PL224150B1 - Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca - Google Patents

Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca

Info

Publication number
PL224150B1
PL224150B1 PL410219A PL41021903A PL224150B1 PL 224150 B1 PL224150 B1 PL 224150B1 PL 410219 A PL410219 A PL 410219A PL 41021903 A PL41021903 A PL 41021903A PL 224150 B1 PL224150 B1 PL 224150B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cmc
seq
cdr
conjugate
Prior art date
Application number
PL410219A
Other languages
English (en)
Other versions
PL410219A1 (pl
Inventor
Arthur Kunz
Justin Keith Moran
Joseph Thomas Rubino
Neera Jain
Eugene Joseph Vidunas
John Mclean Simpson
Paul David Robbins
Nishith Merchant
John Francis Dijoseph
Mark Edward Ruppen
Nitin Krishnaji Damle
Andrew George Popplewell
Original Assignee
Wyeth Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29401497&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL224150(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
Publication of PL410219A1 publication Critical patent/PL410219A1/pl
Publication of PL224150B1 publication Critical patent/PL224150B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycji farmaceutycznej zawierającej taką kompozycję.
Niniejszym ujawniono sposoby wytwarzania koniugatów monomeryczny cytotoksyczny lek/nośnik („koniugatów) o wyższym ładunku leku i zasadniczo zmniejszonej frakcji niskoskoniugowanej (LCF).
Wynalazek dotyczy, zwłaszcza koniugatów przeciwciało przeciwko CD22 - monomeryczna kalicheamycyna. Oprócz koniugatów i kompozycji farmaceutycznych zawierających takie koniugaty według wynalazku, niniejszym przedstawiono sposoby oczyszczania koniugatów oraz ich zastosowanie.
STAN TECHNIKI
Koniugaty leków opracowane do ogólnoustrojowej farmakoterapii są swoistymi wobec celu środkami cytotoksycznymi. Koncepcja ta polega na sprzęganiu środka terapeutycznego z cząsteczką nośnika swoistego wobec określonej populacji komórek docelowych. Jako reszty kierujące naturalny wybór stanowią przeciwciała o wysokim powinowactwie wobec antygenów. Wraz z dostępnością przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie obiecujące stały się perspektywy uzyskania środków terapeutycznych kierujących z przeciwciałem. Substancje toksyczne, które sprzęgano z przeciwciałami monoklonalnymi, obejmują toksyny, leki cytotoksyczne o niskim ciężarze cząsteczkowym, modyfikatory odpowiedzi biologicznej oraz radionuklidy. Koniugaty przeciwciało - toksyna nazywane są często „immunotoksynami, podczas gdy immunokoniugaty składające się z przeciwciał i leków o niskim ciężarze cząsteczkowym, takich jak metotreksat i adriamycyna (ADRIAMYCIN), określane są mianem „chemioimmunokoniugaty. Immunomodulatory obejmują modyfikatory odpowiedzi biologicznej, które są znane z funkcji regulujących, takie jak limfokiny, czynniki wzrostu oraz aktywujący dopełniacz czynnik jadu kobry (CVF). Radioimmunokoniugaty składają się z radioaktywnych izotopów, które mogą być stosowane jako środki terapeutyczne do zabijania komórek przez napromienienie lub też do obrazowania. Oczekuje się, że specyficzne dostarczanie leków cytotoksycznych do komórek nowotworowych za pośrednictwem przeciwciała nie tylko zwiększy ich skuteczność przeciwnowotworową, ale również zapobiegnie niecelowanemu wychwytowi przez prawidłowe tkanki, poszerzając tym samym ich zastosowanie terapeutyczne.
Wynalazek wykorzystuje immunokoniugaty obejmujące przeciwciało jako kierujący nośnik, o swoistości wobec determinant antygenowych na powierzchni komórek nowotworowych sprzężone z lekiem cytotoksycznym. Wynalazek dotyczy koniugatów cytotoksyczny lek - przeciwciało, w których przeciwciało wykazuje swoistość wobec determinant antygenowych w nowotworach złośliwych zależnych od limfocytów B, zaburzeniach limfoproliferacyjnych oraz przewlekłych chorobach zapalnych. Niniejszym przedstawiono także sposoby wytwarzania immunokoniugatów oraz ich zastosowania terapeutyczne.
Do stosowania klinicznego w leczeniu różnych chorób, obejmujących raka i reumatoidalne zapalenie stawów, zatwierdzono wiele środków terapeutycznych opartych na przeciwciałach lub też są one poddawane badaniom klinicznym w wielu nowotworach złośliwych, obejmujących nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B i chłoniaki nieziarnicze. Jednym z takich środków opartych na przeciwciałach jest rituximab (RITUXAN), nieznakowane chimeryczne ludzkie przeciwciało 1γ (region + + mYlV), które jest swoiste dla antygenu CD20 powierzchni komórki, wyrażanego na limfocytach B. Oparte na przeciwciałach środki terapeutyczne są zależne od cytotoksyczności z udziałem dopełniacza (CDCC) lub od zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADDC) wobec limfocytów B, bądź
131 90 też od stosowania radionuklidów, takich jak 131I lub 90Y, co stwarza problemy związane z wytwarzaniem i stosowaniem dla klinicystów i pacjentów. W konsekwencji istnieje zapotrzebowanie na generację immunokoniugatów, które są pozbawione wad właściwych dla aktualnie stosowanych środków terapeutycznych opartych na przeciwciałach, do leczenia wielu nowotworów złośliwych, obejmujących nowotwory złośliwe układu krwiotwórczego, jak chłoniaki nieziarnicze (NHL) i które można łatwo i skutecznie wytwarzać i wielokrotnie stosować bez wywoływania odpowiedzi odpornościowej.
Do stosowania w leczeniu szpiczaków opracowano immunokoniugaty obejmujące związek z rodziny silnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych, znanych pod wspólną nazwą kalicheamycyny lub kompleks LL-E33288 (patrz patent USA nr 4,970,198 (1990)). Najsilniejsze kalicheamycyny oznaczono jako γ, a w niniejszym opisie po prostu jako „gamma. Związki te zawierają metylotrisulfid, który można poddać reakcji z odpowiednimi tiolami, uzyskując disulfid i w tym samym czasie można wprowadzić grupę funkcyjną, taką jak grupa hydrazydowa lub inna grupa funkcyjna, która jest użyteczna do przyłączenia pochodnej kalicheamycyny do nośnika. (Patrz patent USA nr 5,053,394). W pracach nad terapiami wielu różnych nowotworów stosowanie monomerycznych koniuPL 224 150 B1 gatów pochodna kalicheamycyny/nośnik było ograniczone przez dostępność konkretnych środków kierujących (nośników), jak również przez metodologie sprzęgania, które prowadzą do powstawania agregatów białkowych, gdy wzrasta ilość pochodnej kalicheamycyny (tj. obciążenie lekiem) skoniugowanej z nośnikiem. Ponieważ wyższe obciążenie lekiem zwiększa siłę działania koniugatu, a zatem wskazane jest możliwe największe obciążenie nośnika lekiem, o ile zachowane jest powinowactwo wobec białkowego nośnika. Obecność agregatów białek, które mogą być nieswoiście toksyczne i immunogenne, a zatem powinny być wyeliminowane w zastosowaniach terapeutycznych, sprawia, że proces wytwarzania takich koniugatów w skali przemysłowej jest utrudniony, a wydajność produktów spada. Ilość kalicheamycyny wprowadzonej do białka nośnika (obciążenie lekiem) ilość agregatu wytworzonego w reakcji sprzęgania oraz możliwa do uzyskania wydajność końcowego oczyszczonego monomerycznego koniugatu są ze sobą powiązane. A zatem, należy wypracować kompromis pomiędzy wyższym obciążeniem lekiem i wydajnością końcowego monomeru, przez regulowanie ilości reaktywnej pochodnej kalicheamycyny, którą dodaje się w reakcji sprzęgania.
Tendencja cytotoksycznych koniugatów leków, a zwłaszcza koniugatów kalicheamycyny, do tworzenia agregatów, staje się problematyczna zwłaszcza wówczas, gdy reakcje sprzęgania prowadzi się stosując łączniki opisane w patentach USA nr 5,877,296 i 5,773,001, których treść wprowadza się tu w całości przez odniesienie. W takim przypadku wytworzone koniugaty w dużym procencie są w postaci agregatów, a oczyszczenie koniugatów wytworzonych tymi oryginalnymi sposobami (proces CMA) do zastosowania terapeutycznego, jest dosyć trudne. W przypadku niektórych białek nośnikowych nie jest wirtualnie możliwe wytworzenie koniugatów nawet z umiarkowanymi obciążeniami, z wyjątkiem produkcji w małej skali. W konsekwencji istnieje pilne zapotrzebowanie na ulepszone sposoby sprzęgania cytotoksycznych leków, takich jak kalicheamycyna, z nośnikami, które zminimalizują ilość wytwarzanych agregatów, a tym samym pozwolą na możliwie wysokie obciążenie lekiem w połączeniu z rozsądną wydajnością produktu.
Ujawniono już sposoby sprzęgania, w których wytwarza się monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/nośnik o wyższym obciążeniu lekiem i z wyższą wydajnością oraz o zmniejszonym tworzeniu się agregatów (patrz patenty USA nr 5,712,374 i 5,714,586, wprowadzone tu w całości przez odniesienie). Aczkolwiek w sposobach tych uzyskano koniugaty o zasadniczo zmniejszonej zawartości agregatu, stwierdzono następnie, że wytworzone koniugaty zawierają niepożądane wysokie poziomy (% powierzchni w HPLC, 45-65%) niskoskoniugowanej frakcji (LCF), frakcji, która składa się głównie z niesprzężonego przeciwciała. Obecność LCF w produkcie powoduje nieefektywne wykorzystanie przeciwciała, ponieważ frakcja ta nie zawiera cytotoksycznego leku. Może ona również współzawodniczyć z koniugatem kalicheamycyna - nośnik, potencjalnie ograniczając możliwość dotarcia koniugatu do celu, a tym samym zmniejszając skuteczność cytotoksycznego leku. Tak więc, pożądany jest ulepszony sposób sprzęgania, w którym będzie można uzyskać znacznie mniejsze poziomy LCF, dopuszczalne poziomy ilości wytworzonych agregatów, bez znacznej zmiany własności fizycznych koniugatu.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
Kompozycja według wynalazku zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny oraz przeciwciało, który jest przedstawiony wzorem przedstawionym na Fig. 17, przy czym przeciwciało obejmuje sekwencję SEKW. NR ID: 1 jako CDR-H1, reszty 50-66 sekwencji SEKW. NR ID: 27 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2 oraz SEKW. NR ID: 6 dla CDR-13;
kalicheamycyna stanowi 4-10% wagowych koniugatu leku; n oznacza 3 do 9; a kompozycja zawiera mniej niż 10% wagowo nieskoniugowanego przeciwciała.
Korzystnie przeciwciało koniugatu kompozycji według wynalazku obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego, jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 19 i region zmienny łańcucha ciężkiego, jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 27.
Również w korzystnej postaci wykonania przeciwciało koniugatu kompozycji według wynalazku obejmuje łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji SEKW. NR ID: 30, przy czym przeciwciało jest wyrażane w komórce ssaczej.
Korzystnie, kompozycja według wynalazku obejmuje koniugat przeciwciała obejmującego łańcuch lekki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji sekwencji SEKW. NR ID: 29 w komórce ssaczej, oraz łańcuch ciężki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji SEKW. NR ID: 31 w komórce ssaczej.
PL 224 150 B1
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyżej opisaną kompozycję według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, rozcieńczalnik lub nośnik.
Niniejszym ujawniono sposoby wytwarzania monomerycznych koniugatów cytotoksyczny lek/nośnik („koniugatów), takich jak koniugat w kompozycji według wynalazku, o wyższym obciążeniu i zasadniczo zmniejszonej zawartości frakcji niskoskoniugowanej (LCF). Niniejszym opisane zostały monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny - nośnik, koniugaty, kompozycje, sposoby oczyszczania koniugatów oraz zastosowania koniugatów. Bardziej konkretnie, niniejszym opisano sposoby wytwarzania monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny - przeciwciało przeciwko CD22 (CMC-544).
W jednym z ujawnień opisano ulepszony sposób sprzęgania do wytwarzania koniugatów, w którym uzyskuje się znacznie mniejsze poziomy LCF (poniżej 10%) bez zasadniczej zmiany własności fizycznych lub chemicznych. Niniejszym opisano dalsze ulepszenie sposobu sprzęgania, w wyniku którego uzyskuje się nie tylko znaczące zmniejszenie poziomów LCF, ale również znaczące zmniejszenie tworzenia się agregatów w porównaniu ze znanymi sposobami, jak również uzyskuje się znacznie większe obciążenie lekiem. Opisane tu koniugaty mają wzór:
Pr(-X-W)m w którym:
Pr oznacza białkopodobny nośnik,
X oznacza łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może reagować z białkopodobnym nośnikiem,
W oznacza cytotoksyczny lek;
m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym cytotoksyczny lek stanowi 7-9% wagowych koniugatu; a (-X-W)m oznacza pochodną cytotoksycznego leku.
Koniugaty można wytwarzać sposobem obejmującym etapy: (1) dodanie pochodnej cytotoksycznego leku do białkopodobnego nośnika, przy czym pochodna cytotoksycznego leku stanowi 4,5-11% wagowych białkopodobnego nośnika; (2) inkubowanie pochodnej cytotoksycznego leku i białkowodobnego nośnika w nienukleofilowym, kompatybilnym z białkiem, buforowanym roztworze o pH w zakresie od około 7 do 9, z wytworzeniem monomerycznego koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik, przy czym roztwór ten obejmuje ponadto (a) organiczny współrozpuszczalnik, oraz (b) dodatek zawierający co najmniej jeden kwas C6-C18 karboksylowy lub jego sól, przy czym inkubację prowadzi się w temperaturze w zakresie od około 30°C do około 35°C w czasie w zakresie od około 15 minut do 24 godzin; oraz (3) poddanie koniugatu wytworzonego w etapie (2) rozdzielaniu na drodze chromatografii, w celu oddzielenia monomerycznych koniugatów pochodna cytotoksycznego leku/białkopodobny nośnik o obciążeniu cytotoksycznym lekiem w zakresie 4-10% wagowych i zawartości niskoskoniugowanej frakcji poniżej 10%, od nieskoniugowanego białkopodobnego nośnika, pochodnej cytotoksycznego leku i zagregowanych koniugatów.
Opisany niniejszym, białkopodobny nośnik koniugatu jest wybrany z grupy obejmującej hormony, czynniki wzrostu, przeciwciała, fragmenty przeciwciał, mimetyki przeciwciał oraz ich odpowiedniki wytworzone genetycznie lub enzymatycznie.
Według wynalazku, białkopodobnym nośnikiem w koniugacie kompozycji jest przeciwciało. Przeciwciało może być wybrane z grupy obejmującej przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab i fragment F(ab)2.
Opisane tu humanizowane przeciwciało jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22.
Humanizowanym przeciwciałem stosowanym w rozwiązaniach według wynalazku jest przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).
Korzystnie, humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 jest przeciwciało z przeszczepionym CDR, obejmujące łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej jako reszty 21 do 239 sekwencji SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej jako reszty 20 do 466 sekwencji SEKW. NR ID: 30.
PL 224 150 B1
Cytotoksycznym lekiem, który można stosować do wytwarzania monomerycznego koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik sposobem tu opisanym jest inhibitor polimeryzacji tubuliny, czynnik alkilujący, który wiąże się i rozrywa DNA, inhibitor syntezy białek albo inhibitor kinaz tyrozynowych.
Opisany powyżej cytotoksyczny lek jest wybrany spośród kalicheamycyn, tiotepy, taksanów, daunorubicyny, doksorubicyny, epirubicyny, esperamycyn, aktynomycyny, autramycyny, azaseryn, bleomycyn, tamoksyfenu idarubicyny, dolastatyn/aurystatyn, hemiasterlin i maytanzynoidów.
Według wynalazku, cytotoksycznym lekiem jest kalicheamycyna. W szczególnie korzystnym wykonaniu, kalicheamycyną jest gamma-kalicheamycyna lub pochodna N-acetylowa gamma-kalicheamycyny.
Cytotoksyczny lek może być funkcjonalizowany 3-merkapto-3-metylobutanoilohydrazydem i jest sprzężony z białkopodobnym nośnikiem przez ulegający hydrolizie łącznik, który jest zdolny do uwolnienia cytotoksycznego leku z koniugatu po jego związaniu i wejściu do komórek docelowych.
Jako zdolny do hydrolizy łącznik można stosować kwas 4-(4-acetylofenoksy)-butanowy (AcBut).
W celu zmniejszenia agregacji i zwiększenia obciążenia lekiem, jako dodatek w sposobie sprzęgania stosuje się kwas oktanowy lub jego sól, albo kwas dekanowy lub jego sól.
Koniugaty stosowane w kompozycji według wynalazku oczyszcza się przez rozdzielanie metodą chromatografii.
Jako sposób rozdzielania metodą chromatografii do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik stosuje się chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek (SEC).
Jako sposób chromatograficznego rozdzielania do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik, można też stosować HPLC, FPLC lub chromatografię z użyciem SEPHACRYL® S-200.
Ponadto, jako sposób chromatograficznego rozdzielania do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik, stosuje się chromatografię z interakcją hydrofobową (HIC). HIC można prowadzić stosując ośrodek do chromatografii Fenyl SEPHAROSE® 6 Fast Flow, Butyl SEPHAROSE® 4 Fast Flow, Octyl SEPHAROSE® 4 Fast Flow, TOYOPEARL® Ether-650M, ośrodek MACRO-PREP metyl HIC lub MACRO-PREP t-Butyl HIC. Szczególnie korzysny do prowadzenia HIC jest ośrodek do chromatografii Butyl SEPHAROSE® 4 Fast Flow.
Niniejszym opisano monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/nośnik, wytworzony wyżej wskazanym sposobem. Według wynalazku w koniugacie, jako cytotoksyczny lek stosuje się kalicheamycynę, a jako nośnik stosuje się przeciwciało.
Przeciwciało do stosowania w opisanych koniugatach jest wybrane z grupy obejmującej przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab i fragment F(ab)2. Według wynalazku jako przeciwciało w koniugacie stosuje się humanizowane przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22. W szczególności, humanizowanym przeciwciałem przeciwko-CD22 jest korzystnie przeciwciało z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).
Humanizowanym przeciwciałem w koniugacie stosowanym według wynalazku jest humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, obejmujące fragment łańcucha lekkiego o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID: 28 oraz fragment łańcucha ciężkiego o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID:30.
Humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 może być przeciwciałem z przeszczepionym CDR, które jest wariantem przeciwciała otrzymanego metodą dojrzewania powinowactwa i ma zwiększone powinowactwo wobec ludzkiego CD22.
Kalicheamycyna w koniugacie kompozycji według wynalazku jest N-acetylo-gamma-kalicheamycyną.
Pochodna kalicheamycyny może być funkcjonalizowana 3-merkapto-3-metylo-butanoilohydrazydem.
Łącznikiem stosowanym do sprzęgania leku z nośnikiem, jak to zostało niniejszym opisane, jest ulegający hydrolizie łącznik, który jest zdolny do uwolnienia cytotoksycznego leku z koniugatu po jego związaniu i wejściu do komórek docelowych. Zdolnym do hydrolizy łącznikiem może być kwas 4-(4-acetylofenoksy)butanowy (AcBut).
Niniejszym opisano również monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciw-CD22, o wzorze Pr(X-S-S-W)m, w którym: Pr oznacza przeciwciało przeciwko CD22; X oznacza zdolny do hydrolizy łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może re6
PL 224 150 B1 agować z przeciwciałem; W oznacza rodnik kalicheamycyny; m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym kalicheamycyna stanowi 4-10% wagowych koniugatu; a (-X-S-S-W)m oznacza pochodną kalicheamycyny.
Wyżej wskazane przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab i fragment F(ab)2.
Przeciwciałem jest przeciwciało przeciwko CD22 o swoistości wobec ludzkiego CD22, które zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako H1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 2) albo jako H2' (SEKW. NR ID: 13) lub jako H2 (SEKW. NR ID: 15) albo jako H2' (SEKW. NR ID: 16) dla CDR-H2, lub jako H3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 3) dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako L1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 4) dla CDR-L1, jak L2 na Fig. (SEKW. NR ID: 5) dla CDR-L2, albo L3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 6) dla CDR-L3.
Przeciwciało przeciwko CD22 może zawierać łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, albo SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, albo SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.
Przeciwciało przeciwko CD20 może obejmować SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 albo SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 albo SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, oraz SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.
Humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 może być także przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje domenę zmienną obejmującą regiony zrębowe ludzkiego akceptora i CDR nie-ludzkiego donora.
Inne opisane tu humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 zawiera region zrębowy ludzkiego akceptora, w którym regiony domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała są oparte na ludzkiej sekwencji zgodności podgrupy I i w pozycjach 1, 28, 48, 71 i 93 zawierają reszty nie-ludzkiego donora. W innym wykonaniu, humanizowane przeciwciało zawiera ponadto reszty nie-ludzkiego donora w pozycjach 67 i 69.
Humanizowane przeciwciało z przeszczepionym CDR może obejmować domenę zmienną łańcucha lekkiego obejmującą region zrębowy ludzkiego akceptora oparty na ludzkiej sekwencji zgodności podgrupy I, która ponadto zawiera reszty nieludzkiego donora w pozycjach 2, 4, 37, 38, 45 i 60. Przeciwciało z przeszczepionym CDR może ponadto zawierać resztę nie-ludzkiego donora w pozycji 3.
Zgodnie z wynalazkiem, przeciwciało w koniugacie jest przeciwciałem z przeszczepionym CDR i obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).
Przeciwciało z przeszczepionym CDR zgodnie z wynalazkiem obejmuje łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji z SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji z SEKW. NR ID: 30.
Przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR może stanowić wariant przeciwciała otrzymany metodą dojrzewania powinowactwa i ma zwiększone powinowactwo wobec ludzkiego
CD22.
Opisane tu przeciwciało przeciwko CD22 może być chimerycznym przeciwciałem obejmującym sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała monoklonalnego, jak przedstawione odpowiednio w SEKW. NR ID: 7 i SEKW. NR ID: 8.
Alternatywnie przeciwciało przeciwko CD22 obejmuje hybrydowy CDR ze skróconą sekwencją CDR donora, w której brakującą część CDR donora zastąpiono inną sekwencją, która tworzy funkcjonalny CDR.
Według wynalazku pochodną cytotoksycznego leku stanowi N-acetylo-pochodna gamma-kalicheamycyny.
Niniejszym opisano sposób wytwarzania stabilnej, liofilizowanej kompozycji monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik. Stabilną liofilizowaną kompozycję monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik wytwarza się przez (a) rozpuszczenie monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik do końcowego stężenia 0,5 do 2 mg/ml
PL 224 150 B1 w roztworze zawierającym środek krioochronny w stężeniu 1,5%-5% wagowych, polimerowy wypełniacz w stężeniu 0,5-1,5% wagowych, elektrolity w stężeniu 0,01 M do 0,1 M, czynnik ułatwiający rozpuszczanie w stężeniu 0,005-0,05% wagowych, czynnik buforujący w stężeniu 5-50 mM, przy którym końcowe pH roztworu mieści się w zakresie 7,8-8,2, oraz wodę; (b) porcjowanie powyższego roztworu do fiolek w temperaturze +5°C do +10°C; (c) zamrożenie roztworu w temperaturze mrożenia -35°C do -50°C; (d) poddanie zamrożonego roztworu początkowemu etapowi liofilizacji pod pierwszym ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67 do 10,67 Pa (20 do 80 mikronów) przy temperaturze przechowywania od -10°C do -40°C przez 24 do 78 godzin; oraz (e) poddanie liofilizowanego produktu z etapu (d) drugiemu etapowi suszenia pod ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67 do 10,67 Pa (20 do 80 mikronów) przy temperaturze przechowywania od +10°C do + 35°C przez 15 do 30 godzin.
Środek krioochronny stosowany do liofilizacji koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik może być wybrany z grupy obejmującej alditol, mannitol, sorbitol, inozytol, glikol polietylenowy, kwas aldonowy, kwas uronowy, kwas aldarowy, aldozy, ketozy, aminocukry, alditole, inozytole, gliceroaldehydy, arabinozę, liksozę, pentozę, rybozę, ksylozę, galaktozę, glukozę, heksozę, idozę, mannozę, talozę, heptozę, glukozę, fruktozę, kwas glukonowy, sorbitol, laktozę, mannitol, metylo-a-glukopiranozyd, maltozę, kwas izoaskorbinowy, kwas askorbinowy, sorbozę, kwas glukarynowy, erytrozę, treozę, arabinozę, allozę, altrozę, gulozę, idozę, talozę, erytrulozę, rybolozę, ksylulozę, psikozę, tagatozę, kwas glukoronowy, kwas glukonowy, kwas glukarynowy, kwas galakturonowy, kwas mannuronowy, glukozaminę, galaktozaminę, sacharozę, trehalozę, kwas neuraminowy, arabinany, fruktany, galaktany, galakturoniany, glukany, mannany, ksylany, lewan, fukoidan, karageninę, galaktokorolozę, pektyny, kwasy pektynowe, amylozę, pullulan, glukogen, amylopektynę, celulozę, dekstran, pustulan, chitynę, agarozę, keratynę, chrondroitynę, dermatan, kwas hialuronowy, kwas alginowy, żywicę ksantanową, skrobię, sacharozę, glukozę, laktozę, trehalozę, glikol etylenowy, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy, glicerol i pentaerytrytol.
Korzystnie środkiem krioochronnym jest sacharoza, która jest obecna w stężeniu 1,5% wagowych.
Polimerowy wypełniacz stosowany w sposobie liofilizacji może być wybrany spośród dekstranu 40 lub hydroksyetyloskrobi 40, a jego stężenie wynosi 0,9% wagowych.
Elektrolitem stosowanym w roztworze liofilizacyjnym może być chlorek sodu, który jest obecny w stężeniu 0,05 M.
W opisanym sposobie liofilizacji stosuje się czynnik ułatwiający rozpuszczanie. Korzystnie, czynnikiem ułatwiającym rozpuszczanie jest środek powierzchniowo czynny. Szczególnie korzystnie, środkiem powierzchniowo czynnym może być polisorbat 80, który jest obecny w stężeniu 0,01% wagowych.
Jako środek buforujący stosuje się trometaminę, która jest obecna w stężeniu 0,02 M. Korzystnie, na początku etapu liofilizacji pH roztworu wynosi 8,0. Roztwór zawierający koniugat cytotoksyczny lek/nośnik porcjuje się do fiolek w temperaturze +5°C przed rozpoczęciem tego etapu.
Roztwór w fiolkach zamraża się w temperaturze -45°C; zamrożony roztwór poddaje się początkowemu etapowi liofilizacji w warunkach pierwszego ciśnienia suszenia wynoszącego ok. 8 Pa (60 mikronów) i w temperaturze przechowywania -30°C przez 60 godzin; liofilizowany produkt poddaje się drugiemu etapowi suszenia w warunkach drugiego ciśnienia wynoszącego ok. 8 Pa (60 mikronów) i w temperaturze przechowywania +25°C przez 24 godziny.
Niniejszym ujawniono kompozycję zawierającą terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik wytworzonego wyżej opisanym sposobem.
Nośnikiem w monomerycznym koniugacie pochodna cytotoksycznego leku/nośnik jest białkopodobny nośnik wybrany spośród hormonów, czynników wzrostu, przeciwciał i mimetyków przeciwciał.
Białkopodobnym nośnikiem może być ludzkie przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało lub przeciwciało humanizowane.
Humanizowane przeciwciało jest korzystnie skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22.
Przeciwciało przeciwko CD22 wykazuje swoistość wobec ludzkiego CD22 i zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako H1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 2) albo H2' (SEKW. NR ID: 13) lub H2 (SEKW. NR ID: 15) lub H2' (SEKW. NR ID: 16) dla CDR-H2, lub jako H3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 3) dla CDR-H3, oraz obejmuje łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako L1 na Fig. 1 (SEKW. NR
PL 224 150 B1
ID: 4) dla CDR-L1, jako L2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 5) dla CDR-L2, albo jako L3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 6) dla CDR-L3.
Przeciwciało przeciwko CD22 zawiera, korzystnie, łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, albo SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, lub SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.
Bardziej szczegółowo, przeciwciało przeciwko CD22 obejmuje SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2 i SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.
Humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 może być humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).
W szczególności, humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 jest przeciwciało z przeszczepionym CDR o swoistości wobec ludzkiego CD22, które obejmuje łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej SEKW. NR ID: 30.
Przeciwciało z przeszczepionym CDR, może stanowić wariant przeciwciała o zwiększonym powinowactwie wobec ludzkiego CD22, otrzymanego metodą dojrzewania powinowactwa.
Zgodnie z wynalazkiem cytotoksycznym lekiem jest kalicheamycyna, a w szczególności N-acetylo-kalicheamycyna.
Kompozycja tu ujawniona może ewentualnie zawierać dodatkowy środek bioaktywny. Takim środkiem bioaktywnym może być cytotoksyczny lek, czynnik wzrostu lub hormon.
W niniejszym zgłoszeniu opisano sposoby leczenia pacjenta z zaburzeniem proliferacyjnym przez podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej dawki kompozycji farmaceutczynej według wynalazku. Kompozycję tę można podawać podskórnie, dootrzewnowo, dożylnie, dotętniczo, doszpikowo, dokanałowo, przezskórnie, donosowo, miejscowo, dojelitowo, dopochwowo, podjęzykowo lub doodbytniczo. W szczególności, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku podaje się dożylnie.
Kompozycję podaje się człowiekowi cierpiącemu na zaburzenie proliferacyjne, takie jak rak. Rakiem jest rak pochodzenia nabłonkowego złośliwy zależny od limfocytów B. Rakiem złośliwym zależnym od limfocytów B może być białaczka lub chłoniak, który wyraża antygen powierzchni komórki CD22.
Rakiem może też być rak wywodzący się z nabłonka lub mięsak.
