KR20090069330A - 유백광/응집체를 감소시키기 위한 항체 용액 중의 이온 강도의 변화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 제제의 이온 강도를 변화시킴으로써 단백질 제제의 유백광 외관(opalescent appearance)을 감소시키는 방법; 및 저하된 유백광(opalescence)을 갖는 농축된 단백질의 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선택된 단계에서 염 농도를 모니터링하고/하거나 감소시키는 정제 방법에 관한 것이다.

유백광 외관, 단백질, 이온 강도

Description

유백광/응집체를 감소시키기 위한 항체 용액 중의 이온 강도의 변화 {Modification of ionic strength in antibody-solutions to reduce opalescence／aggregates}

[관련 출원에 대한 상호참조]

2006년 10월 12일자로 출원된 미국 특허원 제60/851,651호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다.

본 발명은 단백질 제제의 유백광(opalescence)을 감소시키는 방법; 및 저하된 유백광을 갖는 농축된 단백질 제제의 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물에 관한 것이다.

항체를 포함한 단백질은 지난 20여년 동안 약물 치료에 사용되어 왔다. 높은 치료 용량을 달성하기 위해, 항체는 전형적으로 고농도(약 10 내지 100mg/㎖ 또는 그 이상)로 제형화된다(참조: Brekke, O.H. and Sandlie, I. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2:52-62). 단백질 투여의 측정 방식들은, 고농축된 단백질 제형을 필요로 한다. 예를 들면, 피하 투여용의 치료 항체는 종종 약 100mg/㎖ 이상의 농도로 제형화된다. 이러한 농축된 단백질 제형 중의 일부는 고농도에서 유백광 외관(opalescent appearance)을 나타내는데, 이러한 특성을 종종 유백광이라고 한다(참조: Schellekens, H. (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1:457-462).

농축된 단백질 용액에서의 유백광 외관은, 무엇보다도, 단백질 농도, 레일리 산란(Rayleigh scatter)에서의 이의 효과, 온도, 용질-용질 상호작용의 성질을 포함하는 각종 인자로부터 야기될 수 있다. 단백질이 유백광에 영향을 받기 쉬운 경우, 단백질 농도가 증가함에 따라 유백광 외관은 통상적으로 증가한다. 응집된 단백질 용액에 대한 유백광 용액의 유사성으로 인해, 이의 단백질 활성의 손실 및 약제학적 제형에서의 면역원성을 야기할 수 있는 가능성 측면에 대한 염려가 대두하고 있다(참조: Pinckard et al. (1967) Clin Exp. Immunol. 2:331-340; Robbins et al. (1987) Diabetes 36:838-845; Cleland et al. (1993) Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377).

따라서, 저하된 유백광을 갖는 고농축된 치료학적 단백질, 예를 들면, 치료학적 항체의 제형을 개발하는 것이 요구된다.

[발명의 요지]

본 발명은, 적어도 부분적으로, 항체 제제에서 염, 예를 들면, 염화나트륨의 농도를 감소시키면 상기 제제의 유백광의 외관 및/또는 상기 제제에서의 고분자량 종(high molecular weight species)의 형성이 감소된다는 발견을 기초로 한다. 따 라서, 예를 들면, 상기 제제의 이온 강도(ionic strength)를 변화시킴으로써 단백질(예를 들면, 항체) 제제의 유백광 외관을 감소시키는 방법; 및 저하된 유백광을 갖는 농축된 단백질의 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물이 기재되어 있다. 또한, 정제 공정에서의 선택된 단계들에서 염 농도(들)를 모니터링하고/하거나 감소시키는, 정제방법이 기재되어 있다.

따라서, 한 가지 측면에서, 본 발명은, 단백질 제제, 예를 들면, 항체 제제(예를 들면, 단백질(예를 들면, 항체)을 포함하는 용액)에서 유백광을 저하시키거나 고분자량 종의 양을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 단백질 제제에서 유백광 외관 및/또는 고분자량 종의 양이 감소되고/되거나 없어지도록, 상기 제제의 이온 강도를 변화, 예를 들면, 저하 또는 증가시킴을 포함한다. 상기 양태에서, 단백질 제제에서의 단백질 농도, 예를 들면, 항체 농도에 대한 이온 강도의 비는, 단백질 제제에서 유백광 외관 및/또는 고분자량 종의 양이 감소되고/되거나 없어지도록, 변화 또는 변경, 예를 들면, 저하 또는 증가된다. 상기 양태에서, 단백질 제제는 약제학적 유효 농도에서, 예를 들면, 항체 제제에 대해 약 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150mg/㎖에서 이온 강도(예를 들면, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 이상의 유럽 약전 표준(European Pharmacopeia standard)의 탁도(turbidity) 및/또는 단백질 제제의 질량%의 약 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 그 이상에 상응하는 고분자량 종의 비율(%))를 감소시키기 전에는 원치않는 유백광 및/또는 고분자량 종을 나타낸다.

본 발명의 양태에서, 상기 제제 중의 단백질은, 아래에 더 상세하게 기재되 는 바와 같은, 분비된 단백질, 예를 들면, 항체, 항체의 항원-결합 단편, 결합 도메인-면역글로불린 융합(예를 들면, SMIP™), 가용성 수용체, 수용체 융합, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 또는 응고 인자(clotting factor)이다. 단백질이 항체인 양태에서, 상기 단백질은 하나 이상, 바람직하게는 2개의 전장(full-length) 중쇄(heavy chain) 및 하나 이상, 바람직하게는 2개의 경쇄(light chain)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "항체"는 항체 단편 또는 변이체 분자, 예를 들면, 항원-결합 단편(예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fv, 단일쇄 Fv 단편 및 중쇄 단편(예를 들면, 카멜리드(camelid) VHH)을 포함한다. 항체는 모노클로날 또는 단일-특이성 항체일 수 있다. 상기 항체는 또한 사람 항체, 사람화 항체, 키메릭(chimeric) 항체, CDR-이식된 항체 또는 시험관내에 발생된 항체일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항체는, 예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 갖는다. 또 다른 양태에서, 항체는, 예를 들면, 카파 또는 람다로부터 선택되는 경쇄를 갖는다. 한 가지 양태에서, 불변 영역은 항체의 특성을 변화시키기 위해(예를 들면, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 효과기(effector) 세포 기능 또는 보체 기능 중의 하나를 증가 또는 감소시키기 위해) 변형, 예를 들면, 돌연변이된다. 전형적으로, 항체는 소정의 항원, 예를 들면, 질환, 예를 들면, 신경변성, 대사적, 염증성, 자가면역 및/또는 악성종양 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 예시적인 항체는, Aβ펩티드, 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-22(IL-22), 5T4, 및 성장 및 분화 인자-8(GDF-8)에 대한 항체를 포함하지만 이에 제한되 지 않는다. 본 발명의 양태에서, 항체는 항-GDF-8 항체, 예를 들면, Myo-029이다.

본 발명의 양태에서, 단백질은 더 높은 단백질 및/또는 염 농도에서 자가-응집(self-aggregate)되며, 예를 들면, 단백질은 고 염 제제(예를 들면, 염 농도가 약 50 내지 200mM인 제제(예를 들면, 염 약 100 내지 150mM))에서 음의 2차 비리얼 계수를 갖는다. 예를 들면, 단백질은, 예를 들면, 150mM 염화나트륨을 함유하는 제제에서 약 -1×10^-1 내지 -1mol-mg/g², 약 -1×10^-2 내지 -10×10^-2mol-mg/g², 약 -1×10^-3 내지 -10×10^-3mol-mg/g², 약 -1×10^-4 내지 -10×10^-4mol-mg/g², 약 -1×10^-5 내지 -10×10^-5mol-mg/g²의 2차 비리얼 계수를 갖는다. 다른 양태에서, 단백질은, 예를 들면, 150mM 염화나트륨을 함유하는 제제에서, 예를 들면, 약 1×10^-5 내지 10×10^-5mol-mg/g², 약 1×1O^-4 내지 10×10^-4mol-mg/g², 약 1×10^-3 내지 10×10^-3mol-mg/g², 약 1×10^-2 내지 10×10^-2mol-mg/g²의 양의 비리얼 계수를 갖는다. 단백질이 항체 또는 이의 단편인 양태에서, 항체는, 본 발명의 방법을 수행하기 전 및/또는 후에 약 0.1 내지 약 1,000mg/㎖, 전형적으로 약 0.5 내지 약 500mg/㎖, 약 1 내지 400mg/㎖, 약 5 내지 300mg/㎖, 약 10 내지 250mg/㎖, 약 15 내지 200mg/㎖, 약 20 내지 150mg/㎖, 약 50 내지 100mg/㎖의 농도로 존재한다.

본 발명의 양태에서, 단백질 제제의 이온 강도는, 상기 제제에 존재하는 염의 농도를 저하시키고/시키거나 상기 제제에 사용되는 염을 유백광을 더 적게 유도 하는 염으로 대체함으로써 변화, 예를 들면, 감소된다. 상기 제제 중의 염은, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 또는 인산나트륨 중의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 상기 제제 중의 염 농도는 더 낮은 농도로, 예를 들면, 유백광 제제에서의 농도보다 적어도 약 2배, 3배, 5배, 10배 또는 100배 더 낮은 농도로 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 단백질 제제 중의 염(예를 들면, 염화나트륨) 농도는 약 300mM 미만, 전형적으로, 약 200mM, 150mM, 100mM, 75mM, 50mM, 40mM, 30mM, 25mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 또는 0mM 미만으로 감소시킬 수 있다. 단백질 제제 중의 염 농도는, 예를 들면, 한외여과 또는 투석 중의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 여과 방법을 적용함으로써 변화, 예를 들면, 감소시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가하여, 단백질 제제의 이온 강도는 하나 이상의 제1 염(들), 예를 들면, 고 유백광 유도제를 하나 이상의 제2 염(들), 예를 들면, 더 낮은 유백광 유도체로 대체함으로써 변화, 예를 들면, 감소 또는 증가된다. 염화나트륨(NaCl), 인산나트륨(NaHPO₄), 염화마그네슘(MgCl₂) 및 염화칼슘(CaCl₂)과 같은의 예시적인 염은, 상기 항체 제제에서의 유백광 유도 수준에 따라, 고 유백광 유도제로부터 저 유백광 유도제의 순서로 매겨진다. 따라서, 본 발명의 양태에서, 제1 염은 NaCl이고, 이는, 예를 들면, NaHPO₄, MgCl₂ 또는 CaCl₂ 중의 하나 이상으로부터 선택된 제2 염으로 대체되며; 제1 염은 NaHPO₄이고, 이는, 예를 들면, MgCl₂ 또는 CaCl₂ 중의 하나 이상으로부터 선택된 제2 염으로 대체되며, 제1 염은 MgCl₂이고 제2 염인 CaCl₂로 대체된다. 본 발명의 양태에서, 제1 염을 예를 들면 투석 또는 한외여과에 의해 제거하고, 제2 염을 단백질 제제에 첨가함으로써, 단백질 제제에서 제1 염이 제2 염에 의해 대체된다. 본 발명의 양태에서, 제2 염의 농도는 제1 염의 농도보다 크다. 본 발명의 양태에서, 제2 염의 농도는 제1 염의 농도와 동일하다. 또 다른 양태에서, 제2 염의 농도는 제1 염의 농도 미만이다.

다른 양태에서, 단백질 제제의 이온 강도는 단백질의 제조 및/또는 정제 공정에서, 예를 들면, 사용되는 고 유백광 유도제 염의 농도를 감소시킴으로써 변화, 예를 들면, 저하 또는 증가된다. 상기 양태는 (i) (임의로) 단백질 제제가 유백광 용액을 형성하는지를 하나 이상의 단백질 및/또는 염 농도에서 평가하는 단계, (ii) (임의로) 단백질 제제 중의 염 농도를 제공하는 단계, 및/또는 (iii) 단백질 제제의 이온 강도를 변화, 예를 들면, 감소(예를 들면, 단백질 제제 중의 단백질 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시킴)시키는 단계를 포함한다. 단계(ii) 및/또는 단계(iii)은 필요에 따라 임의의 순서로 반복되고/되거나 수행할 수 있다. 단계(i)은, 예를 들면, 본원 실시예에 기재된 바와 같이 상이한 농도의 단백질 및/또는 염을 함유하는 하나 이상의 샘플에서 유백광 및/또는 고분자량 종의 존재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 단백질 제제의 이온 강도는, 예를 들면, 본원에 기재된 하나 이상의 여과 방법을 적용함으로써 변화, 예를 들면, 감소시킬 수 있다. 대안적으로 또는 이에 추가하여, 단백질 제제의 이온 강도는 단백질 제조 및/또는 정제 공정의 하나 이상의 단계에서 이온 강도, 예를 들면, 염 농도를 저하시킴으로 써 감소시킬 수 있다. 단백질의 제조 및/또는 정제 공정에서의 이러한 이온 강도의 저하는, 하나 이상의 단계에서 사용되는 염의 농도를 저하시킴으로써 실시할 수 있다. 다른 양태에서, 이온 강도는 하나 이상의 단계에서 사용되는 염을 더 낮은 유백광 유도제로 대체함으로써 변화된다. 특정 양태에서, 제제에서의 단백질은 재조합적으로(recombinantly) 제조되며, 예를 들면, 재조합(recombination)을 사용하여, 예를 들면, 세포-결합 단백질, 가용성 단백질 또는 분비된 단백질로서 발현된다. 이러한 양태에서, 단백질은 재조합 숙주로부터 발현되고 분리된다(예를 들면, 배지 중으로 분비되어, 예를 들면, 원심분리 또는 여과에 의해 분리됨). 분리된 단백질은 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography), 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과(diafiltration), 한외여과(ultrafiltration), 바이러스 제거 여과(viral removal filtration), 음이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography) 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법으로 추가로 정제된다. 단백질은 추가로 동결건조(lyophilization)되고/되거나 완충 용액 중에서 재구성(reconstitution)될 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 단계들 중의 하나 이상에서 사용되는 용액(예를 들면, 세척, 부하, 용출, 재구성 용액)의 이온 강도, 예를 들면, 염 농도를 변화, 예를 들면, 감소시킴을 포함한다.

이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 한외여과 및 투석과 같은 여과 방 법을 적용한 후에도 잔여량의 염이 단백질 제제에 존재할 수 있는 것으로 사료된다. 이러한 잔여량의 염은 당업계에서 "도난 효과(Donnan effect)"로서 특징지워진다(참조: Miro, M et al. (2004) Analytica Chimica Acta 512(2):311-317). 이러한 잔여량의 염은, 특히 제제 중의 단백질이 자가-응집되는 경향성이 있는 경우, 예를 들면, 이것이 음의 비리얼 계수를 갖는 경우, 유백광 외관을 갖는 단백질 제제를 야기할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 이온 농도를 변화시키는 것은 단백질 정제 기술에 광범위하게 적용될 수 있다.

본 발명의 양태에서, 단백질 제제에서의 유백광의 감소는 용액의 탁도를 평가함으로써 검출된다. 예를 들면, 단백질 제제의 탁도는 약 5, 4, 3, 2, 1 또는 그 미만의 유럽 약전 표준으로 감소된다.

다른 양태에서, 단백질 제제의 유백광의 감소는 단백질의 2차 비리얼 계수의 변화를 평가함으로써 측정된다. 예를 들면, 단백질의 2차 비리얼 계수의 2배, 3배, 5배, 10배 또는 100배 변화, 예를 들면, 증가 또는 감소가 단백질 제제의 이온 강도를 변화, 예를 들면, 감소시킨 후에 검출된다. 예를 들면, 상기 비리얼 계수는 약 1×10^-2 내지 1×10^-3에서 약 1×10^-3 내지 1×10^-4로 변화, 예를 들면, 감소한다.

또 다른 양태에서, 단백질 제제에서의 유백광의 감소는 고분자량 종의 양을 측정함으로써 검출된다. 고분자량 종은 전형적으로 약 10⁴, 더욱 전형적으로 약 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ 또는 그 이상의 분자량을 갖는다. 상기 제제 중의 단백질 종(protein species)의 중량 평균 분자량은, 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 광 산란 기술(예를 들면, 정적 및 동적 광 산란), 비대칭 유동 장 유동 분별(asymmetric flow field flow fractionation) 또는 SEC-HPLC 중의 하나 이상을 사용하여 검출될 수 있다. 상기 양태에서, 고분자량 종의 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배 또는 100배 저하가, 단백질 제제에서의 유백광 감소의 지표이다. 예를 들면, 고분자량 종의 질량%는 총 단백질 질량의 약 30 내지 40%로부터 약 5% 미만으로 감소하며, 이와 동시에 응집되지 않은 단백질의 질량%는 총 단백질 질량의 약 60 내지 70%로부터 약 95% 이상으로 증가한다(동적 광 산란으로 검출한 바와 같음).

