CN108623682A - 针对tau的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对TAU的抗体。本发明涉及针对tau的抗体及其使用方法。

Description

针对TAU的抗体
本申请是国际申请日为2013年7月3日的国际申请PCT/US2013/049333进入中国、申请号为201380045706.3的题为“针对TAU的抗体”的发明专利申请的分案申请。
政府支持
本发明是在National Institute of Neurological Disorders and Stroke颁发的1R01NS071835下由政府支持做出的。政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本发明涉及针对tau的抗体及其使用方法。
背景技术
微管结合蛋白tau的聚集与若干神经变性病症，包括阿尔茨海默氏病（AD）和额颞叶痴呆相关。在AD中，病理性tau聚集可能沿着现有的神经网络在大脑中渐进性地扩散。AD是痴呆的最常见原因并且是逐渐增多的公共健康问题。目前估计其在美国影响了500万人口，预计到2050年会增加至1300万。阿尔茨海默氏病导致记忆、认知功能丧失以及独立性的最终丧失。其给患者和家庭带来了严重的个人和经济负担。因为在人群中AD和与tau聚集相关的其他神经变性疾病的严重性及日益盛行，急需开发更好的治疗和检测方法。
参考彩图
本申请文件含有至少一个彩色照片。专利局根据需求和必要费用的付款会提供具有彩色照片的该专利申请公开的拷贝。
附图说明
图1描述了N-末端（A）和C-末端(B)人tau (htau)的氨基酸序列。
图2 描述了显示HJ8.1对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图3 描述了显示HJ8.2对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图4 描述了显示HJ8.3对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图5 描述了显示HJ8.4对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图6 描述了显示HJ8.5对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图7 描述了显示HJ8.7对人Tau (A)和小鼠Tau (B)的KD的图。
图8 描述了显示HJ8.8对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图9 描述了显示HJ9.1对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图10 描述了显示HJ9.2对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图11 描述了显示HJ9.3对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图12 描述了显示HJ9.4对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图13 描述了显示HJ9.5对人Tau (A)和小鼠Tau(B)的KD的图。
图14 描述了显示全长tau在野生型和P301S tg小鼠的ISF中存在的免疫印迹。(A)通过使用抗tau抗体BT-2或抗肌动蛋白抗体的免疫印迹分析来自Tau KO (KO)、野生型(WT)和P301S tg (P301S tg)小鼠的海马裂解物。每孔装载13微克蛋白。对应于内源鼠类tau的四条条带和对应于人tau的一条条带分别表示为白色圆圈和黑色圆圈。还存在代表P301Stg海马裂解物中人tau的形式的39 kDa条带。这可能代表了tau降解产物。通过抗tau单克隆抗体 HJ9.3 (B)或HJ8.1 (C)免疫沉淀来自野生型(WT)和P301S tg (P301S tg)小鼠的ISFtau并通过免疫印迹进行分析。通过生物素化的BT-2抗体显现条带。灰色和黑色箭头分别表示内源鼠类tau和人tau。
图15 (A) 阐明了本研究中所用的不同突变体tau构建体的图示，并且(B-D)描述了显示Tau RD蛋白在转染的HEK293细胞中形成纤维状聚集体的图像。(A)根据实验设计，突变体tau的每种形式在羧基末端融合到蓝绿色或黄色荧光蛋白(CFP或YFP)或血凝素(HA)标签上。(B) 在来自用多种形式RD瞬时转染的HEK293细胞的SDS不溶性材料上进行的原子力显微镜(AFM)揭示了RD(ΔK)-HA和RD(LM)-HA产生了明显的纤维状种类。在聚集抗性的RD(PP)-HA中没有检测到纤丝。(n=2), 标尺, 1μm。(C) 利用X-34（淀粉状蛋白特异性染料）染色用多种形式的RD-YFP和单独YFP瞬时转染的HEK293细胞。通过共聚焦显微镜观察的RD(wt)-YFP、RD(ΔK)-YFP和RD(LM)-YFP形成的内含物也对X-34染色阳性。单独表达YFP或RD(PP)-YFP后没有检测到X-34阳性细胞。箭头表示用X-34染色的内含物。(n=3) (D) 将未转染的细胞(NT)和多种形式的RD-YFP/CFP 转染到HEK293细胞中，随后进行Triton/SDS提取并使用针对RD区域的抗体进行蛋白质印迹。检测到单体和高阶分子量种类。(S=可溶性蛋白，而P=沉淀不溶性蛋白)。这被重复了三次，具有相同的结果。
图16 显示了通过FRET检测HEK293细胞中的Tau RD聚集体。为了通过荧光共振能量转移(FRET)定量细胞内RD蛋白聚集，将融合YFP和CFP的多种RD突变体(wt、ΔK、PP、LM)共转染到HEK293细胞中。(A)使利用RD(LM)-CFP/YFP共转染的HEK293细胞成像并使用FRET受体光漂白显微镜定量细胞内聚集体的形成。受体光漂白之前(前)和之后(后)的供体信号证实了RD(LM)-CFP/ YFP 内含物产生了18.2%± 0.058 SD (n=6)的平均FRET效率。上图和下图分别描述了光漂白之前和之后的受体和供体通道。右上图是计算的FRET效率的代表性热图。柱状图的标尺描述了在逐个像素基础上计算的FRET效率。Tau RD聚集体的FRET效率在该细胞中是~34%。(B).使用FPR，确定了来自多种构建体的相对FRET。从RD(PP)-CFP/YFP中没有观察到显著的FRET。然而，RD(ΔK)-CFP/YFP和RD(LM)-CFP/YFP各自产生了强FRET信号(n=3)。(C).将表达RD(ΔK)-CFP/YFP的HEK293细胞暴露于多种浓度的RD(wt)-HA 纤丝(0.01、0.03、0.1和0.3 μM的单体等同物)中9小时。细胞外RD(wt)-HA 纤丝剂量依赖性地诱导RD(ΔK)-CFP/YFP的聚集(n=3)。(*表示p-值<0.05, **表示p-值<0.001,误差棒代表SEM)。
图17 描述了显示Tau-RD聚集体在细胞之间转移并诱导进一步聚集的图像和图。(A).利用RD(ΔK)-YFP转染的HEK293细胞与相等数量的表达RD(LM)-HA的细胞共培养48小时。利用4%的多聚甲醛固定细胞并进行免疫染色/X-34染色。多个细胞显示RD(LM)-HA和RD(ΔK)-YFP在内含物内共定位。这些内含物也对X-34染色阳性，表明β折叠结构（实线箭头）。此外，对X-34染色阳性的一些RD(LM)-HA内含物不与RD(ΔK)- YFP内含物共定位（开放箭头）。(B).将两个细胞群体（一个表达RD(ΔK)-CFP/YFP，另一个表达RD(LM)-HA）共培养48小时。RD(PP)-HA或未转染的细胞NT用作对照。通过与RD(LM)-HA，而不与RD(PP)-HA或模拟转染的细胞共培养增加FRET (n=3)。(C).为了测试通过tau聚集体诱导的细胞死亡作为tau释放机制，HEK293细胞用RD-HA (PP、ΔK或LM)转染48小时，或被模拟转染。在37℃下利用多种浓度的十字孢碱(1、2、4、20 μM)处理模拟转染的细胞30分钟以诱导细胞死亡。然后将细胞暴露于5 μg/ml的碘化丙啶中并通过平板读取器确定荧光。在多个转染群体中没有观察到细胞死亡的证据。(**表示p-值<0.001，误差棒代表SEM)。
图18 描述了显示RD聚集体在细胞之间传播错误折叠的图像和图。利用多个RD-CFP和RD-HA构建体共转染HEK293细胞。15小时后，这些细胞与表达RD(ΔK)-YFP或RD(PP)-YFP的细胞共培养48小时 (A) 进行FRET显微镜检查术以确定共聚集是否通过直接的蛋白接触发生。在光漂白YFP之前和之后测量CFP信号。RD(LM)-CFP和RD(LM)-YFP聚集体具有14.2% ± 0.053 SD (n=11)的平均FRET效率，表明直接接触的RD(LM)-CFP和RD(LM)-YFP。上图和下图分别描述了光漂白之前(Pre)和之后(Post)的受体和供体通道。在右上部显示了计算的FRET效率的代表性热图。柱状图描述了在逐个像素基础上计算的FRET效率。TauRD聚集体的FRET效率在该细胞中是~25%。负值来源于未配对的CFP。(B) 当表达RD(ΔK)-CFP/RD-HA的细胞与表达RD(ΔK)-YFP的细胞共培养时，观察到FRET 信号。当通过共表达tau的易于聚集形式（ΔK或LM突变体）诱导RD(ΔK)-CFP聚集时，该信号增加。当RD-CFP或RD-YFP含有阻断 β-折叠形成的PP突变时，没有注意到显著的信号(n=3)。(C)为了测试错误折叠的扩增，将单独表达CFP或RD(LM)-CFP的细胞群体预先暴露于表达具有PP、ΔK或LM突变的RD-HA的细胞中48小时，以促进错误折叠至不同程度。然后将这些共培养的群体分开并与表达RD(ΔK)-YFP的细胞共培养48小时，以确定通过细胞-细胞转移和FRET报道的聚集程度。RD(LM)-HA细胞先前暴露于RD(ΔK)-CFP细胞群体相对于先前暴露于RD(PP)-HA增加了FRET信号2.6倍。在第二个细胞群体中插入表达纯CFP的细胞完全阻断先前暴露于易于聚集的RD-HA突变体中的影响(n=3)。(* 表示p-值<0.05, **表示p-值 <0.001，误差棒代表SEM)。
图19 描述了显示tau聚集体通过细胞外培养基传播的图和免疫印迹。(A) 利用RD(LM)-HA转染的HEK293细胞与相等数量的RD(ΔK)-CFP/YFP细胞在FRET分析之前共培养48小时。增加细胞培养基的体积减少聚集体跨细胞运动的效率。(B) 将条件性培养基从表达RD(LM)-HA 的细胞转移到表达RD(ΔK)-CFP/YFP的细胞中足以诱导聚集60%。(C) 向培养基中加入的HJ9.3抗体减少了FRET，与干扰聚集传播一致。(D) 非特异性IgG对传播没有影响。(E) HJ9.3对同一个细胞内共表达的RD(ΔK)-CFP/YFP的细胞内聚集没有影响。(F) HJ9.3阻断RD(LM)-HA在共培养细胞中诱导RD(ΔK)-YFP 的影响，如通过去污剂分馏和蛋白质印迹所确定。(T=总蛋白，S=可溶性蛋白，和P=沉淀不溶性蛋白，(G) 三次独立的蛋白质印迹的定量分析揭示了在暴露于HJ9.3后，相对于总部分，沉淀部分~60%的降低。(H) 共培养表达RD(LM)-YFP和mCherry的细胞并通过流式细胞术进行分析。HJ9.3将双阳性细胞的百分比从2.07%降低到1.31%。仅在细胞计量之前混合的细胞是背景对照(*表示p-值<0.05，** 表示p-值<0.001，误差棒代表SEM)。
图20 描述了利用RD(ΔK)–YFP转染的(上图)或模拟转染的(下图)HEK293细胞的图像。向培养基中加入HJ9.3，48小时时期。实验结束时，将细胞固定、透化并利用抗小鼠二级抗体（标记有Alexa 546）染色。共聚焦显微镜用于分析HJ9.3/tau复合体的定位。上图显示当表达RDΔ(K)-YFP时鉴定到许多复合体，但在其缺少时却鉴定不到（下图）。正交分析（右图）证明大多数复合体存在于细胞表面上，尽管观察到了偶然的细胞内复合体。
图21 描述了显示Tau纤丝介导细胞-细胞传播的图像和图。(A)从与HJ9.3或对照IgG抗体(1:1000)共培养0小时或48小时的转染细胞群体中收集条件性培养基，随后进行免疫沉淀和蛋白质印迹。HJ9.3从细胞培养基中特异性捕获tau RD种类，而IgG却不能。高阶聚集的种类在表达RD(ΔK)- YFP或RD(LM)-YFP而非RD(PP)-YFP时存在。(B)三次独立的蛋白质印迹的定量分析显示在48小时温育后tau的~10倍增加。(C)细胞多次暴露于HJ9.3中。(D)暴露于HJ9.3中48小时的来自培养基的纯化的抗体/抗原复合体放置在AFM芯片上用于成像。观察到表达RD(ΔK)-HA和RD(LM)-HA的细胞的培养基中的明显纤丝种类，而RD(PP)-HA仅产生无定形聚集体。 比例尺，1μm。
图22 描述了显示针对重组人tau的HJ8.5和HJ9.4活性的图示和图。(A)描述了阐明RD (LM)-CFP 和RD(ΔK280)-YFP细胞在存在或缺少不同单克隆全长tau抗体的情况下的共培养的图示。(B)描述了显示HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4能够阻断tau传播的图。(C)描述了显示HJ8.5、HJ9.3 和HJ9.4能够在ELISA测定中检测RD-tau纤丝的图。
图23 描述了阐明用于(A) 脑室内注射和(B)在每只小鼠的侧脑室中移植渗透泵的实验设计的图示。(C)显示通过甲酚紫染色验证插管放置的图像。
图24 描述了在P301S tg小鼠中6周输注后通过(A)考马斯亮蓝染色和(B)使用在6周输注之前和之后从泵中获取的抗体针对重组最长人tau同工型hTau40的免疫印迹的抗tau抗体的图像。
图25 描述了显示在用于总tau的HJ8.7-BT2B ELISA中缺少输注的tau抗体干扰的图。所指示浓度的抗体与重组人tau蛋白在应用于ELISA之前预先温育。
图26 描述了利用媒介物/PBS（上图）或不同的抗tau单克隆抗体(如下图中标记的HJ8.5、HJ9.3)处理的9个月龄大小的经处理的P301S tg小鼠的梨状皮质的冠状切片的图像。利用识别tau的异常磷酸化形式的生物素化的AT8抗体染色切片。
图27 描述了显示在(A)海马体CA2和CA3，(B)杏仁核，(C)梨状皮质，和(D)内嗅皮质中神经原纤维缠结的AT8染色覆盖的区域百分比的图。
图28 显示HJ9.3抗体通过ELISA检测tau纤丝和RD-tau单体的图。将不同浓度的RD-wt tau单体和纤丝包被在ELISA平板上。HJ9.3用作一级抗体。对于检测，使用抗小鼠HRP连接的抗体。
图29 描述了阐明tau聚集通过在细胞培养基内转移纤丝而发生跨细胞传播的图示。供体细胞中的蛋白聚集体逃出细胞(A)，进入受体细胞(B)，并直接接触天然折叠的蛋白(C)，以扩增错误折叠状态(D)。这种细胞-细胞运动由直接释放到培养基中的纤丝介导。这些纤丝可以被干扰细胞-细胞传播的抗tau抗体（HJ9.3）俘获在细胞外空间内(E)。
图30. 通过表面等离子共振(SPR)和免疫印迹对抗tau抗体的表征。图描述这样的SPR传感图，其显示了每一个抗tau抗体对固定的重组人tau（最长的同工型hTau40, 441aa）和固定的小鼠tau（最长的同工型mTau40, 432 aa）的结合。每一个抗体以多种浓度(0.11、0.23、0.46、0.90、1.8、3.7、7.5 µg/ml)运行并且以相应的颜色显示图表。(A) 结合固定的人tau和固定的小鼠tau的HJ9.3抗体的SPR传感图(B)。(C) 结合固定的人tau和固定的小鼠tau的HJ9.4抗体的SPR传感图(D)。结合固定的(E)人和(F)小鼠tau的HJ8.5抗体的SPR传感图。(G)通过免疫印迹，使用所指示的抗tau抗体分析3个月龄大小的tau敲除(KO)、3个月龄大小的野生型(WT)、3个月龄大小的P301S (3mo)和9个月龄大小的P301S (9mo)小鼠的RAB可溶性部分。
图31. 抗tau抗体对固定的人tau纤丝的相互作用的SPR传感图。以多种浓度对固定的人tau纤丝运行HJ9.3 (A)、HJ9.4 (B)和HJ8.5 (C)抗tau抗体的SPR传感图。
图32. 不同测定中对抗tau抗体的表征。利用生物素化的HJ8.5抗体染色来自3个月龄大小的tau敲除(KO)、3个月龄大小的野生型(WT)、3个月龄大小的P301S (3mo)、12个月龄大小的P301S (12mo)小鼠的阿尔茨海默氏病(AD)组织的梨状皮质区域和额皮质的区域的脑切片的免疫染色。12个月龄大小的P301S显微图像中的插入显示除弥散性神经毡染色外的细胞体染色。黑色箭头指示放大的区域。人AD脑皮质显微图像中的插入显示高倍放大的神经原纤维缠结(NFT)染色。黑色箭头表示放大的区域。比例尺在具有tau KO的图像中是250 µm，其为相同的放大图。比例尺在P301S 12mo和AD的插入中是50 µm。
图33. 如通过FRET测定检测的tau抗体阻断P301S tau聚集体的吸收和接种活性(seeding activity)。表达RD(ΔK280)-CFP/YFP的HEK293细胞暴露于1xTBS脑裂解物的2.5μg总蛋白中24小时。(A) 与来自敲除(KO)小鼠(n=7)、野生型(WT)小鼠(n=6)或年幼的3个月龄大小的P301S小鼠(n=2)的裂解物相比，从12个月龄大小的P301S小鼠收集的脑裂解物(n=5)诱导高得多的接种活性(****p<0.0001)。 (B)利用RD (ΔK280)-CFP和RD (ΔK280)-YFP共转染HEK293细胞。18小时后，向细胞中加入与抗tau抗体(HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4)或对照抗体(HJ3.4，抗Aβ抗体)温育或不与其温育的预先温育的P301S脑裂解物。与P301S脑裂解物温育的所有tau抗体明显阻断接种活性。通过单因素ANOVA，随后通过用于多重比较的Dunnett’s post hoc检验使用GraphPad Prism 5.0软件确定统计学显著性(***p>0.001)。(C)利用固定量的P301S脑裂解物以多种浓度(0.125 μg/ml、0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml和2 μg/ml)对这些抗体进行滴定。24小时后，进行FRET分析。在我们使用的所有tau抗体中，HJ8.5在阻断P301S脑裂解物的吸收和接种活性中最有效。通过双因素ANOVA，随后通过用于多重比较的Bonferroni post hoc检验确定统计学显著性(** p < 0.0001, * p <0.01, 值代表均值± SEM)。
图34. 没有检测到结合P301S Tau聚集体的tau抗体的细胞吸收。向HEK293细胞中加入P301S脑裂解物3小时。为了检测tau，使用所有3个不同的抗tau或对照(HJ3.4，Aβ抗体)抗体，随后进行Alexa-fluor546 抗小鼠IgG染色。此外，P301S脑裂解物与3个不同的抗tau抗体和HJ3.4抗体预先温育和不预先温育，然后加入到HEK293细胞中，固定并透化。Alexa-fluor546抗小鼠IgG用于鉴定内化的抗体。4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，以蓝色显示)用于核染色。
图35. ICV输注抗体的实验概括和通过不同处理方法的抗体效力。(A)通过脑室内注射将抗体或媒介物(PBS)输注到脑的左侧脑室内的实验设计。(B)代表性甲酚紫染色冠状切片的脑区域以验证外科移植的探针放置到左侧脑室内。在该研究中，我们包括探针正确放置到左侧脑室中的小鼠。
图36. 抗tau抗体强烈降低P301S小鼠脑中的AT8染色。利用生物素化的AT8抗体在包括梨状皮质和杏仁核的区域中染色PBS (A)、HJ3.4 抗体(B)、HJ8.5抗体(C)、HJ9.3抗体(D)和HJ9.4抗体(E)处理的9个月龄大小的P301S小鼠的代表性冠状切片。比例尺是250 µm。A-E中的插入显示了生物素化的AT8抗体染色磷酸化tau的高倍放大，比例尺是50 µm。
图37. 某些抗tau抗体强烈降低P301S小鼠脑中的AT8染色。在9个月龄大小的P301S小鼠中利用抗tau抗体HJ8.5 (N=13)、HJ9.3 (N=15)、HJ9.4 (N=13)、抗Aβ抗体、HJ3.4(N=8)或PBS (N=16)处理的小鼠中梨状皮质(A)、内嗅皮质(B)、杏仁核(C)和海马体CA1区域(D)中通过生物素化的AT8染色异常磷酸化的tau覆盖的区域的百分比。与PBS或HJ3.4抗体处理的小鼠相比，在抗tau抗体处理的小鼠中若干不同脑区域中的AT8染色减少。HJ8.5具有最大的影响。** p < 0.01，* p < 0.05，值代表均值± SEM。
图38. 在雄性和雌性P301S小鼠中生物素化的AT8抗体染色的定量。在雄性(A)和雌性P301S小鼠 (B)中，在抗tau抗体(HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4)、对照抗体(HJ3.4)加PBS处理的小鼠中梨状皮质(A和E)、内嗅皮质 (B和F)、杏仁核(C和G) 和海马体CA1区域(D和H)中通过生物素化的AT8染色异常磷酸化的tau覆盖的区域的百分比。
图39. 一些抗tau抗体强烈地降低P301S小鼠脑中神经原纤维缠结的ThioS染色。(A)在利用PBS、HJ3.4、HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4抗体处理3个月的9个月龄大小的P301S小鼠的梨状皮质中神经原纤维缠结的ThioS染色的代表性图。与PBS或HJ3.4抗体处理的小鼠相比，在HJ8.5抗体处理的小鼠中神经原纤维缠结的ThioS染色减少。比例尺代表100 µm。(B)在所有抗tau抗体和对照处理的小鼠中通过从1（没有染色）到5（最强染色）的评分半定量评估ThioS染色。与PBS或HJ3.4抗体处理的小鼠相比，HJ8.5抗体处理的小鼠具有显著更少的ThioS染色。* p < 0.05，** p < 0.01。
图40. 磷酸tau染色和活化的小胶质染色之间的相关性。(A) HJ8.5 (N=6)、HJ9.3(N=6)和PBS处理的9个月龄大小的P301S小鼠 (N=6/组)中磷酸tau的生物素化的AT8染色显示与PHF1（另一个磷酸tau抗体）染色的强相关性。(B)在所有组中(N=6/组)，在活化的小胶质的CD68染色和磷酸tau的生物素化的AT8染色之间观察到强相关性。(C)利用多克隆小鼠抗tau抗体(Abcam)分析代表性70% FA部分样品(N=4)的免疫印迹。
图41. 活化的小胶质的CD68染色。在P301S小鼠中评估小鼠的小胶质活化。在利用PBS (A)、HJ3.4抗体(B)、HJ8.5抗体(C)、HJ9.3抗体(D)和HJ9.4抗体(E)处理的9个月龄大小的P301S小鼠的梨状皮质中活化的小胶质的CD68染色的代表性图。
图42. 在P301S小鼠中抗体HJ8.5和HJ9.3减少不可溶性tau水平。通过RAB (A)、RIPA (B)和70% FA (C)连续提取所有处理小鼠[PBS (N=16)、HJ3.4抗体(N=8) HJ8.5 (N=13)、HJ9.3 (N=15), HJ9.4 (N=13)]的皮质并通过ELISA定量其tau水平。组之间RAB和RIPA部分中可溶性tau水平没有统计学差异。然而，与PBS或HJ3.4抗体处理的组相比，在HJ8.5和HJ9.3抗tau抗体处理的小鼠中70% FA部分中不溶性tau水平具有显著降低。HJ9.4抗体处理小鼠中不溶性tau水平没有不同于对照组(**p<0.01)。通过ELISA，利用特异性的抗人、抗小鼠或抗磷酸tau抗体评估70% FA部分中人tau (D)、小鼠tau(E)的水平和Ser202和Thr205上的磷酸tau(F)水平(n=6小鼠/处理组)。在抗tau抗体处理小鼠的所有组中人tau水平下降，而小鼠tau水平没有改变。在70% FA部分中，我们还发现如通过AT8反应性检测的Ser202和Thr205上的磷酸tau与对照相比，在抗tau抗体处理小鼠中减少，与总的人tau类似。
