ES2916174T3 - Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina - Google Patents

Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina Download PDF

Info

Publication number
ES2916174T3
ES2916174T3 ES16180729T ES16180729T ES2916174T3 ES 2916174 T3 ES2916174 T3 ES 2916174T3 ES 16180729 T ES16180729 T ES 16180729T ES 16180729 T ES16180729 T ES 16180729T ES 2916174 T3 ES2916174 T3 ES 2916174T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
cmc
cdr
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES16180729T
Other languages
English (en)
Inventor
Arthur Kunz
Justin Keith Moran
Joseph Thomas Rubino
Neera Jain
Eugene Joseph Vidunas
John Mclean Simpson
Paul David Robbins
Nishith Merchant
John Francis Dijoseph
Mark Edward Ruppen
Nitin Krishnaji Damle
Andrew George Popplewell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth Holdings LLC
Original Assignee
Wyeth Holdings LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29401497&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2916174(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Wyeth Holdings LLC filed Critical Wyeth Holdings LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2916174T3 publication Critical patent/ES2916174T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

Una composición que comprende un conjugado de fármaco, en el que dicho conjugado de fármaco comprende derivados de caliqueamicina y un anticuerpo dirigido contra CD22 y tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, los restos 50-66 de la SEQ ID NO: 27 para CDR- H2, la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3, la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a los procedimientos para la producción de conjugados de fármaco/transportador citotóxico monomérico (los "conjugados") con mayor carga de fármaco y fracción baja de conjugado sustancialmente reducida (LCF). En particular, la invención se refiere a conjugados de caliqueamicina con anticuerpos monoméricos dirigidos contra CD22. La invención se refiere también a los conjugados de la invención, y tal como se desvela, a los procedimientos de purificación de los conjugados. La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados, y tal como se desvela, a los usos de los conjugados.
Antecedentes de la invención
Los conjugados de fármacos desarrollados para farmacoterapia sistémica son agentes citotóxicos específicos de diana. El concepto implica el acoplamiento de un agente terapéutico a una molécula transportadora con especificidad para una población de células diana definida. Los anticuerpos con elevada afinidad para los antígenos son una elección natural como restos directores. Con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales de elevada afinidad, las perspectivas de los agentes terapéuticos dirigidos contra anticuerpos se han vuelto prometedoras. Las sustancias tóxicas que se han conjugado con anticuerpos monoclonales incluyen toxinas, fármacos citotóxicos de bajo peso molecular, modificadores de la respuesta biológica, y radionucleidos. Los conjugados de anticuerpo-toxina se denominan frecuentemente inmunotoxinas, mientras que los inmunoconjugados que consisten en anticuerpos y fármacos de bajo peso molecular tales como metotrexato y adraimicina se denominan quimioinmunoconjugados. Los inmunomoduladores contienen modificadores de la respuesta biológica conocidos por tener funciones reguladoras como linfoquinas, factores de crecimiento, y factor del veneno de la cobra activador del complemento (CVF). Los radioinmunoconjugados consisten en isótopos radioactivos que se pueden usar como agentes terapéuticos para destruir células por su radiación o utilizarse para la formación de imágenes. Se espera que la administración específica mediada por anticuerpos de fármacos citotóxicos a células tumorales no solo aumente su eficacia antitumoral, sino que evite también la captación no dirigida por tejidos normales, aumentando de esta manera sus índices terapéuticos.
La presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo como vehículo director y que tienen especificidad para determinantes antigénicos sobre la superficie de células malignas conjugadas a un fármaco citotóxico. La invención se refiere a conjugados de fármaco-anticuerpo citotóxicos, en el que el anticuerpo tiene especificidad para determinantes antigénicos en neoplasias de linfocitos B, trastornos linfoproliferativos y enfermedades inflamatorias crónicas. La presente divulgación también se refiere a procedimientos para producir inmunoconjugados y a su(s) uso(s) terapéutico(s).
Se han homologado numerosos agentes terapéuticos basados en anticuerpos para tratar una variedad de enfermedades que incluyen el cáncer y la artritis reumatoide para uso clínico o están en ensayos clínicos para una variedad de neoplasias incluyendo neoplasias de linfocitos B tales como linfoma no de Hodgkin. Uno de dichos agentes terapéuticos basados en anticuerpos es rituximab (Rituxan™), un anticuerpo y1 (región mYlV) humano quimérico no marcado, que es específico del antígeno superficial celular CD20, que se expresa en linfocitos B. Estos agentes terapéuticos basados en anticuerpos se basan tanto en la citotoxicidad mediada por el complemento (CDCC) como en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra los linfocitos B, o en el uso de radionucleidos, tales como 131I o 90Y, que se han asociado a problemas de preparación y uso por los especialistas clínicos y pacientes. También se conoce un IgG dirigido contra CD22 o un conjugado de Fab' a una inmunotoxina para tratar el linfoma B humano, Ghetie, M.A., (1991) Cancer Research, 51, N° 21, 5876 -5880. El documento WO96/40261 desvela adicionalmente un procedimiento para preparar conjugados de derivado de caliqueamicina monomérico/vehículo con mayor carga de fármaco/rendimiento y una agregación reducida. En consecuencia, existe necesidad de generación de inmunoconjugados que pueda superar los inconvenientes de los agentes terapéuticos basados en anticuerpos actuales para tratar una variedad de neoplasias que incluyen neoplasias hematopoyéticas del tipo linfoma no de Hodgkin (NHL), que se pueden producir de manera fácil y eficaz, y que se pueden usar repetidamente sin inducir una respuesta inmune.
Los inmunoconjugados comprenden un miembro de la potente familia de agentes antibacterianos y antitumorales, conocidos conjuntamente como las caliqueamicinas o el complejo LL-E33288, (véase Patente de los Estados Unidos N° 4.970.198 (1990)), que se desarrollaron para su uso en el tratamiento de mielomas. La más potente de las caliqueamicinas se designa y-i, a la que se hace referencia sencillamente en el presente documento como gamma. Estos compuestos contienen un trisulfuro de metilo que se puede hacer reaccionar con los tioles adecuados para formar disulfuros, introduciendo en el mismo momento un grupo funcional tal como una hidrazida u otro grupo funcional que sea útil en la unión de un derivado de caliqueamicina a transportador (véase la patente de los Estados Unidos n° 5.053.394). El uso de conjugados monoméricos de derivados/transportadores de caliqueamicina en el desarrollo de tratamientos para una amplia variedad de cánceres ha estado limitado por la disponibilidad de agentes de direccionamiento específicos (transportadores) así como por las metodologías de conjugación que dan como resultado la formación de agregados de proteínas cuando aumenta la cantidad del derivado de caliqueamicina que se conjuga al vehículo (es decir, la carga del fármaco). Debido a que mayores cargas del fármaco aumentan la potencia inherente del conjugado, es deseable tener mucho fármaco cargado en el transportador que sea consistente con la retención de la afinidad de la proteína transportadora. La presencia de la proteína agregada, que puede ser no específicamente tóxica e inmunógena, y por tanto debe eliminarse de las aplicaciones terapéuticas, hace más difícil escalar el procedimiento para la producción de estos conjugados y disminuye el rendimiento de los productos. La cantidad de caliqueamicina cargada en la proteína transportadora (la carga de fármaco), la cantidad de agregado que se forma en la reacción de conjugación, y el rendimiento de conjugado monomérico purificado final que se puede obtener están relacionados entre sí. Debe llegarse por tanto a un compromiso entre la mayor carga del fármaco y el rendimiento final del monómero ajustando la cantidad del derivado reactivo de caliqueamicina que se añade a la reacción de conjugación.
La tendencia de los conjugados de fármacos citotóxicos, especialmente de los conjugados de caliqueamicina a agregarse es especialmente problemática cuando se llevan a cabo las reacciones de conjugación con los engarces descritos en la patente de los Estados Unidos N° 5.877.296 y en la patente de los Estados Unidos N° 5.773.001. En este caso, un gran porcentaje de los conjugados producidos están en forma agregada, y es muy difícil purificar los conjugados realizados mediante estos procedimientos originales (procedimiento CMA) para su uso terapéutico. Para algunas proteínas transportadoras, los conjugados con incluso modestas cargas son virtualmente imposibles de preparar excepto a pequeña escala. En consecuencia, existe una necesidad crítica de mejorar los procedimientos para conjugar fármacos citotóxicos, tales como caliqueamicinas, para transportadores que minimicen la cantidad de agregación y permitan por tanto una carga tan alta como sea posible con un rendimiento razonable del producto.
Anteriormente, se han descrito procedimientos de conjugación para preparar derivados/transportadores de caliqueamicina monomérica con mayor carga/rendimiento del fármaco y agregación disminuida (véase la patente de los Estados Unidos N° 5.712.374 y la patente de los Estados Unidos N° 5.714.586). Aunque estos procedimientos dan como resultado preparaciones de conjugados con un contenido de agregados sustancialmente reducido, se ha descubierto que estos conjugados producidos contienen altos niveles indeseables (45-65 %, HPLC Área %) de una fracción baja de conjugado (LCF), una fracción que consiste en su mayoría en anticuerpo no conjugado. La presencia de la LCF en el conjugado da como resultado un uso ineficaz del anticuerpo, que no contiene el fármaco citotóxico. Esto puede competir también con el conjugado del transportador de caliqueamicina a la diana y reducir potencialmente la direccionabilidad de este último dando como resultado una eficacia reducida del fármaco citotóxico. Por tanto, es deseable un procedimiento de conjugación mejorado que daría como resultado niveles significativamente bajos de LCF y que tenga niveles aceptables de agregación, sin alterar significativamente las propiedades físicas del conjugado.
Sumario de la invención
La presente invención es tal como se indica en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende un conjugado de fármaco, en el que dicho conjugado de fármaco comprende derivados de caliqueamicina y un anticuerpo y tiene la fórmula:
Figure imgf000003_0001
en la que el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, los restos 50-66 de la SEQ ID NO: 27 para CDR-H2, la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3, la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3. De acuerdo con la invención, n puede ser (i) 1, 2, 3, 4, 5 o (ii) 3 a 9 o (iii) en el que la carga de fármaco es 4-10 % por fármaco citotóxico, adicionalmente la composición puede ser menos del 10 % en peso de anticuerpo no conjugado. De acuerdo con el anterior aspecto de la invención, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición de la invención y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, la composición farmacéutica puede estar adicionalmente liofilizada.
La presente divulgación se refiere a procedimientos para la producción de conjugados de derivado de fármaco citotóxico/transportador monomérico (los "conjugados") con mayor carga de fármaco y fracción baja de conjugado sustancialmente reducida (LCF). En particular, la divulgación se refiere a la producción de conjugados de derivadotransportador de caliqueamicina monomérica, la invención se refiere a los conjugados, a composiciones, y tal como se desvela, a un procedimiento de purificación de los conjugados, y al uso de los conjugados. Más particularmente, la divulgación se refiere a procedimientos para producir el anticuerpo dirigido contra CD22 del derivado monomérico de caliqueamicina (CMC-544).
Se describe en el presente documento un procedimiento de conjugación mejorado para la producción de los conjugados que da como resultado niveles significativamente menores de la LCF (por debajo del 10 por ciento) sin ninguna alteración significativa de las propiedades físicas o químicas. La divulgación proporciona una mejora adicional del procedimiento de conjugación que da como resultado no solo una reducción significativa en los niveles de la LCF, sino que también dé como resultado una reducción significativa en la agregación de los procedimientos anteriormente descritos, y produce una carga del fármaco sustancialmente mejorada. Los conjugados de la presente invención tienen la fórmula:
Pr(-X-W)m
en la que:
Pr es un transportador proteínico,
X es un engarce que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que pueda reaccionar con un transportador proteínico, W es un fármaco citotóxico;
m es la carga promedio de un producto de conjugación purificado, de tal manera que el fármaco citotóxico constituye un 7 - 8 % del conjugado en peso; y
(-X-W)m es un derivado de fármaco citotóxico.
Los conjugados de la presente invención, en una realización, se generan según el procedimiento de la invención que comprende las etapas de: (1) añadir el fármaco citotóxico derivado del transportador proteínico en el que el derivado de fármaco citotóxico es el 4,5 - 11 % en peso del transportador proteínico; (2) incubar el derivado de fármaco citotóxico y un transportador proteínico en una solución tamponada no nucleófila, compatible con proteínas, que tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a 9 para producir un conjugado de fármaco/transportador citotóxico monomérico, en el que la solución comprende además (a) un cosolvente orgánico, y (b) un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico C6-C18 o su sal, y en el que la incubación se lleva a cabo a una temperatura que varía entre aproximadamente 30°C a aproximadamente 35°C durante un periodo de tiempo que varía entre aproximadamente 15 minutos a 24 horas; y (3) someter el conjugado producido en la etapa (2) a un procedimiento de separación cromatográfica para separar los conjugados monoméricos de derivado de fármaco citotóxico / transportadores proteínicos con una carga en el intervalo de 4 -10 % en peso de fármaco citotóxico y con una fracción conjugada baja (LCF) por debajo del 10 por ciento de un transportador proteínico no conjugado, derivado de fármaco citotóxico, y los conjugados agregados.
En una divulgación, el transportador proteínico del conjugado se selecciona a partir de un grupo que consiste en hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, miméticos de anticuerpos, y sus homólogos diseñados mediante ingeniería genética o enzimáticamente.
En una realización, el transportador proteínico es un anticuerpo. En una realización preferida, el anticuerpo se selecciona entre un grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab y un fragmento F(ab)2.
En otra realización, el anticuerpo humanizado se dirige contra el antígeno superficial celular CD22.
En una realización preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR, y comprende una región variable de la cadena ligera 5/44-gL1 (SEC ID N°:19), y una región variable de la cadena pesada 5/44-gH7 (SEC ID N°:27).
En otra realización preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28.
En otra realización más preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°:30.
En otra realización preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 30.
En otra realización, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que es una variante del anticuerpo obtenida mediante un protocolo de maduración por afinidad y tiene una especificidad aumentada para CD22 humano.
En otra divulgación, el fármaco citotóxico usado para generar el conjugado monomérico de fármaco citotóxico / transportador de la presente invención es cualquiera de un inhibidor de polimerización de la tubulina, un agente alquilante que se une y perturba el ADN, un inhibidor de la síntesis de proteínas, o un inhibidor de las tirosina quinasas.
En una divulgación, el fármaco citotóxico se selecciona entre las caliqueamicinas, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorubicina, doxorrubicina, epirubicina, esperamicinas, actinomicina, autramicina, azaserinas, bleomicinas, tamoxifeno, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, y maitansinoides.
En una realización preferida, el fármaco citotóxico es caliqueamicina. En una realización especialmente preferida, la caliqueamicina es gamma caliqueamicina o un derivado de N-acetil gamma caliqueamicina.
En otro aspecto más, el fármaco citotóxico está funcionalizado con 3 -mercapto-3-metil butanoil hidrazida y conjugado a un transportador proteínico mediante un engarce hidrolizable que puede liberar el fármaco citotóxico a partir del conjugado tras la unión y entrada a las células dianas.
En una realización preferida de este aspecto, el engarce hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). En otra divulgación más, se usa ácido octanoico o su sal, o ácido decanoico o su sal como aditivo durante el procedimiento de conjugación para disminuir la agregación y aumentar la carga del fármaco.
En otra divulgación más, los conjugados de la invención se purifican mediante un procedimiento de separación cromatográfica.
En una divulgación, el procedimiento de separación cromatográfica usado para separar el conjugado del derivadotransportador del fármaco monomérico es la cromatografía de exclusión molecular (SEC).
En otra divulgación, el procedimiento de separación cromatográfica usado para separar el conjugado del derivadotransportador del fármaco monomérico es la cromatografía de HPLC, FPLC o Sephacryl S-200.
En una divulgación preferida, el procedimiento de separación cromatográfica usado para separar el conjugado del derivado-transportador del fármaco monomérico es la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). En una divulgación particularmente preferida, se lleva a cabo la HIC usando medio cromatográfico Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, medio cromatográfico Butyl Sepharose 4 Fast Flow, medio cromatográfico Octyl Sepharose 4 Fast Flow, medio cromatográfico Toyopearl Ether-650M, medio Macro-Prep methyl HIC o medio Macro-Prep t-Butyl HIC. En una realización más particularmente preferida, se lleva a cabo la HIC usando medio cromatográfico Butyl Sepharose 4 Fast Flow.
En otro aspecto, la invención se dirige a un conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico/transportador producido mediante el procedimiento de la divulgación. En una realización preferida de este aspecto, el fármaco citotóxico usado es caliqueamicina y el transportados utilizado es un anticuerpo.
En otra realización preferida, el anticuerpo se selecciona entre un grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab y un fragmento F(ab)2.
En un aspecto más particularmente preferido, se utiliza un anticuerpo humanizado dirigido contra el antígeno superficial celular CD22.
En una realización, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR, y comprende una región variable de la cadena ligera 5/44-gL1 (SEC ID N°:19), y una región variable de la cadena pesada 5/44-gH7 (SEC ID N°:27).
En otra realización, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28.
En una realización preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 30.
En otra realización preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 30.
En otra realización adicional más, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que es una variante del anticuerpo obtenida mediante un protocolo de maduración por afinidad que tiene una especificidad aumentada para CD22 humano.
En una realización preferida, la caliqueamicina es gamma caliqueamicina o una N-acetil gamma caliqueamicina. En una realización, el derivado de caliqueamicina está funcionalizado con 3-mercapto-3-metil butanoil hidrazida. En otra realización, el engarce utilizado para conjugar el fármaco al transportador es un engarce hidrolizable que puede liberar el fármaco citotóxico del conjugado tras la unión y entrada en células diana. En una realización preferida, el engarce hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut).
Otro aspecto de la invención se dirige a un conjugado de derivado monomérico de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD22 que tiene la fórmula, Pr(-X-S-S-W)m en la que: Pr es un anticuerpo dirigido contra CD22; X es un engarce hidrolizable que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que puede reaccionar con un anticuerpo; W es un radical de caliqueamicina; m es la carga promedio de un producto de conjugación purificado, de tal manera que la caliqueamicina constituye un 4 - 10 % del conjugado en peso; y (-X-S-S-W)m es un derivado de caliqueamicina generado mediante el procedimiento de la divulgación.
En una realización de este aspecto, el anticuerpo se selecciona entre un grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab y un fragmento F(ab)2.
En una divulgación preferida, el anticuerpo es un anticuerpo dirigido contra CD22 que tiene especificidad para CD22 humano, y comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como H1 en la Figura 1 (SEC ID N°:1) para CDR-H1, como H2 en la Figura 1 (SEC ID N°:2) o H2' (SEC ID N°:13) o H2" (SEC ID N°:15) o H2"' (SEC ID N°:16) para CDR-H2, o como H3 en la Figura 1 (SEC ID N°:3) para CDR-H3, y comprende una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como L1 en la Figura 1 (SEC ID N°:4) para CDR-L1, como L2 en la Figura 1 (SEC ID N°:5) para CDR-L2, o como L3 en la Figura 1 (SEC ID N°:6) para CDR-H3.
En otra divulgación preferida, el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos al menos una de las secuencias proporcionadas en la SEC ID N°:1 para CDR-H1, SEC ID N°:2 o SEC ID N°:13 o SEC ID N°:15 o SEC ID N°:16 para CDR-H2, o la SEC ID N°:3 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas en la SEC iD N°:4 para CDR-L1, la SeC ID N°:5 para CDR-L2, o la SEC ID N°:6 para CDR-L3.
En otra divulgación más preferida, el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende la SEC ID N°:1 para CDR-H1, la SEC ID N°: 2 o la SEC ID NO:13 o la SEC ID N°:15 o la SEC ID N°:16 para CDR-H2, la SEC ID N°:3 para CDR-H3, la SEC ID N°:4 para CDR-L1, la SEC ID N°:5 para CDR-L2, y la SEC ID N°:6 para CDR-L3.
En otra realización, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo dirigido contra CD22 injertado con CDR y comprende un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR donantes no humanas.
En otra divulgación, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 tiene un marco aceptor humano en el que las regiones del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo se basan en una secuencia consenso del subgrupo I humano y comprenden restos donantes no humanos en las posiciones 1, 28, 48, 71 y 93. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende además restos no humanos en las posiciones 67 y 69.
En una divulgación preferida, el anticuerpo humanizado injertado con la CDR comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una región marco aceptora humana basada en una secuencia consenso del subgrupo I humano y que comprende además restos donantes no humanos en las posiciones 2, 4, 37, 38, 45 y 60. En otra realización, el anticuerpo injertado con la CDR comprende además un resto donante no humano en la posición 3. En otra realización más, el anticuerpo injertado con la CDR comprende una región variable de la cadena ligera 5/44-gL1 (SEQ ID NO:19) y una región variable de la cadena pesada 5/44-gH7 (SEC ID N°:27).
En otra realización, el anticuerpo injertado con la CDR comprende una cadena ligera que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°:30. En otra realización adicional, el anticuerpo injertado con la CDR comprende una cadena ligera que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 30.
En una divulgación, el anticuerpo injertado dirigido contra CD22 es una variante del anticuerpo obtenida mediante un protocolo de maduración por afinidad y tiene una especificidad aumentada para CD22 humano.
En otra divulgación, el anticuerpo dirigido contra CD22 es un anticuerpo quimérico que comprende las secuencias de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal que se muestra en la SEC lD N°:7 y en la SEC lD N°:8, respectivamente.
En otra divulgación más, el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende una CDR híbrida con una secuencia de una CDR donante truncada en la que la porción desaparecida de la CDR donante está sustituida por una secuencia diferente y forma una CDR funcional.
En una realización especialmente preferida, el derivado del fármaco citotóxico es tanto una gamma caliqueamicina como un derivado de N-acetil gamma caliqueamicina.
En otro aspecto, la divulgación se dirige a un procedimiento para la preparación de una composición liofilizada estable de un conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / transportador. En una divulgación preferida, la composición liofilizada estable del conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / transportador se prepara (a) disolviendo el conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / transportador a una concentración final de 0,5 a 2 mg/ml en una solución que comprende un crioprotector a una concentración de 1,5 %-5 % en peso, un agente de volumen polimérico a una concentración de 0,5-1,5 % en peso, electrolitos a una concentración de 0,01 M a 0,1 M, un agente facilitador de la solubilidad a una concentración de 0,005-0,05 % en peso, agente tamponante a una concentración de 5-50 mM de tal manera que el pH final de la solución es de 7,8­ 8,2, y agua; (b) dispensando la solución anterior en viales a una temperatura de 5°C a 10°C; (c) congelando la solución a una temperatura de congelación de -35°C a -50°C; (d) sometiendo la solución congelada a una etapa de criodesecación inicial a una presión de secado primaria de 20 a 80 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de -10°C a -40°C durante 24 a 78 horas; y (e) sometiendo el producto criodesecado de la etapa (d) a una etapa de secado secundaria a una presión de secado de 20 a 80 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de 10°C a 35°C durante 15 a 30 horas.
En una divulgación, el crioprotector usado en la liofilización del conjugado de fármaco citotóxico / transportador se selecciona entre alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietilenglicol, ácido aldónico, ácido urónico, ácido aldárico, aldosas, cetosas, aminoazúcares, alditoles, inositoles, gliceraldehídos, arabinosa, lixosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, glucosa, hexosa, idosa, manosa, talosa, heptosa, glucosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, lactosa, manitol, metil a-glucopiranósido, maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbosa, ácido glucárico, eritrosa, treosa, arabinosa alosa, altrosa, gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucourónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido galacturónico, ácido mannurónico, glucosamina, galactosamina, sacarosa, trehalosa, ácido neuramínico, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos, levano, fucoidano, carragenato, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pululano, glucógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, pustulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma xantana, almidón, sacarosa, glucosa, lactosa, trehalosa, etilenglicol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol, y pentaeritritol.