W innym aspekcie opisano sposób leczenia raka złośliwego zależnego od limfocytów B przez podawanie pacjentowi z takim rakiem terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji zawierającej koniugat cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22. Rakiem złośliwym zależnym od limfocytów B może być chłoniak, a zwłaszcza chłoniak nieziarniczy.
Oprócz kalicheamycyny stosowanej w rozwiązaniach według wynalazku, cytotoksyczny lek, który może być stosowany do wytwarzania koniugatów jest wybrany z grupy obejmującej tiotepę, taksany, winkrystynę, daunorubicynę, doksorubicynę, epirubicynę, aktynomycynę, autramycynę, azaseryny, bleomycyny, tamoksyfen, idarubicynę, dolastatyny/aurystatyny, hemiasterliny, maytanzynoidy i esperamycyny.
Korzystnie, cytotoksycznym lekiem jest N-acetylo-kalicheamycyna.
Opisane niniejszym leczenie obejmuje podawanie koniugatu cytotoksycznego leku według wynalazku razem z jednym lub więcej środkami bioaktywnymi wybranymi spośród przeciwciał, czynników wzrostu, hormonów, cytokin, antyhormonów, ksantyn, interleukin, interferonów i leków cytotoksycznych.
Środkiem bioaktywnym może być przeciwciało, które jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu w nowotworach złośliwych zależnych od limfocytów B. Przeciwciało skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórki wyrażanym w nowotworach złośliwych zależnych od limfocytów B jest korzystnie wybrane z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko CD129, przeciwciało przeciwko CD20 i przeciwciało przeciwko CD33. Przeciwciała takie obejmują przeciwciała przeciwko CD20, rituximab (RITUXAN).
Środkami bioaktywnymi mogą być cytokiny lub czynniki wzrostu, które obejmują, ale nie wyłącznie interleukinę 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF i G-CSF.
PL 224 150 B1
Środkami bioaktywnymi mogą być także hormony, które obejmują estrogeny, androgeny, progestyny i kortykosteroidy.
Alternatywnie środek bioaktywny stanowi cytotoksyczny lek wybrany spośród doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, aklarubicyny, zorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, karubicyny, nogalamycyny, menogarilu, pitarubicyny, walrubicyny, cytarabiny, gemcytabiny, triflurydyny, ancytabiny, enocytabiny, azacytydyny, doksyflurydyny, pentostatyny, broksurydyny, kapecytabiny, kladrybiny, decytabiny, floksurydyny, fludarabiny, gougerotyny, puromycyny, tegafuru, tiazofuryny, adriamycyny (ADRIAMYCIN), cisplatyny, karboplatyny, cyklofosfamidu, dakarbazyny, winblastyny, winkrystyny, mitoksantronu, bleomycyny, mekloretaminy, prednizonu, prokarbazyny, metotreksatu, fluorouracyli, etopozydu, taksolu, analogów taksolu i mitomycyny.
Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 podaje się, korzystnie, razem z jedną lub więcej niż jedną kombinacją cytotoksycznych leków jako część schematu leczenia, przy czym kombinacja środków cytotoksycznych jest wybrana spośród następujących kombinacji: CHOPP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon); COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon); CAP-BOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, prokarbazyna, bleomycyna, winkrystyna i prednizon); m-BACOD (metotreksat, bleomycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, deksametazon i leukoworyna); ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukowaryna, mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ProMACE-CytaBOM (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, cytarabina, bleomycyna i winkrystyna); MACOP-B (metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon, bleomycyna i leukoworyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABV (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna i winblastyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna), ChlVPP (chlorambucyl, winblastyna, prokarbazyna i prednizon); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd); MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd); DHAP (deksametazon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); ESHAP (etopozyd, metyloprednizolon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna); CAMP (lomustyna, mitoksantron, cytarabina i prednizon); i CVP-1 (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon).
Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 podaje się, korzystnie, przed podaniem jednej lub więcej spośród powyższych kombinacji leków cytotoksycznych. Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 można podawać równie korzystnie po podaniu jednej lub więcej spośród powyższych kombinacji leków cytotoksycznych jako część schematu leczenia.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie agresywnych chłoniaków, przy czym leczenie takie obejmuje podawanie wymagającemu takiego leczenia pacjentowi terapeutycznie skutecznej kompozycji monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny - przeciwciało przeciwko CD22 razem z jednym lub więcej środkami bioaktywnymi.
Ponadto niniejszym opisano zastosowanie kompozycji według wynalazku do leczenia pacjenta z zaburzeniem proliferacyjnym, takim jak nowotwór. Nowotworem takim jest zwłaszcza rak złośliwy zależny od limfocytów B, który wyraża na powierzchni komórki antygen CD22. Rakiem złośliwym zależnym od limfocytów B jest, zwłaszcza białaczka lub chłoniak. W jednym z wykonań, nowotworem jest rak lub białaczka.
Terapeutycznie skuteczną dawkę kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można podawać podskórnie, dootrzewnowo, dożylnie, dotętniczo, doszpikowo, dokanałowo, przezskórnie, donosowo, miejscowo, dojelitowo, dopochwowo, podjęzykowo lub doodbytniczo.
Dożylne podawanie terapeutycznie skutecznej dawki kompozycji według wynalazku jest szczególnie korzystne.
Niniejszym przedstawiono zastosowanie monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 według wynalazku do leczenia pacjenta z rakiem złośliwym zależnym od limfocytów B, takim jak chłoniak nieziarniczy. Monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 można korzystnie podawać z jednym lub więcej środkami bioaktywnymi.
PL 224 150 B1
Wyżej wskazane środki bioaktywne są wybrane z grupy obejmującej przeciwciała, czynniki wzrostu, hormony, cytokiny, antyhormony, ksantyny, interleukiny, interferony i cytotoksyczne leki.
Środek bioaktywny może być przeciwciałem skierowanym przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu przez nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B, takim jak przeciwciało przeciwko CD19, przeciwciało przeciwko CD20 i przeciwciało przeciwko CD33. Korzystnie przeciwciałem przeciwko CD20 jest rituximab (RITUXAN).
Środki bioaktywne obejmują też cytokiny lub czynniki wzrostu, takie jak interleukina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF i G-CSF albo hormony, które obejmują estrogeny, androgeny, progestyny i kortykosteroidy.
Środkiem bioaktywnym może być ponadto cytotoksyczny lek wybrany spośród doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, aklarubicyny, zorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, karubicyny, nogalamycyny, menogarilu, pitarubicyny, valrubicyny, cytarabiny, gemcytabiny, triflurydyny, ancytabiny, enocitabiny, azacytydyny, doksyflurydyny, pentostatyny, broksurydyny, kapecytabiny, kladrybiny, decytabiny, floksurydyny, fludarabiny, gougerotyny, puromycyny, tegafuru, tiazofuryny, adriamycyny (ADRIAMYCIN) , cisplatyny, karboplatyny, cyklofosfamidu, dakarbazyny, winblastyny, winkrystyny, mitoksantronu, bleomycyny, mekloretaminy, prednizonu, prokarbazyny, metotreksatu, flurouracili, etopozydu, taksolu, analogów taksolu i mitomycyny.
Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 można podawać razem z jedną lub więcej niż jedną kombinacją cytotoksycznych środków jako część schematu leczenia, przy czym kombinacja cytotoksycznych środków jest wybrana spośród następujących: CHOPP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon); COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon); CAP-BOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, prokarbazyna, bleomycyna, winkrystyna i prednizon); m-BACOD (metotreksat, bleomycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, deksametazon i leukoworyna); ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ProMACE-CytaBOM (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, cytarabina, bleomycyna i winkrystyna); MACOP-B (metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon, bleomycyna i leukoworyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABV (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna i winblastyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); ChlVPP (chlorambucyl, winblastyna, prokarbazyna i prednizon); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd); MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd); DHAP (deksametazon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); ESHAP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna); CAMP (lomustyna, mitoksantron, cytarabina i prednizon); CVP-1 (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon), ESHOP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny, winkrystyna i cisplatyna); EPOCH (etopozyd, winkrystyna i doksorubicyna przez 96 godzin z dawkami typu bolus cyklofosfamidu i z doustnym podawaniem prednizonu), iCE (ifosfamid, cyklofosfamid i etopozyd), CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna), CHOP-B, (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i bleomycyna), CEPP-B (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna i bleomycyna) i P/DOCE (epirubicyna lub doksorubicyna, winkrystyna, cyklofosfamid i prednizon).
Monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/ przeciwciało przeciwko CD22 można również przed podaniem jednej lub więcej kombinacji cytotoksycznych środków jako część schematu leczenia.
Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 podaje się korzystnie po podaniu jednej lub więcej kombinacji cytotoksycznych środków, jako część schematu leczenia.
Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 podaje się jako część schematu leczenia razem z przeciwciałem skierowanym przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu przez nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B, i ewentualnie dawka taka obejmuje również jedną lub więcej kombinacji środków cytotoksycznych.
PL 224 150 B1
Niniejszym opisano także zastosowanie monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia proliferacyjnego. Lek taki można stosować do leczenia zaburzeń proliferacyjnych zależnych od limfocytów B, sam lub w kombinacji z innymi środkami bioaktywnymi.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
Na Fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasów CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44 (SEKW NR ID:1 do 6).
Na Fig. 2 przedstawiono sekwencję DNA (SEKW NR ID:52 i 53) i białka (SEKW NR ID:7) domeny zmiennej łańcucha lekkiego (VL) mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.
Na Fig. 3 przedstawiono sekwencję DNA (SEKW NR ID:54 i 55) i białka (SEKW NR ID: 8) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.
Na Fig. 4 przedstawiono strategię usuwania miejsca glikozylacji i reaktywnej lizyny w CDR-H2 (SEKW NR ID:9-12 i 14).
Na Fig. 5 przedstawiono projekt przeszczepu dla sekwencji łańcucha lekkiego 5/44 (SEKW NR ID: 7). DPK-9 oznacza sekwencję szkieletu akceptora ludzkiej linii zarodkowej (SEKW NR ID: 17). Linie pionowe wskazują różnice pomiędzy resztami mysimi i ludzkimi. Sekwencje podkreślone wskazują reszty donora, które zostały zachowane w przeszczepie. CDR wskazano tłustą pochyłą czcionką (nie przedstawione dla DPK-9). Przeszczep gL1 (SEKW NR ID: 19) obejmuje 6 reszt, a przeszczep gL2 (SEKW NR ID: 20) obejmuje 7 reszt szkieletu donora.
Na Fig. 6 przedstawiono projekt przeszczepu dla sekwencji łańcucha ciężkiego 5/44 (SEKW NR ID: 8); DP7 (SEKW NR ID: 21) oznacza sekwencję szkieletu akceptora ludzkiej linii zarodkowej. Linie pionowe wskazują różnice pomiędzy resztami mysimi i ludzkimi. Sekwencje podkreślone wskazują reszty donora, które zostały zachowane w przeszczepie. CDR wskazano tłustą pochyłą czcionką (nie przedstawiono dla DP7).
Przeszczepy gH4 (SEKW NR ID: 24) i gH6 (SEKW NR ID: 26) obejmują 6 reszt szkieletu donora. Przeszczepy gH5 (SEKW NR ID: 25) i gH7 (SEKW NR ID: 27) obejmują 4 reszty szkieletu donora.
Na Fig. 7 przedstawiono mapę pMRR14 wektora.
Na Fig. 8 przedstawiono mapę pMRR10.1 wektora.
Na Fig. 9 przedstawiono wyniki testu BIAcore® dla chimerycznych mutantów 5/44.
Na Fig. 10 przedstawiono oligonukleotydy dla połączenia gH1 5/44 i genu gL1 (SEKW NR ID: 32-47).
Na Fig. 11 przedstawiono mapę plazmidu dla przejściowego wektora pCR2.1 (544gH1).
Na Fig. 12 przedstawiono mapę plazmidu dla przejściowego wektora pCR2.2 (544gL1).
Na Fig. 13 przedstawiono kasety oligonukleotydów stosowanych do dalszych przeszczepów (SEKW NR ID: 56-65).
Na Fig. 14 przedstawiono wykres badania kompetycyjnego fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała 5/44 i przeszczepionych wariantów.
Na Fig. 15 przedstawiono wykres badania kompetycyjnego fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała 5/44 i przeszczepionych wariantów.
Na Fig. 16 przedstawiono pełną sekwencję DNA (SEKW NR ID: 29, 31, 66 i 67) i białka (SEKW NR ID: 28 i 30) dla przeszczepionych łańcuchów ciężkiego i lekkiego.
Na Fig. 17 przedstawiono schemat koniugatu DMH przeciwciało-NAc-gamma-kalicheamycyna.
Na Fig. 18 przedstawiono wykres wpływu CMC-544 na wzrost chłoniaka zależnego od limfocytów B RAMOS.
Na Fig. 19 przedstawiono wykres wpływu CMC-544 na duże chłoniaki zależne od limfocytów B w modelu ksenoprzeszczepu u myszy nagich in vivo.
Na Fig. 20 przedstawiono wykres, na którym porównano wpływ CMC-544 wytworzonego w procesie sprzęgania z CMA-676 i z CMC-544 na wzrost chłoniaka RL.
Na Fig. 21 przedstawiono wykres, na którym wykazano, że duży chłoniak RL traktowany rituximabem (RITUXAN) jest podatny na leczenie CMC-544.
Na Fig. 22 przedstawiono wykres ilustrujący wpływ rituximabu (RITUXAN) na cytotoksyczne działanie CMC-544.
Na Fig. 23 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA-676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym wczesnym chłoniakiem RAMOS B.
Na Fig. 24 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA-676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym późnym chłoniakiem RAMOS B.
PL 224 150 B1
Na Fig. 25 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA-676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym późnym chłoniakiem RAMOS B.
Na Fig. 26 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA-676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym późnym chłoniakiem RAMOS B.
Na Fig. 27 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA-676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym późnym chłoniakiem RAMOS B.
Na Fig. 28 przedstawiono wykres ilustrujący aktywność przeciwnowotworową CMC-544 z rituximabem (RITUXAN) i bez rituximabu wobec nieziarniczego chłoniaka RL.
Na Fig. 29 przedstawiono wykres ilustrujący aktywność przeciwnowotworową CMC-544 i CHOP wobec nieziarniczego chłodniaka RL.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Koniugaty tu opisane zawierają cytotoksyczny lek derywatyzowany łącznikiem, który obejmuje dowolną grupę reaktywną, która reaguje z białkopodobnym nośnikiem i tworzy koniugat pochodna cytotoksycznego leku-białkopodobny nośnik. Konkretnie, opisane tu koniugaty, w tym koniugaty w kompozycji według wynalazku, zawierają cytotoksyczny lek derywatyzowany łącznikiem, który obejmuje dowolną reaktywną grupę, która reaguje z przeciwciałem stosowanym jako białkopodobny nośnik, z wytworzeniem koniugatu pochodna cytotoksycznego leku - przeciwciało.
Konkretnie, przeciwciała reagują z antygenem powierzchni komórki nowotworów złośliwych zależnych od limfocytów B. Poniżej opisano ulepszony sposób wytwarzania i oczyszczania takich koniugatów. W wyniku stosowania konkretnych współrozpuszczalników, dodatków i określonych warunków reakcji oraz określonego sposobu rozdzielania, uzyskuje się monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/przeciwciało o znacznie zmniejszonej LCF. W przeciwieństwie do formy zagregowanej, forma monomeryczna ma istotną wartość terapeutyczną, a zmniejszenie LCF i zasadnicze zmniejszenie agregacji prowadzi do wykorzystania wyjściowego przeciwciała w terapeutycznie efektywny sposób przez zapobieżenie współzawodnictwu LCF z wyżej skoniugowaną frakcją (HCF).
I. NOŚNIKI
Nośniki/środki kierujące korzystnie stanowią białkopodobne nośniki/środki kierujące. Jako nośnik/środki kierujące wymienić można hormony, czynniki wzrostu, przeciwciała, fragmenty przeciwciał, mimetyki przeciwciał oraz ich odpowiedniki wytworzone na drodze inżynierii genetycznej lub enzymatycznie i nośniki takie określa się dalej pojedynczo lub w odniesieniu do grupy jako „nośniki. Zasadniczą własnością nośnika jest jego zdolność do rozpoznawania i wiązania się z przeciwciałem lub receptorem związanym z niepożądanymi komórkami, które następnie są internalizowane. Przykłady nośników, które można stosować w opisanych tu koniugatach, ujawniono w patencie USA nr 5,053,394, którego treść wprowadza się tu w całości przez odniesienie. Korzystnymi nośnikami są przeciwciała i mimetyki przeciwciał.
Do wytwarzania mimetyków przeciwciał, które wiążą się z epitopami antygenowymi ze swoistością przeciwciała, stosowano wiele nie-immunoglobulinowych szkieletów białkowych (publikacja zgłoszenia PCT nr WO 00/34784). Przykładowo, zaprojektowano szkielet typu „minibody, który jest pokrewny fałdzie immunoglobuliny, przez wykreślenie trzech nici z domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego (Tramontano i in., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Białko to obejmuje 61 reszt i można je stosować do prezentowania dwóch hiperzmiennych pętli. Te dwie pętle randomizowano i wybrano produkty do wiązania antygenu, ale jak do tej pory przydatność szkieletu okazała się nieco ograniczona, z uwagi na problemy z rozpuszczalnością. Innym szkieletem, który stosuje się do prezentacji pętli jest tendamistat, białko, które swoiście hamuje ssacze alfa-amylazy i stanowi 74 resztę, sześcioniciowego, beta-warstwowego białka typu „sandwich, którego warstwy utrzymywane są razem przez dwa wiązania disulfidowe. (McConnell i Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Szkielet ten obejmuje trzy pętle, ale do tej pory pod względem potencjału randomizacyjnego zbadano tylko dwie z tych pętli.
Jako szkielety badano inne białka i stosowano je do wykazania randomizowanych reszt na powierzchniach alfa-helikalnych (Nord i in., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord i in., Protein Eng. 8:601, 1995), pętli pomiędzy alfa-helisami w wiązkach alfa-helis (Ku i Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995) oraz pętli usztywnionych przez mostki disulfidowe, takich jak obecne w małych inhibitorach proteazy (Markland i in., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland i in., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen i Collins, Gene 164; 243, 1995; Wang i in., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995).
Przykłady nośników przeciwciał, które można stosować w rozwiązaniach tu opisanych, obejmują przeciwciała monoklonalne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, ludzkie przePL 224 150 B1 ciwciała i ich biologicznie aktywne fragmenty. Korzystnie, przeciwciała takie są skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórki wyrażanym na komórkach i/lub tkankach docelowych w zaburzeniach proliferacyjnych, takich jak rak. Przykład y konkretnych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom powierzchni komórki na komórkach docelowych obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciała przeciwko antygenowi CD22, który jest nadmiernie wyrażany w większości chłoniaków zależnych od limfocytów B; G5/44, humanizowaną formę mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD22; przeciwciała przeciwko antygenowi CD33 powierzchni komórki, który jest przeważający w niektórych ludzkich nowotworach szpikowych, zwłaszcza w ostrej białaczce szpikowej; pP67.6, humanizowaną formę mysiego przeciwciała przeciwko CD33 (patrz, patent USA nr 5,773,001); przeciwciało przeciwko antygenowi PEM stwierdzonemu w wielu nowotworach pochodzenia nabłonkowego, oznaczone jako mP67.6 (patrz I.D. Bernstein i in., J. Clin. Invest. 79:1153 (1987) i I.D. Bernstein i in., J. Immunol. 128: 867-881 (1992)); oraz humanizowane przeciwciało przeciwko antygenowi węglowodan-Lewis Y, wyrażanemu nadmiernie w wielu guzach litych, oznaczone jako hu3S193 (patrz, patent USA nr 6,310,185 B1). Ponadto, na rynku dostępnych jest kilka przeciwciał, takich jak rituximab (RITUXAN) i trastuzumab (HERCEPTIN®), które również można stosować jako nośniki/środki kierujące. Rituximab (RITUXAN) jest chimerycznym przeciwciałem przeciwko CD20, stosowanym do leczenia różnych chłoniaków zależnych od limfocytów B, a trastuzumab (HERCEPTIN®) jest humanizowanym przeciwciałem przeciwko Her2 stosowanym do leczenia raka sutka.
Jako nośnik można stosować cząsteczkę humanizowanego przeciwciała z przeszczepionym CDR skierowanego przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22, oznaczonemu G5/44. Przeciwciało to jest humanizowaną formą mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD22, które jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22, przeważającemu w pewnych chłoniakach ludzkich. Stosowane tu określenie „cząsteczka przeciwciała z przeszczepionym CDR odnosi się do cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki obejmuje jeden lub więcej regionów determinujących dopasowanie (CDR), obejmujących zmodyfikowany CDR (dalej CDR) od przeciwciała donora (np. mysiego przeciwciała monoklonalnego) przeszczepiony do szkieletu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptora (np. przeciwciała ludzkiego). Korzystnie, takie przeciwciało z przeszczepionym CDR zawiera domenę zmienną obejmującą regiony zrębowe ludzkiego akceptora, jak również jeden lub więcej spośród CDR donora, jak określone powyżej.
Do przeszczepiania CDR można stosować każdą odpowiednią sekwencję regionu zrębowego części zmiennej akceptora, biorąc pod uwagę klasę/typ przeciwciała donora, od którego pochodzą CDR, w tym regiony zrębowe mysie, naczelnych i ludzkie. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można stosować są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, 1991, U.S. Department of Health i Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health). Przykładowo, KOL i NEWM można stosować dla łańcucha ciężkiego, REI można stosować dla łańcucha lekkiego, a EU, LAY i POM można stosować dla obydwu łańcuchów, ciężkiego i lekkiego.
W przeciwciałach z przeszczepionymi CDR korzystnie jako przeciwciało akceptora stosuje się przeciwciało obejmujące łańcuchy, które są homologiczne z łańcuchami przeciwciała donora. Łańcuchy ciężkie i lekkie akceptora nie muszą koniecznie pochodzić od tego samego przeciwciała i w razie potrzeby mogą obejmować łańcuchy złożone zawierające regiony zrębowe pochodzące od różnych łańcuchów.
W przeciwciałach z przeszczepionymi CDR regiony zrębowe również nie muszą obejmować dokładnie tej samej sekwencji, jak regiony przeciwciała akceptora. Przykładowo, reszty nietypowe można zmienić na reszty występujące częściej w danej klasie lub typie łańcucha akceptora. Alternatywnie, wybrane reszty w regionach zrębowych akceptora można zmienić tak, aby odpowiadały resztom obecnym w tej samej pozycji przeciwciała donora lub na resztę, która stanowi konserwatywne podstawienie dla reszty znajdującej się w tej samej pozycji przeciwciała donora. Zmiany takie powinny być utrzymane w zakresie minimum koniecznego do zachowania powinowactwa przeciwciała donora. Protokół doboru reszt w regionach zrębowych akceptora, które mogą wymagać zmiany, podano w publikacji PCT Nr WO 91/09967, której treść wprowadzono tu w całości.
Reszty donora stanowią reszty z przeciwciała donora, tj. przeciwciała, od którego pierwotnie pochodzą CDR.
Przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR-H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2', w którym sekwencję z potencjalnym miejscem glikozylacji usunięto w celu zwiększenia powinowactwa przeciwciała wobec antygenu.
PL 224 150 B1
Alternatywnie lub ponadto, przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR-H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2'', w którym reszta lizyny znajduje się w pozycji 60. Tę resztę lizyny, która usytuowana jest w eksponowanej pozycji w obrębie CDR-H2, i zgodnie z przypuszczeniami może potencjalnie reagować z czynnikami sprzęgającymi, powodując zredukowanie powinowactwa wiązania z antygenem, zastąpiono alternatywnym aminokwasem.
Ponadto, przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR-H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2''', w którym zarówno sekwencję z miejscem potencjalnej glikozylacji, jak i resztę lizyny w pozycji 60, zastąpiono alternatywnymi aminokwasami.
Przeciwciało tu opisane może być wybrane z grupy obejmującej: przeciwciało kompletne obejmujące łańcuchy ciężkie i lekkie o pełnej długości; jego biologicznie aktywny fragment, taki jak fragment Fab, zmodyfikowany Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv; monomer lub dimer o łańcuchu lekkim lub ciężkim; przeciwciało jednołańcuchowe, np. jednołańcuchowe Fv, w którym domeny zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha są połączone łącznikiem peptydowym. Podobnie, regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego można odpowiednio łączyć z domenami innych przeciwciał.
Przeciwciało może również obejmować zmodyfikowany fragment Fab, w którym modyfikacja polega na addycji jednego lub więcej aminokwasów, w celu umożliwienia przyłączenia cząsteczki efektora lub reportera do C-końca łańcucha ciężkiego. Korzystnie, dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub dwie reszty cysteinowe, do których może być przyłączona cząsteczka efektora lub reportera.
Domeny regionu stałego przeciwciała, jeśli są obecne, można je wybrać w zależności od proponowanej funkcji przeciwciała, a zwłaszcza od funkcji efektorowych, które może być, lub mogą nie być, wymagane. Przykładowo, domenami regionu stałego mogą być domeny ludzkiej IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM. Gdy przeciwciało przeznaczone jest do zastosowań terapeutycznych i funkcje efektorowe przeciwciała są wymagane, szczególnie można stosować domenę regionu stałego ludzkiej IgG, a zwłaszcza izotypów IgG1 i IgG3. Alternatywnie, gdy przeciwciało jest przeznaczone do celów terapeutycznych, a funkcje efektorowe przeciwciała nie są ani wymagane ani pożądane, można stosować izotypy IgG2 i IgG4 lub można zmutować region Fc IgG1 w celu zniesienia funkcji efektorowych.
Przeciwciało tu opisane ma powinowactwo wiązania co najmniej 5x10-8 M, korzystnie co naj-9 -10 -10 mniej 1x10-9 M, bardziej korzystnie co najmniej 0,75x10-10 M, a najkorzystniej co najmniej 0,5x10-10 M.
Niniejszym opisano koniugaty immunotoksyn oraz sposoby wytwarzania tych koniugatów z zastosowaniem wariantów przeciwciał lub mimetyków przeciwciał. Warianty przeciwciał są korzystnie skierowane przeciwko CD22 i wykazują poprawione powinowactwo wobec CD22. Warianty takie można otrzymać zgodnie z wieloma protokołami powinowactwa dojrzewania obejmującymi mutowanie CDR (Yang i in., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mieszanie łańcucha (Marks i in., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), stosowanie czynników mutujących szczepy E. coli (Low i in., J. Mol. Biol., 260, 359-368, 1996), mieszanie DNA (Patten i in., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), stosowanie prezentacji na fagu (Thompson i in., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) oraz metodą seksualnego PCR (ang. sexual PCR) (Crameri i in., Nature, 391,288-291, 1998).
Do wyrażania sekwencji DNA kodujących nośnik obejmujący przeciwciała stosowane w rozwiązaniach według wynalazku można stosować dowolny odpowiedni układ komórka gospodarza/nośnik. Do wyrażania, częściowo, fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty Fab i F(ab')2, a zwłaszcza fragmentów Fv i fragmentów przeciwciała jednołańcuchowego, na przykład jednołańcuchowe Fv, można stosować układy bakteryjne, na przykład E. coli, oraz układy z innymi mikroorganizmami. Do wytwarzania większych przeciwciał, obejmujących cząsteczki kompletnych przeciwciał, jako układy ekspresyjne można stosować eukariotyczne komórki gospodarza, np. komórki ssacze. Odpowiednie ssacze komórki gospodarza obejmują komórki CHO, komórki szpiczaka, komórki drożdży, komórki owadzie, komórki hybrydoma, komórki NSO, VERO lub PER C6. Odpowiednie układy ekspresyjne obejmują również zwierzęta i rośliny transgeniczne.
II. ŚRODKI TERAPEUTYCZNE
Środkami terapeutycznymi odpowiednimi do stosowania w rozwiązaniach opisanych niniejszym są cytotoksyczne leki, które hamują lub przerywają polimeryzację tubuliny, środki alkilujące, które wiążą się i przerywają DNA oraz środki, które hamują syntezę białek lub niezbędnych białek komórkowych, takich jak kinazy białkowe, enzymy i cykliny. Przykłady takich cytotoksycznych leków obejmują, ale nie wyłącznie, tiotepę, taksany, winkrystynę, daunorubicynę, doksorubicynę, epirubicynę, aktyPL 224 150 B1 nomycynę, autramycynę, azaseryny, bleomycyny, tamoksyfen, idarubicynę, dolastatyny/aurystatyny, hemiasterliny, kalicheamycyny, esperamycyny i maytanzynoidy. Korzystnymi cytotoksycznymi lekami są kalicheamycyny, które stanowią przykład antybiotyków przeciwnowotworowych opartych na trisulfidzie metylowym. Przykłady kalicheamycyn, odpowiednich do stosowania zgodnie z wynalazkiem, ujawniono, na przykład, w patentach USA nr 4,671,958; 4,970,198; 5,053,394; 5,037,651 i 5,079,233, które wprowadza się tu w całości przez odniesienie. Korzystnymi kalicheamycynami są pochodne gamma-kalicheamycyny lub N-acetylowe pochodne gamma-kalicheamycyny.
III. KONIUGATY POCHODNA CYTOTOKSYCZNEGO LEKU/NOŚNIK Koniugaty tu opisane mają wzór
Pr(-X-W)m w którym:
Pr oznacza białkopodobny nośnik,
X oznacza łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może reagować z białkopodobnym nośnikiem,
W oznacza cytotoksyczny lek;
m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym kalicheamycyna stanowi 4-10% wagowych koniugatu; a (-X-W)m oznacza cytotoksyczny lek.
Korzystnie, X ma wzór:
(CO - Alk1 - Sp1 - Ar - Sp2 - Alk2 - C(Z1) = Q - Sp), w którym:
Alk1 i Alk2 niezależnie oznaczają wiązanie lub rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch (C1-C10) alkilenowy;
Sp1 oznacza wiązanie, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- albo -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z, gdzie X, Y i Z niezależnie oznaczają wiązanie, -NR'-, -S- lub -O-, pod warunkiem, że gdy n=0, wówczas co najmniej jeden spośród Y i Z musi oznaczać wiązanie, a Ar' oznacza 1,2-, 1,3- albo 1,4-fenylen ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, a takimi jak (C1-C5) alkil, (C1-C4) alkoksyl, (C1-C4) tioalkil, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR',
-O(CH2)nCONHR' albo -S(CH2)nCONHR', pod warunkiem, że gdy Alk1 oznacza wiązanie, Sp1 oznacza wiązanie;
n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 5;
R' rozgałęziony lub nierozgałęziony łańcuch (C1-C5), ewentualnie podstawiony jedną lub dwoma grupami, takimi jak -OH, (C1-C4) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, grupa (C1-C3) dialkilaminowa lub (C1-C3) trialkilo-amonio-A-, w której A- oznacza farmaceutycznie dopuszczalny anion tworzący sól,
Ar oznacza 1,2-, 1,3- lub 1,4-fenylen, ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR',
-CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR',
-O(CH2)nCONHR' lub -S(CH2)nCONHR', w którym n i R' mają uprzednio podane znaczenia, albo
1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- lub 2,7-naftyliden, albo
przy czym każdy naftyliden lub fenotiazyna ewentualnie są podstawione jedną, dwoma, trzema lub czterema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', albo -S(CH2)nCONHR', w których n i R' 1 mają wyżej podane znaczenia, pod warunkiem, że gdy Ar oznacza fenotiazynę, Sp1 oznacza wiązanie przyłączone jedynie do atomu azotu;
2 2 Sp2 oznacza wiązanie, -S- lub -O-, pod warunkiem, że gdy Alk2 oznacza wiązanie, wówczas Sp2 oznacza wiązanie;
PL 224 150 B1 1
Z1 oznacza H, (C1-C5) alkil lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, takimi jak (C1-C5)alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR',
-O(CH2)nCONHR' albo -S(CH2)nCONHR', w których n i R' mają wyżej podane znaczenia;
Sp oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony dwuwartościowy lub trzywartościowy rodnik (C1-C18), dwuwartościowy lub trzywartościowy rodnik arylowy lub heteroarylowy, dwuwartościowy lub trzywartościowy rodnik (C3-C18) cykloalkilowy lub heterocykloalkilowy, dwuwartościowy lub trzywartościowy rodnik (C1-C18) arylo- lub heteroarylo-arylowy, dwuwartościowy lub trzywartościowy rodnik (C1-C18) cykloalkilo- lub heterocykloalkilo-alkilowy albo dwuwartościowy lub trzywartościowy nienasycony rodnik (C2-C18) alkilowy, w których heteroaryl korzystnie oznacza furyl, tienyl, N-metylopirolil, pirydynyl, N-metylo-imidazolil, oksazolil, pirymidynyl, chinolil, izochinolil, N-metylokarbazoil, aminokumarynyl lub fenazynyl, przy czym, gdy Sp oznacza rodnik trzywartościowy, rodnik taki może być dodatkowo podstawiony przez niższą grupę (C1-C5) dialkiloaminową, niższy (C1-C5) alkoksyl, hydroksyl lub niższą grupę (C1-C5) alkilotio;
Q oznacza =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- albo =NHO-.
1
Korzystnie, Alk1 oznacza rozgałęziony lub nierozgałęziony łańcuch (C1-C10) alkilenowy; Sp' oznacza wiązanie, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO- albo -NR', gdzie R' ma wyżej podane znacznie, pod 11 warunkiem, że gdy Alk1 oznacza wiązanie, wówczas Sp1 oznacza wiązanie;
Ar oznacza 1,2-, 1,3- albo 1,4-fenylen ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR'-CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR',
-O(CH2)nCONHR' albo -S(CH2)nCONHR', w których n i R' mają uprzednio podane znaczenia; albo Ar oznacza 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- lub 2,7- naftyliden, z których każdy ewentualnie jest podstawiony jedną, dwoma, trzema lub czterema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR',
-CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' albo -S(CH2)nCONHR'.
1
Z1 oznacza (C1-C5) alkil lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, takimi jak (C1-C5) alkil, (C1-C4) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR',
-CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', lub -S(CH2)nCONHR'; Alk2 i Sp2 razem oznaczają wiązanie; a Sp i Q mają znaczenia, jak podano bezpośrednio powyżej.
W patencie USA nr, 5,773,001, którego treść wprowadzono tu w całości, ujawniono łączniki, które można stosować z pochodnymi nukleofilowymi, zwłaszcza hydrazydami i pokrewnymi substancjami nukleofilowymi, pochodzącymi od kalicheamycyn. Łączniki te są szczególnie przydatne w przypadkach, gdy lepszą aktywność uzyskuje się wówczas, gdy wiązanie utworzone pomiędzy lekiem i łącznikiem ulega hydrolizie. Łączniki takie zawierają dwie grupy funkcyjne. Jedną z tych grup stanowi na ogół grupa kwasu karboksylowego, który stosuje się do reagowania z nośnikiem. Gdy kwasowa grupa funkcyjna jest odpowiednio aktywowana, wówczas może tworzyć wiązanie amidowe z wolną grupą aminową nośnika, taką jak, na przykład, grupa aminowa w łańcuchu bocznym lizyny w przeciwciele lub w innym białkopodobnym nośniku. Inną powszechnie stosowaną grupą funkcyjną jest grupa karbonylowa, tj. grupa aldehydowa lub ketonowa, która reaguje z odpowiednio zmodyfikowanym środkiem terapeutycznym. Grupy karbonylowe mogą reagować z grupą hydrazydową leku, z wytworzeniem wiązania hydrazonowego. Wiązanie to ulega hydrolizie, co umożliwia uwolnienie środka terapeutycznego z koniugatu po związaniu z docelowymi komórkami.
Najkorzystniejszym bifunkcyjnym łącznikiem do stosowania w rozwiązaniach tu opisanych jest kwas 4-(4-acetylofenoksy)butanowy (AcBut), który prowadzi do uzyskania korzystnego produktu, przy czym koniugat taki składa się z β-kalicheamycyny, γ-kalicheamycyny lub N-acetylo-Y-kalicheamycyny funkcjonalizowanej przez reakcję z 3-merkapto-3-metylobutanoilohydrazydem, łącznik AcBut oraz ludzkie lub humanizowane przeciwciało IgG jako nośnik kierujący.
IV. SPRZĘGANIE MONOMERYCZNE
Naturalny hydrofobowy charakter wielu cytotoksycznych leków, łącznie z kalicheamycynami, stwarza trudności przy wytwarzaniu monomerycznych koniugatów leków z dobrymi obciążeniami lekiem i rozsądnymi wydajnościami, co jest konieczne w zastosowaniach terapeutycznych. Problem ten zaostrza się w wyniku zwiększonej hydrofobowości wiązania dostarczonego przez łączniki, takie jak łącznik AcBut, ujawniony w patencie USA nr 5,773,001, jak również wskutek zwiększonej odległości kowalencyjnej oddzielającej środek terapeutyczny od nośnika (przeciwciała).
PL 224 150 B1
W związku z hydrofobowym charakterem leków występuje również agregacja koniugatów pochodna cytotoksycznego leku/nośnik o dużych obciążeniach lekiem. A zatem, w celu uzyskania zadowalających ilości monomerycznego produktu, często konieczne jest zmniejszenie obciążenia lekiem. Jak opisano dla koniugatów ujawnionych w patencie USA nr 5,877,296, z uwagi na nadmierną agregację, w niektórych przypadkach w warunkach reakcji ujawnionych w patencie USA nr 5,053,394, trudno jest wytworzyć koniugaty z rozsądnymi wydajnościami i z obciążeniami lekiem użytecznymi do zastosowań terapeutycznych. W tych warunkach w reakcji sprzęgania jako współrozpuszczalnik stosuje się DMF. Tak więc, pożądane są sposoby, w których uzyska się wyższe obciążenia lekiem/wydajność, bez agregacji i towarzyszącej jej straty substancji.
Ulepszenia w kierunku zmniejszenia agregacji opisano w patentach USA nr 5,712,374 i 5,714,586, których treść powołuje się tu w całości. W patentach tych ujawniono białkopodobne nośniki obejmujące, ale nie wyłącznie, białka, takie jak ludzkie i humanizowane przeciwciało, które stosuje się do kierowania cytotoksycznych środków terapeutycznych, takie jak na przykład hP67.6 oraz inne humanizowane przeciwciała. W patentach tych stwierdzono, że zastosowanie nienukleofilowego, kompatybilnego z białkiem, buforowanego roztworu zawierającego (i) glikol propylenowy jako współrozpuszczalnik oraz (ii) dodatek obejmujący co najmniej jeden kwas C6-C18 karboksylowy, zasadniczo prowadzi do wytworzenia monomerycznych koniugatów pochodna cytotoksycznego leku/nośnik o większym obciążeniu lekiem/wydajności, zmniejszonej agregacji oraz o doskonałej aktywności. Jako korzystne kwasy opisano tam kwasy C7 do C12, a najkorzystniejszy okazał się kwas oktanowy (taki jak kwas kaprylowy) lub jego sole. Korzystnymi buforowanymi roztworami dla koniugatów wytworzonych z estrami N-hydroksysukcynimidu (OSu) lub innymi porównywalnie aktywnymi estrami, były buforowane fosforanem roztwory soli fizjologicznej (PBS) roztwory kwasu N-2-hydroksyetylo-piperazyno-N'-2-etanosulfonowego (bufor HEPES). Stosowane w tych reakcjach sprzęgania buforowane roztwory nie mogą zawierać wolnych grup aminowych lub związków nukleofilowych. Łatwo można określić bufory odpowiednie dla innych typów koniugatów. Alternatywnie, stwierdzono, że gdy stosuje się nienukleofilowy, kompatybilny z białkiem, buforowany roztwór zawierający t-butanol bez substancji dodatkowej, również uzyskuje się monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/nośnik z większym obciążeniem lekiem/wydajnością i o zmniejszonej agregacji.
Ilość współrozpuszczalnika potrzebna do wytworzenia monomerycznego koniugatu zmienia się w zależności od białka i specjalista w tej dziedzinie techniki może ją łatwo określić bez prowadzenia dodatkowych eksperymentów. Ilość dodatku konieczna do efektywnego wytworzenia monomerycznego koniugatu również zmienia się w zależności od przeciwciała. Ilość tę może także ustalić specjalista bez prowadzenia dodatkowych badań. Zgodnie z patentami USA nr 5,712,374 i 5,714,586, gdy w reakcjach sprzęgania stosuje się dodatek glikolu propylenowego w ilościach w zakresie od 10% do 60%, korzystnie 10% do 40%, a najkorzystniej około 30% w odniesieniu do łącznej objętości roztworu, oraz dodatek obejmujący co najmniej jeden kwas C6-C18 karboksylowy lub jego sól, a korzystnie kwas kaprylowy lub jego sól, w ilościach w zakresie od 20 mM do 100 mM, korzystnie od 40 mM do 90 mM, a najkorzystniej około 60 mM do 90 mM, uzyskuje się monomeryczne koniugaty pochodną cytotoksycznego leku/nośnik o wyższym obciążeniu lekiem/wydajności i o zmniejszonej agregacji. Oprócz glikolu propylenowego, można również stosować inne kompatybilne z białkiem organiczne współrozpuszczalniki, takie jak glikol etylenowy, etanol, DMF, DMSO, itd. Niektóre lub wszystkie spośród tych rozpuszczalników stosuje się do przeniesienia leku do mieszaniny, w której prowadzi się reakcję sprzęgania.
Zgodnie z tymi patentami, alternatywnie stężenie kwasu C6-C18 karboksylowego lub jego soli można zwiększyć do 150-300 mM, a ilość współrozpuszczalnika można zmniejszyć do 1-10%. W jednym z wykonań, jako kwas karboksylowy stosuje się kwas oktanowy lub jego sól. W korzystnym wykonaniu, kwasem karboksylowym jest kwas dekanowy lub jego sól. W innym korzystnym wykonaniu, kwasem karboksylowym jest kwas kaprylowy lub jego sól, który stosuje się w stężeniu 200 mM kwasu kaprylowego razem z 5% glikolu propylenowego lub etanolu.
W innym alternatywnym wykonaniu w omawianych patentach, w reakcji sprzęgania można dodawać t-butanol w stężeniach w zakresie od 10% do 25%, a korzystnie 15% w stosunku do łącznej objętości roztworu, z wytworzeniem koniugatów pochodna cytotoksycznego leku/nośnik o wyższym obciążeniu lekiem/wydajności i o zmniejszonej agregacji.
Tak ustalone warunki sprzęgania stosowano do wytwarzania CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin), który jest obecnie sprzedawany na rynku jako MYLOTARG®. Ponieważ terapię tę wprowadzono do leczenia ostrej białaczki szpikowej (AML), metodą chromatografii jonowymiennej stwierdzono,
PL 224 150 B1 że kalicheamycyna nie jest rozprowadzona na przeciwciele w jednorodny sposób. Większość kalicheamycyny znajduje się na około połowie przeciwciała, a pozostała część jest obecna w LCF, która zawiera jedynie małe ilości kalicheamycyny. W konsekwencji, istnieje pilna potrzeba ulepszenia sposobów sprzęgania cytotoksycznych leków, takich jak kalicheamycyna, z nośnikami, które zminimalizują stopień agregacji i umożliwią bardziej jednorodne obciążenie lekiem przy znacznie poprawionej wydajności stanowiącego produkt koniugatu.
Konkretny przykład stanowi koniugat G5/44-NAc-gamma-kalicheamycyna DMH AcBut, który określa się jako CMC-544 i który ogólnie przedstawiono na Fig. 17. Do opracowania CMC-544 pożądane było zmniejszenie ilości LCF do >10% w odniesieniu do całości przeciwciała i rozważano różne sposoby redukcji poziomów LCF. Końcowy rezultat może nie mieć wpływu na inne cechy immunokoniugatu, takie jak wiązanie antygenu i cytotoksyczność. Rozważane opcje obejmowały genetyczną lub fizyczną modyfikację przeciwciała, techniki rozdzielania chromatograficznego lub modyfikację warunków reakcji.
W reakcji przeciwciała G5/44 z NAc-gamma-kalicheamycyną DMH AcBut OSu, z zastosowaniem znanych warunków (warunki stosowane do wytwarzania CMA-676) uzyskano produkt o własnościach fizycznych (obciążenie lekiem, LCF i agregacja) podobnych do CMA-676. Okazało się jednakże, że po sprzęganiu uzyskano niepożądanie wysoki poziom (50-60%) LCF. Optymalne warunki reakcji określono stosując statystyczną metodą projektowania eksperymentu, w której badano kluczowe parametry reakcji, takie jak temperatura, pH, wkład pochodnej kalicheamycyny oraz stężenie dodatku. Analiza tych badań wykazała, że wkład kalicheamycyny i stężenie dodatku mają najbardziej znaczący wpływ na poziom frakcji niskoskoniugowanej (LCF) i tworzenie się agregatów, zaś temperatura i pH mają mniejsze znaczenie. W dodatkowych badaniach wykazano również, że stężenia białkowego nośnika (przeciwciała) i współrozpuszczalnika (etanolu) mają podobnie małe znaczenie (w porównaniu z wkładem kalicheamycyny i stężeniem dodatku) dla kontrolowania LCF i poziomu agregatów. W celu zmniejszenia LCF do <10%, wkład pochodnej kalicheamycyny zwiększono od 3% do 8,5% (wag./wag.) w stosunku do ilości przeciwciała w reakcji. Zmieniono dodatek i zamiast kwasu oktanowego lub jego soli w stężeniu 200 mM (proces CMA-676) stosowano kwas dekanowy lub jego sól w stężeniu 37,5 mM. Reakcja przebiegała lepiej przy nieznacznie podniesionej temperaturze (30-35°C) i pH (8,2-8,7). Po wprowadzeniu tych zmian do warunków reakcji uzyskano zmniejszenie LCF do poziomu poniżej 10%, przy jednoczesnym zwiększeniu obciążenia kalicheamycyną i warunki takie określono jako warunki reakcji CMC-544 lub „nowe warunki sposobu. W Tabeli 1 przedstawiono porównanie wyników otrzymanych w warunkach sposobu CMA-676 i CMC-544.
T A B E L A 1: PORÓWNANIE WARUNKÓW SPOSOBU CMA-676 I CMC-544
WARUNKI/WYNIKI WARUNKI SPOSOBU CMA-676 WARUNKI SPOSOBU CMC-544
Wkład kalicheamycyny 3,0% (wag./wag. w odniesieniu do ciężaru proszku) 8,5% (wag./wag.)
Rodzaj i stężenie dodatku Kwas oktanowy/sól sodowa kwasu octanowego; 200 mM Kwas dekanowy/dekanian sodu; 37,5 mM
Temperatura 26°C 31-35°C
PH 7,8 8,2-8,7
Obciążenie kalicheamycyną (procent wagowy, badanie metodą UV) 2,4-3,5 7,0-9,0
Frakcja niskoskoniugowana (LCF) (przed oczyszczeniem) 45-65% powierzchni według HPLC <10%
Agregacja (przed oczyszczeniem) ~5% <5%
Agregacja (po oczyszczeniu) <2% <2%
Wzrost wkładu kalicheamycyny zwiększył obciążenie lekiem od 2,5-3,0% wagowych do 7,0-9,0% (najczęściej 7,5-8,5) wagowych i nie spowodował zwiększenia agregacji białka w reakcji. Z uwagi na zmniejszenie agregacji i LCF, w warunki sposobu CMC-544 uzyskano bardziej homogeniczny produkt. Nowym sposobem sprzęgania powtarzalnie wytworzono CMC-544 w skali multigramowej w odniesieniu do przeciwciała.
W powyższych reakcjach stężenie przeciwciała może mieścić się w zakresie od 1 do 15 mg/ml, a stężenie pochodnej kalicheamycyny, np. estru OSu N-acetylo-gamma-kalicheamycyny-DMH AcBut
PL 224 150 B1 (stosowanego do wytwarzania koniugatów przedstawionych na Fig. 17), mieści się w zakresie 4,5-11% wagowych w odniesieniu do przeciwciała. Jako współrozpuszczalnik stosowano etanol, dla którego stwierdzono dobre wyniki przy stężeniach w zakresie od 6 do 11,4% (objętościowo). Reakcje prowadzono w PBS, HEPES, w kwasie N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-(4-butanosulfonowym) (HEPBS), albo w innym kompatybilnym buforze, przy pH 8 do 9, w temperaturze w zakresie od 30°C do 35°C, w czasie od 15 minut do 24 godzin. Specjalista w tej dziedzinie techniki bez trudności będzie w stanie ustalić dopuszczalne zakresy pH dla innych typów koniugatów. Stwierdzono, że gdy dla różnych przeciwciał stosuje się nieznaczne zmiany w kombinacjach opisanych powyżej dodatków, uzyskuje się lepsze obciążenie lekiem i lepszą wydajność monomerycznego koniugatu, a zatem należy rozumieć, że w celu osiągnięcia optymalnych rezultatów stosowanie danego nośnika białkowego może wymagać zmian w określonych warunkach lub w doborze dodatków.
V. OCZYSZCZANIE I ODDZIELANIE KONIUGATU
Po sprzęganiu monomeryczne koniugaty można oddzielić od nieskoniugowanych reagentów (takich jak białkopodobny nośnik i wolny cytotoksyczny lek/kalicheamycyna) i/lub od zagregowanych form koniugatów, konwencjonalnymi sposobami, takimi jak chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (SEC), chromatografia interakcji hydrofobowej (HIC), chromatografia jonowymienna (IEC) lub chromatografia z ogniskowaniem (CF). Oczyszczone koniugaty są monomeryczne i zawierają zwykle od 4 do 10% wagowych cytotoksycznego leku/kalicheamycyny. W korzystnym wykonaniu, koniugaty oczyszcza się stosując chromatografię interakcji hydrofobowej (HIC). W sposobach stosowanych uprzednio do produkcji w skali przemysłowej koniugatów cytotoksyczny lek/kalicheamycyna - przeciwciało (proces CMA-676), jako jedyny etap oddzielania po sprzęganiu stosowano chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. Aczkolwiek etap ten jest całkiem skuteczny zarówno do usuwania zagregowanego koniugatu, jak i do dokonywania wymiany buforu dla formulacji, nie jest on skuteczny do zmniejszenia zawartości LCF. W konsekwencji, proces z zastosowaniem SEC do kontroli zawartości LCF w końcowym produkcie opiera się wyłącznie na chemii reakcji sprzęgania. Inną wadą SEC jest ograniczenie objętości wprowadzanej do kolumny mieszaniny do reakcji sprzęgania (zwykle nie przekracza ona 5% objętości złoża kolumny). Ogranicza to poważnie wielkość serii (a zatem i wydajność produkcji), która może być przerobiona w danej przestrzeni produkcyjnej. W końcu, proces oczyszczania SEC prowadzi do znacznego rozcieńczenia koniugatu, co ogranicza stężenie białka, które można uzyskać w formulacji.
Gdy w koniugacie stosuje się lek cytotoksyczny o charakterze wysoce hydrofobowym, jak pochodna kalicheamycyny, wówczas korzystną metodą rozdzielenia skoniugowanego i nieskoniugowanego przeciwciała jest chromatografia interakcji hydrofobowej (HIC). W porównaniu z SEC, HIC ma trzy istotne zalety: (1) umożliwia skuteczne zmniejszenie zawartości LCF, jak również agregatu; (2) wydolność kolumny do HIC jest dużo większa; oraz (3) HIC zapobiega nadmiernemu rozcieńczen iu produktu.
Do skutecznego oddzielenia nieskoniugowanych składników i agregatów koniugatu od monomerycznych składników skoniugowanych w procesie sprzęgania, można stosować wiele wysoko wydajnych ośrodków do HIC, odpowiednich do produkcji w skali przemysłowej, takich jak butylo-, fenyloi oktylo- SEPHAROSE® 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
VI. KOMPOZYCJE I FORMULACJE
Niniejszym opisano sposób wytwarzania kompozycji/formulacji terapeutycznej lub diagnostycznej, obejmującej monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/nośnik oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, rozcieńczalnik lub nośnik.
Monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/nośnik może być jedynym składnikiem kompozycji/formulacji terapeutycznej lub diagnostycznej lub można go łączyć z innymi składnikami aktywnymi, obejmującymi inne przeciwciała, na przykład składniki, którymi są przeciwciała przeciwko CD19, przeciwko CD20, przeciwko CD33, przeciwko limfocytom T, przeciwko IFNy lub przeciwko LPS, składniki nie-przeciwciała, takie jak cytokiny, czynniki wzrostu, hormony, antyhormony, leki cytotoksyczne i ksantyny.
Cytokiny i czynniki wzrostu, które można stosować do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, takich jak rak, i z koniugatami pochodna cytotoksycznego leku/nośnik, obejmują interferony, interleukiny, takie jak interleukina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF i G-CSF.
Hormony powszechnie stosowane do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, takich jak rak, które można stosować z koniugatami pochodna cytotoksycznego leku/nośnik, obejmują estrogeny, takie jak dietylostilbestrol i estradiol, androgeny, takie jak testosteron i halotestyna (HALOTESTIN), progestyny,
PL 224 150 B1 takie jak MEGACE® i PROVERA®, oraz kortykosteroidy, takie jak prednizon, deksametazon i hydrokortyzon.
Z koniugatem pochodna cytotoksycznego leku/nośnik mogą być stosowane antyhormony, które są powszechnie stosowane do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, takich jak rak, jak na przykład antyestrogeny, tj. tamoksyfen, antyandrogeny, tj. flutamid i środki nadnerczowe.
Z koniugatem pochodna cytotoksycznego leku/nośnik można stosować środki chemioterapeutyczne/przeciwnowotworowe powszechnie stosowane do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, takich jak rak. Środki takie obejmują, ale nie wyłącznie, adriamycynę (ADRIAMYCIN), cisplatynę, karboplatynę, winblastynę, winkrystynę, bleomycynę, metotreksat, doksorubicynę, flurouracyle, etopozyd, taksol i różne jego analogi i mitomycynę.
Kompozycje korzystnie powinny zawierać terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu. Stosowane tu określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” odnosi się do ilości środka terapeutycznego, koniecznej do leczenia, złagodzenia lub zapobieżenia docelowej chorobie lub stanowi, lub do uzyskania wykrywalnego skutku terapeutycznego lub prewencyjnego. Terapeutycznie skuteczną dawkę dla danego koniugatu można początkowo określić w badaniach z hodowlą komórkową lub w modelach zwierzęcych, zwykle na gryzoniach, królikach, psach, świniach i naczelnych. Model zwierzęcy można również stosować do określenia odpowiedniego stężenia i drogi podawania. Informacje takie są następnie przydatne do oznaczenia dawek i dróg podawania dla ludzi.
Dokładna skuteczna ilość dla człowieka będzie zależeć od zaawansowania stanu chorobowego, ogólnego stanu zdrowia pacjenta, wieku, ciężaru ciała i płci pacjenta, diety, czasu i częstości podawania, kombinacji z innymi lekami, wrażliwości na lek oraz tolerancji/odpowiedzi na terapię. Ilość tę można określić na drodze rutynowych badań i pozostaje ona w gestii osądu lekarza prowadzącego. Na
2 2 ogół, skuteczna dawka mieści się w zakresie 0,1 mg/m2 do 50 mg/m2, korzystnie 0,4 mg/m2 do 2 2 2 mg/m2, a bardziej korzystnie 2 mg/m2 do 9 mg/m2, i oblicza się ją w odniesieniu do białkopodobnego nośnika.
Kompozycje można podawać pacjentowi osobno lub w kombinacji z innymi środkami, lekami lub hormonami. Dawka, w której podaje się monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/przeciwciało, w tym kompozycję według wynalazku, zależy od rodzaju leczonego, stopnia złośliwości chłoniaka lub białaczki, oraz od tego, czy koniugat stosuje się profilaktycznie, czy do leczenia istniejącego stanu.
Częstość dawki zależy od półokresu trwania koniugatu i długości jego działania. Gdy koniugat ma krótki półokres trwania (np. 2 do 10 godzin), konieczne może być podawanie jednej lub więcej dawek dziennie. Alternatywnie, gdy koniugat ma długi półokres trwania (np. 2 do 15 dni), konieczne może być podawanie jedynie jednej dawki dziennie, jednej dawki na tydzień lub nawet jednej dawki co 1 lub 2 miesiące.
Kompozycja może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do podawania koniugatu z przeciwciałem. Nośnik nie powinien indukować wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla biorcy przyjmującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Odpowiednimi nośnikami mogą być duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe, polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów oraz nieaktywne cząsteczki wirusów.
Można stosować farmaceutycznie dopuszczalne sole, na przykład z kwasami mineralnymi, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany, lub sole z kwasami organicznymi, takie jak octany, propioniany, maloniany i benzoesany.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki w tych kompozycjach mogą ponadto zawierać ciecze, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol i etanol. W kompozycjach mogą być również obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające i emulgujące lub substancje regulujące pH. Nośniki takie umożliwiają wytworzenie kompozycji w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żeli, syropów, papek lub zawiesiny do spożywania przez pacjenta.
Korzystne postacie do podawania obejmują postacie odpowiednie do podawania pozajelitowego, np. przez wstrzykiwanie lub infuzję, na przykład przez wstrzykiwanie preparatów typu bolus lub przez ciągły wlew. Gdy produkt jest w postaci do wstrzykiwania lub infuzji, może on mieć postać zawiesiny, roztworu lub emulsji w olejowym lub wodnym nośniku i może zawierać środki ułatwiające formułowanie preparatu, takie jak czynniki zawieszające, konserwujące, stabilizujące i/lub dyspergujące.
Aczkolwiek stabilność buforowanych roztworów koniugatów jest odpowiednia do krótkotrwałego przechowywania, ich stabilność przy długim przechowywaniu jest słaba. W celu zwiększenia stabilnoPL 224 150 B1 ści koniugatu i czasu jego przechowywania, koniugat przeciwciało-lek można liofilizować do suchej postaci, którą rekonstytuuje się przed użyciem stosując odpowiednią sterylną ciecz. Dobrze znane są problemy związane z liofilizacją roztworu białka. Podczas procesów zamrażania i suszenia mogą wystąpić straty w drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze. W konsekwencji, konieczne jest wprowadzenie środków krioochronnych, które działają jako amorficzny stabilizator koniugatów, zachowując strukturalną integralność białka podczas procesu liofilizacji. Użytecznym środkiem krioochronnym jest alkohol cukrowy, taki jak alditol, mannitol, sorbitol, inozytol, glikol polietylenowy i ich kombinacje. W innym wykonaniu, jak środek krioochronny stosuje się kwas cukrowy, obejmujący kwas aldonowy, kwas uronowy i kwas aldarowy oraz ich kombinacje.
Jako środek krioochronny można również stosować węglowodan. Odpowiednimi węglowodanami są związki aldehydowe lub ketonowe zawierające dwie lub więcej grup hydroksylowych. Węglowodany mogą być cykliczne lub liniowe i obejmują, na przykład, aldozy, ketozy, aminocukry, alditole, inozytole, kwasy aldonowe, kwasy uronowe lub kwasy aldarowe albo ich kombinacje. Węglowodanem może być również mono-, di- lub poliwęglowodan, taki jak, na przykład, disacharyd lub polisacharyd. Odpowiednie węglowodany obejmują, na przykład, gliceroaldehydy, arabinozę, liksozę, pentozę, rybozę, ksylozę, galaktozę, glukozę, heksozę, idozę, mannozę, talozę, heptozę, glukozę, fruktozę, kwas glukonowy, sorbitol, laktozę, mannitol, metylo-a-glukopiranozyd, maltozę, kwas izoaskorbinowy, kwas askorbinowy, lakton, sorbozę, kwas glukarowy, erytrozę, treozę, arabinozę, allozę, altrozę, gulozę, idozę, talozę, erytrulozę, rybulozę, ksylulozę, psikozę, tagatozę, kwas glukuronowy, kwas glukonowy, kwas glukarowy, kwas galakturonowy, kwas mannuronowy, glukozaminę, galaktozaminę, sacharozę, trehalozę lub kwas neuraminowy, albo ich pochodne. Odpowiednie poliwęglowodany obejmują, na przykład, arabinany, fruktany, fukany, galaktany, galakturoniany, glukany, mannany, ksylany (takie jak, na przykład, inulina), lewan, fukoidan, karageninę, galaktokarolozę, pektyny, kwasy pektynowe, amylozę, pullulan, glikogen, amylopektynę, celulozę, dekstran, pustulan, chitynę, agarozę, keratynę, chondroitynę, dermatan, kwas hialuronowy, kwas alginowy, żywicę ksantanową lub skrobię. Szczególnie użytecznymi węglowodanami są sacharoza, glukoza, laktoza, trehaloza oraz ich kombinację. Szczególnie przydatnym środkiem krioochronnym jest sacharoza.