图43. 如通过FRET测定所检测，抗tau抗体处理的P301S小鼠在皮质提取物中具有降低的tau 接种活性。(A)通过FRET测定在HEK293细胞上，利用所有PBS (N=16)、HJ3.4 (N=8)、HJ8.5 (N=13)、HJ9.3 (N=15)和HJ9.4 (N=13)处理小鼠的RAB可溶性部分测量Tau 接种活性。利用RD (ΔK280)-CFP和RD (ΔK280)-YFP共转染HEK293细胞。18小时后，向细胞中加入RAB可溶性部分。与PBS或HJ3.4抗体处理的小鼠相比，接种活性在HJ8.5和HJ9.3抗体处理的小鼠中显著减少。与PBS或HJ3.4抗体RAB可溶性部分相比，来自HJ9.4抗体处理的小鼠的RAB可溶性部分不具有降低的接种活性(***p<0.001，值代表均值± SEM)。(B)从tau敲除、PBS或抗tau抗体处理的小鼠免疫沉淀RAB可溶性部分。通过FRET测定测量任何接种活性从抗体/珠复合体的洗脱。在HJ8.5 和HJ9.3抗体处理的小鼠相对于PBS处理的小鼠中观察到显著更低的接种活性(****p<0.0001，值代表均值± SEM)。(C) 通过ELISA分析的所有处理组的9个月龄大小的P301S 脑皮质区域的70% FA部分显示与利用RAB可溶性部分进行的FRET分析的强相关性。(D)评估所有处理的小鼠的9个月龄大小的P301S 脑皮质的RAB可溶性部分中存在的tau水平（X轴）和接种活性（Y轴）之间的比较。在这2次测量中没有显著相关性。(E)在SDD-AGE上分离3个月龄大小的敲除(KO)、3个月龄大小的野生型(WT)、3个月龄大小的P301S和9个月龄大小PBS处理的P301S小鼠的RAB可溶性部分中的tau种类，随后进行蛋白质印迹。多克隆小鼠抗tau抗体用于检测tau种类。高分子量tau种类存在于3个月龄大小的P301S小鼠中的RAB可溶性部分中，并且更大量存在于9个月龄大小的P301S小鼠中。
图44. 组在运动能力、感觉运动功能或条件性恐惧测试的听觉信号组分上没有显著不同。rmANOVAs的结果不能揭示在洞板测试(A)、ledge测试(B)或任何其他感觉运动测量（未显示）或在加速rotarod (C)中用于总移动的治疗的显著主要或相互作用效果。在条件性恐惧测试的第3天来自变更关联基线的数据产生了治疗的显著效果(*p=0.027)并且随后的比较显示该结果的大部分是由于HJ9.4小鼠和PBS+HJ3.4对照组之间的显著差异(p=0.0007)。 (D). 然而， rmANOVA后没有发现治疗对听觉信号数据(min 3-10)的显著主要或相互作用效果提示在该时间内凝滞水平(freezing level)在组之间没有显著不同(E)。为了评估活性水平在第2天关联恐惧测试过程中是否对凝滞具有影响，我们计算了在洞板测试过程中测量的总移动相对于与在关联恐惧测试过程中凝滞消耗的%时间的Pearson’s相关系数(r)，并发现它们不显著相关(p=0.39) (F)。
图45. 通过HJ8.5和HJ9.4抗体处理恢复了P301S tau转基因小鼠中的关联恐惧条件性缺陷。(A)在条件性恐惧测试的第1天，如rmANOVAs后处理对这些数据缺少显著主要或相互作用效果所指示，在2-min基线条件或音调/电击(tone/shock) (T/S)训练过程中没有观察到组之间凝滞水平的差异。(B)相反，在第2天，关联恐惧测试过程中rmANOVA后观察到处理(*p=0.019)对凝滞水平的明显影响和通过Minutes相互作用(**p=0.0001)的明显处理。仅HJ9.4组显示从第1分钟相对于第8分钟的明显适应(#p=0.002)。(C)随后设计的比较显示HJ8.5和HJ9.4 tau抗体组中的凝滞当经过8-min期间平均时相对于PBS+HJ3.4对照组显著增加(分别为**p=0.006和*p=0.022)。然而，数据的进一步分析显示了在第2分钟过程中发生的HJ9.4 组和PBS+HJ3.4对照之间的最大差异(†p=0.004)，而在第4-7分钟过程中发现了在HJ8.5 处理的小鼠和对照组之间的最大差异(††p<0.004)，如“B”中所述。
图46 描述了这样的图，其显示夹层Tau ELISA测定可以用于辨别对接种活性阳性的血浆样品与对接种活性阴性的血浆样品。如Kfoury 等 2012 J Biol Chem 287(23)中所述确定接种活性。将tau聚集体的量报告为来自从健康年轻人收集的血浆的信号（即，测定的背景信号）上的相对倍数变化诱导。
图47 描述了这样的图，其显示了本发明的抗tau抗体在tau细胞传播测定上的影响。在每一组中，第一个棒代表没有添加抗体的培养基，代表传播的基线效力。(A) HJ8.1和HJ8.2；(B) HJ8.3和HJ8.4；(C) HJ8.5和HJ8.7；(D) HJ8.8和HJ9.1；(E) HJ9.2和HJ9.3；(F)HJ9.4和HJ9.5。
图48 描述了这样的图，其显示各抗tau抗体或抗tau抗体的等摩尔混合物在基于细胞的测定中对tau传播的影响。
图49 在(A)中，描述了显示当RD(∆K)-CFP/YFP在同一个细胞内共表达时， HJ9.3抗体对细胞内tau传播没有影响的图，和在(B)中，显示非特异性IgG对tau聚集的跨细胞传播没有影响的图。
图50 描述了这样的图，其显示HJ9.3抑制tau聚集体吸收，如通过流式细胞术所测量。细胞暴露于化学标记有荧光染料的重组RD纤丝中。胰蛋白酶消化和分散后，使用流式细胞仪计数细胞。HJ9.3剂量依赖性地减少荧光标记的细胞的数量，表明聚集体吸收的抑制。
发明内容
阿尔茨海默氏病与所有tau蛋白病之间常见的最小关联是tau的聚集状态。在所有这些疾病状态下，已知单体tau将转化成聚合的有序纤丝。包含纤维状tau聚集体的神经原纤维缠结(NFTs)是tau蛋白病的神经病理性标志。申请人已经发现tau病理在脑中的扩散可能是由从“供体”细胞释放的tau聚集体的形式进入第二个“受体”细胞，并在所述受体细胞中通过直接的蛋白-蛋白接触诱导tau的进一步错误折叠和聚集引起。促进tau聚集体的这种细胞-细胞扩散的tau聚集体的特定形式称为“tau种子(tau seeds)”并且活性在本文中称为“接种活性(seeding activity)”，因为tau聚集体的这种形式在其进入的细胞（即“受体细胞”）中接种或集结tau聚集。
Tau可以以单体形式和不同的聚集形式存在。如本文所用，术语“tau聚集体”指包含两个或多个tau单体的分子复合体。不希望受理论束缚，tau聚集体可以包含结合在一起的几乎不受限数量的单体。例如，tau聚集体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或多个tau单体。或者，tau聚集体可以包含20、30、40、50、60、70、80、90、100或多个tau单体。tau聚集体还可以包含500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或多个tau单体。术语“纤维状tau聚集体”和“tau纤丝”指tau聚集体的形式，并且这些术语在本文中互换使用。纤维状tau聚集体是包含tau的聚合的有序纤维。Tau纤丝一般不是可溶性的，但是较短的装配或寡聚物可以是可溶性的。Tau聚集体还指可溶性的tau寡聚物和原纤维，其在tau聚集过程中充当中间体。在tau聚集体的定义中还包括的是术语“tau种子”，其指当被细胞内化或当在体外暴露于单体tau时能够集结或“接种”细胞内tau聚集的tau聚集体。可以在如本文所述的细胞tau聚集测定中评估tau 接种活性。
此外，申请人已经发现特异性结合tau的抗体及其使用方法。一方面，本发明提供特异性结合tau的抗体。另一方面，本发明提供用于有效减缓和/或减少tau聚集的细胞-细胞传播的手段。本发明的抗体可以通过促进蛋白纤丝的解聚、阻断单体tau在细胞中转化成聚集的tau、促进tau聚集体的细胞内降解、防止tau聚集体进入邻近的细胞或其组合来减缓和/或减少tau聚集的传播。另一方面，本发明提供在从主体获得的生物流体的样品中检测tau聚集体的手段。另一方面，本发明提供在从主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量的手段。另一方面，本发明提供基于在从主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量划分主体的手段。基于在从主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量划分主体可以用于鉴定将在主体生命中发生与tau聚集相关的症状和/或疾病的主体。
本发明包括这样的发现，抗tau抗体可以通过结合从细胞释放的细胞外tau，由此防止tau聚集体进入邻近的细胞并减缓tau聚集的扩散而减缓纤维状tau聚集体的传播。一方面，本发明提供用于防止tau聚集体进入细胞的手段。另一方面，本发明提供用于减少细胞内tau聚集的手段。另一方面，本发明提供用于降低tau 接种活性的手段。用于防止tau聚集体进入邻近的细胞中的本发明的抗体包括结合tau内的表位的那些。
I. 结合tau的抗体
在人中，存在通过可变剪切2、3和10号外显子产生的tau的六种同工型。同工型在352-441个氨基酸范围内。2和3号外显子各自编码在N末端的29个氨基酸插入（称为N，因此tau同工型可以是2N（两个插入）、1N（仅2号外显子）或0N（两者均没有插入）。所有tau同工型具有微管结合域的三个重复。在C末端包括10号外显子导致包括10号外显子编码的第四个微管结合域。因此，tau同工型可以包含微管结合域的四个重复（包括10号外显子）或微管结合域的三个重复（不包括10号外显子）。本发明的抗tau抗体可以包括结合任何形式的tau的抗体。在示例性实施方案中，本发明的抗tau抗体可以包括结合包含10号外显子的tau的同工型的抗体。
如上指出，tau可以以单体和聚集形式，以有序或无序结构，在细胞内和细胞外发现于可溶性和不可溶性区室中，并且可以与其他蛋白或分子络合。本发明的抗tau抗体可以包括结合所述tau的一个或多个形式的抗体。在一些实施方案中，抗tau抗体结合tau单体。在其他实施方案中，抗tau抗体结合tau聚集体。在仍其他实施方案中，抗tau抗体结合tau纤丝。在不同的实施方案中，抗tau抗体结合tau单体和tau聚集体。在备选的实施方案中，抗tau抗体结合tau聚集体和tau纤丝。在不同的实施方案中，抗tau抗体结合tau纤丝和tau单体。
本文有用的抗tau抗体还包括特异性结合生物样品中存在的tau聚集体的所有抗体。本文有用的抗tau抗体还包括减少tau聚集的细胞-细胞传播的所有抗体。换言之，与在缺少本发明的抗体的情况下进入受体细胞的量相比，有用的抗体减缓和/或降低进入受体细胞中的tau的量。因此，有用的抗体降低在受体细胞中发生的tau聚集的量。
一方面，本文有用的抗体包括已经被分离、表征、纯化的，有功能性的并且已经被回收（获得）用于功能性治疗组合物（其向活主体施用）中的那些抗体。另一方面，本文有用的抗体包括已经被分离、表征、纯化的，有功能性的并且已经被回收（获得）用于测定以在从活主体获得的生物样品中检测tau聚集体并在主体生命中预测与tau聚集相关的症状发生的那些抗体。另一方面，本文有用的抗体包括已经被分离、表征、纯化的，有功能性的并且已经被回收（获得）或用于测定以在从活主体获得的生物样品中检测tau聚集体并将主体划分为在主体生命中发生与tau聚集相关的症状风险增加的那些抗体。另一方面，本文有用的抗体包括已经被分离、表征、纯化的，有功能性的并且已经被回收（获得）来使用并列于表A中的那些抗体，以及其变体（例如，人源化形式、嵌合形式和免疫片段）。
表A. 本发明的抗体
术语“抗体”包括术语“单克隆抗体”。“单克隆抗体”指来自单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。可以使用例如本领域所熟知的杂交瘤技术，以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合以及本领域容易已知的其他技术产生单克隆抗体。此外，可以根据本领域已知的方法，利用固定在固相和/或与异源化合物（例如，酶或毒素）缀合的可检测的标记来标记单克隆抗体。
此外，“抗体”表示功能性单克隆抗体，或其免疫有效的片段；如其Fab、Fab'或F(ab')2片段。在本文的一些背景中，将特别提及片段用于强调；然而，将理解不管是否指定片段，术语“抗体”包括此类片段以及单链形式。只要蛋白保留特异性结合其预期靶标的能力，它就包括在术语“抗体”内。定义“抗体”内还包括例如单链形式，一般命名为具有该特异性的抗体的Fv区。优选地，但不必然地，重组产生用于本发现的抗体，因为需要操作通常具有适当特异性的鼠类或其他非人抗体，以将它们转化成人源化形式。抗体可以是糖基化的或可以不是。抗体通过二硫键适当交联，如已知的。
本文有用的抗体的基本抗体单元包含四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链，每一对具有一条“轻”链（约25 kDa）和一条“重”链（约50-70 kDa）。每条链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。
本文有用的抗tau抗体包括已经从其制备过程中分离、表征、纯化，有功能性的并且已经被回收（获得）并因此可以以治疗、药用或诊断充足的量，以有用形式用于本文的那些抗体。
将轻链划分为γ、μ、α和λ。将重链划分为γ、μ、δ或ε，并将抗体的表位分别定义为IgO、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10或更多个氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链对的可变区形成了抗原结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。链展示通过三个高变区，也称为互补决定区（下文中称为“CDR”）连接的相对保守的构架区（FR）的相同一般结构。来自两条链的CDR与构架区排列，使得能够结合特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链均分别包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸分配至每一个结构域与已知常规一致(参见，Kabat "Sequences of Proteins ofImmunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987和1991; Chothia, 等, J. Mol.Bio.(1987) 196:901-917; Chothia, 等, Nature (1989)342:878-883)。
一方面，通过免疫哺乳动物，从所述哺乳动物的抗体产生细胞形成杂交瘤或另外使他们无限繁殖，并培养所述杂交瘤或无限增殖细胞的标准技术产生具有适当特异性的单克隆抗tau抗体，以评估它们的适当特异性。在这种情况下，可以通过例如利用代表包括tau蛋白编码序列的区域或其适当的亚区域的表位的肽免疫人、兔、大鼠或小鼠产生此类抗体。可以通过检索编码想要的抗体的核苷酸序列从杂交瘤或产生它的其他细胞中获得用于重组操作的材料。然后可以操作并分离、表征、纯化，和回收这些核苷酸序列，以提供人源化形式的它们用于本文，若需要。
如本文所用，“人源化抗体”包括这样的抗tau抗体，其包含通过改变具有非人互补决定区（“CDR”）的抗体的序列而来源于人抗体种系的部分或全部氨基酸序列。最简单的这种改变可以简单地由将鼠类恒定区取代为人抗体的恒定区组成，因此产生人/鼠类嵌合体，其可能具有足够低的免疫原性，以被接受用于药物用途。然而，优选地，还通过本领域目前所熟知的技术人源化抗体的可变区，甚至是CDR。通过相应的人构架区取代可变区的构架区，保持非人CDR基本上完整，或甚至利用来源于人基因组的序列替换CDR。还可以随机突变CDR，从而在完全人种系构架区或基本上是人的构架区的背景中维持或增强对tau的结合活性和亲和力。基本上人构架区与已知的人构架序列具有至少90%、95%或99%的序列同一性。还可以在遗传修饰的小鼠中产生完全有用的人抗体，所述遗传修饰小鼠的免疫系统已经被改变以对应于人免疫系统。如上提及，其足以用于该发现的方法中，以使用抗体的免疫特异性片段，包括代表单链形式的片段。
此外，如本文所用，术语“人源化抗体”指这样的抗tau抗体，其包含人构架，来自非人抗体的至少一个CDR，并且其中所存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即具有至少约85-90%，优选至少95%的同一性。因此，除了可能的CDR，人源化抗体的所有部分与一条或多条天然人免疫球蛋白序列的相应对基本上相同。
若需要，可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计。当氨基酸归入以下种类时，待使用的人免疫球蛋白（受体免疫球蛋白）的构架氨基酸被来自提供CDR的非人免疫球蛋白（供体免疫球蛋白）的构架氨基酸替换：(a)受体免疫球蛋白的人构架区中的氨基酸在该位置上对人免疫球蛋白而言是罕见的，然而供体免疫球蛋白中的对应氨基酸在该位置上对人免疫球蛋白而言是常见的；(b)氨基酸的位置刚好邻近CDR之一；或(c)构架氨基酸的任何侧链原子在三维免疫球蛋白模型中CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃（中心-中心）内(Queen, 等,op. cit.,和Co, ct al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1991) 88:2869)。当受体免疫球蛋白的人构架区中的每一个氨基酸和供体免疫球蛋白中的对应氨基酸在该位置上对人免疫球蛋白而言是罕见的时，该氨基酸被在该位置上对人免疫球蛋白而言常见的氨基酸所替换。
在所有情况下，本发明的抗体特异性结合tau。在示例性实施方案中，本发明的抗体特异性结合人tau。本文的短语“特异性结合”表示抗体以0.1 pM-10 nM的范围，0.1 pM-1nM的优选范围的亲和力常数或相互作用的亲和力(KD)结合蛋白。来自多个种类的tau的序列为本领域所知，并且确定抗体是否结合tau的方法为本领域所知。例如，参见实施例。
本发明的抗体还可以用作融合蛋白，其已知为单链可变片段(scFv)。这些scFvs包含通过接头连接的重链和轻链可变区。在大多数情况下，但不是所有情况下，接头可以是肽。接头肽长度优选从约10-25个氨基酸。优选地，接头肽富含甘氨酸，以及丝氨酸或苏氨酸。ScFvs可以用于促进噬菌体展示或可以用于流式细胞术、免疫组织化学或用作靶向结构域。制备和使用ScFvs的方法为本领域所知。
在优选的实施方案中，本发明的ScFvs与人恒定域缀合。在一些实施方案中，重链恒定域来源于IgG结构域，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其他实施方案中，重链恒定域可以来源于IgA、IgM或IgE。
结合tau的本发明的分离的抗体优选识别若干表位之一。在一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别在表A中列出的表位。在另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 1 (DRKDQGGYTMHQD)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 1的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 1的至少6个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 1的至少7个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 1的至少8个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 1的至少9个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 1的至少10个邻接氨基酸内，SEQ IDNO: 1的至少11个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 1的至少12个邻接氨基酸内，和SEQ ID NO: 1的至少13个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 1内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.5。在另一个示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 1内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.1.1。
在另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 2(KTDHGAE)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 2的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 2的至少4个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 2的至少5个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 2的至少6个邻接氨基酸内，和SEQ ID NO: 2的至少7个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 2内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.1.2。在另一个示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 2内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.4。
在另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 3(PRHLSNV)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 3的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 3的至少4个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 3的至少5个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 3的至少6个邻接氨基酸内，和SEQ ID NO: 3的至少7个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 3内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.2。在另一个示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 3内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.3。
在仍另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 4(EPRQ)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 4的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 4的至少4个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQID NO: 4内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.8。
在仍其他实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 5(AAGHV)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 5的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 5的至少4个邻接氨基酸内，和SEQ ID NO: 5的至少5个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 5内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ8.7。
在额外的实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 6(TDHGAEIVYKSPVVSG)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 6的至少5个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 6的至少6个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少7个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少8个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 5的至少9个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少9个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少10个邻接氨基酸内，SEQID NO: 6的至少11个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少12个邻接氨基酸内，SEQ ID NO:6的至少13个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少14个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少15个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 6的至少16个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 6内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ9.1。
在另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 7(EFEVMED)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 7的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 7的至少4个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 7的至少5个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 7的至少6个邻接氨基酸内，和SEQ ID NO: 7的至少7个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 7内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ9.2。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 7内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ9.4。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 7内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ9.5。
在仍另一个实施方案中，结合tau的本发明的分离的抗体识别SEQ ID NO: 8(GGKVQIINKK)的氨基酸序列内的表位。优选地，分离的抗体识别SEQ ID NO: 8的至少3个邻接氨基酸内，包括SEQ ID NO: 8的至少4个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 8的至少5个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 8的至少6个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 8的至少7个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 8的至少8个邻接氨基酸内，SEQ ID NO: 8的至少9个邻接氨基酸内，和SEQ IDNO: 8的至少10个邻接氨基酸内的表位。在示例性实施方案中，识别SEQ ID NO: 8内的表位的本发明的分离的抗体是抗体HJ9.3。
优选的抗体是来源于命名为HJ8.5的杂交瘤的小鼠抗体的人源化形式。如本文所用，术语“来源于”表示“衍生的”抗体包含来自杂交瘤HJ8.5产生的抗体的至少一个CDR区域。用另一种方式说明，“衍生的抗体”包含至少一个CDR区域，其包含选自SEQ ID NO:16、17、18、19、20和21的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以来源于杂交瘤 HJ8.5，并且可以由与SEQID NO:12的轻链可变区包含90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的核酸序列编码，或由与SEQ ID NO:13的重链可变区包含90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以来源于杂交瘤 HJ8.5，并且可以包含与SEQ ID NO:14的轻链可变区具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列，或可以包含与SEQ ID NO:15的重链可变区具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。在上述实施方案的每一个中，抗体可以是人源化的。
在结合tau的本发明的抗体的示例性实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:12的轻链核酸序列和SEQ ID NO:13的重链核酸序列[即在本文中称为HJ8.5的单克隆抗体]。在结合tau的本发明的抗体的另一个示例性实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:14的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列[即在本文中称为HJ8.5的单克隆抗体]。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以包含轻链CDR1，如表B的抗体1。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含轻链CDR2，如表B的抗体4。在仍另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含轻链CDR3，如表B的抗体6。在备选的实施方案中，本发明的抗体可以包含两个或三个轻链CDR的组合，如表B的抗体2、3和5。
同样地，在一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR1，如表B的抗体7。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR2，如表B的抗体10。在仍另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR3，如表B的抗体12。在备选的实施方案中，本发明的抗体可以包含两个或三个重链CDR的组合，如表B的抗体8、9、11。
或者，本发明的抗体可以包含一个或多个轻链CDR和一个或多个重链CDR，如表B的抗体13-48。
表B
在多个实施方案中，本发明的抗体是人源化的。例如，在一个实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含这样的轻链可变区，其包含具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQID NO: 16的CDR1，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 17的CDR2，和具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 18的CDR3，或可以包含这样的重链可变区，其包含具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 19的CDR1，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 20的CDR2，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 21的CDR3。在优选的实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含这样的轻链可变区，其包含具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 16的CDR1，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQID NO: 17的CDR2，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸SEQ ID NO: 18的CDR3，包含这样的重链可变区，其包含具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 19的CDR1，具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 20的CDR2，和具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ IDNO: 21的CDR3。在示例性实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含这样的轻链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO: 17的CDR2，氨基酸SEQ IDNO: 18的CDR3，包含这样的重链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO: 20的CDR2，和氨基酸序列SEQ ID NO: 21的CDR3。本发明还包括SEQ IDNO: 16、17、18、19、20和21的相应核酸序列，其可以通过本领域的技术人员容易地确定，并且可以掺入到载体或其他大的DNA分子中，如染色体中，以表达本发明的抗体。
II. 使用方法
一方面，本发明提供用于向活的主体施用的功能性治疗组合物中的抗体。另一方面，本发明提供用于免疫测定以在从活的主体获得的生物流体的样品中检测tau聚集体的抗体。另一方面，本发明提供用于免疫测定以在从活的主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量的抗体。从主体获得的生物流体的样品中的tau聚集体的量可以用于将主体划分为具有高或低量的tau聚集体，并且可以进一步用于预测在主体的生命中发生与tau聚集相关的症状和/或疾病的风险。
合适的主体包括，但不限于人、家畜动物、伴侣动物、实验室动物和动物园动物。在一个实施方案中，主体可以是啮齿类，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，主体可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可以包括猪、牛、马、山羊、绵羊、骆马、羊驼。在仍另一实施方案中，主体可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例包括宠物，如狗、猫、兔和鸟。在仍另一实施方案中，主体可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”指可以在动物园发现的动物。此类动物可以包括非人灵长类、大型猫科、狼和熊。在优选的实施方案中，动物是实验室动物。实验室动物的非限制性实例可以包括啮齿类、犬科、猫科和非人灵长类。在某些实施方案中，动物是啮齿类动物。啮齿类动物的非限制性实例可以包括小鼠、大鼠、豚鼠等。在其中动物是小鼠的实施方案中，小鼠可以是C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠、129sv或任何其他实验室品系。在示例性实施方案中，主体是C57BL/6J小鼠。在优选的实施方案中，主体是人。
A. 治疗方法
一方面，本发明包括在主体脑中减少tau聚集扩散的方法。另一方面，本发明包括用于减少tau种子诱导的tau细胞内聚集的方法。在每个方面，所述方法包括向主体施用药理学上有效量的抗tau抗体。在上文部分I中描述了合适的抗体。在优选的实施方案中，抗体选自表1的抗体和表2的抗体，包括人源化抗体、嵌合抗体或其免疫片段。
主体在施用药理学上有效量的抗tau抗体之前可以具有或不具有与tau聚集相关的症状。换一种方式说明，主体可以经历或不经历与tau聚集相关的症状。技术人员将理解，病理性tau聚集可能在诊断或与tau聚集相关的症状开始前开始。在一些实施方案中，主体具有与tau聚集相关的症状。在其他实施方案中，主体不具有与tau聚集相关的症状。在仍其他实施方案中，主体具有可检测的tau病理，但不具有与tau聚集相关的任何其他症状。减少tau聚集在主体脑中的扩散可能减少与tau病理性聚集相关的症状的发生和/或进展。
防止纤维状tau聚集体的传播可能治疗与tau聚集体的产生和扩散相关的病理。如本文所用，术语“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”包括预防、缓解、逆转或改善至少一种与tau聚集相关的症状或体征。与tau聚集相关的症状的一种定义指部分由tau纤丝组成的tau聚集体的形成引起的任何症状。具有与tau聚集相关的症状的示例性病症包括，但不限于进行性核上麻痹、拳击员痴呆（慢性损伤性脑病）、额颞叶痴呆和与17号染色体连锁的帕金森氏综合征、Lytico-Bodig疾病（Guam氏Parkinson痴呆复征）、混乱主导的痴呆(tangle-predominant dementia)、神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤、meningioangiomatosis、亚急性硬化性全脑炎、铅脑病，结节性硬化症，Hallervorden-Spatz疾病、脂褐质沉积症、Pick's疾病、皮质基底节变性，嗜银颗粒疾病（AGD）、额颞叶变性、阿尔茨海默氏病和额颞叶痴呆。用于诊断这些病症的方法为本领域所知。
与tau聚集相关的示例性症状可以包括受损的认知功能、改变行为、情感失调、癫痫发作(seizures)和受损的神经系统结构或功能。受损的认知功能包括但不限于记忆力、注意力、精力集中、语言、抽象思考、创造力、执行功能、计划和组织困难。改变的行为包括但不限于身体或语言攻击、冲动行为、降低的抑制、冷漠、降低的引发、人格改变，酒精、烟草或药物滥用，和其他上瘾相关行为。情感失调包括但不限于抑郁、焦虑、狂躁、易怒和情感失禁。癫痫发作包括但不限于全身强直-阵挛性发作、复杂部分发作，和非癫痫的精神性发作。受损的神经系统结构或功能包括但不限于脑积水、帕金森氏综合征、睡眠障碍、精神病、平衡和协调受损。这包括运动受损，如单肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、共济失调、颤搐和震颤。这还包括感觉缺失或异常，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这包括自主神经系统受损，如肠和膀胱异常、性功能异常、血压和体温失调。最后，这包括这样的激素受损，其可归因于下丘脑和脑下垂体异常的激素受损，如生长激素、甲状腺刺激激素、lutenizing激素、促卵泡激素、促性腺激素释放激素、泌乳刺激素，和许多其他激素和调节物的缺乏和失调。用于检测和评价与tau聚集相关的症状的方法为本领域所知。
在一些实施方案中，与tau聚集相关的症状指痴呆。痴呆本身不是具体的疾病，而是描述与记忆力或其他思考技能衰退相关的广泛症状严重到足以减少人进行日常活动的能力的总术语。痴呆也是与tau聚集相关的许多疾病的共有临床特征。技术人员将熟悉可用于诊断痴呆严重性的许多方法。例如，用于痴呆的若干认知测试和筛选调查表为本领域所知，其所有具有不同程度的灵敏度和特异性。非限制性实例包括简易智力状态检查（MMSE）、简易智力测试可能得分（AMTS）、修改的简易智力状态检查（3MS）、认知能力筛查仪（CASI）、连线测验、画钟测试、对老年人认知功能下降填报人调查表、全科医生的认知评估、临床痴呆评定（CDR）、8项知情人访谈区分老化和痴呆（AD8）。
在一些实施方案中，使用CDR定量痴呆症状的严重性。使用CDR，0得分表示没有症状，0.5得分表示非常轻的症状，1得分表示轻度症状，2得分表示中度症状，3得分表示严重症状。因此，主体CDR得分的任何增加均表示认知变坏，痴呆加重。此外，CDR从0到大于0的变化表示痴呆的发生或开始。
在一些实施方案中，与tau聚集相关的症状指tau病理。术语“tau病理”指tau的病理性聚集。在一些实施方案中，tau病理指神经原纤维缠结。在其他实施方案中，tau病理指高度磷酸化的tau。在仍其他实施方案中，tau病理指在血液、血浆、血清、CSF或ISF中可检测到的tau聚集体的高水平比在没有疾病的个体中检测到的无论如何高1.2到大约40倍。用于检测tau的病理性聚集的方法为本领域所知并进一步详细描述于实施例中。
在示例性实施方案中，减少tau聚集在主体的脑中扩散的方法包括向所述主体施用药理学上有效量的抗tau抗体，其中所述抗体选自包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 16的CDR1的轻链可变区的分离抗体，包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 17的CDR2的轻链可变区的分离抗体，包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 18的CDR3的轻链可变区的分离抗体，包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 19的CDR1的重链可变区的分离抗体，包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 20的CDR2的重链可变区的分离抗体，和包含含有具有0-2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO: 21的CDR3的重链可变区的分离抗体。
在另一示例性实施方案中，在主体中减少tau聚集扩散的方法包括向所述主体施用药理学上有效量的抗tau抗体，其中所述抗体特异性结合tau并识别包含SEQ ID NO: 1(DRKDQGGYTMHQD)的表位。
在另一示例性实施方案中，在主体的脑中减少tau聚集扩散的方法包括向所述主体施用药理学上有效量的抗tau抗体，其中所述抗体特异性结合tau并识别由SEQ ID NO: 1(DRKDQGGYTMHQD)组成的表位。
可以向主体施用药理学上有效量的优选药物等级的抗体，包括免疫反应片段。使用标准的有效技术进行施用，包括经外周（即不通过向中枢神经系统中施用）或局部向中枢神经系统施用。外周施用包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺内、经皮肤、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。局部施用，包括直接施用到中枢神经系统(CNS)中包括，但不限于经过腰、心室内或实质细胞内导管或使用外科移植的控制释放的制剂。
特意设计用于有效施用的药物组合物，以适合于所选的施用方式，并且适当时使用药学上可接受的赋形剂，如相容性的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., EastonPa., 16Ed ISBN:0-912734-04-3，最新版本（以其整体通过参考并入本文）提供了从业者一般已知的配制技术的提纲。其可能特别用于改变用于该发现的抗体的可溶性特征，例如通过将它们包在脂质体中或通过封闭极性基团而使得它们更亲脂。
通过静脉内或腹膜内或皮下注射的有效外周全身递送是向活的患者施用的优选方法。用于此类注射的合适的媒介物是简单的。此外，然而，还可以通过鼻气溶胶或栓剂经过粘膜完成施用。用于该施用方式的合适制剂是众所周知的并且通常包括促进跨膜转移的表面活性剂。此类表面活性剂经常来源于类固醇或是阳离子脂质，如N-[1-(2,3-二油酰)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或多种化合物，如胆固醇半琥珀酸酯、磷脂酰甘油等。
待施用的制剂中人源化抗体的浓度是低至约0.1重量%至高达约15或约20重量%的有效量和范围，并且将基于流体体积、粘度等，需要时主要根据所选特定施用方式主要进行选择。可以制备用于向活的患者注射的典型组合物，以含有1-5 mL无菌磷酸缓冲盐溶液的缓冲水和约1-5000 mg本发现的人源化抗体的任一个或组合。制剂在制备制剂后可以被无菌过滤，或另外被制备成在微生物学上可接受的。用于静脉输注的典型组合物可以具有1-250 mL流体，如无菌Ringer's溶液的体积，和1-100 mg/ml，或更高的抗tau抗体浓度。可以冷冻或冻干本发现的治疗剂用于储存并在使用前在合适的无菌载体中重构。冻干和重构可以导致多种程度的抗体活性损失（例如，常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体趋向于具有更大的活性损失）。所施用的剂量是有效剂量并且必须调整以补偿。将选择一般是药物等级质量的制剂的pH以平衡抗体稳定性（化学和物理的）并当施用时安慰患者。一般地，4-8之间的pH是耐受的。剂量根据大小、体重和接受成功施用的个体的其他物理-生物特征而在个体之间变化。
如本文所用，术语“有效量”表示物质，如对施用所述物质的患者产生可测量的和有益的影响，即显著效力的化合物的量。将通过情况周围的环境，包括所施用的化合物、施用途径、所治疗的症状的状态和类似患者以及其他考虑中的施用情况考虑来确定根据该发现施用的化合物的有效量或剂量。一方面，典型剂量含有约0.01 mg/kg -约100 mg/kg如本文所述的抗tau抗体。剂量可以在约0.05 mg/kg-约100 mg/kg，更优选从约0.1 mg/kg-约50mg/kg，或从0.5 mg/kg-约50 mg/kg之间变化。给药频率可以是每天一次或每周或每月一次、两次、三次或更多次，根据需要以有效地治疗症状。或者，给药的频率可以是每三个月至少一次，根据需要以有效地治疗症状。例如，给药可以是约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周、或约每12周。
将通过情况周围的环境确定相对于疾病本身和治疗持续时间的治疗的施用时机。治疗可以在诊断与tau聚集相关的疾病后开始。或者，治疗可以在临床证实与tau聚集相关的症状后开始。此外，治疗可以在检测到tau病理后开始。治疗可以在住院或临床，或从医院出院后晚些时间或在门诊部观察后立即开始。治疗持续可以在一次基础上施用的单一剂量到治疗处理的长期过程中变化。
尽管前述方法看起来是最便利且最适合并有效地用于通过合适的调整施用蛋白，如人源化抗体，但是可以使用用于施用的其他有效技术，如心室内施用、经皮肤施用和口腔施用，只要在本文中利用合适的制剂。
此外，希望使用控制释放的制剂，其使用生物可降解的薄膜和基质，或渗透迷你泵，或基于葡聚糖珠、藻酸盐或胶原的递送系统。
典型的剂量水平可以使用标准的临床技术确定和优化，并将依赖于施用方式。
B. 在生物流体中检测tau聚集体的方法
一方面，本发明提供在从主体获得的生物流体的样品中检测tau聚集体的手段。另一方面，本发明提供在从主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量的手段。所述方法一般包括(i)从主体获得生物流体样品，和(ii)使用特异性结合tau的抗体测量样品中的tau聚集体的量。在上文部分I中描述了合适的抗体。在上文描述了合适的主体。
如本文所用，术语“生物流体”指从主体获得的流体。包含tau聚集体的任何生物流体均是合适的。非限制性实例包括血液、血浆、血清、尿、CSF和ISF。流体可以“直接”使用(beused“as is”)，细胞组分可以从流体中分离，或蛋白部分可以使用标准技术从流体中分离。
如技术人员所理解，收集生物流体样品的方法可以并且将根据生物流体的性质和待进行的分析类型而变化。本领域一般已知的任何多种方法可以用于收集生物流体样品。一般而言，所述方法优选维持样品的完整性，从而可以精确地检测tau聚集体并且根据本发明测量其量。
一旦获得了样品，将其在体外处理，以使用抗tau抗体检测并测量tau聚集体的量。在一些实施方案中，样品中tau聚集体的浓度在检测和测量之前增加。在一些实施方案中，tau聚集体在使用至少一种分离的抗tau抗体检测和测量之前从样品中免疫沉淀。在其他实施方案中，tau聚集体在使用至少两种分离的抗tau抗体检测和测量之前从样品中免疫沉淀。在其中使用至少两种抗体免疫沉淀tau聚集体的实施方案中，优选第一抗体结合tau的第一个表位，并且第二抗体结合tau的第二个非重叠表位。结合tau的两个不同表位的两种抗体的使用在捕获所有可能的tau聚集体构象异构体中可能更有效。用于免疫沉淀的合适的抗体对的非限制性实例列于表C中。在优选的实施方案中，tau聚集体在使用至少两种分离的抗tau抗体检测和测量前从样品中免疫沉淀，其中至少第一抗体识别SEQ ID NO: 1内的表位并且至少第二抗体识别SEQ ID NO: 8内的表位。技术人员利用例行试验将能够确定样品中的tau聚集体在检测和测量之前是否需要被浓缩或免疫沉淀，并且将能够使用本领域已知的方法进行这些操作。
表C
用于使用抗体检测和测量蛋白的量的方法为本领域所熟知。使用本领域技术人员已知的抗体检测和测量蛋白的量的所有合适方法均涵盖在本发明的范围内。非限制性实例包括ELISA、夹层免疫测定、放射性免疫测定、免疫印迹或蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组织化学和阵列。
一般而言，基于抗体检测和测量tau聚集体的量的方法包括使包含tau聚集体的一些或所有样品与抗tau抗体在有效允许在抗体和tau聚集体之间形成复合体的条件下接触。通常，不需要全部样品，允许本领域技术人员随时间流逝重复地检测和测量样品中tau聚集体的量。方法可以在溶液中发生，或者抗体或tau聚集体可以固定在固体表面上。合适表面的非限制性实例包括微量滴定板、试管、珠、树脂和其他聚合物。附着到基质上可以以多种方式发生，如本领域技术人员所理解的。例如，可以利用化学官能团衍生基质和抗体用于两者的随后附着。例如，可以利用化学官能团，包括但不限于氨基、羧基、氧基或巯基衍生基质。使用这些官能团，抗体可以直接使用官能团或间接使用接头而附着。抗tau抗体还可以非共价附着到基质上。例如，可以制备生物素化的抗tau抗体，其可以共价结合被链霉抗生物素蛋白包被的表面，导致附着。或者，可以使用技术如光聚合和光照相平板印刷在表面上合成抗体。
使样品与抗体在足以允许复合体形成的有效条件下接触一段时间一般涉及向样品（或向免疫沉淀的或浓缩的tau聚集体中）中加入抗tau抗体组合物并将所述混合物温育足够长的时间用于抗tau抗体结合存在的任何抗原。在此之后，可以洗涤复合体，然后检测所述复合体并通过本领域所熟知的任何方法测量其量。检测和测量抗体-多肽复合体的量的方法一般基于对标记或标志物的检测。如本文所用，术语“标记”指附着到抗体或其他基质材料上的任何物质，其中通过检测方法可检测所述物质。合适标记的非限制性实例包括发光分子、化学发光分子、荧光色素、荧光猝灭剂、染色分子、放射性同位素、闪烁剂、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属和酶（包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶）。基于检测标记或标志物的检测和测量抗体-多肽复合体的量的方法为本领域所熟知。
在优选的实施方案中，用于测量样品中tau聚集体的量的方法是包括两种捕获抗体和一种检测抗体的免疫测定，其中各捕获抗体是识别彼此不同的tau表位的分离的抗tau抗体，而检测抗体是附着到标记上的分离的抗tau抗体。所述检测抗体可以是与两个捕获抗体之一相同的抗体，或者，该检测抗体可以识别不被任何捕获抗体识别的tau表位。通常，第一捕获抗体和第二捕获抗体以从约10:1-约1:10、从约5:1-约1:5、从约3:1-约1:3，或从2:1-约1:2的量使用。在一些实施方案中，第一捕获抗体和第二捕获抗体以大约相等的浓度使用。捕获抗体的合适对的非限制性实例包括在表D和表E中公开的抗体。合适的检测抗体的非限制性实例包括在表A中列出的抗体，以及特异性结合tau并识别选自SEQ ID NOs: 1-11的氨基酸序列内的表位的抗体。在示例性实施方案中，第一捕获抗体是特异性结合tau并识别SEQ ID NO: 7内的表位的分离的抗体，第二捕获抗体是特异性结合tau并识别SEQ IDNO: 8内的表位的分离的抗体，并且检测抗体是特异性结合tau并识别SEQ ID NO: 8内的表位的分离的抗体。
表D 第一和第二捕获抗体
表E 第一和第二捕获抗体：各抗体特异性结合tau并识别所示SEQ ID NO中指出的氨基酸序列内的表位。
另一方面，本发明提供基于在从主体获得的生物流体的样品中测量tau聚集体的量划分主体的手段。所述方法一般包括(i)从主体中获得生物流体样品并使用特异性结合tau的抗体测量所述样品中tau聚集体的量，(ii)比较该样品中tau聚集体的量与参考值，和(iii)基于样品中测量的tau聚集体的量将所述主体划分为具有高或低量的tau聚集体。在上文详细描述并在实施例中进一步描述了用于从主体获得生物流体样品并使用特异性结合tau的抗体测量样品中的tau聚集体的量的方法。
本领域已知的任何合适的参考值均可以使用。例如，合适的参考值可以是从相同种类的主体或主体组（其不具有tau聚集的临床可检测症状）获得的生物流体样品中tau聚集体的量。在另一实例中，合适的参考值可以是从相同种类的主体或主体组（其不具有可检测的tau病理）获得的生物流体样品中tau聚集体的量。在另一实例中，合适的参考值可以是从相同种类的主体或主体组（其具有0的临床痴呆评定得分(CDR = 0)）获得的生物流体样品中tau聚集体的量。在另一实例中，合适的参考值可以是通过本领域已知方法确定的测定的背景信号。在另一实例中，合适的参考值可以是从同一个主体获得的参考样品中tau聚集体的量的测量值。参考样品包含与测试样品相同类型的生物流体，并且当所述主体没有tau聚集的临床可检测症状时可以从主体获得。技术人员将理解，并不总是可以或期望从主体中获得参考样品，当主体另外健康时。例如，当监测治疗的有效性时，参考样品可以是在治疗开始前从主体获得的样品。在这种实例中，主体可以具有tau病理，但可能不具有tau聚集的其他症状（例如，痴呆、降低的认知等）或所述主体可以具有tau病理和tau聚集的一个或多个其他症状。在额外的实例中，合适的参考样品可以是来自已经显示不具有tau聚集体的个体或个体组的生物流体。
根据本发明，可以基于在样品中测量的tau聚集体的量划分主体。基于在从主体获得的生物流体的样品中测量的tau聚集体的量划分主体可以用于鉴定将在主体生命中发生与tau聚集相关的疾病和/或症状的主体。一般而言，与参考值相比，可以将主体划分为具有高或低量的tau聚集体，其中高量的tau聚集体是高于参考值的量，并且低量是等于或低于参考值的量。在优选的实施方案中，为了划分主体为具有高量的tau聚集体，与参考值相比，生物流体的样品中tau聚集体的量增加至少2倍。例如，与参考值相比，样品中tau聚集体的量增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍或至少50倍。当与参考值相比，从主体获得的生物流体样品中tau聚集体的量增加至少2倍时，并且参考值是从不具有tau聚集的可检测症状的一个或多个无疾病个体获得的相同类型生物流体的样品（或与其等同的样品）时，主体在其生命中更有可能发生与tau聚集相关的疾病和/或症状。
定义
如本文所用，“抗体”指特异性识别tau的免疫球蛋白衍生的分子。本发明的抗体可以是全长抗体（IgM、IgG、IgA、IgE）或可以是抗体片段（Fab、F(ab’)2、scFv）。抗体可以是嵌合的或可以是人源化的。
如本文所用，“CDR”表示“互补决定区”。CDR也称为高变区。
如本文所用，“轻链”是抗体的多肽小亚基。典型的抗体包含两条轻链和两条重链。
如本文所用，“重链”是抗体的多肽大亚基。抗体的重链含有一系列免疫球蛋白结构域，具有至少一个可变结构域和至少一个恒定域。
如本文所用，“人源化”指这样的过程，其中使用重组DNA产生单克隆抗体以产生能够在人细胞培养中表达的构建体。用于产生这些构建体的任何已知技术将为本发明目的工作。
如本文所用，“单链可变片段”或“scFv”或“scFvs”指免疫球蛋白的重链和轻链的可变区通过接头连接的融合蛋白。在一些实施方案中，接头是约10-25个氨基酸的肽。
具体实施方式
实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本发明中很好地起作用的技术，并因此可以被认为构成用于其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员在本公开内容方面应该理解，在所公开的特定实施方案中可以进行许多改变，并且仍然获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1-8的介绍
神经元和神经胶质中微管结合蛋白tau的聚集与超过20种神经变性病症相关，包括阿尔茨海默氏病（AD）、进行性核上性麻痹和额颞叶痴呆。来自人研究的近期证据提示，tau病理并不在大脑中随机分布，而是与神经元连接性的现有网络相连。AD的纤丝状tau病理沿已知的解剖连接前进，尽管网络变性的机制未知。重要的是，近期的病理研究提示，蛋白聚集体在人和小鼠脑中可以从一个细胞移动到另一个细胞中。此外，可以从细胞外空间容易地吸收重组的人疾病相关蛋白质，如tau、SOD-1、α-突触核蛋白和polygutamines的纤丝状形式，以触发细胞内的错误折叠。这些现象暗示了朊病毒传播，为此已经提出外泌体和隧道纳米管介导跨细胞扩散。关于tau聚集体是否可能通过直接的细胞-细胞接触或通过细胞外空间在细胞间扩散蛋白质错误折叠是一个未解决的问题。此外，仍未确定病理性tau种类是否可以介导真正的聚集体跨细胞传播，由此聚集体从“供体”细胞释放，进入第二个“受体”细胞，并通过直接的蛋白质-蛋白质接触诱导进一步的错误折叠，这与更多间接的机制相反。在本文中，测试tau纤丝是否直接释放到细胞外空间内并且是否可以通过该机制传播聚集。
实施例1. 抗tau抗体
使用标准技术产生两个系列的抗tau抗体：HJ8系列（针对重组人tau的小鼠单克隆抗体）和HJ9系列（针对重组小鼠tau的小鼠单克隆抗体）（表1）。已经为许多抗体作图了结合表位（表A）。
为了表征HJ8和HJ9系列抗体对小鼠tau和人tau的结合亲和力，使用Biacore’sSPR技术。通过使用1:1比例的EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)- 碳二亚胺)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)活化Biacore传感器芯片CM-5 (羧甲基葡聚糖基质)。2). 然后在BiacoreCM-5传感器芯片上以5 µl/分钟的流速固定配体（小鼠tau或人tau，20ug/ml，在10 mM醋酸钠pH 3.5中）。通过传送1 M乙醇胺pH 8.5灭活Biacore CM-5传感器芯片上剩余的未结合区域。
在制备传感器表面后，以10 µl/分钟的流速注射在过滤脱气的0.01 M Hepes缓冲液，0.15 M NaCl，0.005%表面活性剂P20，pH 7.4中不同浓度(0.78nM – 400nM)的分析物（例如抗体）。所有样品一式两份运行。利用单个抗体浓度进行每一个循环/运行后，通过使用10 mM甘氨酸pH 1.7再生芯片的表面，以去除结合的抗体/分析物，保持单体/纤丝/配体附着在表面上。
从SPR传感图（图2-13）获得结合速率或On速率(Ka)、解离速率或Off速率(Kd)和亲和力常数或相互作用的亲和力（KD，其中KD = Kd/Ka）（表2和3）。
表2 HJ8系列和HJ9系列与小鼠tau的结合数据
表3 HJ8系列和HJ9系列与人tau的结合数据
实施例2. 全长tau存在于ISF中。
使用识别小鼠和人tau的tau抗体从野生型小鼠和P301S人tau转基因小鼠(P301Stg小鼠，细节见方法)的ISF样品中免疫沉淀tau。使用在免疫沉淀测定中运行良好的两种抗tau单克隆抗体，因为在ISF中单体tau的量相对低。免疫沉淀后，通过免疫印迹分析tau。内源鼠类tau同工型迁移到48–62 kDa处。在野生型脑裂解物中，tau在SDS-PAGE上的四条单独的条带中出现（图14A）。野生型小鼠中最丰富的种类迁移到48 kDa处。在P301S tg小鼠脑中，除了四条内源鼠类tau条带，过表达的人1N4R tau被观察为迁移到55 kDa处的强条带以及39 kDa条带，其可能代表tau降解产物。
与总的脑裂解物相反，免疫沉淀后，在来自野生型小鼠的ISF中利用识别tau的微管结合区(MTBR)的抗体HJ9.3检测到单一的tau条带（图14B）。该条带对应于在小鼠脑裂解物中观察到的最大同工型2N4R。在P301S tg小鼠的ISF中，人特异性tau条带与上述小鼠tau条带共沉淀，并且其分子量稍微小点（图14B）。还通过针对tau HJ8.1产生的另一小鼠单克隆抗体沉淀这两条条带（图14C）。这些数据提示，通过ELISA评估的ISF中的主要种类很可能是全长单体tau。
实施例3. Tau RD蛋白质在转染的HEK293细胞中形成纤维状聚集体
Tau基因编码六个蛋白质同工型，并且多个突变引起显性遗传性神经变性疾病。根据剪切，tau蛋白具有构成易于聚集的蛋白核心的三个或四个重复区域，其称为重复结构域（RD）。tau RD的表达在转基因小鼠中引起病理，并且在患者中存在全长tau截短形成包含纤丝的片段的证据。使用该构建体，而非全长tau，因为其在培养细胞中确实形成纤丝。将已知增加tau聚集的多个突变改造到四重复RD蛋白中：ΔK280 (称为ΔK)、P301L和V337M。在一个蛋白中组合P301L和V337M突变体（称为LM），以产生具有强烈增加的聚集潜力的RD的突变体形式，其与先前已经描述的类似。该“非生理性”突变体便于测定转移事件和错误折叠的跨细胞传播，其依赖于细胞内聚集体的有效形成并补充与“生理性”ΔK突变体类似，但更不强的聚集表型。还将两个脯氨酸取代（I227P和I308P，称为PP）改造至ΔK突变体中，其抑制β-折叠形成和纤维化，尽管它们不阻断无定形聚集体的形成。突变体tau的每种形式在羧基末端融合蓝绿色或黄色荧光蛋白（CFP或YFP）或HA标签。在图15A中图解了构建体。
为了评估tau RD细胞内聚集体的特征，将RD的多种形式瞬时转染到HEK293细胞中。原子力显微镜检查术(AFM)用于评估SDS不溶性材料。RD(ΔK)-HA和RD(LM)-HA产生明显的纤丝种类（图15B）。细胞内的RD(ΔK)-HA和RD(LM)-HA聚集体也对X-34（其为标记β折叠纤丝并发射蓝光谱的硫磺素衍生物）染色阳性（图15C）。此外，去污剂分馏用于测试通过光学显微镜可见的内含物是否具有生物化学相关性。在SDS不溶性沉淀中（在具有蛋白酶抑制剂的1X PBS中1% Triton X-100用于分离可溶性的沉淀，随后为SDS/RIPA提取不溶性沉淀），检测到与寡聚物一致的单体和更高分子量种类（图15D）。
申请人先前使用荧光共振能量转移(FRET)来定量细胞内huntingtin蛋白聚集。为了测试该方法是否可以用于追踪tau RD聚集，将多种RD突变体（wt、ΔK、PP、LM）与黄色荧光蛋白(YFP: FRET 受体)和蓝绿色荧光蛋白(CFP: FRET供体)融合。将这些构建体共转染到HEK293细胞(表示为RD-CFP/RD-YFP)中，并使用FRET受体光漂白共聚焦显微镜和使用荧光平板读取器(FPR)的光谱发射FRET来定量细胞内的聚集体形成。对于共聚焦显微镜，对共表达RD(LM)-CFP/ RD(LM) YFP的细胞成像并在部分和完全受体光漂白之前和之后测量供体信号。光漂白后供体信号的增加产生18.2% ± 0.058的平均FRET效率(n=6，数据为±标准差)，证实了FRET配对的RD种类之间的分子间相互作用（图16A）。为了利用FPR通过光谱FRET测量RD-CFP/YFP聚集，使用建立的方法。这基于RD-YFP和RD-CFP以3:1比例的共转染，以使信号检测极限内的供体猝灭最大化。没有观察到来自RD(PP)-CFP/YFP的显著FRET。然而，RD(ΔK)-CFP/YFP 和RD(LM)- CFP/YFP各自产生了强烈的FRET信号（图16B），其支持显微镜的发现。
先前已经观察到，多种细胞将从细胞外培养基中吸收重组tau纤丝。这触发了融合YFP的天然折叠的全长tau蛋白的细胞内纤维化。为了证实该现象，FRET用于监测多种量的重组RD纤丝诱导的RD(ΔK)-CFP/YFP的聚集。利用RD(ΔK)-CFP/YFP共转染HEK293细胞并培养15小时。然后向培养基中加入多种浓度的RD-HA纤丝（0.01、0.03、0.1和0.3 μM的单体等同物）9小时。然后通过更换培养基去除纤丝，并允许细胞在固定和使用FRET分析之前恢复4小时。观察到重组纤丝诱导的FRET信号相对于未处理的RD(ΔK)- CFP/YFP细胞的剂量依赖性增加（图16C）。总之，观察到tau RD聚集的显微镜、分子、生物化学和生物物理学量度与细胞内纤丝形成之间的相关性。在某些限制内，尤其利用用于蛋白表达水平的对照，基于平板读取器的FRET测定提供了该方法的温和量度。
实施例4. RD聚集的跨细胞诱导
本申请人先前已经确定来自一个细胞的tau内含物将在共培养中转移到天然细胞中。然而，还未证明这些转移的聚集体可以在受体细胞中诱导进一步的聚集，也没有证明聚集的诱导是否是基于直接的蛋白质-蛋白质相互作用。首先测试的是来自一个供体细胞群体的RD(LM)-HA聚集体是否会与RD(ΔK)-YFP在不同的受体群体中共培养后形成内含物。利用易于聚集的RD(LM)- HA转染一个细胞组，并利用RD(ΔK)-YFP转染不同的组。接下来的一天，将细胞群体一起重新涂布并共培养48小时。固定后，使用HA抗体对它们进行免疫染色，并用X-34复染。观察到许多细胞中RD(LM)-HA与RD(ΔK)-YFP共定位在内含物中（图17A）。这些内含物也经常对X-34染色阳性，表明β折叠结构。使用FRET测定扩展这些研究，以监测通过与表达RD(LM)-HA的细胞共培养诱导的RD(ΔK)-CFP/YFP的聚集。在该情况下，共培养两个细胞群体。供体群体表达RD(LM)-HA，而受体群体表达RD(ΔK)- CFP/YFP。tau RD(PP)-HA的β折叠抗性形式或模拟转染的细胞用作阴性对照。48小时后，从细胞单层测量FRET。观察到通过与RD(LM)-HA共培养相对于RD(PP)-HA或模拟转染的细胞诱导的FRET的强烈增加（图17B）。在RD(LM)-HA细胞与RD(WT)-CFP/YFP受体细胞共培养后观察到FRET信号的小幅增加（数据未显示）。这些结果提示了一个易于聚集的tau种类从一个细胞运动到另一个细胞，以在富含β折叠的内含物中触发共定位。聚集体释放可能在细胞死亡后发生，然而，使用多个转染群体的碘化丙啶染色没有观察到对此的证据（图17C）。
实施例5. 通过直接的蛋白接触传播错误折叠
尽管具有强烈的提示性，但是这些结果不能正式地解决共聚集是否经由直接的蛋白接触发生，来源于供体的tau RD之间的分子间结合在受体细胞中接触相应的蛋白质。FRET用于解决该问题。首先，RD(LM)-CFP在供体细胞群体内共表达，而RD(LM)-YFP在第二个受体群体中共表达。在48后利用共聚焦显微镜和FPR测量来自细胞单层的FRET。使用共聚焦显微镜，在光漂白YFP之前和之后测量CFP信号。记录~14.2%的平均FRET效率，表明内含物含有直接接触的RD(LM)-CFP和RD(LM)-YFP（图18A）。然后使用未标记RD的不同形式经由FPR比较相对FRET信号，以诱导RD-CFP的聚集。首先，RD(ΔK)-CFP和RD(LM)-HA在供体细胞群体中共表达，而RD(ΔK)-YFP在第二个受体细胞群体中共表达。RD(LM)-HA充当RD(ΔK)-CFP聚集和运动的增强子，促进其随后转移到RD(ΔK) -YFP受体细胞中。这导致在共培养细胞中小幅的但是可重复的FRET信号增加。当CFP或YFP标记的RD构建体含有阻断β折叠形成的PP突变时，该信号消失（图18B），表明一对的两个成员均具有形成β折叠结构的能力。连同先前的实验，这些结果提示错误折叠的传播通过直接接触而发生，即聚集体从一个细胞离开，以接触并触发第二个细胞中天然折叠的蛋白的错误折叠。该数据暗示，错误折叠的扩增也可能发生在连续的细胞共培养中。预测将“供体”细胞群体预先暴露于聚集种子中将增加在受体细胞群体中检测到的最终聚集。这通过连续培养三个细胞群体来测试。第一个群体表达非荧光RD-HA的多种形式以形成聚集“种子”。第二组表达CFP或RD(ΔK)-CFP作为非许可性（CFP）或许可性RD(ΔK)-CFP)用于聚集体的维持。将这两组共培养48小时以允许错误折叠的扩增。接下来，将组合的第一组和第二组的50%随后与表达RD(ΔK)-YFP的第三个细胞组共培养48小时。该第三个受体组充当“报告物”以表明RD(ΔK)-CFP细胞内聚集和传播的程度。RD(LM)-HA预先暴露于RD(ΔK)-CFP群体中相对于没有预先暴露于易于聚集的tau的细胞增加了最终的FRET 2.6倍。如预期，在第二个细胞群体中表达纯CFP的细胞的插入（interposition）完全阻断了预先暴露于tau RD“种子”中的效果（图18C）。综上，这些数据表明了连续培养的细胞群体内tau聚集的扩增。
实施例6. 通过释放聚集体进入细胞外空间介导的细胞-细胞传播
蛋白聚集体在细胞之间运动的机制是未知的。例如，一些已经假定朊病毒蛋白传播通过隧道纳米管，而其他已经提示了外泌体。因为先前已经报道针对tau蛋白的抗体在体内减少病理，所以猜测tau聚集体可能被直接释放到细胞外空间中。然而基于细胞-细胞接触的跨细胞运动应该独立于细胞外培养基的容积，预测tau的跨细胞运动可能对细胞外容积敏感，如已经对SOD1所描述的。为了开始，首先测试共培养在多种培养基体积背景中的效果。据观察，增加细胞培养基体积降低聚集体跨细胞运动的效率（图19A）。此外，从表达RD(LM)-HA的细胞转移条件性培养基足以在表达RD-CFP/YFP的细胞中诱导聚集（图19B）。这些结果与tau在细胞之间通过细胞外空间的运动一致，但不能确定蛋白是否是被封装在内体中。
据推理，封装的tau的入口会被脂膜阻断，然而游离的tau可接近抗体。因此，测试可以免疫沉淀tau的小鼠单克隆抗体(HJ9.3)是否会阻断跨细胞传播。使用上述tau RD传播的细胞模型的修改，其中RD(LM)-HA和RD(ΔK)-CFP在一个细胞群体内共表达，并且在通过FRET分析之前与表达RD(ΔK)-YFP的细胞共培养48小时。测试HJ9.3相对于混合的小鼠IgG48小时共培养时期。观察到利用HJ9.3的跨细胞传播的剂量依赖性减少，而非特异性IgG没有影响（图19C和D）。重要的是，当两个蛋白在同一个细胞内共表达时，HJ9.3对RD(ΔK)-CFP和RD(ΔK)-YFP的细胞内聚集没有影响（图19E），表明抗体不直接抑制细胞内聚集。通过使用生物化学评估tau错误折叠的诱导进一步测试游离的tau在跨细胞传播中的作用。证实了通过去污剂分馏和蛋白质印迹对聚集的诱导，其揭示了与RD(LM)-HA共培养诱导的不溶性部分中RD(ΔK)-YFP的增加。HJ9.3阻断了RD(LM)-HA在共培养细胞中诱导RD-YFP的不溶性的影响（图19F和G）。
抗体添加的效用提示游离的tau在细胞之间直接转移，但是抗体抑制的机制仍然未确定。猜测HJ9.3阻断tau纤丝被吸收至细胞中。为了测试该想法，流式细胞术用于监测抗体对聚集体跨细胞运动的影响。申请人先前已经建立了血细胞计数范例，由此用mCherry标记一个细胞群体，而第二个含有tau-YFP融合物。共培养后，可以基于双阳性（YFP/mCherry）细胞的相对百分比监测跨细胞运动。利用tau RD(LM)-YFP转染HEK293细胞群体，而利用慢病毒表达mCherry转导第二个群体。洗涤并重悬浮两个群体后，然后将细胞在培养基中存在或缺失10倍稀释的HJ9.3的情况下共培养48小时。收集细胞并使用流式细胞术测定双阳性细胞的相对数量。阴性对照由在分选前混合的相同细胞群体组成。每个数据点由三个生物学重复组成。与0.142%预先混合的细胞（背景）相比，共培养的细胞具有显著更多的RD(LM)-YFP/mCherry双阳性细胞(2.07%)。HJ9.3将双阳性细胞的百分比从2.07%降低至1.31%（图19H）。如通过FRET测量，这类似于该抗体对聚集的跨细胞传播的影响。如通过FRET和流式细胞术测量的该抗体在阻断传播中的效力差异最可能是由于用于测量该事件的两种技术之间的差异。
为了进一步监测HJ9.3抗体对聚集体跨细胞运动的影响，使用直接免疫荧光尝试限定HJ9.3/抗体复合体沉积的地点。在存在HJ9.3的情况下将RD(ΔK)-YFP细胞或未转染的细胞培养48小时。利用4% PFA固定细胞，利用0.25% TritonX-100透化，然后将其暴露于山羊抗小鼠Alexa 546标记的二级抗体中。非常少数量的HJ9.3/tau复合体存在于细胞内部。然而，发现绝大多数复合体在细胞外，主要结合在细胞膜上。该抗体装饰不存在于未转染的细胞中，表明信号对HJ9.3/tau复合体特异（图20）。因此，HJ9.3阻断tau聚集体吸收，将聚集体俘获在细胞外。
实施例7. Tau纤丝介导细胞-细胞传播
HJ9.3在传播测定中的活性产生了限定负责的tau种类的机会。HJ9.3用于从细胞培养基中提取tau。向表达多种RD构建体（wt、PP、ΔK、LM）的细胞的培养基中加入HJ9.3或对照IgG。在48小时时期开始或结束时加入抗体。收集培养基用于使用蛋白-G-琼脂糖珠亲和纯化抗体/抗原复合体。洗涤复合体，然后在SDS装载缓冲液中煮沸用于通过蛋白质印迹进行分析。HJ9.3特异地从细胞培养基中捕获tau RD种类，而IgG没有任何可见的影响（图21A）。当在培养阶段存在HJ9.3时，观察到在培养基中存在的tau蛋白的大约10倍增加，与该阶段结束时加入相反（图21B）。在RD(ΔK)-HA和RD(LM)-HA转染细胞的培养基中也注意到高阶分子量种类，其与RD聚集体一致。RD(PP)-HA tau具有最少的蛋白存在于培养基中，并且在蛋白质印迹上没有观察到任何高阶种类。先前所述实验的时间过程（0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时和48小时）显示在培养基中tau水平的时间依赖性增加，暗示HJ9.3温育的确增加了条件性培养基中存在的tau蛋白的稳态水平（图21C）。综上，这些数据表明HJ9.3通过干扰聚集体吸收到细胞中来阻断细胞-到-细胞的传播，并且与细胞内和细胞外的tau聚集体的稳态流一致。
介导跨细胞传播的tau种类的准确性质是未知的。因此，HJ9.3用于俘获这些种类用于经由AFM成像。在存在HJ9.3的情况下培养利用多种tau突变体转染的HEK293细胞。48后，利用蛋白-G琼脂糖珠纯化抗体/抗原复合体。然后在高盐缓冲液中从珠上洗脱复合体，并沉积在AFM芯片上用于成像。在表达RD(ΔK)-HA 和RD(LM)-HA的细胞的培养基中检测到明显的纤丝状种类，而RD(PP)-HA仅产生无定形聚集体（图21D），并且模拟转染的细胞不产生信号（数据未显示）。这些发现与游离的tau纤丝介导tau聚集通过其释放到细胞外空间中来介导跨细胞传播一致。
实施例8. 抗tau抗体在体内对tau病理的影响
在传播测定中测试针对全长重组人tau的两个额外抗体的活性。在存在和缺失靶向不同tau表位的不同单克隆抗体（HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4，图22A）的情况下将RD(LM)-CFP和RD(ΔK)-YFP细胞共培养48小时。针对Aβ肽的HJ3.4抗体用作阴性对照。所有三个抗tau抗体阻断了RD- tau的聚集前突变体在细胞之间的跨细胞传播（图22B）。阴性对照HJ3.4不阻断跨细胞传播。HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4通过ELISA也检测到了RD-tau纤丝（图22C）。
为了阻断tau聚集体在体内从细胞到细胞的传播，使用利用靶向tau上的不同表位的抗体的被动接种方法。使用Alzet渗透泵(2006型，图23A)通过脑室内注射将抗tau抗体HJ8.5和HJ9.3或媒介物各自输注到6个月龄大小的P301S tg小鼠的侧脑室中。将附着到Alzet泵装配上的大脑插管在前囱前后0.4mm、中线两侧1.0mm和背腹2.5mm的地方外科移植到各小鼠的左侧脑室中（图23B）。治疗后，通过甲酚紫染色验证插管的放置（图23C）。6周后替换Alzet渗透泵，并且在第84天结束实验。
为了证实实验设计不导致抗体降解和/或失活，在向小鼠大脑输注6周后从Alzet泵收集抗体并装载到SDS-PAGE凝胶上。首先通过考马斯亮蓝染料染色凝胶（图24A），然后使用在6周输注之前和之后从泵获取的抗体通过蛋白质印迹分析（图24B）。所有抗体在Alzet泵中体内生理温度下6周后均是稳定且有活性的。进一步证实，重组人tau蛋白与不同输注抗体的掺合（spiking）不干扰用于测量总tau的HJ8.7 – BT2B ELISA测定（图25）。
为了确定抗体治疗是否减少病理性tau染色，在利用Vehicle/PBS或抗tau单克隆抗体治疗的9个月龄大小的P301S tg小鼠的组织切片中评估tau染色。利用识别tau的异常磷酸化形式的生物素化AT8抗体染色梨状皮质的冠状切片。初步免疫组织化学数据的定量分析显示，异常磷酸化的tau装载在将HJ8.5和HJ9.3输注到小鼠大脑中后显著减少（图26和27）。这些影响的生物化学分析正在进行中。如果成功，针对tau传播和病理的被动免疫可以成为治疗阿尔茨海默氏病、额颞叶（fronto-termporal）痴呆或其他tau蛋白病的治疗手段。
实施例3-7的讨论
先前已经提出涉及聚集的模板构象变化和跨细胞传播的朊病毒样机制可以解释tau蛋白病和其他神经变性疾病的不断进行。这由蛋白聚集体从供体细胞释放，进入受体细胞，并直接接触天然折叠的蛋白以扩增错误折叠状态组成。然而，支持该tau蛋白病模型的机理性证据还不完整，并且tau错误折叠以这种方式的跨细胞传播先前未曾被证明。实施例3-7现在描述了tau聚集在培养细胞中经由分泌的tau聚集体跨细胞传播，并提出了可能的机制。首先使用X-34染色和提取材料的AFM证明的是RD tau纤丝在转染细胞中的自发形成。然后，使用共聚焦显微镜观察到的是来源于两个单独细胞的tau在细胞内内含物中的共存。这与在与表达蛋白的易于聚集形式RD(LM)-HA的细胞共培养后tau RD(ΔK)-YFP的增加的去污剂不溶性相关。在相同细胞内共表达的RD(LM)-CFP/YFP之间使用FRET还证明的是聚集的这种增加。这通过受体光漂白（显微镜）和光谱方法（FPR）检测。接下来使用的是在单独的细胞群体中表达的RD(LM)-CFP和RD(LM)-YFP之间的FRET，以证明传播通过直接的蛋白接触发生。然后扩展该方法以证明tau蛋白错误折叠在连续培养条件下在细胞群体内的扩增。tau聚集的跨细胞传播由直接释放到细胞外空间的纤丝介导，因为转移对细胞外容积敏感，条件性培养基可以增加细胞内聚集，并且抗tau抗体(HJ9.3)干扰细胞细胞传播，并且俘获细胞外tau纤丝。使用多种技术，申请人因此已经证明了经由模板构象变化的跨细胞聚集体传播并提出了简单的模型以解释这些现象（图29）。
跨细胞传播-尽管先前已经描述了聚集的tau在细胞之间的自发运动，但是tau蛋白聚集体是否与对细胞的间接影响相反，可以通过蛋白的直接接触而在细胞之间传播错误折叠状态是未知的。α-突触核蛋白的细胞培养研究也已经提示了传播，但是来源于供体细胞的种类（例如聚集体相对于二聚体相对于单体）和在受体细胞中形成的那些种类的性质是不清楚的。同样，SOD1聚集体可以在细胞之间经由培养基转移，以诱导进一步的聚集，但是负责蛋白构象异构体的精确性质和直接的蛋白-蛋白接触是否发生是不清楚的。向转基因小鼠脑中注射纯化的Aβ42和tau纤丝诱导内源tau的聚集，以及附近tau纤丝发生，但是难以通过注射的蛋白排除接种。来自申请人实验室以及随后来自其他人的工作已经证明了tau聚集体的运动和通过重组蛋白将聚集从细胞外诱导到细胞内。但是先前没有tau蛋白的研究曾证明真正的传播：聚集体从一个细胞运动到另一个细胞、与天然蛋白直接接触、蛋白在受体细胞中转化成纤维状态，和错误折叠种类的扩增。
本工作以若干方式证明了这些现象。首先，发现tau RD(LM)-HA的易于聚集形式与表达RD(ΔK)-YFP的细胞的共表达导致共定位在β-折叠阳性内含物中。接下来，观察到表达RD(LM)-HA的细胞与表达RD(ΔK)-CFP和RD(ΔK)-YFP的另一群体的共培养导致FRET信号的增加，提示RD(LM)-HA运动到表达FRET对的细胞中诱导其聚集。为了证明在细胞之间运动的tau聚集体的直接接触和共聚集，在单独群体中表达RD(ΔK)-CFP和RD(ΔK)- YFP。这产生来源于跨细胞运动和共聚集的FRET信号，如果构建体任一个含有双脯氨酸突变以阻断β-折叠形成，则其消失。还观察到通过转移RD-CFP聚集体诱导全长tau-YFP聚集，但效率降低（数据未显示）。最后，通过RD(LM)-HA表达细胞与表达RD(ΔK)-CFP的那些细胞的初步共培养显著增加了通过蛋白聚集体跨细胞运动诱导的FRET的效率，证明聚集状态可以在细胞群体内扩增。
Tau聚集体传播的抗体调节-针对Aβ肽的抗体（其主要在细胞外）可以在脑中防止Aβ聚集并去除现有的聚集体。尽管具有潜在的副作用，但是此类抗体作为治疗是有希望的。然而，在tau蛋白病和共核蛋白病的小鼠模型中接种成功由于靶标蛋白主要在细胞内的事实而一直是个困扰。观察到HJ9.3（针对tau- RD的小鼠单克隆抗体）抑制tau聚集的跨细胞传播。然而，该抗体对tau的细胞内聚集没有影响。细胞培养基长期暴露于该抗体中强烈增加了培养基中的稳态tau水平。这由流式细胞术研究证实，其表明HJ9.3阻断聚集体从一个细胞转移到另一个细胞中。最终，观察到在细胞表面上俘获的HJ9.3/tau复合体。该抗体的效果强烈提示，tau纤丝被释放到细胞外空间中，并且最初不通过在外泌体或隧道纳米管中细胞-细胞转移来传播错误折叠，如已经对朊病毒所提出的。此外，如果不被HJ9.3俘获，存在于细胞外的聚集体可能被再次吸收到细胞中。用于治疗抗体的多种抑制模式是可信的，包括解聚蛋白纤丝、阻断细胞内的转化，和促进细胞内降解。我们利用HJ9.3的结果与干扰细胞吸收作为可以用于阻断tau蛋白病的一种机制最一致，并且提示了新的方式来考虑开发和优化用于神经变性疾病的治疗抗体。
经由纤丝tau的跨细胞传播- HJ9.3阻断tau聚集传播的效用允许该抗体用于俘获所负责的种类。从条件性培养基中免疫亲和纯化tau揭示了纤维状tau。从对照细胞或表达β-折叠-抗性RD(PP)-HA的那些细胞（其产生无定形聚集体）中没有观察到培养基中的tau纤丝。RD(ΔK)- HA和RD(LM)-HA表达各自引起纤丝分泌到细胞外空间中。一个细胞中的蛋白质聚集体怎样影响周围细胞中的聚集是不清楚的，并且很可能的是细胞因子、外泌体或细胞之间的直接联系可以促进该过程。这些可能性不能被完全排除。然而，这些结果与游离的纤维状种类作为通过细胞外空间传播的介质最一致。本工作提示了若干重要问题的答案，所述问题是关于蛋白聚集体在培养中从一个细胞传播到另一个细胞，因而它们在体内是怎样做到这样的机制的。与本文所述的方法结合来监测跨细胞传播，其可以利用药理学和生物学试剂靶定该过程用于更有效地治疗tau蛋白病和其他神经变性疾病。
用于实施例1-8的方法
抗体
最长的小鼠重组tau同种型mTau40 (432 aa)和最长的人tau同种型hTau40 (441 aa)在Eva Mandelkow的实验室中产生并用作ELISA中的标准品。识别人和小鼠tau（残基218–225上的表位）的小鼠单克隆抗体Tau-5来自L. Binder的实验室(LoPresti 等, 1995;Porzig 等, 2007)。单克隆抗体HJ8.1和HJ9.3是在tau敲除小鼠(The JacksonLaboratory)中分别针对人tau和小鼠tau通过免疫产生的小鼠单克隆抗体。两个抗体通过免疫沉淀在蛋白质印迹上和在ELISA测定中均识别小鼠和人tau。HJ9.3识别tau的微管结合区(MTBR)。从Pierce获得也识别人和小鼠tau（残基194– 198上的表位）的小鼠单克隆抗体BT-2。从Abcam, Cambridge, MA购买针对tau（ab64193，定位在重复结构域区域中的表位）的兔多克隆抗体。从Covance, Emeryville, CA购买针对血凝素HA (HA.11 克隆 16B12)的小鼠单克隆抗体。从Santa Cruz Biotechnology购买兔多克隆GFP抗体(sc-8334)。
质粒
编码微管结合蛋白tau 的四个重复结构域（RD）的序列用于蛋白表达。除了野生型形式，产生多种tau突变体：ΔK280 Δ(K)；P301L/V337M (LM)；ΔK280/ I227P/I308P (PP)。将这些序列亚克隆到具有C末端血凝素（HA）标签的pcDNA3.1 (Invitrogen)中，或pEYFP-N1或pECFP-N1 (Clontech)中，以产生C末端荧光蛋白融合物。
动物
先前已经产生并表征了过表达P301S人T34同工型tau (1N4R)的P301S tg小鼠(PS19系)并且其为B6C3背景。从Jackson Laboratory获得P301S tg小鼠。从The JacksonLaboratory获得tau敲除小鼠。年龄和遗传背景匹配的非转基因小鼠同窝仔(littermates)用作野生型小鼠。在所有实验中，雄性和雌性均用于本研究中。
免疫沉淀和免疫印迹分析
免疫沉淀和免疫印迹分析。以1.0 μl/分钟持续15小时从P301S tau转基因小鼠和野生型小鼠中收集海马微透析样品。根据制造商的说明书通过包被有HJ8.1或HJ9.3 tau抗体的Dynabeads (Invitrogen)免疫沉淀ISF。将沉淀的部分装载到还原性4–12% Bis-Tris迷你凝胶(Invitrogen)上并转移到硝酸纤维素膜上。生物素化的BT-2抗体(Pierce)和Poly-HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(Thermo Scientific)用于消除沉淀的抗体的干扰。在补充有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco’s Modified EagleMedium (DMEM)中培养HEK293细胞。在37℃ ，5% CO2的湿润大气中维持培养物。为了瞬时转染，根据制造商的推荐，使用Lipofectamine/Plus试剂和600 ng适当的DNA构建体(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)转染在Optimem培养基中涂布的细胞，并在24小时或48小时后收集用于进一步的分析。
去污剂分馏和蛋白质印迹分析
以400,000细胞/孔在12孔板中涂布HEK293细胞。第二天，用600 ng质粒转染细胞。48小时后，在37℃下利用0.05%胰蛋白酶收集细胞3分钟，在7000 x g下短暂沉淀并在100μl含有蛋白酶抑制剂的PBS中的1% Triton中裂解。然后通过在14,000 x g离心10分钟收集可溶性胞质蛋白。通过在RIPA/SDS缓冲液中重悬浮沉淀并在benzonase核酸酶消化核酸后在20,000 x g离心15分钟来获得不可溶的蛋白。对于共培养实验，在收集和蛋白质印迹之前将RD(LM)-HA和RD(ΔK)-YFP转染的相等数量的细胞一起共培养48小时。使用4%-20%聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)；1:2000稀释的针对tau RD的抗体（其识别RD区域中的表位）(ab64193,Abcam, Cambridge, MA)和/或1:1000稀释的针对GFP的抗体(sc-8334, Santa CruzBiotechnology, Inc.)分析来自各部分的等量HEK293细胞蛋白提取物。进行基于化学发光的过氧化物酶缀合的二级抗体反应并通过X-射线底片检测。使用Image J分析软件进行定量。
共培养实验：通过FRET测量RD-CFP/YFP共聚集
以300,000细胞/孔在12孔板中涂布HEK293细胞。第二天，如上所述用600 ng质粒转染细胞。共转染的细胞接受150 ng RD-CFP构建体和450 ng RD-YFP构建体的组合。15小时后，在37℃下利用0.05%胰蛋白酶收集细胞3分钟，并将细胞的部分一式四份在96孔板中，或在ibidi μ-载玻片 (ibidi GmbH, Germany)上重新涂布用于通过显微镜成像。然后在利用4%的多聚甲醛固定和分析之前将细胞培养额外的48小时。
共培养实验：通过RD-HA测量RD-YFP聚集的诱导
在12孔板中利用RD(ΔK)-YFP或RD(LM)- HA转染HEK293细胞。15小时后，将细胞一起重新涂布到ibidi μ-载玻片上并共培养额外的48小时。然后将它们固定并用抗HA抗体和X-34染色用于通过显微镜分析。
共培养实验：共培养中的传播测定
利用300 ng RD(LM)-HA和300 ng RD(ΔK) –CFP一起，或利用RDΔ(K) – YFP共转染12孔板中的HEK293细胞的两个群体。15小时后，将等百分比的两个群体在96孔板格式中共培养48小时。然后利用4%的多聚甲醛固定细胞并使用荧光平板读取器(FPR)进行FRET分析。对于FRET显微镜分析，利用600ng RD(LM)-CFP或RD(LM)-YFP转染12孔板中的HEK293细胞的两个群体。15小时后，将等百分比的两个群体在ibidi μ-载玻片上共培养48小时。然后利用4%的多聚甲醛固定细胞并进行FRET受体光漂白。
共培养实验：连续培养中tau聚集的扩增
利用600 ng多种形式的非荧光RD-HA转染12孔板中的HEK293细胞并将其培养24小时。利用CFP或RD(ΔK) –CFP转染第二组细胞。然后将等百分比的第一个和第二个群体共培养48小时。此时，50%的该群体与RD(ΔK)-YFP转染的细胞群体在96孔板中进行平板培养48小时。然后用4%的多聚甲醛固定细胞用于使用FPR 进行FRET分析。
培养基转移和条件性培养基实验
利用600 ng的RD(LM)-HA转染12孔板中的HEK293细胞或利用150 ng 的RD(ΔK)-CFP构建体和450 ng的RD(ΔK)- YFP构建体的组合共转染。15小时后，在37℃下利用0.05%胰蛋白酶收集细胞3分钟。在多种量的细胞培养培养基中将相等数量的表达RD(ΔK)- YFP/CFP和RD(LM)-HA的细胞共培养48小时。然后利用4%的多聚甲醛固定细胞并进行FRET分析。对于条件性培养基实验，转染15小时后，用新鲜的培养基替换来自含有转染复合物的RD(LM)-HA细胞的培养基。在37℃下利用0.05%胰蛋白酶收集表达RD(ΔK)- YFP/CFP的细胞3分钟并重新涂布在96孔板中。24小时后，收集来自RD(LM)-HA转染的细胞的条件性培养基并将其加入到表达RD(ΔK)-YFP/CFP的细胞中。48小时后利用4%的多聚甲醛固定细胞并进行FRET分析。
荧光共振能量转移（FRET）测定：利用光漂白通过显微镜的FRET测量
制备用于如早期所述的共转染和共培养实验的转染HEK293细胞用于FRET受体光漂白显微镜观察。使用C-Apochromat 40x 1.2 NA 镜头 (Carl Zeiss Advanced ImagingMicroscopy, 07740 Jena, Germany 100 X (CFP )获得所有图像。使用Zeiss Axiovert200M上的Zeiss LSM510 Meta NLO 多光子/共聚焦激光扫描显微镜系统获取数字图像。用于成像的通道如下：使用458nm氩激光激发供体CFP并利用480-520nm带通滤波器收集荧光；使用514nm氩激光激发受体YFP并利用长波通560nm滤波器收集荧光。为了产生其中强度反映对FRET效率的估计的图像，从在逐个像素基础上光漂白后获得的最终CFP图像中扣减掉初始CFP图像的值，并且将该差异乘以100并除以最终的CFP图像强度：100 X (CFP最终 -CFP初始)/CFP最终。为部分受体光漂白做出适当的调整。使用NIH ImageJ 1.44软件完成图像算术和灰阶-彩图转化。
FRET测定：荧光平板读取器
根据先前描述的方法使用TecanM1000荧光平板读取器获得光谱FRET量度（FRET/供体）。当供体和受体不融合到同一个蛋白上时，光谱FRET量度依赖于对在细胞内表达的供体和受体蛋白的相对量的小心控制。首先针对模拟转染细胞背景扣除平板读取器上的所有值。各孔中的YFP信号(Smpl485ex/528em FRET )用于评估RD-YFP表达水平，并且其同样假设在实验条件下RD-CFP/YFP并不独立变化。这帮助消除表观FRET中的变化是简单地由于RD表达水平的变化的可能性。通过确定受体的“交叉活化”部分X校正受体活化(528nm)通过供体激发信号(435nm)对总FRET量度的相对贡献，其中X=在435ex/528em 测量的RD-YFP信号除以在485ex/528em测量的信号。该“交叉活化”在实验中遇到的RD-YFP的不同表达水平之间基本上恒定。在435ex/528em处记录各样品中的“测量的”FRET值，在435ex/485em处记录“供体”值(CFP)。各孔的“实际”FRET/供体值然后反映为：
。
通过FRET测量蛋白聚集的这种方法已经可靠地允许检测响应药理学的细微变化以及遗传操作雄激素受体和huntingtin蛋白聚集，其通过视觉和生物化学分析得到证实。因为所测量的光谱FRET的相对量依赖于受体：供体的比例，当RD-CFP和RD-YFP在同一个细胞内共表达时使用3:1的恒定比例。这提供近乎最高的FRET效率，同时在供体信号的测量中允许可接受的信噪比。
原子力显微镜检查术(AFM)
从转染的HEK293细胞中提取RIPA不溶性蛋白并将其在mica芯片(Ted Pella, Inc)上温育10分钟。然后用100μl ddH2O冲洗样品两次并在室温下保持至干燥。第二天，使用MFP-3D原子力显微镜(Asylum Research)进行原子力显微镜检查术。
免疫荧光和共聚焦显微镜检查术
制备被转染用于早期所述共培养实验的HEK293细胞用于免疫荧光和X-34染色。在4%的多聚甲醛中室温固定15分钟后，在PBS中室温（RT）下将细胞洗涤两次5分钟，并在PBS中的0.25% Triton X-100中室温下透化10分钟。利用PBS中含有1%正常山羊血清、20 mg/mlBSA、0.25% Triton X-100的封闭溶液在室温下封闭细胞3小时。在封闭溶液中将针对HA(Covance, Emeryville, CA)的一级小鼠单克隆抗体1:2000稀释并在4℃过夜应用于细胞。然后用含有0.1% Triton X-100的PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，并将其与在封闭溶液中以1:400稀释的抗小鼠Alexa546-缀合的二级抗体(Invitrogen)温育。然后用含有0.1%Triton X-100的PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，并将其在室温下暴露于在40%乙醇、60% PBS和20 mM NaOH的溶液中制备的1 μM X-34中10分钟。然后在40% EtOH, 60% PBS中洗涤细胞3次，每次2分钟并利用1X PBS冲洗两次，每次5分钟。使用共聚焦显微镜(405 ConfocalMicroscope-Zeiss)捕获图像。为了表征HJ9.3抗体阻断传播的机制，利用RD(ΔK)-YFP转染或模拟转染HEK293细胞。在存在HJ9.3的情况下培养RD(ΔK)-YFP细胞或模拟转染的细胞48小时后，利用4% PFA固定细胞，利用0.25% TritonX-100透化，然后将其暴露于山羊抗小鼠Alexa 546标记的二级抗体中。使用共聚焦显微镜(Confocal Microscope- Zeiss)捕获图像。
碘化丙啶(PI)细胞死亡测定
在96孔板中以75,000细胞/孔涂布HEK293细胞。第二天，利用100 ng多种形式的非荧光RD-HA质粒一式四份转染细胞或将其暴露于没有DNA的转染复合物中。接下来的一天，去除含有转染复合物的培养基，并利用新鲜的培养基替换。利用多种浓度的十字孢碱(1、2、4、20μM)在37℃处理未转染的细胞30分钟作为细胞死亡的阳性对照。然后去除十字孢碱溶液并将所有细胞在37℃暴露于5 μg/ml碘化丙啶中10分钟。然后用不含苯酚的培养替换碘化丙啶溶液并在平板读取器上在535nm激发和617 nm发射上读取荧光。
免疫沉淀
转染的细胞群体单独或在存在小鼠单克隆抗体HJ9.3（1:1000，其等于2.5 ng/μl抗体）或合并的小鼠IgG抗体的情况下共培养3小时、6小时、9小时、12小时、24小时或48小时。收集条件性培养基并向所述培养基中加入蛋白-G-琼脂糖珠（来自Pierce的100 μl的50%珠浆液）并在4℃旋转温育过夜。18小时后，向样品中加入500 μl 的结合缓冲液(Pierce)并在2000 x g下离心3分钟。去掉上清液，并且将该洗涤步骤重复3次。然后使用高盐洗脱缓冲液(50μl)，在室温下温育5分钟来洗脱结合珠的蛋白。样品然后在2000 x g下离心3分钟并收集上清液。重复该洗脱步骤一次，用于总的100μl洗脱液。开始不暴露于HJ9.3或IgG的条件性培养基的另一样品与HJ9.3 (1:1000)或IgG抗体在4℃旋转温育过夜，随后是如上所述相同的免疫沉淀方案。在4-20%聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上分析所有条件下的样品并利用在TBS/Tween中5%奶粉中以1:2000稀释的针对tau RD的兔多克隆抗体(ab64193, Abcam,Cambridge, MA)进行检测。进行基于化学发光的过氧化物酶缀合的二级抗体反应并通过X-射线底片进行检测。
流式细胞术
将HEK293细胞在~80%汇合时涂布在10-cm平板中。然后利用24 μg的RD(LM)-YFP构建体转染细胞或利用mCherry慢病毒转导细胞。第二天，利用0.05%胰蛋白酶在37℃处理3分钟来收集细胞，沉淀并重悬浮在新鲜的培养基中。两个细胞群体单独或在存在以1:1000或1:10,000稀释的针对Tau-RD的小鼠单克隆抗体HJ9.3的情况下共培养48小时（1:1000等于2.5ng/μl抗体）。在此之后，收集细胞并重悬浮在含有1% FBS和1mM的EDTA的Hanks平衡培养基中。仅在流式细胞术之前预先混合的细胞用作阴性对照。使用MoFlo高速细胞分选仪(Beckman Coulter)计数细胞并对每一种条件分析双阳性细胞的百分比。每种条件具有三个生物学重复，每种实验条件中分析50,000个细胞。
脑室内(ICV)注射抗tau单克隆抗体
表达P301S人T34同工型(1N4R)的P301S tau转基因小鼠用于本研究中。在6个月龄时，这些小鼠发生了tau病理。因而，在6个月龄时通过脑室注射将抗体输注到左侧脑室内并且进行这些输注12周。处理后，处理小鼠脑用于通过ELISA和免疫印迹的免疫组织化学和生物化学分析。
使用Alzet渗透泵2006型进行脑室内注射。将附着到Alzet泵装配上的脑插管在前囱前后0.4mm、中线两侧1.0mm和背腹2.5mm的地方外科移植到各小鼠的左侧脑室中。处理后，通过甲酚紫染色验证插管的放置。
实施例9-15的介绍
Tau是微管结合蛋白，其在统称为tau蛋白病的若干神经变性疾病中形成细胞内聚集体。这些包括阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底核变性(CBD)和额颞叶痴呆(FTD)。Tau是高度可溶性的且天然未折叠的蛋白，其结合并促进微管的装配。在tau蛋白病中，tau在超磷酸化的神经原纤维缠结(NFTs)中积累，其在适当染色后，在营养障碍性神经突和细胞体内可见。在人和转基因小鼠模型中，tau病理的量与进行性神经功能障碍和突触丧失，以及功能性下降相关。
在人tau蛋白病中，病理以疾病特异的模式从一个脑区域进展到另一区域，尽管潜在机制仍不清楚。朊病毒假说支持tau聚集体从起源细胞逃逸以进入邻近细胞，其中它们接种进一步的tau聚集并传播病理。本发明人先前已经观察到，重组tau纤丝将在培养细胞中诱导全长细胞内tau的聚集，并且tau的聚集形式在细胞之间转移(Frost 等, 2009; NatRev Neurosci 11, 155-159)。此外，本发明人发现，细胞内tau纤丝自由地释放到培养基中，其中它们通过与受体细胞中的天然tau直接相互作用而传播聚集。抗tau抗体(HJ9.3)通过防止tau聚集体被吸收到受体细胞中而阻断该过程(Kfoury 等, 2012; J Biol Chem287, 19440-19451)。除利用重组tau的类似实验外，已经显示来自AD脑的成对螺旋丝诱导胞质tau聚集。将来自人P301S tau转基因小鼠的脑提取物注射到表达野生型人tau的小鼠的脑中诱导野生型人tau装配成丝并扩散病理。类似的影响发生在注射重组全长或截短的tau纤丝后，其引起以时间依赖性方式从注射位点传播到相连的脑区域的NFT样内含物的快速诱导。最后，内嗅皮质中的选择性tau表达在齿状回和海马体中的细胞中的轴索末端区中引起晚期病理，其与聚集体的跨突触运动一致。越来越多的工作支持这样的想法，即tau聚集体在细胞之间转移，并且可能被治疗性抗体靶定。
在模拟AD和帕金森氏病(PD)的方面的小鼠模型中，使用针对Aβ和α突触核蛋白的抗体的被动免疫可以减少Aβ和α突触核蛋白在脑中的沉积，并改善行为缺陷。在使用tau磷酸肽的tau蛋白病小鼠模型中主动免疫减少了tau病理并且在一些研究中改善了行为缺陷。然而，在一项研究中，利用全长重组tau主动免疫C57BL/6野生型小鼠诱导了tau病理和神经缺陷。在两项被动接种研究中，当在病理开始前给予抗体时，tau病理减少并且运动功能改善。尽管若干tau免疫研究看起来具有一些有益效果，但是病理开始后施用的抗tau抗体的最大预期效力、针对靶标的最佳tau种类，和治疗效果的机制仍然未知。
实施例9. 抗tau抗体的表征
本发明人先前已经观察到，tau聚集体，而非单体被培养细胞吸收，并且内化的tau聚集体在受体细胞中触发细胞内tau聚集(Frost 等, 2009; Nat Rev Neurosci 11, 155-159;Kfoury 等, 2012; J Biol Chem 287, 19440-19451)。在Kfoury 等 (2012; J Biol Chem287, 19440-19451) 先前所述的适合细胞生物感受器系统中表征8个小鼠单克隆抗体（针对全长人tau产生）的HJ8系列和5个抗体（针对全长小鼠tau产生）的HJ9系列，所述系统测量通过加入含有tau聚集体的脑裂解物诱导的细胞tau聚集。抗体在阻断接种中具有多种效果，尽管事实是所有抗体均有效地结合tau单体并染色神经原纤丝缠结。选择了在阻断接种中具有不同效力的三种抗体用于本文呈现的研究。
在体内测试之前，确定抗体（其全部为IgG2b同种型）的结合亲和力和表位。将人和小鼠tau固定在传感器芯片CM5上用于表面等离子共振(SPR) (图30)。针对小鼠tau产生的HJ9.3抗体以相同的结合常数(KD = Kd/Ka = 100 pM)识别人(图30A)和小鼠(图30B)tau(图30G)。通过使用BIAevaluation软件(Biacore AB)，选择Fit 动力学同步Ka/Kd (Global拟合) ，以1:1 (Langmuir)相互作用模型计算结合(Ka)和解离(Kd)。HJ9.3对人(Ka = 7.5 x104 Ms-1, Kd = 7.5 x 10-6 s-1)和小鼠tau (Ka = 8.6 x 104 Ms-1, Kd = 9.1 x 10-6 s-1)的Ka 和Kd表明对两者的强结合。将HJ9.3的表位定位到氨基酸306-320之间的重复结构域(RD)区。针对小鼠tau产生的HJ9.4以高的结合速率常数(Ka = 2.28 x 105 Ms-1)和非常低的解离常数(Kd = 5.1 x 10-7 s-1)对小鼠tau具有高亲和力KD (2.2 pM) (图30D和表4)。然而，同一个抗体对人tau具有低得多的亲和力(KD = 6.9 nM) (图30C和表4)，其中结合速率常数(Ka = 1.5 x 105 Ms-1)与对小鼠tau的类似，但解离(Kd = 1.07 x 10-3 s-1)快得多。因此，HJ9.4与人tau的相互作用比与小鼠tau的相互作用更不稳定。该抗体的表位是氨基酸7-13。HJ8.5针对人tau产生。其结合人tau (图30E)但不结合小鼠tau (图30F)。KD(0.3 pM) (图30E和表4)和低的解离速率(Kd = 4.38 x 10-8 s-1)表明HJ8.5以非常高的亲和力结合人tau。将HJ8.5的表位定位到氨基酸25-30上。所有3个抗tau抗体在SPR上强烈地识别人tau纤丝(图31)。因为纤丝具有多个相同的表位，所以不能直接计算结合和解离速率。
表4 每个抗体对人和小鼠tau的结合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和结合常数(KD)。BIAevaluation软件(Biacore AB)通过选择Fit动力学同步Ka/Kd (Global拟合)，利用1:1 (Langmuir)相互作用模型来计算Ka和Kd。Ms-1=毫秒，M=摩尔，s=秒。
还通过免疫印迹和免疫染色评估抗体。在蛋白质印迹上，所有3个抗体均结合人tau(图30H)。HJ9.3和HJ9.4均结合小鼠tau，而HJ8.5并不结合(图30G)。与本发明人之前的发现一致(Yamada 等, 2011; J Neurosci 31, 13110-13117)，与3个月龄大小的P301S小鼠相比，在9个月龄大小的P301S小鼠中看起来有更少的重组缓冲液(reassembly buffer,RAB)可溶性tau。还发现，HJ8.5在3个月龄和9-12个月龄大小的转基因P301S小鼠脑中染色人tau。Tau免疫反应性存在于整个细胞体和过程中(图32)。在具有tau聚集体的9-12个月龄大小的P301S小鼠中，HJ8.5在细胞体中检测到tau聚集体(图32)。其他抗体产生类似的结果(表 5)。所有抗体在AD脑中结合神经原纤维缠结和神经纤维网线(图32)。
实施例10. Tau抗体阻断P301S tau聚集体的吸收和接种活性
为了评价在P301S脑裂解物中存在的接种活性，适用本发明人先前描述的细胞生物传感器系统(Kfoury 等, 2012)。这基于融合蓝绿色或黄色荧光蛋白质的含有∆K280突变的tau的重复结构域(aa 243–375) (RD(∆K)-CFP /YFP)的表达。将外源聚集体吸收到这些细胞中触发RD(∆K)-CFP/YFP的细胞内聚集，其通过在荧光平板读取器上记录的荧光共振能量转移(FRET)检测。向生物传感器细胞系统中加入来自12个月龄大小的P301S小鼠的澄清的脑裂解物诱导RD(∆K)-CFP/YFP报告物的强聚集，表明tau 接种活性的存在(图33A)。来自12个月的(12-mo) P301S脑匀浆小鼠的接种活性粗略地对应于50 nM（单体等同量）的重组全长纤丝（数据未显示）。
存在很少或没有通过来自tau敲除小鼠、野生型小鼠或缺少tau病理的3个月龄大小P301S小鼠的裂解物诱导的聚集(图33A)。评估抗tau抗体(HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4)其阻断这些裂解物的吸收和接种活性的能力。HJ3.4 (小鼠单克隆抗Aβ 抗体)是阴性对照。抗tau抗体有效地阻断接种活性(图33B)。为了确定其相对效力，针对固定量的P301S脑裂解物滴定抗体(0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml) (图33C)。与对照相比，HJ8.5抗体在低至0.25 µg/ml的浓度时阻断接种活性。与对照相比，在0.5 µg/ml时，HJ8.5和HJ9.3抗体显著阻断吸收和接种活性。HJ9.4在阻断吸收和接种活性中效力最差，这与其对小鼠tau的较高亲和力一致。所有3个抗tau抗体均检测到被HEK293细胞吸收后内化的tau聚集体，如通过post-hoc细胞透化和染色所检测的。然而，当这些抗体与P301S脑裂解物和不与P301S脑裂解物预先温育时，在利用抗小鼠二级抗体染色后在细胞内没有检测到任何这些抗体(图34)。尽管其他抑制方式是可能的，但是这些数据与基于阻断细胞吸收tau聚集体的机制一致。
实施例11. 抗tau抗体的脑室内输注
在小鼠群体中，P301S小鼠在5 个月龄开始时首次发生了细胞内tau病理。为了测试通过长期脑室内(ICV)施用3种抗体的效力，将插管外科移植到6个月龄的每只小鼠的左侧脑室内并通过Alzet皮下渗透小泵连续输注抗tau抗体3个月(图35A)。抗Aβ抗体HJ3.4和磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作阴性对照。6周后，每个泵用充满新鲜抗体溶液或PBS的一个泵替换。在脑解剖时，通过甲酚紫染色验证每只小鼠左侧脑室中的插管放置(图35B)。仅插管正确放置的小鼠包括在分析中。为了测试6周后抗体在体内的稳定性(图35A)，从动物去除后收集残留的泵内含物，并使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估抗体。轻链和重链是完整的，没有片段化，并且在蛋白质印迹上保留tau结合活性（数据未显示）。为了评估输注过程中CSF和血清中抗tau抗体的浓度，施用生物素化的HJ8.5 (HJ8.5B)48小时(~7.2 µg/天) (图35A)。CSF中游离HJ8.5B的浓度是7.3 µg/ml，在血清中是6.2 µg/ml，表明了抗体从CNS到外周的显著清除(表 6)。也在CSF和血清中检测到结合人tau的HJ8.5B，尽管浓度比游离抗体的低(表 6)。
实施例12. 抗tau抗体处理减少异常磷酸化的tau
为了确定3个月处理后P301S小鼠中tau病理的程度，进行tau病理的多次染色。首先通过利用抗磷酸tau抗体AT8的免疫染色评估脑切片(图36)。AT8结合小鼠和人tau的磷酸化残基Ser202和Thr205(图36)。在利用PBS和HJ3.4处理的小鼠中，AT8强烈地染色多个脑区域，特别是梨状皮质、内嗅皮质、杏仁核和海马体中的神经细胞体和神经毡(图36A和36B)。HJ8.5处理强烈减少了AT8染色(图36C)，尤其是神经毡中的。HJ9.3和HJ9.4也降低了AT8染色，但效果稍微弱一些(图36D和36E)。梨状皮质(图37A)、内嗅皮质(图37B)和杏仁核 (图37C)的中AT8染色的定量分析证明在所有抗tau抗体处理的小鼠中的磷酸tau强烈但可变的减少。HJ8.5抗体显著地减少了梨状皮质、内嗅皮质和杏仁核中的AT8染色。HJ9.3与HJ8.5相比具有稍微降低的效果，并且HJ9.4在内嗅皮质和杏仁核中，但不在梨状皮质中具有明显的效果(图37)。海马体相对于主要是细胞体中的其他脑区域展示多得多的可变AT8染色，并因此在处理相对于对照组中没有统计差异(图37D)。因为已经报道了雄性P301S小鼠比雌性小鼠具有更多的tau病理，所以也评估性别和处理的影响（图38）。除了处理的影响，在雄性小鼠中分析的所有脑区域中存在显著更多的AT8染色(表 7)。然而，抗体的效果仍然高度明显并且在对性别调整后实际上相同(表 8)。也分别比较了雄性和雌性中处理组相对于对照，并且抗体HJ8.5的效果保持最显著(图38A和38B)。
实施例13. 多次染色方式的相关性
为了测试tau淀粉样沉积，硫磺素S(ThioS)用于染色脑切片(图39)。使用在所有对照和抗tau抗体处理的小鼠中给出从1（没有染色）到5（最强染色）的评分的盲评者半定量评估ThioS染色。通过半定量评估，与PBS和HJ3.4相比，HJ8.5处理显著减少ThioS染色(图39A 和39B)。也利用识别tau磷酸残基Ser396 和Ser404的PHF1单克隆抗体染色利用PBS、HJ8.5和HJ9.3处理的小鼠（每组n= 6）。显示针对不同tau表位的2个抗磷酸tau抗体的显著相关的AT8和PHF1染色(r = 0.630, p = 0.005) (图40A)给出了类似的结果。
许多神经变性疾病，包括tau蛋白病在蛋白聚集和细胞损伤周围的脑区域中展示小胶质活化。在处理组中使用抗CD68抗体评估小胶质活化(图41)。与对照相比，HJ8.5和HJ9.3处理减少了梨状皮质、内嗅皮质和杏仁核中的小胶质活化(图41A-41D)。与HJ8.5和HJ9.3相比，HJ9.4在梨状皮质中具有较弱的影响(图41C-41E)，这与AT8染色结果一致(图37A)。小胶质活化在所有样品中与AT8染色强相关(r = 0.511, p = 0.0038) (图40B)。
实施例14. 抗tau抗体减少去污剂不溶性tau和接种活性
为了确定皮质中可溶性和不溶性tau的水平， 进行利用RAB（水性缓冲液）、放射性免疫沉淀测定（RIPA）（去污剂缓冲液）和70%甲酸（FA）的连续生物化学提取以溶解最终的沉淀。通过ELISA，利用以相同KD (0.34 pM)检测人和小鼠tau的抗tau抗体HJ8.7来定量总的tau。在分析之前通过利用这些抗体掺合阳性对照样品并观察没有干扰来排除处理抗体会干扰ELISA的可能性（数据未显示）。分析在图37中通过病理分析评估的所有小鼠。RAB (图42A)或RIPA (图42B)可溶性部分中总tau水平在所有组之间类似。在ELISA和蛋白质印迹之前通过中和样品分析去污剂不溶性/70% FA可溶性部分。分析所研究的每只动物，并发现HJ8.5和HJ9.3相对于对照降低了去污剂不溶性tau >50%（图42C）。代表性样品（每组n=4）通过蛋白质印迹阐明了在利用HJ8.5和HJ9.3处理的小鼠中不溶性tau的降低水平(图40C)。不溶性tau水平在HJ9.4处理组中相对于PBS或HJ3.4处理组没有差异。还在N=6小鼠/组中的去污剂不溶性/ 70% FA可溶性部分中特异地评估人和小鼠tau，在所述组内平均AT8染色反映了图37中结果的平均值。在70% FA可溶性部分中人tau显著高于小鼠tau，并且抗体显著减少了该部分中的人而非小鼠tau(图42D和42E)。在这些相同样品中，通过ELISA评估AT8免疫反应信号的水平。AT8信号在抗体处理的样品中较低(图42F)，与在该部分中看到的总tau类似。
猜测脑中tau聚集的减少与接种活性的减少相关。因此，细胞生物传感器测定用于在来自不同处理组的皮质RAB可溶性部分中测试P301S脑接种活性。本发明人在P301S小鼠中评估ISF tau的前期数据提示细胞外tau聚集体的可能存在与tau的生物化学可溶性和不溶性池处于平衡(Yamada 等, 2011; J Neurosci 31, 13110-13117)。首先，利用来自PBS或HJ3.4处理的小鼠的裂解物处理细胞后评估RD(∆K)-CFP/YFP的细胞内聚集。来自这些组的裂解物强烈地诱导FRET信号(图43A)。在来自HJ8.5和HJ9.3处理的小鼠的皮质组织的裂解物中观察到明显更低的接种活性(图43A)。这不是由于脑裂解物中的残留抗体，因为脑裂解物的免疫沉淀后接接种活性从抗体/珠复合体上洗脱产生了相同的模式(图43B)。因此，HJ8.5和HJ9.3减少了P301S tau转基因小鼠脑中的接种活性。HJ9.4 没有显著减少接种活性(图43A)。接种活性与ELISA检测的去污剂不溶性/甲酸可溶性tau的量强相关(Pearson’sr = 0.529, p = 0.0001) (图43C)，但不与RAB部分中总tau相关(图43D)。猜测接种活性是由于RAB可溶性部分中存在的tau聚集体。为了测试这一点，进行半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)，随后进行蛋白质印迹。除了tau单体，观察到更高分子量tau种类存在于3个月龄大小的P301S小鼠中，并且更多量存在于9个月龄大小的P301S小鼠中(图43E)。这些更高分子量种类的组分很可能构成了在FRET测定中检测到的接种活性并且可能与去污剂不溶性/甲酸可溶性部分中存在的tau处于平衡。
实施例15. 抗tau抗体恢复关联恐惧缺陷
在9个月龄的P301S Tau转基因小鼠的研究中，在多种行为方面比较对照和抗tau抗体处理组。所述组在运动能力、探索或感觉运动测量中没有差异(图44)。通过评估小鼠在条件性恐惧过程上的表现来评估抗tau抗体处理在P301S小鼠中恢复认知缺陷的能力。第1天，所有4个小鼠处理组在训练室中第一个两分钟内展示相似的基线凝滞水平。这通过rmANOVA证实，其不能揭示任何显著的涉及处理的总体主要影响或相互作用 (图45A)。此外，所有4个组在音调-电击 (T/S) 条件性刺激-非条件性刺激(CS-US)配对过程中显示类似的凝滞水平(图45A)。通过处理的非显著性影响和通过分钟相互作用的非显著性基因型证明了3个T/S配对中组之间的凝滞水平的总体差异缺乏。
与第1天测试过程中组之间缺少差异相反，在两个抗tau抗体组和PBS+HJ3.4对照小鼠之间，第2天进行的关联恐惧测试(contextual fear test)（联想学习的形式）的凝滞水平(freezing levels)具有明显的差异(图45B)。随后设计的比较表明，与PBS+HJ3.4对照组相比，HJ8.5小鼠显示显著升高的凝滞水平，其在8分钟测试阶段是平均水平(图45C) [F(1,45)=8.30, p=0.006]，如HJ9.4小鼠显示较低水平[F(1,45)=5.60, p=0.022]。因此，HJ8.5看起来在保持联想学习中具有较强的整体影响。
实施例9-15的讨论
Tau蛋白病的发病机理的一个模型支持一个细胞中产生的聚集体逃逸或释放到细胞外空间中以促进邻近或相连细胞中的聚集。观察到，从脑裂解物中选择特异阻断tau 接种活性的治疗抗体预测如果不强于主动或被动tau接种的先前报道，至少一样强的有效体内应答。以对细胞外tau聚集体的存在敏感的细胞生物传感器测定开始实验。发现来自P301S转基因小鼠的脑裂解物含有接种活性，其可以诱导进一步的细胞内聚集。筛选一组抗tau抗体后，选择在阻断tau 接种活性中有可变活性的3种抗体。将这些抗体在病理已经起始时（6个月）在三个月内经ICV输注到P301S tau蛋白病小鼠中。输注抗体产生在CSF和血清中存在的可估计浓度的抗体，这与抗体从CNS流出进入外周的先前报道一致。利用体外最有效的抗体HJ8.5进行处理显著地减少了tau病理，强烈地降低了来自神经毡的tau病理。利用多个独立品系，生物化学分析不溶性tau，并通过分析脑裂解物中存在的残留tau 接种活性来检测该影响。此外，该处理改善了在该模型中检测到的一种行为缺陷。所有抗体阻断tau聚集体吸收到细胞中，并且在测定中，在存在或缺少细胞外聚集体的情况下，在细胞内没有观察到tau聚集体。这些抗体的效力暗示了细胞外tau在神经病理学的发病机理中的明确作用，先前认为这是细胞自发性的。此外，本工作扩展了本发明人的前期发现，其提示聚集体流可能发生在细胞内病理环境中，提出了可以通过靶向细胞外种类帮助聚集体清除的疗法的可能性。最后，本工作对设计治疗性抗体具有重要的暗示，并且提示靶向接种活性可以特别产生最有效的试剂。
基于机制的抗体疗法 针对tau的若干前期主动和被动外周免疫疗法方法也已经减少了tau病理并改善了行为缺陷，但是抗体选择的潜在合理性基于磷酸表位、与神经原纤维缠结的反应性，或者没有说明。通过利用全长tau接种小鼠进行的一项tau免疫研究在野生型小鼠中诱导病理。然而，在tau转基因模型中利用磷酸tau肽的随后主动免疫方法减少了tau病理并显示行为改善。在被动免疫研究中，在2-3个月龄时，在tau蛋白病开始前，经腹膜内向JNPL3 tau转基因小鼠施用PHF1抗体。PHF1靶向异常磷酸化tau的病理学形式。处理减少了tau病理并改善了行为。然而，尽管其降低了不溶性磷酸化tau，但是总的不溶性tau没有改变。在另一项被动免疫研究中，经外周向JNPL3和P301S小鼠（在2-3个月龄时，在tau蛋白病开始前）施用PHF1或MC1抗体，其靶向聚集体结合的表位。两种处理均改善了tau病理并延迟了运动失调的开始。在这些前期研究中，抗体的作用机制不清楚，并且没有明确测试过任何一项。确实，一些提出了细胞内机制。此外，没有研究看起来已经产生了在本文提供的实施例中描述的tau病理的大幅减少，其中说明将抗体输注到CNS中，而其他研究利用外周输注；并且利用不同的动物模型。
该研究被明确设计以测试细胞外tau种子是发病机理的关键组分的预测。研究以挑取能够在体外阻断tau 接种的抗体的选择方法开始，目的性地测试具有预测活性范围的试剂。在体内测试的所有抗体有效地阻断聚集体吸收和接种，为其所观察到的活性提供了基础。此外，抗体亲和力、表位、同种型、糖基化和结合tau磷酸化形式的能力的相关性对在未来研究中进行评估可能重要。这也是报道抗tau抗体的直接CNS内输注的效果的第一项研究。尽管事实是所利用的抗体各自靶向不同的tau表位并且不靶向磷酸tau，但是3种抗体中的2种在免疫组织学和生物化学上强烈地减少异常的tau装载，并且2种显著地改善记忆力，一种比其他提高到更高的程度。对tau病理的影响也与固有的接种活性减少真正相关。
HJ8.5和HJ9.3在体内强烈地降低了病理性tau种子。Tau病理的强烈减少可能通过防止邻近细胞中tau聚集的诱导而发生。尽管HJ9.4不有效地降低病理，但是其在杏仁核中降低tau病理。在不同脑区域中抗体间有效性的变异可能是由于区域特异性聚集体构象异构体的形成，抗体在对其结合亲和力中具有微小的差异。
一旦细胞外tau聚集体在体内被抗tau抗体隔离，其代谢命运尚不清晰。抗体施用3个月后，发现了减少的小胶质活化，这可能是由于较少的tau相关病理和神经变性。然而，这可能是由于更有效的细胞外聚集体清除，相关小胶质活化的减少。还已经注意到利用抗Aβ抗体的几个月被动免疫减少了小胶质细胞增生。抗体/tau复合体在体内被清除的机制和它们降低tau病理的机制需要被明确阐明。已经提示，利用抗α-突触核蛋白抗体的免疫通过促进溶酶体降解清除α-突触核蛋白聚集体。利用抗α-突触核蛋白抗体的近期研究显示抗体主要通过小胶质，推测通过Fc受体靶向α-突触核蛋白清除。神经元表达Fcγ受体，并且可能能够内化与抗原通过高亲和力FcγRI受体络合的IgG。内化的tau抗体也可能在内体中接触tau并最终通过内体/自噬-溶酶体系统诱导细胞内tau聚集体的清除。尽管本文所述研究中使用的抗tau抗体可以结合细胞外tau装配，但是没有发现在细胞内明显定位的证据。 然而，这并不排除细胞在体内吸收抗体/tau复合体以影响tau聚集体清除以及炎症的可能性。例如，近来已经显示，与病毒络合的抗体可以结合胞质IgG受体TRIM21，将抗体/病毒复合体靶向蛋白酶体。此外，显示结合TRIM21的抗体活化免疫信号传递。尽管还未显示抗体/非感染性抗原复合体与TRIM21的相互作用，但是确定该机制是否与抗tau抗体相关可能是有趣的。有趣的是，在tau蛋白病的P301S模型中也有证据表明先天性免疫系统在明显的tau病理发生之前被活化，并且早期免疫抑制减弱了tau病理。抗体捕获炎症诱导的tau聚集体，减少随后的聚集体诱导的炎症和疾病进展是可能的。
细胞外tau和tau病理的扩散 本文呈现的工作隐含地测试了细胞外tau在发病机理中的作用。现在非常清楚的是，细胞外tau聚集体可以触发细胞内天然tau的纤丝形成，无论其来源是重组蛋白还是从哺乳动物细胞中提取的tau。基于我们的前期工作，最初猜测游离tau聚集体（即非膜包被的）的作用是跨细胞传播的中间体，在所述前期工作中向细胞培养基中加入的HJ9.3阻断内化，并免疫沉淀游离的纤丝(Kfoury 等, 2012; J Biol Chem287, 19440-19451)。
在动物模型中，tau聚集体显然可以从一个区域扩散到另一个区域中（例如从内嗅皮质到齿状回和海马体下游的神经元）。本发明人已经发现，单体tau甚至在非病理状况下在体内仍然不断释放到脑间质液中(Yamada 等, 2011; J Neurosci 31, 13110-13117)。本发明人还发现外源聚集体将减少可溶性ISF tau的水平，提示接种和/或隔离现象可以在该空间中发生(Yamada 等, 2011; J Neurosci 31, 13110-13117)。综上，充足的证据支持细胞外tau聚集体形成并且可以被附近细胞、相连细胞吸收，或可能回到同一个细胞中，由此增加蛋白错误折叠负担的概念。该证据产生了清晰的预测：捕获细胞外接种活性的疗法应该改善疾病。本文呈现的实施例中描述的发现与该想法一致。
Tau流在发病机理中的作用 无法事先预测，通过朊病毒启动子在实际上所有神经元中驱动突变体tau表达的小鼠模型，如P301S应该受益于阻断聚集跨细胞传播的抗体处理。理论上，病理可以在表达该易于聚集的蛋白的所有神经元中独立地发生。然而，本发明人在组织培养中的前期工作提示tau聚集体流的作用，因为向细胞培养基中加入的HJ9.3增加了聚集体随着时间流逝的稳态水平。尽管聚集体流的模型需要进一步的测试，但本文呈现的结果与该想法一致，因为抗体处理显著减少了细胞内tau病理。预测阻断tau吸收的抗体可以在细胞外空间中产生“池(sink)”，其可以通过另一机制，可能涉及小胶质促进清除。
治疗抗体和靶向接种活性 制药工业投入了越来越多的努力来开发靶向在细胞内积累的易于聚集的蛋白的治疗抗体。主要标准是抗体将结合已知在患病脑中积累的表位。该方法可能或不可能产生在体内具有最佳活性的抗体。本文的实施例支持治疗抗体开发的新模型，其强调了在阻断脑中存在的接种活性的效力。使用该方法，鉴定了表观效力比先前已经报道的效力更高的抗体。在阮病毒假说的扩展中，其进一步提出不同的tau聚集体“品系(strains)”在具有不同类型tau蛋白病的患者中可能占主导地位，并且这些可能对不同的抗体具有独特的敏感性。在任何情况下，使用本文所述抗体效力的敏感体外测定可以允许基于抗体的疗法的有效得多的开发和优化。
抗tau抗体的强保护效果，特别是利用HJ8.5抗体的强保护效果提示该类型的方法应该被考虑成为用于人tau蛋白病的治疗策略。尽管经过ICV方法长期施用抗体可能是可以的，但是在未来的研究中，当以预防和和治疗方式给出时，确定外周施用这些抗体的PK/PD响应可能是重要的。此外，tau接种测定可以用于通过抗体监测靶标参与。
用于实施例9-15的实验方法
抗体 通过针对小鼠tau免疫tau敲除小鼠(Jackson实验室)来产生HJ9.3和HJ9.4小鼠单克隆抗体，并通过针对人tau免疫tau敲除小鼠产生HJ8.5和HJ8.7单克隆抗体。HJ9.3、HJ9.4和HJ8.7单克隆抗体识别小鼠和人tau。然而，HJ8.5单克隆抗体仅结合人tau（表位在残基25-30处[NCBI参考序列：NP_005901]）。HJ9.3抗体识别tau的RD区（在残基306-320处的表位）。HJ9.4抗体识别tau的N末端区（表位在残基7-13处）。作为对照抗体，使用HJ3.4小鼠单克隆抗体，其识别人Aβ序列的N末端区（残基1-16处的表位）。HJ8.5、9.3和9.4单克隆抗体是IgG2b同种型。兔多克隆tau抗体（ab64193，定位在重复结构域区的表位）购自Abcam。小鼠单克隆生物素化的BT-2抗体识别人和小鼠tau（残基194-198处的表位）并购自Pierce。兔抗小鼠单克隆CD68抗体购自AbD SeroTec。生物素化的AT8抗体购自Thermo scientific。
表面等离子共振 在BIAcore 2000 表面等离子共振仪(GE Healthcare-BIAcore)上进行表面等离子共振实验。通过使用1:1比例的EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亚胺)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)活化Biacore传感器芯片7分钟。通过以5 µl/分钟的流速固定10 mM醋酸钠pH 3.5中的5 µg/ml重组人或小鼠tau或人tau纤丝来饱和传感器芯片表面。通过1M乙醇胺pH 8.5封闭剩余的未结合区域。对于参考，利用NHS和EDS活化一个流动室，随后利用1M乙醇胺封闭。然后以10 µl/分钟的流速，注射过滤脱气的0.01 M Hepes缓冲液，0.15 M NaCl，0.005%表面活性剂P20，pH 7.4中的不同浓度(0.11、0.23、0.46、0.9、1.8、3.7、7.5 µg/ml)的所有抗tau抗体。一式两份运行所有样品。利用单个抗体浓度的每一轮运行后，通过使用10 mM甘氨酸pH 1.7完全地再生芯片的表面，以去除与tau结合的抗体，而不干扰芯片上固定的tau。通过使用BIAevaluation软件(GE healthcare-BIAcore)进行数据分析。
Tau纤维化（fibrilization） 8µM重组全长人tau与2mM二硫苏糖醇在室温下预温育45分钟，然后加入10 mM HEPES 和100mM NaCl以及8µM肝素共200 µl体积，随后在37℃下温育7天以形成纤丝。纤丝形成后，通过使用100 kDa Microcon离心过滤器，根据制造商的说明书(Millipore)分离样品中剩余的tau单体。
IP和ICV施用生物素化的HJ8.5抗体 根据制造商的说明书(Sulfo-NHS-LC-Biotinkit, Pierce)生物素化小鼠单克隆HJ8.5抗体。在5-6个月龄大小的P301S小鼠 (n=3)中，以50mg/kg通过腹膜间（interperitoneal）注射(IP)施用生物素化的HJ8.5 (HJ8.5B)。48小时后，处死小鼠。收集血清和CSF并储存在-80℃，直至使用。还通过外科移植的渗透泵脑室内注射(ICV)到5-6月龄大小的P301S小鼠 (n=3)的左侧脑室内来施用HJ8.5B。连续输注该抗体48小时。48小时后，处死小鼠。收集血清和CSF并储存在-80℃，直至使用。
脑室内(ICV)注射方法 通过Alzet 渗透泵2006型(Durect)进行ICV输注。小鼠的年龄在外科手术时为6个月。在外科手术前，将L型插管附着到导管(3 cm长)，然后将其附着到携带抗体或媒介物（磷酸缓冲盐溶液- PBS, pH 7.4）的Alzet泵上。该装配在37℃下在PBS中预温育60小时，以在放置到侧脑室之前活化泵。使用立体定向仪(David KopfInstruments)在前囱前后0.4mm、中线两侧1.0mm和脑表面背腹2.5mm的地方将所述装配外科移植到异氟烷麻醉下的各小鼠的左侧脑室中。利用弯曲的钝头剪刀制备皮下袋将Alzet渗透泵放置在皮肤下。利用牙粘固剂与小的锚定不锈钢螺丝固定各移植的插管。粘固剂干燥后，缝合皮肤。将泵中的抗体(2 mg/ml)或PBS连续输注到脑的左侧脑室中。这些渗透泵携带最大200 µl体积，并且它们以3.6 µl/天的流速泵出，导致每天7.2 μg抗体的输注。在各小鼠中，6周输注后更换渗透泵一次。从各小鼠去除Alzet泵后收集Alzet泵中剩余的溶液并储存在-80℃。9个月大小时，处死所有小鼠。单个圈养所有外科移植的小鼠。
组织学 处理12周后，利用戊巴比妥200 mg/kg经腹膜内麻醉P301S小鼠，随后利用冷Dulbecco’s PBS中的3 U/ml肝素进行灌注。取出脑并切成两个半球体。将脑的左边在4%多聚甲醛中固定24小时，转移到PBS中30%蔗糖中并在粉末干冰中冷冻之前储存在4℃，并储存在-80℃。利用冷冻滑动式切片机将半个脑冠状切成50 µm切片并在-20℃下将所有切片储存在具有抗冻剂溶液（0.2M磷酸缓冲盐溶液，30%蔗糖，30%乙二醇）的24孔板中直至使用。从各脑的新鲜灌注的右半球切下来海马体和皮质用于生物化学分析。将所有切下来的组织储存在-80℃直至分析。通过分开300 µm固定脑切片验证插管放置到左侧脑室内并如先前所述通过甲酚紫进行染色(Holtzman 等, 1996; Ann Neurol 39, 114-122)。使用NanoZoomer数字病理学系统(Hamamatsu Photonics)扫描染色的组织。
细胞培养/接种测定：P301S脑裂解物和抗体处理 在补充有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)中培养HEK293细胞。在37 ℃下，在5% CO2的湿润大气中维持培养物。为了瞬时转染，根据制造商的推荐，在12孔板中Optimem培养基中以250,000个细胞/孔涂布HEK293细胞并使用Lipofectamine 2000试剂和600 ng适当的DNA构建体(Invitrogen)进行转染。共转染的细胞接受150 ng的RD(ΔK280)-CFP 构建体和450 ng的RD(ΔK280)-YFP的组合。15小时后，在37 ℃下利用0.05%胰蛋白酶收集细胞3分钟，然后一式四份重新涂布在96孔板中15小时。然后，在4℃旋转下，以多种浓度(0.125 μg/ml、0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml 和2 μg/ml)加入与所有抗tau单克隆抗体(HJ8.5、9.3和9.4)或HJ3.4抗体(单克隆抗-Aβ抗体)预温育的P301S脑裂解物[在具有蛋白酶(Roche)和磷酸酶抑制剂(Roche)的1X TBS中制备]16小时。为了确定利用不同抗体处理3个月的P301S小鼠中的接种活性，还以多种浓度向细胞中加入所有处理小鼠的RAB可溶性部分。在利用4%多聚甲醛固定之前将细胞培养额外24小时，并进行FRET分析。
免疫沉淀 来自PBS或抗体处理的小鼠的RAB可溶性部分在存在与蛋白G-琼脂糖珠交联（每个试剂盒推荐- Pierce Crosslink Immunoprecipitation试剂盒）的小鼠单克隆抗tau抗体HJ9.3和HJ8.5的情况下，在4℃翻转温育24小时。此外，来自抗体处理小鼠的RAB可溶性部分在存在未缀合蛋白G-琼脂糖珠的情况下，在4℃翻转(end-over-end rotation)温育24小时。18小时后，向样品中加入500 µl的结合/洗涤缓冲液(Pierce)并在2000 x g离心3分钟。丢弃上清液，并将该洗涤步骤重复三次。然后使用低pH洗脱缓冲液(25 µl)，在室温下温育5分钟来洗脱结合珠的蛋白。样品然后在2000 x g下离心3分钟并收集上清液。将该洗脱步骤重复一次，得到共50 µl洗脱物。将含有tau聚集体的tau免疫沉淀物(IP)以与初始脑裂解物实验等同的量重新应用于共转染的RD(∆K)-CFP/YFP细胞，用于利用接种测定进一步分析。
脑组织提取 在30 µl/mg的RAB缓冲液[100 mM MES、1 mM EDTA、0.5 mM MgSO4、750 mM NaCl、20 mM NaF、1 mM Na3VO4，补充有蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(Roche)]中将各脑的皮质匀浆。简言之，使用Optima MAX-TL Ultracentrifuge (Beckman)将样品在4℃下50,000 g离心20分钟。将上清液收集为RAB可溶性部分并将沉淀重悬浮在RIPA缓冲液[150 mM NaCl、50 mM Tris、0.5% 去氧胆酸、1% Triton X-100、0.5% SDS–25mM EDTA，pH 8.0，补充有蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(Roche)]中，30 µl/mg，并在4℃下50,000 g离心20分钟。将上清液收集为RIPA可溶性部分。将沉淀进一步重悬浮在70%甲酸中，10 µl/mg，并在4℃下50,000 g离心20分钟。将上清液收集为70%甲酸部分。将所有部分储存在-80℃直至分析。
电泳和免疫印迹 在还原条件下通过4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行凝胶电泳，随后通过使用IBlot装置(Invitrogen)转移到PVDF膜上。在装载和进行凝胶电泳之前通过10N NaOH和中和缓冲(1mol/L Tris 碱；0.5 mol/L NaH4PO4)的1:1混合物1:3稀释来中和70%甲酸部分。预染分子量标准“SeeBlue” (Invitrogen) 包括在每一次运行中。利用含有0.1% 的Tween 20的Tris 缓冲盐水(TBS)中的5%乳封闭膜。然后，将膜洗涤3次，每次5分钟。兔多克隆tau抗体(Abcam, 1:2000)用作在甲酸部分中检测tau的一级抗体。从渗透泵输注之前和之后收集的处理小鼠抗tau抗体也用作一级抗体。膜随后与山羊抗兔或山羊抗小鼠二级抗体(GE Healthcare, 1:2000)温育。利用ECL引发(prime)底物(GEHealthcare)显色所有的膜。利用G:Box Chemiluminescent Imager (Syngene)显像条带。
为了确定抗tau抗体与来自脑匀浆的tau的免疫反应性，通过SDS-PAGE分离9个月龄大小的P301S和3个月龄大小的P301S小鼠、3个月龄大小的野生型小鼠和3个月龄大小的tau敲除小鼠样品的RAB可溶性部分，随后进行蛋白质印迹。将来自各RAB可溶性部分的1 µg总蛋白在还原条件下装载到4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，随后通过使用IBlot装置(Invitrogen)转移到硝酸纤维素膜上。利用含有0.05% tween 20的TBS(TBST)中的5%乳封闭膜，随后与一级抗体(HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4)温育。HRP缀合的驴抗小鼠IgG(1:2000, Santa cruz)用作二级抗体并使用Lumigen TMA6 (GE Healthcare)显色膜。
ELISA检测游离的HJ8.5B和结合tau的HJ8.5B 在IP或ICV施用后48小时在小鼠的血清和CSF中确定游离HJ8.5B的浓度。利用50 ng/ml的重组人tau在4℃包被96孔ELISA平板。利用4% BSA在37℃封闭ELISA平板1小时。然后将平板洗涤5次，随后与在样品缓冲液(在PBS中的0.25% BSA，补充有蛋白酶抑制剂的300 nM Tris pH 7.4)中稀释的血清和CSF样品温育并在4℃温育过夜。第二天利用PBS洗涤平板8次，随后加入链霉抗生物素蛋白-聚辣根过氧化物酶-40 (1:6000, Fitzgerald)，在室温下暗中1.5小时。然后利用PBS洗涤平板8次，利用Super Slow ELISA TMB (Sigma)显色，并在650 nm处进行读取。不同浓度的HJ8.5B用于产生标准曲线，其除血清和CSF样品外在各平板中运行。
利用20 µg/ml的HJ8.7抗体在4℃包被96孔ELISA平板测量结合tau的HJ8.5B的浓度。利用4% BSA在37℃下封闭ELISA平板1小时。然后将平板洗涤5次，随后与在样品缓冲液中稀释的血清和CSF样品温育并在4℃温育过夜。第二天，利用PBS洗涤平板8次，并且平板与链霉抗生物素蛋白-聚辣根过氧化物酶-40 (1:6000, Fitzgerald)在室温下暗中温育1.5小时。然后利用PBS洗涤平板8次，利用Super Slow ELISA TMB (Sigma)显色，并在650 nm处进行读取。与重组tau络合的不同稀释的纯化HJ8.5B用于在各平板中产生标准曲线。
Tau夹层ELISA测定 为了确定总tau水平，利用碳酸盐缓冲液pH 9.6中的HJ8.7抗体(20 µg/ml)包被ELISA半96孔板(Costar)并在振荡器上4℃温育过夜。利用BioTek ELx405平板洗涤器，用PBS将ELISA平板洗涤5次并利用PBS中的4% BSA在37℃下封闭1小时。然后将平板洗涤5次，随后将孔与在样品缓冲液(0.25% BSA于PBS、300 nM Tris pH 7.4中，补充有蛋白酶抑制剂)中稀释的RAB、RIPA或70% FA生物化学提取的可溶性脑组织部分温育并在4℃温育过夜。通过利用1M Tris pH 11稀释1:20来中和70% FA部分，随后利用样品缓冲液进行稀释。第二天，利用PBS洗涤平板8次，随后在37℃下加入在PBS中0.5% BSA中的生物素化的小鼠单克隆抗tau抗体BT-2抗体(0.3 µg/ml, Pierce)1.5小时。然后在PBS中洗涤平板8次，随后加入链霉抗生物素蛋白-聚辣根过氧化物酶-40 (1:4000)在室温下暗中1.5小时。然后利用PBS洗涤平板8次，利用Super Slow ELISA TMB (Sigma)显色，并在BioTekSynergy 2平板读取器上在650 nm处读取吸光度。重组人tau用于在各平板中产生标准品。阴性对照孔在各平板中包括省略一级抗体。在Eva-Maria Mandelkow的实验室中产生的最长的重组人(hTau40, 441aa)和小鼠tau (mTau40, 432aa)同种型用作ELISA测定中的标准品。
为了确定70% FA部分中人tau的水平，利用小鼠单克隆抗体Tau5 (20 µg/ml)包被ELISA 96孔板并且小鼠单克隆抗人tau特异性生物素化的HT7抗体(0.2 ug/ml, ThermoScientific)用于检测。对于70% FA部分中的小鼠tau水平，利用单克隆抗小鼠tau特异性HJ9.2抗体(20 µg/ml)包被ELISA 96孔板并且单克隆生物素化的HJ8.7用于检测。重组人和小鼠tau用于各平板上的标准品。为了确定位置Ser202和Thr205处的磷酸tau水平，利用小鼠单克隆HJ8.7抗体(20 µg/ml) 包被ELISA半96孔板并且生物素化的AT8抗体(0.2 ug/ml,Thermo Scientific)用作检测抗体。
免疫组织化学 为了检测脑中异常磷酸化tau的存在，评估来自所有处理小鼠的间隔分开300 µm的三个50 µm冠状脑切片。利用Tris-缓冲盐溶液(TBS)和0.25% (vol/vol)Triton-X中的3%乳封闭脑切片，随后与识别在ser202和thr205处磷酸化的tau的生物素化的AT8抗体(Thermo Scientific, 1:500)在4℃温育过夜。识别在残基ser396和ser404处异常磷酸化的tau的生物素化的PHF1抗体(1:200)也用于确定AT8和PHF1抗体染色之间的相关性。对于相关性研究，从HJ8.5、HJ9.3和PBS处理组中随机选择小鼠(N=6)。 使用NanoZoomer数字病理学系统扫描染色的组织。为了确定AT8染色与活化的小胶质染色之间的相关性，利用具有0.25% (vol/vol) Triton-X的TBS中的10%正常山羊血清封闭来自所有处理组的所选小鼠的脑切片(N= 6)，并与大鼠抗小鼠CD68抗体(AbD SeroTec, 1:500)在4℃温育过夜。切片然后与生物素化的山羊抗大鼠IgG抗体（小鼠吸附的(Vector, 1:2000)）温育。利用NanoZoomer载玻片扫描仪(Hamamatsu Photonics)扫描所有切片。通过使用NDP指示器软件输出所有图像并通过使用ImageJ软件(National Institutes of Health)进行定量。对于AT8染色，使用来自各小鼠的分开300 μm的3个脑切片，其大约对应于小鼠脑图谱中的Bregma 坐标-1.4、-1.7和-2.0 mm处的切片。这些切片用于确定被异常磷酸化的生物素化AT8抗体染色占据的区域的百分比。一致地将所有转化的图像设定阈值，以定量AT8染并且所有三个切片的平均值用于确定各小鼠被异常磷酸化的tau染色覆盖的区域的百分比。对于PHF-1和CD68染色，使用来自各小鼠的两个脑切片，其分开300 μm并对应于小鼠脑图谱中的前囟坐标-2.3和-2.6 mm。为了确定ThioS染色，将来自所有处理组的随机所选小鼠的脑切片(N= 6)在50%乙醇中的ThioS(0.25 mg/ml)中染色3分钟，随后在50%乙醇和蒸馏水中洗涤。然后包埋薄切片、干燥并通过显微镜利用Nanozoomer评估图像。来自各小鼠的两个脑切片如为用于PHF-1和CD68染色的那些附近所述使用。
半变性琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE) 为了分离在3个月龄大小的tau敲除(KO)、3个月龄大小的野生型(WT)、3个月龄大小的P301S和9个月龄大小的PBS处理P301S小鼠的不同RAB可溶性部分中存在的tau种类，使用先前描述的半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)方法，其中具有较少修改。将样品在具有0.2% SDS的缓冲液G(20 mM Tris, 200 mM甘氨酸)中的水平1.5%琼脂糖凝胶上运行。样品在样品缓冲液(60 mM Tris-HCl pH 6.8、0.2%SDS、5%甘油和0.05%溴酚蓝)中在室温下温育7分钟。电泳后，将蛋白在4℃下从凝胶上转移到Laemmli缓冲液(缓冲液G/0.1% SDS)中的稳定素-P PVDF片(Millipore)上。使用1:2000的抗tau特异性兔多克隆抗体(Abcam)印迹膜。使用GE ECL Plus系统显色印迹。
免疫荧光 将HEK293细胞以75,000个细胞/孔涂布在聚D赖氨酸包被的24孔板中。为了确定所使用的抗tau抗体是否可以检测被HEK293细胞吸收的tau种类，利用P301S脑裂解物处理细胞2小时，随后利用PBS洗涤3次，利用4%的多聚甲醛在室温下固定15分钟，随后利用PBS在室温下洗涤3次。利用0.1% Triton X-100透化细胞10分钟，利用PBS洗涤3次，然后利用含有10% 正常山羊血清和20 mg/ml BSA的PBS中的0.25% Triton X-100封闭。然后细胞与缀合有Alexa-fluor 546的抗小鼠二级抗体温育。为了确定抗体是否可以进入细胞，P301S脑裂解物与不同抗tau抗体HJ8.5、HJ9.3和HJ9.4或针对Aβ的HJ3.4抗体预先温育或不预先温育。然后将裂解物加入到HEK293细胞中2小时，固定并透化。缀合有Alexa-fluor 546的二级抗体用于鉴定抗体。4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；以蓝色显示)用于核染色。通过使用Zeiss LSM5共聚焦显微镜(Zeiss)捕获所有图像。
病理学和生物化学数据的统计学分析 所有数据以均值± SEM呈现，并且使用单因素ANOVA，随后通过Dunnett’s post hoc检验比较不同条件，以比较对照与处理组。统计学显著性设置为P < 0.05。使用Windows的GraphPad Prism 5.04 (GraphPad SoftwareInc.)进行统计。为了定量评估AT8染色，性别是重要的因素，因此使用SAS版本9.2软件通过性别调整结果。
应用处理和性别作为因素的统计学分析 对照组（PBS和HJ3.4）均值与各处理组比较。(PBS的均值+ HJ3.4的均值)/2 VS处理的均值)。两因素ANOVA用于检验性别和处理是否是重要因素，其通过SAS版本9.2中的PROC GLM实现并且在表7中显示了其p值。在SAS版本9.2中的PROC GLM中使用对照说明以评估所有比较。应用在两因素ANOVA中作为调整因素的性别并且在图38D中显示了调整之前/之后的p值。
行为测试 在一组感觉运动测定和转棒上评估小鼠的活动能力和探究行为，以为解释条件性恐惧测试的结果提供额外的对照数据，其用于评价认知功能。在一系列测试的最后进行条件性恐惧测试，以排除短暂的足刺激对其他行为指数的影响。
洞板(Holeboard)探究、感觉运动组和转棒 在洞板探究测试上评价所有小鼠，在所述测试中在30分钟期间定量总的跑动（整个身体运动）和洞穿(hole poke)并提供活动能力和探究的指数。方案涉及使用含有4个角和4个侧孔的计算机化的洞板装置(41 x 41 x38.5 cm高)，其中侧孔在角孔之间等距(Learning Holeboard; MotorMonitor, KinderScientific, LLC, Poway, CA)。光束仪器操作用于定量测试期间的总的跑动和探究性洞穿。该程序已经充当了我们一般的洞板探究/嗅觉偏爱测试的习惯化元件。还在一组7个感觉运动测定上测试了小鼠，所述感觉运动测定组用于评估平衡（突出，平台）、协调（洞，60º和90º倾斜的屏障）、强度（倒置的屏障）和开始运动出小的局限区域（行走开始）。在先前的出版物中使用该组并且更多的程序细节可见于(Wozniak 等(2004; Neurobiol Dis 17,403-414)。转棒测试与先前公开的方法类似并包括三种类型的试验：1)固定棒（60s最大值）；2）恒速转棒(2.5 rpm，60 s最大值)；和3)加速转棒(2.5-10.5 rpm，在 0-180 s之间)。我们的方案由以下组成：在一个固定棒试验、两个恒速转棒试验和两个加速转棒试验上测试各小鼠，对于三个测试期的每一个分隔3天以限制运动学习。
条件性恐惧。 在条件性恐惧测试上评估小鼠，所述测试是进行的最后的行为测量。简言之，在两个Plexiglas调节室(26 cm x 18 cm，和18 cm高) (Med-Associates, St.Albans, VT)中训练和测试小鼠，各室含有独特的和不同的视觉、气味和触觉信号。将各小鼠放置到调节室中用于5分钟试验并在2分钟基线期间内定量凝滞行为。在3分钟开始和60秒间隔后，将小鼠暴露于3个音调-电击配对中，其中各配对包括80 dB音调(条件刺激；CS)的20秒演示，其由宽带白噪音随后在音调的最后一秒内呈现的1.0 mA 连续足刺激(非条件刺激；CS)组成。使用宽带白噪音，而非频率特异性音调，以努力避免可能随年龄发生的可能听觉缺陷。第二天将小鼠放回到调节室中并在8分钟期间定量凝滞行为，以评价关联恐惧调节。24小时后，将小鼠放置到含有不同暗示的其他室内并在2分钟“变更关联”基线过程中和随后的8分钟内（在该时间内呈现听觉暗示（音调；CS））定量凝滞行为。使用FreezeFrame图像分析软件(Actimetrics, Evanston, IL)定量凝滞，其允许在调整“凝滞阈值”时同时观察行为，其将行为分类为在0.75 s间隔内凝滞或不凝滞。将凝滞定义为不运动，除了与平静呼吸相关的运动，并且将数据呈现为凝滞所消耗的时间的百分比。为了评估关联恐惧调节的程度，我们在各处理组内进行分析，其涉及比较在第1天2分钟基线内平均的凝滞所消耗的百分比时间与第2天关联恐惧测试的头2分钟内凝滞所消耗的平均百分比时间，以及整个8分钟期间平均的凝滞水平。完成条件性恐惧测试后，根据先前在Khuchua 等 (2003;Neuroscience 119, 101-111)中描述的程序评价刺激灵敏度。
行为数据的统计学分析 方差分析(ANOVA)模型通常用于分析行为数据(Systat12, Systat Software, Chicago, IL)。使用含有一个对象间变量（处理）和一个对象内（重复测量）变量（分钟）的重复测量(rm) ANOVA模型分析条件性恐惧数据。α水平的Huynh-Feldt调节用于含有多于两个水平的所有对象内效果，以保护免于违背rmANOVA模型潜在的球形/复合对称假设(sphericity/compound symmetry assumption)。在ANOVA模型内进行PBS+HJ3.4对照组与三个其他抗体处理组（即，HJ8.5、HJ9.3、HJ9.4）的每一个之间的计划性比较，用于检验某些关键假设。在其他情况下，根据相关的显著整体ANOVA效果进行配对比较，适当时其进行Bonferroni校正。还计算在洞板测试过程中记录的总移动与第2天关联恐惧测试过程中凝滞所消耗的百分比时间之间的皮尔森相关系数(r)。
实施例16. Tau ELISA测定
开发了ELISA测定，以检测患者血浆样品中病理性tau聚集体的存在。用于该测定的抗体包括小鼠单克隆抗tau HJ9.3和HJ9.2。使用一步Antibody Biotinylation Kit (HJ9.3-Bio)将HJ9.3生物素化。该夹层ELISA利用等同浓度的HJ9.3和HJ9.2作为捕获抗体。利用在碳酸氢盐缓冲液pH 9.6中制备的20 µg/ml的HJ9.2/HJ9.3包被96孔半面积平板(Costar3690) (50µl/孔)并在4℃温育过夜。使用4 % BSA/PBS的封闭步骤后，一式三份向孔中应用血浆样品(在样品缓冲液中1:4稀释：0.25% BSA/PBS，300nM Tris PH 7.4~8.0，1X蛋白酶抑制剂) (50µl/孔)。然后将平板在4℃温育过夜。为了检测，在37℃下以0.3µg/ml向孔中加入在0.5% BSA/PBS中制备的HJ9.3-Bio。在0.5% BSA/PBS中以1:4,000稀释的二级链霉抗生物素蛋白聚HRP40抗体(50 µl/孔并在室温下在振荡器上暗中1.5小时)通过酶反应使用TMBsuper slow底物用于最终的检测。已经设计ELISA以优化血浆中稀有种类的检测。初始实施方案包括利用抗体对包被ELISA平板的表面以优化聚集体的俘获。然而，使用来自较大体积的流体样品的抗体包被珠增加测定的灵敏度可能同等合理。从健康的年轻参与者收集的阴性血浆用于计算测定的背景信号。实验样品中tau种子的存在报道为相对于来自阴性血浆的信号的倍数诱导。
来自先前利用公开的接种测定测试过的临床前和阿尔茨海默氏病(AD)患者的一组血浆样品用于验证夹层tau ELISA测定。使用新开发的ELISA测定来测试没有接种活性的12个对照患者(CDR 0) (阴性)和具有接种活性的12个患者(CDR > 0) (阳性)。基于生物传感器细胞测定，这些患者先前被确定为在CSF和血浆中具有接种活性或没有接种活性。在该细胞测定中，含有∆K280突变的tau蛋白的RD片段与蓝绿色或黄色荧光蛋白融合。这使得能够通过FRET测量荧光共振能量转移来检测聚集。将细胞外聚集体带到细胞内并触发tauFRET报告蛋白的细胞内聚集。
如图45中所示，与具有阳性接种活性的AD患者血浆中明确的tau种子存在相比，在具有阴性接种活性的患者血浆中没有检测到tau聚集体。该基于无细胞的测定可以作为用于许多tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病的非侵入性诊断工具用于更多的临床环境中。此外，其可以允许检测具有初始病理（其注定发生痴呆）的那些患者，通过富集样品群体促进临床试验设计。最后，其可以用于监测抗tau或其他抗痴呆疗法的效力。
实施例17
设置细胞传播测定以测量tau聚集体从一个群体到另一个群体的传播。包含重复结构域(RD)的tau的片段用作具有两个疾病相关突变(LM: P301L/V337M)的无标签形式，以促进CFP-标签形式的聚集，或具有一个疾病相关突变(∆K: ∆K280)的无标签形式。利用RD(LM)和RD(∆K280)-CFP转染一个细胞群，并利用RD(∆K280)-YFP转染另一个。在荧光平板读取器上记录来自96孔板式(format)中一式四份培养的细胞的FRET。FRET信号来自转移到含有RD-YFP的细胞中的RD-CFP聚集体，并且反之亦然。以指定的多个稀释向培养基中加入多种抗体。抗体的初始浓度是~1mg/ml。例如，10-3稀释表示~1µg/ml的终浓度。24小时后，固定细胞并记录FRET测量结果。在图47中呈现了各抗体的数据。一些抗体在防止聚集跨细胞传播中非常有效(例如HJ8.2, HJ9.1)。其他抗体以更居中的方式有效(例如HJ9.3)，而一些基本上无效(HJ8.7)。在各图中，第一个棒代表没有添加抗体的培养基，代表传播的基线效力。
为了测试抗体的协同性，在指定浓度范围内稀释的各抗体环境中确定对传播的影响，或抗体以等摩尔比例混合，然后在相同范围内进行滴定。一些对是强协同的(例如HJ9.3/9.4)，而其他彼此干扰(HJ8.5/9.1) (图48)。
还可以通过流式细胞术测量抗体对tau聚集体吸收的影响。将细胞暴露于重组RD纤丝中，其被荧光染料化学标记。胰蛋白酶消化和分散后，使用流式细胞仪计数细胞。HJ9.3剂量依赖性地减少荧光标记细胞的数量，表明对聚集体吸收的抑制(图50)。
序列表
<110> 华盛顿大学
<120> 针对TAU的抗体
<130> 047563-458812
<150> US 61/667,515
<151> 2012-07-03
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Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp
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Lys Thr Asp His Gly Ala Glu
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Pro Arg His Leu Ser Asn Val
1 5
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Glu Pro Arg Gln
1
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Ala Ala Gly His Val
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Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly
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Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys
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Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His
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Thr Asp His Gly Ala Glu
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Lys Thr Asp His Gly Ala
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gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctgggaca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagat atagttatat acactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctctggagg aggaggatgc tgcaacatat tactgtcacc acagttggga gattccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
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<212> DNA
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gaagtgaagg ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aactactggg tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagattga aatctgataa ttatgcaaca 180
cattatgagg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctatctgc aaatgaacaa cctaagggct gaagacagtg gaatttatta ctgcactaac 300
tgggaagact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
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<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Arg Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Leu Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Glu Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Asn Trp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Ile His
1 5 10 15
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Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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Asn Tyr Trp Val Asn
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Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Glu Glu Ser
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<220>
<223> 合成的
<400> 21
Trp Glu Asp Tyr
1

Claims (17)

1.分离的抗体，其中所述抗体特异性结合tau并识别选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ IDNO: 8的氨基酸序列内的表位。
2.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO: 14 和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体由包含选自SEQ ID NO: 12 和SEQ ID NO:13的核酸序列的核酸序列编码。
4.分离的抗体，其中所述抗体特异性结合tau并包含这样的轻链CDR3，所述轻链CDR3包含具有0-2个氨基酸取代的SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
5.分离的抗体，其中所述抗体特异性结合tau并包含这样的重链CDR3，所述重链CDR3包含具有0-2个氨基酸取代的SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。
6.前述权利要求中任一项的分离的抗体，其中所述抗体选自单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体。
7.前述权利要求中任一项的分离的抗体，其中所述抗体在细胞tau聚集测定中特异地能够阻断tau接种活性。
8.用于减少tau聚集在主体的脑中扩散的方法，所述方法包括向所述主体施用药理学上有效量的抗tau抗体，其中所述抗tau抗体是前述权利要求中任一项的分离的抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括在主体中改善至少一种与tau聚集相关的症状。
10.权利要求9的方法，其中所述至少一种与tau聚集相关的症状选自tau病理、受损的认知功能、改变的行为、异常的语言功能、情感失调、癫痫发作、受损的神经系统结构或功能、和发生阿尔茨海默氏病的增加风险。
11.权利要求8的方法，其中所述施用包括有效的全身施用途径。
12.权利要求8的方法，其中所述施用包括有效的局部施用途径，包括直接在中枢神经系统内施用。
13.免疫测定，其包括前述权利要求1-7中任一项的至少两种分离的抗体。
14.权利要求13的免疫测定，其中所述免疫测定包括至少两种捕获抗体和一种检测抗体，并且其中各捕获抗体是识别彼此不同的tau表位的分离的抗tau抗体。
15.权利要求14的免疫测定，其中第一捕获抗体是特异性结合tau并识别SEQ ID NO: 7内的表位的分离的抗体，第二捕获抗体是特异性结合tau并识别SEQ ID NO: 8内的表位的分离的抗体，并且检测抗体是特异性结合tau并识别SEQ ID NO: 8内的表位的分离的抗体。
16.在从主体获得的生物流体样品中测量tau聚集体的量的方法，所述方法包括使用权利要求13-15中任一项的免疫测定测量tau聚集体的量。
17.权利要求16的方法，其中使用分离的抗tau抗体从所述样品中免疫沉淀tau聚集体，并然后测量免疫沉淀的tau聚集体的量。
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