En una divulgación preferida, el crioprotector es sacarosa, que está presente a una concentración de 1,5 % en peso. En una divulgación, el agente de volumen polimérico usado durante el procedimiento de liofilización se selecciona entre dextrano 40 o hidroxietil almidón 40, y está a una concentración de 0,9 % en peso.
En otra divulgación, el electrolito usado en la solución de liofilización es cloruro de sodio, que está presente a una concentración de 0,05 M.
En una divulgación preferida se usa un agente facilitador de la solubilidad durante el procedimiento de liofilización. Preferentemente, este agente facilitador de la solubilidad es un tensioactivo. En una divulgación particularmente preferida, el tensioactivo es polisorbato 80, que está presente a una concentración de 0,01 % en peso.
En una divulgación, el agente tamponante utilizado es trometamina, que está presente a una concentración de 0,02 M. Es preferible que el pH de la solución sea 8,0 al comienzo del procedimiento de liofilización. La solución que contiene el conjugado de fármaco/transportador citotóxico se dispensa en viales a una temperatura de 50 antes del comienzo del procedimiento.
En una divulgación preferida, la solución en los viales se congela a una temperatura de -45°C; la solución congelada se somete a una etapa de criodesecación inicial a una presión de secado primaria de 60 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de -30°C durante 60 horas; y el producto criodesecado se somete a una etapa de secado secundaria a una presión de secado de 60 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de 25°C durante 24 horas.
Otro aspecto de la invención se dirige a una composición que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un conjugado de derivado/transportador citotóxico monomérico preparado mediante un procedimiento de la divulgación. En una divulgación, el transportador en el conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / transportador es un transportador proteínico seleccionado entre hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos y miméticos de anticuerpos.
En una realización preferida, el transportador proteínico es un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
En una realización preferida, el anticuerpo humanizado se dirige contra el antígeno superficial celular CD22.
En una divulgación especialmente preferida, el anticuerpo dirigido contra CD22 tiene especificidad para CD22 humano, y comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una c Dr que tiene al menos una de las secuencias proporcionada como H1 en la Figura 1 (SEC lD NO:1) para CDR-H1, como H2 en la Figura 1 (SEC ID N°:2) o H2' (SEC ID N°:13) o H2" (SEC ID N°:15) o H2"' (SEC ID N°:16) para CDR-H2, o como H3 en la Figura 1 (SEC ID N°:3) para CDR-H3, y comprende una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como L1 en la Figura 1 (SEC ID N°:4) para CDR-L1, como L2 en la Figura 1 (SEC ID N°:5) para CDR-L2, o como L3 en la Figura 1 (SEC ID N°:6) para CDR-H3.
En otra divulgación preferida, el anticuerpo dirigido contra CD22 tiene una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos al menos una de las secuencias proporcionadas en la SEC ID N°:1 para CDR-H1, SEC ID N°:2 o SEC ID N°:13 o SEC ID N°:15 o SEC ID N°:16 para CDR-H2, o SEC ID N°:3 para CDR-H3; y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas en la SEC ID N°:4 para CDR-L1, la SEC ID N°:5 para CDR-L2, o la SEC ID N°:6 para CDR-L3.
En otra divulgación preferida, el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende la SEC ID N°:1 para CDR-H1, la SEC ID N°: 2 o la SEC ID N°:13 o la SEC ID N°:15 o la SEC ID N°: 16 por CDR-H2, la SEC ID N°:3 para CDR-H3; la SEC ID N°:4 para CDR-L1, la SEC ID N°:5 para CDR-L2, y la SEC ID N°:6 para CDR-L3.
En una realización especialmente preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 injertado con CDR y comprende una región variable de la cadena ligera 5/44-gL1 (SEC ID N° 19), y una región variable de la cadena pesada 5/44-gH7 (SEC ID N°:27).
En otra realización particularmente preferida, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 es un anticuerpo injertado con CDR que tiene especificidad para CD22 humano y comprende una cadena ligera que tiene una secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID N°: 30.
En una divulgación, el anticuerpo injertado con CDR es una variante de anticuerpo que tiene especificidad aumentada para CD22 humano, y el anticuerpo se obtiene mediante un protocolo de maduración por afinidad.
En una realización, el fármaco citotóxico monomérico es caliqueamicina y se selecciona preferentemente entre gamma caliqueamicina o N-acetil caliqueamicina.
En una divulgación, la composición puede contener opcionalmente un agente bioactivo adicional. Dicho agente bioactivo puede ser un fármaco citotóxico, un factor de crecimiento o una hormona.
Otra divulgación más se dirige a un procedimiento para tratar un sujeto con un trastorno proliferativo administrando al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de la invención. La composición se puede administrar por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramedular, por vía intratecal, transdérmica, transcutánea, intranasal, tópica, entérica, intravaginal, sublingual o rectal. En una divulgación preferida, la composición de la invención se administra por vía intravenosa.
En una divulgación, la composición se administra a un sujeto humano que padece un trastorno proliferativo tal como cáncer. En una divulgación preferida, el cáncer es una neoplasia de linfocitos B. La neoplasia de linfocitos B puede ser una leucemia o linfoma que expresa el antígeno superficial celular CD22.
En otra divulgación adicional, el cáncer es un carcinoma o un sarcoma.
Otro aspecto de la presente divulgación se dirige a un procedimiento para tratar una neoplasia de linfocitos B administrando a un paciente con dicha neoplasia una composición terapéuticamente eficaz que comprende un conjugado de un anticuerpo dirigido contra CD22 con un fármaco citotóxico de la invención. En una divulgación preferida, la neoplasia de linfocitos B es un linfoma, particularmente linfoma no de Hodgkin.
En una divulgación el fármaco citotóxico utilizado para preparar los conjugados de la presente invención se selecciona entre el grupo que consiste en caliqueamicinas, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorubicina, doxorrubicina, epirubicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, tamoxifeno, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, maitansinoides, y esperamicinas.
En una realización preferida, el fármaco citotóxico es gamma caliqueamicina o N-acetil caliqueamicina.
En otra divulgación, el tratamiento comprende administrar el conjugado del fármaco citotóxico de la invención con uno o más agentes bioactivos seleccionados entre anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas, antihormonas, xantinas, interleuquinas, interferones, y fármacos citotóxicos.
En una divulgación preferida, el agente bioactivo es un anticuerpo, y se dirige contra un antígeno superficial celular expresado en neoplasias de linfocitos B. En una realización preferida adicional, el anticuerpo dirigido contra los antígenos superficiales celulares expresados en neoplasias de linfocitos B se selecciona entre un grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra CD19, CD20 y CD33. Dichos anticuerpos incluyen el anticuerpo dirigido contra CD20, rituximab (Rituxan™).
En otra divulgación, los agentes bioactivos son citoquinas o factores de crecimiento e incluyen, pero sin limitación, interleuquina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF y G-CSF.
En otra divulgación, los agentes bioactivos son hormonas e incluyen estrógenos, andrógenos, progestinas, y corticoesteroides.
En otra divulgación adicional, el agente bioactivo es un fármaco citotóxico seleccionado entre doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carrubicina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, adriamicina, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, metotrexato de procarbazina, fluorouracilos, etopósido, taxol, análogos de taxol, y mitomicina.
En una divulgación preferida, la composición terapéuticamente eficaz del conjugado de fármaco citotóxico / anticuerpo dirigido contra CD22 se administra junto con una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento, en el que la combinación de agentes citotóxicos se selecciona entre: CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, y procarbazina); CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, y prednisona); m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, y leucovorina); ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina); ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, citarabina, bleomicina, y vincristina); MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina, y leucovorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina); ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina) alternando con ABV (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, y vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina) alternando con ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina), ChlVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina, y prednisona); lMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, y etopósido); MlME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, y etopósido); DHAP (dexametasona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino); ESHAP (etopósido, metilprednisolona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino); CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona, y bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, y prednisona); y CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona).
En una divulgación preferida, la composición del conjugado de fármaco citotóxico / anticuerpo dirigido contra CD22 terapéuticamente eficaz se administra antes de la administración de las una o más combinaciones anteriores de fármacos citotóxicos. En otra realización preferida, la composición terapéuticamente eficaz del conjugado de fármaco citotóxico / anticuerpo dirigido contra CD22 se administra posteriormente a la administración de una o más de las anteriores combinaciones de fármacos citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento.
Otro aspecto de la divulgación se dirige a un procedimiento para tratar linfomas agresivos que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una composición terapéuticamente eficaz de un conjugado monomérico de un derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD22 con uno o más agentes bioactivos. Otro aspecto más de la presente divulgación se dirige al uso de la composición de la invención en el tratamiento de un sujeto con un trastorno proliferativo tal como cáncer. En particular, el cáncer es una neoplasia de linfocitos B que expresa en antígeno CD22 sobre la superficie celular. En particular, la neoplasia de linfocitos B es tanto una leucemia como un linfoma. En una realización, el cáncer es un carcinoma o una leucemia.
En una divulgación, una dosis terapéuticamente eficaz de la administración se administra por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramedular, intratecal, transdérmica, transcutánea, intranasal, tópica, entérica, intravaginal, sublingual o rectal.
En una divulgación preferida, la dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención se administra por vía intravenosa.
Otro aspecto de la divulgación se dirige al uso de un conjugado monomérico de un derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD22 de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con una neoplasia de linfocitos B tal como linfoma no de Hodgkin. En una realización, el conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 de la presente invención se administra con uno o más agentes bioactivos.
En una divulgación, los agentes bioselectivos se seleccionan entre un grupo que consiste en anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas, antihormonas, xantinas, interleuquinas, interferones, y fármacos citotóxicos. En una divulgación preferida, el agente bioactivo es un anticuerpo dirigido contra un antígeno superficial celular expresado en neoplasias de linfocitos B, tales como anticuerpos dirigidos contra CD19, CD20 y CD33. En una realización preferida, el anticuerpo dirigido contra CD20 es rituximab (Rituxan™).
En otra divulgación, los agentes bioactivos incluyen citoquinas o factores de crecimiento tales como interleuquina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF y G-CSF u hormonas, que incluyen estrógenos, andrógenos, progestinas, y corticoesteroides.
En otra divulgación, el agente bioactivo es un fármaco citotóxico seleccionado entre doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carrubicina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, adriamicina, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato, fluorouracilos, etopósido, taxol, análogos de taxol, y mitomicina.
En una divulgación preferida, la dosis terapéutica eficaz del conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 se administra junto con una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento, en el que la combinación de agentes citotóxicos se selecciona entre: CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, y procarbazina); CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, y prednisona); m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, y leucovorina); ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina); ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, citarabina, bleomicina, y vincristina); MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina, y leucovorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina); ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona y procarbazina) alternando con ABV (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, y vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina) alternando con ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina); ChIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina, y prednisona); lMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, y etopósido); MlME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, y etopósido); DHAP (dexametasona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino); ESHAP (etopósido, metilprednisolona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino); CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona, y bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, y prednisona); CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona), ESHOP (etopósido, metilprednisolona, citarabina a dosis elevada, vincristina y cisplatino); EPOCH (etopósido, vincristina, y doxorubicina durante 96 horas con dosis de bolos de ciclofosfamida y prednisona oral), ICE (ifosfamida, ciclofosfamida, y etopósido), CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona, y bleomicina), CHOP-B (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, y bleomicina), CEPP-B (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, y bleomicina), y P/DOCE (epirubicina o doxorubicina, vincristina, ciclofosfamida, y prednisona).
En una divulgación preferida, el conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 se administra antes de la administración de una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento.
En otra divulgación preferida, la dosis terapéutica eficaz del conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 se administra posteriormente a la administración de una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento.
En otra divulgación más preferida, la dosis terapéutica eficaz del conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 se administra junto con un anticuerpo dirigido contra un antígeno superficial celular en neoplasias de linfocitos B, y comprende opcionalmente una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento.
En otro aspecto, la divulgación se dirige al uso de un conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticuerpo dirigido contra CD2 de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo. Se puede usar dicho medicamento para tratar trastornos proliferativos de linfocitos B solos o en combinación con otros agentes bioactivos.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44 (SEC ID Nos:1 a 6).
La Figura 2 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO:52 y 53) y las proteínas (SEQ ID NO:7) del dominio variable de la cadena ligera (Vl) del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44.
La Figura 3 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO:54 y 55) y proteína (SEQ ID NO:8) del dominio variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44.
La Figura 4 muestra la estrategia para la eliminación del sitio de glicosilación y la lisina reactiva en CDR-H2 (SEQ ID NO:9-12y 14).
La Figura 5 muestra el diseño del injerto para la secuencia de la cadena ligera 5/44 (SEQ ID NO:7). DPK-9 es la secuencia marco aceptora de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 17). Las líneas verticales indican las diferencias entre los restos de ratón y humanos. Las secuencias subrayadas indican los restos donantes que se han retenido en el injerto. Las CDR se indican en letras negritas cursivas (no se muestran para DPK-9). El injerto gL1 (SEQ ID NO: 19) tiene 6 restos marco donantes, gL2 (SEQ ID NO:20) tiene 7.
La Figura 6 muestra el diseño del injerto para la secuencia de la cadena pesada 5/44 (SEQ ID NO:8); DP7 (SEQ ID NO:21) es la secuencia marco aceptora de la línea germinal humana. Las líneas verticales indican las diferencias entre los restos de ratón y humanos. Las secuencias subrayadas indican los restos donantes que se han retenido en el injerto. Las CDR se indican como letras negritas en cursiva (no se muestran para DP7). Los injertos gH4 (SEQ ID NO:24) y gH6 (SEQ ID NO:26) tienen 6 restos marco donantes. Los injertos gH5 (s Eq ID NO:25) y gH7 (SEQ ID NO:27) tienen 4 restos marco donantes.
La Figura 7 muestra la cartografía del vector pMRR14.
La Figura 8 muestra la cartografía del vector pMRR10.1.
La Figura 9 muestra los resultados del ensayo Biacore de los mutantes 5/44 quiméricos.
La Figura 10 muestra los oligonucleótidos para los ensamblajes de los genes 5/44 gH1 y gL1 (SEQ ID NO:32-47).
La Figura 11 muestra la cartografía del plásmido del vector intermedio pCR2.1(544gH1).
La Figura 12 muestra la cartografía del plásmido del vector intermedio pCR2.1(544gL1).
La Figura 13 muestra los casetes de oligonucleótidos utilizados para preparar injertos adicionales (SEQ ID NO:56-65).
La Figura 14 es una gráfica que muestra un ensayo de competición entre el anticuerpo 5/44 de ratón marcado fluorescentemente y las variantes injertadas.
La Figura 15 es una gráfica que muestra un ensayo de competición entre el anticuerpo 5/44 de ratón marcado fluorescentemente y las variantes injertadas.
La Figura 16 muestra la secuencia completa de ADN (SEQ ID NO:29, 31, 66 y 67) y las proteínas (SEQ ID NO: 28 y 30) de las cadenas pesada y ligera injertadas.
La Figura 17 es una representación esquemática de un conjugado de anticuerpo dirigido contra NAc-gamma caliqueamicina DMH.
La Figura 18 es una gráfica que muestra el efecto de CMC 544 sobre el crecimiento del linfoma de linfocitos B RAMOS.
La Figura 19 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544 sobre linfomas de linfocitos B grandes en un modelo de xenoinjerto in vivo en ratones lampiños.
La Figura 20 es una gráfica que compara los efectos de CMC-544 realizados con el procedimiento de conjugación de CMA-676 y el procedimiento de conjugación de CMC-544 sobre el crecimiento del linfoma RL. La Figura 21 es una gráfica que muestra que el linfoma RL grande tratado con rituximab (Rituxan™) es susceptible al tratamiento con c MC-544.
La Figura 22 es una gráfica que muestra el efecto de rituximab (Rituxan™) sobre el efecto citotóxico de CMC-544.
La Figura 23 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544, rituximab (Rituxan™), y CMA-676 sobre la supervivencia de ratones SCID con linfoma RAMOS B diseminado de forma temprana.
La Figura 24 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544, rituximab (Rituxan™), y CMA-676 sobre la supervivencia de ratones SCID con linfoma RAMOS B diseminado tardíamente.
La Figura 25 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544, rituximab (Rituxan™), y CMA-676 sobre la supervivencia de ratones SCID con linfoma RAMOS B diseminado tardíamente.
La Figura 26 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544, rituximab (Rituxan™), y CMA-676 sobre la supervivencia de ratones SCID con linfoma RAMOS B diseminado tardíamente.
La Figura 27 es una gráfica que muestra el efecto de CMC-544, rituximab (Rituxan™), y CMA-676 sobre la supervivencia de ratones SCID con linfoma RAMOS B diseminado tardíamente.
La Figura 28 es una gráfica que muestra la actividad antitumoral de CMC-544 con y sin rituximab (Rituxan™) sobre el linfoma RL no de Hodgkin.
La Figura 29 es una gráfica que muestra la actividad antitumoral de CMC-544 y CHOP sobre el linfoma RL no de Hodgkin.
Descripción detallada de la invención
Los conjugados de la presente invención comprenden un fármaco citotóxico derivatizado con un engarce que incluye cualquier grupo reactivo que reacciona con un transportador proteínico para formar un conjugado de derivado de fármaco citotóxico-transportador proteínico. Específicamente, los conjugados de la presente invención comprenden un fármaco citotóxico derivatizado con un engarce que incluye cualquier grupo reactivo que reacciona con un anticuerpo utilizado como un transportador proteínico para formar un conjugado de derivado de fármaco citotóxico / anticuerpo.
Específicamente, el anticuerpo reacciona contra un antígeno superficial celular expresado en neoplasias de linfocitos B. Se describe a continuación un procedimiento mejorado para preparar y purificar dichos conjugados. El uso de cosolventes, aditivos, y condiciones de reacción específicas concretas junto con el procedimiento de separación da como resultado la formación de un conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / anticuerpo con una reducción significativa en la LCF. La forma monomérica por oposición a la forma agregada tiene un significativo valor terapéutico, y minimizar la LCF y reducir sustancialmente la agregación da como resultado la utilización del material de partida del anticuerpo de una manera terapéuticamente significativa evitando que la LCF compita con una fracción mucho más conjugada (HCF).
I. TRANSPORTADORES
Los agentes transportadores/de direccionamiento de la presente invención son preferentemente agentes transportadores/agentes de direccionamiento proteínicos. Los ejemplos de agentes transportadores/agentes de direccionamiento son las hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, miméticos de anticuerpos y sus homólogos diseñados mediante ingeniería genética o enzimáticamente, denominados a partir de ahora en el presente documento como un transportador individual o en forma agrupada como "transportadores". La propiedad esencial de un transportador se su capacidad para reconocer y unirse a un antígeno o receptor asociado con células indeseadas e internalizarse posteriormente. Se describen ejemplos de transportadores en la patente de los Estados Unidos N°. 5.053.394. Los transportadores preferidos para uso en la presente invención son anticuerpos y miméticos de anticuerpos.
Se han utilizado numerosas estructuras de proteínas no inmunoglobulinas para generar miméticos de anticuerpos que se unen a epítopes antigénicos con la especificidad de un anticuerpo (publicación PCT N° WO 00/34784). Por ejemplo, se ha diseñado una estructura de "minicuerpo", que está relacionada con el pliegue de inmunoglobulina, para eliminar tres cadenas beta de un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal (Tramontano y col., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Esta proteína incluye 61 restos y se puede usar para presentar dos bucles hipervariables. Se han aleatorizado estos dos bucles y se han seleccionado los productos según su unión al antígeno, pero hasta el momento el marco parece tener cierta utilidad limitada debido a problemas de solubilidad. Otro marco utilizado para expresar bucles es tendamistat, una proteína que inhibe específicamente las alfa-amilasas de mamífero y tiene 74 restos, una lámina beta de seis cadenas en sándwich junto con dos enlaces disulfuro, (McConnell y Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Esta estructura incluye tres bucles pero, hasta la fecha, solo se han examinado dos de estos bucles para la aleatorización potencial.
Se han ensayado otras proteínas como marcos y se han utilizado para expresar restos aleatorizados sobre superficies de alfa hélice (Nord y col., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord y col., Protein Eng. 8:601, 1995), en los bucles entre las hélices alfa y los haces de hélices alfa (Ku y Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995), y bucles constreñidos por puentes disulfuro, tales como los de los inhibidores de las proteasas pequeñas (Markland y col., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland y col., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen y Collins, Gene 164;243, 1995; Wang y col, J. Biol. Chem. 270:12250, 1995).
Los ejemplos de transportadores de anticuerpos que se pueden usar en la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y sus fragmentos biológicamente activos. Preferentemente, dichos anticuerpos se dirigen contra antígenos superficiales celulares expresados en células y/o tejidos diana en trastornos proliferativos tales como cáncer. Los ejemplos de anticuerpos específicos dirigidos contra antígenos superficiales celulares en células diana incluyen sin limitación anticuerpos dirigidos contra el antígeno CD22 que se expresan en exceso en la mayoría de linfomas de linfocitos B; G5/44, una forma humanizada de un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra CD22; anticuerpos contra el antígeno superficial celular CD33, que es prevalente en determinados tumores mieloides humanos, especialmente, leucemia mieloide aguda; hP67.6, una forma humanizada del anticuerpo de murino dirigido contra CD33 (véase la patente de los Estados Unidos N° 5.773.001); un anticuerpo contra el antígeno PEM que se encuentra en muchos tumores de origen epitelial designados mP67.6 (véase I.D. Bernstein y col., J. Clin. lnvest. 79:1153 (1987) e l.D. Bernstein y col., J. lmmunol. 128:867-881 (1992)); y un anticuerpo humanizado contra el antígeno del carbohidrato Y de Lewis expresado en exceso en muchos tumores sólidos designados hu3S193, (véase la patente de los Estados Unidos N° 6.310.185 B1). Además, existen algunos anticuerpos comercialmente disponibles tales como rituximab (Rituxan™) y trastuzumab (Herceptin™) que se pueden utilizar también como agentes transportadores/de direccionamiento. Rituximab (Rituxan™) es un anticuerpo quimérico dirigido contra CD20 utilizado para tratar diversos linfomas de linfocitos B y trastuzumab (Herceptin™) es un anticuerpo humanizado dirigido contra Her2 utilizado para tratar el cáncer de mama.
Se ilustra en el presente documento el uso como transportador de la presente invención una molécula de anticuerpo humanizado injertada con CDR dirigida contra el antígeno superficial celular CD22, designada G5/44. Este anticuerpo es una forma humanizada de un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra CD22 que se dirige contra el antígeno superficial celular CD22, que es prevalente en determinados linfomas humanos. El término "una molécula de anticuerpo injertada con CDR" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de anticuerpo en la que la cadena pesada y/o ligera contiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que incluyen, si se desea, una CDR modificada (a partir de ahora en el presente documento CDR) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de murino) injertado en un marco de la región variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano). Preferentemente, tal anticuerpo injertado con CDR tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas así como una o más de las CDR citadas anteriormente.
Cuando se injertan las CDR, se puede usar cualquier secuencia marco de región variable aceptora adecuada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante a partir del cual se deriva la CDR, incluyendo regiones marco de ratón, primate y ser humano. Ejemplos de regiones marco humanas que se pueden usar en la presente invención son KOL, NEWM, REl, EU, TUR, TEl, LAY y POM (Kabat y col. Seq. of Proteins of lmmunol. lnterest, 1:310-334 (1994)). Por ejemplo, se pueden usar KOL y NEWM para la cadena pesada, se puede usar REl para la cadena ligera y EU, se pueden usar LAY y POM para la cadena pesada y la cadena ligera.
En un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, se prefiere usar como anticuerpo aceptor uno que tenga cadenas que sean homólogas a las cadenas del anticuerpo donante. Las cadenas pesada y ligera aceptoras no necesitan derivarse necesariamente del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas de materiales compuestos que tienen regiones marco derivadas de diferentes cadenas.
Asimismo, en un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las regiones marco no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, se pueden cambiar restos inusuales por restos más frecuentes de la clase o tipo de la cadena aceptora. Como alternativa, los restos seleccionados en las regiones marco aceptoras se pueden cambiar de tal manera que correspondan al resto que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante o en un resto que sea una sustitución conservativa para el resto que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante. Dichos cambios deben mantenerse en el mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Se muestra un protocolo para seleccionar restos en las regiones marco aceptoras que se pueden necesitar cambiar en la Publicación PCT N° Wo 91/09967.
Los restos donantes son restos procedentes del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo a partir del cual se derivaron originalmente las CDR.
El anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (tal como se ha definido por Kabat y col., (más arriba)) un H2' en el que se ha eliminado una secuencia del sitio de glicosilación potencial a fin de aumentar la afinidad del anticuerpo para el antígeno.
De manera alternativa o adicional, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como se ha definido por Kabat y col., (más arriba)) una H2'' en la que un resto de lisina está en la posición 60. Este resto de lisina, que se localiza en la posición expuesta en CDR-H2, y se considera que tiene el potencial de reaccionar con los agentes de conjugación resultantes en una reducción de la afinidad de la unión a antígeno, se sustituye con un aminoácido alternativo.
Además, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como se ha definido por Kabat y col., (más arriba)) una H2"' en la que la secuencia del sitio de glicosilación potencial y el resto de lisina en la posición 60, se sustituyen con aminoácidos alternativos.
El anticuerpo de la presente invención puede comprender: un anticuerpo completo que tienen las cadenas pesada y ligera de longitud completa; uno de sus fragmentos biológicamente activos, tales como Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 o un fragmento Fv; un monómero o un dímero de cadena ligera o de cadena pesada; o un anticuerpo monocatenario, por ejemplo, un Fv monocatenario en el que los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera se unen mediante un péptido engarce. De manera similar, las regiones variables de la cadena pesada y ligera pueden combinarse con otros dominios de anticuerpos según sea adecuado.
El anticuerpo de la presente invención puede incluir también un fragmento Fab modificado en el que la modificación es la adición de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora o indicadora al extremo terminal C de su cadena pesada. Preferentemente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno a dos restos de cisteína a los cuales se puede unir el efector o la molécula indicadora. Los dominios de la región constante del anticuerpo de la presente invención, si están presentes, se pueden seleccionar con respecto a la función propuesta del anticuerpo, y en particular para las funciones efectoras que puedan requerirse o no. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En particular, se pueden usar dominios de la región constante de la IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando se prevé que el anticuerpo tenga usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Como alternativa, se pueden usar los isotipos IgG2 e IgG4 o la región Fc de IgG1 puede estar mutada para abrogar la función efectora cuando se prevé el anticuerpo para fines terapéuticos y no se requieren o se desean funciones efectoras del anticuerpo.
El anticuerpo de la presente divulgación tiene una afinidad de unión de al menos 5x10-8 M, preferentemente al menos 1x10-9 M, más preferentemente al menos 0,75x10-10 M, y lo más preferentemente al menos 0,5x10-10 M. En una realización, la presente invención se refiere a conjugados de inmunotoxinas y procedimientos desvelados para preparar estos conjugando usando variantes de anticuerpos o miméticos de anticuerpos. En una realización preferida, las variantes del anticuerpo de la presente invención se dirigen contra CD22 y expresan una afinidad aumentada para CD22. Se pueden obtener dichas variantes mediante numerosos protocolos de maduración por afinidad incluyendo mutaciones en las CDR (Yang y col, J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), búsqueda de cadenas (Marks y col., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutantes de E. coli (Low y col., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), Intercambio de ADN (Patten y col., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), expresión en fagos (Thompson y col., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri y col., Nature, 391, 288-291, 1998).
Puede utilizarse cualquier sistema de célula/vector hospedador para la expresión de las secuencias ADN que codifican el transportador, incluyendo los anticuerpos de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo, E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, Fv monocatenarios. Se pueden usar sistemas de expresión de células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, de mamíferos para la producción de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpos completas. Las células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen células CHO, células de mieloma, células de levadura, células de insectos, células de hibridoma, células NSO, células VERO o células PER C6. Los sistemas de expresión adecuados incluyen también animales y plantas transgénicas.
II. AGENTES TERAPÉUTICOS
Los agentes terapéuticos adecuados para su uso en la presente divulgación son fármacos citotóxicos que inhiben o perturban la polimerización de la tubulina, Agentes alquilantes que se unen y perturban el ADN, y agentes que inhiben la síntesis de proteínas o de las proteínas celulares esenciales tales como las proteínas quinasas, enzimas y ciclinas. Los ejemplos de dichos fármacos citotóxicos incluyen, pero no se limitan a tiotepa, taxanos, vincristina, daunorubicina, doxorrubicina, epirubicina, actinomicina, autramicina, azaserinas, bleomicinas, tamoxifeno, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, caliqueamicinas, esperamicinas y maitansinoides. Los fármacos citotóxicos preferidos son las caliqueamicinas, que son un ejemplo de los antibióticos antitumorales de trisulfuro de metilo. Se describen los ejemplos de caliqueamicinas adecuados para el uso en la presente invención, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 4.671.958; patente de los Estados Unidos N° 4.970.198, patente de los Estados Unidos N° 5.053.394, patente de los Estados Unidos N° 5.037.651; y la patente de los Estados Unidos N° 5.079.233. Según la invención, las caliqueamicinas referidas son los derivados de las gamma caliqueamicinas o los derivados de la N-acetil gamma-caliqueamicina.
III. CONJUGADOS DE DERIVADOS DE FÁRMACO CITOTÓXICO/TRANSPORTADOR
Los conjugados de la presente invención tienen la fórmula Pr(-X-W)m en la que:
Pr es un transportador proteínico,
X es un engarce que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que pueda reaccionar con un transportador proteínico,
W es el fármaco citotóxico;
m es la carga promedio de un producto de conjugación purificado, de tal manera que la caliqueamicina constituye un 4 -10 % del conjugado en peso; y
(-X-W)m es un fármaco citotóxico.
Preferentemente, de acuerdo con la divulgación, X tiene la fórmula
(CO - Alq1 - Sp1 - Ar - -Sp2 - Alq2 - C(Z1) = Q - Sp)
en la que
Alq1 y Alq2 son independientemente un enlace o una cadena de alquileno (C1-C10) ramificada o no ramificada; Sp1 es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N-, o -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z en la que X, Y, y Z son independientemente un enlace, -NR'-, -S-, u -O-, con la condición de que cuando n = 0, entonces al menos uno de Y y Z debe ser un enlace y Ar' es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C5), alcoxi (C1-C4), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOoR', -O(CH2)nCONHR', o -S(CH2)nCONHR', con la condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace;
n es un número entero de 0 a 5;
R' es una cadena (C1-C5) ramificada o no ramificada opcionalmente sustituida con uno o dos grupos de -OH, alcoxi (C1-C4), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, dialquilamino (C1-C3), o trialquil (C1-C3) amonio -A' en el que A' es un anión farmacéuticamente aceptable que completa una sal;
Ar es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', o -S(CH2)nCONHR' en el que n y R' son como se ha definido anteriormente en el presente documento o un 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno o
Figure imgf000015_0001
con cada naftilideno o fenotiazina opcionalmente sustituida con uno, dos, tres, o cuatro grupos de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', o -S(CH2)nCONHR' en el que n y R' son como se ha definido anteriormente, con la condición de que cuando Ar es fenotiazina, Sp1 es un enlace vinculado solo a nitrógeno;
Sp2 es un enlace, -S-, u -O-, con la condición de que cuando Alk2 es un enlace, Sp2 es un enlace;
Z1 es H, alquilo (C1-C5), o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', o -S(CH2)nCONHR' en el que n y R' son como se ha definido anteriormente;
Sp es un radical (C1-C18) divalente o trivalente de cadena lineal o ramificada, un radical arilo o heteroarilo divalente o trivalente, un radical cicloalquilo o heterocicloalquilo (C3-C18) divalente o trivalente, un radical arilo o heteroaril (C1-C18) arilo divalente o trivalente, un radical cicloalquilo o heterocicloalquil (C1-C18) alquilo divalente o trivalente o un radical alquilo (C2-C18) divalente o trivalente insaturado, en el que heteroarilo es preferentemente furilo, tienilo, N-metilpirrolilo, piridinilo, N-metilimidazolilo, oxazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, N-metilcarbazoílo, aminocourmarinilo, o fenazinilo y en el que si Sp es un radical trivalente, Sp puede sustituirse adicionalmente por grupos dialquil (C1-C5) lamino inferior, alcoxi (C1-C5) inferior, hidroxi, o alquiltio (C1-C5) inferior; y
Q es =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, o =NHO-.
Preferentemente, Alq1 es una cadena de alquileno (C1-C10) ramificado o no ramificado; Sp' es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, o -NR' en el que R' es como se ha definido anteriormente en el presente documento, con la condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace;
Ar es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', o -S(CH2)nCONHR' en la que n y R' son como se ha definido anteriormente, o Ar es un 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno sustituido cada uno opcionalmente con uno, dos, tres, o cuatro grupos de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', o
-S(CH2)nCONHR'.
Z1 es alquilo (C1-C5), o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C5), alcoxi (C1-C4), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', o -S(CH2)nCON-HR'; Alq2 y Sp2 son conjuntamente un enlace; y Sp y Q son como se ha definido inmediatamente anteriormente.
La patente de los Estados Unidos N° 5.773.001, describe engarces que se pueden usar con derivados nucleófilos, particularmente hidrazidas y nucleófilos relacionados, preparados a partir de caliqueamicinas. Estos engarces son especialmente útiles en aquellos casos en los que se obtiene una actividad mejor cuando el enlace formado entre el fármaco y el engarce es hidrolizable. Estos engarces contienen dos grupos funcionales. Un grupo es normalmente un ácido carboxílico que se utiliza para reaccionar con el transportador. El grupo funcional ácido, cuando se activa adecuadamente, puede formar un enlace amida con un grupo amina libre del transportador, tal como, por ejemplo, la amina en la cadena secundaria de una lisina de un anticuerpo u otro transportador proteínico. El otro grupo funcional es comúnmente un grupo carbonilo, es decir, un aldehido o una cetona, que reaccionará con el agente terapéutico modificado adecuadamente. Los grupos carbonilo pueden reaccionar con un grupo hidrazida en el fármaco para formar un enlace hidrazona. Este enlace es hidrolizable, permitiendo la liberación del agente terapéutico a partir del conjugado tras la unión a las células diana.
Un engarce bifuncional más preferido para su uso en la presente invención es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut), que da como resultado un producto preferido en el que el conjugado consiste en p-caliqueamicina, ycaliqueamicina o N-acetil Y-caliqueamicina funcionalizada por reacción con 3-mercapto-3-metil butanoil hidrazida, el engarce AcBut, y un transportador dirigido al anticuerpo IgG humano o humanizado.
IV. CONJUGACIÓN MONOMÉRICA
La naturaleza hidrófoba natural de muchos fármacos citotóxicos incluyendo las caliqueamicinas crea dificultades en la preparación de conjugados de fármacos monoméricos con buenas cargas de fármacos y rendimientos razonables que son necesarios para las aplicaciones terapéuticas. La hidrofobicidad aumentada del enlace proporcionado por los engarces, tal como el engarce AcBut, descrito en la patente de los Estados Unidos N° 5.773.001, así como la mayor distancia covalente que separa el agente terapéutico del transportador (anticuerpo), agrava este problema. La agregación de conjugados de derivados de fármaco citotóxico / transportador con cargas mayores de fármacos se produce debido a la naturaleza hidrófoba de los fármacos. Ha de limitarse a menudo la carga del fármaco para obtener cantidades razonables de producto monomérico. En algunos casos, tales como con los conjugados de la patente de los Estados Unidos N° 5.877.296, es a menudo difícil preparar conjugados en rendimientos útiles con cargas útiles para aplicaciones terapéuticas que utilizan las condiciones de reacción descritas en la patente de los Estados Unidos N° 5.053.394 debido a la agregación excesiva. Estas condiciones de reacción utilizaron DMF como el cosolvente en la reacción de conjugación. Se necesitan por tanto procedimientos que permiten mayores cargas/rendimientos de fármacos sin agregación y la pérdida inherente de material.
Se describen mejoras para reducir la agregación en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.712.374 y 5.714.586. Se describen en dichas patentes transportadores proteínicos que incluyen, pero no se limitan a, proteínas tales como anticuerpos humanos o humanizados que se usan para dirigir los agentes citotóxicos terapéuticos, tales como, por ejemplo, hP67.6 y el resto de anticuerpos humanizados descritos en las anteriores. En dichas patentes, se ha descubierto que el uso de una solución tamponada no nucleófila, compatible con proteínas, que contiene (i) propilenglicol como cosolvente y (ii) un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico C6-C18 produce generalmente conjugados de derivados monoméricos de fármaco citotóxico / transportador con mayor carga/rendimiento del fármaco y agregación disminuida que tienen una excelente actividad. Los ácidos preferidos descritos en el anterior eran ácidos C7 a C12, y el ácido más preferido era el ácido octanoico (tal como ácido caprílico) o sus sales. Las soluciones tamponadas preferidas para los conjugados preparados a partir de ésteres de N-hidroxisuccinimida (OSu) u otros ésteres activados comparables eran solución salina tamponada con fosfato (PBS) o ácido N-2-hidroxietil piperazina-N'-2-etanosulfónico (tampón HEPES). La solución tamponada utilizada en dichas reacciones de conjugación no puede contener aminas o nucleófilos libres. Para otros tipos de conjugados, se pueden determinar fácilmente los tampones aceptables. Como alternativa, el uso de una solución tamponada no nucleófila, compatible con proteínas, se ha encontrado también que la solución tamponada que contiene t-butanol sin el aditivo adicional produce conjugados de derivados/transportadores de caliqueamicina monomérica con mayor carga/rendimiento del fármaco y agregación disminuida.
La cantidad de cosolvente necesaria para formar un conjugado monomérico varía algo de proteína a proteína y se puede determinar por las personas normalmente expertas en la técnica sin experimentación innecesaria. La cantidad de aditivo necesaria para formar eficazmente un conjugado monomérico varía también de anticuerpo a anticuerpo. Una persona normalmente experta en la materia puede determinar también esta cantidad sin experimentación innecesaria. En las patentes de los Estados Unidos con Números 5.712.374 y 5.714.586 se añadieron adiciones de propilenglicol en cantidades que variaban de 10 % a 60 %, preferentemente de 10 % a 40 %, y más preferentemente aproximadamente 30 % en volumen de la solución total, y un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico Ca-C-ia o su sal, preferentemente ácido caprílico o su sal, en cantidades que varían de 20 mM a 100 mM, preferentemente de 40 mM a 90 mM, y más preferentemente de aproximadamente 60 mM a 90 mM a reacciones de conjugación para producir conjugados de derivados monoméricos de fármaco citotóxico / transportador con mayor carga/rendimiento del fármaco y agregación disminuida. Podrían utilizarse también otros cosolventes orgánicos compatibles con proteínas diferentes de propilenglicol, tales como etilenglicol, etanol, DMF, DMSO; etc. Se utilizaron algunos o todos los cosolventes orgánicos para transferir el fármaco a la mezcla de conjugación.
Como alternativa, en dichas patentes, podría aumentarse la concentración del ácido carboxílico C6-C18 o su sal a 150-300 mM y el cosolvente distribuirse en forma de gotas al 1-10 %. En una realización, el ácido carboxílico era ácido octanoico o su sal. En una divulgación preferida, el ácido carboxílico era ácido decanoico o su sal. En otra divulgación preferida, el ácido carboxílico era ácido caprílico o su sal, que estaba presente a una concentración de 200 mM de ácido caprílico junto con propilenglicol al 5 % o etanol.
En otra divulgación alternativa de dichas patentes, podría añadirse t-butanol a concentraciones que varían de 10 % a 25 %, preferentemente 15 %, en volumen de la solución total a la reacción de conjugación para producir conjugado de derivado de fármaco citotóxico / transportador con mayor carga/rendimiento del fármaco y agregación disminuida.
Estas condiciones de conjugación establecidas se aplicaron a la formación de CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin), que se vende ahora comercialmente como Mylotarg™. Debido a la introducción de este tratamiento para la leucemia mieloide aguda (LMA), se ha aprendido a través del uso de la cromatografía de intercambio iónico que la caliqueamicina no está distribuida sobre el anticuerpo de una manera uniforme. La mayor parte de la caliqueamicina está en aproximadamente la mitad del anticuerpo, mientras que la otra mitad existe en una LCF que contiene solo pequeñas cantidades de caliqueamicina. En consecuencia, existe una necesidad crítica de mejorar los procedimientos para conjugar fármacos citotóxicos tales como las caliqueamicinas con transportadores que minimicen la cantidad de agregación y permitan una mayor carga uniforme del fármaco con un rendimiento significativamente mejorado del producto conjugado.
Un ejemplo específico es el del conjugado G5/44-NAc-gamma-caliqueamicina DMH AcBut, que se denomina CMC-544 y se muestra genéricamente en la Figura 17. Se deseaba la reducción de la cantidad de la LCF a <10 % del anticuerpo total para el desarrollo de CMC-544, y se consideraron varias opciones para la reducción de los niveles de la LCF. Otros atributos del inmunoconjugado, tales como la unión al antígeno y la citotoxicidad, no deben verse afectados por la solución en última instancia. Las opciones consideradas incluyeron la modificación genética o física del anticuerpo, las técnicas de separación cromatográficas, o la modificación de las condiciones de reacción.
La reacción del anticuerpo G5/44 con las NAc-gamma-caliqueamicina DMH AcBut OSu utilizando condiciones de reacción antiguas (Condiciones del Procedimiento CMA-676) dieron como resultado un producto con similares propiedades físicas (carga del fármaco, LCF, y agregación) como CMA-676. Sin embargo, el nivel elevado (50-60 %) de LCF presente tras la conjugación se consideró indeseable. Se determinaron las condiciones de reacción óptimas a través de la metodología estadística de diseño experimental en la que se evaluaron variables de reacción claves tales como la temperatura, pH, entrada del derivado de caliqueamicina, y concentración de aditivos. El análisis de estos experimentos demostró que la entrada de caliqueamicina y la concentración de aditivo tenían los efectos más significativos sobre el nivel de la fracción conjugada baja LCF y la formación de agregados, mientras que la temperatura y el pH ejercieron influencias similares. En experimentos adicionales, se ha mostrado también que las concentraciones de proteínas transportadoras (anticuerpos) y cosolventes (etanol) fueron análogamente de menor importancia (en comparación con la entrada de caliqueamicina y la concentración de aditivo) en el control de la LCF y los niveles de agregados. A fin de reducir la LCF a <10 % se aumentó la entrada del derivado de caliqueamicina de 3 % a 8,5 % (en p/p) con respecto a la cantidad de anticuerpo en la reacción. Se cambió el aditivo de ácido octanoico o su sal a una concentración de 200 mM (procedimiento CMA-676) a ácido decanoico o su sal a una concentración de 37,5 mM. La reacción de conjugación procedió mejor a una temperatura (30-35°C) y un pH (8,2­ 8,7) ligeramente elevados. Las condiciones de reacción que incorporaban estos cambios redujeron la LCF por debajo del 10 por ciento aumentando a la vez la carga de caliqueamicina, y se denominan a partir de ahora en el presente documento Condición de Procedimiento CMC-544 o "nuevas" condiciones de procedimiento. En la Tabla 1 se muestra una comparación de los resultados obtenidos con las Condiciones de Procedimiento CMA-676 y CMC-544.
TABLA 1: COMPARACION DE LAS CONDICIONES DE PROCEDIMIENTO CMA-676 Y CMC-544
Figure imgf000017_0001
continuación
Figure imgf000018_0001
El aumento en la entrada de caliqueamicina aumentó la carga del fármaco de 2,5-3,0 en porcentaje en peso a 7,0­ 9,0 (más normalmente 7,5-8,5) en porcentaje en peso, y dio como resultado un nulo aumento en la agregación de proteínas en la reacción. Debido a la reducción del agregado y la LCF, las condiciones del procedimiento CMC-544 dieron como resultado un producto más homogéneo. CMC-544 se preparó de manera reproducible mediante este nuevo procedimiento de conjugación a escala multigramo de anticuerpo.
En las anteriores reacciones, la concentración del anticuerpo puede variar de 1 a 15 mg/ml, y la concentración del derivado de caliqueamicina, por ejemplo, el éster de N-acetil gamma-caliqueamicina DMH AcBut OSu (usado para preparar los conjugados que se muestran en la Figura 17), varía entre aproximadamente 4,5-11 % en peso del anticuerpo. El cosolvente era etanol, para el cual se han demostrado buenos resultados a concentraciones que variaban entre 6 y 11,4 % (en base volumétrica). Las reacciones se realizaron en PBS, HEPES, ácido N-(2-Hidroxietill)piperazina-N'-(4-etanosulfónico) (HEPBS), u otro tampón compatible a un pH de 8 a 9, a una temperatura que varía de 300°C a aproximadamente 350°C, y para tiempos que varían de 15 minutos a 24 horas. Los que sean expertos en la materia pueden determinar fácilmente intervalos de pH aceptables para otros tipos de conjugados. Se ha descubierto que para diversos anticuerpos, el uso de ligeras variaciones en las combinaciones de los aditivos anteriormente mencionados mejora la carga del fármaco y el rendimiento del conjugado monomérico, y debe entenderse que cualquier transportador de proteínas concreto puede requerir algunas alteraciones menores en las condiciones exactas de selección de los aditivos para conseguir los resultados óptimos.
V. PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DEL CONJUGADO
Tras la conjugación, los conjugados monoméricos se pueden separar de los reactivos sin conjugar (tales como el transportador proteínico y el fármaco citotóxico/caliqueamicina libre) y/o la forma agregada de los conjugados mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular (SEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), o cromatocentrado (CF). Los conjugados purificados son monoméricos, y contienen usualmente de un 4 aun 10 % en peso de fármaco citotóxico/caliqueamicina. En una divulgación preferida, los conjugados se purifican usando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). En los procedimientos anteriormente utilizados para la producción a escala de fabricación de los conjugados de fármacos citotóxicos/caliqueamicina de anticuerpos (procedimiento CMA-676), la única etapa de separación posterior a la conjugación empleada fue la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Aunque esta etapa es muy eficaz en la eliminación de conjugados de agregados y para realizar el intercambio de tampones para la formulación, es ineficaz en la reducción del contenido de LCF. En consecuencia, el procedimiento basado en SEC se basa completamente en la química de la reacción de conjugación para controlar el contenido de LCF del producto final. Otra desventaja de SEC es la limitación del volumen de la mezcla de reacción conjugada aplicada a la columna (que no excede normalmente del 5 por ciento del volumen del lecho de la columna de procedimiento). Esto limita gravemente el tamaño del lote (y por tanto la capacidad de producción) que se puede soportar en un espacio de producción dado. Finalmente, el procedimiento de purificación SEC da como resultado también una dilución significativa de la solución conjugada, que supone restricciones a la concentración de proteínas que se puede conseguir de manera dependiente en la formulación.
Cuando un fármaco citotóxico tiene una naturaleza muy hidrófoba, tal como un derivado de caliqueamicina, y se usa en un conjugado, la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es un candidato preferido para proporcionar una separación eficaz del anticuerpo conjugado y no conjugado. HIC presenta tres ventajas clave sobre SEC: (1) tiene la capacidad de reducir eficazmente el contenido de LCF así como el agregado; (2) la capacidad de carga de la columna para HIC es mucho mayor; y (3) HIC evita la excesiva dilución del producto.