또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질(예를 들면, 항체) 제제(예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 단백질(예를 들면, 항체) 제제) 중의 고분자량 종의 형성을 저하시키는 방법 및/또는 상기 고분자량 종의 양을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 단백질 제제 중의 고분자량 종의 양이 감소되고/되거나 없어지도록, 상기 제제의 이온 강도를 변화, 예를 들면, 감소 또는 증가시킴(예를 들면, 단백질 제제에서의 단백질 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시킴)을 포함한다.

본 발명의 양태에서, 고분자량 종은 단백질 응집체이며, 이는 단백질 및/또는 염 농도 감소시 실질적으로 가역적으로 해리될 수 있다. 고분자량 종은 전형적으로 약 10⁴kDa, 더욱 전형적으로 약 10⁵kDa, 10⁶kDa, 10⁷kDa, 10⁸kDa, 10⁹kDa, 10¹⁰kDa, 10¹¹kDa, 10¹²kDa, 10¹³kDa 또는 그 이상의 분자량을 갖는다. 상기 제제 중 의 단백질 종의 중량 평균 분자량은, 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 광 산란 기술(예를 들면, 정적 및 동적 광 산란), 비대칭 유동 장 유동 분별 또는 SEC-HPLC 중의 하나 이상을 사용하여 검출될 수 있다. 상기 양태에서, 고분자량 종의 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배 또는 100배 저하가, 단백질 제제에서의 유백광 감소의 지표이다. 예를 들면, 고분자량 종의 질량%는 총 단백질 질량의 약 30 내지 40%로부터 약 5% 미만으로 감소하며, 이와 동시에 응집되지 않은 단백질의 질량%는 총 단백질 질량의 약 60 내지 70%로부터 약 95% 이상으로 증가한다(동적 광 산란으로 검출한 바와 같음).

본 발명의 양태에서, 상기 제제의 이온 강도의 감소는 본원에 기재된 방법으로 수행한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질(예를 들면, 항체) 제제(예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 단백질(예를 들면, 항체) 제제)의 제조 및/또는 정제 공정의 효율을 개선시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) (임의로) 단백질 제제가 유백광 용액을 형성하는지를 하나 이상의 단백질 및/또는 염 농도에서 평가하는 단계, 및 (ii) 단백질 제제 중의 고분자량 종의 양이 감소되고/되거나 없어지도록 상기 제제의 이온 강도를 변화, 예를 들면, 감소시키는 단계를 포함한다. 단계(i)은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 상이한 농도의 단백질 및/또는 염을 함유하는 하나 이상의 샘플에서 유백광 및/또는 고분자량 종의 존재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 단백질 제제의 이온 강도는 본원에 기재된 하나 이상의 여과 방법을 적용하고; 단백질 제제에 사용되는 염을, 예를 들면, 본원에 기재된 바 와 같은 더 낮은 유백광 유도체로 대체하고/하거나; 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 단백질의 제조 및/또는 정제 공정의 하나 이상의 단계에서 이온 강도를 감소시킴으로써 변화, 예를 들면, 감소될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체의 제조을 개선시키는 방법, 예를 들면, 항체의 제조 공정에서 사용하기 위한 염 또는 염 농도를 선택하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) 항체 용액을 회수하는 단계(예를 들면, 매트릭스로부터 항체를 용출시키고, 투석된 용액 또는 기타의 여액을 회수하고/하거나, 무수 제제, 예를 들면, 동결건조되거나 건조된 제제를 제1 이온 강도, 예를 들면, 제1 염 농도를 갖는 제1 용액으로 가용화시킴), (ii) 항체 용액 중의 유백광의 수준 및/또는 고분자량 종의 존재를 평가하는 단계를 포함하며, 여기서, (a) 유백광 및/또는 고분자량 종의 수준이 소정의 수준 이하이면, 항체 생성물, 예를 들면, 항체 용액을 포함하는 약제학적 조성물에 사용하기 위한 항체 용액을 선택하고, 또는 (b) 유백광 및/또는 고분자량 종의 수준이 소정의 수준 이상이면, 제2 이온 강도, 예를 들면, 더 낮은 이온 강도(예를 들면, 제2 염 농도, 예를 들면, 더 낮은 염 농도)를 갖는 제2 용액을 선택한다. 항체를 함유하는 제2 용액에서 유백광의 수준 및/또는 고분자량 종의 존재를 필요에 따라 평가할 수 있으며, 유백광의 수준이 소정의 수준에 도달할 때까지(또는 소정의 수준 미만일 때까지) 추가의 용액을 가할 수 있다.

본 발명의 양태에서, 항체 용액은 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래 피, 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과, 한외여과, 바이러스 제거 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 하나 이상의 단백질 정제 방법으로 회수된다. 단백질은 추가로 동결건조되고/되거나 완충 용액 속에서 재구성될 수 있다.

본 발명의 양태에서, 소정 수준의 항체(제1, 제2 및 추가의) 용액은, 약제학적 유효 농도에서, 예를 들면, 항체 제제에 대해 약 5mg/㎖, 10mg/㎖, 25mg/㎖, 50mg/㎖, 75mg/㎖, 100mg/㎖, 125mg/㎖ 또는 150mg/㎖에서, 탁도 값이 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 유럽 약전 표준, 전형적으로 약 3이고/이거나 고분자량 종이 단백질 제제의 질량%의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 그 이상, 전형적으로 약 2%로 증가한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체에 결합된 잔류 염 농도의 양이, 항체를 철저하게 투석한 후에(예를 들면, 0mM 염에서 투석한 후에) 나타나는 양보다 적은, 항체 정제 방법 또는 항체 제제를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질(예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 항체) 제제가 유백광 외관을 갖는 경항이 있는지를 측정하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) (임의로) 단백질을, 예를 들면, 표면 단백질 전하 및/또는 2차 비리얼 계수를 측정함으로써, 자가-응집 경향을 갖는 것으로 확인하는 단계, 및/또는 (ii) 용액 중의 단백질을 함유하는 하나 이상의 샘플에서 단백질 및/또는 염 농도 각각의 증가 및/또는 저하시의 고분자량 종의 형성 및/또는 소멸을 검출하는 단계를 포함한다. 염 및/또는 단백질 농도 증가시 음의 비리얼 계수 및/또는 고분자량 종의 증가는, 상기 제제 중의 단백질이 유백광 외관을 갖는 경향성이 증가한다는 지표이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질(예를 들면, 항체) 샘플의 유백광을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 단백질(예를 들면, 항체) 샘플을 제공하는 단계, 하나 이상(예를 들면, 적어도 2개, 3개 또는 그 이상)의 염(예를 들면, NaCl) 농도에서 탁도 및/또는 고분자량 종의 존재를 측정하는 방법; 하나 이상의 염(예를 들면, NaCl) 농도에서 탁도 및/또는 고분자량 종의 존재의 함수로서의 단백질(예를 들면, 항체) 샘플에서의 유백광의 수준에 대한 보고(report)를 제공함을 포함한다.

다른 측면에서, 저하된 유백광을 갖는 단백질(예를 들면, 항체) 제제(뿐만 아니라 본원에 기재된 단백질 제제를 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 제형) 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 양태에서, 단백질 제제는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다.

다른 양태에서, 단백질 제제는, 하나 이상의 고분자량 종을 제거하기 전, 예를 들면, 여과 또는 원심분리 단계 전에 고분자량 종(예를 들면, 동적 광 산란으로 검출되는 바와 같은)에 비해 적어도 70질량%, 80질량%, 90질량%, 95질량%, 96질량%, 97질량%, 98질량%, 99질량% 또는 그 이상의 응집되지 않은 종을 포함한다. 본 발명의 양태에서, 단백질 제제의 이온 강도가 변화, 예를 들면, 저하됨으로써, 고분자량 종에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배 또는 100 배로 응집되지 않은 단백질 비율(%)이 증가한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체, 예를 들면, 사람 항체 또는 사람화 항체를 약 50mM, 40mM, 30mM, 20mM, 10mM, 5mM 또는 1mM 미만의 염(예를 들면, NaCl)에서 적어도 약 50mg/㎖, 75mg/㎖, 100mg/㎖, 125mg/㎖ 또는 150mg/㎖의 농도로 포함하는 약제학적으로 허용되는 항체 제제를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 하나 이상의 고분자량 종을 제거하기 전, 예를 들면, 여과 또는 원심분리 단계 전에 적어도 70질량%, 80질량%, 90질량%, 95질량%, 96질량%, 97질량%, 98질량%, 99질량% 또는 그 이상의 응집되지 않은 종을 갖는 항체 용액, 예를 들면, 사람 항체 또는 사람화 항체의 항체 용액을 제공하는 단계, (ii) 하나 이상의 정제 단계를 수행하여 중간체 항체 용액을 제공하는 단계, 및 (iii) 중간체 용액을 가공하여 적어도 약 50 내지 150mg/㎖의 농도 및 약 5, 4, 3, 2, 1 또는 그 미만 유럽 약전 표준의 탁도를 갖는 항체 제제를 제공하는 단계를 포함하는, 항체 제제를 제공하는 방법을 특징으로 한다.

또 다른 국면, 특성 및 이점이 바람직한 양태의 설명 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.

도 1은 증가하는 NaCl 농도에 노출된 항체 M1(본원에서 "Myo-029"라고도 함) 용액의 이미지이다(육안으로 인지 가능한 유백광 증가를 나타냄).

도 2는 0mM NaCl 및 10OmM NaCl에서의 항체 M1 용액에 대한 동적 광 산란 플 롯이다.

도 3은 100mM NaCl에서의 항체 M1 용액에 대한 비대칭 유동 장 유동 분별화 플롯이다.

도 4는 100mM NaCl에서의 항체 M1 용액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그래프이다.

도 5는 0mM NaCl로부터 100mM NaCl로 투석된 다음 다시 0mM NaCl로 투석된 항체 M1 용액의 이미지이다(염 농도의 변화에 따라 육안으로 가역적인 유백광을 나타냄).

도 6은 유백광 종(species)의 가역적 형성을 나타내는 항체 M1 용액의 동적 광 산란 플롯이다: (a) 100mM NaCl(OmM NaCl로부터 투석됨), (b) 0mM NaCl(100mM NaCl로부터 투석됨)

도 7은 증가하는 NaCl 농도에 따른 항체 M2 용액의 이미지이다(가시적으로 인지할 수 있는 유백광 증가를 나타내지 않음).

도 8은 0mM NaCl 및 15OmM NaCl에서의 항체 M2 용액에 대한 동적 광 산란 플롯이다.

도 9는 0mM NaCl 및 15OmM NaCl에서의 항체 M3 용액에 대한 동적 광 산란 플롯이다.

도 10은 100mM NaCl에서의 항체 M1에 대한 2차 비리얼 계수 플롯이다.

도 11은 100mM NaCl에서의 항체 M2에 대한 2차 비리얼 계수 플롯이다.

도 12는 1시간 후 유백광을 나타내는 상이한 염을 함유하는 항체 M1 용액의 이미지이다.

도 13은 2주 후 유백광을 나타내는 상이한 염을 함유하는 항체 M1 용액의 이미지이다.

도 14는 상이한 염을 함유하는 항체 M1 용액에 대한 OD400nm 대 온도 사이클의 횟수의 플롯이다.

도 15는 상이한 염을 함유하는 항체 M1 용액에 대한 고분자량(%) 대 염 농도의 플롯이다.

도 16은 상이한 염을 함유하는 항체 M1 용액에 대한 OD400nm 대 염 농도의 플롯이다.

도 17은 도 16에 도시된 플롯의 확대한 영역이다.

도 18은 20mM CaCl₂에서의 OD400nm 대 항체 M1 농도의 플롯이다.

본 출원은 상기 제제의 이온 강도를 변화시킴으로써 단백질 제제의 유백광 외관을 감소시키는 방법; 및 저하된 유백광을 갖는 농축된 단백질의 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물을 기재하고 있다. 선택된 단계에서 염 농도를 모니터링하고/하거나 감소시키는 정제방법 또한 기재되어 있다.

하나의 양태에서, 농축된 항체 제제의 유백광 외관에 대한 염 농도, 즉 이온 강도의 영향을 "항체 M1(본원에서 "Myo-029"라고도 함), 항체 M2 및 항체 M3"의 3개의 항체에 대해 평가한다. 첨부된 실시예에 더 상세하게 기재되는 바와 같이, 3개의 항체는 모두 pH 6.0에서 단지 10mM의 히스티딘에서 비교적 소량의 매우 큰 종을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 큰 종은 너무 커서 SEC-HPLC 컬럼을 사용하여 분리할 수 없었다. 항체 제제 중의 염화나트륨의 양을 증가시킴으로써 이온 강도를 증가시키면, 유백광이 증가할 뿐만 아니라 항체 M1에 대한 액체-액체 상 분리의 출현도 증가한다(예를 들면, 도 1 내지 4 참조). 유백광 외관은, 도 5 내지 6에서 항체 M1에 대해 나타내는 바와 같이 염 제거에 따라 가역적이다. 큰 종은 비대칭 유동 장 유동 분별(AFFFF: Asymmetric Flow Field Flow Fractionation)을 사용하여 항체 M1에 대해 관찰되었으며, 이는 추후에 동적 광 산란 기술을 사용하여 확인되었다(도 2 참조). 항체 M2 및 M3이 항체 M1에 비해 육안 검사에 의해 검출 가능한 유백광의 상당한 증가를 나타내지는 않지만(예를 들면, 도 7 참조), 고분자량 종은 광 산란 기술을 사용하여 항체 둘 다에 대해 검출된다(도 8 및 9에 도시되어 있음).

항체 M1에 대해 계산된 음의 비리얼 계수는, 항체 M3 및 항체 M2(둘 다 양의 비리얼 계수를 가짐)에 비해 항체 M1의 응집/조합 경향성과 일치한다(도 10을 도 11과 비교함).

본원에 나타난 결과는, 연구된 항체의 유백광 외관이 주로 가역적인 자가-조합(self-association)으로 인한 것이며, 이는 이온 강도를 증가시킴으로써 추가로 유도된다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 의해 기재되는 바와 같이, 농축된 항체 제제(특히 응집 경향을 갖는 농축된 항체 제제)의 유백광 외관을 감소시키기 위해서는, 항체 제제의 이온 강도를 제형으로부터 저하되고/되거나 가공 방법에서 제한되어야 한다.

본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.

"유백광" 또는 "유백광 외관"은 용액 중의 하나 이상의 성분의 농도, 예를 들면, 단백질 및/또는 염 농도의 함수로서의, 용액(예를 들면, 단백질 제제)에서 검출되는 탁도의 정도를 나타낸다. 상기 탁도의 정도는 공지된 탁도의 현탁액을 사용하여 생성된 표준 곡선을 참조하여 계산할 수 있다. 약제학적 조성물에 대한 탁도의 정도를 측정하기 위한 참조 표준은 유럽 약전 기준(European Pharmacopoeia criteria)(참조: European Pharmacopoeia, Fourth Ed., Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM), Strasbourg, France)을 근거로 할 수 있다. 상기 유럽 약전 기준에 따르면, 투명 용액은 유럽 약전 표준에 따라 대략 3의 탁도를 갖는 참조 현탁액더 낮거나 동일한 탁도를 갖는 것으로 정의된다. 비탁측정(Nephelometric turbidity measurement)은 레일리 산란을 검출할 수 있으며, 이는 전형적으로 조합 또는 비이상성 효과(nonideality effect)의 부재하에서 농도에 대해 선형으로 변한다.

예를 들면, 이상적인 용액은 수학식 1과 일치하게 행동한다.

KC/R_θ = 1/M

위의 수학식 1에서,

M은 분자량이고, K는 상수이며, R_θ는 레일리 비(이는 다수의 실험적 매개변수를 조합한다)이고, C는 농도이다.

반면, 비-이상적인 용액은 수학식 2를 사용하여 설명할 수 있다.

KC/R_θ = 1/M + 2BC + ‥‥

위의 수학식 2에서,

B는 2차 비리얼 계수이다.

M을 수득하기 위해, KC/R_θ를 0 각도 및 0 농도로 외삽한다. 짐 플롯(Zimm plot)은 종좌표에 KC/R_θ를 배치하고 횡좌표에 sin²(θ/2) + kC(여기서, k는 임의의 상수이다)를 배치한다. 따라서, 짐 플롯은 동일한 그래프 상에서 KC/R_θ 0 각도 및 0 농도 둘 다를 외삽할 수 있게 한다. 짐 플롯에서, M 및 B는 각각 0 각도 라인의 절편 및 기울기이다.

"2차 비리얼 계수"는 배제된 용적 효과(excluded volume effect) 및 분자간 상호작용의 척도를 나타내는 것으로 당업계에서 인지되고 있다(참조: Tessier, P.M. et al. (2003) Current Opinion in Biotechnology 14(5):512-516). 양의 2차 비리얼 계수는 전형적으로 배제 용적 효과 및 분자간 반발성 상호작용 둘 다를 나타낸다. 이와 달리, 음의 2차 비리얼 계수는 전형적으로 인력성 분자간 상호작용을 나타낸다. 이러한 분자내 및 분자간 상호작용의 균형은 2차 비리얼 계수의 부 호 및 크기를 결정한다.

"이온 강도(ionic strength)"는 용액 중의 이온의 농도이다. "I"가 이온 강도인 경우, 이온 강도는 수학식 3이다.

위의 수학식 3에서,

c_i는 이온 i의 몰 농도이고, z_i는 이온의 전하이고, 합계는 용액 중의 모든 이온에 대해 이루어진다(참조: IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 2nd Ed. (1997)).

본원에서 사용되는 "단백질"은 하나의 단위로서 기능할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 연속 쇄를 나타낸다. "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 나타내는 데 사용되지만, 당업계의 숙련가들은 이 용어가 장쇄에 제한되지 않으며 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소한의 쇄를 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 단일 폴리펩티드가 단위로서 기능할 수 있는 경우, "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. "단백질"과 "폴리펩티드"는 아래에 더 상세하게 기재되어 있는 바와 같은 항체, 수용체 융합, SMIP™, 성장 인자, 사이토킨, 응고 인자 및 효소를 포함한다.

"항체"는 면역글로불린 또는 이의 단편이며, 항원-결합 부위를 포함하는 펩 티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일특이성 항체, 다중특이성 항체, 이특이성 항체, 사람화 항체, 탈면역화 항체, 사람 항체, 카멜리드 항체, 설치류 항체, 단일쇄 항체, 키메릭 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 혼성 항체, 돌연변이 항체, 이식 항체 및 시험관내 생성된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "항체"는 또한 Fab, F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH, 및 항원-결합 기능을 보유하는 기타의 항체 단편 및 변이체 분자와 같은 항체 단편 및 변이체 분자를 포함한다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함한다.

"단백질 제제"는 제제의 이온 강도 증가시 고분자량 종을 형성할 수 있는, 용액 중의 하나 이상의 단백질(예를 들면, 항체)을 함유하는 조성물을 나타낸다. 단백질 제제는 동일하거나 상이한 단백질, 예를 들면, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체를 함유할 수 있다.

"고분자량 종"은 2개 이상의 단백질, 예를 들면, 항체의 조합을 나타낸다. 본 발명의 양태에서, 상기 단백질 조합에 의해, 단량체성 단백질의 고차 응집물(higher order aggregate)이 형성된다. 상기 조합은, 비-공유적인(예를 들면, 정전기, 반 데르 발스) 단백질-단백질 상호작용의 결과로서 야기될 수 있다. 상기 조합은 전형적으로 단백질 제제의 이온 강도 감소시 가역적이다. 단백질, 예를 들면, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체는 동일하거나 상이할 수 있다. 고분자량 종은 전형적으로 약 10⁴, 더욱 전형적으로 약 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, lO¹¹, 10¹², 10¹³ 또는 그 이상의 분자량을 갖는다.

고분자량 종을 형성하기 위한 단백질의 응집은 본원에 더 상세하게 기재되어 있는 바와 같이 광학 밀도, 비대칭 유동 장 유동 분별, SEC-HPLC, 정적 광 산란 및 동적 광 산란을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 분석 기술을 사용하여 모니터링할 수 있다.

단백질 샘플의 탁도는 광학 밀도(특정 파장에서의 광의 흡광도)로서 측정할 수 있다. 광학 밀도 측정은 분광분석법(예를 들면, 400nm의 파장에서 SpectraMax UV-Vis를 사용함)을 사용하여 이루어질 수 있다. 광학 밀도를 측정하는 방법에 대한 더 상세한 설명을 위해, 예를 들면, 문헌[참조: Eckhardt BM (1994) J Pharm Sci Technol. 48(2):64-70]을 참조한다.

비대칭 유동 장 유동 분별(AF4)은 비대칭 장 유동 분별법의 한 가지 유형이다. AF4는 생체분자를 포함한 각종 입자의 신속한 분별 및 고해상도 확인을 가능하게 하는 방법이다(참조: Giddings, J. C; Yang, F. J.; Myers, M. N., Flow-field-flow fractionation: a versatile new separation method, 193 Science 1244-1245 (1976); Giddings, J. C; Yang, F. J.; Myers, M. N., Theoretical and experimental characterization of flow field-flow fractionation, 48 Anal. Chem. 1126-1132 (1976)). AF4는 수 나노미터로부터 수 마이크로미터에 이르는 입자를 분리할 수 있다. 장 유동 분별 분리는 (크로마토그래피 분리 컬럼과 비교하여) 박막 유동 채널(thin flow channel)에서 일어난다. 수성 또는 유기 용매가 이 채널을 통해 샘플을 이동시킨다. 샘플에 가해지는 제1 힘인, 채널을 통한 유동은 낮은 채널 높이로 인한 층류 유동이다. 제2 힘은 채널 유동에 수직으로 발생한다. AF4에서, 유동 채널의 한쪽 면은 멤브레인이고, 제2 힘은 당해 멤브레인을 통해 채널을 가로지르는 유체 유동이다. 입자 분리는 이 시스템에서 이러한 2가지 힘의 결과로서 발생한다. 첫째, 채널내 층류 유동으로 인한 속도 구배는 채널 중심의 입자가 채널을 따라 더 신속하게 이동하여 채널의 측면에 더 가까운 것부터 분리될 수 있도록 한다. 둘째, 제2 힘은 샘플을 멤브레인 쪽으로 밀어낸다. 더 작은 분자가 더 큰 입자보다 더 신속하게 채널의 중심 쪽으로 역확산되고, 이에 따라, 채널의 중심 쪽으로의 더 신속한 용매 유동으로 인해 더 작은 분자가 더 큰 입자로부터 분리되기 때문에, 크기 분리가 일어난다.

두문자어 SEC-HPLC는 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography)를 나타낸다. SEC 및 HPLC는, 조합 SEC-HPLC 분석 기술과 같이, 개별적으로 널리 공지된 분석 기술이다(참조: Garnick, R. L., Ross, M. J., Du Mee, C. P., Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Ed. J. Swarbrick, J.C., Boylan, Vol. 1: 253 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1988)). 각각의 기술이 근거하는 이론에 깊이 파고드는 것은 아니지만, SEC는 또한 겔 투과 크로마토그래피로서 공지되어 있으며, 겔 매트릭스를 통해 이동할 수 있는 분자의 능력으로 인해, 크기에 기초하여 분자를 분리하며, HPLC는 분자가 고압하에서 고정 매질을 통과하여 이동하기 때문에 확산 계수에 기초하여 분자를 분리한다.

정적 및 동적 광 산란은 용매/용질 시스템으로부터 산란된 광의 패턴을 측정 하기 위한 2가지 상이한 실험 방법이다(참조: Berne, B. and Pecora, R. Dynamic Lights Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics (Wiley, New York, 1976)). 정적 및 동적 광 산란은 정보의 상보적인 단편을 제공하며, 이러한 이유로 이들은 통상적으로 용액의 확인을 위해 앞뒤로 나란히 사용된다.

정적 광 산란은 용액 중의 입자에 의해 산란된 레이저 광의 시간-평균-세기의 각도 의존도를 측정함을 포함한다. 입자의 크기 및 구조는 검출기 각도의 함수로서 광 산란 세기에 영향을 미친다. 저 산란 벡터 및 저 농도의 제한시, 산란된 세기의 각도 분포는 입자 형태와는 무관해진다는 것은 널리 확립되어 있다(참조: Zimm, B., The scattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions, 16 J. Chem. Phys. 1093-9 (1948)). 앞서 논의한 바와 같이, (KC/R_θ)를 0 각도 및 0 농도에 외삽시킴으로써, 평균 분자량, 선회 반경 및 2차 비리얼 상수를 포함하는 몇 가지 인자들을 추정할 수 있다.

동적 광 산란은 용액 중의 입자, 이 경우에는 단백질이 랜덤한 브라운 운동을 하기 때문에 일어나는 산란된 광의 세기에 대한 시간 의존적 변동을 측정함을 포함한다. 이러한 세기 변동을 분석함으로써, 입자의 확산 계수의 분포를 측정할 수 있다. 이어서, 확산 계수의 분포를 널리 공지된 이론을 사용하여 크기 분포로 전환시킬 수 있다. 동적 광 산란에 대한 상한은 샘플 밀도 의존적이며, 즉 입자는, 당해 상한이 종종 입자의 침강이 확산 공정을 좌우하는 시점으로 되도록, 이동할 수 있어야 한다. 이의 하한은, 현탁 매질에 비해 샘플이 생성하는 과다한 산란광 뿐만 아니라, 샘플 농도, 상대 굴절률, 레이저 파워, 레이저 파장, 검출기 감도 등을 포함하는 다른 인자들에 좌우될 것이다.

단백질

특정 양태에서, 단백질 제제 중의 단백질은 재조합적으로 제조된다. 본원에서 사용되는 "재조합적으로 발현된 단백질" 및 "재조합 단백질"은 해당 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사람의 손으로 조작되는 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 특정 양태에서, 이러한 조작은 하나 이상의 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 발현하고자 하는 폴리펩티드를 부호화(encoding)하는 하나 이상의 이종 유전자의 도입에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 숙주 세포에서 통상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사할 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 대해 이질적일 수 있으며, 예를 들면, 숙주 세포에서 통상적으로 발현되는 폴리펩티드에 대해 이종일 수 있다. 특정 양태에서, 재조합적으로 발현된 이종 폴리펩티드는 키메릭이다. 예를 들면, 폴리펩티드의 일부는 숙주 세포에서 통상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 함유할 수 있는 반면에 다른 일부는 숙주 세포에 대해 이질적인 아미노산 서열을 함유한다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리펩티드는 숙주 세포에서 통상적으로 발현되는 둘 이상의 상이한 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 둘 다 숙주 세포에 대해 이질적인 둘 이상의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 몇몇 양태에 서, 숙주 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 활성화 또는 상향조절(upregulation)에 의해 유전적으로 변화된다.

바람직하지 않은 정도의 유백광을 나타내고/나타내거나 고분자량 종을 형성하는 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은, 무엇보다도, 약제학적으로 또는 산업적으로 관련된 항체, 수용체, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 응고 인자, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제의 유백광을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 분리할 수 있는 단백질의 하기 목록은 단순히 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다. 당해 기술분야의 숙련가들은 단백질이 본 발명에 따라 발현될 수 있고 필요에 따라 제조하고자 하는 특정 단백질을 선택할 수 있음을 이해할 것이다.

항체 및 결합 단편

면역글로불린으로도 공지되어 있는 항체는 전형적으로 각각 대략 25kDa의 2개의 경쇄(L)와 각각 대략 50kDa의 2개의 중쇄(H)로 이루어진 4량체성 글리코실화 단백질이다. 람다 및 카파라고 하는 2가지 유형의 경쇄가 항체에서 발견될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 5개의 주요 부류, 즉 A, D, E, G 및 M으로 지정될 수 있으며, 이들 중의 몇몇은 추가로 서브클래스(동형), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 나뉠 수 있다. 각각의 경쇄는 N-말단 가변(V) 도메인(VL) 및 불변(C) 도메인(CL)을 포함한다. 각각의 중쇄는 N-말단 V 도메인(VH), 3개 또는 4개의 C 도메인(CH) 및 힌지 영역(hinge region)을 포함한다. VH에 가장 가까운 CH 도메인을 CH1이라고 한다. VH 및 VL 도메인은 구조형성 영역(framework region)으로 불리는 비교적 보존된 서열의 4개의 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 이루어지며, 이는 초가변 서열의 3개의 영역(상보성 결정 부위, CDR)을 위한 스캐폴드(scaffold)를 형성한다. CDR은 항체와 항원과의 특이 상호작용을 책임지는 잔기의 대부분을 함유한다. CDR을 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 따라서, 중쇄에서의 CDR 구성요소는 H1, H2 및 H3이라고 하고, 반면에 경쇄에서의 CDR 구성요소는 L1, L2 및 L3이라고 한다. CDR3은 전형적으로 항체-결합 부위 내 분자 다양성의 가장 큰 원인이다. 예를 들면, H3은 2개의 아미노산 잔기 정도로 짧거나 26개 이상의 아미노산일 수 있다. 상이한 종류의 면역글로불린의 아단위 구조 및 3차원 형태는 당업계에 널리 공지되어 있다. 항체 구조에 대한 개요에 대해서는 문헌(참조: Andibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988)을 참조한다. 당해 기술분야의 숙련가는, 각각의 아단위 구조(예를 들면, CH, VH, CL, VL, CDR, FR 구조)가, 활성 단편, 예를 들면, 항원에 결합하는 VH, VL 또는 CDR 아단위의 일부, 즉 항체-결합 단편, 또는, 예를 들면, Fc 수용체 및/또는 보체에 결합하고/하거나 활성화시키는 CH 아단위의 일부를 포함한다는 것을 인지할 것이다. CDR은 전형적으로 문헌(참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.)에 기재되어 있는 바와 같이 카베트(Kabat) CDR이라고 한다. 항원 결합 부위를 확인하기 위한 또 다른 표준은 초가변 루프(hypervariable loop)를 나타내는 것이다[참조: Chothia, D. et al. (1992); J. Mol. Biol. 227:799-817; and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638]. 여전히 또 다른 표준은 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody modelling software)에 의해 사용되는 AbM 정의이다[참조: Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-V erlag, Heidelberg)]. 또는, 카베트 CDR에 대해 기재된 양태는, 초티아 초가변 루프 또는 AbM-정의된 루프와 관련하여 기재된 유사한 관계를 사용하여 수행할 수 있다.

항체의 "항체-결합 단편" 내에 포함된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (vi) 카멜리드 또는 카멜화 가변 도메인, 예를 들면, VHH 도메인; (vii) 단일쇄 Fv(scFv); 및 (viii) 이특이성 항체를 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH이 별도의 유전자에 의해 코딩(coding)되기는 하지만, 이들은 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 접합될 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨)(참조: Bird et al. (1988) Science 2M-ATh- 26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). 이러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 " 항체-결합 단편"내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 비손상 항체(intact antibody)에서와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가한다.

"이특이성" 또는 "이작용성" 항체 이외에, 항체는 이의 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. "이특이성" 또는 "이작용성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성 항체이다. 이특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 포함하는 각종 방법에 의해 제조될 수 있다[참조: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)].

당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 방법이 항체를 수득하는 데 이용 가능하다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 제조할 수 있다. 그후, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마는 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(BIACORE™) 분석과 같은 표준 방법을 사용하여 스크리닝하여, 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 하나 이상의 하이브리도마를 동정한다(identify). 모든 형태의 특정 항원, 예를 들면, 재조합 항원, 자연 발생 형태, 이의 변이체 또는 단편 뿐만 아니라 이의 항원성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다.

항체를 제조하는 예시적인 방법 중의 하나는 단백질 발현 라이브러리, 예를 들면, 파지(phage) 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함 한다. 파지 디스플레이는, 예를 들면, 문헌[참조: Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; and WO 90/02809]에 기재되어 있다.

디스플레이 라이브러리의 사용 이외에, 특정 항원을 사용하여 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스, 햄스터 또는 랫트를 면역화시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들면, 마우스 항체 제조이 결핍된 마우스 종을 사람 Ig 좌(locus)의 거대 단편으로 가공할 수 있다. 하이브리도마 기술을 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 유전자로부터 유도된 항원-특이 모노클로날 항체를 제조 및 선택할 수 있다[참조: XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, published Oct. 31, 1996, and PCT Application No. PCT/US96/05928, filed Apr. 29, 1996].

또 다른 양태에서, 모노클로날 항체를 비-사람 동물로부터 입수한 다음, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 변화, 예를 들면, 사람화, 탈면역화, 키메릭 항체를 제조할 수 있다. 키메릭 항체를 제조하기 위한 각종 방법들이 기재되어 있다[참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP 171496; European Patent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B]. 사람화 항체는 또한, 예를 들면, 사람 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현하지만 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없는 유전자삽입 마우스(transgenic mouse)를 사용하여 제조할 수 있다. 윈터(Winter)는 본원에 기재된 사람화 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 예시적인 CDR-이식 방법을 기재하고 있다(미국 특허 제5,225,539호 참조). 특정 사람 항체의 CDR 모두가 비-사람 CDR의 적어도 일부로 대체되거나, CDR의 단지 일부만이 비-사람 CDR로 대체될 수 있다. 사람화 항체를 소정의 항원에 결합하기 위해 필요한 CDR의 수를 대체하는 것만이 필요하다.

사람화 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 도메인의 서열을 사람 Fv 가변 도메인으로부터의 대응하는 서열(equivalent sequence)로 대체함으로써 생성시킬 수 있다. 사람화 항체 또는 이의 단편을 생성하기 위한 예시적인 방법이 문헌(참조: Morrison (1985) Science 229:1202-1207; by Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; US 6,407,213)에 제공되어 있다. 이러한 방법들은 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄로부터 면역글로불린 Fv 가변 도메인의 전부 또는 일부를 부호화하는 핵산 서열을 분리, 조작 및 발현함을 포함한다. 이러한 핵산은 상기한 바와 같이 소정의 표적에 대해 항원을 제조하는 하이브리도마로부터 및 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그후, 사람화 항체 분자를 부호화하는 재조합 DNA를 적당한 발현 벡터로 복제할 수 있다.

특정 양태에서, 사람화 항체는 보존적 치환(conservative substitution), 공 통 서열 치환(consensus sequence substitution), 배선 치환(germline substitution) 및/또는 복귀 돌연변이(backmutation)의 도입에 의해 최적화된다. 이러한 변형된 면역글로불린 분자는 당업계에 공지된 몇 가지 기술(참조: Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol, 92: 3-16, 1982)에 의해 제조될 수 있으며, PCT 공보 제WO 92/06193호 또는 유럽 특허공보 제0239400호의 교시에 따라 제조할 수 있다.

항체는 또한 국제 공개공보 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호에 기재된 방법에 의한 "탈면역화(deimmunization)" 또는 사람 T 세포 에피토프의 특이 결손에 의해 변형될 수 있다. 간략하게 말하면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드에 대해 분석할 수 있으며, 이러한 펩티드가 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타낸다(참조:국제 공개공보 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호). 잠재적인 T-세포 에피토프의 검출을 위해, "펩티드 트레이딩(peptide threading)"이라고 하는 컴퓨터 모델링 방법을 적용할 수 있으며, 또한 사람 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 데이터베이스를 국제 공개공보 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호에 기재된 바와 같이 V_H 및 V_L 서열에 존재하는 모티프(motif)에 대해 검색할 수 있다. 이러한 모티프가 18개의 주요 MHC 클래스 II DR 동종이형체에 결합하며, 이에 따라 잠재적인 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적인 T-세포 에피토프는 가변 도메인에서 소수의 아미노산 잔기를 치환함으로써 또는 바람직하게는, 단일 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있다. 전형적으로, 보존적 치 환이 이루어진다. 종종, 독점적인 것은 아니지만, 사람 배선 항체 서열에서의 위치에 공통인 아미노산이 사용될 수 있다. 사람 배선 서열은, 예를 들면, 문헌(참조: Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; and Tomlinson et al. (1995) EMBOJ. 14:4628-4638)에 기재되어 있다. V BASE 디렉토리는 사람 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리를 제공한다(참조: Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). 이러한 서열은, 예를 들면, 구조형성 영역 및 CDR를 위한 사람 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 공통(consensus) 사람 구조형성 영역이, 예를 들면, 미국 특허 제6,300,064호에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

특정 양태에서, 항체는 변형된 면역글로불린 불변 또는 Fc 영역을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원의 교시사항에 따라 제조된 항체는 효과기 세포 활성, 용리(lysis), 보체-매개된 활성, 항체 제거율(clearance) 및 항체 반감기와 같은 항체의 몇 가지 면역 기능을 조절할 수 있는, 보체 및/또는 Fc 수용체와 같은 효과기 분자에 더 강력하게 또는 더 특이적으로 결합할 수 있다. 항체(예를 들면, IgG 항체)의 Fc 영역에 결합하는 전형적인 Fc 수용체는 대립유전자 변이체를 포함한 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn 서브클래스의 수용체 및 대안적으로 이들 수용체의 접합된 형태(spliced form)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Fc 수용체에 대해서는 문헌[참조: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods 4:25-34,1994; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995]에 검토되어 있다.

본 발명의 방법으로 분리할 수 있는 항체의 비제한적인 예는 Aβ, IL-13, IL-22, GDF8 및 5T4에 대한 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 항체 각각은 하기 및 첨부된 실시예에 더 상세하게 기재되어 있다.

항- GDF8 항체

본 발명의 방법에 사용할 수 있는 예시적인 항체는 항-GDF8 항체이다. "GDF-8"은 성장 및 분화 인자-8 및, 경우에 따라, GDF-8과 구조적 또는 기능적으로 관련된 인자, 예를 들면, BMP-11 및 TGF-β 상과(superfamily)에 속하는 기타의 인자를 나타낸다. 상기 용어는 GDF-8의 전장 비가공 전구체 형태 뿐만 아니라 해독후 절단(post-translational cleavage)으로부터 야기된 성숙한 프로펩티드 형태를 나타낸다. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하여 성숙 GDF-8과 관련된 적어도 일부의 생물학적 활성을 보유하는 GDF-8의 단편 및 변이체를 나타낸다. 아미노산 서열 사람 GDF-8 뿐만 아니라 기타의 다수의 척추동물 종(쥐, 바분, 소, 닭 포함)이, 예를 들면, 문헌[참조: U.S. 04/0142382, US 02/0157125, and McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:12457-12461]에 기재되어 있다. GDF-8에 대한 중화 항체, 예를 들면, Myo-029의 예가, 예를 들면, 미국 특허 제2004/0142382호에 기재되어 있으며, 본원에 첨부된 실시예를 참조한다. 예시적인 질환 및 장애는 근육 및 신경근육 장애, 예를 들면, 근이영양증(듀센 근이영양 증(Duchenne's muscular dystrophy) 포함); 근위축성 측삭 경화증; 근위축증; 기관 위축증; 무름(frailty); 터널 증후군; 울혈성 폐쇄성 폐질환; 근력감퇴, 악액질 및 기타의 근소모 증후군; 지방 조직 장애(예를 들면, 비만); 2형 당뇨병; 손상된 글루코즈 내성; 대사 증후군(예를 들면, X 증후군); 화상 또는 질소 불균형과 같은 외상에 의해 유도된 인슐린 내성; 및 골 퇴행성 질환(예를 들면, 골관절염 및 골다공증)을 포함한다.

항-Aβ 항체

항-Aβ 항체 제제의 유백광의 감소는 본 발명의 교시사항에 따라 실시할 수 있다. "AB 항체", "Aβ 항체", "항-Aβ 항체" 및 "항-Aβ"는 APP, Aβ 단백질 또는 이들 둘 다의 하나 이상의 에피토프 또는 항원결정기(antigenic determinant)에 결합하는 항체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 예시적인 에피토프 또는 항원결정기는 사람 아밀로이드 전구체 단백질(APP)내에서 발견될 수 있지만, 바람직하게는 APP의 Aβ 펩티드 내에서 발견된다. APP의 다수의 동형, 예를 들면, APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ 및 APP⁷⁷⁰이 존재한다. APP 내의 아미노산은 APP⁷⁷⁰ 동형의 서열에 따라 번호가 지정된다(참조: GenBank Accession No. P05067). Aβ(본원에서는 베타 아밀로이드 펩티드 및 A 베타라고도 함) 펩티드는 APP의 39 내지 43 아미노산(Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43)의 약 4-kDa 내부 단편이다. 예를 들면, Aβ40은 APP의 잔기 672-711로 이루어지고, Aβ42는 APP의 잔기 672-713으로 이루어진다. 생체내 또는 동일계내에서의 상이한 세크레타제 효소에 의한 APP의 단백질분해적 프로세싱의 결과로서, Aβ는 40개 아미노산 길이의 "단형(short form)" 및 42 내지 43개 아미노산 길이의 "장형(long form)" 둘 다로 발견된다. 에피토프 또는 항원결정기는 Aβ 펩티드의 N-말단 내에 위치할 수 있으며, Aβ의 아미노산 1-10내의 잔기, 바람직하게는 Aβ42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-7, 3-6 또는 3-7, 또는 Aβ의 잔기 2-4, 5, 6, 7 또는 8 또는 Aβ의 잔기 3-5, 6, 7, 8 또는 9, 또는 Aβ42의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10을 포함한다. "중심" 에피토프 또는 항원결정기는 Aβ 펩티드의 중심 또는 중간-부분내에 위치하며, Aβ의 아미노산 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 19-21, 19- 22, 19-23 또는 19-24 내의 잔기를 포함한다. "C-말단" 에피토프 또는 항원결정기는 Aβ 펩티드의 C-말단내에 위치하며, Aβ의 아미노산 33-40, 33-41 또는 33-42 내의 잔기를 포함한다.

각종 양태에서, Aβ 항체는 말단-특이적(end-specific)이다. 본원에서 사용되는 "말단-특이적"은, Aβ 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 잔기에 특이적으로 결합하지만 당해 잔기를 포함하는 더 긴 Aβ 종 또는 APP에 존재하는 경우에는 동일한 잔기를 인지하지 못하는 항체를 나타낸다.

각종 양태에서, Aβ 항체는 "C 말단-특이적"이다. 본원에서 사용되는 "C 말단-특이적"은 항체가 Aβ 펩티드의 유리 C-말단을 특이적으로 인지하는 것을 의미한다. C 말단-특이적 Aβ 항체의 예는, 잔기 40에서 말단화되는 Aβ 펩티드는 인지하지만 잔기 41, 42 및/또는 43에서 말단화되는 Aβ 펩티드는 인지하지 못하는 것, 잔기 42에서 말단화되는 Aβ 펩티드는 인지하지만 잔기 40, 41 및/또는 43에서 말단화되는 Aβ 펩티드는 인지하지 못하는 것 등을 포함한다.

하나의 양태에서, 상기 항체는 3D6 항체 또는 이의 변이체, 또는 10D5 항체 또는 이의 변이체일 수 있으며, 이들 둘 다는 미국 특허 제2003/0165496A1호, 미국 특허 제2004/0087777A1호, 국제 공개공보 제WO 02/46237A3호에 기재되어 있다. 3D6 및 10D5에 대한 기재는 또한, 예를 들면, 국제 공개공보 제WO 02/088306A2호 및 국제 공개공보 제WO 02/088307A2호에서 찾아볼 수 있다. 3D6은 사람 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 1-5에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체(mAb)이다. 비교하자면, 10D5는 사람 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-6에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 양태에서, 항체는 미국 특허 제20040082762A1호 및 국제 공개공보 제WO 03/077858A2호에 기재된 바와 같이 12B4 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 12B4는 사람 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-7에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 양태에서, 항체는 미국 특허 제10/858,855호 및 국제 특허출원 제PCT/US04/17514호에 기재된 바와 같이 12A11 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 12A11은 사람 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-7에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 양태에서, 항체는 미국 특허 제10/789,273호 및 국제 특허출원 제WO 01/62801 A2호에 기재된 바와 같은 266 항체일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한, 사람 β-아밀로이드 펩티드에 위치한 C-말단 에피토프에 특이적으로 결합하도록 설계된 항체는 미국 특허 제5,786,160호에 기재된 바와 같은 369.2B를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 양태에서, 항체는 Aβ 펩티드에 선택적으로 결합하는 사람화 항 A β 펩티드 3D6 항체이다. 더 구체적으로, 사람화 항 Aβ 펩티드 3D6 항체는 (예를 들면, 알츠하이머병을 앓고 있는 환자의) 뇌의 플라크 침전물에서 발견되는 사람 β-아밀로이드 1-40 또는 1-42 펩티드에 위치한 NH₂-말단 에피토프에 특이적으로 결합하도록 설계된다.

항-Aβ 항체는 아밀로이드생성 질환, 특히 알츠하이머병을 치료하는 데 사용될 수 있다. "아밀로이드생성 질환"은 불용성 아밀로이드 섬유의 형성 또는 침착과 관련된(또는 이에 의해 유발되는) 질환을 포함한다. 예시적인 아밀로이드생성 질환에는 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성인 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매(fronto-temporal dementia) 및 프리온 관련 전염성 해면상 뇌증(사람의 구루병 및 크레이츠펠트-야콥병, 및 양 및 소의 스크래피 및 BSE)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 상이한 아밀로이드생성 질환은 침착된 섬유의 폴리펩티드 성분의 성질에 의해 정의되거나 특성화된다. 예를 들면, 알츠하이머병을 앓는 대상체 또는 환자에서, β-아밀로이드 단백질(예: 와일드형, 변이체 또는 절두된 β-아밀로이드 단백질)이 아밀로이드 침착물의 특징적 폴리펩티드 성분이다. 따라서, 알츠하이머병은 대상체 또는 환자의 뇌에서 "Aβ의 침착을 특징으로 하는 질환" 또는 "Aβ의 침착과 관련된 질환"의 한 예이다. "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

항-5 T4 항체

5T4 항원은 이전에 특징지워져 왔다(참조: 국제 공개공보 제WO 89/07947호 참조). 사람 5T4의 완전 핵산 서열은 공지되어 있다(참조: Myers et al. (1994) J Biol Chem 169: 9319-24 and GenBank at Accession No. Z29083). 다른 종으로부터의 5T4 항원, 예를 들면, 쥐과 5T4(참조: 국제 공개공보 제WO 00/29428호), 개과 5T4(참조: 국제 공개공보 제WO 01/36486호) 또는 고양이과 5T4(참조: 미국 특허 제05/0100958호)에 대한 서열 또한 공지되어 있다.

사람 5T4는 암종에서 광범위하게 발현되지만 정상 성인 조직에서는 매우 제한된 발현 패턴을 갖는 약 72 kDa의 당단백질이다. 이는 결장직장암 및 위암의 전이와 매우 상관성이 있는 것으로 보인다. 5T4 항원의 발현은 또한, 유방암 및 난소암에서도 높은 빈도로 발견된다(참조: Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10:479-84; Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69:899-902; Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66:867-9). 5T4는 종양 진행 및 전이 가능성에 대해 기계적으로 관여할 수 있는 마커(marker)로서 제안된 바 있다(참조: Carsberg et al. (1996) Int J Cancer 68:84-92). 5T4는 또한 면역치료제로서의 사용을 위해 제안된 바 있다(참조: 국제 공개공보 제WO 00/29428호). 5T4의 항원성 펩티드가, 예를 들면, 내용이 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제05/0100958호에 기재되어 있다.

몇 가지 계류중인 출원들, 예를 들면, 미국 특허 제2003/0018004호 및 제2005/0032216호는 일반적으로 항-5T4 모노클로날 항체를 부호화하는 헥산, 벡터 및 이의 숙주 세포에 관한 것이다. 일반적으로 사람화 항-5T4 H8 모노클로날 항체 및 이의 칼리키아미신 접합체(calicheamicin conjugate) 뿐만 아니라 이러한 칼리키아미신 접합체를 사용하는 치료방법에 속하는 가특허원이 출원되었다(참조: 미국 특허 제2006/0088522호). 이들 출원 모두의 내용은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.

항- IL13 항체

인터류킨-13(IL-13)은 T 림프구 및 비만 세포에 의해 분비되는 이전에 특징지워진 사이토킨이다(참조: McKenzie et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41). "IL-13"은 IL-13의 전장 비가공 전구체 형태 뿐만 아니라 해독후 절단으로부터 생성된 성숙 형태를 포함한 인터류킨-13을 나타낸다. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하여, 성숙 IL-13과 관련된 적어도 일부의 생물학적 활성을 보유하는 IL-13의 단편 및 변이체를 나타낸다. "IL-13"은 사람 IL-13 뿐만 아니라 기타 척추동물 종을 포함한다. 몇 가지 계류중인 출원들, 예를 들면, 미국 특허 제2006/0063228A호 및 제2006/0073148호는 사람 및 원숭이 IL-13에 대한 항체, IL-13 펩티드, 벡터 및 이를 제조하는 숙주 세포를 기재하고 있다. 상기한 모든 공보의 내용은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.

IL-13은 IL-4와 몇 가지 생물학적 활성을 공유한다. 예를 들면, IL-4 또는 IL-13은 B 세포에서 스위칭되는 IgE 동형을 야기할 수 있다(참조: Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800). 또한, 증가된 수준의 세포 표면 CD23 및 혈청 CD23(sCD23)이 천식 환자에서 보고되었다(참조: Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc. 20:119-25). 또한, IL-4 또는 IL-13은 B 세포 및 단핵구에서 MHC 클래스 II 및 저-친화도 IgE 수용체(CD23)의 발현을 상향조절할 수 있어 증진된 항원 전달 및 조절된 대식세포 기능을 야기할 수 있다(참조: Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800). 이러한 관찰은 IL-13이 기도 호산구증가증 및 기도 과민반응(AHR)의 발생에 있어서 중요한 플레이어(player)일 수 있음을 시사한다(참조: Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800; Wills- Karp et al. (1998) Science 282:2258-61). 따라서, IL-13의 억제는 호흡기 질환, 예를 들면, 천식; 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과도한 점액 제조, 예를 들면, 낭성 섬유증 및 폐 섬유증을 포함하는 기타의 상태; 아토피 질환, 예를 들면, 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 비염; 피부(예를 들면, 아토피성 피부염), 위장 기관(예를 들면, 염증성 장 질환(IBD), 예를 들면, 궤양성 대장염 및/또는 크론병), 간(예를 들면, 간경화, 간세포 암종)의 염증성 및/또는 자기면역 상태; 공피증; 종양 또는 암(예를 들면, 연조직 또는 고형 종양), 예를 들면, 백혈병, 아교모세포종 및 림프종, 예를 들면, 호킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma); 바이러스 감염(예를 들면, HTLV-1로부터의 감염); 다른 기관의 섬유증, 예를 들면, 간의 섬유증(예를 들면, 간염 B 및/또는 C 바이러스에 의해 유발된 섬유증)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 염증성 및/또는 알레르기성 상태의 병리를 완화시키는 데 유용할 수 있다.

항- IL22 항체

인터류킨-22(IL-22)는 IL-10과 서열 상동성을 나타내는 이전에 특징지워진 클래스 II 사이토킨이다. 이의 발현은 IL-9 또는 ConA에 의해 T 세포에서 상향조절된다(참조: Dumoutier L. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(18): 10144-9). 연구에서는, IL-22 mRNA의 발현이 LPS 투여에 반응하여 생체내에서 유도되며, IL-22가 급성기 반응을 표시하는 파라미터를 조정하고(참조: Dumoutier L. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(18): 10144-9; Pittman D. et al. (2001) Genes and Immunity 2:172), 중화 항-IL-22 항체를 사용하여 IL-22 활성을 감소시키면 마우스 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서 염증 증상이 완화되는 것으로 나타났다. 따라서, 예를 들면, 자기면역 질환(예를 들면, 관절염 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염); 호흡기 질환(예를 들면, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)); 예를 들면, 피부(예를 들면, 건선), 심혈관계(예를 들면, 죽상경화증), 신경계(예를 들면, 알츠하이머병), 신장(예를 들면, 신염), 간(예를 들면, 간염) 및 췌장(예를 들면, 췌장염)의 염증 상태를 치료하기 위해, IL-22 길항제, 예를 들면, 중화 항-IL-22 항체 및 이의 단편을 사용하여 생체내에서 면역 억제를 유도할 수 있다.

"IL-22"는 IL-22의 전장 비가공 전구체 형태 뿐만 아니라 해독후 절단으로부터 생성된 성숙 형태를 포함한 인터류킨-22를 나타낸다. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하여, 성숙 IL-22와 관련된 적어도 일부의 생물학적 활성을 보유하는 IL-22의 단편 및 변이체를 나타낸다. "IL-22"는 사람 IL-22 뿐만 아니라 기타 척 추동물 종을 포함한다. 사람 및 설치류 IL-22의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 IL-22에 대한 항체가, 예를 들면, 미국 특허 제2005-0042220호 및 제2005-0158760호 및 제6,939,545호에 기재되어 있다. 이들의 내용은 모두 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.

소분자 면역약제학( Small Modular ImmunoPharmaceuticals ( SMIP ™))

본 발명은 소분자 면역약제학(SMIP™)에도 적용할 수 있다. 이는 전형적으로 CH1을 제외한 면역글로불린 중쇄로부터의 하나 이상의 천연 또는 가공된 불변 영역을 포함하는 영역, 예를 들면, IgG 및 IgA의 CH2 및 CH3 영역 또는 IgE의 CH3 및 CH4 영역에 융합되거나 달리 결합되는 면역글로불린 힌지 또는 힌지-작용 영역 폴리펩티드에 융합되거나 달리 결합되는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-융합 단백질을 나타낸다(예를 들면, 더 상세한 설명을 위해서는 미국 특허 제05/0136049호 참조(Ledbetter, J. et al.)). 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전적으로 또는 부분적으로 유도된 작제물의 경우 CH3)에 융합되거나 달리 결합되는 힌지 영역 폴리펩티드 및 천연의 또는 가공된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전적으로 또는 부분적으로 유도된 작제물의 경우 CH4)에 융합되거나 달리 결합되는 천연의 또는 가공된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전적으로 또는 부분적으로 유도된 작제물의 경우 CH3)를 포함하는 영역을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존적 세포-매개된 세포독성, 보체 고정 및/또는 표적, 예를 들면, 표적 항원에 대한 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 활성을 나타낼 수 있다.

가용성 수용체 및 수용체 융합

본 발명은 또한 가용성 수용체 또는 이의 단편에 적용할 수 있다. 가용성 수용체의 예는 수용체의 세포외 도메인, 예를 들면, 가용성 종양 괴저 인자 알파 및 베타 수용체(TNFR-1; 1991년 3월 20일자로 공개된 유럽 특허공보 제417,563호 참조: TNFR-2, 1991년 3월 20일자로 공개된 유럽 공개공보 제417,014호 참조: 문헌[Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96] 참조, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가용성 수용체는 예를 들면, 제US 2003-0108549호(이의 내용 또한 참고로 인용되어 있다)에 기재된 바와 같은 인터류킨-21 수용체(IL-21R)의 세포외 도메인을 포함한다.

융합 단백질은 표적 잔기, 예를 들면, 가용성 수용체 단편 또는 리간드, 및 면역글로불린 쇄, Fc 단편, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE를 포함한 각종 동형의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 수용체의 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 사람 면역글로불린 Fc 쇄(예를 들면, 사람 IgG, 예를 들면, 사람 IgG1 또는 사람 IgG4, 또는 이의 돌연변이형)에 융합될 수 있다. 하나의 양태에서, 사람 Fc 서열은 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이되며, 예를 들면, 와일드형 서열로부터 잔기 254 및 257에서 돌 연변이되어 Fc 수용체 결합을 감소시킨다. 융합 단백질은 추가로 제1 잔기를 제2 잔기에 접합시키는 링커 서열, 예를 들면, 면역글로불린 단편을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 펩티드 링커, 예를 들면, 아미노산 약 4 내지 20개, 더욱 바람직하게는 아미노산 5 내지 10개 길이의 펩티드 링커를 포함할 수 있으며; 펩티드 링커는 아미노산 8개 길이이다. 예를 들면, 융합 단백질은 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_y(여기서, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다)의 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 추가의 아미노산 서열이 융합 단백질의 N- 또는 C-말단에 부가되어 발현, 입체 가요성, 검출 및/또는 분리 또는 정제를 촉진시킬 수 있다.

특정 양태에서, 가용성 수용체 융합은 가용성 TNFR-Ig(예를 들면, TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들면, p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예를 들면, 75 kd TNFR-IgG(예를 들면, 사람 IgG1의 235 아미노산 Fc 부분에 융합된 75 kD TNF 수용체)를 포함한다.

본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 통상의 기술에 따라, 예를 들면, 결찰을 위한 평활 말단(blunt-ended terminus) 또는 스태거 말단(stagger-ended terminus), 적당한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 경우에 따라 접착 말단(cohesive end)의 충전, 바람직하지 않은 접합을 피하기 위한 알칼리 포스파타아제 처리 및 효소 결찰을 사용하여 골격내에서 함께 결찰된다. 또 다른 양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함한 통상의 기술에 의해 합성할 수 있다. 또는, 유전자 단편의 PCR 증폭을, 이후에 어닐링 및 재증폭시켜 키메릭 유전자 서열을 생성시킬 수 있는 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보성 오버행(complementary overhang)을 야기하는 앵커 프라이머(anchor primer)를 사용하여 수행할 수 있다(참조: Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). 또한, 융합 잔기(예를 들면, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역)를 부호화하는 다수의 발현 벡터가 시판되고 있다. 면역글로불린 융합 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제5,516,964호; 제5,225,538호; 제5,428,130호; 제5,514,582호; 제5,714,147호; 및 제5,455,165호에 기재되어 있다.

성장 인자 및 사이토킨

약제학적 및/또는 상업적 제제로서 효과적인 것으로 나타났고 본 발명의 교시사항에 따라 바람직하게 제조할 수 있는 폴리펩티드의 또 다른 종류는 성장 인자 및 기타의 시그널링 분자, 예를 들면, 사이토킨을 포함한다.

성장 인자는 전형적으로, 세포에 의해 분비되고 다른 세포 상의 수용체에 결합되어 이를 활성화시켜 수용체 세포에서의 대사적 또는 발생적 변화를 개시하는 당단백질이다. 포유류 성장 인자 및 기타의 시그널링 분자의 비제한적인 예는 사이토킨; 상피세포 성장 인자(EGF); 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF), 예를 들면, aFGF 및 bFGF; 전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4 또는 TGF-베타 5를 포함한 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들면, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태발생 단백질(bone morphogenetic protein; BMP); 인터페론, 예를 들면, 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(TL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-13(예를 들면, IL-11); 종양 괴저 인자 알파 및 베타; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrands factor); 항-응고 인자, 예를 들면, 단백질 C; 심방성 나트륨 이뇨 인자(atrial natriuretic factor); 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들면, 유로키나아제 또는 사람 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제(t-PA); 봄베신; 트롬빈, 조혈 성장 인자; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted: 일반적으로 T세포 발현 및 분비된 활성화에 대해 조절됨); 사람 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 멀러리안(mullerian) 억제 물질; 릴렉신 A-쇄; 릴렉신 B-쇄; 프로릴렉신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 신경영양 인자, 예를 들면, 골-유도된 신경영양 인자(BDNF: bone-derived neurotrophic factor), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-베타를 포함한다. 당해 기술분야의 숙련가들은 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 발현될 수 있는 기타의 성장 인자 또는 시그널링 분자를 인지할 것이다.

성장 인자 또는 기타의 시그널링 분자의 글리코실화 패턴에 있어서의 특이적인 변형은 이들의 치료학적 특성에 있어서 극적인 효과를 갖는 것으로 나타났다. 한 가지 예로서, 만성 빈혈을 앓고 있는 환자를 위한 통상적인 치료방법은 적혈구의 제조을 촉진시키기 위해 재조합 사람 에리트로포이에틴(rHuEPO: recombinant human erythropopietin)의 빈번한 주사를 제공하는 것이다. 통상의 rHuEPO보다 지속시간이 더 긴, rHuEPO의 유사체인 다르베포에틴 알파(ARANESP®)가 개발되었다. 다르베포에틴 알파와 rHuEPO의 주요 차이점은 2개의 가외의 살리실산-함유 N-결합된 올리고사카라이드 쇄의 존재여부이다. 다르베포에틴 알파의 제조은 시험관내 당조작(glycoengineering)을 사용하여 달성되었다(참조: Elliott et al., Nature Biotechnology 21(4):414-21, 2003, 전문이 본원에 참고로 인용되어 있음). 엘리엇 등은 시험관내 돌연변이(in vitro mutagenesis)를 사용하여 가외의 글리코실화 부위를 rHuEPO 폴리펩티드 주쇄에 삽입함으로써 다르베포에틴 알파 유사체를 발현시켰다. 가외의 올리고사카라이드 쇄는 EPO 수용체 결합 부위 말단에 위치하며 분명히 수용체 결합을 방해하지 않는다. 그러나, 다르베포에틴 알파의 반감기는 rHuEPO보다 3배까지 더 높으므로 훨씬 더 효과적인 치료제이다.

응고 인자

응고 인자는 약제학적 및/또는 상업적 제제로서 효과적인 것으로 나타났다. B형 혈우병은 환자의 혈액이 응고되지 않는 질환이다. 따라서, 출혈을 야기하는 어떠한 작은 상처라도 잠재적으로 생명을 위협한다. 예를 들면, 응고 인 자(Coagulation Factor) IX(인자 IX 또는 "FIX")는 결핍시 B형 혈우병을 야기하는 단일쇄 당단백질이다. FIX는 활성화 펩티드의 방출에 의해 이본쇄 세린 프로테아제(two-chain serine protease)(인자 IXa)로 활성화될 수 있는 단일쇄 효소원으로서 합성된다. 인자 IXa의 촉매적 도메인은 중쇄에 위치한다(참조: Chang et al., J. Clin. Invest., 100:4, 1997, 전문이 본원에 참고로 인용됨). FIX는 N-결합 및 O-결합된 탄수화물 둘 다를 포함하는 다중 글리코실화 부위를 갖는다. 세린 61에서의 한 가지 특정 O-결합된 구조(Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1-O-Ser)는 한때는 FX에 유일한 것으로 생각되었으나 그 이래로 포유동물 및 초파리에서 노치 단백질(Notch protein)을 포함한 수 개의 다른 분자 상에서 발견되었다(참조: Maloney et al., Journal of Biol. Chem., 275(13), 2000). 세포 배양물에서 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; "CHO") 세포에서 제조된 FIX는 세린 61 올리고사카라이드 쇄에서 약간의 변이성을 나타낸다. 이러한 상이한 당형태(glycoform) 및 기타의 가능한 당형태는 사람 또는 동물에 투여할 경우 응고를 유도하는 상이한 능력을 가질 수 있고/있거나 혈중에서 상이한 안정성을 가질 수 있어 덜 효과적인 응고를 초래할 수 있다.

B형 혈우병과는 임상적으로 구별하기 어려운 A형 혈우병은, 단일쇄로서 합성된 다음 이본쇄 활성 형태로 가공되는 또 다른 당단백질인 사람 응고 인자 VIII의 결손에 의해 야기된다. 본 발명은 또한 응고 활성을 조정하기 위해 응고 인자 VIII의 글리코실화 패턴을 조절 또는 변경하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 제조할 수 있는 또 다른 응고 인자는 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 포 함한다.

효소

본 발명의 교시사항에 따라 바람직하게 제조할 수 있고 약제학적 및/또는 상업적 제제로서 효과적인 것으로 나타난 또 다른 종류의 폴리펩티드는 효소를 포함한다. 효소는 당단백질로서 이의 글리코실화 패턴이 효소 활성에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명은 또한 세포 배양물에서 효소를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 제조된 효소는 더 광범위하거나 달리 더 바람직한 글리코실화 패턴을 갖는다.

한 가지 비제한적인 예로서, 글루코세레브로시다제(GCR)의 결핍은, 특정 세포의 리소좀에서의 글루코세레브로시다제의 축적에 의해 야기되는 고쉐병(Gaucher's disease)으로서 공지된 질환을 야기한다. 고쉐병을 가진 대상체는 비장비대, 간비대, 골격 장애, 혈소판 감소증 및 빈혈증을 포함한 광범위한 증상을 나타낸다. 프리드만 및 헤이즈(Friedman and Hayes)는 주요 아미노산 서열에서의 단일 치환을 함유하는 재조합 GCR(rGCR)이, 자연 발생하는 GCR과 비교하여, 변형된 글리코실화 패턴, 구체적으로 푸코스 및 N-아세틸 글루코사민 잔기의 증가를 나타낸다는 것을 보여주었다(미국 특허 제5,549,892호 참조).

또한, 프리드만 및 헤이즈는 이러한 rGCR이, 자연 발생하는 rGCR과 비교하여, 개선된 약동학적 특성을 나타냄을 입증하였다. 예를 들면, 자연 발생하는 GCR보다 대략 2배 더 많은 rGCR이 간 쿠퍼 세포(Kupffer cell)를 표적화하였다. 2개의 단백질의 주요 아미노산 서열이 단일 잔기에서 상이하지만, 프리드만 및 헤이즈 는 rGCR의 변형된 글리코실화 패턴이 쿠퍼 세포의 표적화에도 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 당해 기술분야의 통상의 숙련가들은 글리코실화 패턴의 변화로부터 야기되는 변경된 효소적, 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 나타내는 또 다른 공지된 효소의 예를 알 것이다.

단백질 제조

본 발명에 따라 단백질을 제조하는 재조합 방법은 당업계에 공지되어 있다. 단백질을 부호화하는 뉴클레오티드 서열은 전형적으로, 폴리펩티드를 제공하는 목적하는 양의 변형된 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 숙주 세포로 도입하기 위한 발현 벡터에 삽입된다. "벡터"는 핵산, 예를 들면, 유전자를 종종 포함하고 추가로 핵산 복제, 전사, 안정성 및/또는 숙주 세포로부터의 단백질 발현 또는 분비에 필요한 최소의 인자를 포함하는 핵산 작제물을 포함한다. 이러한 작제물은 염색체외 인자로서 존재할 수 있거나 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.

"발현 벡터"는 핵산 작제물이 목적하는 단백질 산물의 높은 수준의 발현을 위해 최적화되는 특정 유형의 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 종종, 특정 세포 유형에서의 높은 수준의 전사를 위해 최적화되고/되거나 발현이 특정 유도제의 사용을 기초로 하여 구성되도록 최적화된 전사 조절제, 예를 들면, 프로모터 및 인핸서 인자를 갖는다. 발현 벡터는 단백질의 적합한 및/또는 증진된 해독을 제공하는 서열을 추가로 갖는다. 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 그룹으로부터 용 이하게 선택될 수 있다. "발현 카세트(expression cassette)"는 유전자를 함유하고, 유전자 이외에, 숙주 세포에서 유전자의 적합하고 증진된 발현을 가능케 하는 인자를 갖는 핵산 작제물을 포함한다. 항체를 제조하기 위해, 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 서열은 동일한 핵산 분자(예를 들면, 동일한 발현 벡터)에 존재하거나, 또는 별도의 핵산 분자(예를 들면, 별도의 발현 벡터)로부터 발현될 수 있다.

"작동가능하게 연결된(operably linked)"은 성분이 이들의 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 병치 형태를 포함한다(예를 들면, 기능적으로 연결된). 예로서, 관심있는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로머터/인핸서는 관심있는 폴리뉴클레오티드의 발현이 프로모터/인핸서에 의해 지시된 발현을 활성화시키는 조건하에서 달성되도록 상기 폴리뉴클레오티드에 결찰된다.

발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분(integral part)으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질감염된 세포를 검출할 수 있는 선별 마커(예를 들면, 암피실린-내성, 히그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 내오마이신 내성)를 함유한다(참조: 미국 특허 제4,704,362호(Itakura et al.)). 면역글로불린 DNA 카세트 서열, 인서트 서열 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포(예를 들면, 복제 기점)의 벡터 및 선별 마커 유전자의 복제를 조절하는 서열과 같은 추가의 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선별을 촉진시킨다[참조: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(Axel et al.)]. 예를 들면, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포에 약물, 예를 들면, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr^- 숙주 세포에서 사용하기 위해) 및 네오 유전자(G418 선별을 위해)를 포함한다.

벡터가 적합한 숙주 세포에 삽입되면, 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현 및 목적하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에서 유지된다. 세포 배양 및 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 영향을 받기 쉬운 어떠한 숙주 세포라도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 포유류의 세포이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유류 세포의 비제한적인 예는 BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/1, ECACC No: 85110503); 사람 망막아세포(PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); SV40에 의해 형질감염된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(현택 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포)(참조: Graham et al., J. Gen Virol, 36:59, 1977); 새끼 햄스터 신장 세포주(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포(Sertoli cell)(TM4)(참조: Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 푸른 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 자궁경부암 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W 138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(참조: Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다.

추가로, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 다수의 시판 및 비시판 하이브리도마 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가들은 하이브리도마 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/있거나 최적의 성장 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현을 위한 상이한 배양 조건을 필요로 할 수 있음을 인지할 것이며, 필요에 따라 조건을 변형시킬 수 있을 것이다.

이러한 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들면, 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(참조: Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들면, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 등으로부터 유도된 프로모터이다(참조: Co et al., (1992) J. Immunol. 148:1149). 포유류 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 인자, 예를 들면, FF-1a 프로모터 및 BGH 폴리 A, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40)(예를 들면, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바 이러스 주요 후발 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스성 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가의 설명을 위해서는, 예를 들면, 미국 특허 제5,168,062호(Stinski), 미국 특허 제4,510,245호(Bell et al.) 및 미국 특허 제4,968,615호(Schaffher et al.)를 참고한다. 예시적인 양태에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 높은 수준의 유전자 전사를 추진하는 인핸서/프로모터 조절 인자(예를 들면, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유도된 것, 예를 들면, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자)에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 예시적인 양태에서, 작제물은 진핵성 숙주 세포에서 비교적 높은 수준의 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES)를 포함한다. 상용성 IRES 서열이 미국 특허 제6,193,980호에 기재되어 있으며, 이것 또한 본원에 인용되어 있다.

또는, 부호화 서열은 유전자삽입 동물의 게놈으로의 도입 및 이후의 유전자삽입 동물의 젖에서의 발현을 위해 외래도입유전자(transgene)에 삽입될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,741,957호(Deboer et al.), 미국 특허 제5,304,489호(Rosen) 및 미국 특허 제5,849,992호(Meade et al.)). 적합한 외래도입유전자는 포유류 선 특이 유전자, 예를 들면, 카제인 또는 베타 락토글로불린으로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하게 결합하는 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 부호화 서열을 포함한다.

원핵 숙주 세포가 또한 본 발명의 항체를 제조하는 데 적합할 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, DNA 서열)를 클로닝하는 데 특히 유용한 원핵 숙주 중의 하나이다. 사용하기에 적합한 또 다른 미생물성 숙주는 바실러스, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들면, 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella) 및 세라티아(Serratia) 및 각종 슈도모나스 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 또한 발현 벡터를 제조할 수 있으며, 이는 전형적으로 숙주 세포(예를 들면, 복제 기점)와 상용성인 발현 조절 서열을 함유할 것이다. 또한, 다수의 각종 널리 알려진 프로모터, 예를 들면, 락토즈 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 임의로 작동자 서열과 함께 발현을 조절하며, 전사 및 해독을 개시 및 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.

원핵생물에서의 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 갖는 이. 콜라이에서 가장 빈번하게 실시된다. 융합 벡터는, 항체의 특이성 또는 항원 인지에 영향을 미치지 않으면서, 이에 부호화되는 항체에, 종종 재조합 항체의 불변 영역에 다수의 아미노산을 부가한다. 융합 펩티드의 아미노산의 부가는 항체에 추가의 기능을 부가하며, 예를 들면, 마커(예를 들면, 에피토프 태그, 예를 들면, myc 또는 플래그(flag))로서의 기능을 부가할 수 있다.

다른 미생물, 예를 들면, 효모 또한 발현에 유용하다. 경우에 따라 발현 조 절 서열(예를 들면, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는 사카로마이세스(saccharomyces)가 바람직한 호모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타의 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 그중에서도 알콜 데하이드로게나아제로부터의 프로모터, 이소시토크롬 C 및 말토즈 및 갈락토즈 이용을 책임지는 효소를 포함한다.

관심있는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들면, 중쇄 및 경쇄 부호화 서열 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 전사될 수 있으며, 이는 세포성 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들면, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포에 통상적으로 사용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공, 라이포펙션(lipofection), 바이오리스틱스(biolistics) 또는 바이러스-기본 형질감염은 다른 세포성 숙주에 사용될 수 있다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989), 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 인용되어 있음). 포유류 세포를 형질변환시키는 데 사용되는 또 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주입의 사용을 포함한다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). 유전자삽입 동물을 제조하기 위해, 외래도입유전자를 수정된 난모세포에 미세주입하거나 배아 줄기 세포의 게놈 및 핵이 없는 난모세포로 전사된 이러한 세포의 핵에 삽입할 수 있다.

중쇄 및 경쇄가 별도의 발현 벡터에서 클로닝되는 경우, 벡터를 동시-형질감염시켜 비손상 면역글로불린의 발현 및 어셈블리를 수득한다. 일단 발현되면, 전 체 항체, 이의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 본 발명의 다른 면역글로불린 형태를 본원에 기재된 바와 같이 분리하고/하거나 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계에 공지된 과정에 따라 추가로 정제할 수 있다(참조: Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N. Y., (1982)). 약제학적 용도를 위해서는 상동성이 적어도 약 90 내지 95%인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 상동성이 98 내지 99% 이상인 것이 가장 바람직하다.

단백질 정제

본 발명에 따라 발현된 단백질을 분리 및/또는 정제하는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 발현된 단백질은 배지로 분비되고, 이에 따라, 세포 및 다른 고체가, 예를 들면, 정제 공정의 제1 단계로서 원심 분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다.

몇몇 양태에서, 발현된 단백질은 숙주 세포의 표면에 결합된다. 이러한 양태에서, 배지는 제거되고, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 숙주 세포는 정제 공정의 제1 단계로서 용리된다. 포유류 숙주 세포의 용리는 유리 비드에 의한 물리적 분해 및 고 pH 조건으로의 노출을 포함하는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 방법으로 달성할 수 있다.

단백질은 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화도, 크기 배제 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리 또는 용해도 차이, 에탄 올 침전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 방법 또는 단백질 정제를 위한 기타의 이용 가능한 기술에 의해 분리 및 정제할 수 있다(참조: Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, VoI 182), Academic Press, 1997)(이들 문헌은 각각 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다). 특히 면역친화 크로마토그래피의 경우, 단백질은, 해당 단백질에 대해 야기되고 고정 지지체에 부착되는 항체를 포함하는 친화성 컬럼에 결합시킴으로써 분리할 수 있다. 친화력 태그, 예를 들면, 인플루엔자 코트 서열, 폴리-히스티딘 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 표준 재조합 기술에 의해 단백질에 부착시켜, 적합한 친화성 컬럼에 통과시킴으로써 용이하게 정제할 수 있다. 정제 공정 동안 폴리펩티드 또는 단백질의 분해를 감소시키거나 없애기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들면, 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 류펩틴, 펩스타틴 또는 아프로티닌을 임의의 단계 또는 모든 단계에서 첨가할 수 있다. 프로테아제 억제제는, 발현된 폴리펩티드 또는 단백질을 분리 및 정제하기 위해 세포가 용리되어야 하는 경우에 특히 유리하다.

본 발명의 특정 방법에 따라 발현된 단백질은 본 발명이 아닌 세포 배양 조건하에서 성장시키는 것보다 더 광범위하고/하거나 변형된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 따라서, 정제 단계에서 이용할 수 있는 본 발명의 실용적인 이익 중의 하나는 본 발명의 특정 방법 및/또는 조성물에 따라 성장된 당단백질 위에 존재하는 추가의 및/또는 변형된 당 잔기가, 본 발명이 아닌 방법 및/또는 조성물에 따라 성장된 당단백질에서 가능한 것보다 더 용이하게 또는 더 큰 순도로 전문가가 당단백질을 정제하는 데 사용될 수 있는 뚜렷한 생화학적 특성을 부여할 수 있다는 것이다.

당해 기술분야의 통상의 숙련가들은 정확한 정제 기술이 정제 대상 폴리펩티드 또는 단백질의 특성, 폴리펩티드 또는 단백질이 발현되는 세포의 특성 및/또는 세포가 성장되는 배지의 조성에 따라 다를 수 있음을 인지할 것이다.

약제학적 제형

본 발명의 단백질 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 존재하에서 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 단백질 제제를 함유하는 조성물은 비경우, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 경구, 구강, 설하, 비내, 기관지, 눈(opthalmic), 경피(국소), 경점막, 직장 및 질 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 이용 가능한 경로에 의해 대상체에 투여하거나 먼저 전달을 위해 제형화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 포유류 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 또는 단백질, 전달제(즉, 상기한 바와 같은 양이온성 중합체, 펩티드 분자 수송체, 계면활성제 등)를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균 및 항진균 제제, 등장성 및 흡수 지연 제 등을 포함한다. 추가의 활성 화합물이 또한 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 제조된 단백질 또는 폴리펩티드를 전신 약물요법을 위한 약물, 예를 들면, 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물학적 반응 변화제 및 방사성 핵종에 접합시킬 수 있다(참조: Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US 04/0082764 A1). 본 발명에 따라 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 추가의 성분은, 예를 들면, 방향제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충전제, 활주제, 압축 조제, 결합제, 정제-붕해제, 캡슐화제, 유화제, 완충제, 방부제, 감미제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정제 또는 삼투-조절제 또는 이들의 배합물을 포함한다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명에 따라 제조된 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제와 함께(동시에 또는 연속해서) 투여할 수 있다. 이러한 약제학적 활성제의 예시적인 목록은 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: the Physicians' Desk Reference, 55 Edition, published by Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, 2001]에서 찾아볼 수 있다. 다수의 이들 열거된 제제들의 경우, 약제학적 유효 투여량 및 섭생은 당업계에 공지되어 있으며; 다수가 상기 문헌(Physicians' Desk Reference) 자체에 제시되어 있다.

고체 약제학적 조성물은 하나 이상의 고체 담체 및 임의로 하나 이상의 기타의 첨가제, 예를 들면, 방향제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충전제, 활주제, 압축 조제, 결합제 또는 정제-붕해제 또는 캡슐화제를 함유할 수 있다. 적합한 고체 담체는, 예를 들면, 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토즈, 덱스트린, 전 분, 젤라틴, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 또는 이온 교환 수지, 또는 이들의 배합물을 포함한다. 분말 약제학적 조성물에서, 담체는 미분된 활성 성분과 혼합되어 있는 미분된 고체일 수 있다. 정제에서, 활성 성분은 일반적으로 적합한 비율로 필요한 압축 특성을 갖는 담체 및 임의로 기타의 첨가제와 혼합되고 목적하는 형태와 크기로 압착된다.

액체 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드 또는 단백질 및 하나 이상의 액체 담체를 함유하여 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭서 또는 가압 조성물을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 액체 담체는, 예를 들면, 물, 유기 용매, 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방, 또는 이들의 배합물을 포함한다. 액체 담체는 가용화제, 유화제, 완충제, 방부제, 감미제, 방향제, 현탁제, 증점제, 색, 점도 조절제, 안정제 또는 삼투-조절제, 또는 이들의 배합물과 같은 다른 적합한 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 액체 제형이 소아과에서 사용하기 위해 의도되는 경우, 알콜을 포함시키지 않거나 이의 양을 제한하는 것이 일반적으로 바람직하다.

경구 또는 비경구 투여에 적합한 액체 담체의 예는 물(임의로 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 유도체와 같은 첨가제 함유), 알콜 또는 이들의 유도체(1가 알콜 또는 다가 알콜, 예를 들면, 글리콜 포함) 또는 오일(예를 들면, 분별화된 코코너유 및 낙화생유)을 포함한다. 비경구 투여를 위해, 담체는 또한 오일상 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 가압 조성물을 위한 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 기타의 약제학적으 로 허용되는 추진제일 수 있다.

멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약제학적 조성물은, 예를 들면, 근육내, 복강내, 경막외, 경막내, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 비경구 투여될 수 있다. 경구 또는 경점막 투여용 약제학적 조성물은 액체 또는 고체 조성물 형태일 수 있다.

특정 양태에서, 약제학적 조성물은 이의 의도되는 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 비경구, 경피 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은, 멸균 희석제, 예를 들면, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타의 합성 용매; 항균제, 예를 들면, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트화제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성(tonicity)을 조절하기 위한 제제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 성분들을 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예를 들면, 염산 또는 수산화나트륨으로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 시린지 또는 유리나 플라스틱으로 만든 다수회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.

주사 용도에 적합한 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 수용액(수용성인 경) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수(bacteriostatic water), CREMOPHOR EL™(미국 뉴저지주 파시파니에 소재한 BASF 제조) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어 야 하며, 용이한 주사능(syringability)이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 유리하게는, 특정 약제학적 제형은 제조 및 저장 조건하에서 안정하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 일반적으로, 관련 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 특정 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 다가 알콜, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 유리할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

멸균 주사 가능한 용액은 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 필요량으로, 필요에 따라 앞서 열거한 성분들 중의 하나 또는 배합물과 함께, 적당한 용매에 혼입시킨 다음 여과 살균시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 포유류 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 염기성 분산 매질 및 앞서 열거한 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 유리한 제조방법은 활성 성분과 앞서 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성 하는 진공 건조 및 동결-건조이다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 가용성 담체를 포함한다. 경구 치료학적 투여를 위한 목적으로, 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 부형제와 함께 혼입시키고, 정제, 트로키제 또는 캡슐제, 예를 들면, 젤라틴 캡슐제의 형태로 사용할 수 있다. 경구 조성물은 또한, 예를 들면, 구강청정제로서의 용도를 위해 유동성 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은, 결합제, 예를 들면, 미세결정성 셀룰로즈, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 전분 또는 락토즈; 붕해제, 예를 들면, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활주제, 예를 들면, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들면, 수크로즈 또는 사카린; 또는 방향제, 예를 들면, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향과 같은 성분들, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들면, 어린이, 정제를 삼키는 능력이 떨어지는 개인 또는 동물에게 투여하기 쉽게 하기 위해 츄어블하거나 액상인 제형 또는 식품 재료 또는 액체와 혼합할 수 있다. 경구 전달용 제형은 유리하게는 위장관내에서의 안정성을 향상시키고/시키거나 흡수를 증진시키는 제제를 포함할 수 있다.

흡입에 의해 투여의 경우, 포유류 세포주로부터 발현된 단백질 제제 및 전달제를 포함하는 본 발명의 조성물은 또한 비내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 적당한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디 클로로테트라플루오로메탄, 하이드로플루오로알칸, 예를 들면, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A™) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA™), 이산화탄소 또는 기타의 적합한 가스를 사용하거나 사용하지 않고서 가압 용기, 펌프, 스프레이, 아토마이저 또는 분무기로부터 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸 스프레이 형태로 통상적으로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된, 예를 들면, 치료학적 유효량을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 본 발명은 특히 비강 스프레이, 흡입기, 또는 상부 및/또는 하부 기도로의 기타의 직접 전달을 사용한 본 발명의 조성물의 전달을 고려한다. 인플루엔자 바이러스에 대해 지시된 DNA 백신의 비내 투여는 CD8 T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 호흡기의 적어도 일부의 세포가 이러한 경로로 전달되는 경우 DNA를 차지할 수 있으며, 본 발명의 전달제가 세포 흡수를 증진시킬 것임을 나타낸다. 특정 양태에 따르면, 포유류 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 및 전달제를 포함하는 조성물은 에어로졸 투여를 위해 큰 다공성 입자로서 제형화된다.

변화 방출 및 박동 방출 경구 투여 형태는 방출 속도 변화제로서 작용하는 부형제를 함유할 수 있으며, 이들은 장치의 몸체에 피복되고/되거나 이에 포함된다. 방출 속도 변화제는 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 크산탄 검, 카보머, 암모니오 메타크릴레이트 공중합체, 수소화 피마자유, 카누바 왁스, 파라핀 왁스, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한 되지 않는다. 변화 방출 및 박동 방출 경구 투여 형태는 방출 속도 변화 부형제 중의 하나 또는 배합물을 함유할 수 있다. 방출 속도 변화 부형제는 투여 형태내에, 즉 매트릭스 내에 및/또는 투여 형태 위에, 즉 표면 또는 피복물 위에 존재할 수 있다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과 대상 차단막에 적합한 투과제가 제형에 사용된다. 이러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 및 전달제는, 예를 들면, 하나 이상의 광유, 액상 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물과의 혼합물에 현탁되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로서 제형화될 수 있다. 또는, 이들은 예를 들면, 하나 이상의 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액상 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜 및 물의 혼합물에 현탁되거나 용해된 적합한 로션 또는 크림으로서 제형화될 수 있다.

또는, 상기 화합물은 좌제 또는 질 좌약(pessary) 형태로 투여될 수 있거나, 겔, 하이드로겔, 로션 또는 기타의 글리세라이드, 용액, 크림, 연고 또는 살포성 분말(dusting powder) 형태로 국소적으로 적용될 수 있다.

몇몇 양태에서, 조성물은 단백질이 신체로부터 신속하게 제거되는 것을 보호 하는 담체, 예를 들면, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제형으로 제조된다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 즉시 방출, 지연 방출, 변화 방출, 서방출, 펄스 방출 또는 제어-방출 전달을 위해 제형화될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조방법은 당해 기술분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 적합한 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜성 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 감염된 세포에 표적화된 리포솜 포함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 단백질은 또한 사이클로덱스트린과 함께 사용될 수 있다. 사이클로덱스트린은 특정 분자와 포접 착물(inclusion complex) 및 비포접 착물(non-inclusion complex)을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 사이클로덱스트린 착물의 형성은 단백질 또는 폴리펩티드의 용해도, 용해 속도, 생체이용효율 및/또는 안정성을 변화시킬 수 있다. 사이클로덱스트린 착물은 일반적으로 대부분의 투여 형태 및 투여 경로에 유용하다. 단백질 또는 폴리펩티드와의 직접 착화에 대한 대안으로서, 사이클로덱스트린은 보조 첨가제로서, 예를 들면, 담체, 희석제 또는 가용화제로서 사용될 수 있다. 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린이 가장 통상적으로 사용되며, 적합한 예는 공개된 국제 공개공보 제WO 91/11172호, 제WO 94/02518호 및 제WO 98/55148호에 기재되어 있다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단위 투여 형태, 예를 들면, 정제 또는 캡슐제로 제공된다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서는 경구 또는 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 형태에서, 조성물은 적당량의 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투여 형태는 패키지된 조성물, 예를 들면, 패킷화 분말(packeted powder), 액체를 함유하는 바이알, 앰풀, 예비-충전된 시린지 또는 사쉐일 수 있다. 단위 투여 형태는, 예를 들면, 캡슐제 또는 정제 자체일 수 있거나, 이는 패키지 형태의 적당한 수의 이러한 조성물일 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가들이 인지하는 바와 같이, 치료학적으로 유효한 단위 투여량은, 예를 들면, 투여방법, 폴리펩티드 또는 단백질의 효능 및/또는 수용자의 체중 및 약제학적 조성물 중의 다른 성분의 정체(identity)를 포함하는 몇 가지 인자에 좌우될 것이다.

단백질 제제, 예를 들면, 이를 함유하는 약제학적 조성물은 필요에 따라 각종 간격으로 및 상이한 시간에 걸쳐, 예를 들면, 약 1 내지 10주, 2 내지 8주, 약 3 내지 7주, 약 4, 5 또는 6주 동안 매주 1회 투여할 수 있다. 숙련가들은 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 일반적인 건강 및/또는 대상체의 연령 및 기타의 존재하는 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 대상체를 상기한 바와 같이 폴리펩티드 또는 단백질로 처리하는 것은 단일 처 리 또는 연속 처리를 포함할 수 있다. 추가로, 적합한 투여량은 폴리펩티드 또는 단백질의 효능에 좌우될 수 있고, 임의로, 예를 들면, 예비선택된 목적하는 반응이 달성될 때까지 용량을 증가시키면서 투여함을 통해 특정 수용자에 맞출 수 있다는 것으로 이해된다. 특정 동물 대상체에 대한 특수한 투여 수준은 사용되는 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설률, 약물 병용 및 조절 대상 발현 또는 활성의 정도를 포함하는 각종 인자에 좌우될 것으로 이해된다.

본 발명은 비사람 동물의 치료를 위한 본원에 기재된 조성물의 용도를 포함한다. 따라서, 투여량 및 투여방법은 수의 약리학 및 의학의 공지된 원리에 따라 선택될 수 있다. 이에 대한 안내는, 예를 들면, 문헌[참조: Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001]에서 찾아볼 수 있다.

약제학적 조성물은 투여에 대한 사용설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

하기 실시예는 예시적이며 이에 제한되는 것은 아니다.

항체 M1 내지 M3의 용액을 상이한 염 농도, 즉 상이한 이온 강도에서 정적 광 산란, 동적 광 산란 및 비대칭 유동 장 유동 분별에 의해 평가하였다.

항체 용액 제조

모든 용액은 실온에서 밤새 2번 완충액을 교체하면서 적당한 염-함유 완충 용액에 투석함으로써 제조하였다.

기기 분석:

정적 광 산란

정적 광 산란(SEC-MALS)을 사용하여 항체 용액의 중량 평균 분자량을 측정하였다. 정적 광 산란 실험을 위해, 항체 용액을 4mg/㎖로 되도록 희석시키고, 다수의 샘플을 기기에 수동으로 주입하였다. 항체 용액을 와이어트 테크놀러지(Wyatt Technology)로부터의 Mini Dawn 기기를 사용하여 다중 각도(45, 90 및 135)에서 정적 광 산란을 사용하여 20℃에서 측정하였다. 90°에서의 산란 데이터를 사용하여 중량 평균 분자량을 계산하였다. 완전한 데이터 세트(다중 각도)를 사용하여, 분자량 및 2차 비리얼 계수를 계산하는 데 사용되는 짐 플롯을 작성하였다.

동적 광 산란

동적 광 산란을 사용하여 용액 중의 항체의 입자 크기를 측정하였다. 항체 용액을 와이어트 테크놀러지로부터의 DynaPro 기기를 사용하여 90° 각도 및 25℃에서 측정하였다.

비대칭 유동 장 유동 분별

비대칭 유동 장 유동 분별(AF4)을 또한 사용하여 용액 중의 항체의 입자 크기를 측정하였다. AF4 측정은 와이어트 테크놀러지로부터의 Eclipse 기기에서 수행하였다. AF4 분석 파라미터는 다음과 같다: 온도 2O℃, 실험 완충액은 투석 완충액과 동일함, 10KDa 컷오프 멤브레인(cutoff membrane).

광학 밀도

단백질 샘플의 탁도는 400nm의 파장에서 SpectraMax UV-Vis를 사용하여 겉보기 광학 밀도(특정 파장에서의 광의 흡광도)로서 측정하였다.

실시예 1: IgGl 항체 M1 ( Myo -029)의 분석

항체 M1 용액은 염 농도, 즉 이온 강도에 따른 큰 유백광 효과를 나타낸다. 도 1은 단백질 약 20mg/㎖에서 농도가 대략 0mM NaCl에서 150mM NaCl로 증가함에 따라 유백광에 있어서의 육안으로 인지할 수 있는 변화를 보여준다. 0mM NaCl 내지 100mM NaCl에 이르는 항체 M1 용액을 또한 동적 광 산란에 의해 분석하고, 샘플을 약 5mg/㎖로 희석시켰다. 수집된 데이터가 표 1에 나타나 있다. 도 1은 증가하는 NaCl 농도에 노출된 항체 M1(본원에서 "Myo-029"라고도 함) 용액의 이미지를 보여준다(육안으로 인지할 수 있는 유백광 증가를 나타냄).

도 2는 0mM NaCl 용액 및 10OmM NaCl 항체 M1 용액에 대한 동적 광 산란 플롯을 보여주며, 이에 대한 데이터는 표 1에 포함되어 있다.

항체 M1에 대한 동적 광 산란 데이터

	"피크 1"		"피크 2"		"피크 3"
	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%
0mM NaCl	139	98.0	--	--	5.49×1012	2.0
25mM NaCl (상부 층)a	266	96.6	--	--	2.19×1011	3.4
25mM NaCl (바닥 층)	268	96.8	--	--	1.03×1012	3.2
50mM NaCl (상부 층)	290	88.8	--	--	2.59×1011	11.2
50mM NaCl (바닥 층)	342	85.8	--	--	5.27×1012	14.2
100mM NaCl	353	64.4	9.04×107	0.8	1.18×1012	34.8

^a 25mM 용액 및 50mM 용액은 상부 및 바닥 층으로의 상 분리를 나타내었다. 층들은 둘 다 항체를 함유하였다.

피크 2 및 피크 3 종의 질량%의 증가는 도 1에서 육안으로 인지할 수 있는 유백광의 증가와 상관성이 있다. 0mM NaCl 용액에서 피크 3의 존재는 항체 M1에 대해 낮은 염 농도에서도 소량의 유백광 종이 존재함을 나타낸다.

(단백질 20mg/㎖에서) 항체 M1의 100mM NaCl 용액의 비대칭 유동 장 유동 분별은 도 3에 도시된 바와 같은 큰 종을 나타낸다. SEC-HPLC(3mg/㎖로 희석시킨 샘플)은 도 4에 도시된 바와 같이 항체 M1의 유사한 100mM NaCl 용액에 대해 큰 종을 식별할 수 없다.

항체 M1에 대한 유백광 효과의 가역성을 또한 실험하였다. 항체 M1 용액을 0mM NaCl에서 100mM NaCl로 투석시킨 다음 다시 0mM NaCl로 투석시켰다. 항체 M1을 (원래 염 비함유 용액에서) 밤새 100mM NaCl 용액으로 투석시킨 다음 소량의 상기 물질을 10OmM NaCl에서 염-비함유 용액으로 밤새 다시 투석시켰다. 도 5는 이러한 세 가지 항체 M1 용액에 대한 육안으로 인지할 수 있는 유백광의 변화를 보여준다. 도 6은 유백광 100mM NaCl 중간 투석 용액 및 또한 0mM NaCl 최종 투석 용액에 대한 동적 광 산란 플롯이다.

이와 같은 데이터는, 상기 종이 0mM NaCl에서 단지 비교적 소량으로 존재하기는 하지만 항체 M1이 매우 큰 종을 함유하며, 이러한 큰 종의 농도가 염 농도가 증가함에 따라 증가함을 나타낸다. 데이터는 또한 큰 종은 비대칭 유동 장 유동 분별을 사용하여 식별할 수 있지만 너무 커서 SEC-HPLC 컬럼으로는 식별할 수 없으며, 베딩(bedding)에 의해 붕괴되거나 희석시 붕괴됨을 보여준다. 다행히, 큰 종은 제시된 바와 같이 동적 광 산란을 사용하여 분해 및 분석할 수 있다.

실시예 2: IgG1 항체 M2 의 분석

항체 M2 용액은 피하 항체 투여와 관련한 농도 범위에 걸쳐 큰 유백광 효과를 나타내지 않는다. 도 7은 단백질 약 20mg/㎖에서 농도가 0mM NaCl에서 150mM NaCl로 증가함에 따라 유백광에 있어서의 육안으로 인지할 수 있는 변화의 결여를 보여준다. 또한, 0mM NaCl 및 150mM NaCl의 항체 M2 용액을 단백질 약 5mg/㎖에서 동적 광 산란에 의해 분석하였다. 수집된 동적 광 산란 데이터가 표 2에 나타나 있다. 도 8은 0mM NaCl 용액 및 15OmM NaCl 항체 M2 용액에 대한 동적 광 산란 플롯을 보여주며, 이에 대한 데이터는 표 2에 포함되어 있다.

항체 M2에 대한 동적 광 산란 데이터

	"피크 1"		"피크 2"a		"피크 3"
	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%
0mM NaCl	130	99.8	--	--	3.89×1011	0.2
150mM NaCl	129	98.0	--	--	1.23×1011	2.0

^a "피크 2"는 단지 표 1에 대한 비교 목적으로 포함된다.

상기 데이터는 항체 M2가 피하 투여와 관련한 농도 범위에서 인지할 수 있는 양의 유백광 종을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 사실상, 피크 3 질량%는 단지 150mM NaCl 수준에서 0mM NaCl에서의 항체 M의 질량% 수준으로 증가한다.

실시예 3: 항체 M3 의 분석

항체 M3 용액은 평가된 농도 범위에 걸쳐 큰 유백광 효과를 나타내지 않는다. 0mM NaCl 및 150mM NaCl의 항체 M3 용액을 약 5mg/㎖에서 동적 광 산란에 의해 분석하였다. 수집된 동적 광 산란 데이터가 표 3에 나타나 있다.

도 9는 0mM NaCl 용액 및 15OmM NaCl 항체 M3 용액에 대한 동적 광 산란 플롯을 보여주며, 이에 대한 데이터는 표 3에 포함되어 있다.

항체 M3에 대한 동적 광 산란 데이터

	"피크 1"		"피크 2"a		"피크 3"
	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%	MW (kDa)	질량%
0mM NaCl	178	99.9	--	--	1.68×1011	0.1
150mM NaCl	191	97.4	--	--	1.22×1011	2.6

^a "피크 2"는 단지 표 1에 대한 비교 목적으로 포함된다.

상기 데이터는 항체 M3이 평가된 농도 범위에서 인지할 수 있는 양의 유백광 종을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 사실상, 피크 3 질량%는 단지 150mM NaCl 수준에서 0mM NaCl에서의 항체 M1에 대한 것보다 약간 더 높은 질량% 수준으로 증가한다.

실시예 4: 2차 비리얼 계수의 평가

정적 광 산란을 사용하여 실시예 1 내지 3에서 분석한 항체(항체 M1, 항체 M2 및 항체 M3)에 대한 분자량 및 2차 비리얼 계수(A2)를 측정하였다. 2차 비리얼 계수 측정은 정적 광 산란 및 짐 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 실험은 다중 희석 단백질 샘플을 수동으로 광 산란 시스템에 주입함으로써 수행한다. 이러한 다중 측정 및 정확한 농도를 사용하여, 짐 플롯을 작성할 수 있다. 이러한 데이터가 표 4에 나타나 있다.

정적 광 산란 데이터로부터 계산된 분자량 및 2차 비리얼 계수

샘플	MW (kDa)	A2 [mol-㎖/g2]
항체 M1 (0mM NaCl)	131	-3.62 x-4
항체 M1 (100mM NaCl)	130	-2.41 x-3
항체 M2 (0mM NaCl)	149	3.29 x-4
항체 M2 (150mM NaCl)	148	6.77 x-4
항체 M3 (0mM NaCl)	181	2.05 x-3
항체 M3 (150mM NaCl)	156	1.29 x-3

2차 비리얼 계수 데이터는, 양의 비리얼 계수를 갖는 항체 M2 및 항체 M3와 비교하여, 항체 M1의 응집/조합 경향, 즉 음의 2차 비리얼 계수를 보여준다. 도 10은 단백질 0.1 내지 1.1mg/㎖의 농도 범위에서 10OmM NaCl에서의 항체 M1에 대한 2차 비리얼 계수 플롯을 보여주고, 도 11은 15OmM NaCl에서의 항체 M2에 대한 2차 비리얼 계수 플롯이다. 이러한 데이터는 2차 비리얼 계수가 특정 항체에 대한 유백광의 예측자(predictor)로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 항체 M1 의 유백광에 대한 염 정체 및 농도의 영향

항체 M1의 유백광에 대한 염 정체의 영향을 평가하기 위해, 몇 가지 실험을 수행하였다.

시간 경과에 따른 염 정체에 의한 유백광 변화:

"염이 없는 대조 용액, 100mM NaHPO₄를 갖는 용액, 100mM NaCl을 갖는 용액 및 100mM CaCl₂를 갖는 용액"과 같은 4개의 63mg/㎖ 항체 M1 용액을 제조하였다. 이어서, 이들 용액을 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 1시간 후의 이들 용액의 이미지가 도 12에 도시되어 있다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 1시간 후의 유백광의 순서는 NaCl > NaHPO₄ > CaCl₂이다. 이러한 이미지는 또한 유백광이 단지 클로라이드 이온의 존재에 관련되는 것은 아님을 보여주며, 즉 NaHPO₄ 용액이 유백광을 나타낸다.

이어서, 동일한 용액을 2 내지 8℃에서 2주간 유지시켰다. 2주 후의 이들 용액의 이미지가 도 13에 도시되어 있다. 도 13에 도시된 각각의 용액들은 2 내지 8℃에서 2주후 겔화를 보이며 유백광을 나타내었다. 그러나, 겔화 및 유백광의 정도는 염 유형 및 농도에 의존적이었다. 유백광의 순서는 1시간 후의 결과와 동일하였다: NaCl > NaHPO₄ > CaCl₂. 또한, 염 MgCl₂에 대해서는 시험하였지만 여기에 나타내지는 않았으며, NaCl > NaHPO₄ > MgCl₂ > CaCl₂와 같다.

염 정체 및 온도 사이클링에 의한 유백광 변화:

400nm에서의 광학 밀도의 변화를 사용하여 온도 사이클링 동안 유백광에 대한 염 정체의 영향을 모니터링하였다. 본 실험을 위해, "염이 없는 대조 용액, 100mM NaHPO₄를 갖는 용액, 100mM NaCl을 갖는 용액 및 100mM CaCl₂를 갖는 용액"과 같은 4개의 40mg/㎖ 항체 M1 용액을 제조하였다. 이들 용액을 3회 사이클 동안 2 내지 8℃에서 실온으로 순환시켰다. 2 내지 8℃에서 실온으로 다시 2 내지 8℃으로의 각각의 사이클은 24시간이 소요되었다. OD400nm 대 사이클의 회수에 대한 플롯이 도 14에 도시되어 있다. 예를 들면, NaCl 용액에 대한 증가하는 OD400nm 값은 부가적인 구조의 형성이 증가함을 나타낸다. 따라서, 도 14의 데이터는 액체와 겔 사이의 순환이 마찬가지로 유백광을 증가시킴을 보여준다.

염 정체 및 농도에 의한 유백광 변화:

고분자량 물질 % 변화를 염 농도의 변화에 대해 SEC-HPLC로 모니터링하였다. 본 실험을 위해, CaCl₂, NaCl, MgCl₂ 및 NaHPO₄ 용액을 0, 5, 10 및 20mM 농도에서 제조하였다. 고분자량 물질 %를 각 샘플에 대해 측정하였다. 고분자량 물질 % 대 농도의 플롯이 도 15에 도시되어 있다. 고분자량 종의 백분율은 CaCl₂를 제외하고는 각 염에 대해 증가한다.

염 정체 및 농도에 의한 광학 밀도의 변화:

400nm에서의 광학 밀도의 변화를 사용하여 유백광에 대한 염 정체 및 농도의 영향을 모니터링하였다. 본 실험을 위해, MgCl₂, CaCl₂ 및 NaCl 염을 사용하여 일련의 항체 M1 용액을 제조하였다. OD400nm 대 염 농도의 플롯이 도 16에 도시되어 있다. 도 17은 도 16의 데이터의 확대한 영역을 보여준다. 이들 데이터는 고분자량 종이 NaCl 농도 증가에 따라 증가하며 CaCl₂ 및 MgCl₂에 대해서는 단지 약간 증가함을 입증한다.

20 mM CaCl ₂ 에서의 항체 M1 농도에 대한 광학 밀도의 변화:

마지막으로, 400nm에서의 광학 밀도의 변화를 사용하여 20mM CaCl₂ 용액에서의 항체 M1 농도 변화의 영향을 모니터링하였다. 본 실험을 위해, 항체 M1의 10mg/㎖, 20mg/㎖, 50mg/㎖, 60mg/㎖ 및 75mg/㎖ 용액을 20mM CaCl₂ 속에서 제조하였다. OD400nm 대 항체 M1 농도의 플롯이 도 18에 도시되어 있다. 이러한 데이터는 고차 구조(higher order structure)가 항체 M1 농도가 증가함에 따라 증가함을 보여준다.

몇 가지 관찰이 실시예 5에 대한 데이터 모두에 관해 이루어질 수 있다. 유백광 효과는, NaCl > Na₂PO₄ > MgCl₂ > CaCl₂"의 방식으로 염 의존적이다. 소정의 단백질 농도에 대해, 유백광은 초기에 증가한 다음, 염 농도가 증가함에 따라 평탄(plateau)하거나 감소한다. 유백광은 단백질 농도에 따라 증가한다. 평가된 모든 염은 2 내지 8℃에서 항체 M1을 겔화시키며, 겔화 시간은 염 의존적이고 유백광의 정도와 관련이 있는 것으로 보인다.

본 발명에서 사용되는 항체는 바람직하게는 항체 M1(본원에서 "Myo-029"라고도 함), 항체 M2 및 항체 M3이다. 항체 제제(바람직하게는 항체 M1, 항체 M2 또는 항체 M3 함유)의 이온 강도가 본 발명에 따라 저하되거나 감소되는 경우, 이온 강도의 저하 또는 감소는 항체 농도에 대한 이온 강도의 비가 저하되도록 통상적으로 수행된다.

본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타의 참조 문헌은 전문이 본원에 참고로 인용된다.

또 다른 양태가 하기 청구의 범위의 영역내에 포함된다.

Claims (34)

1. 항체 제제의 유백광 외관(opalescent appearance)이 감소되도록 항체 제제 중의 항체 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시킴을 포함하며, 여기서, 이온 강도(ionic strength)를 변화시키기 전에, 항체 제제가 약 100mg/㎖의 약제학적 유효 농도에서 약 2 이상의 유럽 약전 표준(European Pharmacopeia standard)의 유백광(opalescence)을 나타내는, 항체 제제의 유백광을 저하시키는 방법.
2. 단백질 제제 중의 고분자량 종(high molecular weight species)이 감소되도록 항체 제제 중의 항체 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시킴을 포함하는, 항체 제제 중의 고분자량 종의 형성을 감소시키는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 제제가 사람 항체, 사람화 항체, 키메릭(chimeric) 항체, CDR-이식된 항체 또는 시험관내에서 발생된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 제제가 IgGl 또는 IgG4 중쇄 불변 영역(heavy chain constant region)을 포함하는, 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 제제가 항-GDF8 항체를 포함하는, 방 법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 제제의 항체가 약 50 내지 200mM의 염 농도에서 음의 2차 비리얼 계수를 갖는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 항체의 2차 비리얼 계수가, 100mM 염화나트륨을 함유하는 항체 제제 중에서 약 -1 내지 -10×10^-3mol-mg/g² 또는 약 -1 내지 -10×10^-4mol-mg/g²인, 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 제제의 항체가 약 50 내지 200mM의 염 농도에서 양의 비리얼 계수를 갖는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 항체의 2차 비리얼 계수가, 100mM 염화나트륨을 함유하는 항체 제제 중에서 약 1 내지 10×10^-4mol-mg/g² 또는 약 1 내지 10×10^-3mol-mg/g² 인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 상기 방법을 수행하기 전 및/또는 후에 항체 제제 중에 약 5 내지 300mg/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 상기 제제에 존재하는 염의 농도를 감소시킴으로써 저하되는, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 상기 제제에 존재하는 염의 농도를 저하시킴으로써 감소되며, 여기서, 상기 제제에 존재하는 상기 염이 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 인산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 상기 제제에 존재하는 염의 농도를 저하시킴으로써 감소되며, 여기서, 상기 염의 농도가 상기 유백광 제제에서의 농도보다 적어도 약 2배, 3배, 5배, 10배 또는 100배 더 낮게 감소되는, 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 제1 염을 제2 염으로 대체함으로써 변화되며, 여기서, 상기 제1 염이 NaCl이고, 상기 제2 염이 NaHPO₄, MgCl₂ 및 CaCl₂로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 제1 염을 제2 염으로 대체 함으로써 변화되며, 여기서, 상기 제1 염이 NaHPO₄이고, 상기 제2 염이 MgCl₂ 및 CaCl₂로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
16. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 제제의 이온 강도가 한외여과 또는 투석에 의해 변화되는, 방법.
17. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서,

    상기 항체 제제의 유백광을 평가하는 것 또는 항체 제제 중의 염 농도를 측정하는 것을 추가로 포함하며,

    여기서, 상기 항체 제제의 이온 강도가, 1종 이상의 여과방법을 적용하는 것 또는 항체 정제 공정에서의 하나 이상의 단계의 염 농도를 감소시키는 것 중의 하나 이상을 포함하는 공정에 의해 변화되는, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 항체를 정제하는 공정이 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 동결건조(lyophilization) 또는 재구성(reconstitution) 중의 하나 이상을 포함하는, 방법.
19. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 제제의 유백광을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 항체 제제의 유백광이, 용액의 탁도를 평가하거나 2차 비리얼 계수의 변화를 평가하거나 고분자량 종의 형성의 변화를 평가함으로써 검출되는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 유백광이 약 2 또는 1의 유럽 약전 표준 또는 그 이하로 감소되는, 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 2차 비리얼 계수가 약 -1 내지 -10×10^-3으로부터 약 -1 내지 -10×10^-4로 변하는, 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 고분자량 종의 양이 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 50배 또는 100배까지 감소되는, 방법.
24. 단백질 제제 중의 고분자량 종의 형성이 감소되도록 항체 제제 중에서의 항체 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시킴을 포함하며, 여기서, 상기 제제 중의 항체가 100mM 염화나트륨 용액에서 음의 비리얼 계수를 갖는, 항체 제제 중의 고분자량 종의 형성을 저하시키는 방법.
25. (임의로) 단백질 제제가 유백광 용액을 형성하는지 여부를 하나 이상의 염 농도에서 평가하는 것, 및 항체 제제 중의 고분자량 종이 감소되도록 상기 제제 중의 항체 농도에 대한 이온 강도의 비를 변화시켜 항체 제제의 정제 공정의 효율을 개선시키는 것을 포함하며,

    여기서, 상기 용액의 이온 강도가, 1종 이상의 여과방법을 적용하는 것, 상기 단백질 제제에 사용되는 염을 더 낮은 유백광 유도제로 대체하는 것, 또는 정제 공정의 하나 이상의 단계의 이온 강도를 감소시키는 것 중의 하나 이상에 의해 변화되는, 항체 제제의 정제 공정의 효율을 개선시키는 방법.
26. 제1 항체 용액을 회수하는 것, 및 상기 제1 항체 용액 중의 유백광의 수준 또는 고분자량 종의 존재를 평가하는 것을 포함하며,

    여기서, (a) 유백광 또는 고분자량 종의 수준이 소정의 수준 이하인 경우, 항체 제품에 사용하기 위한 제1 항체 용액을 선택하고, 또는 (b) 유백광 또는 고분자량 종의 수준이 소정의 수준 이상인 경우, 제2 이온 강도를 갖는 제2 항체 용액을 선택하는, 항체의 제조를 개선시키는 방법.
27. 제26항에 있어서, 용액 중의 유백광의 수준이 소정의 수준 이하로 될 때까지 평가 단계를 반복 수행함을 추가로 포함하는, 방법.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항체 용액이, 매트릭스로부터의 항체 용 출, 투석된 용액 또는 기타의 여액의 회수, 무수 제제의 가용화 또는 크로마토그래피법 중의 하나 이상으로부터 선택된 단백질 정제방법에 의해 회수되는, 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 항체 용액이 크로마토그래피법에 의해 회수되며, 상기 크로마토그래피법이 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography), 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과(diafiltration), 한외여과(ultrafiltration), 바이러스 제거 여과(viral removal filtration), 음이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography) 및 양이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
30. 제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정 수준의 상기 항체 용액의 탁도가 약 2인, 방법.
31. (임의로) 항체를 자가-응집 경향을 갖는 것으로 확인하는 것, 항체 제제의 하나 이상의 샘플을 제공하는 것, 및 하나 이상의 샘플에서의 염 농도의 증가시 고분자량 종의 형성을 검출하는 것(여기서, 염 농도의 증가시 고분자량 종의 형성의 증가는, 상기 제제 중의 항체가 유백광 외관을 갖는 경향성이 증가한다는 지표이다)을 포함하는, 항체 제제가 유백광 외관을 갖는 경항이 있는지를 측정하는 방법.
32. 항체 샘플을 제공하는 것, 하나 이상의 염 농도에서 탁도 또는 고분자량 종의 존재를 측정하는 것, 및 상기 항체 샘플 중의 유백광의 수준에 대한 보고(report)를, 하나 이상의 염 농도에서의 탁도 또는 고분자량 종의 존재의 함수로서 제공하는 것을 포함하는, 항체 샘플의 유백광을 평가하는 방법.
33. 제1항, 제2항, 제25항 또는 제26항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항체 제제.
34. 약 50mM 미만의 NaCl에서 항체를 적어도 약 50mg/㎖의 농도로 포함하는, 약제학적으로 허용되는 항체 제제.

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