Środkiem krioochronnym jest, korzystnie, węglowodan lub alkohol „cukrowy, którym może być alkohol wielowodorotlenowy. Związkami wielowodorotlenowymi są związki, które zawierające więcej niż jedną grupę hydroksylową. Korzystnie, związki wielowodorotlenowe są liniowe. Odpowiednie związki wielowodorotlenowe obejmują, na przykład, glikole, takie jak glikol etylenowy, glikol polietylenowy i glikol polipropylenowy, glicerol lub pentaerytrytol; albo ich kombinacje.
Środkiem krioochronnym jest w szczególności sacharoza, trehaloza, mannitol lub sorbitol.
Po sformułowaniu kompozycje według wynalazku można bezpośrednio podawać pacjentowi. Pacjentami mogą być zwierzęta. Jednakże, korzystnie kompozycje są wytworzone w postaci odpowiednie do podawania ludziom.
Kompozycje według wynalazku można podawać wieloma drogami, obejmującymi, ale nie wyłącznie, podawanie doustne, dożylne, domięśniowe, dotętnicze, doszpikowe, dokanałowe, dokomorowe, przezskórne (patrz publikacja zgłoszenia PCT nr WO 98/20734), podskórne, dootrzewnowe, dojelitowe, miejscowe, podjęzykowe, dopochwowe lub doodbytnicze. Do podawanie kompozycji według wynalazku można również stosować rozpylacze pod ciśnieniem. Na ogół, kompozycje według wynalazku wytwarza się jako preparaty do wstrzykiwania w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin. Można również wytworzyć stałe postaci odpowiednie do rozpuszczania lub zawieszania w ciekłych nośnikach bezpośrednio przed wstrzykiwaniem.
Na ogół kompozycje dostarcza się bezpośrednio przez wstrzykiwanie podskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe, albo do śródmiąższowej przestrzeni tkanki. Kompozycje można również podawać do miejsca zmienionego chorobowo. Można stosować schematy leczenia, w których podaje się dawkę pojedynczą lub dawki wielokrotne.
Należy rozumieć, że składnikiem aktywnym w kompozycji jest koniugat cytotoksyczny lek/białkopodobny nośnik. Jako taki, składnik ten jest podatny na rozkład w przewodzie żołądkowo-jelitowym. A zatem, gdy kompozycję podaje się tą drogą, musi ona zawierać czynniki zabezpieczające koniugat przed rozkładem, które jednakże uwolnią koniugat natychmiast po zabsorbowaniu z dróg pokarmowych.
Dokładne omówienie farmaceutycznie dopuszczalnych nośników można znaleźć w publikacji Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
PL 224 150 B1
Monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/ humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 (G5/44), CMC-544, jest przeznaczony do stosowania do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, charakteryzujących się komórkami, które na swojej powierzchni wyrażają antygen CD22.
Niniejszym opisano zastosowanie CMC-544 do wytwarzania kompozycji lub leku do leczenia zaburzenia proliferacyjnego, charakteryzującego się komórkami wyrażającymi CD22.
CMC-544 można również stosować w dowolnej terapii, w której pożądane jest zmniejszenie poziomu komórek wyrażających CD22, które są obecne u pacjentów leczonych kompozycją według wynalazku. Konkretnie, kompozycję lub lek stosuje się do leczenia ludzi lub zwierząt z zaburzeniami proliferacyjnymi, a mianowicie chłoniakami i białaczkami, w który na powierzchni komórki wyrażany jest antygen CD22. Takie komórki wyrażające CD22 mogą krążyć w organizmie pacjenta lub mogą być lokalizowane w konkretnym miejscu w organizmie w niepożądanie wysokiej ilości.
CMC-544 można również korzystnie stosować do leczenia nowotworów złośliwych związanych z limfocytami B, obejmujących chłoniaki i białaczki, a najkorzystniej chłoniaka nieziarniczego (NHL), ostrej białaczki limfocytowej (ALL), szpiczaka mnogiego, ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) i przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL). Do leczenia pacjentów cierpiących na nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B CMC-544 można stosować sam lub w kombinacji z innymi środkami bioaktywnymi.
Powszechnie stosowane bioaktywne środki obejmują czynniki wzrostu, cytokiny i środki cytotoksyczne. Środki cytotoksyczne powszechnie stosowane do leczenia zaburzeń proliferacyjnych, takich jak rak, które można stosować z CMC-544, obejmują antracyklinę, taką jak doksorubicyna, daunorubicyna, idarubicyna, aklarubicyna, zorubicyna, mitoksantron, epirubicyna, karubicyna, nogalamycyna, menogaril, pitarubicyna i walrubicyna przez okres do trzech dni; nukleozydy pirymidynowe lub purynowe, takie jak cytarabina, gemcytabina, triflurydyna, ancytabina, enocytabina, azacytydyna, doksyflurydyna, pentostatyna, broksurydyna, kapecytabina, kladrybina, decytabina, floksurydyna, fludarabina, gougerotyna, puromycyna, tegafur i tiazofuryna. Inne środki chemioterapeutyczne/ przeciwnowotworowe, które można podawać w kombinacji z CMC-544, obejmują adriamycynę (ADRIAMYCIN), cisplatynę, karboplatynę, cyklofosfamid, dakarbazynę, winblastynę, winkrystynę, mitoksantron, bleomycynę, mekloretaminę, prednizon, prokarbazynę, metotreksat, flurouracyle, etopozyd, taksol i różne jego analogi i mitomycynę. CMC-544 można podawać jednocześnie z jednym lub więcej spośród tych środków terapeutycznych. Alternatywnie, CMC-544 można podawać po podaniu jednego lub więcej spośród tych środków terapeutycznych.
CMC-544 można również podawać sam, jednocześnie lub po podaniu kombinacji innych środków bioaktywnych, takich jak czynniki wzrostu, cytokiny, steroidy, przeciwciała, takie jak przeciwciało przeciwko CD22, rituximab (RITUXAN) i środki chemioterapeutyczne, jako część schematu leczenia. Ustalone schematy do leczenia złośliwych zaburzeń limfoproliferacyjnych obejmują CHOPP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna), CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon), COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon), CAP-BOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, prokarbazyna, bleomycyna, winkrystyna i prednizon), m-BACOD (metotreksat, bleomycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, deksametazon i leukoworyna), ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna), ProMACE-CytaBOM (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, cytarabina, bleomycyna i winkrystyna), MACOP-B (metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, ustalona dawka prednizonu, bleomycyna i leukoworyna), MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna), ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna), MOPP naprzemiennie z ABV (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna i winblastyna) i MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna) i ChlVPP (chlorambucyl, winblastyna, prokarbazyna i prednizon). Terapia może obejmować fazę wprowadzającą, fazę wzmacniającą i fazę podtrzymującą leczenie. CMC-544 można także podawać sam, jednocześnie lub kolejno w dowolnym z opisanych powyżej schematów leczenia, jako część faz terapii wprowadzającej, wzmacniającej lub podtrzymującej.
Koniugaty tu opisane można również podawać razem z innymi środkami bioaktywnymi i chemioterapeutycznymi, jako część schematu skojarzonej chemioterapii do leczenia nawracających agresywnych chłoniaków. Takie schematy leczenia obejmują IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd), MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd), DHAP (deksametazon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna), ESHAP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny i cisplatina), EPOCH (etopozyd, winkrystyna i doksorubicyna przez 96 godzin z dawkami typu bolus cyklofosfamidu i doustnymi dawkami prednizonu), CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna),
PL 224 150 B1
CAMP (lomustyna, mitoksantron, cytarabina i prednizon), CVP-1 (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon), CHOP-B, (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i bleomycyna), CEPP-B (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna i bleomycyna) i P/DOCE (epirubicyna lub doksorubicyna, winkrystyna, cyklofosfamid i prednizon). Dodatkowe schematy leczenia agresywnych chłoniaków mogą obejmować w fazie 1 pierwszą linię leczenia CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon)-rituximab (RITUXAN)-CMC-544, a następnie w fazie 2 i w fazie 3 leczenie CHOP-rituximab (RITUXAN), CHOP-CMC-544 albo CHOP-rituximab (RITUXAN)-CMC-544. Alternatywnie, faza 1 może obejmować w pierwszej linii leczenie COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon)-rituximab (RITUXAN)-CMC-544, a następnie w fazie 2 i w fazie 3 leczenie COP-rituximab (RITUXAN), COP-CMC-544 albo COP-rituximab (RITUXAN)-CMC-544. W innym wykonaniu, leczenie agresywnych chłoniaków może obejmować pierwszą lub drugą linię leczenia koniugatem CMC-544 przeciwciało-lek w fazie 1, a następnie w fazie 2 i w fazie 3 leczenie CMC-544 i CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon), CMC-544 i COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon), CMC-544 z rituximabem (RITUXAN) albo samym rituximabem (RITUXAN). W jeszcze innym wykonaniu, leczenie agresywnych chłoniaków może obejmować pierwszą linię leczenia koniugatem CMC-544, a następnie w fazie 2 i 3 leczenie samym CMC-544 lub w kombinacji z innymi schematami leczenia obejmującymi, ale nie wyłącznie, ESHOP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny, winkrystyna i cisplatin), EPOCH (etopozyd, winkrystyna i doksorubicyna przez 96 godzin z dawkami typu bolus cyklofosfamidu i doustnymi dawkami prednizonu) iMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd), ASHAP (adriamycyna (ADRIAMYCIN), solumedrol, Ara-C i cisplatyna), MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd) i ICE (ifosfamid, cyklofosfamid i etopozyd). Szczegółowy opis leków cytotoksycznych stosowanych w chemioterapii nowotworów złośliwych, obejmujący kombinację schematów chemioterapii, dawkowanie, itd., które opisano w niniejszym zgłoszeniu, można znaleźć w publikacji Cancer Principles and Practice of Oncology, red. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, wydanie 6, wydawcy: Lippincott, Williams i Wilkins (2001) oraz w Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, red. Edward Chu i Vincent T. DeVita, wydawcy: Jones i Bartlett, (2002).
Niniejszym ujawniono sposoby leczenia ludzi i zwierząt cierpiących lub narażonych na ryzyko wystąpienia zaburzenia proliferacyjnego, które charakteryzuje się komórkami wyrażającymi CD22, który obejmuje podawanie pacjentowi skutecznej ilości CMC-544 według wynalazku.
Wynalazek opisano poniżej w odniesieniu do konkretnych przykładów wykonania, które mają charakter ilustracyjny i nie ograniczają zakresu wynalazku.
P R Z Y K Ł A D 1
WYTWARZANIE PRZECIWCIAŁ KANDYDATÓW
Wybrano panel przeciwciał przeciwko CD22 z hybrydoma, stosując następujące kryteria wyboru: wiązanie się z komórkami Daudi, internalizacja na komórkach Daudi, wiązanie się z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej (PBMC), internalizacja na PBMC, powinowactwo (wyższe niż 10-9 M), mysie γ1 i szybkość produkcji. Jako korzystne przeciwciało wybrano 5/44.
I KLONOWANIE GENU I WYRAŻANIE CZĄSTECZKI PRZECIWCIAŁA CHIMERYCZNEGO 5/44
a) Przygotowanie komórek hybrydoma 5/44 i przygotowanie RNA z tych komórek
Hybrydoma 5/44 wytworzono stosując technologię konwencjonalną dla hybrydoma, po immunizacji myszy ludzkim białkiem CD22. Z komórek hybrydoma 5/44 uzyskano RNA stosując zestaw RNEasy (Qiagen, Crawley, UK; Nr katalogowy 74106). Tak otrzymany RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA, jak opisano poniżej.
b) Rozmieszczenie CD22 na komórkach nowotworowych NHL
W celu zbadania występowania i rozmieszczenia barwnika prowadzono badanie immunohistochemiczne, stosując przeciwciała monoklonalne 5/44 przeciwko CD22. Do badania włączono kontrolne przeciwciała przeciwko CD20 i przeciwko CD79a w celu potwierdzenia występowania obszarów z nowotworami zależnymi od limfocytów B.
Badano łącznie 50 nowotworów, które podzielono na kategorie w następujący sposób, stosując systemy do klasyfikacji Working Formulation i REAL:
• 7 B białaczka limfoblastyczna/chłoniak (wysokie/l) • 4 B CLL/mały chłoniak limfocytowy (niskie/A) • 3 chłoniak limfoplazmocytowy/chłoniak immunocytarny (niskie/A) • 1 komórka kory mózgowej (Int/F) • 14 chłoniak grudkowy (niskie do Int/D) • 13 rozsiany chłoniak wielkokomórkowy (Int do wysokie/G,H)
PL 224 150 B1 • 6 niesklasyfikowanych (K) • 2 chłoniaki z limfocytów T
Czterdzieści chłoniaków zależnych od limfocytów B było pozytywnych wobec antygenu CD22 z przeciwciałem 5/44 przy stężeniu 0,1 gg/ml, a sześć następnych okazało się pozytywnych po zwiększeniu stężenia do 0,5 gg/ml. Dla pozostałych dwóch nowotworów zależnych od limfocytów B, które były negatywne przy stężeniu 0,1 gg/ml, ilość tkanki była niewystarczająca do badania wyższego stężenia. Jednakże, w równoległym teście z innym przeciwciałem przeciwko CD22 oznaczonym 6/13 (Celltech, Slough, UK), które dało silniejsze zabarwienie niż 5/44, dla wszystkich 48 chłoniaków z limfocytów B uzyskano zabarwienie pozytywne dla CD22.
A zatem, można wywnioskować, że antygen CD22 jest powszechnie wyrażany w chłoniakach zależnych od limfocytów B, a zatem stanowi on odpowiedni cel w immunoterapii NHL.
c) Klonowanie VH i VL metodą PCR
Stosując odwrotną transkryptazę zsyntetyzowano sekwencje cDNA kodujące domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego 5/44 i otrzymano jednoniciowy cDNA, który jest kopią mRNA obecnego w całkowitym RNA. Następnie kopie te stosowano jako matrycę do amplifikacji sekwencji mysiego regionu zmiennego, stosując swoiste startery oligonukleotydowe i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
i) Synteza cDNA cDNA zsyntetyzowano w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 gl, zawierającej następujące reagenty: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 10 mM ditiotreitolu, 3 mM MgCl2, 0,5 mM dATP, dTTP, dCTP i dGTP, 20 jednostek RNAzyny, 75 ng losowego startera heksanukleotydowego, 2 gg 5/44 RNA i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 42°C przez 60 minut, po czym reakcję zakończono przez ogrzewanie w temperaturze 95°C przez 5 minut.
II) PCR
Porcje cDNA poddano PCR, stosując kombinacje starterów swoistych dla łańcucha ciężkiego i lekkiego. Jako startery w przód stosowano degenerowane pule starterów zaprojektowanych do annealingu z sekwencjami konserwatywnymi peptydu sygnałowego. Wszystkie te sekwencje zawierają, w kolejności, miejsce restrykcyjne (VL Sful; VH Hindlll) począwszy od 7 nukleotydów od końca 5', sekwencję GCCGCCACC (SEKW. NR ID: 50), pozwalającą na optymalną translację wytworzonych mRNA, kodon inicjacji oraz 20-30 nukleotydów opartych na sekwencjach peptydu liderowego znanych przeciwciał mysich (Kabat i in., supra).
Startery 3' są zaprojektowane tak, że obejmują połączenie J-C regionu zrębowego 4 przeciwciała i zawierają miejsce restrykcyjne dla enzymu BsiWI, ułatwiające wklonowanie fragmentu VL PCR. Startery 3' łańcucha ciężkiego są mieszaniną zaprojektowaną tak, że obejmują połączenie J-C przeciwciała. W celu ułatwienia klonowania starter 3' obejmuje miejsce restrykcyjne Apal. Region 3' starterów zawiera mieszaną sekwencję opartą na sekwencjach znalezionych w znanych przeciwciałach mysich (Kabat i in., 1991, supra).
Kombinacje opisanych powyżej starterów umożliwiają bezpośrednie wklonowanie produktów PCR dla VH i VL do odpowiedniego wektora ekspresyjnego (patrz poniżej), z wytworzeniem chimerycznych (mysio-ludzkich) łańcuchów ciężkiego i lekkiego oraz ekspresję tych genów w komórkach ssaczych, z wytworzeniem przeciwciał chimerycznych żądanego izotypu.
Inkubacje (100 gl) w reakcjach PCR prowadzono w następujący sposób. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM dATP, dTTP, dCTP i dGTP, 10 pmoli mieszaniny starterów 5', 10 pmoli startera 3', 1 gl cDNA i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 95°C przez 5 minut, a następnie w cyklu w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 1 minutę i w 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach porcje każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym.
Gdy annealing puli startera w obrębie miejsca startu regionu zrębowego I zastąpiono pulą startera peptydu sygnałowego, dla regionu V łańcucha ciężkiego otrzymano jedynie amplifikowany produkt DNA. Fragmenty wklonowano do wektorów sekwencyjnych DNA. Sekwencje DNA określono i poddano translacji, uzyskując wydedukowaną sekwencję aminokwasową. Tę wydedukowaną sekwencję zweryfikowano przez odniesienie do eksperymentalnie określonej N-końcowej sekwencji białka. Na Fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasową CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44. Na Fig. 2 i 3 przedstawiono sekwencję DNA/białko odpowiednio dla dojrzałych regionów V łańcucha lekkiego i ciężkiego mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.
PL 224 150 B1 iii) Klonowanie molekularne fragmentów PCR
Sekwencje mysiego regionu V wklonowano następnie do wektorów ekspresyjnych pMRR10.1 i pMRR14 (Fig. 7 i 8). Są to wektory do wyrażania łańcucha lekkiego i ciężkiego zawierające DNA kodujący stałe regiony ludzkiego łańcucha lekkiego kappa i ludzkiego łańcucha ciężkiego gamma-4. Region VL subklonowano do wektora ekspresyjnego przez trawienie restrykcyjne i ligację z wektora sekwencjonującego przy użyciu miejsc restrykcyjnych Sful i BsiWI i otrzymano plazmid pMRR10(544cL) (Fig. 8). Łańcuch ciężki DNA amplifikowano metodą PCR, a do wprowadzenia peptydu sygnałowego stosowano starter 5', a ponieważ nie otrzymano go w strategii klonowania, stosowano lider łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała z różnych hodowli hybrydoma (oznaczony 162). Starter 5' miał następującą sekwencję: 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTC TCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' (SEKW. NR ID: 51).
Starter do tyłu był identyczny, jak stosowany w początkowym klonowaniu genu VH. Wytworzony produkt PCR trawiono enzymami HindIII i Apal, subklonowano i jego sekwencję DNA potwierdzono wytwarzając plazmid pMRR14(544cH) (Fig. 7). Po przejściowej kotransfekcji obydwu wektorów ekspresyjnych do komórek CHO otrzymano chimeryczne przeciwciało c5/44. Do tego celu jako reagent stosowano Lipofectamine, zgodnie z zaleceniami producenta (InVitrogen:Life Technology, Groningen, The Netherlands. Nr katalogowy 11668-027).
II. USUNIĘCIE MIEJSCA GLIKOZYLACJI I REAKTYWNEJ LIZYNY
Sekwencję z potencjalnym N-związanym miejscem glikozylacji zauważono w CDR-H2 o sekwencji aminokwasowej N-Y-T (Fig. 3). SDS-PAGE, Western blotting i wybarwianie węglowodanem żeli 5/44 i ich fragmentów (obejmujących Fab) wskazuje, że miejsce to było faktycznie glikozylowane (nie pokazano). Ponadto, w eksponowanej pozycji w obrębie CDR-H2 obserwowano resztę lizyny, która jest zdolna do zmniejszenia powinowactwa wiązania przeciwciała przez dostarczenie dodatkowego miejsca do sprzęgania ze środkiem, z którym może być sprzęgane przeciwciało.
Do wprowadzenia podstawień aminokwasów do sekwencji CDR-H2 w celu usunięcia miejsca glikozylacji i/lub reaktywnej lizyny stosowano strategię PCR, jak przedstawiono na Fig. 4 (SEKW NR ID: 9-12 i 14). Do usunięcia miejsce glikozylacji stosowano startery do przodu kodujące mutacje N55Q, T57A lub T57V (Fig. 4, SEKW NR ID: 10-12), a czwarty starter do przodu zawierający podstawienie K60R wytworzono do usunięcia reaktywnej reszty lizyny (Fig. 4, SEKW NR ID: 14). W każdej z tych amplifikacji PCR stosowano starter do tyłu regionu zrębowego 4. Produkty PCR trawiono enzymami Xbal i Apal i wstawiono do pMRR14(544cH) (także przeciętego Xbal i Apal), otrzymując plazmidy ekspresyjne kodujące te mutanty. Mutacje N55Q, T57A i T57V odcinają miejsce glikozylacji przez zmianę sekwencji aminokwasów z dala od sekwencji zgodności N-X-T/S, zaś mutacja K60R zastępuje potencjalnie reaktywną lizynę resztą argininy o podobnym ładunku dodatnim. Otrzymane warianty plazmidów cH kotransfekowano z plazmidem cL i otrzymano wyrażane warianty przeciwciał chimerycznych.
III. OCENA AKTYWNOŚCI GENÓW CHIMERYCZNYCH
Aktywności genów chimerycznych oceniano po przejściowym transfekowaniu do komórek CHO i oznaczeniu stałych powinowactwo metodą analizy BiaCore®.
Powinowactwa chimerycznych 5/44 lub ich wariantów, w których usunięto miejsce glikozylacji lub ich reaktywną lizynę, badano stosując technologię BIA do wiązania z konstruktami CD22-mFC. Wyniki przedstawiono na Fig. 9. Wszystkie pomiary wiązania prowadzono stosując aparaturę BIAcore® 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja). Badanie prowadzono przez wyłapywanie CD22mFc przez immobilizowane przeciw-mysie Fc. Przeciwciało było w fazie rozpuszczalnej. Do immobilizowanego przeciw-mysiego Fc wstrzykiwano próbki, wzorzec i kontrole (50 μΊ), a następnie przeciwiało w fazie rozpuszczalnej. Po każdym cyklu powierzchnię regenerowano 50 μl 40 mM HCl przy 30 gl/min. Analizę kinetyczną prowadzono stosując oprogramowanie BIAevaluation 3.1 software (Pharmacia).
Usunięcie miejsca glikozylacji w konstrukcie T57A spowodowało nieznacznie większe szybkości wiązania (ang. on-rate) i znacząco mniejsze szybkości dysocjacji (ang. off-rate) w porównaniu z chimerycznym 5/44, co dało około 5-krotną poprawę powinowactwa. Mutacja N55Q nie miała wpływu na powinowactwo. Wynik ten jest nieoczekiwany, ponieważ sugeruje, że usunięcie samego węglowodanu w oczywisty sposób nie wpływa na wiązanie (jak w przypadku zmiany N55Q). Poprawę powinowactwa obserwowano jedynie przy zmianie T57A. Zgodnie z jednym z możliwych wyjaśnień, niezależnie od obecności węglowodanu, treonina w pozycji 57 ma negatywny wpływ na wiązanie, który jest usuwany
PL 224 150 B1 w wyniku konwersji treoniny do alaniny. Hipoteza, że istotna jest mała wielkość alaniny, a negatywny wpływ treoniny ma związek z jej wielkością, jest oparta na wynikach uzyskanych z zastosowaniem mutacji T57V: nie jest korzystne zastąpienie waliny w pozycji 57 (nie pokazano).
Usunięcie reszty lizyny przez mutację K60R ma obojętny wpływ na powinowactwo, tj. wprowadzenie reszty argininy usuwa potencjalnie reaktywne miejsce, bez uszczerbku dla powinowactwa.
A zatem, do sposobu humanizacji włączono zarówno mutacje w celu usunięcia miejsca glikozylacji, jak i w celu usunięcia reaktywnej lizyny.
P R Z Y K Ł A D 2
PRZESZCZEPIENIE CDR DO 5/44
Powyżej opisano metody klonowania molekularnego genów dla regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała 5/44 oraz ich zastosowanie do wytwarzania chimerycznych (mysio/ludzkich) przeciwciał 5/44. Na Fig. 2 i 3 przedstawiono sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe domen VL i VH mysiego 5/44 (odpowiednio SEKW. NR ID:7 i 8). W przykładzie tym opisano przeszczepienie CDR przeciwciała 5/44 do ludzkich regionów zrębowych w celu zmniejszenia potencjalnej immunogenności u ludzi, zgodnie z metodą Adair i in. (publikacja zgłoszenia PCT nr WO 91/09967).
I. PRZESZCZEPIENIE CDR Z LEKKIEGO ŁAŃCUCHA 5/44
Zestawienie sekwencji białkowej z sekwencjami najwyższej zgodności ludzkiego regionu V łańcucha lekkiego podgrupy I kappa wykazało 64% identyczności sekwencji. W konsekwencji, do skonstruowania łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR wybrane regiony zrębowe akceptora odpowiadały regionom ludzkiej linii zarodkowej 012 VK podgrupy I, sekwencji DPK9. Sekwencja akceptora regionu zrębowego 4 pochodziła od ludzkiej sekwencji JK1 linii zarodkowej regionu J (SEKW NR ID: 18).
Przedstawione na Fig. 5 porównanie sekwencji aminokwasów regionów zrębowych mysiego 5/44 (SEKW NR ID: 7) i sekwencji akceptora (SEKW NR ID: 17) wskazuje na 27 różnic pomiędzy łańcuchami donora i akceptora. W każdej pozycji analizowano potencjalną resztę mysią, która pośrednio bądź bezpośrednio przyczynia się do wiązania z antygenem, poprzez wpływ na upakowanie lub przy międzyprzestrzeni VH/VL. Gdy resztę mysią uznawano za ważną i wystarczająco różniącą się od reszty ludzkiej pod względem wielkości, polarności lub ładunku, wówczas resztę mysią zachowywano. W oparciu o tę analizę skonstruowano dwie wersje łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR, o sekwencjach przedstawionych jako SEKW. NR ID: 19 i SEKW. NR ID: 20 (Fig. 5).
II. PRZESZCZEPIENIE CDR Z ŁAŃCUCHA CIĘŻKIEGO 5/44
Do łańcucha ciężkiego 5/44 przeszczepiono CDR, stosując tę samą strategię, jak w przypadku łańcucha lekkiego. Stwierdzono, że domena V ciężkiego łańcucha 5/44 jest homologiczna z ludzkimi łańcuchami ciężkimi należącymi do podgrupy I (70% identyczności sekwencji), a zatem jako region zrębowy akceptora stosowano ludzki region zrębowy VH1, DP7 linii zarodkowej podgrupy I. Sekwencje akceptora regionu zrębowego 4 pochodziły od ludzkiej sekwencji linii zarodkowej regionu J, JH4 (SEKW NR ID: 22).
Na Fig. 6 przedstawiono porównanie łańcucha ciężkiego 5/44 z regionami zrębowymi i jak można zauważyć, łańcuch ciężki 5/44 (SEKW NR ID: 8) różni się od sekwencji akceptora (SEKW NR ID: 21) w 22 pozycjach. Zgodnie z założeniem, że każda z tych zmian może przyczynić się do wiązania antygenu, skonstruowano 5 wersji łańcuchów ciężkich z przeszczepionym CDR, o sekwencjach przedstawionych jako SEKW. NR ID: 23, SEKW. NR ID: 24, SEKW. NR ID: 25, SEKW. NR ID: 26 i SEKW. NR ID: 27 (Fig. 6).
III. KONSTRUOWANIE GENÓW DLA PRZESZCZEPIONYCH SEKWENCJI
Zaprojektowano geny do kodowania przeszczepionych sekwencji gH1 i gL1 i zaprojektowano i skonstruowano serie nakładających się oligonukleotydów (Fig. 10, SEKW NR ID: 32-47). Do konstruowania genów regionów V z przeszczepionym CDR stosowano technikę składania PCR. Przygotowano mieszaniny reakcyjne o objętości 100 pl zawierające 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,001% żelatyny, 0,25 mM dATP, dTTP, dCTP i dGTP, 1 pmol każdego z „wewnętrznych starterów (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmoli każdego z „zewnętrznych” starterów (F1, R1) i 1 jednostkę polimerazy Taq (AmpliTaq, Applied BioSystems, Nr katalogowy N808-0171). Stosowano następujące parametry cykli PCR: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę, dla 30 cykli. Produkty reakcji przepuszczono następnie przez 1,5% żel agarozowy, odcięto i odzyskano na kolumnach QIAGEN spin (zestaw do ekstrakcji żelowej QIAquick Nr katalogowy 28706). Wyeluowano DNA w objętości 30 pl. Porcje (1 pl) DNA gH1 i gL1 wklonowano następnie do wektora do klonowania pCR2.1 TOPO, stosując InVitrogen TOPO TA (nr katalogowy K4500-01) zgodnie
PL 224 150 B1 z instrukcją producenta. Ten nieekspresyjny wektor służył jako przejściowy produkt do klonowania w celu ułatwienia sekwencjonowania dużej ilości klonów. Do identyfikacji prawidłowych klonów, zawierających gH1 i gL1 stosowano sekwencjonowanie DNA przy użyciu starterów swoistych wobec wektora i otrzymano plazmidy pCR2.1 (544gH1) i pCR2.1(544gL1) (Fig. 11 i 12).
Do wytworzenia humanizowanych przeszczepów gH4, 5, 6 i 7 i gL2 stosowano metodę zastąpienia kasety oligonukleotydowej (SEKW NR ID: 56-65). Na Fig. 13 przedstawiono wzorzec kaset oligonukleotydowych. W celu skonstruowania każdego wariantu, wektor pCR2.1(544gH1) lub pCR2.1(544gL1)) przecięto wskazanymi enzymami restrykcyjnymi (Xmal/SacII dla łańcucha ciężkiego, Xmal/BstEII dla łańcucha lekkiego). Duży fragment wektora oczyszczono z agarozy na żelu i stosowano do ligacji z kasetą oligonukleotydową. Kasety składały się z 2 komplementarnych oligonukleotydów (wskazanych na Fig. 13, SEKW NR ID: 56-65), zmieszanych w stężeniu 0,5 pmola^l w objętości 200 μl 12,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioerytrytolu. Annealing prowadzono przez ogrzewanie do temperatury 95°C przez 3 minuty w łaźni wodnej (objętość 500 ml), a następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono, aby powoli oziębiła się do temperatury pokojowej. Annealowaną kasetę oligonukleotydową rozcieńczono następnie w 10-krotnej objętości wody, po czym ligowano do odpowiednio skróconego wektora. Do potwierdzenia poprawności sekwencji stosowano sekwencjonowanie DNA, tworząc plazmidy pCR2.1 (5/44-gH4-7) i pCR2.1 (5/44-gL2). Następnie zweryfikowane przeszczepione sekwencje subklonowano do wektorów ekspresyjnych pMRR14 (łańcuch ciężki) i pMR10.1 (łańcuch lekki).
IV. AKTYWNOŚĆ WIĄŻĄCA CD22 W SEKWENCJACH Z PRZESZCZEPIONYM CDR
Wektory kodujące przeszczepione warianty kotransfekowano do komórek CHO w różnych kombinacjach, razem z pierwotnymi łańcuchami chimerycznego przeciwciała. Aktywność wiążącą porównywano w teście kompetycyjnym, porównując wiązanie pierwotnego mysiego przeciwciała 5/44 z wiązaniem z komórkami Ramos (otrzymanymi z ATCC, ludzka linia komórkowa limfoblastów chłoniaka, wyrażająca powierzchniowy CD22). Badanie to uważa się za najlepszy sposób porównania zdolności przeszczepów do wiązania się z CD22 powierzchni komórki. Wyniki przedstawiono na Fig. 14 i 15. Jak można zauważyć, pomiędzy poszczególnymi przeszczepami istnieje bardzo mała różnica i w porównaniu z macierzystym przeciwciałem mysim wszystkie z nich działają bardziej skutecznie niż przeciwciało chimeryczne. Wprowadzenie 3 dodatkowych reszt ludzkich przy końcu CDR-H2 (gH6 i gH7) nie miało wpływu na wiązanie.
Wybrano kombinację przeszczepu z najmniejszą liczbą mysich reszt gL1gH7. Łańcuch lekki z przeszczepem gL1 obejmuje 6 reszt donora. Reszty V2, V4, L37 i Q45 są resztami potencjalnie ważnymi dla upakowania. Reszta H38 znajduje się przy międzyprzestrzeni VH/VL. Reszta D60 jest resztą na powierzchni w pobliżu CDR-L2 i może przyczyniać się bezpośrednio do wiązania antygenu. Spośród tych reszt w sekwencjach zarodkowych ludzkich genów kappa z innych podgrup znaleziono reszty V2, L37, Q45 i D60. Łańcuch ciężki z przeszczepionym gH7 obejmuje 4 reszty regionu zrębowego donora (resztę R28 uważa się za część CDR-H1 zgodnie z definicją strukturalną stosowaną przy przeszczepianiu CDR (patrz Adair i in., (1991), publikacja zgłoszenia patentowego PCT nr WO 91/09967)). Reszty E1 i A71 są resztami powierzchniowymi w pobliżu CDR. Reszta 148 jest potencjalną resztą upakowania. Reszta T93 jest obecna przy międzyprzestrzeni VH/VL. Spośród tych reszt w innych genach linii zarodkowej ludzkiej podgrupy I znaleziono reszty E1 i A71. Resztę I48 znaleziono w podgrupie 4 ludzkiej linii zarodkowej, a resztę T73 znaleziono w podgrupie 3 ludzkiej linii zarodkowej.
Cały DNA i sekwencję białkową dla łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego, obejmującą przybliżone pozycje intronów w obrębie genów dla regionu stałego dostarczonych przez wektory, przedstawiono na Fig. 16 jako SEKW. NR ID: 29 i SEKW. NR ID: 28, odpowiednio, dla łańcucha lekkiego oraz jako SEKW. NR ID: 31 i SEKW. NR ID: 30, odpowiednio, dla łańcucha ciężkiego.
Z wektorów tych wycięto DNA kodujący geny łańcuchów lekkiego i ciężkiego. DNA łańcucha ciężkiego trawiono w miejscu 5' Hindlll, a następnie traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA E. coli i uzyskano tępy koniec 5'. Po przecięciu EcoRI w miejscu 3' uzyskano fragment łańcucha ciężkiego, który oczyszczono z żeli agarozowych. W ten sam sposób wytworzono fragment łańcucha lekkiego, z tępym końcem w miejscu 5' Sful i z miejscem 3' EcoRI. Obydwa fragmenty wklonowano do wektorów ekspresyjnych opartych na DHFR i stosowano do wytworzenia stabilnych linii komórkowych w komórkach CHO.
PL 224 150 B1
P R Z Y K Ł A D 3
SPRZĘGANIE NAc-GAMMA KALICHEAMYCYNA DMH ACBUT Z HUMANIZOWANYM PRZECIWCIAŁEM PRZECIWKO CD22 (G5/44)
W typowej reakcji sprzęgania, humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 (G5/44) sprzęgano z NAc-gamma kalicheamycyna DMH AcBut OSu (pochodną kalicheamycyny) (patrz Fig. 17), przy czym docelowe stężenie białka wynosiło 7,5 mg/ml, a docelowe obciążenie pochodną kalicheamycyny wynosiło 8,5% wagowych w odniesieniu do ciężaru białka. Docelowe pH mieszaniny reakcyjnej wynosiło 8,5 ± 0,2, a docelowe stężenia innych składników reakcji były następujące: 50 mM kwasu N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-(4-butanosulfonowego) (HEPBS), 37,5 mM dekanianu sodu i 9% obj./obj. etanolu. Reakcję prowadzono w temperaturze 33° ± 2°C przez 1 godzinę. Przed oczyszczeniem uzyskano następujące wyniki analizy tej typowej reakcji: białko: 7,34 mg/ml; obciążenie kalicheamycyną: 82,7 μg//mg; agregat: 93,25%; i nieskoniugowane białko (LCF): 1,07% (% powierzchni UV zgodnie z HPLC).
Badano wpływ różnych powierzchniowo czynnych dodatków oraz ich stężeń na wydajność i czystość produktu w celu określenia ich wpływu na wytwarzanie skoniugowanego monomeru (patrz Tabela 2). Reakcje prowadzono przy utrzymywaniu wszystkich parametrów na stałym poziomie, z wyjątkiem dodatku i jego stężenia.
Koniugaty wytworzone w tych reakcjach badano pod kątem stężenia białka, obciążenia kalicheamycyną, zawartości agregatu i LCF. Aczkolwiek zadowalające wyniki uzyskano dla wszystkich kwasów n-karboksylowych, w zakresie od C6 (heksanian) do C12 (dodekanian), najlepsze łączne rezultaty (niski poziom LCF, niski poziom agregatu i wysoki odzysk monomerycznego koniugatu) otrzymano dla dekanianu w zakresie stężeń w zakresie 30 mM do 50 mM.
T A B E L A 2: WPŁYW DANEGO DODATKU I JEGO STĘŻENIA NA WYNIKI SPRZĘGANIA
Dodatek/stężenie Odzysk białka (% odzysku) Procent agregatu Procent LCF
Heksanian-500 mM 51,3 3,36 38,3
Heptanian-400 Mm 49,9 4,7 20,6
Oktanian-200 mM 57,3 3,27 10,6
Nanonian-100 mM 54,7 1,41 0,3
Dekanian-50 mM 56,7 1,35 0,2
Undekanian-20 mM 46,9 2,95 0,6
Dodekanian-5 mM 65,6 0,78 7,0
P R Z Y K Ł A D 4
SPOSÓB CHROMATOGRAFICZNEGO OCZYSZCZANIA
I. SPOSOBY ROZDZIELANIA CHROMATOGRAFICZNEGO
Aczkolwiek stwierdzono, że najlepszym ośrodkiem do HIC jest Butylo-SEPHAROSE® 4 Fast Flow, zadowalające wyniki można również uzyskać przy nieznacznej zmianie warunków chromatografii, stosując inne żywice, takie jak Octyl-SEPHAROSE® Fast Flow, PPG-600C (Tosoh Biosep), FRACTOGEL® EMD Propyl (EM Processing) i Source 15ISO (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Substancją wyjściową do oczyszczania była mieszanina z reakcji sprzęgania, zawierająca 7,2 mg/ml białka przy obciążeniu pochodną kalicheamycyny wynoszącym 83 μg/mg, z 10,1% zawartości agregatu (% powierzchni w HPLC) i z 5,6% zawartości LCF (% powierzchni w HPLC).
Po zakończeniu reakcji sprzęgania mieszaninę reakcyjną rozcieńczono czterokrotnie dodatkiem roztworu fosforanu potasu do końcowego stężenia fosforanu (pH 8,2) 0,7 M. Po wymieszaniu roztwór ten przesączono przez filtry 0,45 μ. Rozcieńczony roztwór wprowadzono na kolumnę z Butyl- SEPHAROSE® 4 Fast Flow. Łączna ilość wprowadzonego do kolumny białka wynosiła 29 mg na ml objętości złoża. Po przemyciu 0,7 M roztworem fosforanu potasu kolumnę eluowano gradientem od 0,7 M do 4 mM fosforanu potasu, pH 8,2. Wyeluowane z etapu z gradientem frakcje zebrano do dalszej obróbki, łącznie z pulą obejmującą monomeryczny koniugat z zawartością poniżej 1% powierzchni agregatu i LCF. Pulę tę wprowadzono na kolumnę odsalającą SEPHADEX G-25 (Amersham Biosciences) w celu wymiany buforu na odpowiedni dla formulacji, składający się z 20 mM Tris-HCl i 100 mM chlorku sodu przy pH 8,0. Oczyszczony preparat CMC-544 z wymienionym buforem miał
PL 224 150 B1 następujące własności: obciążenie kalicheamycyną: 81 gg/mg; agregat: 0,4% (% powierzchni HPLC) LCF: 0,8% (procent powierzchni HPLC).
P R Z Y K Ł A D 5
ANALIZA WIĄZANIA IMMUNOKONIUGATU NAC-GAMMA KALICHEAMYCYNA DMH ACBUT-G5/44 (CMC-544)
Wytworzony w powyższej reakcji sprzęgania immunokoniugat humanizowanego przeciwciała przeciwko CD22 (G5/44) z kalicheamycyną (CMC-544) analizowano w badaniach wiązania, w celu określenia, czy koniugat wytworzony ulepszonym sposobem może mieć szkodliwy wpływ na wiązanie antygenu. Jak przedstawiono w Tabeli 3, procedura sprzęgania nie ma wpływu na powinowactwo wiązania antygenu z przeciwciałem. Immunokoniugat CMC-544, wytworzony znanym i nowym sposobem sprzęgania, wiąże docelowy antygen z podobnym powinowactwem, które nie różni się od powinowactwa dla nieskoniugowanego przeciwciała G5/44.
T A B E L A 3: POWINOWACTWO WIĄZANIA CMC-544 WYTWORZONEGO SPOSOBAMI SPRZĘGANIA PRZY UŻYCIU CMA-676 i CMC-544
Przeciwciało przeciwko CD22 Kd (M) Ka (1/M) kd (1/s) ka (1/Ms) Procent LCF
Humanizowane G5/44 1,30 x 10'1° 7,90 x 109 2,80 x 10'5 2,20 x 105 100
CMC-544 (21 gm/mg) (sposób z CMA-676) 1,20 x 10-1° 8,10 x 109 6,10 x 10'5 4,90 x 105 25
CMC-544 (87 gm/mg) (sposób z CMC-544) 1,50 x 10'10 6,60 x 109 6,90 x 10'5 4,60 x 105 3,3
Analizy biosensoryczne prowadzono stosując BIAcore® 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Szwecja). CD22mFc kowalencyjnie immobilizowano na biosensorowym chipie pokrytym karboksymetylodekstranem aktywowanym N-hydroksysukcynimidem (CM5), zgodnie ze standardowymi metodami chemicznego sprzęgania amin, przy gęstości białka około 2000 jednostek rezonansowych. Próbki CMC-544 lub G5/44 rozcieńczono w buforze HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, zawierającym 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% polisorbat 20 (obj./obj.)) i w celu związania wstrzykiwano w stężeniu w zakresie 1 do 100 nM na powierzchnię chipu biosensorowego pokrytego CD22mFc przy szybkości przepływu 30 gl/min przez 3 minuty. Po fazie wiązania dysocjację związanego przeciwciała monitorowano przez przemywanie chipa buforem HBS przez 15 minut. Powierzchnię antygenową regenerowano przez przemywanie przez 30 sekund biosensorowego chipa 15 gl buforu do regeneracji (10 mM NaOH i 200 mM NaCl), a następnie przez 2 minuty stanowiące czas stabilizacji przed następnym cyklem. Stałe kinetyczne obliczono metodą nieliniowej analizy regresji najmniejszych kwadratów, stosując model dopasowania krzywych wiązania 1:1 Lagmuir i program BIAevaluation (wersja 3.0, BIAcore). Wiązanie antygenu z CMC-544 oceniono metodą analizy rezonansu plazmonów powierzchniowych, stosując CD22mFc kowalencyjnie immobilizowany na biosensorowym chipie. Wyniki analiz kinetycznych wiązania CMC-544 i G5/44 z CD22mFc wskazują, że po dopasowaniu całości danych do modelu wiązania 1:1 Langmuir z wyrównaniem dla przeniesienia mas, zarówno CMC-544, jak i nieskoniugowany G544, wiążą CD22 z podobnym powinowactwem (CMC-544:CD22 KD = 200 pM; G5/44:CD22 KD = 235 pM). Sprzęganie z kalicheamycyną nie ma wpływu na zdolność G5/44 do skutecznego wiązania CD22mFc.
Wiązanie CMC-544 i G5/44 z CD22 wyrażanym na powierzchni komórek chłoniaka zależnego od limfocytów B badano również metodą cytometrii przepływowej. W badaniu tym jako kontrole dopasowane do izotypu stosowano gemtuzumab przeciwko CD33 mAb (hP67.6) i jego koniugat z kalicheamycyną CMA-676 (gemtuzumab ozogamycyna). Jako kontrolę pozytywną stosowano rituximab (RITUXAN), chimeryczną ludzką IgG1 przeciwko ludzkiemu CD20 mAb. Jako kontrole negatywne stosowano również oczyszczone poliklonalne IgG1 i IgG4. Wiązanie CMC-544 i G5/44 z CD22 na Ramos lub RL BCL było podobne i odróżnialne od wiązania dla ludzkiej poliklonalnej IgG4. Dla RL BCL stwierdzono mniejszą powierzchnię wyrażania CD22 niż dla Ramos BCL. Dla porównania, wiązanie CMA-676 lub gL1gH7 z obydwoma BCL było podobne do wiązania dla ludzkiej poliklonalnej IgG4, co jest zgodne z brakiem wyrażania CD33 (danych nie pokazano). Dla tych samych komórek stwierdzono silne wiązanie z rituximabem (RITUXAN) przeciwko CD20. W przeciwieństwie do hP67.6 i CMA-676, ani dla CMC-544 ani dla G5/44 nie wykazano żadnego wiązania z CD22- CD33+ w komórkach białaczki HL-60 (danych nie pokazano). Wyniki te sugerują, że sprzęganie G5/44 z kalicheamycyną nie ma wpływu na jej swoistość wobec antygenu. CMC-544 konkretnie rozpoznaje
PL 224 150 B1
CD22 na ludzkich limfocytach B, ale nie na limfocytach B mysich, szczurzych, psich, świńskich lub naczelnych (cynomolgus i rezus) (danych nie przedstawiono).
P R Z Y K Ł A D 6
ANALIZA DZIAŁANIA CMC-544 IN VITRO I IN VIVO
I. CYTOTOKSYCZNOŚĆ IN VITRO
Porównywano działanie CMC-544 wytworzonego w procesach z zastosowaniem CMA-676 i CMC-544 na wzrost in vitro linii komórkowych chłoniaka zależnego od limfocytów B CD22+, RL, Daudi, Raji i Ramos. W celu uwidocznienia nieswoistego wobec antygenu działania koniugatu stosowano dopasowany do izotypu koniugat kalicheamycyny skierowany na ludzkie CD33 (CMA-676). Użycie nieskoniugowanej N-Ac gamma kalicheamycyny DMH (lek uwolniony z koniugatu po hydrolizie kwasowej) wskazuje, że każda ze stosowanych linii komórkowych była wrażliwa na śmiertelne działanie kalicheamycyny. W Tabeli 4 przedstawiono wyniki tych badań w oparciu o równoważnik kalicheamycyny, a w Tabeli 5 przedstawiono te same wyniki wyrażone jako stężenia skoniugowanego białka przeciwciała. Dostarczanie kalicheamycyny do komórek CD22+ za pośrednictwem CD22 było co najmniej 10 razy bardziej skuteczne w zabijaniu docelowych komórek, niż w przypadku tego samego nieskoniugowanego leku. Dopasowany do izotypu koniugat kontrolny (CMA-676) miał cytotoksyczność mniejszą lub podobną jak nieskoniugowana pochodna kalicheamycyny. Jak widać w Tabeli 4, koniugat wytworzony w procesie sprzęgania z CMC-544 może zapewnić równoważne działanie cytotoksyczne przy mniejszych stężeniach przeciwciała, niż koniugat wytworzony w procesie sprzęgania z zastosowaniem CMA-676.
T A B E L A 4: ZAHAMOWANIE WZROSTU PRZEZ SKONIUGOWANĄ KALICHEAMYCYNĘ (IC50 Pm dla kalicheamycyny)
Linie komórek chłoniaka z limfocytów B Proces z CMC-544 obciążenie CMC-544: 65 gG/MG Proces Z CMA-676 OBCIĄŻENIE CMC-544: 35 gG//MG Kontrola Negatywna Obciążenie CmA-676: 35 gG/MG N-Acetylo-GammaKalicheamycyna DMH
RL #1 6 30 600 226
#2 12 40 400 270
Daudi #1 21 80 1886 260
Raji #1 500 ND* 2800 460
#2 560 520 4100 490
Ramos #1 200 130 ND 700
#2 260 ND ND 1000
*ND, nie oznaczano
T A B E L A 5. ZAHAMOWANIE WZROSTU PRZEZ SKONIUGOWANE PRZECIWCIAŁO (IC50 gg/ml PRZECIWCIAŁA)
Linie komórek chłoniaka z limfocytów B Proces z CMC-544 Obciążenie CMC-544: 65 gG/MG Proces z CMA-676 Obciążenie CMC-544: 35 gG/MG Kontrola negatywna Obciążenie CMA-676: 35 gG/MG Przeciwciało kontrolne G5/55
RL #1 0,09 0,86 17,14 >100
#2 0,18 1,14 11,43 >100
Daudi #1 0,32 2,29 53,89 >100
Raji #1 7,69 ND* 80,00 >100
#2 8,62 14,86 117,14 >100
Ramos #1 3,08 3,71 ND >100
#2 4,00 ND ND >100
*ND, nie oznaczano
PL 224 150 B1
Cytotoksyczność in vivo. CMC-544 wytworzony w procesie wytwarzania CMC-544 badano w ksenoprzestrzeniach chłoniaka zależnego od limfocytów B. W badaniach tych stosowano dwa nowotwory, choniaki z limfocytów B, RAMOS i RL. Chłoniak RL jest linią komórek chłoniaka nie-Burkitta, pochodzącą od NHL, zaś RAMOS pochodzi pierwotnie od komórek chłoniaka Burkitta. Na Fig. 18 przedstawiono reprezentatywne badanie, w którym CMC-544 i mysi odpowiednik tego przeciwciała wykazały skuteczność w hamowaniu wzrostu komórek chłoniaka z limfocytów B RAMOS w sposób zależny od dawki.
Koniugat humanizowanego przeciwciała okazał się bardziej skuteczny niż jego mysi odpowiednik. W badaniu tym najniższa dawka koniugatu kalicheamycyny zdolna do znacznego zahamowania wzrostu chłoniaka wynosiła 10 μg/kg skoniugowanej NAc-gamma kalicheamycyny-DMH. W przeciwieństwie do tego, nieskoniugowane przeciwciało, G5/44, w dawce 10 mg/kg podawanej dootrzewnowo w schemacie podobnym jak dla koniugatów, nie miało wpływu na wzrost nowotworu.
Podobne badania prowadzono stosując model chłoniaka RL. W Tabeli 6 przedstawiono łączną analizę z trzech niezależnych badań, w których oceniano przeciwnowotworowe działanie CMC-544 wobec nowotworów RL NHL o wielkości 300-400 mg u myszy nagich. Po 3 tygodniach CMC-544 w sposób zależny od dawki spowodował regresję nowotworów. Na podstawie analiz statystycznych powyższych badań minimalną dawkę CMC-544 w modelu chłoniaka RL ustalono na 20 μg/kg w odniesieniu do zawartości kalicheamycyny. W żadnych z tych trzech badań nie obserwowano przypadków śmiertelnych. Wyższe dawki (60-320 μg/kg) CMC-544 spowodowały prawie całkowitą regresję chłoniaka RL. Reasumując, wyniki uzyskane w modelach z dwoma chłoniakami z limfocytów B wyraźnie wskazują, że CMC-544 jest zdolny do spowodowania regresji nowotworu.
T A B E L A 6: DZIAŁANIE PRZECIWNOWOTWOROWE CMC-544 WOBEC KSENOPRZESZCZEPÓW RL NHL U MYSZY NAGICH
DAWKA KALICHEAMYCYNY μG/KG ŚREDNI STOPIEŃ WZROSTU NOWOTWORU1 % T/C2 WARTOŚĆ P-VALUE W FUNKCJI NOŚNIKA3
Nośnik 6,74 - -
20 2,87 43 0,011
40 1,34 20 <0,001
60 0,58 9 <0,001
80 0,54 8 <0,001
160 0,21 3 <0,001
320 0,10 1 <0,001
1 Stopień wzrostu nowotworu (RTG) obliczony jako (ciężar nowotworu po 3 tygodniach/ciężar nowotworu dnia 1) dla każdego zwierzęcia 2 100* (średni RTG dla dawki CMC-544 /średni RTG dla grupy z nośnikiem) 3 wartość p z jednostronnego testu t dla CMC-544 w porównaniu z nośnikiem, z zastosowaniem transformacji rank RTG jako zmiennej odpowiedzi. We wszystkich testach t błąd określano w oparciu o zbiorcze wariancje, s2, we wszystkich leczonych grupach (s2=154,54)
Stosując modele chłoniaka RL i RAMOS badano również zdolność CMC-544, wytworzonego nowym sposobem, do hamowania wzrostu dużych ustabilizowanych chłoniaków z limfocytów B w ksenoprzeszczepach. Nowotwory pozostawiono do wzrostu do fazy 1,5 lub 2 g ciężaru guza, a następnie CMC-544 lub dopasowany do izotypu koniugat jako kontrolę negatywną (CMA-676) podawano dootrzewnowo w dawce 160 μg/kg skoniugowanej kalicheamycyny, z zachowaniem początkowego schematu dawkowania w dniach 1, 5 i 9. Ten sam schemat dawkowania do spowodowania długotrwałej regresji nowotworów w małym stadium rozwoju (patrz Tabela 6). Jak przedstawiono na Fig. 19, podawanie CMC-544 myszom z dużym chłoniakiem RAMOS spowodowało stopniową regresję początkowego ciężaru chłoniaka, a po 20 dniach u trzech spośród czterech myszy z guzem guza, nie stwierdzono. Monitorowanie tych uwolnionych od guza myszy aż do 50 dnia nie wykazało ponownego wzrostu cofającego się chłoniaka RAMOS. Dla porównania, w dopasowanej do izotypu grupie kontrolnej, CMA-676 nie wykazywał działania na wzrost nowotworu. Cztery spośród pięciu myszy z dużym guzem, które leczono CMA-676, należało uśmiercić przez dniem 15, ponieważ ciężar guza osiągnął blisko 15% ciężaru ciała.
PL 224 150 B1
Podobne badanie z CMC-544 prowadzono w modelu chłoniaka RL. Dootrzewnowe podawanie CMC-544 w dawce 160 pg/kg przy podobnym schemacie, jak opisano uprzednio, w ciągu 30 dni spowodowało >90% regresję początkowego ciężaru chłoniaka RL. Jednakże, do dnia 45, u 2 myszy z grupy ze skurczonymi chłoniakami zaobserwowano ponowny wzrost guzów. Wyniki te wskazują, że CMC-544 jest zdolny do spowodowania regresji małych, jak również dużych, ustabilizowanych chłoniaków. W niewielu badaniach, tu nie przedstawionych, chłoniaki RL, które sporadycznie ponownie rosły po początkowej regresji wywołanej CMC-544, traktowano ponownie CMC-544. Badania te wykazały, że nowotwory RL były nadal reaktywne w drugim przebiegu leczenia CMC-544 i ponownie cofały się. A zatem, leczenie CMC-544 może być skuteczne przeciwko chłoniakom zależnym od limfocytów B, zarówno o małym, jak i o dużym ciężarze, z możliwością powtórzenia terapii.
II. PORÓWNANIE IN VIVO KONIUGATU WYTWORZONEGO W PROCESACH SPRZĘGANIA Z ZASTOSOWANIEM CMA-676 I CMC-544
Na Fig. 20 przedstawiono wyniki reprezentatywnych badań, w których myszom z ustabilizowanym chłoniakiem RL podawano dwie różne dawki (80 i 320 pg/kg skoniugowanej kalicheamycyny) CMC-544 wytworzonego w procesie sprzęgania z zastosowaniem CMA-676 i w procesie sprzęgania z zastosowaniem CMC-544, zgodnie ze standardowym schematem dawkowania. Jak oczekiwano, obserwowana skuteczność przeciwnowotworowa była zależna od dawki i nie stwierdzono różnicy w skuteczności pomiędzy dwoma preparatami CMC-544. W przeciwieństwie do powyższego, nieskoniugowana N-acetylo-gamma kalicheamycyną DMH, podawana dootrzewnowo w dawce 160 pg/kg, była nieaktywna. Jednakże, należy podkreślić, że dla każdej dawki skoniugowanej kalicheamycyny ilość białka stanowiącego przeciwciało w postaci koniugatu była czterokrotnie wyższa dla CMC-544 wytworzonego w procesie z użyciem CMA-676 niż dla wytworzonego w procesie z CMC-544. Ponieważ przede wszystkim zawartość kalicheamycyny w docelowym koniugacie jest odpowiedzialna za powodowanie działania przeciwnowotworowego, możliwe jest dostarczenie żądanej ilości kalicheamycyny poprzez koniugat wytworzony nowym sposobem z zastosowaniem dużo mniejszych ilości kierującego przeciwciała. W efekcie, zwiększone obciążenie koniugatu wytworzonego w procesie z CMC-544 uzyskuje się w związku z brakiem znacznych ilości frakcji niskoskoniugowanej (LCF).
III. LECZENIE NOWOTWORÓW OPORNYCH NA RITUXIMAB (RITUXAN)
Jako następny badano problem, czy chłoniaki zależne od limfocytów B, wzrastające po przerwaniu leczenia dostępnym na rynku rituximabem przeciwko CD20 (RITUXAN), nadal będą reagowały na leczenie CMC-544. Do tej pory, rozwijające się (nieustabilizowane) chłoniaki RL leczono przez 3 tygodnie rituximabem (RITUXAN). Wzrost chłoniaka RL był zahamowany, dopóki kontynuowano terapię rituximabem (RITUXAN). Po przerwaniu leczenia rituximabem (RITUXAN), chłoniaki RL gwałtownie urosły do wielkości około 1 g ciężaru i w tym czasie rozpoczęto leczenie CMC-544 w dootrzewnowej dawce 160 pg/kg. Jak przedstawiono na Fig. 21 i 22, chłoniaki RL nadal reagowały na CMC-544 i do dnia 60 u 80% myszy stwierdzono brak guza. A zatem, CMC-544 przy trzech jest zdolny do spowodowania regresji chłoniaków zależnych od limfocytów B, których wzrost można zahamować jedynie przez ciągłe dawkowanie rituximabu (RITUXAN).
P R Z Y K Ł A D 7
DZIAŁANIE CMC-544 IN VITRO i IN VIVO
I. BADANIA WIĄZANIA I TOKSYCZNOŚCI
CMC-544 badano w testach na wiązanie z CD22, jak również pod kątem aktywności w modelach in vitro i in vivo. CMC-544 porównywano również z CMA-676, dopasowanym do izotypu kontrolnym koniugatem hP67.6 (IgG4) związanym z kalicheamycyną poprzez AcBut, i z rituximabem (RITUXAN), chimeryczną IgG1 przeciwko CD20 mAb, (IDEC Pharmceuticals, San Diego, CA.), który jest dostępny na rynku i został zakupiony z firmy Medworld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY). W badaniach domeny wiążącej G5/44 stosowano następujące przeciwciała: BU12 (Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 i To 15 (Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13 i M5/44 (Celltech, Slough, UK). W badaniach na blokowanie jako dodatkowe przeciwciała stosowano SJ10 (Immunotech, Fullerton, CA) i M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1 (Celltech, Slough, UK). Stosowane w tych badaniach linie komórkowe, obejmujące linię komórek Ramos chłoniaka Burkitta (CRL-1923) i linię komórek RL chłoniaka ziarniczego (NHL) otrzymano z American Type Culture Collection. W badaniu wykrywania mykoplazmy przez reakcję łańcuchową polimerazy (ATCC, Manassas, VA) stwierdzono, że linie komórkowe są wolne od mykoplazmy. Linie komórkowe utrzymywano w formie hodowli
PL 224 150 B1 w zawiesinie w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 0,2% glukozy, 100 U/ml soli sodowej penicyliny G i 100 μg/ml siarczanu streptomycy.
Zdolność G5/44 do hamowania wiązania mysiego mAb o znanej swoistości wobec CD22 badano metodą analizy BIAcore®, przy użyciu Fc-CD22 immobilizowanym na chipie BIAcore® CM5. Porównywano jednostki rezonansu plazmonów powierzchniowych (RU) otrzymane dla immobilizowanego Fc-CD22 nienasyconego lub nasyconego uprzednio G5/44. Analizę interakcji biomolekularnych prowadzono stosując BIACORE® 2000. Przeciwciała przepuszczano przez powierzchnię kontrolą w ślepej próbie (komora przepływu 1, pełni funkcję kontroli, bez sprzężonego białka) oraz przez badaną powierzchnię Fc-CD22 (komora przepływu 2) immobilizowanego na sensorowym chipie CM5, zgodnie z chemiczną metodą sprzęgania amin, do poziomu 9,042 RU. Otrzymany sensorgram stanowi odpowiedź (RU) na komorę przepływu 2 minus odpowiedź (RU) na komorę przepływu 1. Drugi sensorgram otrzymano przez nasycenie komór przepływu G5/44 (100 μg/ml), przed wprowadzeniem mysiego mAb przeciwko CD22, które uprzednio scharakteryzowano w odniesieniu do wiązania. Natychmiast po zmierzeniu odpowiedzi G5/44, poszczególne mysie mAb przeciwko CD22 poddano perfuzji, bez usuwania G544. Rejestrowano również drugą łączną odpowiedź uzyskaną po związaniu się mysiego mAb przeciwko CD22 z CD22 pokrytym G5/44. Gdy mysie przeciwciało wiąże się z CD22 w miejscach innych niż zajmowane przez G5/44, wówczas połączone odpowiedzi powinny być addytywne. Gdy wiązanie G5/44 z CD22 zakłóca lub zapobiega wiązaniu z drugim przeciwciałem, wówczas połączone odpowiedzi nie powinny być addytywne. Każdy z drugich połączonych pomiarów korygowano pod względem szybkości dysocjacji „off-rate dla interakcji G5/44:CD22.
G5/44 blokował wiązanie jedynie tych przeciwciał, które wiązały się z epitopem A/Ig-podobną domeną 1 CD22 (SHCL1 Leu 14 i HD239), co oznacza, że G5/44 w tej domenie również wiąże CD22. Przeciwciała, które wiążą się z epitopem B/Ig-podobną domeną 3 CD22 (RFB-4), epitopem C/Ig-podobną domena 4 CD22 (To 15) i Ig-podobną domeną 2 CD22 (4KB128), nie były blokowane przez G5/44. Wyniki te wskazują, że miejsce wiążące G5/44 na CD22 jest zlokalizowane w pierwszej domenie Ig-podobnej, ponieważ zapobiega to wiązaniu tych przeciwciał mAb przeciwko CD22, które rozpoznają pierwszą Ig-podobną domenę CD22 (epitop A). Inne przeciwciała przeciwko CD22, M6/13 (Celltech, Slough, UK), o nieznanej subswoistości, były również blokowane przez G5/44 (Celltech, Slough, UK), mapując tym samym miejsce wiążące M6/13 z epitopem A/Ig-podobną domeną 1 CD22. Przeciwciało M5/44, mysie macierzyste przeciwciało G5/44, o tej samej swoistości jak G5/44, hamuje wiązanie G5/44 i służy jako kontrola pozytywna. W badaniach tych rolę kontroli negatywnej pełni przeciwciało BU12 przeciwko CD19.
Wyniki przedstawiono w Tabeli 7.
T A B E L A 7: WIĄZANIE MYSIEGO M/AB PRZECIWKO CD22 O OKREŚLONEJ SWOISTOŚCI Z FC-CD22 TRAKTOWANYM UPRZEDNIO G544. ODPOWIEDZI WIĄŻĄCE WYRAŻONO JAKO JEDNOSTKI REZONANSU PLAZMONÓW POWIERZCHNIOWYCH (RU)
Przeciw- ciało Epitop Domena Ig CD22 Odpowiedź 1 dla G544 Odpowiedź 2 po drugim mAb przeciwko CD22 Odpowiedź 3 (Odpowiedź 2-1) Odpowiedź 3 dopasowana do „OFF” rate G544 Wiązanie drugiego mAb bez G544 dostosowane do tła Hamowanie przez G544(%)
1 2 3 4 5 6 7 8
Przeciw CD22, SHCL-1 Leu 14 A 1,2 654,3 579,8 -74,5 9 29,3 69
Przeciw CD22, HD239 A 1 710,5 628,7 -81,8 1,7 19,3 91
Przeciw CD22, M 6/13 7 7 710,0 652,7 -57,3 26,2 152,4 83
Przeciw CD22, RFB-4 B 3 703,5 1108,5 405 488,5 534 9
PL 224 150 B1 cd. tabeli 7
1 2 3 4 5 6 7 8
Przeciw CD22, 4KB128 7 2 691,0 1343,5 652,5 736,0 738,8 0
Przeciw CD22, To 15 C 4 676,9 1163,6 486,7 570,2 614,6 7
Przeciw CD22, M 5/44 kontrola pozytywna 725,1 679,3 -45,8 37,7 613,9 94
Przeciw CD19, BU12 kontrola negatywna 686,2 602,7 -83,5 0 0 0
Stosując mysie przeciwciała mAb o znanej swoistości wiązania poszczególnych domen z CD22-Bm badano również zdolność G5/44 do blokowania wiązania się tych przeciwciał z limfocytami B. Ponadto, badano również zdolność mAb do blokowania wiązania G5/44 z limfocytami B. W badaniach 5 tych najpierw komórki Ramos w ilości 1 x 105 eksponowano na mysie przeciwciało przeciwko CD22 (10 pg/ml humanizowanego G5/44 lub mysiego monoklonalnego przeciwciała przeciwko CD22) przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, a następnie komórki eksponowano na G5/44 (10 pg/ml). Komórki inkubowano jeszcze przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Po obróbce przeciwciałem limfocyty B wytrącono w postaci grudki i przemyto układem PBS-1% BSA i przez 30 minut w temperaturze 4°C dodawano odpowiednie drugie przeciwciało (kozie przeciwludzkie przeciwciało FITC (łańcuch ciężki i lekki) albo kozie przeciwmysie przeciwciało FITC (łańcuch ciężki i lekki)) w ilości 100 pl i w rozcieńczeniu 1:100 w układzie PBS-1% BSA. Komórki znowu wytrącono, przemyto i ponownie zawieszono w układzie PBS-1% BSA, po czym dodano do probówki zawierającej 250 pl układu PBS-1% formaldehyd. Związane z komórkami natężenie fluorescencji mierzono metodą cytometrii przepływowej, stosując cytometr przepływowy BD FACSort.
Wyniki wskazują, że uprzednia ekspozycja G5/44 na limfocyty B CD22+ spowodowała znaczne zahamowanie późniejszego wiązania przeciwciał mAb M5/44 i M6/13 przeciwko CD22. Dla porównania, G5/44 nie hamował wiązania przeciwciał przeciwko CD22 mAb RFB4, To15, HD239 i 4KB z limfocytami B. Brak znaczącego hamowania wiązania HD239 z limfocytami B przez G5/44, jak wykryto metodą cytometrii przepływowej, był nieoczekiwany, zwłaszcza z uwagi na fakt, że analiza BIAcore® wykazywała, że G5/44 może blokować wiązanie HD239 z CD22. Brak silnego hamowania wiązania HD239 przez G5/44 można wyjaśnić w oparciu o różnice w stopniu powinowactwa wobec CD22. Gdy powyższe mysie mAb przeciwko CD22 badano pod kątem zdolności do hamowania wiązania G5/44 z limfocytami B CD22+, wiązanie G5/44 hamowały SHCL1 i M6/13, ale nie inne przeciwciała mAb przeciwko CD22. Epitopy wiążące HD239 i SHCL1 mapowano do pierwszej Ig-podobnej domeny CD22. Jednakże, epitopy rozpoznawane przez M6/13 lub M5/44 nie zostały zmapowane. Opisane powyżej badania blokowania wskazują, że powyższe przeciwciała rozpoznają epitopy zlokalizowane na pierwszej Ig-podobnej domenie CD22, określanej wspólnie jako epitop A.
Dwadzieścia tysięcy komórek Ramos inkubowano z różnymi dawkami CMC-544, z i bez rituximabu (RITUXAN) przez 96 godzin. Po 96 godzinach mierzono żywotność komórek przez ekskluzję jodkiem propidiowym, a następnie przez analizę metodą cytometrii przepływowej. Obliczano średnio żywotność dla 3 do 6 studzienek i dla różnego leczenia obliczano hamowanie żywotności komórek w odpowiedzi na dawkę. Tło dla hamowania żywotności komórek jako odpowiedzi obliczono od zerowego stężenia CMC-544. Do zbadania, czy CMC-544 spowodował statystycznie istotne zahamowanie wzrostu komórek Ramos przy dawkach w zakresie 0,01 do 3 ng kalicheamycyny DMH/ml, stosowano analizę regresji logistycznej. Regresję logistyczną stosowano również do oznaczenia statystycznej istotności interakcji pomiędzy CMC-544 i rituximabem (RITUXAN). Obliczono również średnie stężenia hamujące (IC50) i odnotowano skuteczność każdego leczenia w stosunku do leczenia samym CMC-544. Analizy statystyczne prowadzono stosując metodę PROBIT w SAS wersja 8.2.
Wyniki prowadzonych badań wskazują, że CMC-544 spowodował zależne od dawki zahamowanie wzrostu komórek Ramos przy dawkach w zakresie 0,01 do 3 ng kalicheamycyny DMH/ml. Średnie stężenie hamujące (IC50) dla samego CMC-544 wynosiło 0,029 ng/ml. Do komórek traktowaPL 224 150 B1 nych CMC-544 dodano rituximab (RITUXAN) w stężeniach 2, 20 i 200 μg/ml, w celu określenia statystycznej istotności interakcji pomiędzy rituximabem (RITUXAN) i cytotoksyczną aktywnością CMC-544. Rituximab (RITUXAN), dodawany w stężeniach 20 i 200 μg/ml bez CMC-544, nie miał istotnego na wzrost komórek (111,7% i 94,0% wzrostu dla nośnika, odpowiednio). W kombinacji z CMC-544 trzy stężenia rituximabu (RITUXAN) spowodowały statystycznie istotne (p <0,05) przesunięcia w pętli w lewo i przerwanie krzywej dawka-odpowiedź dla CMC-544. Kombinacja z rituximabem w stężeniach 2 i 200 μg/ml spowodowała największe przesunięcia w krzywych dawka - odpowiedź. Te dwie krzywe nie różniły się statystyczne, ale były zasadniczo różne (p<0,05) od krzywej dla kombinacji z dawką 20 μg/ml. Wyniki obserwowane w pierwszym badaniu potwierdzono drugim badaniem (wyników nie przedstawiono). Średnie stężenia hamujące dla kombinacji 2, 20 i 200 μg/ml rituximabu (RITUXAN) plus CMC-544 odpowiednio wynoszą 0,0072, 0,0081 i 0,0072 ng/ml. Średnie stężenie hamujące dla CMC-544 plus rituximab (RITUXAN) są około czterokrotnie wyższe niż wartości IC50 dla samego CMC-544.
II AKTYWNOŚĆ PRZECIWNOWOTWOROWA IN VIVO WOBEC PODSKÓRNYCH KSENOPRZESZCZEPÓW I OGÓLNOUSTROJOWO ROZSIANYCH CHŁONIAKÓW ZALEŻNYCH OD LIMFOCYTÓW B U MYSZY SCID
Samice atymicznych myszy nagich, o ciężarze ciała 18-22 g, poddano całkowitemu napromienieniu (400 radów). Napromienienie w dalszym stopniu osłabiło układ odpornościowy myszy, zwiększając szansę przyjęcia nowotworu. Trzy dni po napromienieniu myszom wstrzyknięto podskórnie w prawy bok 107 komórek RL w MATRIGEL (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA, rozcieńczony w pożywce RPMI w stosunku 1:1. Gdy guzy osiągnęły odpowiednią wielkość (0,3 g, na ogół po 21 dniach), myszom podawano w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, w dawce 0,2 ml/mysz, ip. CMC-544, rituximab (RITUXAN) lub CHOP (patrz poniżej). Pierwszy dzień podawania leku oznaczono jako dzień 1. Dnia 5 i 9 (leczenie = g4Dx3) podawano dwie dodatkowe dawki. Leczenie CHOP obejmowało cyklofosfamid (C) (CYTOXAN, Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ) w dawce 40 mg/kg ip; doksorubicynę HCl (H), (Sigma-Aldrich, Co., St Louis, MO) w dawce 3,3 mg/kg ip; winkrystynę (O), (GensiaSicor Pharmaceuticals Irvine, CA) w dawce 0,5 mg/kg ip; oraz prednizon (P), (Roxane Labs., Columbia, OH) w dawce 0,2 mg/kg po. CHO podawano według tego samego schematu dawkowania, jak CMC-544 i rituximab (RITUXAN) (q4Dx3), zaś prednizon podawano doustnie co drugi dzień, łącznie 5 dawek (q2Dx5). Guzy mierzono przynajmniej raz w tygodniu i obliczano ciężar guza (g) = 0,5 (szerokość guza/2) (długość guza). Obliczano średnią dla grupy, SEM, i porównywano ją ze średnią dla grupy leczonej nośnikiem na istotność statystyczną, stosując wielotorowe testy T. Średnie w grupach zapisywano aż do 50 dnia, lub do śmierci myszy (co przerywa średnią w grupie) lub do momentu, w których guz urósł do zbyt dużych rozmiarów (>3,5 g) i mysz należało uśmiercić. Po upływie tego czasu, ciężar guza odnotowywano jedynie dla pojedynczych myszy w całej leczonej grupie. Pod koniec każdego badania w każdej leczonej grupie zapisywano również liczbę myszy wolnych od guza.
Do oceny działania na rozsiane chłoniaki samego CMC-544 lub w kombinacji z innymi środkami bioaktywnymi stosowano model myszy SCID. Samcom myszy SCID (CB17 SCID), o ciężarze ciała 20-25 g, przez żyłę ogonową wstrzykiwano 106 komórek Ramos (0,2 ml). Dnia 3 lub 9 po wstrzyknięciu komórek myszom podawano nośnik, koniugaty (CMC-544 lub CMC-676) albo rituximab (RITUXAN) ip, łącznie 3 dawki. W schemacie leczenia od dnia 3 dawki podawano w dniu 3, 7 i 11. W schemacie leczenia od dnia 9 dawki podawano w dniu 9, 13 i 17. W schemacie leczenia od dnia 9 podawano również kombinacje CMC-544 i rituximabu (RITUXAN), jak opisano powyżej. Myszy monitorowano codziennie i gdy wystąpiło porażenie kończyn tylnych, myszy uśmiercano. Stosowano 7 do 10 myszy w każdej leczonej grupie. Dla każdej grupy obliczano średni czas przeżycia, (±SD), medianę, minimalne i maksymalne czasy przeżycia. Różnice w rozkładzie przeżywalności pomiędzy poszczególnymi grupami oznaczano stosując nieparametryczny test Long-rank, a istotność oznaczano przy poziomie 0,05. Krzywe przeżycia konstruowano stosując metodę Kaplana-Meiera.
W pierwszym teście badano wpływ dwóch różnych schematów dawkowania na czasy przeżycia myszy SCID z rozsianym chłoniakiem. W pierwszym badaniu obserwowano początkowe dawkowanie leku 3 dni po dożylnym wstrzyknięciu komórek nowotworowych (model rozwijania), a w drugim badaniu obserwowano opóźnione dawkowanie leku po 9 dniach po wstrzyknięciu komórek nowotworowych (model ustabilizowany). W każdym badaniu podawano dootrzewnowo 3 dawki w 4-dniowych odstępach (Q4Dx3) CMC-544 (160 μ9/Κο), CMA-676 (160 μg/kg) albo rituximab (RITUXAN) (20 mg/kg). W modelu rozwijania u myszy leczonych nośnikiem średni czas przeżycia wynosił 27 dni (Fig. 23, Tabela 8).
CMA-676, dopasowana do izotypu kontrola dla CMC-544, nie zwiększył w znaczny sposób czasu przeżycia (p>0,05). CMC-544 znacznie zwiększył czas przeżycia do 41 dni, zaś rituximab miał po36
PL 224 150 B1 ważny wpływ na zwiększenie czasu przeżycia do >125 dni (znacznie większy niż CMC-544, p<0,05). Opóźnione dawkowanie, które daje komórkom możliwość krążenia (naprowadzanie) i osadzenia się w docelowych tkankach (model ustabilizowany) zmieniło wyniki dla CMC-544 i rituximabu (RITUXAN). CMA-676 ponownie nie miał istotnego wpływu na czasy przeżycia (Fig. 24, Tabela 8). Rituximab (RITUXAN) zwiększył średni czas przeżycia do 62,6 dnia, a CMC-544 poprawił tę średnią do 83,5 dnia. W modelu ustabilizowanym nie obserwowano zasadniczej różnicy pomiędzy działaniem CMC-544 i rituximabu (RITUXAN).
T A B E L A 8: OPIS POMIARÓW CZASÓW PRZEŻYCIA
Badanie Związek Średni czas przeżycia Mediana czasu przeżycia Standardowe odchylenia Minimalny czas przeżycia Maksymalny czas przeżycia Ilość zwierząt
Model rozwijania CMA-676 32,9 34,0 3,9 28,0 36,0 7
CMC-544 41,0 38,0 10,1 32,0 60,0 7
Rituximab 128,4 >130,0 4,7 119,0 >130,0 7
Nośnik 27,2 28,0 1,4 25,0 28,0 8
Model Ustabilizo wany CMA-676 33,7 31,0 4,6 30,0 42,0 7
CMC-544 83,5 76,5 41,6 34,0 >130,0 8
Rituximab 62,6 37,0 46,2 31,0 >130,0 7
Nośnik 30,5 29,0 3,6 27,0 36,0 8
Prowadzono badanie wstępne w celu określenia, czy rituximab (RITUXAN) ma jakikolwiek wpływ, pozytywny lub negatywny, na przeżycie w odpowiedzi na CMC-544. CMC-544 (160 gg/kg) podawano bez i z rituximabem (RITUXAN) (20 mg/kg, wysoką dawkę kombinacji leku oznaczono jako (HD)). Ponadto z małymi dawkami CMC-544 (80 gg/kg) podawano małe dawki rituximabu (RITUXAN) (10 mg/kg). Przy dawkach 80 gg/kg lub 10 mg/kg związków nie podawano oddzielnie z uwagi na ograniczoną liczbę myszy w badaniu. Tę kombinację, CMC-544 (80 gg/kg) z rituximabem (RITUXAN) (10 mg/kg), oznaczono jako kombinację ze średnią dawką (MD) i badano ją w celu określenia działania niższych dawek kombinacji leków na przeżycie myszy SCID. CMC-544 (160 gg/kg) i sam rituximab (RITUXAN) (20 mg/kg), podawano jak opisano powyżej dla modelu ustabilizowanego. Każdy z tych leków zwiększył średni czas przeżycia, odpowiednio do 58,5 i 50,5 dnia (Fig. 25, Tabela 9). Dla kombinacji średni czas przeżycia nieznacznie (aczkolwiek w statystycznie nieistotny sposób, p>0,05) zwiększył się do 64,4 dnia przy dużej dawce kombinacji. Kombinacja przy średniej dawce wynoszącej 80 gg/kg CMC-544 i 10 mg/kg rituximabu (RITUXAN) znacznie zwiększyła (p<0,05 w stosunku do grupy leczonej nośnikiem) czas przeżycia, średnio do 92,4 dnia. Wyniki te sugerują, że niższe dawki kombinacji CMC-544 i rituximabu (RITUXAN) były uzasadnione.
T A B E L A 9: OPIS POMIARÓW CZASÓW PRZEŻYCIA WE WSTĘPNYM BADANIU KOMBINACJI
Związek Średni czas przeżycia Mediana czasu przeżycia Standardowe odchylenie Min. czas przeżycia Maks. czas przeżycia Ilość zwierząt
CMC MD + Ritux MD 92,4 >100,0 16,0 62,0 >100,0 10
CMC HD + Ritux HD 64,4 58,5 26,7 29,0 >100,0 10
CMC-544 58,5 34,5 35,8 27,0 >100,0 10
Rituximab 50,5 41,0 26,4 30,0 >100,0 10
Nośnik 31,0 27,0 9,7 27,0 56,0 9
CMC MD = CMC544 średnia dawka, 80 gg/kg CMC HD = CMC-544 duża dawka, 160 gg/kg Ritux MD = Rituximab średnia dawka, 10 mg/kg Ritux HD = Rituximab duża dawka, 20 mg/kg
PL 224 150 B1
Badano również kombinację CMC-544 i rituximabu (RITUXAN). Leczenie prowadzono w następujących grupach: CMC-544 w dawkach 40, 80 i 160 gg/kg; rituximab (RITUXAN) w dawkach 5, 10 i 20 mg/kg; i CMC-544 w dawce 40 gg/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 5 mg/kg, CMC-544 w dawce 80 gg/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 10 mg/kg i CMC-544 w dawce 160 gg/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 20 mg/kg. Wszystkie dawki rituximabu (RITUXAN) nieznacznie poprawiły średni czas przeżycia w zakresie 33 do 40 dni (dla wszystkich dawek p<0,05 w porównaniu ze średnim czasem przeżycia w grupie leczonej nośnikiem, wynoszącym 25,8 dnia, Fig. 26, Tabela 10). Duża dawka CMC-544, 160 gg/kg, zwiększyła średni czas przeżycia do 85 dni, to było zgodnie z wynikami podanymi dla dwóch wcześniejszych badań. Połączenie CMC-544 z rituximabem (RITUXAN) nie przyniosło znacznej poprawy czasów przeżycia (Fig. 27, Tabela 10). Każda z dwóch niższych dawek CMC-544 (80 i 40 gg/kg) poprawiła znacznie (p<0,05) czasy przeżycia, w porównaniu z odnotowanymi dla wysokiej dawki CMC-544. Dla dawek CMC-544 40 i 80 gg/kg, odpowiednio u 90% i 80% myszy obserwowano przeżycie przez 125 dni. W obydwu grupach z kombinacją leków 100% myszy przeżyłoaż do 125 dnia. Niższe dawki CMC-544 są bardziej skuteczne niż wysoka dawka, 160 gg/kg.
Rituximab (RITUXAN) w kombinacji z CMC-544 nie miał oczywistego wpływu na aktywność wobec modelu rozsianego chłoniaka z limfocytów B u myszy SCID w badanych dawkach (patrz powyżej). Stosując model podskórnego ksenoprzeszczepu chłoniaka z limfocytów B u myszy nagich Balb/c, oceniano również, czy CMC-544, podawany z rituximabem (RITUXAN) spowodował nasilenie lub zahamowanie aktywności przeciwnowotworowej. W podskórknym modelu chłoniaka z limfocytów B guzy ustabilizowano do średniego ciężaru 300 mg, a następnie podawano dootrzewnowo dwa badane środki terapeutyczne. CMC-544 stosowano w dawkach 20 lub 80 gg/kg Q4Dx3, z lub bez rituximabu (RITUXAN) (20 mg/kg Q4Dx3). Współpodawanie rituximabu (RITUXAN) nie zwiększyło ani nie zahamowało w sposób istotny (p>0,05) skuteczności terapeutycznej CMC-544 (Fig. 28). W badaniu tym rituximab (RITUXAN), podawany sam, hamował wzrost chłoniaka RL z limfocytów B (57% zahamowania wzrostu guza w dniu 20, p<0,05 w stosunku do grupy leczonej nośnikiem), podobnie jak obserwowano dla niższej dawki CMC-544.
Schemat z kombinacją środków chemioterapeutycznych CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon) jest najczęściej stosowaną metodą terapeutyczną w leczeniu pacjentów z chłoniakiem nieziarniczym. Przeciwnowotworowe działanie CHOP porównywano z działaniem CMC-544 w ustabilizowanych ksenoprzeszczepach chłoniaka RL z limfocytów B. Poszczególne składniki schematu CHOP stosowano u myszy nagich w odpowiednich maksymalnych tolerowanych dawkach (danych nie podano), jak następuje: cyklofosfamid (C) 40 mg/kg IP, doksorubicyna (H) 3,3 mg/kg IP, winkrystyna (O) 0,5 mg/kg IP i prednizon (P) 0,2 mg/kg PO. CHO podawano Q4Dx3, a P podawano PO, Q2Dx5. CMC-544 podawano IP, Q4Dx3 w dawce 160 gg/kg równoważnika kalicheamycyny. Leczenie CHOP początkowo spowodowało znaczne hamowanie wzrostu chłoniaka RL z limfocytów B (Fig. 29). Jednakże, po 3 tygodniach guzy ponownie rosły z podobną szybkością wzrostu, jak w grupie leczonej nośnikiem. W przeciwieństwie do powyższego, przeciwnowotworowe działanie CMC-544 było całkowite i trwało przez cały okres badania. Wyniki te sugerują, że CMC-544, w dawkach znacznie niższych od maksymalnej dawki nieletalnej u myszy nagich, jest znacznie skuteczniejszy niż terapia skojarzona CHOP.
Badania te wykazują, że rituximab (RITUXAN), jako dodatek do CMC-544, spowodował znaczny wzrost aktywności cytotoksycznej CMC-544, obserwowanej w stosunku do komórek chłoniaka Ramos z limfocytów B. Donoszono ostatnio o synergistycznej interakcji rituximabu (RITUXAN) i glukokortykosterodów w komórkach Ramos. Ponadto, gdy rituximab (RITUXAN) podawano w kombinacji z 10 gM deksametazonu, obserwowano synergistyczny wzrost zahamowania w 4 do 8 dodatkowych liniach komórkowych.
Zgodnie z doniesieniami, sam rituximab (RITUXAN) w dawce 0,4 do 10 gg/ml, spowodował istotne, aczkolwiek małe (maksymalnie 18%) zahamowanie wzrostu komórek Ramos. Był on ponadto aktywny w 6 spośród 8 linii komórkowych chłoniaka nieziarniczego zależnego od limfocytów B, przy inkubacji w dawce 10 gg/ml (48 godzin inkubacji). W publikacji Ghetie i in., wykazano, że po 24 godzinach inkubacji z komórkami Ramos, rituximab (RITUXAN), w dawce 10 gg/ml, spowodował 6,2% wzrostu apoptozy (w porównaniu z 3,5% dla komórek traktowanych nośnikiem). Zgodnie z bieżącymi badaniami, rituximab (RITUXAN), w dawkach 20 i 200 gg/ml, gdy był podawany sam, nie miał wpływu na wzrost komórek Ramos. W badaniach na myszach nie stwierdzono żadnej interakcji pomiędzy CMC-544 i rituximabem (RITUXAN) ani w modelu rozsianym, ani w modelu podskórnego kseno38
PL 224 150 B1 przeszczepu. Badane kombinacje leków nie zakłócały ani nie wzmagały działania poszczególnych składników. Należało potwierdzić, czy zmniejszenie dawek każdego leku w modelu rozsianym wpłynie na zmianę w tych obserwacjach.
Model rozsianego chłoniaka zależnego od limfocytów B z komórkami Ramos został opisany w publikacji Flavell i in. Zgodnie z doniesieniami, średnia czasów przeżycia w grupie myszy leczonych nośnikiem wynosiła 34-36 dni. U myszy rozwijało się porażenie kończyn tylnych, które postępowało, powodując stan konania, a wkrótce potem śmierć. Analiza histologiczna narządów wykazała, że najczęściej atakowanymi narządami były nadnercza, śledziona i przestrzeń podpajęczynówkowa. W przestrzeni podpajęczynówkowej często pojawiają się nacieki rozszerzające się w kierunku mózgu. Rituximab (RITUXAN) działał dobrze, gdy podawano go we wczesnej fazie procesu chorobowego myszom SCID z rozsianym chłoniakiem (Fig. 23), ale był mniej skuteczny przy podawaniu dnia 9 w modelu z ustabilizowaną fazą (Fig. 24). Rituximab (RITUXAN), będący izotypem IgG1, najprawdopodobniej działa poprzez mechanizmy efektorowe mysiego gospodarza. Mechanizmy te obejmują cytotoksyczność, której pośredniczy dopełniacz i/lub zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową poprzez rekrutację komórek naturalnych zabójców, które są obecne u myszy SCID. Wstrzyknięte komórki nowotworowe Ramos prawdopodobnie stają się wcześniej bardziej podatne na mechanizmy odpornościowe gospodarza, które aktywowano rituximabem (RITUXAN), zanim zyskają możliwość naciekania do dotkniętych narządów. Nieskoniugowanego przeciwciała G5/44 (cząsteczka kierująca w CMC-544) nie badano jeszcze w modelu rozsianego guza u myszy SCID, ale nie odnotowano jego działania przy podawaniu w modelu podskórnych ksenoprzeszczepów. Nie oczekuje się, że G5/44, jako izotyp IgG4, będzie aktywował mechanizmy efektorowe gospodarza, a tym samym będzie miał działanie przeciwnowotworowe.
G5/44 skoniugowany z kalicheamycyną (CMC-544) działa w przeciwny sposób niż rituximab (RITUXAN), dając lepsze wyniki przy podawaniu w ustabilizowanej fazie choroby. Przyczyna, dla której CMC-544 ma lepsze działanie w ustabilizowanej fazie, nie jest jasna, ale faza ustabilizowana w bliższym stopniu odzwierciedla sytuację kliniczną. CMA-676, dopasowany izotyp, niewiążący koniugat kontrolny, nie miał znacznego wpływu na średnie czasy przeżycia. Wyniki w modelu myszy SCID z rozsianym chłoniakiem sugerują wyraźnie, że w celu określenia maksymalnej dawki skutecznej (MED), dawki CMC-544 należy zmniejszyć. Dawka 160 pg/kg była mniej aktywna od niższych dawek 80 i 40 pg/kg. Powód nie jest jasny, ale dawka 160 pg/kg może znacznie przekraczać dawkę MED. Problemowi temu poświęcono dalsze badania.
Zgodnie z publikacją Mohammad i in., terapię CHOP (cyklofosfamid (C) 40 mg/kg IV, oksorubicyna (H) 3,3 mg/kg IV, winkrystyna (O) 0,5 mg/kg IV i prednizon (P) 0,2 mg/kg PO) stosowano w modelu podskórnych przeszczepów z linią komórkową rozsianego wielokomórkowego chłoniaka, DLCL. Jako dawki w terapii CHOP stosowano dawki oznaczone jako maksymalne dawki tolerowane. Leczenie, CHO podawane raz IV i P, stosowane raz dziennie przez 5 dni, uważano za „aktywne” i uzyskano wartość T/C 25,8%. Nie zapisywano liczy wyleczonych nowotworów. Wyniki w modelu opisanym przez Mohammada i in., wydają się podobne do obserwowanych w terapii CHOP (podawanej IP, Q4Dx3) w opisanym tu modelu RL. W przeciwieństwie do CMC-544, w żadnym z badań CHOP nie uzyskano wyniku długotrwałych wyleczeń.
T A B E L A 10: OPISOWE POMIARY CZASU PRZEŻYCIA W BADANIACH KOMBINACJI
Leczenie Średni czas przeżycia Średnia czasów przeżycia Standardowe odchylenie Min. czas przeżycia Maks. czas przeżycia Liczba zwierząt
1 2 3 4 5 6 7
CMC-544 40 pg/kg 118,90 125,00 19,29 64,00 125,00 10
CMC LD + Ritux LD 125,00 125,00 0,00 125,00 125,00 10
CMC-544 80 μ/kg 118,22 125,00 17,86 71,00 125,00 9
CMC MD + Ritux MD 125,00 125,00 0,00 125,00 125,00 10
CMC-544 160 pg/kg 85,22 82,00 40,37 35,00 125,00 9
CMC HD + Ritux HD 91,30 100,00 36,31 44,00 125,00 10
Rituximab 5 mg/kg 40,70 36,50 9,57 34,00 64,00 10
PL 224 150 B1 cd. tabeli 10
1 2 3 4 5 6 7
Rituximab 10 mg/kg 33,80 34,00 3,26 29,00 41,00 10
Rituximab 20 mg/kg 40,50 34,00 15,45 31,00 82,00 10
Nośnik 25,80 25,00 3,12 22,00 34,00 10
CMC LD = CMC-544 niska dawka, 40 Mg/kg
Ritux LD = Rituximab niska, 5 mg/kg
CMC MD = CMC-544 średnia dawka, 80 Mg/kg
Ritux MD = Rituximab średnia dawka, 10 mg/kg
CMC HD = CMC-544 wysoka dawka, 160 Mg/kg
Ritux HD = Rituximab wysoka dawka, 20 mg/kg
P R Z Y K Ł A D 8
STABILNE FORMULACJE CMC-544
Stabilne formulacje CMC-544 do podawania in vivo wytworzono przez dodanie rozcieńczalników, nośników i stabilizatorów. Po chromatografii HIC, frakcje chromatograficzne badano metodą SEC-HPLC i metodą analizy UV przy wielu długościach fali. Na podstawie powyższej analizy dobrano odpowiednie frakcje i uzyskano informacje dotyczące zawartości agregatu, stężenia białka i obciążenia kalicheamycyną. W celu stabilizowania roztworu dodano substancje pomocnicze, stabilizatory, czynniki wypełniające i środki buforujące. Ponieważ CMC-544 może ulec rozkładowi w wielu szlakach rozkładu, przy opracowywaniu formulacji należy uwzględnić niestabilność fizyczną. Jednym z głównych problemów w pracach nad formulacjami jest konieczność zminimalizowania szybkości hydrolizy kalicheamycyny z przeciwciała, przy jednoczesnym utrzymaniu fizycznej i chemicznej integralności przeciwciała przeciwko CD-22. Ponadto, należy również zmniejszyć wytrącanie się koniugatu kalicheamycyna - przeciwciało, które może wystąpić w warunkach określonego pH i przy określonym stężeniu.
W pracach nad formułowaniem monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny - przeciwciało, pH formulacji jest krytyczne, ponieważ zmniejsza rozkład i niestabilność fizyczną. W celu zmniejszenia hydrolizy kalicheamycyny i otrzymania odpowiedniej rozpuszczalności koniugatu wybrano pH o wartości 8,0. Dodatkowe dane, otrzymane w badaniach SDS-PAGE i w badaniach wiązania antygenu metodą ELISA, wskazują, że przy pH 8,0 zachowano znaczną strukturalną integralność i swoistość przeciwciała. W konsekwencji, aby utrzymać pH na poziomie 8,0, jako czynnik buforujący wybrano trometaminę. Innym buforem może być dizasadowa sól sodowa lub fosforan potasu. Stężenie buforu może mieścić się w zakresie 5 do 50 mM. Jako korzystne do utrzymania optymalnej stabilności/rozpuszczalności sugeruje się pH w zakresie 7,5 do 8,5. W obecnym opisie, pH dla wytworzonego produktu mieści się w zakresie 7,0-9,0.
Aczkolwiek stabilność buforowanych roztworów koniugatów jest odpowiednia dla krótkich okresów, stabilność długotrwała jest zła. W celu poprawienia czasu przechowywania koniugatów stosuje się liofilizację. Problemy towarzyszące liofilizacji roztworu białka są dobrze znane i podczas procesu zamrażania i suszenia mogą wystąpić straty w drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze. Wprowadzona do preparatu sacharoza pełni funkcję amorficznego stabilizatora koniugatu i utrzymuje strukturalną integralność przeciwciała podczas zamrażania i suszenia. Sacharozę stosuje się w stężeniach 1,5-5,0% wag./obj. Ponadto, w celu poprawienia wyglądu i zwiększenia sztywności fizycznej liofilizowanych placków można wprowadzić polimerowy czynnik wypełniający, taki ja dekstran lub hydroksyetyloskrobia, w stężeniach w zakresie 0,5-1,5% wagowego. Stosując takie substancje można uzyskać liofilizowane placki przy stosunkowo niskich stężeniach i można je stosować do zmniejszenia łącznej zawartości substancji stałych w liofilizowanej formulacji, umożliwiając w ten sposób szybką liofilizację. W badaniach formulacji stosowano Dekstran 40 w stężeniu 0,9% wagowego.
W celu zwiększenia rozpuszczalności koniugatu do formulacji wprowadzono Polisorbat 80. Stosowano korzystne stężenie 0,01%, a zakres możliwych do stosowania stężeń wynosi 0,005-0,05%. Do formulacji dodano również TWEEN w stężeniu 0,01-0,05% objętościowych.
Do formulacji można również dodać elektrolitu, który stosuje się w celu poprawienia efektywności końcowego procesu oczyszczania. Na ogół stosuje się chlorek sodu w stężeniu 0,01 M do 0,1 M. Zamiast chlorku sodu można również stosować inne elektrolity, takie jak siarczan sodu, który można łatwiej liofilizować. W najlepszym przypadku, końcowy roztwór CMC-544 zawiera 1,5% sacharozy (wagowo), 0,9% Dekstran 40 (wagowo), 0,01% TWEEN 80, 50 mM chlorku sodu, 0,01% polisorbat 80 (wagowo) i 20 mM trometaminy.
PL 224 150 B1
Typowy skład roztworu przed liofilizacją jest następujący: 5 mg/ml CMC-544, 1,5% wagowego sacharozy, 0,9% wagowego Dekstran 40, 0,05 M chlorku sodu, 0,01-0,05% objętościowy TWEEN, 0,01% wagowego polisorbat 80, 0,02 M trometaminy, pH 8,0, oraz woda. Roztwór porcjuje się do bursztynowych fiolek w temperaturze +5°C do 10°C, (korzystnie +5°C); następnie roztwór zamraża się w temperaturze zamrażania -35°C do -50°C, (korzystnie w -45°C); zamrożony roztwór poddaje się początkowemu etapowi liofilizacji pod pierwszym ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67 do 10,67 Pa (20 do 80 mikronów) (korzystnie ok. ok. 8 Pa (60 mikronów)); liofilizowany produkt utrzymuje się w temperaturze przechowywania wynoszącej -10°C do -40°C, (korzystnie -30°C), przez 24 do 72 godzin, (korzystnie przez 60 godzin); i na końcu liofilizowany produkt poddaje się drugiemu etapowi suszenia pod ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67-10,67 Pa (20-80 mikronów), (korzystnie 8 Pa (60 mikronów)) w temperaturze przechowywania +10°C do + 35°C, (korzystnie +25°C), przez 15 do 30 godzin (korzystnie przez 24 godziny). Do określenia końca etapu pierwszego suszenia stosuje się test podnoszenia ciśnienia. Pod koniec cyklu liofilizacji fiolki napełnia się azotem i zamyka.
W Tabeli 11 zestawiono różnice w formulacjach stosowanych dla CMC-544 i dla CMC-676. Istotne różnice pomiędzy formulacjami dla CMA-676 i dla CMC-544 obejmują zmniejszone stężenie białka w nowej formulacji (0,5 mg/ml), stosowanie trometaminy jako buforu i obecność 0,01% TWEEN 80. Różnice te spowodowały, że rekonstytuowana nowa formulacja CMC-544 była klarowna, w przeciwieństwie do zmętnienia, które obserwowano w rekonstytuowanej formulacji CMA-676 (patrz Tabele 12 i 13).
T A B E L A 11: PORÓWNANIE FORMULACJI CMA-676 i FORMULACJI CMC-544 DLA CMC-544
Formulacja CMA-676 Formulacja CMC-544
Stężenie białka 1,0 mg/ml 0,5 mg/ml
Skład 1,5% sacharozy, 0,9% dekstran 40, 100 mm chlorku sodu, 5 mm buforu fosforanowego 1,5% sacharozy, 0,9% dekstran 40, 0,01% TWEEN 80, 0,01% polisorbat 80, 50 mm chlorku sodu, 20 mm trometaminy
T A B E L A 12: STABILNOŚĆ I OBSERWACJE WŁASNOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH FORMULACJI CMA-676 i CMC-544 DLA CMC-544 W TEMPERATURZE 5°C
Formulacja CMA-676 Formulacja CMC-544
Czas Na początku 2 tygodnie Na początku 2 tygodnie
Obserwacje Lekko mętna Lekko mętna Klarowna Klarowna
pH 7,5 7,5 7,8 7,8
Całkowita ilość białka (mg/ml) 1,07 1,07 0,52 0,52
Całkowita ilość kalicheamycyny (pg/mg białka) 67 67 57 57
Nieskoniugowana kalicheamycyny (pg/mg białka) 1,21 2,82 0,97 1,13
% Agregatów 3,03 2,81 1,59 1,70
T A B E L A 13: STABILNOŚĆ I OBSERWACJE WŁASNOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH FORMULACJI CMA-676 I CMC-544 LIOFILIZOWANCH I PRZECHOWYWANYCH W TEMPERATURZE 25°C
Formulacja CMA-676 Formulacja CMC-544
Czas Na początku 4 tygodnie Na początku 4 tygodnie
1 2 3 4 5
Obserwacje własności fizycznych rekonstytuowanych koniugatów Lekko mętna Lekko mętna Klarowna Klarowna
pH 7,5 7,5 7,8 7,8
Całkowita ilość białka (mg/ml) 1,03 1,03 0,51 0,51
PL 224 150 B1 cd. tabeli 13
1 2 3 4 5
Całkowita ilość kalicheamycyny (pg/irig białka) 67 67 57 57
Nieskoniugowana kalicheamycyny (pg/irig białka) 1,13 1,03 1,03 0,94
% Agregatów 2,63 2,96 1,49 2,09
BIBLIOGRAFIA
1. G. Kohler i Milstein, C., Nature, 256:495 (1975).
2. T. G. Hose i Blair, A.H. CRC Critical Rev. Drug Carrier Systems 3:263 (1987).
3. Patent USA Nr 5,877,296
4. Patent USA Nr 5,773,001
5. Patent USA Nr 5,714,586
6. Patent USA Nr 5,712,374
7. Patent USA Nr. No. 5,053,394
8. J. Tramontane i in., J. Mol. Recognit. 7:9 (1994).
9. H. McConnell i Hoess, J., J. Mol. Biol. 250:460 (1995).
10. Nord i in., Nat Biotechnol. 15:772 (1997).
11. Nord i in., Protein Eng. 8:601 (1995).
12. Ku i Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:6552 (1995).
13. Markand i in., Biochemistry 35:8045 (1996).
14. Markand i in., Biochemistry 35:8098 (1996).
15. Rottgen i Collins, Gene 164:243 (1995).
16. Wang i in., J. Biol. Chem., 270:12250 (1995).
17. I.D. Bernstein i in., J. Clin. Invest. 79:1153 (1987).
18. I.D. Bernstein i in., J. Immunol. 128:867-881 (1992).
19. Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, 1991, U.S. Department of Health i Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health.
20. Publikacja zgłoszenia PCT nr WO 91/09967.
21. Yang i in., J. Mol. Biol., 254, 392-403 (1995).
22. Low i in., J. Mol. Biol., 260, 359-368 (1996).
23. Patten i in., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, (1997).
24. Thompson i in., J. Mol. Biol., 256, 77-88, (1996).
25. Crameri i in., Nature, 391, 288-291, (1998).
26. Patent USA Nr 4,671,958
27. Patent USA Nr 4,970,198
28. Patent USA Nr 5,037,651
29. Patent USA Nr 5,079,233
30. Patent USA Nr 5,877,296
31. Publikacja zgłoszenia PCT nr WO 98/20734
32. Trail P i Bianchi A., Current Opin. Immunol., 11:584-588, (1999).
33. Dubowchik G. i Walker M., Pharmacol. & Therapeutics, 83:67-123 (1999).
34. Bross P.F., Beitz J., Chen G., Chen X.H., Duffy E., Keiffer-Bross P., Beitz J., Chen G., Chen X., Duffy E., Kieffer L., Roy S., Sridhara R., Rahman A., Williams G., Pazdur R., Clin. Cancer Res., 7:1490-1496 (2001).
35. Berger M., Leopold L., Dowell J., Korth-Bradley J., Sherman M. invest. New Drugs, 20:395-406 (2002).
36. Sievers E., Larson R., Stadmauer E., Estey E., Lowenberg B., Dombret H., Karanes C., Theobald M., Bennet J., Sherman M., i in., J. Clin. Oncol., 19:3244-3254 (2001).
37. Larson R., Boogaerts M., Estey E., Karanes C., Stadtmauer E., Sievers E., Mineur P., Bennett J., Berger M., Eten C. i in., Leukemia, 16:1627-1636 (2002).
38. Hamann P., Hinman L., Beyer C., Kindh D., Upeslacis J., Flowers D., Bernstein I., Choice of Linker. Bioconj. Chem., 13:40-46 (2002).
PL 224 150 B1
39. Hamann P., Hinman L., Hollander I., Beyer C., Lindh D., Holcomb R., Hallet W., Tsou H., Upeslacis J., Shochat D., i in., Bioconj. Chem., 13:47-58 (2002).
40. Lee M., Dunne T., Chang C., Siegal M., Morton G., Ellestad G., McGahren W., Borders D., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114:985-987 (1992).
41. Zein N., Sinha A., McGahren W., Ellestad G., Science, 240:1198-1201 (1988).
42. Thorson J., Sievers E., Ahlert J., Shepard E., Whitwam R., Onwueme K., Ruppen M., Current Pharmaceut. Design, 6:1841-1879 (2000).
43. Andrews R., Singer J., Bernstein I., J. Exp. Med., 169:1721-1731 (1989).
44. Kreitman R.J., Current Pharmaceut. Biotech., 2:313-325 (2001).
45. Pastan I., Kreitman R.J., Current Opin. Investig. Drugs, 3(7):1089-1091 (2002).
46. Kreitman R.J., Curr. Opin. Mol. Ther., 5:44-551 (2003).
47. Crocker P.R. i Varki A. Siglecs, Trends in Immunol., 22:337-342 (2001).
48. Hursey M., Newton D.L., Hansen H.J., Ruby D., Goldenberg D.M., Rybak S.M., Leukemia i Lymphoma, 43:953-959 (2002).
49. Nitschke L., Floyd H. i Crocker P.R., Scand. J. Immunol., 53:227-234 (2001).
50. Moyron-Quiroz J.E., Partida-Sanchez S., Donis-Hernandez R. Sandoval-Montes C. i Santos-Argumedo L., Scand. J. Immunol., 55:343-351 (2002).
51. Tedder T.F., Tuscano J., Sato S., Kehrl J.H., Ann. Rev. Immunol., 15:481-504 (1997).
52. Hanna R., Ong G.L., Mattes M.J., Cancer Res., 56:3062-3068 (1996).
53. Shan D. i Press O.W., J. Immunol., 154:4466-4475 (1995).
54. Dowell J.A., Korth-Bradley J., Liu H., King S.P., Berger M.S., J. Clin. Pharmacol., 41:1206-1214 (2001).
55. Gibaldi M., Perrier D., Pharmacokinetics, wydanie 2, Marcel-Dekker Inc., NY (1982).
56. Van Horssen P.J., Preijers, F.W., Van Oosterhout, Y.V., Eling W.M. i De Witte, T., Leukemia & Lymphoma, 39(5-6):591-599 (2000).
57. Hinman L.M., Hamann P.R., Wallace R., Menendez A.T., Durr F.E., Upeslacis J., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993).
58. Kreitman R.J., Wilson W.H., Bergeron K., Raggio M., Stetler-Stevenson M., Fitzgerald D.J., Pastan I., N. Engl. J. Med., 345:241-247 (2001).
59. Leonard J.P. i Link B.K., Sem. Oncol. 29:81-86 (2002).
60. Schindler J., Sausville E., Messmann R., Uhr J.W. & Vitetta, E.S., Clin.Cancer Res., 7, 255-258 (2001).
61. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, red., Cancer Principles i Practice of Oncology, wydanie 6, wydawcy: Lippincott, Williams i Wilkins (2001).
62. Edward Chu i Vincent T. DeVita, Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, Publishers: Jones i Bartlett (2002).
PL 224 150 B1
Wykaz sekwencji
<110> Wyeth Holdings Corporation Kunz, i in., Arthur
<120> KONIUGATY POCHODNA KALICHEAMYCYNY/NOŚNIK
<130> P194 1010PL.D3
<150> <151> 60/377,440 2002-05-02
<150> <151> PCT/US2003/013910 2003-05-02
<160> 65
<170> Patentln wer. 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 5 PRT Mus musculus
<220> <223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H1
<400> 1
Asn Tyr Trp Ile His 1 5
<210> <211> <212> <213> 2 16 PRT Mus musculus
<220> <223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H2gLl T3
<400> 2
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 3 12 PRT Mus musculus
<220> <223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H3
<400> 3
Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10
<210> <211> <212> <213> 4 15 PRT Mus musculus
PL 224 150 B1 <220>
<223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L1 <400> 4
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn 1 5 10
Thr Phe Leu 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L2 <400> 5
Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0>
<223> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L3 <4 00> 6
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0>
<223> mysie monoklonalne 5/44 VL domain <400> 7
Asp Val Val Val Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Gin Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser
2 0 2 5 30
Tyr Gly Asn Thr Ehe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
5 0 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Thr Ile Lys Pro Glu A.sp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly
85 90 95
Thr Hi s Gin Pro Tyr Thr Ehe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
PL 224 150 B1 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<223> mysie monoklonalne 5/44 VH domain <400> 8
Glu Val 1 Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Thr Val 10 Leu Ala Arg Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<220>
<223> T57A
PL 224 150 B1 <400> 11
Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn 10 Leu Lys Gly
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> T57V
<400> 12
Gly Asr l Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 1 7
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> CDR-H2 (T57)A H'
<400> 13
Gly Ile : Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> K6CR
<400> 14
Gly Asr l Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> CDR-H2 (K60R)RH’’
<400> 15
Gly Ile : Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys
1 ” 5 10 15
Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
PL 224 150 B1 <220>
<223> CDR-: H2 (T57A K60R) H'
<4 0 0> 16
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys
1 5 10 15 ’
Gly
<210> 17
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> DKP9
<4 00> 17
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Trp Tyr 25 Gin Gin Lys Pro Gly 30 Lys Ala
Pro Lys Leu 35 Leu Ile Tyr Gly Val 40 Pro Ser Arg Phe Ser 45 Gly Ser Gly
Ser Gly 5 0 Thr Asp Phe Thr Leu 55 Thr Ile Ser Ser Leu 6 0 Gin Pro Glu Asp
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
70 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> JK1 <400> 18
Phe Gly Gin Gly 'l'hr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 113 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22 0>
<223> gLl <400> 19
Asp 1 Val Gin Val Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
PL 224 150 B1
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly
85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gL2
<400> 20
Asp Val Val Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly
85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 21
<211> 80
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> DP7
<400> 21
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val
20 25 30
Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Phe Gin Gly
35 40 45
PL 224 150 B1
Arg Val 50 Thr Met Thr Arg Asp 55 Thr Ser Thr Ser Thr 60 Val Tyr Met Glu
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75 80
<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> JH4 <400> 22
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gHl <400> 23
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gin Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 .10
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24 <211> 121 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH4 <400> 24
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
25 30
PL 224 150 B1
Trp Ile His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu
50 55 SO
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH5
<400 25
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val· Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210 26
<211> 121
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> gH6
<400> 26
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
PL 224 150 B1
Trp ile His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> : 27
<211> 121
<212> : PRT
<213> . Sekwencja sztuczna
<220>
<223> , gH7
<400> : 27
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29 <211> 239 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Pełna sekwencja g5/44 łańcuch lekki <400 28
Met 1 Lys Leu Pro Val 5 Arg Leu Leu Val Leu 10 Leu Leu Phe Trp Ile 15 Pro
Ala Ser Arg Gly Asp Val Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
PL 224 150 B1
Ala Ser Val 35 Gly Asp Arg Val Thr 40 Ile Thr Cys Arg Ser 45 Ser Gin Ser
Leu Ala 50 Asn Ser Tyr Gly Asn 55 Thr Phe Leu Ser Trp 60 Tyr Leu His Lys
Pro 65 Gly Lys Ala Pro Gin 70 Leu Leu Ile Tyr Gly 75 Ile Ser Asn Arg Phe 90
Ser Gly Val Pro Asp 85 Arg Phe Ser Gly Ser 90 Gly Ser Gly Thr Asp 95 Phe
Thr Leu Thr Ile 100 Ser Ser Leu Gin Pro 105 Glu Asp Phe Ala Thr 110 Tyr Tyr
Cys Leu Gin 115 Gly Thr His Gin Pro 120 Tyr Thr Phe Gly Gin 125 Gly Thr Lys
Val Glu 130 Ile Lys Arg Thr Val 135 Ala Ala Pro Ser Val 140 Phe Ile Phe Pro
Pro 145 Ser Asp Glu Gin Leu 150 Lys Ser Gly Thr Ala 155 Ser Val Val Cys Leu 160
Leu Asn Asn Phe Tyr 165 Pro Arg Glu Ala Lys 170 Val Gin Trp Lys Val 175 Asp
Asn Ala Leu Gin 180 Ser Gly Asn Ser Gin 185 Glu Ser Val Thr Glu 190 Gin Asp
Ser Lys Asp 195 Ser Thr Tyr Ser Leu 200 Ser Ser Thr Leu Thr 205 Leu Ser Lys
Ala Asp 210 Tyr Glu Lys His Lys 215 Val Tyr Ala Cys Glu 220 Val Thr His Gin
Gly 225 Leu Ser Ser Pro Val 230 Thr Lys Ser Phe Asn 235 Arg Gly Glu Cys
<21C> 29 <211> 781 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> DNA nić kodująca g5/44 łańcuch lekki <400> 29
ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt 60
cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta 120
ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180
acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga 240
atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag tggtactgat 300
ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa 360
ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta 420
gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480
tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 54 0
PL 224 150 B1
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600
agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720
aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt 78 0
c 781
<210> 30 <211> 467 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Pełna sekwencja g5/44 łańcuch ciężki <4OO> 30
Met 1 Asp Phe Gly Phe 5 Ser Leu Val Phe Leu 10 Ala Leu Ile Leu Lys 15 Gly
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Val Gin 25 Ser Gly Ala Glu Val 30 Lys Lys
Pro Gly Ala 35 Ser Val Lys Val Ser 40 Cys Lys Ala Ser Gly 45 Tyr Arg Phe
Thr Asn 50 Tyr Trp Ile His Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Gin Gly Leu
Glu 65 Trp Ile Gly G1 y Ile 70 Asn Pro Gly Asn Asn 75 Tyr Ala Thr Tyr Arg 80
Arg Lys Phe Gin Gly 85 Arg Val Thr Met Thr 90 Ala Asp Thr Ser Thr 95 Ser
Thr Val Tyr Met 100 Glu Leu Ser Ser Leu 105 Arg Ser Glu Asp Thr 210 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Thr Arg Glu Gly Tyr 120 Gly Asn Tyr Gly Ala 125 Trp Phe Ala
Tyr Trp 130 Gly Gin Gly Thr Leu 135 Val Thr Val Ser Ser 140 Ala Ser Thr Lys
Gly 145 Pro Ser Val Phe Pro 150 Leu Ala Pro Cys Ser 155 Arg Ser Thr Ser Glu 160
Ser Thr Ala Ala Leu 165 Gly Cys Leu Val Lys 170 Asp Tyr Phe Pro Glu 175 Pro
Val Thr Val Ser 180 Trp Asn Ser Gly Ala 185 Leu Thr Ser Gly Val 190 His Thr
Phe Pro Ala 195 Val Leu Gin Ser Ser 200 Gly Leu Tyr Ser Leu 205 Ser Ser Val
Val Thr 210 Val Pro Ser Ser Ser 215 Leu Gly Thr Lys Thr 220 Tyr Thr Cys Asn
Val 225 Asp His Lys Pro Ser 230 Asn Thr Lys Val Asp 235 Lys Arg Val Glu Ser 243
Lys Tyr Gly Pro Pro 245 Cys Pro Pro Cys Pro 250 Ala Pro Glu Phe Leu 255 Gly
PL 224 150 B1
Gly Pro Ser Val 260 Phe Leu Phe Pro Pro 265 Lys Pro Lys Asp Thr 270 Leu Met
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin
275 260 285
Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
355 3 60 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser C-ln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 4 00
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys
465
<210> 31 <211> 2160 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> DNA nić kodująca g5/44 łańcuch ciężki <400> 31
aagcttgccg ccaccatgga cttcggattc tctctcgtgt tcctggcact cattctcaag 60
ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa gcctggtgct 120
tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gattcattgg 180
gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc cgggaataac 240
tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga cacctccaca 300
agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt gtactattgt 360
actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gggtacccta 42 0
gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480
aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
PL 224 150 B1
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 66 0
ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780
ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840
catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900
ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgccccLace ccaggccctg 960
cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1020
cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc 1080
tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc 1140
catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 1200
ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1260
tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 132 0
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat. 1440
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620
gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680
tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 174 0
atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800
ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860
cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 192 0
caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980
caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc 2040
aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtcta 2100
catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaattc 2160
<210 32 <211> 94 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22 0 <223> 5/44gHl Tl <400> 32 agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt gcttccgtca 60 aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac 94
PL 224 150 B1 <210> 33 <211> 96 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> 5/44gHl Τ2 <400> 33
gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaag ggcagagcaa 60
cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 96
<210> 34
<211> 95
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> 5/44gHl T3
<400> 34
agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc 60
acagtctcct cagcttctac aaagggccca agaaa 95
<210> 35
<211> 94
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> 5/44gHl BI
<400> 35
ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga 60
atccgaagtc catggtggcg gcaagctttt attc 94
<210> 36
<211> 97
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> 5/44gHl B2
<400> 36
gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc 60
aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 97
<210> 37
<211> 93
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> 5/44gHl B3
<400> 37
cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag 60
atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 93
<210> 38 <211> 21 <212> DNA
PL 224 150 B1
PL 224 150 B1 gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc ctaacaggca acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc <210> 44 <211> 88 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> 5/44gLl B2 <400> 44 ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac tctgactgga tctacaagtg atggtgac <210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> 5/44gLl B3 <400> 45 aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> 5/44gLl FI <400> 46 ggatgattcg aagccgccac
gatgttgtgg atctcttgca tacctgcaca tctggggtgc tgactcaaac ggtctagtca agcctggcca cagacaggtt tccactctcc gagtcttgca gtctccacag cactggcagt ctgcctgtca aacagttatg ctcctcatct ggttcaggga gctttggaga ggaacacctt atgggatttc cagatttcac tcaagtttct tttgtcttgg caacagattt actcaagatc
0
180
240
PL 224 150 B1
agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 339
<210> 49
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> DNA nić kodująca mysie monoklonalne ! 3/44 domena VH
<400> 49
gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120
cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat 180
aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc 300
tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 50
<211> 9
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja w starterze oligonukleotydowym
<400> 50
gccgccacc 9
<210> 51
<211> 101
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> starter oligonukleotydowy 5 '
<400> 51
gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60
ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g 101
<210> 52
<211> 339
<212> DNA
<213> MUS mus culus
<220>
<223> DNA nić niekodująca mysie monoklonalne 5/44 domena VL
<400> 52
ctacaacacc actgagtttg aggtgagagg gacggacagt cgaaacctct agttcaaaga 60
tagagaacgt ccagatcagt ctcagaacgt ttgtcaatac ccttgtggaa aaacagaacc 120
atggacgtgt tcggaccggt cagaggtgtc gaggagtaga taccctaaag gttgtctaaa 180
agaccccacg gtctgtccaa gtgaccgtca ccaagtccct gtctaaagtg tgagttctag 240
PL 224 150 B1
tcgtgttatt tcggactcct gaacccttac ataatgacga atgttccatg tgtagtcggc 300
atgtgcaagc ctcccccctg gttcgacctt tattttgca 339
<210 53
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220
<223> DNA nić niekodująca mysie monoklonalne 5/44 domena VH
<400 53
ctccaggttg acgtcgtcag accctgacat gaccgttccg gaccccgaag gcacttctac 60
aggacgttcc gaagaccgat gtccaaatgg ttgatgacct aagtgaccca ttttgtctcc 120
ggacccgtcc cagatcttac ctaaccacca taattaggac ctttattaat atgatgcata 180
ttctccttga acttcccgtt ccggtgtgac tgacgtcagt gtaggcggtc gtgacggatg 240
tacctggagt cgtcggactg ttcactcctg agacgccaga taatgacatg ttctctcccg 300
ataccattga tgccccggac caaacgaatg accccggtcc cctgagacca gtggcagagg 360
agt 363
<210 54 <211> 110 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> gH4 cligonukleotyd <400 54 ccgggaataa ctacgctaca tataggagaa atctaaaggg cagagcaacg ctgaccgcct tattgatgcg atgtatatcc tctttagatt tcccgtctcg ttgcgactgg <210 55 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> gH4 przeszczep <400 55
Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly Arg Ala 15 10 15
Thr Leu Thr Ala 20
110 <210> 56 <211> 109 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH5 cligonukleotyd <400 56 ccgggaataa ctacgctaca tataggagaa atctaaaggg cagagttacg atgaccgcct
PL 224 150 B1 tattgatgcg atgtatatcc tctttagatt tcccgtctca atgctactg
109 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH5 przeszczep <400> 57
Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe Gin Gly Arg Val
10 15
Thr Met Thr Ala 20 <210> 58 <211> 110 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH6 cligonukleotyd <400> 58 ccgggaataa ctacgctaca tataggagaa aattccaggg cagagcaacg ctgaccgcct 60 tattgatgcg atgtatatcc tcttttaagg tcccgtctcg ttgcgactgg 110 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH6 przeszczep <400> 59
Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe Gin Gly Arg Ala
10 15
Thr Leu Thr Ala 20 <210> 60 <211> 110 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH7 olżgonukleotyd <400> 60 ccgggaataa ctacgctaca tataggagaa aattccaggg cagagttacg atgaccgcct 60 tattgatgcg atgtatatcc tcttttaagg tcccgtctca atgctactgg 110 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> gH7 przeszczep
PL 224 150 B1 <400> 61
Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe Gin Gly Arg Val
10 15
Thr Met Thr Ala 20 <210 62 <211> 123 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> gL2 cligonukleotyd <400 62 ecggggtgac gttgtcgtga cccagagccc atccagcctg agcgcatctg taggagaccg 60 gccactgcaa cagcactggg tctcgggtag gtcggactcg cgtagacatc ctctggccca 120 gtg 123 <210 6 3 <211> 22 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> gL2 przeszczep <400 63
Ser Arg Gly Asp Val Val Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val 20 ~ <210 64 <211> 781 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> DNA nić niekodująca g5/44 łańcuch lekki <400 64
aagcttcggc ggtggtactt caacggacaa tccgacaacc acgaagacaa caagacctaa 60
ggacgaaggg ccccactgca agttcactgg gtctcgggta ggtcggactc gcgtagacat 12 0
cctctggccc agtggtagtg aacatctagg tcagtctcag aacgtttgtc aatacccttg 180
tggaaaaaca gaaccataga cgtgtttggt ccatttcggg gtgttaacga gtagatgcct 240
tagagattgt ctaaatcacc acatggt ctg tccaagtcgc caaggccttc accatgacta 300
aagtgggagt gctagagcag agaggtcggt cttctaaagc ggtgaataat gacaaatgtt 360
ecatgtgtag tcggcatgtg taagccagtc ccatgatttc atctttagtt tgcatgccat 420
cgccggggta gacagaagta gaagggcggt agactactcg tcaactttag accttgacgg 480
agacaacaca cggacgactt attgaagata gggtctctcc ggtttcatgt caccttccac 540
ctattgcggg aggttagccc attgagggtc ctctcacagt gtctcgtcct gtcgttcctg 600
tcgtggatgt cggagtcgtc gtgggactgc gactcgtttc gtctgatgct ctttgtgttt 660
PL 224 150 B1
cagatgcgga cgcttcagtg ggtagtcccg gactcgagcg ggcagtgttt ctcgaagttg 720
tcccctctca caatctccct cttcacgggg gtggacgagg agtcaaggtc ggacccttaa 780
g 781
<210> 65 <211> 2160 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> DNA nić nlekodująca g5/44 Łańcuch ciężki <400> 65
ttcgaacggc ggtggtacct gaagcctaag agagagcaca aggaccgtga gtaagagttc 60
cctcacgtca cactccacgt taaccaggtc agtcctcgtc tccaattctt cggaccacga 12 0
aggcagtttc aaagcacatt ccgatcgccg atgtccaagt gtttaataac ctaagtaacc 180
cagtccgtcc gaggccctgt tccggacctt acctagccac cgtaattagg gcccttattg 240
atgcgatgta tatcctcttt taaggtcccg tctcaatgct actggcgcct gtggaggtgt 300
tcgtgacaga tgtacctcga cagtagagac tctaggctcc tgtggcgtca catgataaca 360
tgatctcttc cgatgccatt aatgcctcgg accaagcgga tgaccccggt cccatgggat 420
cagtgtcaga ggagtcgaag atgtttcccg ggtaggcaga agggggaccg cgggacgagg 480
tcctcgtgga ggctctcgtg tcggcgggac ccgacggacc agttcctgat gaaggggctt 540
ggccactgcc acagcacctt gagtccgcgg gactggtcgc cgcacgtgtg gaagggccga 600
caggatgtca ggagtcctga gatgagggag tcgtcgcacc actggcacgg gaggtcgtcg 660
aacccgtgct tctggatgtg gacgttgcat ctagtgttcg ggtcgttgtg gttccacctg 720
ttctctcaac cactctccgg tcgtgtccct ccctcccaca gacgaccttc ggtccgagtc 780
gggaggacgg acctgcgtgg ggccgacacg tcggggtcgg gtcccgtcgt tccgtacggg 840
gtagacagag gagtgggcct ccggagactg gtggggtgag tacgggtccc tctcccagaa 900
gacctaaaaa ggtggtccga ggcccgtcgg tgtccgacct acggggatgg ggtccgggac 960
gcgtatgtcc ccgtccacga cgcgagtctg gacggttctc ggtataggcc ctcctgggac 1020
ggggactgga ttcggttggg gtttccggtt tgagaggtga gggagtcgag tctgtggaag 1080
agaggagggt ctagactcat tgagggttag aagagagacg tctcaggttt ataccagggg 1140
gtacgggtgg tacgggtcca ttcggttggg tccggagcgg gaggtcgagt tccgccctgt 1200
ccacgggatc tcatcggacg taggtccctg tccggggtcg gcccacgact gcgtaggtgg 1260
aggtagagaa ggagtcgtgg actcaaggac ccccctggta gtcagaagga caaggggggt 1320
tttgggttcc tgtgagagta ctagagggcc tggggactcc agtgcacgca ccaccacctg 1380
cactcggtcc ttctggggct ccaggtcaag ttgaccatgc acctaccgca cctccacgta 1440
ttacggttct gtttcggcgc cctcctcgtc aagttgtcgt gcatggcaca ccagtcgcag 1500
gagtggcagg acgtggtcct gaccgacttg ccgttcctca tgttcacgtt ccagaggttg 1560
PL 224 150 B1
tttccggagg gcaggaggta gctcttttgg tagaggtttc ggtttccacc ctgggtgccc 162 0
cacgctcccg gtgtacctgt ctccagtcga gccgggtggg agacgggacc ctcactggcg 1680
acacggttgg agacagggat gtcccgtcgg ggctctcggt gtccacatgt gggacggggg 1740
tagggtcctc ctctactggt tcttggtcca gtcggactgg acggaccagt ttccgaagat 1800
ggggtcgctg tagcggcacc tcaccctctc gttacccgtc ggcctcttgt tgatgttctg 1860
gtgcggaggg cacgacctga ggctgccgag gaagaaggag atgtcgtccg attggcacct 1920
gttctcgtcc accgtcctcc ccttacagaa gagtacgagg cactacgtac tccgagacgt 1980
gttggtgatg tgtgtcttct cggagaggga cagagaccca tttactcacg gtcccggccg 2 04 0
ttcgggggcg aggggcccga gagccccagc gcgctcctac gaaccgtgca tggggcagat 2100
gtatgaaggg tccgtgggtc gtacctttat ttcgtgggtg gtgacgggac cgagcttaag 2160
Zastrzeżenia patentowe

Claims (5)

1. Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny oraz przeciwciało, który jest przedstawiony wzorem:
przy czym przeciwciało obejmuje sekwencję SEKW. NR ID: 1 jako CDR-H1, reszty 50-66 sekwencji SEKW. NR ID: 27 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2 oraz SEKW. NR ID: 6 dla CDR-13;
kalicheamycyna stanowi 4-10% wagowych koniugatu leku; n oznacza 3 do 9; a kompozycja zawiera mniej niż 10% wagowo nieskoniugowanego przeciwciała.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 19 i region zmienny łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 27.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało obejmuje łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji SEKW. NR ID: 30, przy czym przeciwciało jest wyrażane w komórce ssaczej.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało obejmuje łańcuch lekki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji sekwencji SEKW. NR ID: 29 w komórce ssaczej, oraz łańcuch ciężki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji SEKW. NR ID: 31 w komórce ssaczej.
5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, rozcieńczalnik lub nośnik.
PL410219A 2002-05-02 2003-05-02 Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca PL224150B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37744002P 2002-05-02 2002-05-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL410219A1 PL410219A1 (pl) 2015-03-30
PL224150B1 true PL224150B1 (pl) 2016-11-30

Family

ID=29401497

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374523A PL222725B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Sposób wytwarzania kompozycji i kompozycja zawierająca monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22 o zmniejszonej zawartości frakcji niskoskoniugowanej
PL413302A PL228741B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 oraz ich zastosowanie
PL410219A PL224150B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca
PL410218A PL224001B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Sposób wytwarzania stabilnej liofilizowanej kompozycji obejmującej monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22, kompozycja otrzymana tym sposobem oraz jej zastosowanie
PL411824A PL224844B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Zastosowanie kompozycji zawierającej monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374523A PL222725B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Sposób wytwarzania kompozycji i kompozycja zawierająca monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22 o zmniejszonej zawartości frakcji niskoskoniugowanej
PL413302A PL228741B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 oraz ich zastosowanie

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL410218A PL224001B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Sposób wytwarzania stabilnej liofilizowanej kompozycji obejmującej monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22, kompozycja otrzymana tym sposobem oraz jej zastosowanie
PL411824A PL224844B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Zastosowanie kompozycji zawierającej monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22

Country Status (34)

Country Link
US (6) US8153768B2 (pl)
EP (3) EP2371392B1 (pl)
JP (5) JP5153057B2 (pl)
KR (2) KR101125524B1 (pl)
CN (1) CN100482277C (pl)
AU (2) AU2003231293A1 (pl)
BE (1) BE2017C049I2 (pl)
BR (3) BRPI0309868B8 (pl)
CA (2) CA2871117A1 (pl)
CR (3) CR7557A (pl)
CY (4) CY1116634T1 (pl)
DK (3) DK3127553T3 (pl)
EC (1) ECSP045445A (pl)
ES (3) ES2593304T3 (pl)
FR (1) FR17C1054I2 (pl)
HK (2) HK1162926A1 (pl)
HU (4) HUE057124T2 (pl)
IL (2) IL164946A (pl)
LT (3) LT1507556T (pl)
LU (1) LUC00044I2 (pl)
MX (1) MXPA04010792A (pl)
NL (1) NL300903I2 (pl)
NO (3) NO339730B1 (pl)
NZ (2) NZ586071A (pl)
PH (2) PH12013501158B1 (pl)
PL (5) PL222725B1 (pl)
PT (3) PT1507556T (pl)
RU (3) RU2422157C3 (pl)
SG (3) SG10201700289RA (pl)
SI (3) SI2371392T1 (pl)
TW (2) TWI438010B (pl)
UA (1) UA88599C2 (pl)
WO (1) WO2003092623A2 (pl)
ZA (2) ZA200409752B (pl)

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6905669B2 (en) 2001-04-24 2005-06-14 Supergen, Inc. Compositions and methods for reestablishing gene transcription through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase
US20110045005A1 (en) * 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
EP2371392B1 (en) * 2002-05-02 2015-07-08 Wyeth Holdings LLC Calicheamicin derivative-carrier conjugates
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
JP5470597B2 (ja) * 2004-05-26 2014-04-16 国立大学法人 香川大学 希少糖ｄ−アロースを利用した細胞・組織・臓器保存液及び該液を用いる保存方法
TW200621282A (en) * 2004-08-13 2006-07-01 Wyeth Corp Stabilizing formulations
US7294484B2 (en) 2004-08-27 2007-11-13 Wyeth Research Ireland Limited Production of polypeptides
TWI364458B (en) 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
US20060045877A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
PE20060817A1 (es) * 2004-09-10 2006-10-10 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/calicheamicina
EP1661584A1 (en) * 2004-11-26 2006-05-31 Heinz Dr. Faulstich Use of conjugates of amatoxins and phallotoxins with macromolecules for cancer and inflammation therapy
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US7250416B2 (en) 2005-03-11 2007-07-31 Supergen, Inc. Azacytosine analogs and derivatives
US20070003559A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Wyeth Methods of determining pharmacokinetics of targeted therapies
US7678832B2 (en) 2005-08-16 2010-03-16 Synta Pharmaceuticals Corp. Bis(thio-hydrazide amide) formulation
SI1928503T1 (sl) 2005-08-24 2012-11-30 Immunogen Inc Postopek za pripravo konjugatov majtansinoid protitelo
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
WO2008051245A2 (en) * 2005-12-02 2008-05-02 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
WO2007067602A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
KR101443752B1 (ko) 2006-03-10 2014-09-26 와이어쓰 엘엘씨 항-５ｔ４ 항체 및 이의 용도
ES2371085T3 (es) * 2006-05-27 2011-12-27 Faulstich, Heinz, Dr. Utilización de conjugados de amatoxinas o falotoxinas con macromoléculas para la terapia tumoral y de la inflamación.
PT2495307T (pt) 2006-07-13 2018-05-10 Wyeth Llc Produção do fator ix de coagulação com padrão melhorado de glicosilação
NZ575350A (en) 2006-08-21 2012-02-24 Synta Pharmaceuticals Corp Bis(phenylcarbonothioyl)hydrazide derivatives
BRPI0719250A2 (pt) * 2006-10-12 2015-06-16 Wyeth Corp Métodos e composições com opalescência reduzida.
EP2395077A1 (en) 2006-11-03 2011-12-14 Wyeth LLC Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
EP2097097B1 (en) 2006-12-01 2018-05-30 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibodies, in particular human antibodies, that bind cd22 and uses thereof
US8552067B2 (en) * 2006-12-22 2013-10-08 The Regents Of The University Of California Macromolecular conjugates of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein inhibitors and uses therefor
BRPI0806680A2 (pt) * 2007-01-16 2015-06-16 Wyeth Corp Tratamento, detecção e monitoramento de inflamação via trem-1
AU2008223133A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Wyeth Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides
CN102558001B (zh) 2007-05-22 2015-09-23 惠氏有限责任公司 制造酰肼的改良方法
PE20090309A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-18 Wyeth Corp Conjugado portador-caliqueamicina y un metodo de deteccion de caliqueamicina
LT2211904T (lt) * 2007-10-19 2016-11-25 Seattle Genetics, Inc. Cd19 surišantys agentai ir jų panaudojimas
US20090169550A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
JP2011508738A (ja) * 2007-12-26 2011-03-17 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８発現腫瘍細胞のターゲティングを向上させる方法及び剤
MX341344B (es) 2007-12-26 2016-08-16 Biotest Ag Agentes dirigidos a cd138 y sus usos.
US9011864B2 (en) * 2007-12-26 2015-04-21 Biotest Ag Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
KR20100097753A (ko) * 2007-12-26 2010-09-03 바이오테스트 아게 Ｃｄ138 표적성 면역접합체 및 이의 용도
US20090186026A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Wyeth Ephrin and eph receptor agonists for modulation of bone formation and resorption
WO2009124109A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 The Government Of The U.S. A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health &Human Services Human monoclonal antibodies specific for cd22
FR2930443B1 (fr) * 2008-04-29 2010-06-25 Oreal Produit extemporane de soin a base d'un lyophilisat de microorganisme et de tensioactif(s) de hlb superieur ou egal a 12
US8236319B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
CN104984360A (zh) * 2009-06-03 2015-10-21 伊缪诺金公司 轭合方法
EP2533814A2 (en) * 2010-02-11 2012-12-19 Ablynx N.V. Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012023085A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Wyeth Llc Cell culture of growth factor-free adapted cells
HRP20220796T1 (hr) 2010-10-01 2022-10-14 ModernaTX, Inc. Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracil i njihove uporabe
WO2012065161A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Scott & White Healthcare Antibodies to tumor endothelial marker 8
US20120222979A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-06 Elwha LLC, a limited liability company of the State of Delaware Glassy compositions
KR102272828B1 (ko) 2011-03-29 2021-07-05 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
LT2750768T (lt) 2011-08-30 2019-02-11 Astex Pharmaceuticals, Inc. Decitabino darinio kompozicijos
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US20140322758A1 (en) 2011-10-21 2014-10-30 Pfizer Inc. Addition of iron to improve cell culture
BR112014013694A2 (pt) 2011-12-08 2017-06-13 Biotest Ag método para tratar uma doença, e, kit
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
SG11201408626YA (en) 2012-07-03 2015-03-30 Univ Washington Antibodies to tau
US8883979B2 (en) 2012-08-31 2014-11-11 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
AU2013326881B2 (en) 2012-10-04 2018-08-02 Immunogen, Inc. Use of a PVDF membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014080251A1 (en) 2012-11-24 2014-05-30 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
SG10201705150RA (en) 2012-12-21 2017-07-28 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
PL2992015T3 (pl) * 2013-05-02 2019-01-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Leczenie skojarzone niefukozylowanym przeciwciałem anty-CD20 z koniugatem przeciwciało anty-CD22-lek
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
SI3066074T1 (sl) * 2013-11-04 2020-03-31 Pfizer Inc. Intermediati in postopki za sintetizacijo derivatov kaliheamicina
AU2014342610A1 (en) 2013-11-04 2016-06-02 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-EFNA4 antibody-drug conjugates
ES2960619T3 (es) 2014-02-28 2024-03-05 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Enlazadores cargados y sus usos para la conjugación
WO2015140708A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Pfizer Inc. Method of cell culture
US11998594B2 (en) 2014-04-02 2024-06-04 Case Western Reserve University Anti-cancer plant virus particles linked to HER2 antigens
MX2016016490A (es) 2014-06-20 2017-07-28 Bioalliance Cv Conjugados de farmaco-anticuerpo anti-receptor de folato alfa (fra) y metodos de uso de los mismos.
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
US9925281B2 (en) 2014-08-05 2018-03-27 Case Western Reserve University Coated plant virus imaging agents
WO2016073972A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
CN107735110B (zh) 2015-04-07 2021-11-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 纳米粒子免疫偶联物
JP2018515457A (ja) * 2015-04-21 2018-06-14 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー カリケアマイシン構築物および使用方法
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
EP3297672B1 (en) 2015-05-21 2021-09-01 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
US10624975B2 (en) 2015-06-29 2020-04-21 Case Western Reserve University Anticancer drug-containing plant virus particles
AU2016287585B2 (en) 2015-07-02 2020-12-17 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Lyophilized pharmaceutical compositions
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EP3725332B1 (en) * 2015-07-16 2023-10-04 Case Western Reserve University Plant virus particles for delivery of antimitotic agents
CA3214798A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Pfizer Inc. Cells and method of cell culture
JP2018536404A (ja) 2015-11-09 2018-12-13 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｈｏ細胞において産生したポリペプチドの品質特性を操作する方法
CN108713026B (zh) 2016-01-08 2023-01-06 美国全心医药生技股份有限公司 四价抗psgl-1抗体及其用途
WO2017172907A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Sorrento Therapeutics, Inc. Calicheamicin antibody drug conjugates linking an amidoacetyl group to a sugar moiety on calicheamicin
CA3019753C (en) 2016-04-05 2021-10-26 Pfizer Inc. Cell culture process
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
GB201610512D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
EP3487527A4 (en) 2016-07-21 2020-03-11 Case Western Reserve University PARTICLES OF VEGETABLE OR VIRAL-LIKE PARTICLES
WO2018085658A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Case Western Reserve University Melt processed viral nanoparticle constructs
CN110099682B (zh) 2016-11-14 2023-03-31 杭州多禧生物科技有限公司 偶联连接体，含有此连接体的细胞结合分子-药物偶联物及其制备和应用
US11590183B2 (en) 2017-03-10 2023-02-28 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
WO2018167621A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Pfizer Inc. Tyrosine prototrophy
CA3063359A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
US11672840B2 (en) 2017-05-17 2023-06-13 Case Western Reserve University Anticancer trail-targeted plant virus particles
MX2020001233A (es) 2017-08-03 2020-07-20 Otsuka Pharma Co Ltd Compuesto farmaceutico y metodos de purificacion del mismo.
CN111868223A (zh) 2017-09-15 2020-10-30 百时美施贵宝公司 大规模生产目的多肽过程中的在线生物质电容监测
JP7066837B2 (ja) 2017-10-13 2022-05-13 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｂ細胞成熟抗原結合タンパク質
WO2019084555A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Case Western Reserve University TYMOVIRUS VIRUSES AND VIRAL TYPE PARTICLES USEFUL AS NANOVECTORS FOR IMAGING AND THERAPEUTIC AGENTS
WO2019178489A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Metabolic enzyme activity and disulfide bond reduction during protein production
CN110507824A (zh) * 2018-05-21 2019-11-29 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种抗间皮素抗体及其抗体药物缀合物
EP3858863A1 (en) * 2018-05-30 2021-08-04 AbbVie Stemcentrx LLC Anti-sez6 antibody drug conjugates and methods of use
WO2020069028A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
MX2021005808A (es) 2018-11-20 2021-07-02 Univ Cornell Complejos macrociclicos de radionucleidos alfa-emisores y su uso en radioterapia focalizada de cancer.
WO2020115655A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Pfizer Inc. Cells with reduced inhibitor production and methods of use thereof
MX2021011320A (es) 2019-03-19 2021-12-10 Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron Terapia de combinacion con omomyc y un anticuerpo que se une a pd-1 o a ctla-4 para el tratamiento del cancer.
US11390853B2 (en) 2019-04-26 2022-07-19 Case Western Reserve University Freeze dried viral nanoparticle constructs
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US11896676B2 (en) 2019-08-07 2024-02-13 Case Western Reserve University Targeting cancer cells and tissue using filamentous plant virus particles
EP4069312A4 (en) * 2019-12-04 2024-03-27 The Research Foundation for the State University of New York COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING OFF-TARGET TOXICITY OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATES
MX2023000197A (es) 2020-07-07 2023-02-22 BioNTech SE Arn terapeutico para el cancer positivo para vph.
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
CN112724263B (zh) * 2021-04-02 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 改造抗cd20单克隆抗体以提高其药物疗效的方法及其应用
KR20240046323A (ko) 2021-07-13 2024-04-08 비온테크 에스이 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023148598A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Pfizer Inc. Cysteine prototrophy
WO2024058201A1 (ja) * 2022-09-16 2024-03-21 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット
WO2024089013A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Peptomyc, S.L. Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4771128A (en) * 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5134075A (en) 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JP3179481B2 (ja) 1990-06-27 2001-06-25 プリンストン ユニバーシティ 突然変異体ｐ５３検出用プローブ
CZ282603B6 (cs) 1991-03-06 1997-08-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G Humanizované a chimerické monoklonální protilátky
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5686072A (en) 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5484892A (en) * 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US6310185B1 (en) 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
MX9701075A (es) 1994-08-12 1998-03-31 Myriad Genetics Inc Mutaciones en vivo y polimorfismos en el gen de susceptibilidad al cancer de pecho y ovario enlazado con 17q.
DE69534530T2 (de) 1994-08-12 2006-07-06 Immunomedics, Inc. Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US20020141990A1 (en) 1996-11-01 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Anti-RSV human monoclonal antibodies
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
CA2284665C (en) 1997-03-20 2010-08-17 David Fitzgerald Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to cd-22 bearing cells and tumors
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DK0999853T3 (da) * 1997-06-13 2003-04-22 Genentech Inc Stabiliseret antostofformulering
AT408613B (de) 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
US6183477B1 (en) * 1998-09-04 2001-02-06 Smith & Nephew, Inc. Attachment tool for drill guide
KR100345463B1 (ko) 1998-11-19 2003-01-08 주)녹십자 B형간염바이러스의표면항원프리-s1에대한인간화항체및이의제조방법
JP2000226336A (ja) * 1998-11-30 2000-08-15 Sankyo Co Ltd 免疫グロブリン製剤
WO2000034784A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
EP1194167B1 (en) * 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
AU6558400A (en) * 1999-08-17 2001-03-13 Novo Nordisk A/S Stabilisation of freeze-dried cake
AU7787100A (en) 1999-10-12 2001-04-23 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Improved method for the detection of acid resistant microorganisms in a stool
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
EP2371392B1 (en) 2002-05-02 2015-07-08 Wyeth Holdings LLC Calicheamicin derivative-carrier conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
TWI379693B (en) 2012-12-21
CY2017035I1 (el) 2018-04-04
PT3127553T (pt) 2022-01-24
US8153768B2 (en) 2012-04-10
PL224001B1 (pl) 2016-11-30
ZA200409752B (en) 2010-08-25
ES2545745T3 (es) 2015-09-15
EP3127553A1 (en) 2017-02-08
PL374523A1 (pl) 2005-10-31
US9351986B2 (en) 2016-05-31
KR101125524B1 (ko) 2012-03-22
HK1162926A1 (en) 2012-09-07
WO2003092623A3 (en) 2004-03-18
UA88599C2 (ru) 2009-11-10
EP2371392A1 (en) 2011-10-05
IL164946A (en) 2015-06-30
JP6872376B2 (ja) 2021-05-19
JP2015061875A (ja) 2015-04-02
DK2371392T3 (en) 2015-08-31
FR17C1054I2 (fr) 2019-01-11
RU2004135101A (ru) 2005-06-27
PH12013501158A1 (en) 2015-11-09
NZ573563A (en) 2010-10-29
CN1665532A (zh) 2005-09-07
JP2012051900A (ja) 2012-03-15
BRPI0309868B8 (pt) 2021-05-25
CR20120364A (es) 2012-10-05
NL300903I2 (nl) 2018-02-08
PL413302A1 (pl) 2016-05-23
JP5153057B2 (ja) 2013-02-27
CR7557A (es) 2008-10-03
HUS1700038I1 (hu) 2017-11-28
ZA201003874B (en) 2019-12-18
US20180339058A1 (en) 2018-11-29
SI3127553T1 (sl) 2022-02-28
HK1070825A1 (zh) 2005-06-30
RU2016141576A (ru) 2018-05-03
FR17C1054I1 (pl) 2018-01-12
CY1117973T1 (el) 2017-05-17
PL411824A1 (pl) 2015-08-17
PH12013501159A1 (en) 2015-12-02
RU2422157C2 (ru) 2011-06-27
RU2602878C2 (ru) 2016-11-20
NO2017061I1 (no) 2017-11-21
HUE027590T2 (hu) 2016-11-28
BE2017C049I2 (pl) 2022-08-09
JP5441971B2 (ja) 2014-03-12
SI2371392T1 (sl) 2015-10-30
AU2009202609B2 (en) 2012-07-26
NO20044663L (no) 2005-01-25
TW201231089A (en) 2012-08-01
RU2011108928A (ru) 2012-09-20
PT1507556T (pt) 2016-09-28
BR122019027966B8 (pt) 2021-07-27
CY2017035I2 (el) 2018-04-04
TWI438010B (zh) 2014-05-21
ES2916174T3 (es) 2022-06-28
PL224844B1 (pl) 2017-02-28
TW200404005A (en) 2004-03-16
CR20130390A (es) 2013-11-08
JP2017105801A (ja) 2017-06-15
CY1116634T1 (el) 2017-03-15
PH12013501158B1 (en) 2015-11-09
LT1507556T (lt) 2016-10-10
US8747857B2 (en) 2014-06-10
SG165158A1 (en) 2010-10-28
US20120213804A1 (en) 2012-08-23
CY1124900T1 (el) 2023-01-05
NO20161431A1 (no) 2005-01-25
NO339730B1 (no) 2017-01-23
BR122019027974B1 (pt) 2022-06-14
RU2678818C2 (ru) 2019-02-04
LUC00044I2 (pl) 2018-02-26
LTPA2017036I1 (lt) 2017-11-27
NO344509B1 (no) 2020-01-20
RU2602878C3 (ru) 2021-11-24
EP1507556B1 (en) 2016-07-27
HUE030806T2 (hu) 2017-05-29
IL230659A (en) 2016-02-29
JP2005524700A (ja) 2005-08-18
US8835611B2 (en) 2014-09-16
US20040192900A1 (en) 2004-09-30
JP5756489B2 (ja) 2015-07-29
PL228741B1 (pl) 2018-05-30
AU2003231293A1 (en) 2003-11-17
MXPA04010792A (es) 2005-03-07
CA2871117A1 (en) 2003-11-13
EP1507556A4 (en) 2009-01-07
KR20050006220A (ko) 2005-01-15
SI1507556T1 (sl) 2016-10-28
RU2422157C3 (ru) 2021-04-23
JP2013163678A (ja) 2013-08-22
EP1507556A2 (en) 2005-02-23
PL410218A1 (pl) 2015-03-30
SG10201700289RA (en) 2017-02-27
NZ586071A (en) 2012-02-24
IL164946A0 (en) 2005-12-18
EP2371392B1 (en) 2015-07-08
HUE057124T2 (hu) 2022-04-28
US20040082764A1 (en) 2004-04-29
DK1507556T3 (en) 2016-09-12
LT3127553T (lt) 2022-04-11
CN100482277C (zh) 2009-04-29
PL410219A1 (pl) 2015-03-30
CA2483552A1 (en) 2003-11-13
PH12013501159B1 (en) 2015-12-02
PT2371392E (pt) 2015-10-07
RU2016141576A3 (pl) 2018-05-03
DK3127553T3 (da) 2022-01-31
HUE057124T4 (hu) 2022-02-28
ES2593304T3 (es) 2016-12-07
BR0309868A (pt) 2005-10-18
US20160303252A1 (en) 2016-10-20
KR20110050753A (ko) 2011-05-16
IL230659A0 (en) 2014-03-31
WO2003092623A2 (en) 2003-11-13
BR122019027966B1 (pt) 2020-11-17
PL222725B1 (pl) 2016-08-31
ECSP045445A (es) 2005-01-28
US20140235835A1 (en) 2014-08-21
AU2009202609A1 (en) 2009-07-16
LTC2371392I2 (lt) 2019-03-25
LUC00044I1 (pl) 2017-11-03
EP3127553B1 (en) 2021-12-01
SG187991A1 (en) 2013-03-28
BRPI0309868B1 (pt) 2020-04-28
KR101062628B1 (ko) 2011-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2678818C2 (ru) Конъюгаты &#34;производное калихеамицина-носитель&#34;
AU2015246156B2 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates
AU2012244218C1 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates