CN107880123A

CN107880123A - 识别α‑突触核蛋白的人源化抗体

Info

Publication number: CN107880123A
Application number: CN201711166162.2A
Authority: CN
Inventors: 约瑟·萨尔丹哈; 塔洛陈·S.·尼扎
Original assignee: Prothena Biosciences Ltd
Current assignee: Prothena Biosciences Ltd
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2018-04-06
Also published as: HRP20230065T1; JP2015502341A; MY165038A; IL272615B; CN104334184B; RS63930B1; ES2937409T3; SI2771031T1; RU2014121325A; US20180201669A1; EP3378535B1; CA2853531A1; CA2853531C; JP6592059B2; BR112014010198B1; JP2018046836A; US10723792B2; JP6234511B2; SG11201401857WA; RU2016101137A3

Abstract

本申请公开了人源化9E4抗体。所述抗体结合人类α‑突触核蛋白且可用于路易体病的免疫治疗。

Description

识别α-突触核蛋白的人源化抗体

分案申请说明

本申请是申请日为2012年10月26日(进入中国国家阶段日期为2014 年4月28日)、申请号为201280053194.0、发明名称为“识别α-突触核蛋白的人源化抗体”的分案申请。

相关专利申请参照

本申请主张美国临时专利申请号为61/553,131，申请日为2011年10 月28日的申请的优先权，以及美国临时专利申请号61/711,208，申请日为 2012年10月8日的申请，两份专利申请的整体均作为本申请的参照。

序列清单参考

文件424859SEQLIST.txt中记录的序列清单的大小为34千字节，其生成于2012年10月24日，在此并入参考。

背景技术

突触核蛋白病也被称为路易体病(LBDs)，其特点是多巴胺能系统退化、运动障碍、认知障碍，并形成路易体(LBs)和/或路易神经突的变性(McKeith et al.,Neurology(1996)47:1113-24)。共核蛋白病，包括帕金森氏病(包括特发性帕金森病)，弥漫性路易体病(DLBD)也被称为路易体痴呆(DLB)，路易体的变种阿尔茨海默病(LBV)，组合阿尔茨海默氏症和帕金森氏病，纯自主神经功能衰竭和多系统萎缩(MSA；例如，橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和希-德二氏综合征)。几个非运动症状和体征被认为是在共核蛋白病的前驱期(即症状前、亚临床、临床前或运动前期间)的先兆。这样的早期迹象包括，例如，REM睡眠行为障碍(RBD)，嗅觉丧失和便秘(Mahowald et al.,Neurology(2010)75:488-489)。路易体病仍然是一个运动障碍和人口老龄化的认知功能减退的常见原因(Galaskoet al.,Arch.Neurol.(1994)51:888-95)

α-突触核蛋白是一个大蛋白质家族的一部分，包括β-和γ-突触核蛋白和synoretin。α-突触核蛋白在正常状态与突触相关联，并且被认为在神经可塑性，学习和记忆中发挥作用。一些研究已经表明α-突触核蛋白与帕金森病发病机制中发挥中心作用。该蛋白可聚集形成在病理条件下的不溶性纤维。例如，突触核蛋白在路易体中聚集(Spillantini et al.,Nature(1997) 388:839-40；Takeda et al.,J.Pathol.(1998)152:367-72；Wakabayashi et al., Neurosci.Lett.(1997)239:45-8)。α-突触核蛋白的基因突变共同隔离与罕见的家族性形式的帕金森综合征(Kruger et al.,Nature Gen.(1998)18:106-8； Polymeropoulos,et al.,Science(1997)276:2045-7)。在转基因小鼠(Masliahet al.,Science(2000)287:1265-9)和果蝇(Feany et al.,Nature(2000) 404:394-8)的α-突触核蛋白变化研究中模拟了路易体病的几个病理方面。此外，研究已经表明，突触核蛋白的可溶性低聚物可能具有神经毒性 (Conway KA,et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2000)97:571–576；VollesMJ, Lansbury PT,Jr Biochemistry(2003)42:7871–7878)。α-突触核蛋白在相似的形态和神经系统的积累人类，小鼠，和苍蝇这些不同物种和动物模型中的变化表明，这种分子利于路易体病的发展。

发明内容

本发明提供一种抗体，包括具有序列SEQ ID NO:11的三个Kabat 互补决定区的成熟重链可变区，所述成熟重链可变区至少90％与序列SEQ ID NO:11相同，以及具有序列SEQID NO:4的三个Kabat互补决定区的轻链，所述轻链至少90％与序列SEQ ID NO:4相同。在一些抗体中，重链成熟可变区显示了与SEQ ID NOs:11至少有95％，96％，97％，98％，或99％是相同的，轻链成熟可变区显示了与SEQ ID NOs:4至少有95％，96％，97％， 98％，或99％的序列是相同的。在某些位置的L36(Kabat编号方式)可被Y或F占用、位置L83(Kabat编号)可被F或L占用、位置H73(Kabat 编号方式)可被N或D占用及位置H93(Kabat编号)可被由A或S占用。在一些此类抗体的成熟重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：11不同和成熟的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：4不同。

在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO:8：8和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO:8：3。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：8和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ IDNO：4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：8和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：9和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：9和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：9和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：10和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：10和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：10和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：11和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：11和成熟的轻链可变区具有指定的的氨基酸序列SEQ ID NO：4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQID NO：11和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO：5。

本发明进一步提供了一种抗体，其包含3个SEQ ID NO:11中的Kabat 互补决定区的人源化重链和一个包含三个SEQ ID NO:4中的互补决定区的人源化轻链，其中(provided that)位置L36(Kabat编号)由F或Y占据和/或位置L83(Kabat编号)是由L或F和/或位置H73(Kabat编号)被占据为D或N，和/或位置H93(Kabat编号)由S或A占据。在一些这种抗体，位置L36(Kabat编号)是由F占据和位置H73(Kabat编号)由D占据，位置H93(Kabat编号)是由S占据。在一些此类抗体，位置L36是由 F占据。在一些此类抗体，位置L83是由L占据。在一些此类抗体，位置 L36由F占据和位置H73是由D占据。在一些这样的抗体，位置L83被L 占据，在一些此类抗体H73的位置是由D占据。在一些此类抗体，位置 H93是由A占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据和位置L83是由L 占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据和位置H73是由D占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据和位置H93是由A占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据，位置L83由L占据和位置H73由D占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据，位置L83由L占据和位置H93由A占据.有一些这样的抗体，位置L36为F被占据，位置L83由L占据，位置H73是由 D占据和位置H93由A占据。在一些这样的抗体，残留在位置L36，L83， H73和H93(Kabat编号)是由氨基酸如表1所示由F占据和位置H73(Kabat 编号)由D占据，位置H93(Kabat编号)是由A占据。在一些这样的抗体，位置L36(Kabat编号)由F和位置H93(Kabat编号)是由S占据。在一些此类抗体占据，位置H73(Kabat编号)是由D占据和位置H93占据(Kabat编号)是由S。在一些这样的抗体，位置H73(Kabat编号方式) 是由D占据和位置H93(Kabat编号)由A占据。在一些这样的抗体，位置H93(Kabat编号)是由S占据。在一些这样的抗体，位置H73(Kabat 编号)是由N占据。在一些此类抗体，位置L36(Kabat编号)由F占据，位置L83(Kabat编号)由L占据，位置H73(Kabat编号)为D占据，位置H93(Kabat编号)是由S占据。在一些此类抗体，位置L36(Kabat编号)由F占据，位置L83(Kabat编号)是由L占据和位置H93(Kabat编号)由S占据。

任何上述抗体，成熟重链可变区可以被融合到一个重链恒定区和成熟轻链恒定区可以融合到一个轻链恒定区。

上述任何抗体，重链恒定区可以是天然人类恒定区的突变形式，所述重链恒定区与Fcγ受体的结合力低于所述天然人类恒定区与Fcγ受体的结合力。

上述任何抗体中，重链恒定区可以是人类IgG1同种型。在一些抗体，同种异型为G1m3。在一些抗体中，同种异型是G1m1。

本发明进一步提供了一种对于任何上述的成熟重链可变区和/或任何上述的成熟轻链可变区核酸编码，例如，SEQ ID NO：15、17、18、19 和20。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有载体，所述载体包含有任何上述核酸。

本发明进一步提供了一种治疗患有路易体病或具有得路易体病风险的患者的方法，包括给患者施用的任何上述抗体的有效方案。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不良降低。在一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中保留突触素和/或MAP2。

本发明进一步提供了一种治疗患有路易体病或具有得路易体病风险的患者的方法，包括给患者施用的任何上述抗体的有效方案。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，所述疾病是REM睡眠行为障碍(RBD)。在一些方法中，所述疾病是路易体痴呆(DLB)或者多系统萎缩(MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不良降低。在一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中保留突触素和/或MAP2。

本发明进一步提供了在患有或在具有患路易体病风险的病人中检测路易体病的方法，包括向所述患者施用有效量的任何上述抗体，其中结合到路易体病的所述抗体和联胞抗体可以被检测。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，所述疾病是路易体痴呆(DLB)或者多系统萎缩(MSA)。在一些方法中，抗体被标记。

本发明进一步提供了一种降低在h有或在存在患有路易体疾病的风险的患者身上形成路易体的方法，其包括给患者施用的任何有效量上述抗体的一种方法。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，所述疾病是路易体痴呆(DLB)或者多系统萎缩(MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不良降低。在一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中保留突触素和/或MAP2。

本发明进一步提供了一种抑制突触核蛋白聚集或清除在患或有路易体疾病风险的病人中的路易体或突触核蛋白的方法，其包括给患者施用的任何有效量的上述抗体的一种方法。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，本病是路易体痴呆(DLB)或者多系统萎缩(MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，患者神经炎营养不良减小。在一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法保留在患者中的突触素和/或MAP2。

本发明进一步提供了包含任何上述抗体的一种药物组合物。

本发明进一步提供了一种制备抗体的方法，包括通过核酸编码所述抗体的重链和轻链转化培养细胞，使细胞分泌抗体；然后从细胞培养基中纯化所述抗体；其中所述抗体是可以是以上描述的任何抗体。

本发明进一步提供了一种制备细胞系产生抗体的方法，包括将编码抗体重链和轻链的载体和选择性标记物引入细胞；在适合环境下繁殖细胞来选择具有增加的载体拷贝数量的细胞，从所选择的细胞中分离单个细胞；将基于抗体产量选择的单细胞所克隆的细胞建库(banking)；其中所述抗体可以是以上描述的任何抗体。某些这样的方法还包括选择性的条件下繁殖细胞和筛选细胞系，其自然表达和分泌至少

附图说明

图1为携带人源化9E4重链成熟可变区的亲本鼠科mAb(被称为 m9E4)的氨基酸序列排列。1791009Hu9E4VHFr(SEQ ID NO:7)是人类受体 VH序列。

图2为携带人源化9E4轻链成熟可变区的亲本鼠科mAb(被称为 m9E4)的氨基酸序列排列。63102889Hu9E4VLFr(SEQ ID NO:2)是人类受体VL序列。根据Kabat定义的互补决定区区域有下划线和粗体。

图3为在莫里斯水迷宫测试的记忆表现上使用9E4被动免疫治疗的结果。

图4为在圆梁测试的速度和差错上使用9E4被动免疫治疗的结果。

图5为针对从染病组织传染的抗原的各种版本的人源化9E4抗体的免疫沉淀反应。Ch9E4:嵌合体的9E4；H1L3:Hu9E4VHv1-Hu9E4VLv3； H3L2:Hu9E4VHv3-Hu9E4VLv2；H3L3:Hu9E4VHv3-Hu9E4VLv3；N.S.＝非特异性的。

图6为具有小鼠、嵌入式生物体和人源化9E4抗体的重组人类突触核蛋白的免疫印迹。

序列的简要说明

SEQ ID NO:1是m9E4VL可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是63102889Hu9E4VLFr可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是Hu9E4VLv1可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是Hu9E4VLv2可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是Hu9E4VLv3可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是m9E4VH可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是1791009Hu9E4VHFr可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是Hu9E4VHv1可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是Hu9E4VHv2可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是Hu9E4VHv3可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是Hu9E4VHv4可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是天然的人类野生型α-突触核蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，以及在N 端的精氨酸。

SEQ ID NO:14是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是Hu9E4VLv1可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16是Hu9E4VLv2可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:17是Hu9E4VLv3可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18是Hu9E4VHv1可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:19是Hu9E4VHv2可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20是Hu9E4VHv3可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:21是Hu9E4VHv4可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:22是Hu9E4VL信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23是Hu9E4VL信号肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO:24是Hu9E4VH信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25是Hu9E4VH信号肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO:26是Hu9E4VL共有区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27是Hu9E4VH共有区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，无在N端的精氨酸。

SEQ ID NO:29是在版本3人源化9E4的包括(a)一个可变区和(b)一个恒定区的轻链的氨基酸序列，以及在N端的精氨酸。

SEQ ID NO:30是在版本3人源化9E4的包括(a)一个可变区和(b)一个恒定区的轻链的氨基酸序列，不带在N端的精氨酸。

SEQ ID NO:31是在版本3人源化9E4的包括一个可变区和一个恒定区的重链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:32是在BIP版本人源化9E4的重链G1m3异型恒定区的氨基酸序列。

定义

单克隆抗体通常是以隔离形式提供的。这意味着一种抗体中蛋白质和由生产和净化中产生的其他高分子通常至少有50％的w/w纯度，但是不排除单克隆抗体混合着过量药物可接受的载体或其他促进它使用的载体的可能性。有些时候单克隆抗体重蛋白质和由生产和净化中产生的其他高分子有至少60％、70％、80％、90％、95或者99％的w/w纯度。

单克隆抗体的特异性结合成靶抗原意味着至少106、107、108、109 或者1010M-1的纯化。特异性结合强度更高，且可区别于发生在至少一个不相关的目标上的非特异性结合。特异性结合可以是特定功能群或者特定合适空间(例如锁和钥匙类型)之间化学键形成的结果，而非特异性结合通常是范德华引力的结果。但是特异性结合不是必然意味着一种单克隆抗体结合有且只有一个目标。

基本的抗体结构单元是一个具有若干子单元的四聚体。每一个四聚体包含两对完全相同的多肽链，每一对有一个轻链(约25kDa)和一个重链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括约100到110或者更多主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。这种可变区最初的表达与可分裂的信号肽相关联。没有信号肽的可变区有时候作为一种成熟的可变区被提及。所以，例如，一个轻链的成熟可变区意味着一个轻链的没有轻链信号肽的可变区。每个链的羧基端部分界定主要负责效应功能的恒定区。

轻链被分类为kappa或者lambda。重链被分类为gamma、mu、alpha、 delta或者epsilon，且抗体的同型性分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链之中，可变区和恒定区中加入了一个约12个或者更多氨基酸的“J”形区域，且重链中还包含一个约10个或者更多氨基酸的“D”形区域。(另参见,Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nded.Raven Press, N.Y.,1989,Ch.7,incorporated by reference in its entirety forall purposes).

每一个轻/重链对的成熟的可变区形成抗体结合位置。这样，一个完整的抗体有两个结合位置。除了双功能的或者双特异的抗体，两个结合位置是一样的。链都展示出相同的由三个变异度高的区域构成的相对保守的框架区域(FR)的基本结构，也称为互补决定区或者CDRs。每一对的两条链上的CDRs是按框架区域排列的，能够结合一个特定的抗原决定基。从N端到C端，轻链和重链都是由域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3和FR4组成的。氨基酸在每个域的排布与Kabat的定义、Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,MD, 1987and 1991)或者Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989)是一致的。Kabat还提供一个广泛使用的编号规定(Kabat编号)，使得不同重链之间或不同的轻链之间的对应残基被赋予相同的编号(例如，Kabat编号H83表示在成熟的重链可变区中position 83；同样的，Kabat编号position L36表示在轻链可变区中position 36)。

术语“抗体”包括完整的抗体及它的结合片段。通常来说，在为了特定的与包括单独的重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、diabodies、Dabs、 nanobodies及Fv等目标的结合，片段与完整的抗体在衍生的过程中相互竞争。片断能够由DNA重组技术产生，或者靠酶或完整免疫球蛋白的化学分离。术语“抗体”还包含一个双特异性抗体和/或一个人源化抗体。双特异性抗体或双功能抗体是有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位置(参考例子Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)； Kostelny etal.,J.Immunol.148:1547-53(1992))的人源化杂合抗体。在一些双特异性抗体中，两个不同的重/轻链对包括一人源化9E4重链/轻链对和一特定不同抗原决定基的α-突触核蛋白的不同于受9E4结合的重链/轻链对。人源化抗体在以下节IV B中概括地讨论。

术语“抗原决定基”涉及抗原上与抗体结合的位置。一个抗原决定基可以由连续的氨基酸或非连续的一种或多种蛋白质三次折叠排列的氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的抗原决定基通常暴露存放在变性溶剂中，而三次折叠形成的抗原决定基通常在处理变性溶剂时丢失。一个抗原决定基在一个独特的空间构象中通常包括至少3种，经常会更多，至少5个或 8-10个氨基酸。决定抗原决定基的空间构象的方法包括，例如，x-射线晶体和二维核磁共振。参见例子Epitope Mapping Protocols,in Methods in MolecularBiology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)。

识别到相同或者重叠的抗原决定基的抗体能够在一个简单的能显示一个抗体与另一抗体结合一靶抗原相互竞争能力的免疫测定中被识别。一个抗体的抗原决定基也可以由与其抗原相结合的抗体的X-射线晶体来定义以识别相接触的残基。备选地，如果降低或消除一种抗体的结合的抗原中的所有氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，那么这两种抗体有相同的抗原决定基。如果一些降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，那么这两种抗体有重叠的抗原决定基。

在抗体之间的竞争是由一种受测试的抗体抑制参考抗体与共同抗原特异性结合的化验所决定的(参考例子Junghans et al.,Cancer Res.50:1495, 1990)。如果一种测试抗体的过量(例如，至少2x、5x、10x、20x或者100x) 对参考抗体结合的抑制在一个竞争性结合试验中测量达到至少50％，但是优选75％、90％或99％，那么这种测试抗体与该参考抗体相互竞争。竞争性试验中识别的抗体(竞争性抗体)包括与相同的抗原决定基结合的抗体，正如参考抗体以及与相邻的抗原决定基相结合的抗体，所述抗原决定基足够靠近与参考抗体相结合的抗原决定基以发生空间位阻效应。

“病人”包括人类或者其他接受预防性或治疗性治疗的哺乳动物对象。

为了将氨基酸替代分类为保守的或者非保守的，氨基酸分组如下：第一组(疏水性侧链)：met,ala,val,leu,ile；第二组(中性亲水性侧链)： cys,ser,thr；第三组(酸性侧链)：asp,glu；第四组(基本侧链):asn,gln, his,lys,arg；第五组(影响链取向的残基)：gly,pro；和第六组(芳香族侧链)：trp,tyr,phe。保守置换牵涉同一类中氨基酸之间的取代。非保守取代构成这些类别中其中一个类别的成员与另一类别的成员的交换。

百分比序列特性是与Kabat编号规定的最大限度地排列的抗体序列一起确定的。在排列后，如果一主体抗体区域(例如一个重链或者轻链的完整的成熟可变区)与一个参考抗体的相同区域作比较，在主体和参考抗体区域之间的百分比序列特性是被既在主体又在参考抗体中的相同的氨基酸所占据的位置的数目除以两个区域排列的位置的总数目，不计间隙，再乘以100以转换为百分比。

“包含”一种或多种被列举的元素的成分或方法可能包括其他没有特别列举到的元素。例如，一种包含抗体的成分可能含有单独的抗体或者混合着其他成分的抗体。

值的范围的指定包含范围内或限定范围内所有整数，以及在范围内的整数定义的所有子范围。

除非上下文另有清楚地看出，术语“约”包括规定值的扫描电子显微镜中的值。

如果主体具有至少一个已知的危险因素(例如遗传、生化、家族史、环境暴露)，统计学上讲该危险因素使带有该危险因素的个体相比于没有带危险因素的个体处于疾病发展风险更显著的境地，那么个体处于疾病的风险就会增加。

术语“症状”涉及疾病的主观证据，例如改变了的步态，正如病人所感知到的。“病征”涉及疾病的客观证据，正如医生所观察到的。

统计显著性表示p≤0.05。

“认知功能”涉及心理过程，例如注意力、记忆力、产生和理解语言、解决问题，并对自身周围的事物和自我保护产生兴趣中的任意一个或全部。

“增强认知功能”或者“改善认知功能”涉及一种相对于基线的改善例如，诊断或初始治疗。“认知功能的衰退”涉及一种相对于所述基线的功能下降。

在动物模型系统中国，如大鼠或小鼠，认知功能可以通过使用迷宫的方法来测定，在该迷宫中主体使用空间信息(例如Morris水迷宫，巴恩斯圆形迷宫，高架旋臂迷宫，T迷宫等)、恐惧条件、主动回避、照亮的矿场、暗活度计，高架十字迷宫，双室探索性测试或强迫性游泳测试。

在人类中，认知功能可以由一个或好几个标准化测试来测量。测试例或者认知功能测定已有描述(Ruoppila,l.and Suutama,T.Scand.J.Soc. Med.Suppl.53,44-65,1997)并且包括标准化心理测试(例如韦氏记忆量表，韦氏成人智力量表，瑞文标准推理，Schaie-瑟斯顿成人心理能力测试)、神经心理测验(例如Luria-Nebraska)、元认知自我评价(例如元记忆问卷)、视觉空间检测(例如Poppelreuter的图，时钟识别，蜂窝绘图及取消)、认知筛选测验(例如Folstein的简易精神状态测试)以及反应时间测试。其他认知能力的标准测试包括阿尔茨海默病评估量表认知分量表(ADAS-cog)；变更规模的临床总体印象(CIBIC-plus scale)；日常生活能力量表阿尔茨海默病合作研究活动(ADCS-ADL)；简易精神状态检查(MMSE)；神经精神量表(NPI)；临床痴呆评定量表(CDR)；剑桥神经心理测试自动电池(CANTAB)或者山德士的老年临床评估(SCAG)、斯特鲁测验、路径描绘测验、韦氏数字广度测试和CogState计算机化认知测试。除此以外，认知功能可使用成像技术来测量，例如正电子发射断层扫描(PET)，功能性磁共振成像(fMRI)，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，或者任何其他允许测量大脑功能的成像技术。

详细说明

I.基本内容

本发明提供了人源化9E4抗体。所述抗体对路易体疾病的治疗和诊断有用。

II.靶分子

天然的人类野生型α-突触核蛋白是一种140种氨基酸的有如下氨基酸序列的肽：

MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTKEQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQ ID NO:12) (Ueda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:11282-6)；GenBank accession number:P37840)。所述蛋白有三个公认的域，一个涵盖氨基酸1-61的KTKE重复域，一个跨越氨基酸60-95的NAC(非淀粉样蛋白成分)域，以及一个跨越约氨基酸98到140的C端酸性结构域。

除非本文另有明显说明，参考α-突触核蛋白或其片段包括上述指示的人类的天然野生型氨基酸序列，以及其人类等位基因变体，特别是那些与路易体病相关的(例如E46K、A30P和A53T，具有指示SEQ ID NO：12 中的氨基酸的首字母，在SEQ ID NO:12中表示密码子位置的数字，以及表示等位变体中氨基酸的第二个字母)。此类变体能够可选地单独存在或以任何下面描述的本发明的任何一个方面中的任何组合形式存在。提高α-突触核蛋白聚合的诱发突变E83Q、A90V、A76T，也可以单独存在或者以与其他和/或人类等位基因变异体E46K、A30P和A53T结合形式存在。

III.路易体病

路易体病(LBD)的特点是多巴胺能系统、运动机的改变、认知障碍，以及路易体(LBs)形成的退化。(McKeith et al.,Neurology(1996) 47:1113-24)。路易体是在神经细胞中发现的球状蛋白质沉淀。其在大脑中的存在扰乱大脑的正常功能，即中断包括乙酰胆碱和多巴胺的化学信使的反应。路易体病包括帕金森氏病(包括特发性帕金森病)，又名路易体痴呆 (DLB)的弥漫性路易体病(DLBD)，阿尔茨海默病的路易体变种(LBV)，阿尔茨海默氏症和帕金森病，以及如多系统萎缩(MSA；例如橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和Shy-Drager综合征)。DLBD共有阿尔茨海默氏症和帕金森氏病的症状。DLBD不同于帕金森氏症主要表现在路易体的位置。在DLBD中路易体主要在皮层中形成。在帕金森氏病中，它们主要在黑质中形成。其他路易体病包括单纯性自主神经衰竭，路易体吞咽困难，偶然性路易体病，以及遗传路易体病(例如，α-突触核蛋白基因的突变， PARK3和PARK4)。

Ⅳ.本发明的抗体

A.结合特异性和功能特性

本发明人源化抗体具体结合人类α-突触核蛋白。若干人源化抗体 (即Ka抗体)的亲和力最好是鼠抗体9E4的五倍或者二倍。若干人源化抗体有一种与鼠9E4抗体相同或更强的亲和力。优选的人源化抗体结合相同的抗原决定基和/或与鼠抗体9E4竞争结合人类α-突触核蛋白。

在若干抗体中，人源化9E4一端连接双特异抗体，另一端连接血脑屏障表现的与受体结合的一种抗体，例如胰岛素受体，胰岛素生长因子 (IGF)受体，瘦素受体，脂蛋白受体，或优选转铁蛋白受体(Friden et al., PNAS 88:4771-4775,1991；Friden et al.,Science 259:373-377,1993)。受体中介的转运可以穿过血脑屏障转移这种双特异抗体。通过构建所述双特异抗体降低与血脑屏障受体的亲和力，从而进一步增强大脑对双特异抗体的吸收，对受体亲和力的降低使双特异抗体在大脑中分布更广(参见，例如，Atwal.et al.Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu et al.Sci.Trans.Med.3, 84ra44,2011)。

实施例的双特异抗体也可以是(1)双重可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链包含通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu et al.,Generation andCharacterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg (2010))；(2)Tandab，这是两种单链双抗体的融合体，其产生四价的双特异性抗体，其具有两个针对每一种目标抗原的结合位点；(3)flexibody，这是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(4)基于蛋白激酶A中“二聚化和锚结构域”的所谓的“锚和锁(dock and lock)”分子，当应用于Fabs 时，其可以产生由两个相同的Fab片段和与之连接的不同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(5)所谓的蝎子分子(Scorpion molecule)，其包含，例如，融合于人类Fc区的两个末端的两个scFv。用于制备所述双特异性抗体平台的例子包括但是不限于BiTE(Micromet)，DART(MacroGenics), Fcab和Mab2(F-star),Fc-工程IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换,Genmab).

B.人源化抗体

人源化抗体是一种基因工程抗体，其中来自于互补决定区从非人类 “供体”抗体移植到人类“受体”抗体序列中的(参见，例如，Queen et al., US5,530,101and 5,585,089；Winter et al.,US 5,225,539,Carter,US 6,407,213, Adair,US 5,859,205 6,881,557,Foote,US 6,881,557)。所述受体抗体序列可以是，例如，一个成熟人类抗体可变区序列，这种序列的组合物，人类抗体序列的共有序列(例如，light and heavy chainvariable region consensus sequences of Kabat,1991,supra)，或一个种系可变区序列。重链的更优序列是有NCBI登录号AAC50998(GI:1791009)的人类成熟重链可变区或由种系IGHV3-7'01或IGHV3-7'02(克隆名V3-7或VH3-11)衍生出的其他成熟重链可变区(Glas et al.,Clin Exp Immunol.107:372-80,1997)或并入其中一种种系序列的成熟重链可变区。对于轻链，更优的受体序列是有NCBI登录号AAY33350(GI:63102889)的人类成熟轻链可变区或由种系 IGKV1D-39或IGKV1-39(克隆名O2或O12)衍生出的其他成熟轻链可变区 (Kramer et al.,Eur J Immunol.35:2131-45,2005)或并入其中一种种系序列的成熟轻链可变区。因此，本发明人源化抗体是有三条轻链和三条重链互补决定区的一种抗体，其中互补决定区是由Kabat定义的来自于供体9E4抗体，成熟可变区框架序列和恒定区序列，如果存在，则完全或者实质上是源自于人类抗体序列。同样地，人源化的重链是具有三个互补决定区的重链，其中互补决定区是由Kabat定义的来自于所述9E4抗体，及成熟可变区框架序列和恒定区序列的重链，如果存在，则完全或者实质上是源自于人类抗体重链序列。同样地，人源化的轻链是具有三个互补决定区的轻链，其中互补决定区是由Kabat定义的来自于所述9E4抗体，及成熟可变区框架序列和恒定区序列的轻链，如果存在，则完全或者实质上是源自于人类抗体轻链序列。当相应的残基由Kabat定义的至少有85％,90％,95％, 96％,97％,98％,99％或100％是相同时，抗体链成熟可变区框架序列或抗体链恒定区序列实质上是分别来自于人类成熟可变区框架序列或恒定区序列。

源自人类成熟可变区框架残基的某些氨基酸可被选择以用于替换，该替换是基于它们对互补决定区构象和/或对抗原的结合的可能的影响。检测这种可能的影响可以通过如下方法进行：建模，检测特定位置的氨基酸的特征，或经验观测替换带来的影响、或诱变特定的氨基酸。

例如，当鼠的成熟可变区框架残基和一个选定的人类的成熟可变区框架残基之间的氨基酸不同，人框架氨基酸可以被源自鼠抗体的等效框架氨基酸取代，当氨基酸被合理的取代：

(1)与抗原非共价结合，

(2)毗邻互补决定区区域，

(3)否则，与互补决定区相互作用(例如在一个互补决定区区域内约6 )，

(4)介导重链和轻链的相互作用。

本发明提供了鼠9E4抗体的人源化形式，包括三个实施例的人源化轻链成熟可变区(Hu9E4VLv1-v3；SEQ ID NOs:3-5)和四个实施例的人源化重链成熟可变区(Hu9E4VHv1-v4；SEQ ID NOs:8-11)。SEQ ID NO:4包括鼠 9E4轻链的三个Kabat互补决定区和AAY33350的成熟可变区框架。如表2 所示，SEQ ID NOS.3和5包括回复突变。SEQ ID NO.11包括鼠9E4的三个Kabat互补决定区和AAC50998的成熟可变区框架。如表3所示，SEQ ID NOs:8-10包括回复突变。

本发明提供了人源化9E4抗体的突变，其中人源化重链成熟可变区显示了与SEQID NOs:8-11至少有90％,95％或99％是相同的，人源化轻链成熟可变区显示了与SEQ IDNOs:3-5至少有90％,95％或99％的序列是相同的，然而，任何来自于特定的SEQ ID NO.突变发生在成熟可变区域框架，而不是在Kabat互补决定区。在某些所述抗体中，位置L36被Y或F 占据，和/或位置L83被F或L占据，和/或位置H73被N或D占据和/或位置H93被A或S占据(这里所说的所有的位置，和其他所述的一样，在这个应用中是来自于Kabat号)在某些所述抗体中，Hu9E4VLv1-v3和 Hu9E4VHv1-v4中的某些或者全部回复突变被保留。换句话说，重链位置 H73和H93的一个或两个被D和A分别占据。同样地，在某些所述抗体中，轻链位置L36和L83的一个或两个被F和L分别占据。在某些所述抗体中，1,2,3或所有四个位置H73,H93,L36和L83被D,A,F和L分别占据。在某些所述抗体中，0,1或2位置在重链成熟可变区域框架相应的SEQ ID NO:11处被改变或0,1或2位置在轻链成熟可变区域框架相应的SEQ IDNO:4处被改变。

一些抗体具有包括三个SEQ ID NO:11序列中Kabat互补决定区的人源化重链和三个SEQ ID NO:4序列中Kabat互补决定区的人源化轻链，其中(provided that)位置L36(Kabat编号)被F或Y占据，和/或位置L83 (Kabat编号)被L或F占据，和/或位置H73(Kabat编号)被D或N占据，和/或位置H93(Kabat编号)被S或A占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat 编号)被F占据并且位置L83(Kabat编号)被L占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据并且位置H73(Kabat编号)被D 占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat 编号)被F占据并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，且位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些这样的实施例中，位置 L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H93 (Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号) 被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H93(Kabat编号)被 A占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置 H73(Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被F占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat 编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，且位置H93(Kabat 编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被F占据，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号)被L占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号) 被L占据，且位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号)被L占据，且位置H93(Kabat 编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号)被L 占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73 (Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些这样的实施例中，位置H73(Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些这样的实施例中，位置H73(Kabat编号)被D占据，位置H93(Kabat 编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置H93(Kabat编号)被S 占据。在一些这样的实施例中，位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号)被Y占据，位置L83(Kabat编号)被F占据，位置H73(Kabat编号)被N占据，且位置H93(Kabat编号)被S占据。因此在表1中列出了一些典型的实施例，这些实施例中在位置L36、L83、H73和H93上具有满足要求的残基以及它们的结合。

表1：在位置L36、L83、H73和H93(Kabat编号)上具有满足要求的残基的典型的实施例。

典型实施例	L36	L83	H73	H93
					1	f	F	N	A
2	f	l	N	A
					3	f	F	d	A
4	f	F	N	s
					5(version 3)	f	l	d	A
6	f	l	N	s
					7(version 1)	f	F	d	s
8	f	l	d	s
					9	Y	l	N	A
10	Y	l	d	A
					11	Y	l	N	s
12	Y	l	d	s
					13	Y	F	d	A
14	Y	F	d	s
					15(version 2)	Y	F	N	s

在一些实施例中，重链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的SEQ ID NO:10。在一些实施例中，轻链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3。在一些实施例中，重链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的SEQ ID NO:10，并且轻链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3。在一些实施例中，重链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的SEQ ID NO:10，并且轻链成熟可变区有一个氨基酸序列指定的SEQ ID NO:5。

其他氨基酸置换能够在重链成熟可变区框架内进行，例如，在不与互补决定区接触的残基中进行。通常通过氨基酸置换对多种人源化序列进行置换是比较保守的。在一些实施例中，对Hu9E4VLv1-v3以及 Hu9E4VHv1-v4(无论是否保守)进行的置换对Hu9E4VLv1-v3以及 Hu9E4VHv1-v4的最终抗体的结合力或结合能都不会有显著的影响，也就是说其结合人类α-突触核蛋白的能量不会有显著的影响。

通常变体与Hu9E4VLv1-v3以及Hu9E4VHv1-v4重链和轻链成熟可变区序列的差别在于几个(即，通常在无论轻链或重链成熟可变区框架或上述两者内不会超过1、2、3、5或10位点改变)位点的置换、删除或者插入上。

C.恒定区的选择

人源化抗体的重链和轻链成熟可变区能够被连接到人类恒定区的至少一部分上。某种程度上，恒定区的选择取决于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性、抗体依赖的细胞吞噬作用和/或补体依赖的细胞毒性是否是所期望的。例如，人类的同种型IgG1和IgG3有补体依赖的细胞毒性而人类同种型IgG2和IgG4不具有。人类IgG1和IgG3相对于IgG2和IgG4也能引起更强的细胞介导效应功能。轻链恒定区可以是λ或κ。典型的人类轻链κ 恒定区有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。一些这样的轻链κ恒定区能够通过核酸序列进行编码。在轻链κ恒定区有SEQ ID NO:28氨基酸序列的情况下，SEQ ID NO:13的N末端精氨酸能够被忽略。一些这样的轻链κ恒定区能够通过核酸序列进行编码。一个典型的人类IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:14(具有或没有C末端赖氨酸)的氨基酸序列。一些这样的重链恒定区能够通过核酸序列进行编码。抗体可以表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体、表达为单独的重链和轻链、表达为Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv，或单链抗体，其中重链和轻链的可变结构域通过间隔区连接。

人类恒定区在不同个体间显示同种异型的变化和同族同种异型的变化，即恒定区在不同个体的一个或多个多态性位点可以不同。同种异型和同族同种异型的区别在于：血清识别一个结合于一个或多个其他同种型的非多态性区域的同族同种异型。因此，例如一个重链恒定区是IgG1G1m3 同种异型体并且具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列。另一个重链恒定区具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列，除非其缺少C末端赖氨酸。

在轻链和/或重链的氨基端或羧基端的一个或多个氨基酸，例如重链C-末端的赖氨酸，可能会丢失或在某一部分或全部分子上衍生化。可在恒定区制备替换，以减少或增加效应子功能，如补体介导的细胞毒性或 ADCC(参见，例如Winter等，US Patent No.5,624,821；Tso等，US Patent No.5,834,597；and Lazar等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或在人体内延半衰期(参见，例如Hinton等，J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性的替换包括在250位的谷氨酰胺和/或428位的亮氨酸(在本段落中使用EU编号来表示恒定区)，可以增加抗体的半衰期。234、235、236和 /或237任意位点的替换可以降低对Fcγ受体的亲和力，尤其是FcγRI受体(参见，例如US6,624,821)。任选地，在人类IgG2的234、236和/或 237位被丙氨酸取代，235位被谷氨酰胺取(参见，例如US5,624,821)。

D.重组抗体表达

抗体可以通过重组表达来产生。编码该抗体的核酸可以通过所需的细胞类型(例如，CHO或Sp2/0)密码子优化表达。重组核酸构建体通常包括可操作地连接到抗体链编码序列的表达控制序列，其包括天然相关或异源启动子区。表达控制序列可以是启动子的真核系统中能够转化或转染真核宿主细胞的载体。一旦载体已掺入合适的宿主，宿主被保持在适合核苷酸序列高水平表达以及交叉反应的抗体的收集和纯化的条件下。载体编码抗体链也可以包含一个可选择的基因，如二氢叶酸还原酶，来允许编码抗体链的核酸复制数扩增。

大肠杆菌是一种可用于表达抗体，特别是抗体片段的原核宿主。也可用微生物，如酵母表达。酵母属是一种优选的酵母宿主，其为具有表达控制序列、复制起点和终止序列等的合适载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括但不限于，来自醇脱氢酶的启动子，异细胞色素C及应用于麦芽糖和半乳糖利用率的酶。

哺乳动物细胞可以用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段。见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。一些能够分泌完整的异种蛋白质的合适的寄主细胞系列已经在本领域得到发展，包括CHO细胞系、各种COS细胞系列、HeLa细胞、HEK293细胞， L细胞和非抗体产生骨髓瘤细胞系列包括Sp2/0和NS0。使用非人类细胞很有利。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强剂(Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986))和必要的信息处理位置，如核糖体结合位点、RNA(核糖核酸)剪接位点、聚腺苷酸化位置和转录终止剂序列。优选的表达控制序列是源自内生基因、巨细胞病毒、SV40、腺苷病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

将编码抗体重链和轻链载体引入细胞培养，细胞池可以进行筛选以增长无血清培养基中的生产能力和质量。然后顶级生产细胞库可以根据基于FACS的单细胞克隆来产生单克隆线。对应于大于7.5g/L的培养产物滴度比，每天每个细胞50pg或100pg以上的单位生产率是有利的。由单个细胞克隆产生的抗体也可用于浊度，过滤特性，聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)，等电聚焦(IEF)，紫外(UV)扫描，高效液相色谱联用 (HP-SEC)，碳水化合物低聚糖映射，质谱法及合并所需测定法，如酶联免疫吸附法(ELISA)或生物传感器。随后可将选定的克隆副本存入银行的多个小瓶冷冻保存以备后用。

一旦表达，可以根据本领域的标准步骤，包括蛋白A捕获、柱色谱法(例如hydrophobic interaction or ion exchange),low-pH病毒失活等等(另参见,Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982)。

商业生产包括密码子优化、启动子选择、转录元件和终止子、无血清单细胞克隆及细胞银行的抗体的方法，利用选择标记来进行复制数、CHO 终止子、血清游离单细胞克隆的增殖及改善蛋白质效价(见，如，US 5,786,464,US 6,114,148,US 6,063,598,US 7,569,339,WO2004/050884, WO2008/012142,WO2008/012142,WO2005/019442,WO2008/107388,和WO2009/027471,以及US 5,888,809)。

V.核酸

本发明进一步提供编码任何上述重链和轻链的核酸。通常地，该核酸还编码一个融合于成熟的重链和轻链的信号肽(例如，具有可以被SEQ ID NOS:23和25编码的氨基酸序列SEQ ID NOS:22和24的信号肽)。核酸上的编码序列可与调控序列可操作地连接，以确保编码序列如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等的表达。编码重链和轻链的核酸可发生于分离形式或可被克隆到一个或多个载体中。该核酸可以通过，例如，固相合成或重叠寡核苷酸聚合酶链式反应(PCR)进行合成。编码重链和轻链的核酸可以结合为一个连续的核酸，如处于表达载体内，或者可以是独立的，例如，每个克隆到其自身表达载体。

VI.治疗应用

本发明针对患有或有路易体疾病患病风险的患者，提供了治疗或用于预防路易体疾病的几种方法。适合治疗的患者既包括已出现突触核蛋白病症状或早期征兆的患者，也包括有路易体病(LBD)患病风险但尚未出现症状的个体，例如，脑电图放缓，神经精神症状(抑郁症，老年痴呆症，幻觉，焦虑，淡漠，快感缺乏)，植物神经变化(体位性低血压，膀胱障碍，便秘，大便失禁，流涎，吞咽困难，性功能障碍，脑血流量的变化)，感觉改变(嗅觉，疼痛，颜色辨别异常感觉)，睡眠障碍(REM睡眠行为障碍(RBD)，不宁腿综合征/周期性肢体运动，嗜睡，失眠)以及其他体征和症状(疲劳，复视，视物模糊，脂溢性皮炎，减肥/增肥)。因此，本方法可以预防性地给药于已知具有路易体病(LBD)遗传风险的个体。这些个体包括有亲属患过该种疾病的人类，以及由遗传分析或生化指数分析来确定患病风险的人类。帕金森病风险的遗传标记包括α-突触核蛋白或帕金、UCHLI和CYP2D6基因突变；特别是在位置30和53的α-突触核蛋白基因突变。目前患有帕金森病的个人可以通过其临床表现包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳来识别。

对无症状的患者，治疗可以在任何年龄开始(例如，10岁，20岁， 30岁)。然而，通常，病人在40岁，50岁，60岁或70岁前没有必要开始治疗。治疗通常需要一段时间内多个剂量。可以通过测定抗体监控治疗，或活化的T细胞或B细胞对治疗剂(例如，α-突触核蛋白肽的截短形式) 随时间的反应。如果响应下降，指示升压剂量。

通过在患者体内产生有益的治疗反应(例如，减少神经炎和/或聚集轴突α-突触核蛋白、减少神经炎性营养不良、改善认知功能和/或逆转、治疗或阻止认知功能减退)的情况下对患者给药抗体，该抗体用于可治疗或预防路易体疾病。在一些方法中，治疗患者与对照人群相比，大脑皮层的神经纤维网中的神经炎营养不良区域可平均减少至少10％、20％、30％或 40％。

认知障碍、认知功能逐渐减退下降、脑形态学改变以及脑功能改变通常能在患有路易体病或有路易体病风险的患者中观察到。本发明抗体的给药能抑制或延缓此类患者认知功能下降。

本发明还提供保存或增加突触密度和/或树突状密度的方法。突触或树突密度的改变指数可通过突触形成(突触素)和/或树突(MAP2)标记物来测定。在一些方法中，该突触或树突密度可以恢复到健康受试者突触或树突密度的水平。在一些方法中，与未治疗的对照患者群相比，接受治疗的患者的突触或树突密度的平均等级可提高5％，10％，15％，20％，25％， 30％或更多。

VII.药物组合物和治疗方法

在预防性应用中，将抗体或试剂诱导的抗体或相同的药物组合物给药于易感患者或以其他方式有疾病风险的患者，通过机制(剂量，频率和给药途径)有效降低风险，减轻严重性，或延迟至少一个该疾病的标志或症状的发作。在某些预防性应用中，该机制可有效地抑制或延迟α-突触核蛋白和截短片段在脑中的积累，和/或抑制或延缓它的毒性作用和/或抑制/ 或延缓行为缺陷的发展。在治疗性应用中，抗体或试剂诱导的抗体被给药于疑似患者或已经患有路易体疾病的患者，或通过机制(剂量，频率和给药途径)有效地改善或至少抑制进一步恶化中的至少一个标志或该疾病的症状。在一些治疗应用中，该机制可有效地减少或至少抑制α-突触核蛋白的水平和截短片段，有关的毒性和/或行为缺陷的进一步增加。

如果通过本发明的方法治疗的患者个体达到的效果比不用本方法治疗的对照群体患者的平均效果更有利，或者如果接收治疗的患者与对照组患者在对照临床试验(例如，II期，II/III期或III期试验)相比较，表现出更有利的效果，p<0.05或0.01，甚至0.001的水平，则认为一种机制是治疗或预防上是有效的。

有效剂量变化取决于许多不同的因素，包括给药方式，靶位点，患有包括路易体病类型患者的生理状态，患者是否为ApoE基因的载体，患者是人类还是动物，其他药物给药和治疗是预防性的还是治疗性的。

一种示例性的抗体剂量范围是从约0.01-5mg/kg，更通常为 0.1-3mg/kg，或0.15-2mg/kg或0.15-1.5mg/kg患者体重。服用这种剂量的抗体计划可以是每天、隔日、每周、每两周、每月、每季度或根据通过实证分析决定的任何其他计划。一种示例性治疗需要在延长的时间段内给药多个剂量，例如，至少为六个月。其他示例性的治疗方案需要每两周或每月或每3～6个月给药一次。

抗体可以通过外围途径(即，给药或诱导抗体穿过血脑屏障到达大脑中的一个期望的站点)给药。给药途径包括局部、静脉注射、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内。某些给药途径是静脉内和皮下。这种类型的注射通常施于手臂或腿部肌肉。在一些方法中，试剂直接注射到特定的沉积积累的组织，例如颅内注射。

用于胃肠外给药的药物组合物可以是无菌和基本上等渗并在药品生产质量管理规范(GMP)条件下生产的。药物组合物可以以单位剂量形式来提供(即，剂量为单次给药)。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料进行配制。配制取决于所选择的给药途径。对于注射剂，抗体可在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减少注射部位的不适感)。该溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选抗体可以为冻干形式，使用前与合适的载体如无菌无热原水一起构造。

该机制，可以与另一种有效治疗或预防所治疾病的药剂组合给药。例如，对于帕金森氏病，对抗α-突触核蛋白WO/2008/103472、左旋多巴、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO-B抑制剂、金刚烷胺或抗胆碱能药等的免疫治疗药剂可与本机制组合使用。

VIII.其他应用

上述抗体可用于临床诊断或治疗或研究时检测α-突触核蛋白。该抗体也可以作为研究试剂出售，用于实验室研究检测承载α-突触核蛋白的细胞及其对各种刺激的响应。在该种用途中，单克隆抗体可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素标记，并且可以以具有所有必要试剂的试剂盒的形式来提供，从而对α-突触核蛋白进行化验。该抗体也可用于纯化α-突触核蛋白，例如，通过亲和色谱法。

该抗体可以用于检测患者的路易体病。这些方法对于诊断或确定诊断帕金森病，或大脑中存在或易感路易体病的其他相关联疾病有帮助。例如，该方法可用于呈现痴呆症状的患者。如果患者有路易体病，则该患者很可能患有路易体疾病，如帕金森病。该方法也可以用于无症状的患者。路易体或α-突触核蛋白的其他异常沉积的存在表明易感未来有症状的疾病。该方法对于监测疾病进展和/或监控先前已诊断患有路易体病的患者对治疗的反应也是有用的。

可以通过给药抗体，绑定后检测该抗体来执行该方法。如果需要的话，可通过使用缺乏全长恒定区如Fab的抗体片段来避免透明化现象。在一些方法中，同样的抗体既可以作为治疗试剂也可作为诊断试剂。

用于诊断(例如，体内成像)时，该抗体可通过静脉内注射到患者体内给药，或通过颅内注射直接进入大脑给药或通过在颅骨上钻一个洞给药。试剂的用量应与作为治疗方法的用量范围相同。尽管在一些方法中，抗体未标记而次级标记剂用于与抗体结合，但通常，该抗体被标记。标记的选择取决于检测手段。例如，荧光标记物适于光学检测。采用顺磁性标签适用于无手术干预断层探测。也可以使用正电子发射型断层显像(PET) 或单光子发射计算机断层成像术(SPECT)检测放射性标记物。

通过将标记位点的数目，大小和/或强度与相应的基线值比较来进行诊断。该基线值可代表非疾病个体的群体的平均水平。基线值也可代表同一患者以前确定的水平。例如，基线值可以在患者开始治疗前来确定，此后测量值然与基线值进行比较。测量值相对于基线值减少预示治疗的积极响应。

该抗体可以用于产生抗独特型抗体。(见，例如，Greenspan&Bona, FASEB J.7(5):437-444,1989；and Nissinoff,J.Immunol.147:2429-2438, 1991)。这类抗个体基因型抗体既可用于临床人类-抗体-人类抗体(HAHA) 在应用抗体治疗的个体疗效的研究，也可用于药物动力、药效学、生物分布研究。例如，抗独特型抗体与人源化9E4抗体可变区特异性结合，因此可被用于在药动学研究中检测人源化9E4抗体及帮助量化人类-抗体-人类抗体(HAHA)对接受治疗的个体的疗效。

上文或下文引用的所有专利申请、网站、以及其他出版物、保藏号等，出于所有目的以相同的程度结合其全文进行引用如同具体地和单独地指明每个单独的条目来引入参考。如果不同版本的序列在不同时间都与登记号相关联，则是指在本申请的有效申请日期内相关联的登记号。有效申请日指早期的实际申请日，或优先权申请日如适用参见登记号。同样，如果不同时间公布不同版本的出版物、网站或其他，则除非另有说明，是指在有效申请日内最新公布的版本。除非特别注明，本发明的任何特征、步骤、要素、实施方式或标记可与其余任意一个进行组合。虽然本发明已经通过说明和举例详细描述以达到清楚明了和便于理解的目的，但是显而易见，在附属权利要求保护范围内，可进行某些改变和修正。

具体实施方式

实施例I.人源化9E4抗体的设计

人源化的切入点或供体抗体是由具有ATCC保藏号PTA-8221和美国专利申请号11/710248(公开号为US2009/0208487)中所述的杂交瘤产生的鼠抗体9E4。所述9E4的可变卡帕(Vκ)属于对应于人类Kabat子组1 的鼠Kabat子组1。所述9E4的可变重链(Vh)属于对应于人类Kabat子组3(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242,1991)的鼠Kabat子组3d。此实施例通篇使用Kabat编号。

所述17-残基CDR-L1属于常规种类3，所述7-残基CDR-L2属于类别1，所述9-残基CDR-L3属于Vκ(Martin&Thornton,J Mol Biol.263:800-15, 1996)中的类别1。所述5-残基CDR-H1属于类别1，所述17-残基CDR-H2 属于类别2(Martin&Thornton,J Mol Biol.263:800-15,1996)。所述CDR-H3 没有规范的类别，但是所述7残基环根据Shirai等的规则有可能具有一个扭结基。(FEBS Lett.455:188-97,1999)。

搜索所述PDB数据库(Deshpande et al.,Nucleic Acids Res.33: D233-7,2005)的蛋白质序列来找到可以提供一个9E4抗体的粗略结构模型的模型。该二聚抗体X836(pdb代码3MBX)(Teplyakov et al,Mol Immunol., 47(14):2422-6,2010)的晶体结构被选定为V结构，因为它具有良好的分辨力(1.6A)且与9E4Vκ的整体序列相似，为所述环保留了相同的典范结构。1H3P(Pizarro et al.,FEBS Lett.509:463-8,2001)用于所述Vh结构。它有良好的整体序列相似性和适当的分辨力(2.6A)，但也具有与扭结基相同长度的CDR-H3。此外，CDRs-H1和H2具有与9E4Vh相同的典范结构。 DeepView/Swiss-PdvViewer 3.7(SP5)(Guex and Peitsch,Electrophoresis 18: 2714-2723,1997)用于结构建模。

一个来自NCBI的非冗余蛋白质序列数据库的检索允许选择合适的人类架构来植入鼠的互补决定区。对于Vκ，选择一个具有NCBI保藏号 AAY33350(GI:63102889)(Krameret al.,Eur J Immunol.35:2131-45,2005) 的人类卡帕轻链。所述9E4抗体具有与CDR-L2和L3相同的典范类，且根据IMGT公约属于人种系IGKV1D-39或IGKV1-39(克隆名O2或O12)。它是Kabat人类卡帕子组1的一员。对于Vh，选择一个具有NCBI保藏号AAC50998(GI:1791009)(Glas et al.,Clin Exp Immunol.107:372-80, 1997)的人类Ig重链，也具有与9E4相同的典范类且属于人种系IGHV3-7'01或IGHV3-7'02(克隆名V3-7或VH3-11)。它是Kabat人类重链子组3的一员。

在人类受体与鼠供体可变区架构位置的不同被认定为回复突变的候选。H73在抗原结合位置的边缘且与CDR-H2交互。L36是Vκ/Vh的界面残基。L83邻近恒定区。在抗体9E4中L83是亮氨酸，但在人架构中L83 是较大的氨基酸苯丙氨酸。

三个人源化重链和三个人源化轻链在这些位置的不同排列来结合形成回复突变。(图1-2序列排序以及表2-3)。

表2 VH回复突变

VH变异体	VH外显子受体序列	供体架构残基
			Hu9E4VHv1	NCBI保藏号AAC50998	H73,H93
Hu9E4VHv2	NCBI保藏号AAC50998	H93
			Hu9E4VHv3	NCBI保藏号AAC50998	H73

表3 VL回复突变

VL变异体	VL外显子受体序列	供体架构残基
			Hu9E4VLv1	NCBI保藏号AAY33350	L36
Hu9E4VLv2	NCBI保藏号AAY33350	None
			Hu9E4VLv3	NCBI保藏号AAY33350	L36,L83

>9E4Vκ版本1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYP LTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)

>9E4Vκ版本2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSY PLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:4)

>9E4Vκ版本3

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSIQTLLYSSNQKNYLAWFQQKPGKAPKLLIYWASIRKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQYYSYP LTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:5)

>9E4vh版本1

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC SRGGAGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:8)

>9E4vh版本2

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC SRGGAGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:9)

>9E4vh版本3

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGGSTYYPDNVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGGAGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:10)

AAY33350轻链和AAC50998重链的Kabat编号如下：

AAY33350轻链的Kabat编号：

AAC50998重链的Kabat编号：

其它重链和轻链可变区的Kabat编号可以通过对准分配相同编号的相应残基或使用市售软件来确定。

表4人源化抗体9E4在回复突变的优选架构残基的Kabat编号

实施例II.携带α-突触核蛋白抗体的被动免疫

这个实验的目的是证实α-突触核蛋白抗体在体内及体外的研究以及行为分析的有效性。我们使用α-突触核蛋白转基因(61线)，α-突触核蛋白基因敲除和野生型雌性小鼠，3-4个月大时开始且n＝14/组。抗体检测包括9E4(IgG1，抗原决定基：α-突触核蛋白的氨基酸118-126)，5C1 (IgG1，抗原决定基：α-突触核蛋白的氨基酸118-126，C-链接)，5D12，IgG2(SN118-126)，1H7，IgG1(序号91-99)和IgG1对照抗体 27-1。5个月期间内小鼠接受10mg/kg的剂量总共21次注射。此外，通过单方面引入人类α-突触核蛋白(wt)到海马区，动物被注射慢病毒(LV)来表达人类α-突触核蛋白(wt)。

读出抗体包括这些来自Chemicon(抗原决定基:全长α-突触核蛋白)， Millipore(抗原决定基:全长α-突触核蛋白),和Neotope,ELADW 105(抗原决定基:全长α-突触核蛋白的氨基酸121-124)。

终点：抗体效价在生命期的测定。

行为分析包括水迷宫实验(MWW)和水平梁试验。所述圆梁试验是采用不同直径的两个圆梁进行运动平衡、协调和步态的试验。圆梁A的直径较大 (被认为是较简单的圆梁测试)圆梁D的直径较小(被认为是较困难的圆梁测试)。数据被表示为“误差”(滑倒次数/10cm)和“速度”(行程10cm所需的时间/sec)。水迷宫试验在在第10周开展并结束。接着是如下的神经病理学测量：α-突触核蛋白聚沉、突触素和微管相关蛋白。然后是如下的生物化学测量：α-突触核蛋白，PSD95，突触。利用突触、神经元和神经胶质标记来完成选取多重标签和共焦标签。

结果表明，除了5D12的所有的抗体，产生的同步积累和保存的树突和突触密度显著降低，同样在MWM性能的积极成果也降低了。该9e4 抗体在体外和体内研究以及行为分析方面是有效的。所得读数表明抗体可能减少神经炎/轴突α-突触核蛋白聚集。

行为结果：所述9e4抗体改善了-突触核蛋白转基因小鼠(图3-4) 在水迷宫实验中的行为表现。相反地，所述5D12抗体没有改善-突触核蛋白转基因小鼠(图4)在水迷宫实验中的行为表现。该9E4和1H7抗体提高了在水平梁试验中的速度和错误的行为表现，而5D12抗体和5C1抗体却没有(图4)。

神经病理学结果：所述9E4、1H7和5C1抗体减少了ELADW-105 阳性神经炎营养不良症状，而5D12抗体没有。在α-突触核蛋白转基因小鼠中，与对照组相比9E4抗体减少了大脑皮层中43％的神经纤维面积和 40％的基底神经节。该9E4抗体还保存了在大脑皮层和基底节的突触素和 MAP2。

实施例III.免疫沉淀

对从患病组织采取的抗原进行免疫沉来淀测试各种版本的人源化 9E4抗体的结合效力(图5)。通过各5μg表示抗体用蛋白G磁珠(New England Biolabs)来对来自老年痴呆和路易体的大脑的150微克Tris-可溶性脑裂解物进行免疫沉淀。用PBS/350mM NaCl/0.5％NP-40清洗5次，然后水煮，再通过SDS-PAGE对由此产生的样品进行分析。印迹后，用Ab5038 (Millipore)将膜温育，即得检测总突触核蛋白的多克隆抗体。重复以上实验三次以确保精度。

实施例IV.免疫印迹

重组人类突触核蛋白与小鼠免疫印迹法，嵌合的人源化9E4抗体如图6所示。小鼠的抗体稀释曲线与嵌合的人源化9E4抗体明显相似。所有抗体的检测在28kDa的第一频带和在49kDa的第二频带。所述49kDa频带可能是共核蛋白的多聚体。

表明重组体的数量，通过SDS-PAGE分离细菌表达的人类野生型突触核蛋白，并用相同数量的9E4的表达形态来印迹。洗涤后，将品种相适应的山羊多克隆抗与IRDye-800荧光体结合，然后洗涤印迹。不同的抗体的曝光时间是相同的。

保藏

下面的杂交瘤已根据布达佩斯条约的规定在指定期限内保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC,P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108)。该保藏将被保存至授权登记，若所述保藏样品发生基因突变则该保藏样品应被替换，若保藏样品自存放机构收到最近的提取样品的请求后至少五年内或自保藏之日起至少三十年内或在相关专利的强制执行的期限内死亡或损毁的都应该被替换，以上期限以较长的为准。自本专利申请公布之日起这些公开的细胞系的使用限制将不可变地予以撤销。

序列表

<110> 普罗典娜生物科学有限公司

<120> 识别α-突触核蛋白的人源化抗体

<130> 057450/424859

<150> 61/553,131

<151> 2011-10-28

<160> 32

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ser Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 15

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgca agtccatcca gaccctgctg tactcctcca accagaagaa ctacctggcc 120

tggttccagc agaagcccgg caaggccccc aagctgctga tctactgggc ctccatccgc 180

aagtccggcg tgccctcccg cttctccggc tccggctccg gcaccgactt caccctgacc 240

atctcctccc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagta ctactcctac 300

cccctgacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaag 339

<210> 16

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgca agtccatcca gaccctgctg tactcctcca accagaagaa ctacctggcc 120

tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc aagctgctga tctactgggc ctccatccgc 180

aagtccggcg tgccctcccg cttctccggc tccggctccg gcaccgactt caccctgacc 240

atctcctccc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagta ctactcctac 300

cccctgacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaag 339

<210> 17

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgca agtccatcca gaccctgctg tactcctcca accagaagaa ctacctggcc 120

tggttccagc agaagcccgg caaggccccc aagctgctga tctactgggc ctccatccgc 180

aagtccggcg tgccctcccg cttctccggc tccggctccg gcaccgactt caccctgacc 240

atctcctccc tgcagcccga ggacctggcc acctactact gccagcagta ctactcctac 300

cccctgacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaag 339

<210> 18

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacggca tgtcctgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcctcc atctcctccg gcggcggctc cacctactac 180

cccgacaacg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgacg acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgctc ccgcggcggc 300

gccggcatcg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgtcctcc 348

<210> 19

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacggca tgtcctgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcctcc atctcctccg gcggcggctc cacctactac 180

cccgacaacg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgctc ccgcggcggc 300

gccggcatcg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgtcctcc 348

<210> 20

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacggca tgtcctgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcctcc atctcctccg gcggcggctc cacctactac 180

cccgacaacg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgacg acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggcggc 300

gccggcatcg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgtcctcc 348

<210> 21

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60

tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacggca tgtcctgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcctcc atctcctccg gcggcggctc cacctactac 180

cccgacaacg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggcggc 300

gccggcatcg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgtcctcc 348

<210> 22

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Ser Ser Gly

20

<210> 23

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60

tccggc 66

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 25

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgc 57

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> VARIANT

<222> 42

<223> Xaa = Y or F

<220>

<221> VARIANT

<222> 89

<223> Xaa = F or L

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Xaa Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 27

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> VARIANT

<222> 74

<223> Xaa = N or D

<220>

<221> VARIANT

<222> 97

<223> Xaa = A or S

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Xaa Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Xaa Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 29

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 30

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 31

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 32

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

Claims

1.一种特异性结合人类α-突触核蛋白的抗体，包括具有序列SEQ ID NO:11的三个Kabat CDRs的人源化重链可变区以及具有序列SEQ ID NO:4的三个CDRs的人源化轻链可变区，但是所述轻链的位置L36(Kabat编号方式)被F占用，位置L83(Kabat编号)被F或L占用，位置H73(Kabat编号方式)被D占用，且位置H93(Kabat编号)被由A或S占用，且所述人源化重链可变区在不超过两个可变区框架位置与序列SEQ ID NO:8或10有差别，所述人源化轻链可变区在不超过两个可变区框架位置与序列SEQ ID NO:5有差别。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述重链可变区连接到重链恒定区，所述轻链可变区连接到轻链恒定区。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:32或SEQID NO:14，但是其中C-末端赖氨酸残基可以被省略，且其中所述轻链恒定区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28。

4.如上述任一项权利要求所述的抗体在制备用于治疗突触核蛋白病的药物中的用途。

5.一种编码上述任一项权利要求所述的抗体的重链和轻链的核酸。