JP2020504729A - タウ凝集を防止するためのモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体 - Google Patents
タウ凝集を防止するためのモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法施行規則(37 C.F.R.)第1.821条にしたがう1つまたは複数の配列表(以下参照)を含み、これは、紙およびコンピュータ可読媒体の両方に開示され、この紙およびコンピュータ可読の開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
Clavagueraおよび同僚は、タウ自体が内因性病原体(endo−pathogen)として働き得ることを実証した(Clavaguera,F.et al.(2009)Nat.Cell Biol.11,909−913)。低スピン(low spin)脳抽出物を、P301Sタウトランスジェニックマウスから単離し(Allen,B.et al.(2002)J.Neurosci.22,9340−9351)、希釈し、幼若ALZ17マウスの海馬および皮質領域に注入した。ALZ17マウスは、遅い病変(late pathology)のみを発現するタウトランスジェニックマウス株である(Probst,A.et al.(2000)Acta Neuropathol.99,469−481)。注入されたALZ17マウスは、固体線維状病変を直ぐに発現し、P301Sマウスに由来する免疫枯渇された脳抽出物または野生型マウスに由来する抽出物の投与は、タウ病変を誘発しなかった。可溶性(S1)およびサルコシル不溶性タウ(P3)中の脳抽出物の分別(Sahara,N.et al.(2013)J.Alzheimer’s.Dis.33,249−263)およびALZ17マウスへのこれらの注入は、P3画分が、病変の誘発に最も有効であることを実証した。それは、細胞内過リン酸化線維状タウの大部分を含有する。病変の大部分は、P301S抽出物を野生型マウスの脳内に注入した場合にも誘発され得るが、NFTは形成されなかった。その後の研究において、Clavagueraらは、他のタウオパチー(嗜銀顆粒病(AGD)、進行性核上性まひ(PSP)、および大脳皮質基底核変性症(CBD))の死後脳組織から抽出されたヒトタウも、ALZ17モデルにおいてタウ病変を誘発し得ることを示した(Clavaguera,F.et al.(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,9535−9540)。これらのデータの提示以来、いくつかの他のタウシーディングおよび拡散モデルが報告されている(Ahmed,Z.et al.(2014)Acta Neuropathol.127,667−683;Walker,L.C.et al.(2013)JAMA Neurol.70,304−310)。これらの研究からの主な結論は、細胞内封入体中の病原性タウが細胞から細胞周辺腔中へと分泌される機構を示す。次に、病理学的タウ材料は、順行および逆行方向の両方で、小胞の鞘に沿って輸送され、その後、バルクエンドサイトーシスによって、隣接する細胞によって取り込まれる。この機構は、ヒトの疾患において観察される病変の拡散が、明確な解剖学的パターンにしたがう理由を説明する。興味深いことに、病理学的タウの末梢投与は、ALZ17マウスにおけるタウ病変の形成を加速させ得る(Clavaguera,F.et al.(2014)Acta Neuropathol.127,299−301)。
α−シヌクレインは、β−およびγ−シヌクレインおよびシノレチン(synoretin)を含むタンパク質のファミリーの1つである。α−シヌクレインは、シナプスに関連して正常な状態で発現され、シナプス小胞放出を調節し、それによって、神経、可塑性、学習および記憶に影響を与える役割を果たすものと考えられる。
α−シヌクレインに結合する抗体は、レビー小体病(LBD)としても知られているシヌクレイノパチーを治療するための潜在的な治療剤として開発された。シヌクレイノパチーは、タンパク質α−シヌクレインが主要な構成要素である、レビー小体(LB)および/またはレビー神経突起として顕微鏡で見られる細胞内タンパク質凝集体の堆積によって特徴付けられる(Jellinger,Mov Disord.2012 Jan;27(1):8−30;McKeith et al.,Neurology(1996)47:1113−24)。シヌクレイノパチーとしては、パーキンソン病(特発性パーキンソン病を含む)およびびまん性レビー小体(DLB)病(レビー小体認知症(DLB)としても知られている、レビー小体変異型アルツハイマー病(LBV)、複合された(combined)アルツハイマー病およびパーキンソン病(PD)、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症(MSA;例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群))が挙げられる。
定義
本明細書において使用される際、「α−シヌクレイン」という用語は、「α−シヌクレインタンパク質」と同義であり、α−シヌクレインタンパク質アイソフォーム(例えば、P37840、1−3としてUniProtにおいて同定される)のいずれかを指す。α−シヌクレインのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるように配列番号10に対して示され、メチオニン(M)は、アミノ酸残基1である:
GM37変異体1重鎖CDR2配列番号33
GM37変異体2重鎖CDR2配列番号34
GM37変異体3重鎖CDR2配列番号35
に示される重鎖におけるCDR2配列の相違だけGM37と異なる。
(i)本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、および
(ii)免疫グロブリンのCH領域またはCH2およびCH3領域を含むその抗原結合フラグメント
を含む一価抗体であり、ここで、CH領域またはその抗原結合フラグメントは、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがIgG4サブタイプでない場合、CH3領域などのCH領域の他の領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、同一のCH領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のCH領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
−本明細書に定義される抗α−シヌクレイン抗体、および
−薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
1.タウの凝集を阻害するのに使用するための、α−シヌクレイン結合モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
a)0.5〜10nM、例えば1〜5nMまたは1〜2nMの、α−シヌクレインに対する結合親和性(KD);
b)α−シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力;
c)F28−sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力;
d)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα−シヌクレインのレベルを減少させる能力;
e)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルの運動機能を回復させる能力;
f)α−シヌクレインのシーディング(インビトロでの、および/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など)を防止する能力;および/または
g)ヒト脳における切断α−シヌクレインに結合する能力
の1つ以上を示す、先行する項目のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜11に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜11に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜11に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜11に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、いずれかの項目1〜13に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号51のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号52のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号53のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜9および項目16〜17に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
(a)配列番号44のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号46のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号48のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、項目1〜9および項目14〜15に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号94または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号97または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号63または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号64または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目46または47に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号95または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号63または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号103または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目53または54に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号65または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号96または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号63または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号64または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目63または64に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号65または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号98または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号101または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目70または71に記載の使用。
・配列番号65または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号99または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号64または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目77または78に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号65または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号100または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号64または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目84または85に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号65または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号66または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号67または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目1〜9および項目18〜19に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
・配列番号62または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
・配列番号63または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;および
・配列番号102または4つ以下のアミノ酸差、もしくは3つ以下のアミノ酸差、もしくは2つ以下のアミノ酸差、もしくは1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目91または92に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
1.免疫原およびリガンド産生
以下のタンパク質を、図1に示される免疫原として使用するための取得または産生した。マウスを3つの免疫原で免疫した:完全長組み換えヒトα−シヌクレイン原線維;アミノ酸1〜60を含有するヒトα−シヌクレイン組み換えタンパク質(Rpeptide,Bogart,Georgia)およびアミノ酸1〜119を含有するヒトα−シヌクレイン組み換えタンパク質。完全長α−シヌクレインから原線維を作製するために、Rpeptide(Bogart,Georgia)製の凍結乾燥製品(カタログ番号S−1001−2)を使用した。これを、1mg/mlのタンパク質の濃度で、20mMのトリスおよび300mMのNaCl緩衝液に溶解させた。原線維を作製するために、7日間にわたって37℃で、Vortemp 56シェーカーインキュベータ(Labnet International,Edison,NJ,USA)において200rpmで各ウェル中に直径70μmのセラミックビーズを含む96ウェルプレート中で、タンパク質溶液を170μlのアリコートでインキュベートし、原線維の形成の後、チオフラビンTを加え、ウェルの1つにおける蛍光を測定した。アミノ酸1〜60を含有する組み換えα−シヌクレインを、水に溶解させて、1mg/mlの濃度を得た。
抗体HuMab−シヌクレインは、完全にマウスである抗体の発現を防ぐよう、マウス免疫グロブリン(Ig)重鎖およびマウスκ軽鎖をダブルノックアウトされた、HuMAbマウス株HCo17−BALB/cおよびHCo12−BALB/cマウスの免疫化から得られた(ヒトモノクローナル抗体;Medarex Inc.,San Jose,CA,USA)。様々なマウス株を、ヒトIg重鎖およびヒトIg κ軽鎖遺伝子座の挿入によってトランスジェニックにし、これは、ヒトVH(重鎖の可変領域)およびVL(軽鎖の可変領域)遺伝子の数が異なる。
上に定義される十分な抗原特異的抗体価発現を有するHuMAbマウスを殺処分し、腹部大動脈および大静脈に隣接する脾臓およびリンパ節を採取した。マウス骨髄腫細胞株との脾細胞およびリンパ節細胞の融合は、基本的に製造業者の指示にしたがって、CEEF 50 Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences,Glen Burnie,MD,USA)を用いた電気融合によって行った。融合細胞を、HyQ mADCF−Mab(Perbio)中の10%のFetal Clone I Bovine血清(Perbio)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Cambrex)、0.5U/mLのペニシリン、0.5U/mLのストレプトマイシン(Cambrex)、50μMの2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、600ng/mLのインターロイキン6(IL−6)(Strathmann)、1×HAT(Sigma)および0.5mg/mLのカナマイシン(Invitrogen)を含有する融合培地に播種した。10日後、上清を収集し、細胞を、HyQ mADCF−Mab中の10%のFetal Clone I Bovine血清、0.5U/mLのペニシリン、0.5U/mLのストレプトマイシン、600ng/mLのIL−6および1×proHT(Cambrex)を含有する収集培地で洗浄した。ハイブリドーマ培養物の上清を、一次スクリーニングアッセイによってスクリーニングした。上清を、8つの異なるリガンドへの結合について特性評価した。これらは、4つのオルソログ:ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザル、ヒトα−シヌクレインβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレイン(配列番号37〜41)を含み、最後に、それらを、α−シヌクレインの残基120〜140が欠如したヒトα−シヌクレイン誘導体に結合するそれらの能力について試験した。
SMART RACE cDNA Amplificationキット(Clontech)を用いて、全RNAを、0.2〜5×106個のハイブリドーマ細胞から調製し、5'−RACE−相補的DNA(cDNA)を、100ngの全RNAから調製した。VHおよびVLコード領域を、PCRによって増幅させ、ライゲーション非依存クローニング(Aslanidis,C.and P.J.de Jong,Nucleic Acids Res 1990;18(20):6069−74)によって、p33G1fおよびp33κ発現ベクター(ヒトIgG1/κ定常領域コード配列を含む)中で、フレーム内で、直接クローニングした。各抗体について、16個のVLクローンおよび16個のVHクローンをシークエンシングした。適切なオープンリーディングフレーム(ORF)を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選択した。重鎖および軽鎖の全ての組合せのベクターを、293fectinを用いて、FreestyleTM 293−F細胞中で一時的に共発現させた。
抗体を、一過性トランスフェクション剤としてpTT5ベクターおよびPEIpro(National Research Council of Canada)を用いた、HEK293 6E細胞中でのトランスフェクションによって産生した。簡潔に述べると、重鎖および軽鎖を、PEIpro(VWR)を用いてHEK293細胞へとトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後、細胞にTN1(Sigma)を補充した。生存率が50%に近づくまで細胞を増殖させ、抗体の収量をeasy IgG titre(Thermo)によって測定した。培養物の上清を、0.2μmのデッドエンドフィルタ上でろ過し、5mLのタンパク質Aカラム(rProtein A FF,Amersham Bioscience)に充填し、0.1Mのクエン酸−NaOH、pH3で溶離した。溶出液を、2Mのトリス−HCl、pH9で直ちに中和し、12.6mMのNaH2PO4、140mMのNaCl、pH7.4(B.Braun)に対して一晩(O/N)透析した。透析の後、試料を、0.2μmのデッドエンドフィルタ上で滅菌ろ過した。純度をSDS−PAGEによって決定し、濃度を比濁法および280nmでの吸光度によって測定した。精製された抗体を分割し、−80℃で貯蔵した。
α−シヌクレインへの抗体のリアルタイムの結合を、BIAcore(登録商標)3000を用いて測定した。捕捉表面を、CM5チップ(BIAcore(登録商標))の第1のフローセル(Fc1)および第2のフローセル(Fc2)中で、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体(Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare,Cat.no:BR−1008−38)の一部)をアミンカップリングすることによって調製した。マウス抗体を、約500RUのリガンドレベルを達成するのに必要な濃度で、Fc2中で捕捉した。検体(ASynBAP)を30μl/分でFc1〜2中に注入する前に、ベースラインを10分間安定させた。ASynBAPを、それぞれ100〜3200nMおよび25〜3200RUで試験した。それぞれの一連の滴定における最高濃度は、二連で試験した。各サイクルの最後に、表面を10mMのグリシン−HCl、pH1.7(30秒の注入)で再生して、捕捉されたマウス抗体および検体を除去した。HBS−EP(GE Healthcare,Cat.No:BR−1001−88)を、全ての実験において試験緩衝液および試料希釈剤として使用し、アッセイを25℃で行った。全ての試料を、収集する前に4℃に保持した。
α−シヌクレインに対する抗体のエピトープマッピングを、Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC Lelystad,the Netherlands)において一連の重複直鎖ペプチドを用いて行った。合成された20量体ペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、Pepscanに基づくELISAにおいて試験した。α−シヌクレインの全コード配列をカバーする直鎖ペプチドアレイ、ならびに酸化メチオニンまたはニトロシル化チロシンを含む全てのペプチドを、(4℃で一晩)一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、25℃で1時間にわたって1/1000希釈率の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート(SBA,cat.nr.2010−05)とともにインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質2,2'−アジノ−ジ−3−エチルベンゾチアゾリンスルホネート(ABTS)および2μl/mlの3パーセントのH2O2を加えた。1時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子(CCD)−カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。データ処理のために、標準的な96ウェルプレートELISAリーダーと同様に、0〜3000mAUのCCDカメラ範囲からの値を得た。結果を定量化し、Peplabデータベースに保存した。時々、ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を含み、カードを手動で調べて、気泡によって生じる値を0として採点する。それぞれ配列ILEDMPまたはILEDを含有するペプチドへの抗体GM37およびGM285の結合データが、図6に見られる。
抗α−シヌクレイン抗体は、患者に使用するための臨床グレード材料を製造するのに使用される製造条件を模倣する条件下で、哺乳動物細胞培養物中で産生される。このように産生されたタンパク質は、抗体の治療有効性ならびに経時的な抗体の安定性に影響を与える生物物理学的特性の両方に影響を与え得る翻訳後修飾を起こすことが周知である。数十年の研究から確認された経験的知識により、特定の分子の発現性(developability)のリスクを生じることが知られている一連の翻訳後修飾が確認された。これらの翻訳後修飾は、重鎖および軽鎖タンパク質の一次配列中に存在するアミノ酸鎖と相関することが示されている。これらの配列を同定し、それらが治療用抗体の製造可能性および発現性に与える潜在的リスクを決定し得るアルゴリズムが作成された。
α−シヌクレイン原線維(シード)調製の説明
α−シヌクレインの原線維化が、わずかに異なるプロトコルにしたがって行われ得る。
細胞内タウのシーディングのα−シヌクレイン抗体に仲介される阻害の効果を示すために、HEK293細胞ベースのシーディングアッセイを設定した(図8、下側パネルは、アッセイの設備を示す)。HEK293細胞を、24ウェルプレート中で、100,000個の細胞/ウェルで平板培養し、平板培養後24時間でヒトタウ−P301L−FLAGをコードするcDNAで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、24時間にわたって、抗体を用いてまたは用いずに、凝集した原線維化α−シヌクレイン(シード)を細胞に播種し(Lipofectamine2000トランスフェクションを用いて)、続いて、細胞を分割し、再度平板培養し、さらに24時間後に採取した。細胞を溶解させ、PBS中で超音波処理し、1%のtriton X、phos−stopおよび完全ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(Roche)緩衝液を補充した。全細胞溶解物を、Cisbio製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。このアッセイは、FRETにおいてドナー(Tb3+共役)およびアクセプタ(d2共役)抗体の両方に同じ抗体を用いた、時間分解蛍光に基づいている。10μlの試料を、10μlの抗体混合物と混合し、20時間インキュベートした。プレートを、Pherastarプレートリーダーで読み取って、時間分解蛍光(励起光の切り替え後に測定/積分されるFRET信号)を評価した。このアッセイは、AD患者に由来するヒト脳剖検材料、タウトランスジェニックマウス(rTg4510)に由来する脳材料、および高い特異性および感受性を有する播種されたHEK293細胞の両方において、凝集タウを測定する。シードとして原線維化タウタンパク質の様々な調製物を用いて、このタイプのHEK293細胞ベースのシーディングアッセイが、タウ抗体の臨床候補を選択するために効率的に使用された。結果が図8の上側パネルに示される。α−シヌクレインシード(300ngの粗シード)単独のトランスフェクションは、約100の相対的タウ凝集(α−Syn、3つ目のバー)をもたらし、これは、α−シヌクレインが、内因性タウのクロスシーディングを強力に誘発することを示す。シーディング効果は、B12(対照抗体)および以下のタウ抗体(mC10−2、mD1.2、LU0041Gと示されるタウ結合抗体およびヒト化(h)C10−2)との共トランスフェクションによって影響されなかった。しかしながら、α−シヌクレインHLD1、GM37(37)、GM63(63)および9E4に対する4つの異なる抗体とともに、細胞を共インキュベートすることによって、タウ凝集の部分的な改善があった。例えば、抗体9E4は、相対的凝集の増加を(非処理の対照における100と比較して)20にする。全ての抗体を、粗シード(400ulの総体積中、2.4ugの抗体および300ngのシード)とともに共トランスフェクトした。
A.免疫化/ハイブリドーマスクリーニング
α−シヌクレインに対するモノクローナル抗体を、例えば反応性アルデヒドで架橋された様々なシヌクレイン凝集体でマウスを免疫化することによって生成した。第1の抗原を、Rpeptide(4241 Mars Hill Road,Bogart,GA 30622,USA)製の組み換え凍結乾燥α−シヌクレインで作製した。それは、タンパク質をPBSに溶解させて、70uMのα−シヌクレイン(1mg/ml)の溶液を得ることによって作製した。溶液を37℃で18時間インキュベートし、100ulのアリコートで凍結させた。第2の抗原を、組み換えα−シヌクレイン(Rpeptide)から、それを70マイクロMで、20mMのトリス(pH=7.4)、0.15MのNaClに溶解させることによって、同様に作製した。反応性アルデヒドONE(4−オキソ−2−ノネナール、Cayman Chemicals(Ann Arbor,MI)製のCat # 10185)を、20:1のモル比で加えて、α−シヌクレインのオリゴマーを共有結合的に架橋した。溶液を、(振とうせずに)37℃で18時間インキュベートした。未反応のONEを、Vivaspin500スピンカラム(10kDaのMWCO)によって除去し、試料を、20mMのトリス、pH7.4、0.15MのNaClに対して透析し、アリコートで凍結させた。第3の抗原は、凍結乾燥粉末(Rpeptide製の原材料)として送られた、組み換えα−シヌクレインフラグメントアミノ酸1〜60(Rpeptide)であった。簡潔に述べると、3匹の雌マウス(4〜7週齢)を免疫し、3回まで追加免疫した。尾採血を行い、抗原に対する酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって抗シヌクレイン抗体についてスクリーニングした。力価が、ELISAにおいてベースラインの3倍のOD読み取りを達成することが血清希釈によって定義される。対照に対して1:50,000より高い力価を示すマウスを、融合のために選択した。採取された脾細胞を、SP2/0マウス骨髄腫細胞に融合し、希釈し、単細胞融合から平板培養した。上清を、融合の14日後に採取し、抗体産生についてスクリーニングした。シヌクレインELISAを用いて、50の陽性クローンを、約1000ウェルから回収した。Clonotyping System/APキットを、免疫グロブリンアイソタイピング(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)に使用した。50の抗α−シヌクレイン上清を、以下のSKMEL5細胞アッセイにおいてatto標識α−シヌクレイン凝集体の蓄積の減少についてスクリーニングした。市販の抗体LB509が、陽性対照として含まれていた。50の抗血清のうち、4つのみの抗血清が、α−シヌクレインの細胞内蓄積を減少させたことが分かり、これらの抗体を、クローニングのために取った。次に、これらの4つの抗体を、アッセイにおいて用量反応で試験した。最も高い効果を有する抗体、2E6を、PD関連モデルにおいてさらなる特性評価のために選択した。
組み換えα−シヌクレインを、rPeptide(カタログ番号S−1001−2)から注文し、製造業者の勧告にしたがって、ダブル蒸留水に溶解させて、20mMのトリス−HCL/100mMのNaCl、pH=7.4中の1mg/mlの溶液を得た。Sigma(#38371)製のAtto488 Protein Labeling Kitを用いることによって、α−シヌクレインをAtto488で蛍光標識した。30%のAtto488で標識されたα−シヌクレインと70%の非標識α−シヌクレインとの混合物を作製し、次に、この混合物を、2日間にわたって撹拌しながら(300rpm)37℃でインキュベートし、次に、3日間停止し、次に、1日撹拌し、次に、1日停止し、次に、4日間撹拌した。その後、原線維を採取し、使用するまで−20℃に保持した。原線維を細胞アッセイに使用する場合、それらを、添加の直前に、ホーンプローブ超音波装置を用いて、5.50%のサイクルを設定して、5分で常に超音波処理した。
ヒト黒色腫細胞株SK−mel5(ATCC、HTB−70)を、ATCCガイドラインにしたがって増殖させた。細胞を、Falcon BD 96ウェルプレート中で、ウェル当たり3000個の細胞の密度で平板培養し、一晩、付着させた。Atto488で標識されたα−シヌクレイン原線維を、m2E6抗体(0.01mg/ml)およびα−シヌクレインペプチド113〜125または126〜140(0.01mg/ml)と一緒に、細胞(0.01mg/ml)に加えた。24時間のインキュベーションの後、細胞を、PBS中で2回洗浄し、4%のパラホルムアルデヒドによって固定した。次に、細胞を、Hoechstで染色し、Cellomics ArrayScanにおいて読み取った。核を、1つのチャネル中で検出し、有効なオブジェクトの数を定義した。Atto488で標識された原線維を、核を取り囲む、したがって細胞の細胞質を表す、予め定義された環で形成された領域において別のチャネル中で検出した。α−シヌクレインスポットを含む細胞のパーセントを定量した。結果は、原線維が与えられない細胞において、スポット含有細胞のごく少ないバックグラウンドがあったに過ぎないことを示す(バックグラウンドは、おそらく自己蛍光によるものであった)(図7C)。原線維が与えられた細胞のみにおいて、細胞の75%が、蓄積された細胞内スポットを有していた。原線維およびm2E6抗体とともに共インキュベートされた細胞において、約30%のみのスポット陽性細胞があった。細胞を、原線維、m2E6および126〜140ペプチドとともに共インキュベートしたとき、約60%の陽性細胞があり、したがって、このペプチドは、m2E6の効果を有意に阻害した。113〜120ペプチドと、原線維および2E6との共インキュベーションは、m2E6の効果を変化させなかった。ペプチド113〜120または126〜140のいずれかと一緒の原線維のインキュベーションは、細胞内の原線維の蓄積に影響を与えなかった。したがって、m2E6は、溶液中でα−シヌクレイン原線維に結合し、細胞内のそれらの蓄積を阻害する。
抗原特異的ELISAアッセイを用いて、抗体陽性融合を結合について分析した。Corningの96ウェル高結合プレートを、100ngの凝集シヌクレインで被覆した。ウェルを、室温(RT)で1時間(hr)にわたってPBS中5%のミルクを用いてブロックした。プレートを、PBS+1%のTween 20を用いて3回洗浄した。100マイクロリットルのハイブリドーマ上清を各ウェルに加え、プレートを室温でインキュベートした。その後、HRP結合ヤギ抗マウスIgG(重鎖および軽鎖特異的またはγ鎖特異的)二次抗体を各ウェルに加えて、結合された抗シヌクレイン抗体の存在を検出した。定量基質のために、1つの成分TMBを加え、プレートをOD620で測定した。
4つの抗αシヌクレイン陽性ハイブリドーマを選択し、mRNAを細胞ペレットから抽出した。各mRNA prepからのcDNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いて、逆転写酵素によって生成した。その後、可変領域プライマーを用いて、PCR反応を行って、HCおよびLC遺伝子のVHおよびVL領域の両方を増幅した。増幅されたDNAを、アガロースゲル上に分離させ、VHおよびVL産物の両方を単離し、ゲルから精製し、pCR2.1(Invitrogen)へとクローン化し、TOP10細胞に形質転換した。最小で6つの陽性コロニーを選択し、DNAシーケンシングによって分析して、VHおよびVL領域の配列を決定した。
モノクローナル抗体の発現
ハイブリドーマクローンの培養物を増殖させ、タンパク質Gクロマトグラフィーを用いて、マウスモノクローナル抗体を、培養された上清から精製した。HEK293細胞への重鎖および軽鎖遺伝子の一過性共トランスフェクション、培養物の増殖、上清の採取およびタンパク質クロマトグラフィーによる精製を用いて、組み換えマウス、ヒトおよびキメラ抗体を産生した。グラム量の抗体が繰り返し必要とされる場合、安定した細胞株をCHO細胞中で生成した。これらの安定した細胞株を、必要に応じて増殖させることができ、抗体精製を前述のとおりに行った。
組み換えモノクローナル抗体を、重鎖および軽鎖遺伝子(Geneart A/G)の遺伝子合成によって生成した。その後、合成された遺伝子を、哺乳動物細胞培養物中での発現のために標準的な発現ベクター(例えばpcDNA3.1)へとクローン化した。
m2E6のヒト化を、構造ベースのCDRグラフトによって行った。2E6 VLおよびVHドメインのアミノ酸配列を、PDBおよびIMGTデータベース中で見られる全てのヒト抗体VLおよびVHフレームワークアミノ酸配列に対する相同性についてスクリーニングした。構造モデリングを、PDBデータベースからの20SL抗体を用いて、m2E6 Fv領域について行った。20SLアミノ酸配列は、2E6 VHおよびVLドメインのそれぞれに対して82.7%および83.2%相同である。重要なことには、20SLの構造を、2.1Åの解像度で決定した。20SLを用いた2E6ヒト化フレームワークの構造アライメントは、立体障害または立体構造力(steric force)によって折り畳みまたは局所構造に潜在的に影響を与え得る、フレームワーク領域中の重要な残基の決定を可能にした。ヒト化抗体の理論的な抗体構造モデリングを用いて、結合特異性および親和性を維持するために、元のマウスアミノ酸として特異的な残基を2E6のヒト化形態に維持することの潜在的な重要性について示唆した。この構造モデリングを用いて、ヒト化2E6の活性を最適化した。
1.L3−11軽鎖+9C12重鎖
2.L3−11軽鎖+8D9重鎖
3.7A10軽鎖+9C12重鎖
4.L3−11軽鎖+A
5.7A10軽鎖+A
9.B+9C12重鎖
10.C+9C12重鎖
11.D+9C12重鎖
12.B+8D9重鎖
13.C+8D9重鎖
14.D+8D9重鎖
15.B+重鎖
16.C+重鎖
17.D+重鎖
抗体を、培養された上清から精製し、その後、CM5チップ上に固定された抗ヒトIgG Abを用いて捕捉されたIgGを用いて、SPR(Biacore 3000)によって、シヌクレインへの結合について分析した(表7)。
AD患者に由来する前頭葉を、氷冷した滅菌PBS中で均質化し、ナイフホモジナイザーによって均質化し、Branson sonifier(5パルス0.9秒、アウトプット2)を用いて超音波処理し、4℃で5分間、3000gで清浄化した。上清を収集し、タンパク質濃度をBCAによって決定した。α−シヌクレイン凝集体のレベルを決定するのに使用される試料は、2.1〜4.8ug/μlのタンパク質を含有していた。α−シヌクレイン凝集体を、Cisbio製の市販のα−シヌクレイン凝集アッセイ(カタログ番号6FASYPEG)を用いて測定した。レビー小体のマーカーである、セリン129においてリン酸化されたα−シヌクレイン(シヌクレイン−p129)を、Cisbio製の近日発売予定の市販のシヌクレイン−p129凝集アッセイを用いて測定した。各キットからのそれぞれの緩衝液を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって、2つのアッセイを行った。簡潔に述べると、全ての10%のホモジネートを、溶解緩衝液のいずれかの中で1:12および1:72で連続希釈し、10μlの試料を、10μlのそれぞれの抗体混合物(5μlのTb−クリプテート抗体および5μlのd2コンジュゲート)と混合し、20時間インキュベートした。時間分解FRETを、Pherastarプレートリーダーにおいて測定し、信号対雑音比を計算し、各試料についてタンパク質に対して正規化した。
Claims (15)
- タウの凝集を阻害するのに使用するための、α−シヌクレイン結合モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、凝集した可溶性形態のα−シヌクレインに結合する、請求項1に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- タウ凝集の阻害が、インビボまたはインビトロで行われる、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記α−シヌクレイン抗体が、アルツハイマー病の患者に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記患者が、レビー小体変異型アルツハイマー病または複合されたパーキンソン病およびアルツハイマー病に罹患していない、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記α−シヌクレイン抗体が、嗜銀顆粒病(AGD)、精神病、特に、ADに起因する精神病またはADの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ(PSP)、前頭側頭型認知症(FTDまたはその変異型)、TBI(外傷性脳損傷、急性または慢性)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、ピック病、原発性加齢性タウオパチー(PART)、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病(グアムパーキンソン認知症複合)、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症を含む群から選択されるタウオパチーの患者に投与される。より典型的に、前記タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病(AGD)、精神病、特に、ADに起因する精神病またはADの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ(PSP)、前頭側頭型認知症(FTDまたはその変異型)、TBI(外傷性脳損傷、急性または慢性)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、およびピック病からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記α−シヌクレイン抗体が、α−シヌクレインのC末端部分に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、ヒトα−シヌクレインのC末端アミノ酸110〜140内のエピトープに結合する、請求項7に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記エピトープが、ヒトα−シヌクレイン(配列番号10)のアミノ酸112〜117、112〜115、118〜126、126〜138または136〜140内にある、請求項7または8に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体、またはそのフラグメントが、
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体、またはそのフラグメントが、
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体、またはそのフラグメントが、
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体、またはそのフラグメントが、
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体、またはそのフラグメントが、
(a)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
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TWI760305B (zh) | 抗分揀蛋白抗體、包含其之組成物與套組及其用途 |
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