Numerosos medios de HIC de alta capacidad adecuados para el uso a escala de producción, tales como Butyl, Phenyl y Octyl Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), pueden conjugar eficazmente de manera separada componentes y agregados del conjugado a partir de componentes conjugados monoméricos tras el procedimiento de la conjugación.
VI. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES
La presente divulgación proporciona también un procedimiento para la preparación de una composición/formulación de un conjugado monomérico de un derivado de fármaco citotóxico/transportador de la presente invención junto con un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.
El conjugado monomérico de derivado de fármaco citotóxico / transportador puede ser un único principio activo en la composición/formulación terapéutica o diagnóstica o tal como se desvela puede ir acompañado de mediante otros principios activos que incluyen ingredientes de anticuerpos diferentes, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra CD19, dirigidos contra CD20, dirigidos contra CD33, dirigidos contra linfocitos T, dirigidos contra IFNy o dirigidos contra LPS, o ingredientes no de anticuerpos tales como citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, antihormonas, fármacos citotóxicos y xantinas.
Las citoquinas y factores de crecimiento que se pueden usar para tratar trastornos proliferativos tales como el cáncer y que se pueden usar junto con los conjugados de derivados de fármaco citotóxico / transportador de la presente divulgación incluyen interferones, interleuquinas tales como interleuquina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF y G-CSF. Las hormonas comúnmente usadas para tratar trastornos proliferativos tales como el cáncer y que se pueden usar junto con los conjugados de derivado de fármaco citotóxico / transportador de la presente divulgación incluyen estrógenos tales como dietilestilbestrol y estradiol, andrógenos tales como testosterona y Halotestin, progestinas tales como Megace y Provera, y corticoesteroides tales como prednisona, dexametasona, e hidrocortisona.
Se usan comúnmente antihormonas tales como antiestrógenos, es decir, tamoxifeno, antiandrógenos, es decir, flutamida y agentes antiadrenales para tratar trastornos proliferativos tales como el cáncer, y se pueden usar junto con el conjugado del derivado / transportador del fármaco citotóxico de la presente divulgación.
Los agentes quimioterapéuticos/antineoplásicos usados habitualmente para tratar trastornos proliferativos tales como el cáncer, y que se pueden usar junto con el conjugado de derivado de fármaco citotóxico / transportador de la presente invención incluyen, pero sin limitación, Adriamicina, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina, bleomicina, metotrexato, doxorrubicina, fluorouracilos, etopósido, taxol y sus diversos análogos, y mitomicina.
Las composiciones deben comprender preferentemente una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o dolencia diana, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier conjugado, se puede estimar la dosis terapéuticamente eficaz inicialmente tanto en ensayos de cultivos celulares como en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración adecuado y la pauta de administración. Dicha información puede usarse seguidamente para determinar dosis útiles y rutas para la administración en seres humanos.
La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad de la patología, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la(s) combinación(es) de fármacos, las sensibilidades a la reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Esta cantidad se puede determinar mediante experimentación rutinaria y está comprendida en el criterio del especialista clínico. En general, una dosis eficaz estará entre 0,1 mg/m2 y 50 mg/m2, preferentemente 0,4 mg/m2 a 30 mg/m2, más preferentemente 2 mg/m2 a 9 mg/m2, cuya dosis se calcula sobre la base del transportador proteínico.
Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar tal como se desvela en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. La dosis a la que se administra el conjugado de derivado / anticuerpo de fármaco citotóxico monomérico depende de la naturaleza de la dolencia que se va a tratar, el grado del linfoma o de la leucemia maligna y si el conjugado se está usando profilácticamente o para tratar una dolencia existente.
La frecuencia de a dosis dependerá de la vida media del conjugado y de la duración de su efecto. Si el conjugado tiene una vida corta media (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario proporcionar una o más dosis por día. Como alternativa, si la molécula del conjugado tiene una vida media larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede ser necesario solo proporcionar una dosificación una vez por día, una vez por semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.
Una composición puede contener también un transportador farmacéuticamente aceptable para la administración del conjugado del anticuerpo. El transportador no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los transportadores adecuados pueden ser grandes macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli (ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.
Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los transportadores farmacéuticamente aceptables de estas composiciones pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, suero salino, glicerol, y etanol. Además, pueden estar presentes en dichas composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH. Dichos transportadores permiten que las composiciones se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas o suspensiones, para la ingestión por el paciente.
Las formas preferidas para la administración incluyen formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o la infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes formuladores, tales como agentes suspensores, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes.
Aunque la estabilidad de las soluciones conjugadas tamponadas es adecuada para la estabilidad a corto plazo, la estabilidad a largo plazo es mala. Para potenciar la estabilidad del conjugado y para aumentar su vida media, el conjugado de anticuerpo-fármaco puede liofilizarse hasta una forma seca, para la reconstitución antes del uso con un líquido estéril adecuado. Los problemas asociados con la liofilización de una solución de proteínas están bien documentados. Se puede producir la pérdida de la estructura secundaria, teciaria y cuaternaria durante los procedimientos de congelación y secado. En consecuencia, pueden incluirse crioconservantes para actuar como estabilizantes amorfos del conjugado y para mantener la integridad estructural de la proteína durante el procedimiento de liofilización. En una realización, el crioconservante útil en la presente divulgación es un alcohol azucarado, tal como alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietilenglicol, y sus combinaciones. En otra divulgación, el crioconservante es un ácido azucarado, incluyendo un ácido aldónico, un ácido urónico, un ácido aldárico, y sus combinaciones.
El crioconservante de esta divulgación puede ser también un hidrato de carbono. Los hidratos de carbono adecuados son compuestos de aldehídos o cetonas que contienen dos o más grupos hidroxilo. Los hidratos de carbono pueden ser cíclicos o lineales e incluyen, por ejemplo, aldosas, cetosas, aminoazúcares, alditoles, inositoles, ácidos aldónicos, ácidos urónicos, o ácidos aldáricos, o sus combinaciones. El hidrato de carbono puede ser también un mono, un di, o un policarbohidrato, tal como por ejemplo, un disacárido o polisacárido. Los hidratos de carbono adecuados incluyen por ejemplo, gliceraldehídos, arabinosa lixosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, glucosa, hexosa, idosa, manosa, talosa, heptosa, glucosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, lactosa, manitol, metil a-glucopiranósido, maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbosa, ácido glutámico, eritrosa, treosa, arabinosa alosa, altrosa, gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucourónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido galacturónico ácido mannurónico, glucosamina, galactosamina, sacarosa, trehalosa o ácido neuramínico, o derivados del mismo. Los policarbohidratos adecuados incluyen, por ejemplo, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos (tales como, por ejemplo, inulina), levano, fucoidano, carragenato, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pululano, glucógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, pustulano, quitina, agarosas, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma xantana, o almidón. Entre los hidratos de carbono útiles están la sacarosa, glucosa, lactosa, trehalosa, y sus combinaciones. La sacarosa es un crioconservante particularmente útil.
Preferentemente, el crioconservante de la presente invención de la divulgación es un hidrato de carbono o alcohol "azucarado", que puede ser un alcohol polihídrico. Los compuestos polihídricos son compuestos que contienen más de un grupo hidroxilo. Preferentemente, los compuestos polihídricos son lineales. Los compuestos polihídricos adecuados incluyen, por ejemplo, glicoles tales como etilenglicol, glicoles tales como propilenglicol, polietilenglicol, y polipropilenglicol, glicerol, o pentaeritritol; o sus combinaciones.
En algunas divulgaciones preferidas, el agente crioconservante es sacarosa, trehalosa, manitol, o sorbitol.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones se adapten para la administración a sujetos humanos.
Las composiciones de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquiera de numerosas rutas incluyendo, pero no se limitan a, rutas oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (véase Publicación PCT N° WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Se pueden usar también hipopulverizadores para administrar las composiciones de la invención. Normalmente, las composiciones pueden prepararse como inyectables, tanto como soluciones o suspensiones líquidas. Se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o administrarse en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones se pueden administrar también en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un calendario de dosis única o un calendario de dosis múltiple.
Se apreciará que el principio activo de la composición será un conjugado de fármaco citotóxico/transportador proteínico. De este modo, será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar mediante una ruta que utiliza el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al conjugado de la degradación, pero que liberen al conjugado una vez que se ha absorbido desde el tracto gastrointestinal.
Está disponible una discusión completa de los transportadores farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
La presente divulgación proporciona en particular un derivado de caliqueamicina monomérico / anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 (G5/44), CMC-544, para su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos caracterizados por células que expresan el antígeno CD22 sobre su superficie.
La presente divulgación proporciona además el uso de CMC-544 en la fabricación de una composición o un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo caracterizado por células que expresan CD22.
Se puede utilizar también CMC-544 en cualquier tratamiento en el que se desee reducir el nivel de células que expresan CD22 que están presentes en el sujeto que se está tratando con la composición o un medicamento descrito en el presente documento. Específicamente, la composición o el medicamento se utilizan para tratar seres humanos o animales con trastornos proliferativos, concretamente linfomas y leucemias, que expresan el antígeno CD22 sobre la superficie celular. Estas células que expresan CD22 pueden estar circulando en el cuerpo o estar presentes en un número indeseablemente grande en un sitio concreto en el cuerpo.
CMC-544 puede usarse también preferentemente para el tratamiento de neoplasias de linajes de linfocitos B que incluyen linfomas y leucemias, de forma más preferente linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), mieloma múltiple, leucemia linfocítica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (LLC). CMC-544 se puede usar solo o en combinación con otros agentes bioactivos para tratar sujetos que padecen neoplasias de linfocitos B. Los agentes bioactivos comúnmente utilizados incluyen factores de crecimiento, citoquinas, y fármacos citotóxicos. Los fármacos citotóxicos comúnmente utilizados para tratar trastornos proliferativos tales como el cáncer, y que se pueden usar juntos con CMC-544 incluyen una antraciclina tal como doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carrubicina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, y valrubicina durante hasta tres días; y un nucleósido de pirimidina o purina tal como citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina. Otros agentes quimioterapéuticos/antineoplásicos que se pueden administrar en combinación con CMC-544 incluyen adriamicina, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato, fluorouracilos, etopósido, taxol y sus diversos análogos, y mitomicina. CMC-544 se puede administrar simultáneamente con uno o más de estos agentes terapéuticos. Como alternativa, CMC-544 se puede administrar secuencialmente con uno o más de estos agentes terapéuticos.
CMC_544 se puede administrar también solo, en paralelo con, o secuencialmente con una combinación de otros agentes bioactivos tales como factores de crecimiento, citoquinas, esteroides, anticuerpos tales como anticuerpo dirigido contra CD20, rituximab (Rituxan™), y agentes quimioterapéuticos como parte de un régimen de tratamiento. Los regímenes de tratamiento establecidos para el tratamiento de trastornos linfoproliferativos malignos incluyen CHOPP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona, y procarbazina), CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona), COP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona), CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, y prednisona), m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, y leucovorina), ProM-ACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina), ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, citarabina, bleomicina, y vincristina), MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dosis fija de prednisona, bleomicina, y leucovorina), MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina), ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina), MOPP alternando con ABV (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, y vinblastina), y MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, y procarbazina) alternando con ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina, y dacarbazina), y ChIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina, y prednisona). El tratamiento puede comprender una fase de tratamiento de inducción, una fase de tratamiento de consolidación y una fase de tratamiento de mantenimiento. CMC-544 se puede administrar también solo, en paralelo con, o secuencialmente con cualquiera de los regímenes de tratamiento anteriormente identificados como parte de la fase de tratamiento de inducción, una fase de tratamiento de consolidación y una fase de tratamiento de mantenimiento.
Los conjugados de la presente divulgación pueden administrarse también junto con otros agentes bioactivos y quimioterapéuticos como parte de un régimen de quimioterapia combinado para el tratamiento de los linfomas agresivos que han recidivado. Dicho régimen de tratamiento incluye IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, y etopósido), MlME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, y etopósido), DHAP (dexametasona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino), ESHAP (etopósido, metilprednisolona, citarabina a dosis elevada, y cisplatino), EPOCH (etopósido, vincristina, y doxorubicina durante 96 horas con dosis de bolos de ciclofosfamida y prednisona oral), CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona, y bleomicina), CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, y prednisona), CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina y prednisona), CHOP-B (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona, y bleomicina), CEPP-B (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, y bleomicina), y P/DOCE (epirubicina o doxorubicina, vincristina, ciclofosfamida, y prednisona). Los regímenes de tratamiento adicionales para linternas agresivos pueden incluir una primera línea de tratamiento en fase 1 con CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona)-rituximab (Rituxan™)-CMC-544, seguido por CHOP-rituximab en fase 2 y fase 3 (Rituxan™), c Ho P-CMC-544 o CHOP-rituximab (Rituxan™)-CMC-544. Como alternativa, la fase 1 puede tener una primera línea de tratamiento con COP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona)-rituximab (Rituxan™)-CMC-544, seguido por COP-rituximab (Rituxan™) en fase 2 y fase 3, COP-CMC-544 o COP-rituximab (Rituxan™)-CMC-544. En una divulgación adicional, el tratamiento de linfomas agresivos puede incluir una primera o segunda línea de tratamiento con el conjugado de fármaco-anticuerpo CMC-544 en fase 1, seguido por CMC-544 y CHOP en fase 2 y 3 (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona), CMC-544 y COP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona), CMC-544 con rituximab (Rituxan™) o rituximab (Rituxan™) solo. En otra divulgación adicional, el tratamiento de linfomas agresivos puede incluir una primera línea de tratamiento con el conjugado de fármacoanticuerpo CMC-544 seguido en fase 2 y 3 con CMC-544 solo o en combinación con diferentes regímenes de tratamiento que incluyen, pero no se limitan a, ESHOP (etopósido, metilprednisolona, citarabina a dosis elevada, vincristina y cisplatino), EPOCH (etopósido, vincristina, y doxorubicina durante 96 horas con dosis de bolos de ciclofosfamida y prednisona oral), lMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, y etopósido), ASHAP (Adriamicina, solumedrol, Ara-C, y cisplatino), MlME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, y etopósido) e ICE (ifosfamida, ciclofosfamida, y etopósido). Se pueden encontrar detalles de diversos fármacos citotóxicos utilizados en quimioterapia de neoplasias malignas que incluyen la combinación de regímenes quimioterapéuticos, dosificaciones, etc., que se proporcionan en esta solicitud y que se pueden encontrar en Cancer Principles and Practice of Oncology, Eds. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, 6a Edición, Editores: Lippincott, Williams and Wilkins (2001) and Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, Eds. Edward Chu y Vincent T. DeVita, Editores: Jones and Bartlett, (2002).
La presente divulgación proporciona también un procedimiento para tratar sujetos humanos o animales que padecen o están en riesgo de un trastorno proliferativo caracterizado por células que expresan CD22, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de CMC-544 de la presente divulgación.
La presente invención se describe adicionalmente a continuación en ejemplos específicos de trabajo que pretenden describir adicionalmente la invención sin limitar su alcance.
Ejemplo 1
GENERACIÓN DE ANTICUERPOS CANDIDATOS
Se seleccionó un panel de anticuerpos contra CD22 a partir de hibridomas que utilizaban los siguientes criterios de selección: unión a células Daudi, internalización en células Daudi, unión a células mononucleares de sangre periférica (PBMC), internalización en PBMC, afinidad (mayor de 10'9M), ratón y1 y tasa de producción. 5/44 se seleccionó como el anticuerpo preferido.
I. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICA DE MOLÉCULAS DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS 5/44
a) Preparación de células de hibridoma 5/44 y preparación de ARN a partir de las anteriores
Se generaron células de hibridoma 5/44 mediante tecnología de hibridoma convencional tras inmunización de ratones con proteína CD22 humana. Se preparó el ARN de células de hibridoma 5/44 utilizando un kit RNEasy (Qiagen, Crawley, Reino Unido; n° de catálogo 74106). El ARN obtenido se transcribió de manera inversa con ADNc, como se describe a continuación.
b) Distribución de CD22 en tumores NHL
Se emprendió un estudio de inmunohistoquímica para examinar la incidencia y distribución de la tinción usando anticuerpos monoclonales 5/44 dirigidos contra CD22. Se incluyeron en el estudio anticuerpos dirigidos contra CD20 y CD79 de control para confirmar las áreas de linfocitos B de los tumores.
Se estudiaron un total de 50 tumores y estos se clasificaron como sigue utilizando la formulación de trabajo y los sistemas de clasificación REAL:
7 B Leucemia/linfoma linfoblástico (Alto/l)
4 B Linfoma linfocítico de células pequeñas/LLC (Bajo/A)
3 linfoplasmacitoide/Inmunocitoma (Bajo/A)
1 Células del manto (Int/F)
14 Linfoma del centro del folículo (Bajo a Int/D)
13 Linfoma de células grandes difuso (Int a Alto/G,H)
• 6 Inclasificable (K)
• 2 linternas de linfocitos T
Cuarenta linternas de linfocitos B fueron positivos para el antígeno CD22 con el anticuerpo 5/44 a 0,1 pg/ml y seis más se volvieron positivos cuando se aumentó la concentración a 0,5 pg/ml. Para los restantes dos tumores de linfocitos B que fueron negativos a 0,1 pg/ml, el tejido remanente fue insuficiente para ensayar a concentraciones mayores. Sin embargo, el ensayo en paralelo con otro anticuerpo dirigido contra CD22 designado 6/13, que proporcionó una tinción más fuerte que 5/44, dio como resultado una tinción positiva para CD22 en los 48 linternas de linfocitos B. Por tanto, es posible concluir que el antígeno CD22 está ampliamente expresado en linfomas de linfocitos B y proporciona por tanto una diana adecuada para la inmunoterapia en NHL.
c) Clonación mediante la PCR de 5/44 Vh y Vl
Se sintetizaron las secuencias de ADNc para los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de 5/44 utilizando la transcriptasa inversa para producir copias de ADNc monocatenario del ARNm presente en el ARN total. Este se usó a continuación como el molde en la amplificación de las secuencias de la región V de murino utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
i) Síntesis del ADNc
Se sintetizó el ADNc en un volumen de reacción de 20 pl que contenía los reactivos siguientes: Tris 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, ditiotreitol 10 mM, MgCh 3 mM, desoxirribonucleósido trifosfato 0,5 mM, 20 unidades de ARNsin, 75 ng de cebador de hexanucleótidos aleatorio, 2 pg de ARN 5/44 y 200 unidades de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney. Tras la incubación a 42°C durante 60 minutos, se terminó la reacción calentando a 95°C durante 5 minutos.
ii) PCR
Se sometieron alícuotas del ADNc a la PCR usando combinaciones de cebadores específicas de las cadenas pesada y ligera. Se usaron combinados de cebadores degenerados designados para hibridarse con las secuencias conservadas del péptido señal como cebadores directos. Estas secuencias contienen, en orden, un sitio de restricción (Vl Sful; Vh HindlII) que comienza 7 nucleótidos desde sus extremos 5', la secuencia GCCGCCACC (SEC ID N°:50), para permitir la traducción óptima de los ARNm resultantes, un codón de inicio y 20-30 nucleótidos basados en las secuencias peptídicas líderes de anticuerpos de ratón conocidos (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
Los cebadores 3' se designan para ampliar la unión J-C del marco 4 del anticuerpo y contienen un sitio de restricción para la enzima BsiWI para facilitar la clonación del fragmento Vl de la PCR. Los cebadores 3' de la cadena pesada son una mezcla diseñada para ampliar la unión J-C del anticuerpo. El cebador 3' incluye un sitio de restricción Apal para facilitar la clonación. La región 3' de los cebadores contiene una secuencia mixta basada en los encontrados en anticuerpos de ratón conocidos (Kabat y col., 1991, más arriba).
Las combinaciones de los cebadores descritos anteriormente permiten que los productos de la PCR para Vh y Vl se clonen directamente en un vector de expresión adecuado (véase a continuación) para producir cadenas pesadas y ligeras quiméricas (ratón-ser humano) de estos genes que se van a expresar en células de mamíferos para producir anticuerpos quiméricos del isotipo deseado.
Las incubaciones (100 pl) para la PCR se desarrollaron como sigue. Cada reacción contenía Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, 0,01 % en p/v de gelatina, desoxirribonucleósido trifosfato 0,25 mM, 10 pmoles de la mezcla del cebador 5', 10 pmoles del cebador 3', 1 pl de ADNc y 1 unidad de polimerasa Taq. Las reacciones se incubaron a 95°C durante 5 minutos y a continuación se ciclaron a 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto. Después de 30 ciclos, se analizaron las alícuotas de cada reacción mediante electroforesis en un gel de agarosa.
Para la región V de la cadena pesada, se obtuvo un solo producto de ADN amplificado cuando un combinado de cebadores que se hibridó con el inicio del marco I sustituyó la señal del combinado del cebador peptídico. Los fragmentos se clonaron en vectores de secuenciación del a Dn . Se determinó la secuencia de ADN y se tradujo para dar una secuencia de aminoácidos deducida. Esta secuencia deducida se verificó por referencia a la secuencia de la proteína del extremo N determinada experimentalmente. Las Figuras 2 y 3 muestran la secuencia de ADN/proteína de las regiones V de la cadena ligera y pesada madura del anticuerpo 5/44 monoclonal de ratón, respectivamente. iii) Clonación molecular de los fragmentos de la PCR
A continuación se clonaron las secuencias de la región V de murino en los vectores de expresión pMRR10.1 y pMRR14 (Figuras 7 y 8). Se trata de vectores para la expresión de la cadena ligera y la cadena pesada que contienen el ADN que codifica las regiones constantes de la cadena ligera kappa humana y ligera y pesada gamma 4 humana. La región Vl se subclonó en el vector de expresión mediante digestión por restricción y ligadura a partir del vector de secuenciación, utilizando los sitios de restricción Sful y BsiWI, creando el plásmido pMRR10(544cL) (Figura 8). El ADN de la cadena pesada se amplificó mediante la PCR utilizando un cebador 5' para introducir un péptido señal, como este no se obtuvo en la estrategia de clonación, se empleó un anticuerpo líder de la cadena pesada de ratón procedente de un hibridoma propio diferente (denominado 162). El cebador 5' tenía la siguiente secuencia:
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGG CACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' (SEC ID N°: 51).
El cebador inverso era idéntico al utilizado en la clonación del gen Vh original. El producto resultante de la PCR se digirió con las enzimas HindlII y Apal, se subclonó, y su secuencia de ADN se confirmó, creando el plásmido pMRR14(544cH) (Figura 7). La transfección simultánea transitoria en ambos vectores de expresión en células CHO generó el anticuerpo c5/44 quimérico. Esto se consiguió usando el reactivo Lipofectamine de acuerdo con los protocolos del fabricante (InVitrogen:Life Technology, Groningen, Países Bajos, n° de catálogo 11668-027).
II. ELIMINACIÓN DEL SITIO DE GLICOSILACIÓN Y DE LA LISINA REACTIVA
Se observó un sitio de glicosilación potencial unido a N en CDR-H2, que tenía la secuencia de aminoácidos N-Y-T (Figura 3). SDS-PAGE, el análisis de la transferencia Western y de la tinción de hidratos de carbono de geles de 5/44 y sus fragmentos (incluyendo Fab) indicaron que este sitio estaba indudablemente vez glicosilado (no se muestra). Además, se observó un resto de lisina en una posición expuesta en CDR-H2, que tenía el potencial de reducir la afinidad de unión del anticuerpo proporcionando un sitio adicional para la conjugación con un agente con el que se puede conjugar el anticuerpo.
Se usó una estrategia de la PCR para introducir sustituciones de aminoácidos en la secuencia de CDR-H2 en un intento de eliminar el sitio de glicosilación y/o la lisina reactiva, como se muestra en la Figura 4. Se usaron cebadores directos que codificaban las mutaciones N55Q, T57A o T57V para eliminar el sitio de glicosilación (Figura 4) y se generó un cuarto cebador directo que contenía la sustitución K60R para eliminar el resto de lisina reactiva (Figura 4). Se usó un cebador inverso del marco 4 en cada una de estas amplificaciones de la PCR. Los productos de la PCR se digirieron con las enzimas Xbal y Apal y se insertaron en pMRR14(544cH) (escindido también con Xbal y Apal) para generar los plásmidos de expresión que codifican estos mutantes. Las mutaciones N55Q, T57A y T57V eliminan el sitio de glicosilación cambiando la secuencia de aminoácidos con respecto al consenso N-X-T/S mientras que la mutación K60R sustituye la lisina potencialmente reactiva por el resto arginina cargado positivamente de manera similar. Los plásmidos variantes cH resultantes se transfectaron simultáneamente con el plásmido cL para generar las variantes de anticuerpos quiméricos expresadas.
III. EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES DE LOS GENES QUIMÉRICOS
Se evaluaron las actividades de los genes quiméricos tras la transfección transitoria en células CHO y la determinación de las constantes de afinidad mediante un análisis BiaCore.
Las afinidades de 5/44 quimérico o sus variantes, de los que se había eliminado su sitio de glicosilación o su lisina reactiva, se investigaron utilizando tecnología BIA para la unión a las construcciones CD22-mFc. Los resultados se muestran en la Figura 9. Se llevaron a cabo todas las medidas de la unión en el instrumento BIAcore™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Se llevó a cabo el ensayo mediante la captura de CD22mFc con Fc inmovilizado dirigido contra IgG de ratón. El anticuerpo estaba en la fase soluble. Las muestras, los patrones, y los controles (50 jl) se inyectaron en Fc inmovilizado dirigido contra IgG de ratón seguido por el anticuerpo en la fase soluble. Después de cada ciclo, se regeneró la superficie con 50 j l de HCl 40 mM a 30 jl/min. Se llevó a cabo el análisis cinético utilizando el programa informático BIAevaluation 3.1 (Pharmacia).
La eliminación del sitio de glicosilación en la construcción T57A dio como resultado una velocidad de la reacción directa ligeramente más rápida y una velocidad de la reacción inversa significativamente más lenta en comparación con 5/44 quimérico, proporcionando un aumento de la afinidad de aproximadamente 5 veces. La mutación N55Q no tuvo efecto sobre la afinidad. Este resultado fue inesperado ya que sugiere que la eliminación de los hidratos de carbono por sí mismos no tiene efecto aparentemente sobre la unión (como con el cambio de N55Q). Se observó solo la afinidad aumentada con el cambio T57A. Una posible explicación es que, con respecto a la presencia del hidrato de carbono, la treonina en la posición 57 ejerce un efecto negativo sobre la unión que se elimina en la conversión de treonina a alanina. La hipótesis de que el tamaño pequeño de la alanina es importante, y de que el efecto negativo de la treonina está relacionado con su tamaño, se basa en el resultado obtenido usando la mutación T57V: esta sustitución con valina en la posición 57 no es beneficiosa (no se muestran los resultados).
La eliminación de lisina por la mutación K60R tiene un efecto neutro sobre la afinidad, es decir, la introducción de arginina elimina un sitio reactivo potencial sin comprometer la afinidad.
Las mutaciones para la eliminación del sitio de glicosilación y la eliminación de la lisina reactiva se incluyeron por tanto en el diseño de humanización.
Ejemplo 2
INJERTO EN CDR de 5/44
Se ha descrito anteriormente la clonación molecular de genes para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 5/44 y su uso para producir anticuerpos 5/44 quiméricos (ratón/ser humano). Se muestran los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de los dominios 5/44 Vl y Vh de ratón en las Figuras 2 y 3 (SEC ID Nos:7 y 8), respectivamente. Este ejemplo describe el injerto en CDR del anticuerpo 5/44 en marcos humanos para reducir la inmunogenicidad potencial en seres humanos, de acuerdo con el procedimiento de Adair y col., (publicación PCT N° WO91/09967).
I. INJERTO EN CDR DE CADENA 5/44 LIGERA
La alineación de la secuencia de proteína con secuencias consenso procedentes de la región V de la cadena ligera Kappa del subgrupo I humano indicó una identidad de secuencias del 64 %. En consecuencia, para construir la cadena ligera injertada con CDR, las regiones marco aceptoras seleccionadas correspondieron a las de la secuencia DPK9 de la línea germinal O12 del subgrupo I de VK humano. La secuencia aceptora del marco 4 se derivó de la secuencia JK1 de la línea germinal de la región J humana.
Se proporciona una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones marco 5/44 de murino y la secuencia aceptora en la Figura 5 y muestra que existen 27 diferencias entre las cadenas donantes y aceptoras. En cada posición, se preparó un análisis del potencial del resto de murino para contribuir a la unión con el antígeno, de forma tanto directa como indirecta, a través de los efectos sobre el empaquetado o en la interfase Vh/Vl. Si se consideró importante un resto de murino y suficientemente diferente del resto humano en términos de tamaño, polaridad o carga, entonces el resto de murino se retuvo. Basándose en este análisis, se construyeron dos versiones de la cadena ligera injertada con CDR, que tenían las secuencias proporcionadas en la SEC ID N°:19 y la SEC ID N°:20 (Figura 5).
II. INJERTO EN CDR DE LA CADENA 5/44 PESADA
Se llevó a cabo el injerto en CDR de la cadena 5/44 pesada utilizando la misma estrategia que se ha descrito para la cadena ligera. Se ha encontrado que el dominio V de la cadena 5/44 pesada es homólogo a las cadenas pesadas humanas que pertenecen al subgrupo I (70 % de identidad de la secuencia) y por tanto se ha usado el marco VH1-3 DP7 de la línea germinal del subgrupo I humano como un marco aceptor. Las secuencias aceptoras del marco 4 se derivaron de la secuencia JH4 de la línea germinal de la región J humana.
En la Figura 6 se muestra una comparación de la cadena 5/44 pesada con las regiones marco en la que se puede observar que la cadena 5/44 pesada difiere de la secuencia aceptora en las posiciones 22. El análisis de la contribución que cualquiera de estas puede hacer a la unión con el antígeno condujo a 5 versiones de las cadenas pesadas injertadas con CDR que se estaban construyendo, que tenían las secuencias proporcionadas en la SEC ID N°:23, SEC ID N°:24, SEC ID N°:25, SEC ID N°:26 y SEC ID N°:27 (Figura 6).
III. CONSTRUCCIÓN DE GENES DE SECUENCIAS INJERTADAS
Se diseñaron los genes para codificar las secuencias injertadas gH1 y gL1, y se diseñaron y construyeron una serie de oligonucleótidos solapantes (Figura 10). Se empleó una técnica de ensamblaje de la PCR para construir los genes. Se configuraron volúmenes de reacción de 100 pl que contenían Tris-HCl l0 mM pH 8,3, MgCh 1,5 mM, KCl 50 mM, gelatina al 0,001 %, desoxirribonucleósido trifosfato 0,25 mM, 1 pmol de cada uno de los cebadores 'internos' (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmoles de cada uno de los cebadores 'externos' (F1, R1), y 1 unidad de la polimerasa Taq (AmpliTaq, Applied Biosystems, n° de catálogo N808-0171). Los parámetros de ciclación de la PCR fueron 94 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, durante 30 ciclos. A continuación se desarrollaron los productos de reacción en un gel de agarosa al 1,5 %, se escindieron y recuperaron utilizando columnas de centrifugación QIAGEN (kit de extracción en gel QIAquick, n° de cat. 28706). El ADN se eluyó en un volumen de 30 pl. A continuación se clonaron alícuotas (1 pl) del ADN de gH1 y gL1 en el vector de clonación pCR2.1 TOPO de InVitrogen TOPO TA (n° de catálogo K4500-01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este vector no de expresión sirvió como intermedio de clonación para facilitar la secuenciación de un gran número de clones. Se usó la secuenciación del ADN utilizando cebadores específicos de vector para identificar clones correctos que contenían gH1 y gL1, creando los plásmidos pCR2.1 (544gH1) y pCR2.1 (544gL1) (Figuras 11 y 12). Se utilizó un procedimiento de sustitución del casete de oligonucleótidos para crear los injertos humanizados gH4, 5, 6 y 7, y gL2. La Figura 13 muestra el diseño de los casetes de oligonucleótidos. Para construir cada variante, se cortó el vector pCR2.1(544gH1) o pCR2.1(544gL1)) con las enzimas de restricción que se muestran (XmaI/SacII para la cadena pesada, XmaI/BstEII para la cadena ligera). El fragmento de vector grande se purificó en gel de agarosa y se utilizó en la ligadura con el casete de oligonucleótidos. Estos casetes están compuestos por 2 oligonucleótidos complementarios (que se muestran en la Figura 11), mezclados a una concentración de 0,5 pmoles/pl en un volumen de 200 pl de Tris-HCl 12,5mM pH 7,5, MgCh 2,5 mM, NaCl 25 mM, ditioeritritol 0,25 mM, Se consiguió la hibridación calentando a 95 °C durante 3 minutos en un baño de agua (volumen 500 ml) permitiendo a la reacción enfriarse lentamente a temperatura ambiente. El casete de oligonucleótidos hibridado se diluyó a continuación diez veces en agua antes de la ligadura en el vector cortándolo adecuadamente. Se usó la secuenciación del ADN para confirmar la secuencia correcta, creando los plásmidos pCR2.1 (5/44-gH4-7) y pCR2.1 (5/44-gL2). Las secuencias injertadas verificadas se subclonaron a continuación en los vectores de expresión pMRR14 (cadena pesada) y pMR10.1 (cadena ligera).
IV. ACTIVIDAD DE UNIÓN A CD22 DE LAS SECUENCIAS INJERTADAS CON CDR
Los vectores que codificaban las variantes injertadas se transfectaron simultáneamente en células CHO en una variedad de combinaciones, junto con las cadenas de anticuerpos quiméricos originales. Se comparó la actividad de unión en un ensayo de competición, compitiendo la unión del anticuerpo 5/44 original de ratón para la unión a células Ramos (obtenidas de la ATCC, una línea de células linfoblásticas humanas de linfoma de Burkitt que expresaban CD22 superficial). Se consideró que este ensayo era el mejor modo de comparar los injertos por su capacidad de unirse a CD22 superficial celular. Los resultados se muestran en la Figuras 14 y 15. Como se puede observar, existe muy poca diferencia entre cualquiera de los injertos, todos se comportaron más eficazmente que el quimérico en la competición frente al progenitor de murino. La introducción de 3 restos humanos adicionales en el extremo de CDR-H3 (gH5 y gH7) no parece haber afectado la unión.
Se seleccionó la combinación del injerto con el menor número de restos gL1gH7 de murino. El injerto gL1 de la cadena ligera tiene 6 restos donantes. Los restos V2, V4, L37 y Q45 son restos de empaquetado potencialmente importantes. El resto H38 está en la interfase Vh/Vl. El resto D60 es un resto superficial cercano a CDR-L2 y puede contribuir directamente a la unión con el antígeno. De estos restos, V2, L37, Q45 y D60 se encuentran en las secuencias de la línea germinal de los genes kappa humanos procedentes de otros subgrupos. El injerto gH7 de la cadena pesada tiene 4 restos marco donantes (se considera que el resto R28 es parte de CDR-H1 en la definición estructural utilizada en el injerto con CDR (véase Adair y col., (1991), solicitud PCT N° WO91/09967)). Los restos E1 y A71 son restos superficiales próximos a las CDR. El resto 148 es un potencial resto empaquetado. El resto T93 está presente en la interfase Vh/Vl. De estos restos, E1 y A71 se encuentran en otros genes de la línea germinal del subgrupo I humano. El resto 140 se encuentra en el subgrupo 4 de la línea germinal humana, y T73 se encuentra en el subgrupo 3 de la línea germinal humana.
El ADN completo y la secuencia de proteínas de la cadena ligera y la cadena pesada, incluyendo la posición aproximada de los intrones en los genes de la región constante proporcionados por los vectores, se muestran en la Figura 16 y se proporcionan en la SEC ID N°:29 y la SEC ID N°:28, respectivamente, para la cadena ligera y la SEC ID N°: 31 y la SEC ID N°: 30 respectivamente, para la cadena pesada.
El ADN que codificaba estos genes de la cadena ligera y la cadena pesada se escindió de estos vectores. El ADN de la cadena pesada se digirió en el sitio 5' HindIII, se trató a continuación con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli para crear un extremo 5' enromado. La escisión en el sitio 3' EcoRI dio como resultado el fragmento de la cadena pesada, que se purificó a partir de geles de agarosa. De la misma manera, se produjo un fragmento de cadena ligera enromado en el sitio 5' Sful y con un sitio 3' EcoRI. Ambos fragmentos se clonaron en vectores de expresión basados en DHFR y se usaron para generar líneas celulares estables en células CHO.
Ejemplo 3
CONJUGACIÓN DE NAc-GAMMA CALIQUEAMICINA DMH ACBUT CON ANTICUERPO HUMANIZADO DIRIGIDO CONTRA CD22 (G5/44)
En una reacción de conjugación típica, el anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 (G5/44) se conjugó con NAcgamma caliqueamicina DMH AcBut OSu (derivado de caliqueamicina) (véase la Figura 17), en la que la concentración de la proteína diana era de 7,5 mg/ml y la carga del derivado de caliqueamicina diana era del 8,5 por ciento en peso de la proteína. El pH de la reacción diana era de 8,5 más o menos 0,2, y las concentraciones diana de los diferentes componentes de la reacción fueron como sigue: ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(4-butanosulfónico) (HEPBS) 50 mM, decanoato de sodio 37,5 mM, y etanol total en v/v al 9 por ciento. La reacción se llevó a cabo a 33° ± 2°C durante una hora. Los resultados del análisis de esta reacción típica antes de la purificación fueron como sigue: Proteína: 7,34 mg/ml; Carga de caliqueamicina: 82,7 microg/mg; Agregado: 93,25 por ciento; y proteína sin conjugar (LCF): 1,07 (UV área en porcentaje mediante HPLC).
Se ensayó el efecto de diversos aditivos tensioactivos y sus concentraciones sobre el rendimiento y la pureza del producto para determinar su efecto sobre la producción de monómero conjugado (véase la Tabla 2). Las reacciones se desarrollaron cuando todo se mantuvo constante excepto el aditivo y su concentración. Los conjugados producidos a partir de estas reacciones se analizaron para determinar la concentración de proteínas, la carga de caliqueamicina, el contenido de agregados, y la LCF. Aunque todos los ácidos n-carboxílicos en el intervalo de C6 (hexanoato) a C12 (dodecanoato) proporcionaron resultados aceptables, los mejores resultados globales (LCF baja, agregados bajos, y una elevada recuperación de conjugados monoméricos) se obtuvieron con decanoato en un intervalo de concentración de 30 mM a 50 mM.
TABLA 2: EFECTO DE LA IDENTIDAD Y CONCENTRACIÓN DE ADITIVOS SOBRE LOS RESULTADOS DE LA
CONJUGACIÓN
Figure imgf000027_0002
Ejemplo 4
PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA
I. PROCEDIMIENTOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Aunque Butyl Sepharose 4 Fast Flow se ha identificado como el mejor medio HIC para la presente solicitud, se pueden obtener resultados aceptables con ligeras alteraciones en las condiciones cromatográficas utilizando otras resinas tales como Octyl Sepharose Fast Flow, PPG-600C (Tosoh Biosep), Fractogel EMD Propyl (EM Processing) y Source 15ISO (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
El material de partida para la purificación era una mezcla de reacción de conjugación que contenía 7,2 mg/ml de proteína en una carga de derivado de caliqueamicina de 83 pg/mg, con un contenido de agregados de 10,1 % (porcentaje de área mediante HPLC), y un contenido de LCF de 5,6 % (porcentaje de área mediante HPLC).
Tras completarse la reacción de conjugación, la mezcla de reacción se diluyó cuatro veces mediante la adición de una solución de fosfato de potasio a una concentración final de fosfato de 0,7 M (pH 8,2). Tras el mezclado, esta solución se filtró a través de filtros de 0,45 micras. La solución diluida se cargó en una columna Butyl Sepharose 4 Fast Flow. La cantidad total de proteína cargada en la columna fue de 29 mg por ml de volumen de lecho. Tras un lavado con fosfato de potasio 0,7 M, La columna se eluyó utilizando un gradiente en etapa de fosfato de potasio 0,7 M a 4 mM, pH 8,2. Las fracciones eluidas durante el gradiente en etapas se combinaron para el procesamiento adicional, consistiendo el combinado en un conjugado monomérico con menos de un 1 por ciento de área de cada uno de los agregados y LCF. Este combinado se cargó en una columna de desalación Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) para el intercambio de un tampón adecuado para la formulación, consistente en Tris-Cl 20 mM y cloruro de sodio 100 mM a pH 8,0. La preparación de CMC-544 purificada, intercambiada con el tampón tenía las siguientes propiedades: Carga de caliqueamicina: 81 microg/mg; Agregado: 0,4 por ciento (porcentaje de área mediante HPLC) LCF: 0,8 por ciento (porcentaje de área mediante HPLC).
Ejemplo 5
ANÁLISIS DE UNIÓN DE LA NAC-GAMMA CALIQUEAMICINA DMH ACBUT CON EL INMUNOCONJUGADO G5/44 (CMC-544)
El inmunoconjugado del anticuerpo humanizado dirigido contra CD22 (G5/44) con caliqueamicina (CMC-544) generada mediante el procedimiento de conjugación anterior se analizó en un estudio de unión para determinar si el conjugado generado utilizando el procedimiento mejorado tenía algún efecto adverso sobre la unión al antígeno. La Tabla 3 muestra que el procedimiento de conjugación no tiene ningún impacto sobre la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo. El inmunoconjugado CMC-544 preparado mediante el procedimiento de conjugación antiguo o nuevo se unió al antígeno diana con afinidades similares, que no difieren de las del anticuerpo G5/44 sin conjugar.
TABLA 3: AFINIDADES DE UNIÓN DE CMC-544 REALIZADAS UTILIZANDO LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONJUGACIÓN CMA-676 Y CMC-544
Figure imgf000027_0001
Se llevaron a cabo análisis con biosensores utilizando BIAcore 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). CD22mFc se inmovilizó covalentemente sobre el chip biosensor revestido con carboximetil dextrano activado con N hidroxisuccinimida (CM5) utilizando química normalizada de acoplamiento de aminas a una densidad de proteínas de aproximadamente 2000 unidades de resonancia. Las muestras de CMC-544 o G5/44 se diluyeron en tampón HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y polisorbato 20 al 0,005 por ciento (en v/v)) y se inyectó en un intervalo de concentración de 1 a 100 nN sobre la superficie del chip biosensor revestida de CD22mFc a un caudal de 30 microl/min durante 3 min para permitir la unión. Tras la fase de unión, se vigiló la disociación del anticuerpo de unión lavando el chip con el tampón HBS durante un periodo de 15 minutos. Se regeneró la superficie antigénica lavando el chip biosensor con 15 microl del tampón de regeneración (NaOH 10 mM y NaCl 200 mM) durante 30 segundos, seguido por un tiempo de estabilización de 2 minutos antes del siguiente ciclo. Se calcularon las constantes cinéticas mediante análisis no lineal de regresión por mínimos cuadrados utilizando un modelo 1:1 ajustado a la curva de unión de Langmuir y un programa BIAevaluation (versión 3.0, BIAcore). Se evaluó la unión de CMC-544 al antígeno mediante análisis de resonancia de plasmón superficial utilizando CD22mFc inmovilizado covalentemente sobre un chip biosensor. Los resultados del análisis cinético de la unión de CMC-544 y G5/44 a CD22mFc muestran que, Tras ajustar los datos globalmente a un modelo de Langmuir 1:1 con compensación para la transferencia de masas, Tanto CMC-544 como CD22 unido a G544 sin conjugar tuvieron una afinidad similar (CMC-544:CD22 Kd = 200 pM; G5/44:CD22 Kd = 235 pM). La conjugación a la caliqueamicina no afecta a la capacidad de G5/44 de unirse eficazmente a CD22mFc.
Se examinó también la unión de CMC-544 y G5/44 a CD22 expresada sobre la superficie de células de linfoma de linfocitos B mediante citometría de flujo. Se usaron el mAb gemtuzumab dirigido contra CD33 (hP67.6) y su conjugado de caliqueamicina CMA-676 (gemtuzumab ozogamicina) como controles emparejados por isotipo en esta evaluación. Rituximab (Rituxan™), una IgG1 quimérica humana dirigida contra mAb CD20 humano, se usó como control positivo. IgG2 e IgG4 policlonales humanos purificados se usaron también como controles negativos. La unión de CMC-544 y G5/44 a CD22 a Ramos o RL BCL fue similar y distinguible de la de IgG4 policlonal humana. RL BCL mostró una expresión superficial de CD22 menor que en Ramos BCL. Por el contrario, la unión de CMA-676 o de gL1gH7 a cualquiera de bCl fue similar a la de la IgG4 policlonal humana consistente con su ausencia de expresión de CD33 (no se muestran los datos). Las mismas células demostraron una fuerte unión de rituximab dirigido contra CD20 (Rituxan™). A diferencia de hP67.6 y CMA-676, ni CMC-544 ni G5/44 demostraron ninguna unión a células CD22' CD33+ HL-60 de leucemia (no se muestran los datos). Estos resultados sugieren que la conjugación de G5/44 con caliqueamicina no afecta su especificidad antigénica. CMC-544 reconoce específicamente CD22 en linfocitos B humanos, pero no en linfocitos B de murino, rata, can, porcino o primate (macaco y mono Rhesus) (no se muestran los datos).
Ejemplo 6
ANÁLISIS DE LOS EFECTOS IN VITRO E IN VIVO DE CMC-544
I. CITOTOXICIDAD IN VITRO
Se comparó el efecto de CMC-544 utilizando los procedimientos CMA-676 y CMC-544 sobre el crecimiento in vitro de líneas celulares de linfoma de linfocitos B CD22+, RL, Daudi, Raji y Ramos. Se usó un conjugado de caliqueamicina emparejado por isotipo dirigido a CD33 humano (CMA-676) para reflejarlos efectos no específicos de antígeno del conjugado. El uso de N-Ac gamma caliqueamicina DMH sin conjugar (el fármaco liberado a partir del conjugado tras la hidrólisis ácida) en esta evaluación indicó que cada una de estas líneas celulares utilizadas fue sensible a los efectos letales de la caliqueamicina. La Tabla 4 muestra los resultados de estas evaluaciones basados en la equivalencia de la caliqueamicina y la Tabla 5 muestra estos resultados expresados como las concentraciones de las proteínas de los anticuerpos conjugados. La administración mediada por CD22 de caliqueamicina a las células CD22+ fue al menos 10 veces más eficaz en la destrucción de las células diana que el propio fármaco no conjugado. El conjugado del control emparejado por isotipo (CMA-676) mostró citotoxicidad que fue tanto menor como similar con el derivado de caliqueamicina sin conjugar. Resulta evidente de la Tabla 4 que el conjugado preparado mediante el procedimiento de conjugación CMC-544 puede generar un efecto citotóxico equivalente a concentraciones menores de anticuerpos que el conjugado preparado mediante el procedimiento de conjugación CMA-676
TABLA 4: INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO POR LA CALIQUEAMICINA CONJUGADA (Ics0 Pm de la caliqueamicina)
Figure imgf000028_0001
continuación
Figure imgf000029_0001
TABLA 5 INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR EL ANTICUERPO CONJUGADO (IC50 pg/ML DE ANTICUERPO)
Figure imgf000029_0002
Citotoxicidad in vivo. CMC-544 preparado mediante el procedimiento CMC-544 se evaluó adicionalmente en xenoinjertos de linfoma de linfocitos B. En estos estudios se utilizaron dos tumores de linternas de linfocitos B. Linterna RL es una línea de células derivada de NHL no de Burkitt, mientras que RAMOS se derivó originalmente de linfoma de Burkitt. En un experimento representativo que se muestra en la Figura 18, CMC-544 y su homólogo de anticuerpo de murino mostraron ser eficaces en la inhibición, de una manera dependiente de la dosis, del crecimiento de linfocitos B RAMOS.
Se ha mostrado que el conjugado del anticuerpo humanizado es más potente que su homólogo murino. En este estudio, la dosis más baja del conjugado de caliqueamicina que puede producir una inhibición del crecimiento de linfoma significativa era de 10 pg/kg de conjugado de NAc-gamma caliqueamicina DMH. Por el contrario, el anticuerpo sin conjugar, G5/44, a 10 mg/kg administrado por vía intraperitoneal en un calendario similar como conjugado no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral.
Se llevaron a cabo estudios similares utilizando el modelo del linfoma RL. La Tabla 6 muestra los análisis combinados de tres experimentos independientes en los que se evaluaron los efectos antitumorales de CMC-544 en tumores RL NHL estadificados a 300-400 mg de tamaño en ratones lampiños. CMC-544 produjo tumores dependientes de la dosis hasta la regresión en un marco de tiempo de 3 semanas. La dosis mínimamente eficaz de c MC-544 en el modelo de linfoma RL se estableció a partir de análisis estadísticos de estos estudios para ser 20 pg/kg basándose en el contenido en caliqueamicina. No existen muertes en ninguno de estos tres estudios. Dosis mayores (60-320 pg/kg) de CMC-544 produjeron una regresión casi completa del linfoma RL. En su conjunto, los resultados obtenidos con los dos modelos de linfomas de linfocitos B demuestran claramente la capacidad de CMC-544 de producir una regresión tumoral.
TABLA 6: EFECTO ANTITUMORAL DE CMC-544 CONTRA XENOINJERTOS RL NHL EN RATONES LAMPIÑOS
Figure imgf000029_0003
Se ha investigado también la capacidad de CMC-544 realizada mediante el nuevo procedimiento de inhibir el crecimiento de xenoinjertos grandes de linternas de linfocitos B establecidos usando los modelos de linterna RAMOS y RL. Se dejaron crecer los tumores y se estadificaron a 1,5 o 2 g de masa tumoral tras lo cual se administraron CMC-544 o un conjugado del control negativo emparejado por isotipo (CMA-676) por vía intraperitoneal a la dosis de 160 |jg/kg de caliqueamicina conjugada manteniendo el calendario original de dosificación en los días 1, 5 y 9. Se ha mostrado anteriormente que el mismo calendario de dosificación producía una regresión duradera de tumores pequeños estadificados (véase la Tabla 6). Tal como se muestra en la Figura 19, la administración de CMC-544 a ratones que soportan linfomas RAMOS grandes produjo la regresión gradual de la masa de linfoma preexistente y en el día 20, 3 de 4 ratones que soportan tumores estaban exentos de tumores. La vigilancia de estos ratones exentos de tumores no indica ningún recrecimiento del linfoma RAMOS en regresión. Por el contrario, un control emparejado por isotipo, CMA-676, no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral. Cuatro de cinco ratones que soportaban tumores grandes tratados con CMA-676 se sacrificaron antes del día 15 debido a que su carga tumoral alcanzó casi el 15 por ciento de su peso corporal.
Se llevó a cabo un experimento similar utilizando CMC-544 en el modelo de linfoma RL. La administración intraperitoneal de CMC-544 a una dosis 160 jg/kg en un calendario similar al que se ha descrito antes produjo más del 90 por ciento de regresión de la masa preexistente de linfoma RL en 30 días. Sin embargo en el día 45, 2 ratones de este grupo con linfomas reducidos mostraron un recrecimiento de los tumores. Estos resultados indican que CMC-544 puede producir la regresión de linfomas establecidos tanto pequeños como grandes. En un pequeño número de estudios que no se muestran aquí, los linfomas RL que recrecieron esporádicamente tras la regresión inicial inducida por CMC-544 se volvieron a tratar con CMC-544 de nuevo. Estos estudios mostraron que los tumores RL siguieron siendo sensibles al segundo ciclo del tratamiento con CMC-544 y volvieron a experimentar de nuevo regresión. Por tanto, el tratamiento con CMC-544 puede ser eficaz frente a masas pequeñas y grandes de linfomas de linfocitos B con potencial para repetir el tratamiento.
II. COMPARACIÓN IN VIVO DE CONJUGADOS PREPARADOS CON PROCEDIMIENTOS DE CONJUGACIÓN CMA y CMC
La Figura 20 muestra los resultados de un experimento representativo en el que los ratones que soportaban un linfoma estadificado recibieron dos dosis diferentes (80 y 320 jg/kg de caliqueamicina conjugada) de CMC-544 preparadas usando el procedimiento de conjugación CMA-676 y el procedimiento de conjugación CMC-544 utilizando el calendario de dosificación normalizado. La eficacia antitumoral observada fue dependiente de la dosis como se esperaba y no hubo diferencias en las eficacias de cualquiera de las dos preparaciones CMC-544. Por el contrario, La N Acetil-gamma caliqueamicina DMH sin conjugar administrada por vía intraperitoneal a 160 jg/kg fue inactiva. Sin embargo, debe enfatizarse que para cada dosis de la caliqueamicina conjugada, la cantidad de proteína de anticuerpo administrada en la forma de un conjugado fue cuatro veces mayor para CMC-544 preparada mediante el procedimiento CMA-676 frente a la preparada mediante el procedimiento CMC-544. Como el contenido de caliqueamicina del conjugado diana es principalmente responsable de producir el efecto antitumoral, es posible administrar la cantidad requerida de caliqueamicina mediante el conjugado preparado mediante el nuevo procedimiento utilizando cantidades mucho más pequeñas del anticuerpo director. La carga aumentada del conjugado preparado mediante el procedimiento CMC-544 es, en efecto, debida a la ausencia de cantidades significativas de fracción conjugada baja (LCF).
III. TUMORES RESISTENTES AL TRATAMIENTO CON RITUXIMAB (RITUXAN™)
La siguiente cuestión a explorar si cualquiera de los linfomas de linfocitos B que crece después de la finalización del tratamiento con el rituximab (Rituxan™) dirigido contra CD20 comercialmente disponible sigue siendo sensible al tratamiento con CMC-544. Con este fin, linfomas RL en desarrollo (no estadificados) se trataron con rituximab (Rituxan™) durante tres semanas. Siempre que se continuó el tratamiento con rituximab (Rituxan™), se inhibió el crecimiento del linfoma RL. Tras el cese del tratamiento con rituximab (Rituxan™), los linfomas RL crecieron rápidamente hasta el tamaño de 1 masa de 1 g, en cuyo momento se trataron con CMC-544 a la dosis intraperitoneal de 160 jg/Kg. Como se muestra en las Tablas 21 y 22, estos linfomas RL siguieron siendo sensibles a c MC-544 con un 80 % de ratones que llegaron a estar exentos de tumores en el día 60. Por tanto, CMC-544 puede producir la regresión de linfomas de linfocitos B con tres dosis que podrían solo inhibirse mediante la dosificación continua de rituximab (Rituxan™).
Ejemplo 8
EFECTO IN VITRO E IN VITRO DE CMC-544
I. ESTUDIOS DE UNIÓN Y TOXICIDAD
Se evaluó CMC-544 para su unión con CD22 y también para su actividad en modelos in vitro e in vivo. Se comparó también CMC-544 con CMA-676, un conjugado del control emparejado por isotipo de hP67.6 (IgG4) con AcBut unido a caliqueamicina, y a rituximab (Rituxan™), una IgG1 quimérica dirigida contra el mAb CD20, (IDEC Pharmceuticals, San Diego, CA), que está comercialmente disponible y se ha adquirido de Medworld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY). Se utilizaron los siguientes anticuerpos en los estudios del dominio de unión G5/44: BU12 (Celltech, Slough, Reino Unido); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 y To 15 (Dako Corp, Carpintería, Ca ); M6/13 y M5/44 (Celltech, Slough, Reino Unido). Los anticuerpos adicionales utilizados en los estudios de bloqueo fueron SJ10 (Immunotech, Fullerton, CA) y M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1 (Celltech, Slough, Reino Unido). Las líneas celulares para los estudios que incluían la línea Ramos de células de linfoma de Burkitt (CRL-1923) y la línea celular RL de linfoma no de Hodgkin (CRL-2261) (NHL) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Se determinó que las líneas celulares estaban exentas de micoplasmas con un ensayo de detección de micoplasmas mediante reacción en cadena de la polimerasa (ATCC, Manassas, VA). Las líneas celulares se mantuvieron como cultivos en suspensión en medio Rp Mi más FBS al 10 por ciento, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa al 0,2 por ciento, 100 U/ml de penicilina G sodio, y 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina.
Se evaluó si G5/44 puede inhibir o no la unión de los mAb de murino de especificidad conocida para CD22 mediante el análisis BIAcore utilizando Fc-CD22 inmovilizado con el chip BIAcore CM5. Se compararon las unidades de resonancia mediante plasmón superficial (RU) obtenidas con y sin saturación previa de Fc-CD22 inmovilizado con G5/44. Se llevó a cabo el análisis de interacción biomolecular utilizando BIACORe 2000. Los anticuerpos se pasaron sobre una superficie del control blanca (celda de flujo 1, sirve como control, no se acopló la proteína) y la superficie del ensayo de Fc-CD22 (celda de flujo 2) se inmovilizó sobre un chip sensor mediante química de acoplamiento de aminas a un nivel de 9,042 RU. El sensorgrama resultante era la respuesta (RU) sobre la celda de flujo 2 menos la respuesta (RU) sobre la celda de flujo 1. Se obtuvo un segundo sensorgrama saturando en primer lugar las celdas de flujo G5/44 (100 microg/ml) antes de la introducción de los mAB de murino contra CD22 que se habían caracterizado anteriormente para su unión. Inmediatamente tras medir la respuesta a G5/44, los mAb de murino dirigidos contra CD22 se perfundieron individualmente sin eliminar G544. Se registró también la segunda respuesta combinada generada debido a la unión del mAb de murino dirigido contra CD22 con el CD22 revestido con G5/44. Si el anticuerpo de murino se unió a CD22 en los sitios no relacionados con los ocupados por G5/44, entonces las respuestas combinadas serían aditivas. Si la unión de G5/44 con CD22 interfería o evitaba la unión del segundo anticuerpo, entonces las respuestas combinadas no serían aditivas. Cada una de las segundas medidas combinadas se corrigió para la "velocidad de la reacción inversa" de la interacción G5/44 CD22.
G5/44 bloqueó la unión solo de aquellos anticuerpos que se unían al epítopo A / dominio 1 de tipo lg de CD22 (SHCL1 Leu 14 y HD239), indicando que G5/44 se une también en este dominio de CD22. Los anticuerpos que se unen al epítope B / dominio 3 de tipo Ig de CD22 (RFB-4), epítope C / dominio 4 de tipo lg de CD22 (To 15) y dominio 2 de tipo lg 2 de CD22 (4KB128), no se bloquearon por G5/44. Estos resultados indican que el sitio de unión a G5/44 en c D22 se localiza en el primer dominio de tipo Ig ya que evita la unión de aquellos mAb dirigidos contra CD22 que reconocen el primer dominio de tipo Ig de CD22 (epítope A). Otro anticuerpo dirigido contra CD22, M6/13 (Celltech, Slough, Reino Unido), de subespecificidad desconocida se bloqueó también con G5/44 (Cell-tech, Slough, Reino Unido), cartografiando de esta manera el sitio de unión de M6/13 al epítopo A / dominio 1 de tipo Ig de CD22. El anticuerpo M5/44, el precursor murino de G5/44 que tiene la misma especificidad que G5/44, inhibe la unión de G5/44, y sirve como control positivo. El anticuerpo BU12 dirigido contra c D19 sirve como control negativo en estas evaluaciones. Los resultados se resumen en la Tabla 7.
TABLA 7: UNIÓN DE M/AB DIRIGIDO CONTRA CD22 DE MURINO CON ESPECIFICIDADES DEFINIDAS A FC-CD22 PRETRATADO CON G544. RESPUESTA A LA UNIÓN EXPRESADA COMO UNIDADES DE RESONANCIA
MEDIANTE PLASMÓN SUPEFICIAL (RU)
Figure imgf000031_0001
continuación
Figure imgf000032_0001
Usando los mAb de murino de especificidades de unión conocidas para los dominios individuales de CD22, se investigó la capacidad de G5/44 para bloquear la unión de estos anticuerpos a los linfocitos B. Además, se investigó también la capacidad de los mAb para bloquear la unión de G5/44 a los linfocitos B. En estos estudios, 1 x 105 células Ramos se expusieron en primer lugar al anticuerpo dirigido contra CD22 de murino (10 pg/ml de G5/44 humanizado o anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra CD22) durante 1 hora a 40 C antes de la exposición de las células a G5/44 (l0 pg/ml). Las células se incubaron durante 1 hora más a 40 °C. Después de los tratamientos con anticuerpos, los linfocitos B se agruparon y lavaron con PBS-BSA al 1 % y se añadió el anticuerpo secundario adecuado (tanto anticuerpo de cabra-FITC dirigido contra IgG humana (cadena pesada y ligera) o anticuerpo de cabra-FITC dirigido contra IgG de ratón (cadena pesada y ligera)) a 100 pl de una dilución 1:100 en PBS-BSA al 1 por ciento durante 30 minutos a 40 C. Las células se agruparon de nuevo, se lavaron, y se volvieron a suspender en PBS-BSA al 1 por ciento y se añadieron a un tubo que contenía 250 microl de PBS- formaldehido al 1 por ciento. Se midió la intensidad de la fluorescencia asociada con las células mediante citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo BD FACSort.
Los resultados mostraron que la exposición previa de G5/44 a linfocitos B CD22+ dio como resultado una significativa inhibición de la unión posterior de los mAb M5/44 y M6/13 dirigidos contra CD22. Por el contrario, la unión de los mAb RFB4 dirigidos contra CD22, To15, HD239, y 4KB a los linfocitos B no fue inhibida por G5/44. La ausencia de inhibición significativa de la unión de HD239 a los linfocitos B mediante G5/44 como se detectó mediante citometría de flujo fue inesperada, debido especialmente a que el análisis BIAcore indicó que G5/44 puede bloquear la unión de HD239 a CD22. La ausencia de una inhibición fuerte de HD239 por G5/44 puede explicarse basándose en las diferencias en sus afinidades relativas para CD22. Cuando se examinaron los anteriores mAb dirigidos contra CD22 de murino para establecer su capacidad de inhibir la unión de G5/44 a linfocitos B CD22+, SHCL1 y M6/13, pero no de los otros mAb dirigidos contra CD22, inhibió la unión de G5/44. Se han cartografiado los epítopos de unión de HD239 y SHCL1 al primer dominio de tipo Ig de CD22. Sin embargo, no se han cartografiado los epítopos reconocidos por M6/13 o M5/44. Los estudios de bloqueo detallados anteriormente indican que los anticuerpos anteriores reconocen los epítopos localizados en el primer dominio de tipo Ig de CD22, conocidos en su conjunto como epítopo A.
Se incubaron veinte mil células Ramos don diversas dosis de CMC-544 con y sin rituximab (Rituxan™) durante 96 horas. Después de 96 horas, se midió la viabilidad celular medida mediante exclusión con yoduro de propidio y se analizó mediante citometría de flujo. Se calculó la viabilidad promedio de 3 a 6 pocillos y se calculó la inhibición de respuesta a la dosis para los diversos tratamientos. Se calculó la inhibición de respuesta al fondo de la viabilidad celular de una concentración cero de CMC-544. Se usó la regresión logística para ensayar si CMC-544 produjo una inhibición dependiente de la dosis estadísticamente significativa del crecimiento de células Ramos sobre el intervalo de dosis de 0,01 a 3 ng de caliqueamicina DMH/ml. Se usó también la regresión logística para determinar si la interacción de CMC-544 con rituximab (Rituxan™) fue estadísticamente significativa. Se calcularon también las concentraciones (CI50) y se registró solo la eficacia de cada tratamiento con respecto al tratamiento con CMC-544. El análisis se llevó a cabo utilizando el procedimiento PROBIT en SAS versión 8.2.
Los resultados del estudio mostraron que CMC-544 produjo una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento de células Ramos sobre el intervalo de dosis de 0,01 a 3 ng de caliqueamicina DMH/ml. La concentración inhibidora promedio (CI50) de CMC-544 solo fue de 0,029 ng/ml. Se añadieron concentraciones de 2, 20, y 200 pg/ml de rituximab (Rituxan™) a células tratadas con CMC-544 para determinar si la interacción de rituximab (Rituxan™) con la actividad de citotoxicidad de CMC-544 es estadísticamente significativa. Rituximab (Rituxan™), añadido a 20 y 200 pg/ml sin CMC-544, no tuvo efecto significativo sobre el crecimiento celular por sí mismo (111,7 por ciento y 94,0 por ciento de crecimiento del vehículo, respectivamente). En combinación con CMC-544, las tres concentraciones de (Rituxan™) produjeron cambios estadísticamente significativos (p menos de 0,05) hacia la izquierda en la pendiente e interceptan la curva de dosis-respuesta de CMC-544. La combinación con 2 y 200 pg/ml de rituximab produjo los cambios más grandes en las curvas de dosis-respuesta. Estas 2 curvas no fueron estadísticamente diferentes entre sí, pero fueron significativamente diferentes (p menos de 0,05) de la dosis combinada de 20 pg/ml. Un segundo estudio (no se notifican los resultados) confirmó los resultados observados en el primer estudio. Las concentraciones inhibidoras promedio para las combinaciones de 2, 20, y 200 pg/ml de rituximab (Rituxan™) más CMC-544 son 0,0072, 0,0081, y 0,0072 ng/ml, respectivamente. Las concentraciones inhibidoras promedio CMC-544 más rituximab (Rituxan™) son aproximadamente cuatro veces más potentes que la CI50 de CMC-544 solo.
II XENOINJERTOS SUBCUTÁNEOS CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL IN VIVO Y LINFOMAS DE LINFOCITOS B DISEMINADOS SISTÉMICAMENTE EN RATONES SCID
Se administró a ratones lampiños atímicos hembras de 18 -22 g una irradiación corporal total (400 rads). La irradiación suprimió además el sistema inmune de los ratones para potenciar la captación del tumor. Tres días después de la irradiación, se inyectaron a los ratones por vía subcutánea células 107 RL en Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Belford, Ma , diluidas 1:1 en medio RPMI) en el flanco derecho dorsal. Cuando los tumores alcanzaron el tamaño adecuado, (0,3 g, normalmente 21 días después), se administró CMC-544, rituximab (Rituxan™) o tratamiento CHOP (véase a continuación) en solución salina estéril, 0,2 ml/ratón ip. El día inicial de la administración del fármaco se consideró el día 1. Se administraron dos dosis adicionales en los días 5 y 9 (tratamiento = q4Dx3). El tratamiento CHOP consistió en ciclofosfamida (C), (Cytoxan™, Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ) 40 mg/kg ip; HCl de doxorubicina (H), (Sigma-Aldrich, Co., St Louis, MO) 3,3 mg/kg ip; vincristina (O), (GensiaSicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) 0,5 mg/kg ip; y prednisona (P), (Roxane Labs., Columbia, OH) 0,2 mg/kg por vía oral. CHO se administró de acuerdo con el mismo calendario de dosificación que CMC-544 y rituximab (Rituxan™) (q4Dx3) mientras que prednisona se administró por vía oral cada día diferente para 5 dosis (q2Dx5). Los tumores se midieron al menos una vez a la semana y se calcularon como masa tumoral (g) = 0,5 (anchura del tumor/2) (longitud del tumor). Se calcularon las SEM promedio de grupo y se compararon con el grupo tratado con el vehículo para la significancia estadística utilizando test de la T múltiples. Se registraron los promedios de grupo hasta 50 días o hasta que murió cualquier ratón (que perturbó el promedio del grupo) o el tumor creció demasiado grande (mayor de 3,5g) y hubo que someter a eutanasia al ratón. Transcurrido este tiempo, se registró la masa tumoral solo para cada ratón individual en todos los grupos de tratamiento. Se registró también el número de ratones exentos al final de cada grupo de tratamiento del estudio.
Para determinar el efecto de CMC-544 solo o en combinación con otros agentes bioactivos en linfomas diseminados, se usó el modelo de ratón SCID. Ratones SCID machos, (CB17 SCID), de 20-25g, recibieron una inyección con 106 células Ramos a través de la vena de la cola (0,2 ml). 3 o 9 días después de la inyección de células, se administró a los ratones vehículo, conjugados (CMC-544 o CMC-676), o rituximab (Rituxan™), ip, para un total de 3 dosis. El día 3 del calendario de tratamiento, los ratones recibieron una dosis en los días 3, 7, y 11. El día 9 del calendario de tratamiento, los ratones recibieron una dosis en los días 9, 13 y 17. El día 9 del calendario de tratamiento, se administraron también combinaciones de CMC-544 y rituximab (Rituxan™) como se describe a continuación. Se vigiló a los ratones diariamente para la presencia de parálisis en las extremidades inferiores en cuyo momento se sacrificaron. Se usaron de siete a 10 ratones por grupo de tratamiento. El tiempo de supervivencia promedio del grupo (±SD), Se calcularon los tiempos medios, mínimos, y máximos. Se determinó la diferencia en la distribución de supervivencia entre grupos utilizando el test de rango logarítmico no paramétrico con una significancia notificada al nivel de 0,05. Se construyeron las curvas de supervivencia utilizando el procedimiento de Kaplan-Meier.
El estudio inicial examinó el efecto de dos diferentes calendarios de dosificación sobre los tiempos de supervivencia de ratones SCID con el linfoma diseminado. El primer estudio buscó iniciar la dosificación del fármaco 3 días después que se inyectaran las células tumorales por vía intravenosa (modelo de desarrollo), Mientras que el segundo estudio retrasó la dosificación del fármaco hasta 9 días después de la inyección de células (modelo establecido). En cada estudio se administraron 3 dosis de CMC-544 (160 microg/kg), CMA-676 (160 pg/kg), o rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg) ip, con 4 días de separación (Q4Dx3). En el modelo de desarrollo, los ratones tratados con el vehículo tuvieron un tiempo de supervivencia promedio de 27 días (Figura 23, Tabla 8). CMA-676, el control emparejado por isotipo para CMC-544, no aumenta el tiempo de supervivencia significativamente (p mayor de 0,05). CMC-544 aumentó significativamente el tiempo de supervivencia a 41 días mientras que rituximab tuvo un profundo efecto, aumentando el tiempo de supervivencia a más de 125 días (significativamente mayor que CMC-544, p menor de 0,05). La dosificación retardada hasta que las células tumorales tuvieron oportunidad de circular (buscar) y depositarse en los tejidos diana (modelo establecido) cambió los resultados para CMC-544 y rituximab (Rituxan™). De nuevo, CMA-676 no tuvo efecto significativo sobre los tiempos de supervivencia (Figura 24, Tabla 8). Rituximab (Rituxan™) aumentó el tiempo de supervivencia promedio a 62,6 días mientras que CMC-544 aumentó el tiempo de supervivencia promedio a 83,5 días. No hubo diferencia significativa entre los efectos de CMC-544 y rituximab (Rituxan™) en el modelo establecido.
TABLA 8: MEDIDAS DESCRIPTIVAS DE TIEMPOS DE SUPERVIVENCIA
Figure imgf000033_0001
continuación
Figure imgf000034_0001
Se llevó a cabo un estudio preliminar para determinar si rituximab (Rituxan™) tenía algún efecto, tanto positivo como negativo, sobre la respuesta de supervivencia de CMC-544. Se administró CMC-544 (160 pg/kg) con y sin rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg, se marcó la dosis alta de fármaco combinada (HD)). Además, se administraron simultáneamente dosis menores de CMC-544 (80 pg/kg) con dosis menores de rituximab (Rituxan™) (10 mg/kg). Los compuestos no se administran por separado a dosis respectivas de 80 pg/kg o 10 mg/kg debido al número limitado de ratones en el estudio. Esta combinación, CMC-544 (80 pg/kg) con rituximab (Rituxan™) (10 mg/kg), se marcó la dosis media combinada (MD) y se desarrolló para determinar la factibilidad de las dosis combinadas menores de fármacos sobre la supervivencia del ratón SCID. CMC-544 (160 pg/kg) y rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg), administrados en solitario, Se comportaron como se había encontrado en el modelo anterior establecido. Cada tiempo de supervivencia promedio se prolongó a 58,5 y 50,5 días, respectivamente (Figura 25, Tabla 9). En combinación, el tiempo de supervivencia promedio aumentó ligeramente (aunque no fue estadísticamente significativo, p mayor de 0,05) aumentó a 64,4 días para una dosis elevada combinada. La dosis media combinada de 80 pg/kg de c MC-544 y 10 mg/kg de rituximab (Rituxan™) aumentó significativamente (p menor de 0,05 frente al vehículo tratado) el tiempo de supervivencia hasta un promedio de 92,4 días. Estos resultados sugirieron que se garantizaron las dosis combinadas menores de CMC-544 y rituximab (Rituxan™).
TABLA 9: MEDIDAS DESCRIPTIVAS DE TIEMPOS DE SUPERVIVENCIA PARA ESTUDIOS COMBINADOS
INICIALES
Figure imgf000034_0002
Se llevó un estudio combinado adicional con CMC-544 y rituximab (Rituxan™). Se analizaron los siguientes grupos de tratamiento: CMC-544 a 40, 80 y 160 pg/kg; rituximab (Rituxan™) a 5, 10, y 20 mg/kg; y CMC-544 a 40 pg/kg más rituximab (Rituxan™) 5 mg/kg, CMC-544 a 80 pg/kg más rituximab (Rituxan™) 10 mg/kg, y CMC-544 a 160 pg/kg más rituximab (Rituxan™) 20 mg/kg. Todas las dosis de rituximab (Rituxan™) aumentaron ligeramente el tiempo de supervivencia promedio al intervalo de 33 - 40 días, (todas la dosis tenían p menos de 0,05 en comparación con el tiempo de supervivencia promedio tratado con el vehículo de 25,8, Figura 26, Tabla 10). La dosis alta de CMC-544, 160 pg/kg, Aumentó el tiempo de supervivencia promedio a 85 días, consistente con los resultados notificados en los dos estudios iniciales. La combinación de CMC-544 con rituximab (Rituxan™) no mejora significativamente los tiempos de supervivencia (Figura 27, Tabla 10). Las dos dosis menores de CMC-544 (80 y 40 pg/kg) aumentaron cada una significativamente (p menos de 0,05) los tiempos de supervivencia promedio por encima de la dosis alta de CMC-544. Para las dosis de 40 y 80 pg/kg de CMC-544, 90 por ciento y 80 por ciento de los ratones, respectivamente, sobrevivían aún a los 125 días. Ambos grupos combinados de fármacos hicieron que el 100 por ciento de los ratones sobrevivieran hasta el día 125. Dosis menores de CMC-544 son más eficaces que la dosis alta de 160 pg/kg.
Rituximab (Rituxan™), en combinación con CMC-544, no tuvieron un efecto evidente sobre la actividad de CMC-544 en el modelo de linfocitos B diseminados en ratones SCID a las dosis ensayadas (véase anteriormente). Cualquiera de CMC-544, administrado simultáneamente con rituximab (Rituxan™), dio como resultado un aumento o inhibición de la actividad de actividad antitumoral se evaluó también usando el xenoinjerto de linfoma RL B subcutáneo en ratones lampiños Balb/c. En el modelo de linfoma B subcutáneo, los tumores se estadificaron hasta una masa tumoral promedio de 300 mg, después de los cual los dos agentes terapéuticos bajo estudio se administraron IP, CMC-544 se usó a 20 u 80 pg/kg Q4Dx3 con o sin rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg Q4Dx3). La administración simultánea de rituximab (Rituxan™) ni aumentó ni inhibió significativamente (p mayor de 0,05) la eficacia terapéutica de CMC- 544 (Figura 28). Rituximab (Rituxan™), administrados en solitario, inhibieron el crecimiento del linfoma RL B (inhibición del 57 por ciento del crecimiento tumoral en el día 20, p menor de 0,05 frente al vehículo tratado) en este estudio, similar al observado con la dosificación menor de CMC-544.
El régimen quimioterapéutico combinado CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona) es la modalidad de tratamiento más comúnmente utilizada para pacientes con linfoma no de Hodgkin. Se comparó el efecto antitumoral de CHOP con el de CMC-544 en xenoinjertos RL B establecidos. Los componentes individuales del régimen CHOP se utilizaron a sus dosis respectivas máximas toleradas evaluadas en ratones lampiños (no se notifican los datos) y fueron como sigue: Ciclofosfamida (C) 40 mg/kg IP, doxorubicina (H) 3,3 mg/kg IP, vincristina (O) 0,5 mg/kg IP, y prednisona (P) 0,2 mg/kg PO. CHO se administró Q4Dx3 y P se administraron por vía oral, Q2Dx5. CMC-544 se administró IP, Q4Dx3 a una dosificación de 160 microg/kg de equivalentes de caliqueamicina. El tratamiento CHOP produjo inicialmente una inhibición significativa del crecimiento del linfoma RL B (Figura 29). Sin embargo, 3 semanas después, los tumores volvieron a crecer con velocidades de crecimiento similares a las del grupo tratado con vehículo. Por el contrario, el efecto antitumoral de CMC-544 fue completo y prolongado a lo largo del periodo experimental. Estos resultados sugieren que CMC-544, a una dosis significativamente menor que la dosis no letal máxima en ratones lampiños, fue más eficaz que el tratamiento combinado CHOP.
Estos estudios mostraron que rituximab (Rituxan™) añadido a CMC-544 produjo un significativo aumento en la actividad citotóxica de CMC-544 observada con las células Ramos de linfoma B. Se ha notificado recientemente una interacción sinérgica en células Ramos para rituximab (Rituxan™) y los glucocorticoides. Además, se ha observado una inhibición sinérgica del crecimiento en 4 de 8 líneas de células adicionales con rituximab (Rituxan™) cuando se administró en combinación con dexametasona 10 pM.
Rituximab (Rituxan™) por sí mismo, 0,4 a 10 pg/ml, se notificó que producía una inhibición del crecimiento de células Ramos significativa aunque pequeña (máximo del 18 por ciento). Además, fue activo en 6 de 8 líneas celulares de linfoma no de Hodgkin de linfocitos B cuando se incubó a 10 pg/ml (48 h de incubación). Ghetie y col., mostraron que rituximab (Rituxan™), 10 pg/ml, produjo un aumento del 6.2 por ciento en la apoptosis (frente al 3,5 por ciento en las células tratadas con vehículo) tras 24 horas de incubación con células Ramos. En los estudios actuales, rituximab (Rituxan™), a las dosis de 20 y 200 pg/ml no tuvo efecto sobre el crecimiento de las células Ramos cuando se administró solo. En ratones, no hubo evidencia de ninguna interacción entre CMC 544 y rituximab (Rituxan™) tanto en el modelo diseminado como en el modelo de xenoinjerto subcutáneo. Los fármacos combinados ensayados no interfieren con los efectos del resto ni los potencian. Si se reducen las dosis de cada fármaco en el modelo diseminado cambiara esta observación necesaria a determinar.
El modelo de linfoma de linfocitos B diseminados con células Ramos se ha descrito por Flavell y col. Se notificó que los tiempos de supervivencia promedio para los ratones tratados con vehículo eran de 34-36 días. Los ratones desarrollaron parálisis de las extremidades posteriores y progresaron hasta llegar a estar moribundo, muriendo pronto después. El análisis histológico de los órganos rebeló que los órganos implicados más comúnmente eran la glándula adrenal, el bazo y el espacio subaracnoidea. El espacio subaracnoidea infiltrado se extiende frecuentemente en el cerebro. Rituximab (Rituxan™) se comportó correctamente cuando se administró en la fase inicial del procedimiento de la enfermedad para los ratones SCID diseminados (Figura 23), pero lo hizo peor cuando se administró en el día 9 en la fase establecida del modelo (Figura 24). Rituximab (Rituxan®); siendo del isotipo IgG1, trabaja más probablemente a través de los mecanismos efectores del ratón hospedador. Estos mecanismos incluyen la citotoxicidad mediada por complemento y/o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediante el reclutamiento de linfocitos citotóxicos naturales que están presentes en los ratones SCID. Las células tumorales Ramos inyectadas son probablemente más susceptibles inicialmente hacia los mecanismos inmunes del hospedador que se activan mediante rituximab (Rituxan™), antes de que las células tengan una oportunidad de infiltrarse en los órganos afectados. El anticuerpo G5/44 sin conjugar (la molécula directora en CMC-544) no se ha ensayado todavía en el modelo del tumor diseminado en ratones SCID, pero no tiene efecto cuando se administra en xenoinjertos subcutáneos. G5/44, siendo del isotipo IgG4, no se espera que active los mecanismos efectores del hospedador y, por lo tanto, no produciría actividad antitumoral.
La caliqueamicina conjugada con G5/44 (CMC-544) se comportó de manera opuesta a rituximab (Rituxan™), produciendo mejores resultados cuando se administró en la fase establecida de la enfermedad. El motivo para que CMC-544 se comporte mejor en la fase establecida no está claro, pero la fase establecida representa más claramente la situación clínica. CMA-676, el isotipo emparejado del conjugado del control no unido, no tiene ningún efecto significativo sobre los tiempos de supervivencia promedio. Los resultados en el modelo SCID diseminado sugieren claramente que las dosis de CMC-544 deben reducirse para determinar la dosis eficaz máxima (MED). La dosis de 160 pg/kg fue menos activa que las dosis menores de 80 y 40 pg/kg. No es evidente el motivo, pero la dosis de 160 pg/kg puede ser aproximadamente la MED. Se planificaron estudios adicionales para centrarse en este problema.
Mohammad y col., usó el tratamiento CHOP (Ciclofosfamida (C) 40 mg/kg IV, doxorubicina (H) 3,3 mg/kg IV, vincristina (O) 0,5 mg/kg IV, y prednisona (P) 0,2 mg/kg PO) en un modelo de xenoinjertos subcutáneos con una línea celular de linfoma difuso de células grandes, DLCL. Las dosis utilizadas para el tratamiento CHOP para ser su dosis tolerada máxima. El tratamiento con CHO, administrado una vez IV y P, administrado diariamente durante 5 días, se clasificó 'activo', produciendo una T/C de 25,8 por ciento. No se registraron curas de tumores. Los resultados en el modelo descrito por Mohammad y col., parecen similares a los observados con el tratamiento CHOP (administrado IP, Q4Dx3) en el modelo RL descrito en el presente documento. En ningún estudio produjo CHOP curas a largo plazo, A diferencia de CMC-544.
TABLA 10: MEDIDAS DESCRIPTIVAS DEL TIEMPO DE SUPERVIVENCIA PARA ESTUDIOS COMBINADOS
Figure imgf000036_0001
Ejemplo 9
FORMULACIONES ESTABLES DE CMC-544
Se prepararon formulaciones estables de CMC-544 para la administración in vivo añadiendo diluyentes, excipientes, vehículos y estabilizantes. Tras la cromatografía HIC, se evaluaron fracciones cromatográficas mediante SEC-HPLC y análisis UV multilongitud de onda. Se seleccionaron las fracciones adecuadas para la combinación sobre la base de los análisis anteriores, que proporcionaron información sobre el contenido de agregados, la concentración de proteínas, y la carga de caliqueamicina. Se añadieron excipientes, estabilizantes, agentes de volumen y agentes tamponantes para estabilizar la solución. Como CMC-544 puede experimentar degradación mediante numerosas rutas de degradación, necesitan tenerse en cuenta las inestabilidades físicas en el desarrollo de las formulaciones. Una de las principales consideraciones en el desarrollo de las formulaciones es que debe de minimizarse la velocidad de hidrólisis de la caliqueamicina procedente del anticuerpo mientras que debe mantenerse la integridad física y química del anticuerpo dirigido contra CD-22. Además, debe minimizarse la precipitación del conjugado de caliqueamicina-anticuerpo, que se puede producir en determinadas condiciones de pH y concentración.
En el desarrollo de una formulación de un conjugado de derivado-anticuerpo de caliqueamicina monomérica, el pH de la formulación es crítico, ya que minimiza la degradación y la inestabilidad física. Se seleccionó un pH de 8,0 para minimizar la hidrólisis de la caliqueamicina y mantener la solubilidad adecuada del conjugado. Datos adicionales obtenidos utilizando SDS-PAGE y el ELISA de unión a antígeno indicaron que la integridad y especificidad estructural del anticuerpo se mantienen a un pH de 8,0. En consecuencia, se seleccionó trometamina como agente tamponante para mantener un pH de 8,0. Un tampón alternativo podría incluir sodio dibásico o fosfato de potasio. El intervalo de concentración tampón puede ser de 5 a 50 mM. Se ha sugerido un intervalo de pH preferido de 7,5 a 8,5 para una estabilidad/solubilidad óptima. La especificación de pH actual para el producto acabado es de 7,0-9,0. Aunque la estabilidad de las soluciones conjugadas tamponadas es adecuada para la estabilidad a corto plazo, la estabilidad a largo plazo es mala. Se usa la liofilización para aumentar la vida media de los conjugados. Los problemas asociados con la liofilización de una solución de proteínas están bien documentados, y se puede producir la pérdida de la estructura secundaria, teciaria y cuaternaria durante los procedimientos de congelación y secado. La sacarosa se incluye en la formulación por actuar como n estabilizante amorfo del conjugado y para mantener la integridad estructural de la proteína durante la congelación y el secado. Se han usado concentraciones de 1,5-5,0 por ciento en p/v de sacarosa. Además, se puede incorporar un agente de volumen polimérico tal como Dextrano 40 o hidroxietil almidón para potenciar la apariencia y la rigidez física de las tortas liofilizadas a una concentración de 0,5-1,5 por ciento en peso. Estos materiales forman tortas liofilizadas a concentraciones relativamente bajas y se pueden usar para minimizar el contenido total de sólidos de la fórmula liofilizada, permitiendo de esta manera una criodesecación más rápida. Los estudios de formulación han utilizado una concentración de Dextrano 40 de 0,9 por ciento en peso
Se incluye polisorbato 80 en la formulación para aumentar la solubilidad del conjugado. Se utiliza una concentración preferida del 0,01 por ciento con un intervalo potencial de 0,005-0,05 por ciento. Se ha añadido también Tween a la formulación a una concentración de 0,91-0,05 por ciento en volumen.
Puede estar también presente en la fórmula un electrolito y se puede usar para mejorar la eficacia del procedimiento de purificación final. Se usa normalmente cloruro de sodio a una concentración de 0,01 M a 0,1 M. Se pueden usar también electrolitos adicionales tales como sulfato de sodio como un sustituto del cloruro de sodio debido a que pueden liofilizarse más fácilmente. Óptimamente, la solución final de CMC-544 comprende sacarosa al 1,5 por ciento (en peso), Dextrano 40 al 0,9 por ciento (en peso), Tween 80 al 0,01 por ciento, cloruro de sodio 50 mM, polisorbato 80 al 0,01 por ciento (en peso) y trometamina 20 mM.
Se presenta a continuación una fórmula representativa para la solución antes de la liofilización: CMC-5440,5 mg/ml, sacarosa 1,5 por ciento en peso, Dextrano 40 0,9 por ciento en peso, cloruro de sodio 0,05 M, tween 0,01-0,05 por ciento en volumen, polisorbato 80 0,01 por ciento en peso, trometamina 0,02 M, pH 8,0, y agua. La solución se dispensa en viales de color ámbar a una temperatura de 5°C to 10°C, (óptimamente a 5°C); la solución se congela a una temperatura de congelación de -35°C a -50°C, (óptimamente a -45°C); la solución congelada se somete a una etapa de criodesecación inicial a una presión de secado primaria de 20 a 80 micrómetros, (óptimamente a 60 micrómetros); los productos criodesecados se mantienen a una temperatura de almacenamiento de -10 °C a -40°C, (óptimamente a -30°C), durante 24 a 72 horas, (óptimamente durante 60 horas); y finalmente, el producto criodesecado se somete a una etapa de secado secundario de 20-80 micrómetros, (óptimamente a 60 micrómetros) a una temperatura de almacenamiento de 10°C a 35°C, (óptimamente 25°C), durante 15 a 30 horas (óptimamente durante 24 horas). Se usó un ensayo de aumento de presión para determinar la finalización del secado primario. A la conclusión del ciclo de liofilización, los viales se volvieron a llenar con nitrógeno y se cerraron. La Tabla 11 muestra las diferencias en la formulación utilizada para CMC-544 y la formulación utilizada para CMC-676. Las diferencias significativas entre la formulación de CMA-676 y la formulación utilizada para CMC-544 incluyen una concentración reducida de proteínas en la nueva formulación (0,5 mg/ml), el uso de trometamina como tampón y la presencia de tween 80 al 0,01 por ciento.
Estos resultados en el CMC-544 reconstituido en la nueva formulación resultan evidentes al contrario que la turbidez que se observa en la formulación de CMA-676 reconstituida (véanse las Tablas 12 y 13).
TABLA 11: COMPARACIÓN DE LA FORMULACIÓN CMA-676 y DE LA FORMULACIÓN CMC-544 PARA CMC-544
Figure imgf000037_0002
TABLA 12: OBSERVACIONES DE ESTABILIDAD Y FISICOQUIMICAS DE LAS FORMULACIONES DE CMA-676 Y CMC-544 LIOFILIZADAS Y ALMACENADAS A 5°C.
Figure imgf000037_0001
continuación
Figure imgf000038_0001
TABLA 13: OBSERVACIONES DE ESTABILIDAD Y FISICOQUIMICAS DE LA FORMULACION DE CMA-676 Y
CMC-544 LIOFILIZADA Y ALMACENADA A 25°C
Figure imgf000038_0002
Bibliografía
1. G. Kohler y Milstein, C., Nature, 256:495 (1975).
2. T. G. Hose y Blair, A.H. CRC Critical Rev. Drug Carrier Systems 3:263 (1987).
3. Patente de los Estados Unidos N° 5.877.296
4. Patente de los Estados Unidos N° 5.773.001
5. Patente de los Estados Unidos N° 5.714.586
6. Patente de los Estados Unidos N° 5.712.374
7. Patente de los Estados Unidos N° 5.053.394
8. J. Tramontano; y col., J. Mol. Recognit. 7:9 (1994).
9. H. McConnell y Hoess, J., J. Mol. Biol. 250:460 (1995).
10. Nord y col., Nat Biotechnol. 15:772 (1997).
11. Nord y col., Protein Eng. 8:601 (1995).
12. Ku y Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:6552 (1995).
13. Markand y col., Biochemistry 35:8045 (1996).
14. Markand y col., Biochemistry 35:8098 (1996).
15. Rottgen y Collins, Gene 164:243 (1995).
16. Wang y col, J. Biol. Chem., 270:12250 (1995).
17. I.D. Bernstein y col., J. Clin. Invest. 79:1153 (1987).
18. I.D. Bernstein y col., J. Immunol. 128:867-881 (1992).
19. Kabat y col. Seqencing of Proteins of Immunological Interest, 1:310-334 (1994).
20. Publicación PCT WO 91/09967.
21. Yang y col., J. Mol. Biol., 254, 392-403 (1995).
22. Low y col., J. Mol. Biol., 250, 359-368 (1996).
23. Patten y col., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, (1997).
24. Thompson y col., J. Mol. Biol., 256, 77-88, (1996).
25. Crameri y col., Nature, 391, 288-291, (1998).
26. Patente de los Estados Unidos N° 4.671.958
27. Patente de los Estados Unidos N° 4.970.198
28. Patente de los Estados Unidos N° 5.037.651
29. Patente de los Estados Unidos N° 5, 079, 233
30. Patente de los Estados Unidos N° 5.877.296
31. Publicación PCT N° WO 98/20734
32. Trail P y Bianchi A., Current Opin. Immunol., 11:584-588, (1999).
33. Dubowchik G, y Walker M., Pharmacol. & Therapeutics, 83:67-123 (1999).
34. Bross P.F., Beitz J., Chen G., Chen X.H., Duffy E., Keiffer-Bross P., Beitz J., Chen G., Chen X., Duffy E., Kieffer L., Roy S., Sridhara R., Rahman A., Williams G., Pazdur R., Clin. Cancer Res., 7:1490-1496 (2001). 35. Berger M., Leopold L., Dowell J., Korth-Bradley J., Sherman M., Invest. New Drugs; 20: 395-406 (2002). 36. Slevers E., Larson R., Stadmauer E., Estey E., Lowenberg B., Dombret H., Karanes C., Theobald M., Benn et J., Sherman M., y col., J. Clin. Oncol.; 19:3244-3254 (2001).
37. Larson R., Boogaerts M., Estey E., Karanes C., Stadtmauer E., Sievers E., Mineur P., Bennett J., Berger M., Eten C. y col. Leukemia; 16:1627-1636 (2002).
38. Hamann P., Hinman L., Beyer C., Kindh D., Upeslacis J., Flowers D., Bernstein I., Choice of Linker. Bioconj. Chem.; 13:40-46 (2002).
39. Hamann P., Hinman L., Hollander I., Beyer C., Lindh D., Holcomb R., Hallet W., Tsou H., Upeslacis J., Shochat D., y col., Bioconj. Chem.; 13:47-58 (2002).
40. Lee M., Dunne T., Chang C., Siegal M., Morton G., Ellestad G., McGahren W., Borders D., J. Am. Chem. Soc.
1992; 114:985-987 (1992).
41. Zein N., Sinha A., McGahren W., Ellestad G., Science; 240:1198-1201 (1988).
42. Thorson J., Sievers E., Ahlert J., Shepard E., Whitwam R., Onwueme K., Ruppen M., Current Pharmaceut. Design; 6:1841-1879 (2000).
43. Andrews R., Singer J., Bernstein I., J. Exp. Med.; 169:1721-1731 (1989).
44. Kreitman R.J., Current Pharmaceut. Biotech.; 2:313-325 (2001).
45. Pastan I., Kreitman R.J., Current Opin. Investig. Drugs, 3(7):1089-1091 (2002).
46. Kreitman R.J., Curr. Opln. Mol. Ther. ; 5:44-551 (2003).
47. Crocker P.R. y Varki A. Siglecs, Trends in Immunol.; 22:337-342 (2001).
48. Hursey M., Newton D.L., Hansen H.J., Ruby D., Goldenberg D.M., Rybak S.M., Leukemia and Lymphoma; 43:953-959 (2002).
49. Nitschke L., Floyd H., y Crocker P.R., Scand. J. Immunol.; 53:227-234 (2001).
50. Moyron-Quiroz J.E., Partida-Sanchez S., Donis-Hernandez R., Sandoval-Montes C. y Santos-Argumedo L., Scand. J. Immunol.; 55:343-351 (2002).
51. Tedder T.F., Tuscano J., Sato S., Kehrl J.H., Ann. Rev. Immunol.; 15:481-504 (1997).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un conjugado de fármaco, en el que dicho conjugado de fármaco comprende derivados de caliqueamicina y un anticuerpo dirigido contra CD22 y tiene la fórmula:
Figure imgf000061_0001
en la que el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, los restos 50-66 de la SEQ ID NO: 27 para CDR-H2, la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3, la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que n es (i) 1, 2, 3, 4, 5 o (ii) 3 a 9, o (iii) en la que la carga de fármaco es 4 - 10 % en peso de fármaco citotóxico.
3. La composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición es menos del 10 % en peso de anticuerpo no conjugado.
4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende una región variable de cadena ligera tal como se establece en la SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada tal como se establece en la SEQ ID NO: 27.
5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende una cadena ligera que consiste en los restos 21 a 239 de la SEQ ID NO: 28 y una cadena pesada que consiste en los restos 20 a 466 de la SEQ ID NO: 30, y en la que el anticuerpo se expresa en una célula de mamífero.
6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que es resultado de la expresión de la SEQ ID NO: 29 en una célula de mamífero y una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que es resultado de la expresión de la SEQ ID NO: 31 en una célula de mamífero.
7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región marco de cadena pesada que comprende restos donadores en las posiciones 1, 28, 48, 72 y 97 de la SEQ ID NO: 8 ocupados por Glu, Arg, Ile, Ala y Thr, respectivamente, en la que el resto de la región marco de la cadena pesada está ocupado por los correspondientes restos del marco aceptor humano de las SEQ ID NO: 21 o 22.
8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región marco de cadena pesada que comprende restos de donador en las posiciones 1, 28, 48, 68, 70, 72 y 97 de la SEQ ID NO: 8 ocupados por Glu, Arg, Ile, Ala, Leu, Ala y Thr, respectivamente, en la que el resto de la región marco de la cadena pesada está ocupado por los correspondientes restos del marco aceptor humano de las SEQ ID NO: 21 o 22.
9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región marco de cadena ligera que comprende restos de donador en las posiciones 2, 4, 42, 43, 50 y 65 de la SEQ ID NO: 7 ocupados por Val, Val, Leu, His, Gln y Asp, respectivamente, en la que el resto de la región marco de la cadena pesada está ocupado por los correspondientes restos del marco aceptor humano de las SEQ ID NO: 17 o 18.
10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo dirigido contra CD22 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región marco que comprende restos de donador en las posiciones 2, 3, 4, 42, 43, 50 y 65 de la SEQ ID NO: 7 ocupados por Val, Val, Val, Leu, His, Gln y Asp, respectivamente, en el que el resto de la región marco de cadena ligera está ocupado por los correspondientes restos del marco aceptor humano de las SEQ ID NO: 17 o 18.
11. Una composición farmacéutica que comprende la composición de cualquier reivindicación anterior y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. La composición de cualquier reivindicación anterior o composición farmacéutica según la reivindicación 11 que está liofilizada.
ES16180729T 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina Expired - Lifetime ES2916174T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37744002P 2002-05-02 2002-05-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2916174T3 true ES2916174T3 (es) 2022-06-28

Family

ID=29401497

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03724432.4T Expired - Lifetime ES2593304T3 (es) 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
ES11157981.9T Expired - Lifetime ES2545745T3 (es) 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
ES16180729T Expired - Lifetime ES2916174T3 (es) 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03724432.4T Expired - Lifetime ES2593304T3 (es) 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
ES11157981.9T Expired - Lifetime ES2545745T3 (es) 2002-05-02 2003-05-02 Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina

Country Status (34)

Country Link
US (6) US8153768B2 (es)
EP (3) EP1507556B1 (es)
JP (5) JP5153057B2 (es)
KR (2) KR101062628B1 (es)
CN (1) CN100482277C (es)
AU (2) AU2003231293A1 (es)
BE (1) BE2017C049I2 (es)
BR (3) BRPI0309868B8 (es)
CA (2) CA2483552A1 (es)
CR (3) CR7557A (es)
CY (4) CY1116634T1 (es)
DK (3) DK3127553T3 (es)
EC (1) ECSP045445A (es)
ES (3) ES2593304T3 (es)
FR (1) FR17C1054I2 (es)
HK (2) HK1070825A1 (es)
HU (4) HUE030806T2 (es)
IL (2) IL164946A (es)
LT (3) LT1507556T (es)
LU (1) LUC00044I2 (es)
MX (1) MXPA04010792A (es)
NL (1) NL300903I2 (es)
NO (3) NO339730B1 (es)
NZ (2) NZ586071A (es)
PH (2) PH12013501158B1 (es)
PL (5) PL228741B1 (es)
PT (3) PT3127553T (es)
RU (3) RU2422157C3 (es)
SG (3) SG187991A1 (es)
SI (3) SI1507556T1 (es)
TW (2) TWI438010B (es)
UA (1) UA88599C2 (es)
WO (1) WO2003092623A2 (es)
ZA (2) ZA200409752B (es)

Families Citing this family (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6905669B2 (en) 2001-04-24 2005-06-14 Supergen, Inc. Compositions and methods for reestablishing gene transcription through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase
US20110045005A1 (en) * 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
LT1507556T (lt) 2002-05-02 2016-10-10 Wyeth Holdings Llc Kalicheamicino darinio ir nešiklio konjugatai
AR048098A1 (es) * 2004-03-15 2006-03-29 Wyeth Corp Conjugados de caliqueamicina
JP5470597B2 (ja) * 2004-05-26 2014-04-16 国立大学法人 香川大学 希少糖ｄ−アロースを利用した細胞・組織・臓器保存液及び該液を用いる保存方法
TW200621282A (en) * 2004-08-13 2006-07-01 Wyeth Corp Stabilizing formulations
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
TWI364458B (en) 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
US20060045877A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
GT200500255A (es) * 2004-09-10 2006-04-10 Anticuerpos anti-5ta humanizados y conjugados anticuerpo anti-5ta/calicheamicina
EP1661584A1 (en) * 2004-11-26 2006-05-31 Heinz Dr. Faulstich Use of conjugates of amatoxins and phallotoxins with macromolecules for cancer and inflammation therapy
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US7250416B2 (en) 2005-03-11 2007-07-31 Supergen, Inc. Azacytosine analogs and derivatives
US20070003559A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Wyeth Methods of determining pharmacokinetics of targeted therapies
RU2433822C2 (ru) 2005-08-16 2011-11-20 Синта Фармасьютиклз Корп. Композиция бис(тио-гидразид амида)
ES2533992T3 (es) 2005-08-24 2015-04-16 Immunogen, Inc. Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpo maitansinoide
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
US9393215B2 (en) 2005-12-02 2016-07-19 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
US20070160577A1 (en) * 2005-12-06 2007-07-12 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
NZ571208A (en) 2006-03-10 2011-12-22 Wyeth Corp Anti-5T4 antibodies and uses thereof
ES2371085T3 (es) * 2006-05-27 2011-12-27 Faulstich, Heinz, Dr. Utilización de conjugados de amatoxinas o falotoxinas con macromoléculas para la terapia tumoral y de la inflamación.
CN101541950A (zh) 2006-07-13 2009-09-23 惠氏公司 糖蛋白的产生
JP2010501562A (ja) 2006-08-21 2010-01-21 シンタ ファーマシューティカルズ コーポレーション 増殖性障害を治療するための化合物
KR20090069330A (ko) * 2006-10-12 2009-06-30 와이어쓰 유백광/응집체를 감소시키기 위한 항체 용액 중의 이온 강도의 변화
MX2009004519A (es) 2006-11-03 2009-05-12 Wyeth Corp Sustancias que inhiben la glucolisis en un cultivo de celulas.
BRPI0717902A2 (pt) 2006-12-01 2013-10-29 Medarex Inc "anticorpo monoclonal humano isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceria, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para prepar um anticorpo anti-cd22, método para inibir o desenvolvimento de uma célula tumoral que expressa cd22 e método para tratar uma doença inflamatória ou autoimuneem um indivíduo"
CA2671900A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 The Regents Of The University Of California Macromolecular conjugates of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein inhibitors and uses thereof
JP2010516678A (ja) * 2007-01-16 2010-05-20 ワイス エルエルシー Ｔｒｅｍ−１による炎症治療、検出およびモニタリング
DK2115126T3 (en) * 2007-03-02 2015-05-04 Wyeth Llc Use of copper and glutamate in cell culture for the preparation of polypeptides
CN102558001B (zh) 2007-05-22 2015-09-23 惠氏有限责任公司 制造酰肼的改良方法
PE20090309A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-18 Wyeth Corp Conjugado portador-caliqueamicina y un metodo de deteccion de caliqueamicina
EP2211904B1 (en) * 2007-10-19 2016-08-17 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
BRPI0819593A2 (pt) * 2007-12-21 2015-05-05 Genentech Inc "método para tratamento de um paciente com artrite reumatóide (ra)"
DK2242772T3 (en) * 2007-12-26 2015-01-05 Biotest Ag Immunoconjugates that targets CD138, and uses thereof
CN101952315B (zh) * 2007-12-26 2015-04-01 生物测试股份公司 靶向cd138的试剂及其应用
EP2238169A1 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
CA2710483C (en) * 2007-12-26 2018-05-08 Biotest Ag Methods and agents for improving targeting of cd138 expressing tumor cells
US20090186026A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Wyeth Ephrin and eph receptor agonists for modulation of bone formation and resorption
US8591889B2 (en) * 2008-04-04 2013-11-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for CD22
FR2930443B1 (fr) * 2008-04-29 2010-06-25 Oreal Produit extemporane de soin a base d'un lyophilisat de microorganisme et de tensioactif(s) de hlb superieur ou egal a 12
KR20230003298A (ko) 2008-04-30 2023-01-05 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
KR102444399B1 (ko) * 2009-06-03 2022-09-16 이뮤노젠 아이엔씨 메이탄시노이드의 제조방법
US20130012916A1 (en) * 2010-02-11 2013-01-10 Glide Pharmaceutical Technologies Limited Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012023085A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Wyeth Llc Cell culture of growth factor-free adapted cells
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
WO2012065161A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Scott & White Healthcare Antibodies to tumor endothelial marker 8
US8512679B2 (en) * 2011-03-04 2013-08-20 Elwha Llc Glassy compositions
UA116524C2 (uk) 2011-03-29 2018-04-10 Іммуноджен, Інк. Спосіб одержання кон'югата антитіло-майтансиноїд
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
KR102004559B1 (ko) 2011-08-30 2019-07-26 아스텍스 파마수티컬스, 인크. 데시타빈 유도체 제제
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
KR20170021919A (ko) 2011-10-21 2017-02-28 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
RU2632108C2 (ru) 2011-12-08 2017-10-02 Биотест Аг Применения иммуноконъюгатов, мишенью которых является cd138
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
US8883979B2 (en) 2012-08-31 2014-11-11 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
RU2661083C2 (ru) 2012-10-04 2018-07-11 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
JP6133431B2 (ja) 2012-11-24 2017-05-24 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 親水性連結体及び薬物分子と細胞結合分子との共役反応における親水性連結体の使用
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
SG11201504887TA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
AR096184A1 (es) * 2013-05-02 2015-12-16 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de un anticuerpo para cd20 afucosilado con un conjugado de anticuerpos para cd22-fármaco
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
JP6494240B2 (ja) * 2013-11-04 2019-04-03 ファイザー・インク カリケアマイシン誘導体を合成するための中間体および方法
KR20160072268A (ko) 2013-11-04 2016-06-22 화이자 인코포레이티드 항-efna4 항체-약물 접합체
US10464955B2 (en) 2014-02-28 2019-11-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Charged linkers and their uses for conjugation
WO2015140708A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Pfizer Inc. Method of cell culture
CN106661124A (zh) 2014-06-20 2017-05-10 荷商台医(有限合伙)公司 抗叶酸受体α(FRA)抗体‑药物缀合物及其使用方法
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
US9925281B2 (en) 2014-08-05 2018-03-27 Case Western Reserve University Coated plant virus imaging agents
CN107001428B (zh) 2014-11-07 2023-01-10 卡斯西部储备大学 使用病毒颗粒的癌症免疫疗法
EP3280454A1 (en) 2015-04-07 2018-02-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanoparticle immunoconjugates
TW201713363A (zh) * 2015-04-21 2017-04-16 史坦森特瑞斯公司 卡奇黴素構建體及使用方法
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
US10624975B2 (en) 2015-06-29 2020-04-21 Case Western Reserve University Anticancer drug-containing plant virus particles
JP6768722B2 (ja) 2015-07-02 2020-10-14 大塚製薬株式会社 凍結乾燥医薬組成物
AU2015242213A1 (en) 2015-07-12 2018-03-08 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Bridge linkers for conjugation of cell-binding molecules
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
EP3725332B1 (en) * 2015-07-16 2023-10-04 Case Western Reserve University Plant virus particles for delivery of antimitotic agents
WO2017051347A2 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Pfizer Inc. Cells and method of cell culture
CN108350416A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 百时美施贵宝公司 操纵在cho细胞中产生的多肽的品质属性的方法
EP3400239B1 (en) 2016-01-08 2021-06-02 AltruBio Inc. Tetravalent anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
WO2017172907A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Sorrento Therapeutics, Inc. Calicheamicin antibody drug conjugates linking an amidoacetyl group to a sugar moiety on calicheamicin
IL261999B2 (en) 2016-04-05 2023-04-01 Pfizer Cell culture process
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
GB201610512D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
EP3487527A4 (en) 2016-07-21 2020-03-11 Case Western Reserve University PARTICLES OF VEGETABLE OR VIRAL-LIKE PARTICLES
CA3042695A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Case Western Reserve University Melt processed viral nanoparticle constructs
KR20220147720A (ko) 2016-11-14 2022-11-03 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
US11590183B2 (en) 2017-03-10 2023-02-28 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
CA3056182A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Pfizer Inc. Tyrosine prototrophy
JP7090347B2 (ja) 2017-05-12 2022-06-24 ハープーン セラピューティクス，インク． メソテリン結合タンパク質
WO2018213587A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Case Western Reserve University Anticancer trail-targeted plant virus particles
BR112020002280A2 (pt) 2017-08-03 2020-07-28 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. composto farmacológico e métodos purificação do mesmo
CN111868223A (zh) 2017-09-15 2020-10-30 百时美施贵宝公司 大规模生产目的多肽过程中的在线生物质电容监测
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
WO2019084555A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Case Western Reserve University TYMOVIRUS VIRUSES AND VIRAL TYPE PARTICLES USEFUL AS NANOVECTORS FOR IMAGING AND THERAPEUTIC AGENTS
KR20200133240A (ko) 2018-03-16 2020-11-26 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질 생산 동안의 대사 효소 활성 및 디술피드 결합 환원
CN110507824A (zh) * 2018-05-21 2019-11-29 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种抗间皮素抗体及其抗体药物缀合物
MA51453A (fr) * 2018-05-30 2020-09-23 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugués anticorps anti-sez6-médicaments et procédés d'utilisation
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
WO2020106886A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Cornell University Macrocyclic complexes of radionuclides and their use in radiotherapy of cancer
US20220073942A1 (en) 2018-12-06 2022-03-10 Pfizer Inc. Cells with reduced inhibitor production and methods of use thereof
CA3133155A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Fundacio Privada Institut D'investigacio Oncologica De Vall Hebron Combination therapy for the treatment for cancer
US11390853B2 (en) 2019-04-26 2022-07-19 Case Western Reserve University Freeze dried viral nanoparticle constructs
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US11896676B2 (en) 2019-08-07 2024-02-13 Case Western Reserve University Targeting cancer cells and tissue using filamentous plant virus particles
EP4069312A4 (en) * 2019-12-04 2024-03-27 Univ New York State Res Found COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING OFF-TARGET TOXICITY OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATES
KR20230035576A (ko) 2020-07-07 2023-03-14 비온테크 에스이 Hpv 양성 암 치료용 rna
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
CN112724263B (zh) * 2021-04-02 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 改造抗cd20单克隆抗体以提高其药物疗效的方法及其应用
KR20240046323A (ko) 2021-07-13 2024-04-08 비온테크 에스이 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023148598A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Pfizer Inc. Cysteine prototrophy
WO2024058201A1 (ja) * 2022-09-16 2024-03-21 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット
WO2024089013A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Peptomyc, S.L. Combination therapy for the treatment of cancer

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4771128A (en) * 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5134075A (en) 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1992000311A1 (en) 1990-06-27 1992-01-09 Princeton University Probes for detecting mutant p53
CZ282603B6 (cs) 1991-03-06 1997-08-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G Humanizované a chimerické monoklonální protilátky
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5686072A (en) 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5484892A (en) * 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US6310185B1 (en) 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
AU3272695A (en) 1994-08-12 1996-03-07 Immunomedics Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
JP2002503943A (ja) 1994-08-12 2002-02-05 ミリアド・ジェネティックス・インコーポレイテッド １７ｑ−連鎖乳癌および卵巣癌感受性遺伝子におけるイン・ビボ突然変異および多形性
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US20020141990A1 (en) 1996-11-01 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Anti-RSV human monoclonal antibodies
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
ES2300122T3 (es) 1997-03-20 2008-06-01 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of Department Of Health And Human Services Anticuerpos recombinantes e inmunoconjugados dirigidos contra celulas y tumores portadores de cd-22.
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
AT408613B (de) * 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
US6183477B1 (en) * 1998-09-04 2001-02-06 Smith & Nephew, Inc. Attachment tool for drill guide
KR100345463B1 (ko) 1998-11-19 2003-01-08 주)녹십자 B형간염바이러스의표면항원프리-s1에대한인간화항체및이의제조방법
JP2000226336A (ja) * 1998-11-30 2000-08-15 Sankyo Co Ltd 免疫グロブリン製剤
EP2154535A1 (en) 1998-12-10 2010-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
ES2331644T3 (es) 1999-06-09 2010-01-12 Immunomedics, Inc. Inmunoterapia de trastornos autoinmunes usando anticuerpos cuya diana son celulas b.
WO2001012653A1 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Novo Nordisk A/S Stabilisation of freeze-dried cake
IL149062A0 (en) 1999-10-12 2002-11-10 Connex Ges Zur Optimierungvon Improved method for detecting acid resistant microorganisms in the stool
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
LT1507556T (lt) 2002-05-02 2016-10-10 Wyeth Holdings Llc Kalicheamicino darinio ir nešiklio konjugatai
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0309868B1 (pt) 2020-04-28
PL224150B1 (pl) 2016-11-30
LUC00044I2 (es) 2018-02-26
CN100482277C (zh) 2009-04-29
PH12013501158A1 (en) 2015-11-09
PL224001B1 (pl) 2016-11-30
LUC00044I1 (es) 2017-11-03
JP2015061875A (ja) 2015-04-02
PL222725B1 (pl) 2016-08-31
KR101062628B1 (ko) 2011-09-07
JP5441971B2 (ja) 2014-03-12
SI2371392T1 (sl) 2015-10-30
DK2371392T3 (en) 2015-08-31
SI1507556T1 (sl) 2016-10-28
CN1665532A (zh) 2005-09-07
WO2003092623A2 (en) 2003-11-13
HUE057124T4 (hu) 2022-02-28
LTPA2017036I1 (lt) 2017-11-27
CA2483552A1 (en) 2003-11-13
PT3127553T (pt) 2022-01-24
US8153768B2 (en) 2012-04-10
US20040192900A1 (en) 2004-09-30
JP2013163678A (ja) 2013-08-22
FR17C1054I1 (es) 2018-01-12
CY1116634T1 (el) 2017-03-15
NZ586071A (en) 2012-02-24
MXPA04010792A (es) 2005-03-07
US9351986B2 (en) 2016-05-31
US8835611B2 (en) 2014-09-16
PH12013501159B1 (en) 2015-12-02
RU2602878C3 (ru) 2021-11-24
BRPI0309868B8 (pt) 2021-05-25
NO344509B1 (no) 2020-01-20
ECSP045445A (es) 2005-01-28
JP2017105801A (ja) 2017-06-15
LT1507556T (lt) 2016-10-10
AU2003231293A1 (en) 2003-11-17
SG10201700289RA (en) 2017-02-27
RU2422157C2 (ru) 2011-06-27
CR20120364A (es) 2012-10-05
PL224844B1 (pl) 2017-02-28
SI3127553T1 (sl) 2022-02-28
CR7557A (es) 2008-10-03
NL300903I2 (nl) 2018-02-08
AU2009202609A1 (en) 2009-07-16
RU2016141576A3 (es) 2018-05-03
ZA201003874B (en) 2019-12-18
US20180339058A1 (en) 2018-11-29
US20140235835A1 (en) 2014-08-21
CY2017035I2 (el) 2018-04-04
BR122019027966B1 (pt) 2020-11-17
LTC2371392I2 (lt) 2019-03-25
BR122019027966B8 (pt) 2021-07-27
KR20110050753A (ko) 2011-05-16
PL413302A1 (pl) 2016-05-23
JP5756489B2 (ja) 2015-07-29
NO20044663L (no) 2005-01-25
EP2371392B1 (en) 2015-07-08
UA88599C2 (ru) 2009-11-10
DK3127553T3 (da) 2022-01-31
EP1507556B1 (en) 2016-07-27
PT2371392E (pt) 2015-10-07
EP3127553B1 (en) 2021-12-01
SG165158A1 (en) 2010-10-28
NZ573563A (en) 2010-10-29
NO20161431A1 (no) 2005-01-25
ES2593304T3 (es) 2016-12-07
RU2011108928A (ru) 2012-09-20
TWI438010B (zh) 2014-05-21
CA2871117A1 (en) 2003-11-13
JP2005524700A (ja) 2005-08-18
CR20130390A (es) 2013-11-08
TW200404005A (en) 2004-03-16
PT1507556T (pt) 2016-09-28
TWI379693B (en) 2012-12-21
US8747857B2 (en) 2014-06-10
PL228741B1 (pl) 2018-05-30
CY1124900T1 (el) 2023-01-05
PL410219A1 (pl) 2015-03-30
RU2678818C2 (ru) 2019-02-04
ZA200409752B (en) 2010-08-25
PH12013501158B1 (en) 2015-11-09
EP3127553A1 (en) 2017-02-08
HUS1700038I1 (hu) 2017-11-28
PL410218A1 (pl) 2015-03-30
EP1507556A4 (en) 2009-01-07
HUE027590T2 (hu) 2016-11-28
PH12013501159A1 (en) 2015-12-02
HK1070825A1 (zh) 2005-06-30
JP5153057B2 (ja) 2013-02-27
RU2602878C2 (ru) 2016-11-20
BR0309868A (pt) 2005-10-18
US20160303252A1 (en) 2016-10-20
KR101125524B1 (ko) 2012-03-22
NO339730B1 (no) 2017-01-23
NO2017061I1 (no) 2017-11-21
ES2545745T3 (es) 2015-09-15
KR20050006220A (ko) 2005-01-15
IL164946A0 (en) 2005-12-18
IL230659A (en) 2016-02-29
HUE030806T2 (hu) 2017-05-29
US20040082764A1 (en) 2004-04-29
FR17C1054I2 (fr) 2019-01-11
EP1507556A2 (en) 2005-02-23
BR122019027974B1 (pt) 2022-06-14
TW201231089A (en) 2012-08-01
IL164946A (en) 2015-06-30
IL230659A0 (en) 2014-03-31
DK1507556T3 (en) 2016-09-12
EP2371392A1 (en) 2011-10-05
LT3127553T (lt) 2022-04-11
RU2016141576A (ru) 2018-05-03
JP2012051900A (ja) 2012-03-15
WO2003092623A3 (en) 2004-03-18
PL374523A1 (en) 2005-10-31
JP6872376B2 (ja) 2021-05-19
SG187991A1 (en) 2013-03-28
HUE057124T2 (hu) 2022-04-28
BE2017C049I2 (es) 2022-08-09
AU2009202609B2 (en) 2012-07-26
RU2004135101A (ru) 2005-06-27
HK1162926A1 (en) 2012-09-07
CY1117973T1 (el) 2017-05-17
PL411824A1 (pl) 2015-08-17
RU2422157C3 (ru) 2021-04-23
US20120213804A1 (en) 2012-08-23
CY2017035I1 (el) 2018-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2916174T3 (es) Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
AU2017204487B2 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates
AU2012244218C1 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates