estar sob a forma liofilizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogênio estéril, antes do uso.

[00120] Os presentes regimes podem ser administrados em combinação com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença que será tratada. Por exemplo, no caso de doença de Parkinson, imunoterapia contra alfa-sinucleína WO/2008/103472, Levodopa, agonistas de dopamina, inibidores de COMT, inibidores de MAO-B, Amantadina, ou agentes anticolinérgicos podem ser usados em combinação com os presentes regimes.

VIII .Outras Aplicações

[00121] Os anticorpos descritos acima podem ser usados para detectar alfa-sinucleína no contexto de diagnóstico clínico ou tratamento ou em pesquisa. Os anticorpos também podem ser vendidos como reagentes de pesquisa para pesquisa laboratorial para detectar células contendo alfa-sinucleína e sua resposta a vários estímulos. Nesses usos, os anticorpos monoclonais podem ser marcados com moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por spin, enzimas ou radioisotipos, e podem ser fornecidos sob a forma de kit com todos os reagentes necessários para realizar o ensaio de alfa-sinucleína. Os anticorpos também podem ser usados para purificar alfa-sinucleína, por exemplo, por cromatografia de afinidade.

[00122] Os anticorpos podem ser usados para detectar LBs em um paciente. Esses métodos sao úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de PD, ou outra doença associada à presença de LBs no cérebro, ou suscetibilidade a essa. Por exemplo, os métodos podem ser usados em um paciente que apresenta sintomas de demência. Se o paciente possuir LBs, então é provável que o paciente sofra de uma doença de corpos de Lewy, como doença de Parkinson. Os métodos também podem ser usados em pacientes assintomáticos. A presença de corpos de Lewy ou outros depósitos anormais de alfa-sinucleína indica a suscetibilidade à doença sintomática no futuro. Os métodos também são úteis para monitorar o progresso e/ou resposta da doença ao tratamento em pacientes que foram anteriormente diagnosticados com uma doença de corpos de Lewy.

[00123] Os métodos podem ser realizados ao administrar um anticorpo e então detectar o anticorpo após esse ser ligado. Se desejado, a resposta de compensação response pode ser evitada utilizando um fragmento de anticorpo desprovido de uma região constante de comprimento total, como um Fab. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir como um tratamento e reagente diagnóstico.

[00124] Para o diagnóstico (por exemplo, imagem in vivo), os anticorpos podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente, ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana ou ao perfurar um orifício através do crânio. A dosagem de reagente deve estar dentro das mesmas faixas que os métodos de tratamento. Tipicamente, o anticorpo é marcado, embora em alguns métodos, o anticorpo seja não marcado e um agente de marcação secundário é usado para se ligar ao anticorpo. A seleção de rótulo depende do meio de detecção. Por exemplo, um rótulo fluorescente é adequado para a detecção óptica. 0 uso de rótulos paramagnéticos é adequado para a detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Rótulos radioativos também podem ser detectados utilizando PET ou SPECT.

[00125] O diagnóstico é realizado ao comparar o número, tamanho e/ou intensidade de locais marcados com os valores de linha de base correspondentes. Os valores de linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos saudáveis. Os valores de linha de base também podem representar níveis anteriores determinados no mesmo paciente. Por exemplo, os valores de linha de base podem ser determinados em um paciente antes de começar o tratamento, e os valores medidos são comparados com os valores de linha de base. Uma redução nos valores em relação à linha de base indica uma resposta positiva ao tratamento.

[00126] Os anticorpos podem ser usados para gerar anticorpos anti-idiótipos (veja, por exemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5) :437-444, 1989; and Nissinoff, J. Immunol. 147:2429-2438, 1991). Esses anticorpos anti-idiótipos podem ser utilizados em farmacocinética, farmacodinâmica, estudos de biodistribuição bem como em estudos de respostas de anticorpo humano-anti-humano clínicos (HAHA) em indivíduos tratados com os anticorpos. Por exemplo, os anticorpos anti-idiótipos ligam especificamente a região variável de anticorpos 9E4 humanizados e, portanto, podem ser usados para detectar anticorpos 9E4 humanizados em estudos farmacocinéticos e ajudar a quantificar as respostas de anticorpo humano-anti-humano (HAHA) em indivíduos tratados.

[00127] Todos os depósitos de patente, website, outras publicações, números de acesso e similares citados acima ou abaixo estão incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos na mesma extensão como se cada item individual estivesse específica e individualmente indicado como incorporado a título de referência. Se versões diferentes de uma sequência estiverem associadas a um número de acesso em momentos diferentes, a versão associada ao número de acesso na data de depósito efetiva desse pedido é considerada. A data de depósito efetiva significa o início da data de depósito real ou a data de depósito de um pedido de prioridade referente ao número de acesso se aplicável. Também, se versões diferentes de uma publicação, website ou similares forem publicadas em momentos diferentes, a versão mais recentemente publicada na data de depósito efetiva do pedido é considerada, exceto onde indicado em contrário. Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade, ou aspecto da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outro, exceto onde especificamente indicado em contrário. Embora a presente invenção seja descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e entendimento, será evidente que algumas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

EXEMPLOS EXEMPLO I.Desenho de anticorpos 9E4 humanizados

[00128] O ponto de partida ou anticorpo doador para humanização é o anticorpo de camundongo 9E4 produzido pelo hibridoma que possui o No. de Acesso ATCC PTA-8221 e descrito no Pedido de Patente No. U.S. 11/710.248 (número de publicação US2009/0208487). A variável kappa (VK) de 9E4 pertence ao subgrupo 1 de Kabat de camundongo que corresponde ao subgrupo 1 de Kabat humano. A variável pesada (Vh) de 9E4 pertence ao subgrupo 3 de Kabat de camundongo que corresponde ao subgrupo 3 de Kabat humano (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991). A numeração de Kabat é usada ao longo desse Exemplo.

[00129] 0 resíduo 17 CDR-L1 pertence à classe canônica 3, o resíduo 7 CDR-L2 pertence à classe 1, e o resíduo 9 CDR-L3 pertence à classe 1 em Vk (Martin & Thornton, J Mol Biol. 263:800-15, 1996). O resíduo 5 CDR-H1 pertence à classe 1, e o resíduo 17 CDR-H2 pertence à classe 2 (Martin & Thornton, J Mol Biol. 263:800-15, 1996) . CDR-H3 não possui classes canônicas, porém a alça de resíduo 7 possui uma base torcida de acordo com as regras de Shirai et al. (FEES Lett. 455:188-97, 1999).

[00130] Uma pesquisa foi realizada sobre as sequências de proteínas no banco de dados PDB (Deshpande et al. , Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) para encontrar estruturas que poderiam fornecer um modelo estrutural bruto de 9E4 . A estrutura cristalina de anticorpo dimérico X836 (código pdb 3MBX) (Teplyakov et al, Mol Immunol., 47(14) :2422-6, 2010) foi selecionada para a estrutura VK visto que essa possui resolução satisfatória (1.6A) e similaridade de sequência total a 9E4 VK, mantendo as mesmas estruturas canônicas das alças. 1H3P (Pizarro et al., FEBS Lett. 509:463-8, 2001) foi usado para a estrutura Vh. Esse possui similaridade de sequência total satisfatória e resolução razoável (2.6A), porém também possui o mesmo comprimento CDR-H3 com uma base torcida. Ademais, CDRs-Hl e H2 possuem as mesmas estruturas canônicas que 9E4 Vh. DeepView/Swiss-PdvViewer 3.7 (SP5) (Guex and Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2723, 1997) foi a modelagem de estrutura usada.

[00131] Uma pesquisa do banco de dados de sequência de proteínas não redundante de NCBI permitiu a seleção de estruturas humanas adequadas nas quais enxerta- se as CDRs de murídeo. Para VK, uma cadeia leve kappa humana com código de acesso NCBI AAY33350 (GI:63102889) (Kramer et al., Eur J Immunol. 35:2131-45, 2005) foi selecionada. Essa possui as mesmas classes canônicas para CDR-L2 e L3 que 9E4, e pertence a IGKV1D-39 ou IGKV1-39 de linha germina t iva humana (nome de clone 02 ou 012) de acordo com a convenção IMGT. Esse é um membro do subgrupo 1 kappa humano de Kabat. Para Vh, a cadeia pesada de Ig humano com código de acesso NCBI AAC50998 (GI:1791009) (Glas et al. , Clin Exp Immunol. 107:372-80, 1997) foi selecionada, novamente com as mesmas classes canônicas que 9E4 e pertencendo a IGHV3-7'01 ou IGHV3-7'02 de linha germinativa humana (nome de clones V3-7 ou VH3-11). Esse é um membro do subgrupo 3 de cadeia pesada humano de Kabat.

[00132] As seguintes posições que se diferem entre as estruturas de região variável de aceitador humano e doador de camundongo foram identificadas como sendo candidatos à retromutação. H73 está na borda do sítio de ligação ao antígeno e interage com CDR-H2. H93 é um resíduo de interface que se encontra abaixo das alças CDR-H1 e H3. L3 6 é um resíduo de interface VK/Vh. L83 está em estreita proximidade ao domínio constante. Em 9E4, L83 é uma leucina, enquanto em estrutura humana, L83 é um aminoácido fenilalanina maior.

[00133] Três cadeias pesadas humanizadas e três cadeias leves humanizadas são feitas incorporando retromutações em permutações diferentes dessas posições (Figuras IA, B, alinhamento de sequência, e Tabelas 2-3). Tabela 2 VH Retromutações

Tabela 3 VL Retromutações

>9E4VK Versionl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKA PKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPLTFGGGT KLEIK (SEQ ID NO: 3) >9E4VK Version2 DIQMTQS PS S LSASVGDRVTITCKSIQTLLYS SNQKNYLAWYQQKPGKA PKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPLTFGGGT KLEIK (SEQ ID NO: 4) >9E4VK Versions DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKA PKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQYYSYPLTFGGGT KLEIK (SEQ ID NO: 5) >9E4vh Versionl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVA SISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGAGIDYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) >9E4vh Version2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVA SISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGAGIDYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 9) >9E4vh Version3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVA SISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGAGIDYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 10)

[00134] A numeração de Kabat de cadeia leve AAY33350 e cadeia pesada AAC50998 está listada abaixo: Numeração de Kabat para cadeia leve AAY33350: LI D L2 I L3 Q L4 M L5 T L6 Q L7 S L8 P L9 S LIO S Lll L L12 S L13 A L14 S L15 V L16 G L17 D L18 R L19 V L20 T L21 I L22 T L23 C L24 R L25 A L26 S L2 7 Q L28 S L29 I L30 S L31 S L32 Y L33 L L34 N L35 W L36 Y L37 Q L38 Q L39 K L40 P L41 G L42 K L43 A L44 P L4 5 K L46 L L47 L L48 I L49 Y L50 A L51 A L52 S L53 S L54 L L55 Q L56 S L57 G L58 V L59 P L60 S LSI R L62 F L63 S L64 G L65 S L66 G L67 S L68 G L69 T L70 D L71 F L72 T L73 L L74 T L75 I L76 S L77 S L78 L L79 Q L80 P L81 E L82 D L83 F L84 A L85 T L86 Y L87 Y L88 C L89 Q L90 Q L91 S L92 Y L93 S L94 T L95 P L96 L L97 T L98 F L99 G L100 G L1O1 GL102 TL103 KL104 LL105 EL106 I L1O7 K L108 - L109 - L11O -Llll - Numeração de Kabat para cadeia pesada AAC50998: Hl E H2 V H3 Q H4 L H5 V H6 E H7 S H8 G H9 G H10 G Hll L H12 V H13 Q H14 P H15 G H16 G H17 S H18 L H19 R H20 L H21 S H22 C H23 A H24 A H25 S H26 G H2 7 F H28 T H29 F H30 S H31 S H32 Y H33 W H34 M H35 S H36 W H37 V H38 R H39 Q H40 A H41 P H42 G H43 K H44 G H45 L H46 E H47 W H48 V H49 A H50 N H51 I H52 K H52A Q H53 D H54 G H55 S H56 E H57 K H58 Y H59 Y H60 V H61 D H62 S H63 V H64 K H65 G H66 R H67 F H68 T H69 I H70 S H71 R H72 D H73 N H74 A H75 K H76 N H77 S H78 L H79 Y H80 L H81 Q H82 M H82A NH82B SH82C LH83 R H84 A H85 E H86 D H87 T H88 A H89 V H90 Y H91 Y H92 C H93 A H94 R H95 G H96 S H97 S H98 D H99 M H100 -H1O1 DH102 Y H103 W H1O4 G H105 Q H1O6 GH107 TH108 LH109 VH110 TH111 V H112 S H113 S H114 -

[00135] A numeração de Kabat de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve pode ser determinada por alinhamento com resíduos correspondentes atribuídos com o mesmo número ou utilizando software comercialmente disponível. Tabela 4. Numeração de Kabat de resíduos de estrutura preferidos para retromutação em anticorpos 9E4 humanizados

[00136] O objetivo desse experimento é determinar a eficácia de anticorpos a-sinucleína em estudos in vitro e in vivo bem como ensaios comportamentais. Utilizou-se a-sinucleína transgênica (Linhagem 61), a- sinucleína em camundongos fêmeas nocaute e tipo selvagem de 3 a 4 meses de idade no início e n=14/grupo. Os anticorpos testados incluem 9E4 (IgGl, epítopo: aminoácidos 118-126 de alfa-sinucleína), 5C1 (IgGl, epítopo: aminoácidos 118-126 de alfa-sinucleína, c-ligante), 5D12, IgG2 (SN118-126), 1H7, IgGl (SN 91-99) e um anticorpo de controle IgGl 27-1. Os camundongos receberam uma dosagem de 10 mg/kg durante um período de 5 meses, em um total de 21 injeções. Ademais, os animais receberam uma injeção com lentivírus (LV) que expressa a a-sinucleína humana (wt) por introdução unilateral de a-sinucleína humana (wt) no hipocampo.

[00137] Os anticorpos de leitura incluem aqueles de Chemicon (epítopo: alfa-sinucleína de comprimento total), Millipore (epítopo: alfa-sinucleína de comprimento total), e Neotope, ELADW 105 (epítopo: aminoácidos 121-124 de alfa-sinucleína de comprimento total).

[00138] Pontos de Avaliação: Os títulos de anticorpos foram medidos durante a fase em vida. Os ensaios comportamentais incluem teste de Labirinto Aquático de Morris (MWW) e teste de feixe horizontal. O teste de trave redonda é um teste de equilíbrio motor, coordenação e marcha conduzida utilizando dois feixes de diâmetro variado. A Trave A é o diâmetro maior (mais fácil, considerado a trave de treinamento) e a Trave D é o diâmetro menor (mais difícil, considerado trave de teste). Os dados são apresentados como "erros" (número de deslizes/lOcm) e "velocidade" (tempo necessário para percorrer lOcm/segundos). 0 desempenho em labirinto aquático foi realizado em 10 semanas e terminou. As seguintes medidas de neuropatologia foram realizadas: agregação de alfa-sinucleína, sinaptofisina, e MAP2 . As seguintes medidas de bioquímica foram realizadas: alfa- sinucleína, PSD95, sinaptofisina. A marcação múltipla selecionada e marcação confocal foram realizadas utilizando marcadores sinápticos, neuronais e gliais.

[00139] Os resultados mostraram que todos os anticorpos, exceto 5D12, produziram uma redução significativa em acúmulo de a-sin e a preservação de densidades sinápticas and dendríticas, bem como resultados positivos em desempenho de MWM. O anticorpo 9E4 é eficaz em estudos in vitro e in vivo bem como ensaios comportamentais. As leituras indicam que o anticorpo pode reduzir os agregados neuríticos/axonais de alfa-sinucleína.

[00140] Resultados Comportamentais: 0 anticorpo 9E4 melhorou o desempenho em labirinto aquático em camundongos com a-sinucleína (Figuras 3-4) , Em contrapartida, o anticorpo 5D12 não melhorou o desempenho em labirinto aquático em camundongos transgênicos com a- sinucleína (Figure 4). Os anticorpos 9E4 e 1H7 melhoraram o desempenho no teste de trave como medido por velocidade e erros, enquanto os anticorpos 5D12 e 5C1 não (Figura 4).

[00141] Resultados de Neuropatologia: Os anticorpos 9E4, 1H7 e 5C1 reduziram a distrofia neurítica positiva ELADW-105, enquanto o 5D12 anticorpo não. Em camundongos transgênicos com alfa-sinucleína, o anticorpo 9E4 reduziu a área de neurópilo em 43% em neocórtex e em 40% em gânglios basais como comparado com o controle. O anticorpo 9E4 também preservou a sinaptofisina e MAP2 em neocórtex e gânglios basais.

EXEMPLO III. Imunoprecipitação

[00142] A imunoprecipitação foi realizada para testar a eficácia de ligação de várias versões de anticorpos 9E4 humanizados em relação a seu antígeno obtido do tecido doente (Figura 5) . 150 μg de lisados cerebrais solúveis em Tris de cérebros com Demência com Corpos de Lewy foram imunoprecipitados com 5 μg de cada anticorpo indicado utilizando esferas magnéticas de Proteína G (New England Biolabs). As amostras foram lavadas 5 vezes com PBS/350 mM NaCl/0,5% de NP-40, fervidas, e as amostras resultantes resolvidas por SDS-PAGE. Após o ensaio de blotting, as membranas foram incubadas com Ab5038 (Millipore), um anticorpo policlonal que detecta a sinucleína total. O experimento foi repetido três vezes para confirmar a precisão.

EXEMPLO IV. Western blot

[00143] O ensaio Western blotting de sinucleína humana recombinante com anticorpos 9E4 de camundongo, quiméricos e humanizados é mostrado na Figura 6. As curvas de diluição de anticorpo são aparentemente similares para anticorpos 9E4 de camundongo, quiméricos e humanizados. Todos os anticorpos detectaram uma faixa em 28 KDa e uma segunda faixa em 49 kDa. A faixa em 49 kDa é provavelmente um multímero de sinucleína.

[00144] As quantidades indicadas de sinucleína tipo selvagem humana bacterialmente expressa recombinante foram resolvidas por SDS-PAGE, e maculadas com quantidades idênticas da forma indicada de 9E4. Após a lavagem, os anticorpos policlonais de cabra adequados à espécie conjugados com o fluoróforo IRDye-800 foram aplicados, e a mancha foi lavada. Os tempos de exposição foram idênticos para os anticorpos diferentes.

DEPÓSITO

[00145] O seguinte hibridoma foi depositado sob as provisões do Tratado de Budapest com a American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) na data indicada. Esse depósito será mantido em um depósito autorizado e substituído no caso de mutação, não viabilidade ou destruição durante um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente de liberação de uma amostra ser recebida pelo depósito, durante um período de pelo menos trinta anos após a data do depósito, ou durante a vida da patente relacionada, qualquer seja o período mais longo. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público dessas linhagens celulares serão irrevogavelmente removidas mediante a emissão de uma patente do pedido.

Claims

1. Anticorpo caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada madura possuindo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5, em que a região variável da cadeia pesada madura é fundida a uma região constante da cadeia pesada humana e a região constante da cadeia leve madura é fundida a uma região constante da cadeia leve humana.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região variável da cadeia pesada madura ter uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região variável da cadeia pesada madura ter uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 8.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região constante da cadeia pesada ser uma forma mutante da região constante humana natural que tem ligação reduzida a um receptor FCY em relação à região constante humana natural.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a região constante da cadeia pesada ser do isotipo IgG1 humano.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a região constante da cadeia pesada ter a sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 32 desde que o resíduo de lisina C-terminal possa ser omitido.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a região constante da cadeia leve possuir a sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 13.

8. Ácido nucleico caracterizado por codificar uma região variável da cadeia pesada madura e/ou uma região variável da cadeia leve madura, conforme definido pela reivindicação 1.

9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por codificar uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10 e/ou uma região variável de cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5.

10. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ter uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 17, 18 e 20.

11. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 17 e/ou SEQ ID NO: 20.

12. Célula hospedeira caracterizada por compreender um vetor compreendendo o ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 8, e em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de Escherichia coli ou levedura.

13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o vetor compreender um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 17 e/ou SEQ ID NO: 20.

14. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um anticorpo conforme definido na reivindicação 1.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o anticorpo compreender uma região variável da cadeia pesada madura possuindo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5.

16. Método de produção de um anticorpo, caracterizado por compreender cultivar as células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo, de modo que a célula secrete o anticorpo, e purificar o anticorpo a partir do meio de cultura de células, em que o anticorpo é conforme definido pela reivindicação 1.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5.

18. Uso de um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar a doença com corpos de Lewy ou risco dela.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a doença ser doença de Parkinson ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou demência com corpos de Lewy (DLB).