CN103328509A - 人胰岛素测定法和测定试剂 - Google Patents
人胰岛素测定法和测定试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103328509A CN103328509A CN2010800592610A CN201080059261A CN103328509A CN 103328509 A CN103328509 A CN 103328509A CN 2010800592610 A CN2010800592610 A CN 2010800592610A CN 201080059261 A CN201080059261 A CN 201080059261A CN 103328509 A CN103328509 A CN 103328509A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- antibody
- human
- reagent
- assay method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种对人胰岛素特异性的抗体和使用该抗体的测定法和测定试剂,其能够准确测定人胰岛素而不被猪胰岛素影响。本发明提供一种能够特异性测定人胰岛素的测定法和测定试剂,其通过组合与人胰岛素特异性反应而不与猪胰岛素反应的单克隆抗体和不同的抗-人胰岛素抗体而进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种与人胰岛素特异性反应的抗体。本发明还涉及一种使用所述与人胰岛素特异性反应的单克隆抗体的人胰岛素测定法和测定试剂。
背景技术
胰岛素是一种肽激素(分子量:大约5800),其在朗格汉斯胰岛(pancreatic islets of Langerhans)中的β细胞中经由前体,即胰岛素原而产生,并且由下述组成:α链(还称为A链),即由21个氨基酸组成的肽,和β链(还称为B链),即由30个氨基酸组成的肽。胰岛素参与糖、氨基酸和脂肪代谢,并且其生理重要性在于降血糖效应。糖尿病是由于β细胞减少或功能退化、或由于外周组织中胰岛素作用不足导致的胰岛素分泌不足。因此,测定血液胰岛素浓度(其反应β细胞的胰岛素分泌功能)是诊断和理解糖尿病的临床状况和确定异常葡萄糖耐受性原因的有用指标。
另一方面,胰岛素替代疗法是一种重要的糖尿病治疗方式。该疗法通过施用下述进行:常规的牛和猪胰岛素,通过基因重组得到的人胰岛素,和通过人胰岛素氨基酸序列中的变化(置换、缺失、添加、插入)或通过用脂肪酸修饰一部分组成氨基酸而得到的胰岛素类似物制剂(以下还称为胰岛素类似物)。为了确定所述胰岛素替代疗法的准确临床效果,需要区分由糖尿病患者在体内产生的内源性胰岛素和从外界施用到体内的外源性胰岛素,从而特异性测量人体中存在的内源性胰岛素。
下述是关于使用单克隆抗体的人胰岛素测定法的内容。
专利文件1公开了按照酶联免疫吸附测定法(以下还称为ELISA)定量人胰岛素的方法。这种测定法使用结合不溶性载体的抗-人胰岛素单克隆 抗体,以及识别不与所述抗体的表位竞争的表位且用酶标记的抗-人胰岛素单克隆抗体。专利文件1没有描述关于与来源于除人之外的动物物种的胰岛素(包括猪胰岛素和胰岛素类似物)的反应性,并且不清楚是否可以特异性测量人胰岛素。
专利文件2公开了按照粒子凝集免疫测定法(particle agglutination immunoassay)定量人胰岛素的方法。这种测定法使用具有不同识别位点并且结合不溶性载体的两种小鼠产生的抗-人胰岛素单克隆抗体。尽管据记载这两种小鼠产生的抗-人胰岛素单克隆抗体是基于专利文件3所述的方法生成的,但是专利文件3描述小鼠产生的抗-人胰岛素单克隆抗体是通过使用猪胰岛素作为免疫原产生的。专利文件2还描述在使用由豚鼠产生的猪胰岛素抗血清纯化的多克隆抗体时,和在使用这两种小鼠产生的抗-人胰岛素单克隆抗体时,在粒子凝集免疫测定法中,针对标准人胰岛素的反应性是相同的。
专利文件3公开了针对猪胰岛素或人胰岛素的单克隆抗体、其制备方法、和使用所述单克隆抗体的放射性免疫测定法(以下还称为RIA)。专利文件3提及:(1)将通过用牛胰岛素或猪胰岛素免疫动物如豚鼠得到的抗血清用于测量人胰岛素,(2)与使用猪胰岛素或人胰岛素作为免疫原的情形相比,当使用牛胰岛素作为免疫原时,难以得到与人胰岛素反应的单克隆抗体,以及(3)由于猪胰岛素(不像牛胰岛素)仅在B链C端处的氨基酸不同,因此通过使用猪胰岛素作为免疫原可以得到与人胰岛素反应的单克隆抗体,并且公开了单克隆抗体通过使用猪胰岛素作为免疫原得到,并且所得到的单克隆抗体优选与猪胰岛素和人胰岛素交叉反应。
考虑专利文件2和3,推论对于基于专利文件3的方法产生的并且在专利文件2中记述的两种小鼠产生的抗-人胰岛素单克隆抗体,使用猪胰岛素作为免疫原,并且这样的抗体应该与猪胰岛素反应。
专利文件1和2均描述了通过使用多种具有针对人胰岛素的不同识别位点的单克隆抗体测量人胰岛素的方法,并没有包括使用至少不与猪胰岛素反应的抗体来特异性测量人胰岛素的想法。
非专利文件1至3报道了商购人胰岛素测定试剂的反应特异性(猪胰岛素和胰岛素类似物相对于人胰岛素的的交叉反应性(率))。
非专利文件1公开了两种商购试剂中的一种具有与猪胰岛素19.2%的交叉反应性和与赖脯胰岛素(insulin lispro,其是一种胰岛素类似物)0.02%的交叉反应性,并且另一种试剂具有与猪胰岛素100%的交叉反应性和与赖脯胰岛素75%的交叉反应性。
非专利文件2公开了26种商业试剂中有16种试剂具有与猪胰岛素19.2%至450%的交叉反应性,并且有8种试剂具有与赖脯胰岛素小于0.1%至100%的交叉反应性。
非专利文件3公开了以6种商业试剂测量系列稀释的胰岛素类似物,揭示一种试剂与门冬胰岛素(insulin aspart)、甘精胰岛素(insulin glargine)和赖脯胰岛素的平均交叉反应性为小于0.7%,并且另外5种试剂与三种胰岛素类似物的平均交叉反应性为小于3.6%至143%。然而,文件没有公开这些试剂与猪胰岛素的交叉反应性。
如上述,在用于人胰岛素测定法的商业试剂中不存在不与猪胰岛素交叉反应的试剂。一种商业试剂与多种胰岛素类似物具有小于0.7%的交叉反应性,并且一种商业试剂具有小于10%的交叉反应性。非专利文件3中与多种胰岛素类似物的交叉反应性小于0.7%的商业试剂是非专利文件1和2中与猪胰岛素的交叉反应性为19.2%的商业试剂。
引用列表
专利文件
专利文件1:日本公开的专利公开号H01-148962
专利文件2:日本公开的专利公开号H03-118472
专利文件3:日本公开的专利公开号S60-188327
非专利文件
非专利文件1:Clinical chemistry(临床化学),47[3](2001)P.602-5
非专利文件2:Clinical laboratory(临床实验室),49[3-4](2003)P.113-21
非专利文件3:Clinical chemistry(临床化学),50[1](2004)P.257-9
发明概述
技术问题
本发明提供一种不与猪胰岛素反应而特异性与人胰岛素反应的抗-人胰岛素,和使用所述抗体的人胰岛素-特异性测定法和测定试剂。
问题的解决方案
作为广泛研究的结果,本发明人在使人胰岛素在溶液中保持其构象而不是将其固定到固相上时筛选抗-人胰岛素抗体时,发现了一种不与猪胰岛素、牛胰岛素,胰岛素原和胰岛素类似物反应而与人胰岛素特异性反应的抗-人胰岛素抗体,并且进一步发现了所述特异性抗体可以用于免疫测定法中来区分人胰岛素和猪胰岛素等,并且从猪胰岛素等准确测量人胰岛素,由此完成了本发明。因此,本发明包括下述:
[1]一种抗-人胰岛素抗体,其具有下述性质(a)和(b):
a)所述抗体与人胰岛素反应,并且
b)所述抗体不与猪胰岛素反应。
[2]权利要求1的抗-人胰岛素抗体,其还具有一种或多种下述性质:
c)所述抗体不与牛胰岛素反应,
d)所述抗体不与犬胰岛素反应,
e)所述抗体不与兔胰岛素反应,
f)所述抗体不与胰岛素原反应,
g)所述抗体不与胰岛素类似物反应,和
h)所述抗体不与由序列RGFFYTPKT(SEQ ID NO.1)组成的肽片段反应。
[3][2]所述的抗-人胰岛素抗体,其中所述胰岛素类似物选自由下列各项组成的组:赖脯胰岛素,门冬胰岛素,甘精胰岛素,地特胰岛素(insulin detemir),和格鲁辛胰岛素(insulin glulisine)。
[4][1]至[3]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,其还具有下述性质:
(i)所述抗体识别人胰岛素分子中β-链C-端RGFFYTPKT区的构象。
[5][4]所述的抗-人胰岛素抗体,其中人胰岛素分子中β-链C-端RGFFYTPKT区的构象是可在下述溶液中得到的构象:
0.01M HEPES(pH 8.5),0.15M氯化钠,3mM EDTA,和0.005%表面活性剂P20。
[6][1]至[5]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体是单克隆抗体。
[7][6]所述的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体由保藏号为FERM BP-11314的杂交瘤产生。
[8][6]所述的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体能够识别与由保藏号为FERM BP-11314的杂交瘤产生的单克隆抗体所识别的表位相同的表位。
[9]一种人胰岛素测定法,其包括使权利要求1至8中任一项的抗体与生物样品接触的步骤,从而检测通过接触形成的所述抗体与人胰岛素的复合物。
[10][9]所述的人胰岛素测定法,其中[1]至[8]中任一项所述的抗体用可检测的标记物质标记。
[11]一种使用下述两种抗体的人胰岛素测定法:
1)[1]至[8]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有至少与人胰岛素反应的性质的抗体A。
[12]一种使用下述两种抗体的人胰岛素测定法:
1)[1]至[8]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有特异性识别1)中的抗体的性质的抗体B。
[13][11]或[12]所述的人胰岛素测定法,其中1)和2)中的两种抗体均为单克隆抗体。
[14][11]或[12]所述的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体是单克隆抗体,并且其中2)中的抗体是多克隆抗体。
[15][11]至[14]中任一项所述的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体和/或2)中的抗体被固定到固相上。
[16][15]所述的人胰岛素测定法,其中所述固相是胶乳,并且其中胰岛素通过胶乳免疫凝集测定法测定。
[17][16]所述的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体被固定到固相上,其中2)中的抗体用标记物质标记,并且其中胰岛素通过ELISA或免疫层 析测定。
[18]一种外源性胰岛素测定法,其包括下述步骤:
(1)获得人胰岛素和外源性胰岛素的总浓度;
(2)用[9]至[17]中任一项所述的胰岛素测定法获得人胰岛素的浓度;和
(3)通过从(1)获得的浓度减去(2)获得的浓度而得到外源性胰岛素的浓度。
[19]一种胰岛素测定试剂,其中所述胰岛素测定试剂使用[1]至[8]中任一项的抗体。
[20]一种胰岛素测定试剂,其使用下述两种抗体:
1)[1]至[8]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有至少与人胰岛素反应的性质的抗体A。
[21]一种胰岛素测定试剂,其使用下述两种抗体:
1)[1]至[8]中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有特异性识别1)中的抗体的性质的抗体B。
[22][20]或[21]所述的胰岛素测定试剂,其中1)和2)中的两种抗体均为单克隆抗体。
[23][20]或[21]所述的胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体是单克隆抗体,并且其中2)中的抗体是多克隆抗体。
[24][20]至[23]中任一项所述的人胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体和/或2)中的抗体被固定到固相上。
[25][24]所述的人胰岛素测定试剂,其中所述固相是胶乳,并且其中胰岛素通过胶乳免疫凝集测定法测定。
[26][24]所述的人胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体被固定到固相上,其中2)中的抗体用标记物质标记,并且其中胰岛素通过ELISA或免疫层析测定。
[27]一种外源性胰岛素测定试剂盒,其包括下述测定试剂:
(1)用于测量人胰岛素和外源性胰岛素的总胰岛素浓度的试剂,和
(2)[19]至[26]中任一项所述的人胰岛素测定试剂。
发明的有利效果
利用本发明,可以准确地测定人胰岛素,而不受猪胰岛素、牛胰岛素、胰岛素原和胰岛素类似物的影响。由于利用本发明,由处于胰岛素替代疗法中进行猪胰岛素、胰岛素类似物等给药的糖尿病患者,可以准确地测量仅由患者的β细胞分泌的人胰岛素,因此可以准确地理解糖尿病患者的临床状况。
仅外源性胰岛素,如来源于除人之外的动物物种的胰岛素和胰岛素类似物,可以由下述测定:i)来自使用与人胰岛素以及胰岛素替代疗法中所用的来源于除人之外的动物物种的胰岛素和胰岛素类似物交叉反应的抗-人胰岛素抗体的测定法的人胰岛素、源于除人之外的动物物种的胰岛素、和胰岛素类似物的总量(总浓度)的测定结果,和ii)来自使用本发明的抗体的测定法的仅人胰岛素的测定结果。
附图简述
图1是人胰岛素氨基酸序列的示意图。在图1中,(a)至(g)指示人胰岛素与测定与本发明的抗体的反应性的来源于除人之外的动物物种的胰岛素(猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素和犬胰岛素)和胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)的氨基酸序列中的变异。图1圆圈中的字母表示由一个字母代表的氨基酸。
<来源于动物物种的胰岛素>
猪胰岛素:部分(c)是″A″而不是″T″。
牛胰岛素:部分(c)是″A″而不是″T″,部分(f)是″A″而不是″T″,并且部分(g)是″V″而不是″I″。
兔胰岛素:部分(c)是″S″而不是″T″。
犬胰岛素与猪胰岛素相同。
<胰岛素类似物>
赖脯胰岛素:部分(a)和(b)是″K-P″而不是″P-K″。
门冬胰岛素:部分(a)是″D″而不是″P″。
甘精胰岛素:部分(d)是″G″而不是″N″并且部分(c)的″T″上添加 ″RR″。
地特胰岛素:部分(c)中不存在″T″并且部分(b)的″K ″上添加肉豆蔻酸(C14H28O2)。
格鲁辛胰岛素:部分(b)是″E″而不是″K″,并且部分(e)是″K″而不是″N″。
图2-1是使用Biacore(注册商标)T100检验66224-抗体与人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素和牛胰岛素的反应性的测试的结果图表。在图2-1中,(a),(b),(c)和(d)分别是关于人胰岛素、胰岛素原、赖脯胰岛素和门冬胰岛素的结果。
图2-2同上。在图2-2中,(e),(f),(g),(h)和(i)分别是关于甘精胰岛素、地特胰岛素、格鲁辛胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素的结果。
图3-1是使用Biacore(注册商标)T100检验66408-抗体与人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素和牛胰岛素的反应性的测试的结果图表。在图3-1中,(a),(b),(c)和(d)分别是关于人胰岛素、胰岛素原、赖脯胰岛素和门冬胰岛素的结果。
图3-2同上。在图3-2中,(e),(f),(g),(h)和(i)分别是关于甘精胰岛素、地特胰岛素、格鲁辛胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素的结果。
图4是使用竞争性ELISA检验66224-抗体与由人胰岛素β-链C端区域的序列″RGFFYTPKT″(SEQ ID NO.1)组成的肽片段(该肽的氨基酸序列不同于猪胰岛素仅在于C端氨基酸是″T ″(猪胰岛素的C端氨基酸是″A″))的反应性的测试的结果图表。
图5是分别使用66224-抗体和66408-抗体作为一级和二级抗体,以及一级抗体在板上固相化,使用夹心ELISA检验与人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素和犬胰岛素的反应性的测试的结果图表。
图6是分别使用66408-抗体和66224-抗体作为一级和二级抗体,以及一级抗体在板上固相化,使用夹心ELISA检验与人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素和犬胰岛素的反应性的测试的结果图表。
实施方案描述
在本说明书中,当化合物“与抗体反应”、“与抗体有反应”、“具有与抗体的反应性”和“结合抗体”或抗体“识别”化合物时,这些表述具有本发明的领域中常用的意思并且可以同义使用。然而,这些表述必须以最广泛的意义来解释,包括本发明的领域中所用的具有相同意思的其它表述,如“具有针对……的亲和性”,这不限于这些举例。抗体是否与化合物“反应”可以通过后文所述的并且为本领域技术人员公知的固相抗原ELISA、竞争性ELISA和夹心ELISA验证,也可以通过利用表面等离子体共振原理的方法(SPR法)来验证。SPR法可以使用名称为Biacore(注册商标)的商购装置、传感器和试剂进行。
在本说明书中,本发明的抗体“与化合物不反应/不与化合物反应”的表述表示本发明的抗体基本上不与该化合物反应,而“基本上不反应/基本上不与……反应”的表述表示,当例如基于SPR法使用Biacore(注册商标)T100固定本发明的抗体以测定与所测化合物的反应性时,本发明的抗体和所测化合物之间的反应性相对于对照实验(缺少所测化合物的测试)中的反应性没有显着增加。当然,除SPR法之外还可通过本领域技术人员熟知的方法/方式验证抗体与化合物“基本上不反应”。
在本说明书中,“交叉反应(交叉反应性)”表示这样的抗体性质,即,抗体不仅仅与原始抗原特异性(选择性)反应(仅与其结合),而且还与化学结构与所述原始抗原相似的物质(以下还称为交叉反应性物质)非特异性反应(结合)。例如,抗原和交叉反应性物质之间的非特异性反应(结合)的程度通过所述抗原与原始抗原之间的反应(结合)率表示,并且表示为交叉反应性或交叉反应率。
在本说明书中,“不溶性载体”可以表述为“固相”。尽管用不溶性载体物理或化学支持抗原或抗体或支持状态可以描述为“固定”、“固定的”和“固相的”,这些表述包括与本发明的领域中所用的相同意思的其它表述,诸如“敏化”和“吸附”。
在本说明书中,术语“检测”或“测量”必须以最广义解释,包括胰岛素存在性证明和/或定量,并且必须不能解释为在任何意义上的限制。
在本说明书中,“外源性胰岛素”表示与在人体内生成的所谓的“内 源性胰岛素”相比,对于糖尿病治疗由体外施用到体内的胰岛素,并且具体表示来源于除人之外的动物物种的胰岛素和/或胰岛素类似物。
本发明的抗-人胰岛素抗体是特异性与人胰岛素反应而不与猪胰岛素反应的抗体。本发明的抗-人胰岛素抗体还可以不与下述中的任一种或多种反应:牛胰岛素,犬胰岛素,兔胰岛素,胰岛素原和胰岛素类似物。所述胰岛素类似物包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素。如上述,所述胰岛素类似物还称为″胰岛素类似物制剂″。除了上述反应性,本发明的抗-人胰岛素抗体理想地不与由人胰岛素β链C端区域的序列″RGFFYTPKT″(SEQ ID NO.1)组成的肽片段反应。人胰岛素与猪胰岛素彼此不同,仅在于β链C端氨基酸是″T″还是″A″。因此,为了得到与人胰岛素特异性反应而不与猪胰岛素反应的抗体,可以选择与包括人胰岛素β-链C端区域的氨基酸序列的肽片段特异性反应的抗体;然而,通过选择与人胰岛素反应、不与猪胰岛素反应且不与包括人胰岛素β链C端区域的氨基酸序列的肽片段反应的抗体,可以得到识别涉及下述序列(即,包括人胰岛素与猪胰岛素之间的氨基酸差异的序列)的人胰岛素构象的抗体,由此理想地确保更高的特异性。
本发明的抗-人胰岛素抗体可以是单克隆抗体。具体地,可以引用由杂交瘤66224(FERM BP-11314)产生的单克隆抗体(66224-抗体)。本发明的抗-人胰岛素抗体还包括能够识别与FERM BP-11314杂交瘤产生的单克隆抗体识别的表位相同的表位的抗体。如在PCT/JP2010/62261所述的66226-抗体(由国际保藏号为FERM BP-11234的杂交瘤产生的单克隆抗体)的情形中,识别与抗-人胰岛素抗体结合的胰岛素(以下还称为复合胰岛素)的构象而不与猪胰岛素反应的抗体也可以以与本发明的抗体相同的方式使用。这样的抗体可以通过与下述抗体(即,在与人胰岛素和猪胰岛素结合时,其复合胰岛素形成不同构象的抗体)组合而用作具有与本发明的抗体相同特征的抗体。
本发明的抗体可以通过下述容易地产生:将人胰岛素作为抗原(免疫原)溶解在溶剂中,如磷酸缓冲盐水中,并且施用该溶液来免疫除人之外的动物(以下在与抗体获得相关的描述中还简单称为动物)。尽管用作抗原的胰岛素可以是完整的胰岛素分子或其部分,但是优选使用完整的胰岛 素分子来保持涉及人胰岛素β链C端区域的氨基酸序列的人胰岛素的构象,从而获得如上所述具有更高特异性的抗体。需要时,向所述溶液中加入适当的佐剂形成乳剂后,可以使用该乳剂进行免疫。佐剂可以是广泛使用的佐剂,诸如油包水乳剂、水包油包水乳剂、水包油乳剂、脂质体、或氢氧化铝凝胶以及来源于生物源性成分的蛋白或肽物质。例如,可以以优选方式使用弗氏不完全或完全佐剂。尽管没有特别限制,需要适当地选择佐剂的施用途径、施用剂量和施用时间,从而在要被所述抗原免疫的动物中可以增强期望的免疫反应。
尽管用于免疫的动物的选择不受特别限制,但是优选地是哺乳动物,并且可以是小鼠、大鼠、牛、兔、山羊和绵羊,尽管小鼠是更优选的。动物可以根据常规技术进行免疫,例如,可通过皮下、皮内、静脉内或腹膜内向动物注射抗原溶液,优选与佐剂的混合物来完成免疫。由于免疫应答一般根据待免疫的动物的类型和品系而不同,希望根据将要使用的动物适当设定免疫方案。优选地,在初次免疫后,重复数次施用抗原。
随后进行下述操作来获得单克隆抗体,但是这些操作不是限制性的。产生单克隆抗体本身的方法可根据,例如,在Antibodies,A Laboratory Manual(抗体,实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),(1988))中描述的方法进行。
在最后的免疫后,可如下产生杂交瘤:从免疫的动物提取脾或淋巴结细胞(其是产生抗体的细胞),并将这些细胞与增殖性骨髓瘤细胞融合。优选地,具有高的产生抗体能力(数量上和质量上)的细胞用于细胞融合,并且骨髓瘤细胞与将要用于融合的产生抗体的细胞所来源的动物是相容的。细胞融合可根据本领域熟知的方法进行,可以使用聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法或使用电流的方法。获得的杂交瘤可根据已知的方法增殖,在鉴定所产生抗体的性质的同时可以选择所需的杂交瘤。杂交瘤可通过已知的方法如有限稀释或软琼脂法进行克隆。
考虑所产生的抗体在测定中实际使用的条件,可以高效率且有效地选择杂交瘤。作为一个标准实例,可以提及,可通过ELISA、RIA或使用Biacore(注册商标)的方法选择产生与胰岛素反应的抗体的杂交瘤来获得杂交瘤。具体而言,首先,将固相抗原ELISA用于选择产生与人胰岛 素高度反应的单克隆抗体的杂交瘤,所述固相抗原ELISA使杂交瘤培养物上清液中的抗体与在平板等上固相化的人胰岛素初始反应,然后与标记的抗-IgG抗体反应。
例如,Biacore (注册商标)T100也可以用于验证与猪胰岛素、牛胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)的反应性并且选择具有理想反应性(特异性)的杂交瘤,以确保选择了产生本发明的抗-人胰岛素抗体的杂交瘤。推论在验证反应性时,人们可以通过验证与在溶液中保持其构象而不是固定到固相上的人胰岛素的反应性而容易地缩小识别人胰岛素构象的抗-人胰岛素单克隆抗体的范围。
通过产生包括与猪胰岛素仅在β链C端氨基酸不同的人胰岛素β链C端区域的氨基酸序列的人胰岛素的肽片段,并且通过选择产生不与该肽片段反应的单克隆抗体的杂交瘤,可以得到这样的杂交瘤,所述杂交瘤产生在人胰岛素的构象上而不是该序列的一级结构上识别该序列的单克隆抗体。尽管由人胰岛素β链C端区域的序列″RGFFYTPKT″组成的肽片段可以优选地用作所述肽片段,但是可以使用人胰岛素C端区域的任意肽片段,只要所述肽片段包含人胰岛素β链的C端氨基酸并且具有至少可被抗体识别的长度。该肽的氨基酸数目优选为5个以上。
筛选本发明的杂交瘤(抗体)的方法按照后述实施例总结如下:
初级筛选:进行固相抗原ELISA来验证与人胰岛素的反应性并且选择阳性细胞。
二级筛选:进行人胰岛素的竞争性ELISA来再次验证抗体与人胰岛素反应并且选择阳性细胞。
三级筛选:使用用Biacore(注册商标)进行的反应性测定法来选择具有针对人胰岛素的特异性反应性而针对来源于除人之外的动物物种的胰岛素、胰岛素原和胰岛素类似物没有交叉反应性的孔。
四级筛选:进行用由人胰岛素β链C端区域的序列″RGFFYTPKT″组成的肽片段的竞争性ELISA来选择针对该肽片段没有反应性而针对人胰岛素具有高反应性的孔。
尽管不希望受到任何具体理论的局限,本发明人推论完成本发明的一 个原因如下。
在常规筛选中,将人胰岛素直接或间接地固相化或标记,因此,可能失去人胰岛素的一部分原始构象。如上述,猪胰岛素和人胰岛素仅在β链C端氨基酸处具有结构差异,并且在这种情形中,构象的微小变化可能对抗体的表位确定具有显着的影响。在本发明中,如上所述,在保持人胰岛素构象时,使用Biacore(注册商标)进行筛选,并且使用与人胰岛素β链C端区域的肽片段竞争性ELISA进行有意丧失构象的筛选,从而选择具有更高特异性的抗体。
通过本文的完整的说明,本领域技术人员将能够理解,通过在使用Biacore(注册商标)的反应性测定法中验证至少针对人胰岛素和猪胰岛素的反应性,可以筛选到产生本发明的抗体的杂交瘤。
可通过大量培养以这种方法选择的杂交瘤产生具有期望性质的单克隆抗体。大量培养的方法不是特别限定的,并且可以包括例如通过在适当培养基中培养杂交瘤从而在培养基中产生单克隆抗体的方法,以及通过将杂交瘤注射到哺乳动物的腹腔中以用于增殖从而在腹水中产生抗体的方法。例如,可以通过适当组合阴离子交换层析、亲和层析、硫酸铵分级分离法、PEG分级分离法和乙醇分级分离法来纯化单克隆抗体。
本发明的抗体可以是完整抗体分子和具有抗原-抗体反应活性的功能片段。抗体可以是通过免疫动物、通过基因重组技术获得的那些或可以是嵌合抗体。抗体的功能片段包括F(ab’)2和Fab’,并且这些功能片段可以通过用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)加工上述获得的抗体来产生。
本发明的抗体可以固定在不溶性载体上或用熟知和常用的标记物质进行标记,我们将在下文对其进行描述。我们可以将它们分别称作“固定(固相)的抗体”和标记的抗体。此类固定的或标记的抗体包括在本发明的范围中。例如,固定的抗体可通过使不溶性载体物理吸附或化学结合本发明的抗体(在它们中间可存在适当的间隔物)来产生。不溶性载体可由聚合物基质材料,如聚苯乙烯树脂,无机基质材料,如玻璃,和多糖基质材料,如纤维素和琼脂糖制成,并且形状不受特别限制并可任意选择。例如,不溶性载体可以是板形(例如微量平板和膜)、珠子、粒子(例如胶乳粒子)或 筒状体(例如试管)。
例如,用于产生抗体的标记物质包括酶、荧光材料、化学发光材料、生物素、抗生物素蛋白、或放射性同位素、胶体金粒子和有色胶乳。标记物质可通过常规方法,如戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫吡啶(pyridyl disulfide)法和高碘酸法结合抗体。然而,固定的或标记的抗体的类型和产生方法不限于上述那些。例如,当酶如过氧化物酶或碱性磷酸酶用作标记物质时,可使用酶的特异性底物测定酶活性,所述特异性底物例如关于辣根过氧化物酶(HRP)为1,2-苯二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,和关于ALP为磷酸对硝基苯酯。当生物素用作标记物质时,至少抗生物素蛋白或酶修饰的抗生物素蛋白通常用在该反应中。
本发明的抗-人胰岛素抗体可以与A:至少与人胰岛素反应的抗-人胰岛素抗体(以下还称为抗体A)或B:特异性识别本发明的抗-人胰岛素抗体的抗体(以下还称为抗体B)组合使用。
抗体A没有特别限制,只要该抗体具有与人胰岛素的反应性,并且可以具有与胰岛素原、胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)、猪胰岛素和牛胰岛素中的任一种的交叉反应性。抗体A可以是单克隆抗体或多克隆抗体,只要该抗体与人胰岛素反应,并且在单克隆抗体的情形中,具体地包括由杂交瘤66408(FERM BP-11315)产生的单克隆抗体(66408-抗体)和由杂交瘤66221(FERM BP-11314)产生的单克隆抗体。抗体A可以是完整的抗体分子以及抗体与人胰岛素反应的功能片段。在本发明的测定法和测定试剂可以通过组合抗体A和本发明的抗体而配置的条件下,抗体A的人胰岛素识别位点没有必要完全独立于本发明的抗-人胰岛素抗体的人胰岛素识别位点。
抗体B是指间接检测系统(诸如所谓的双抗体方法)中或用于增敏的抗体,并且可以是与本发明的抗-人胰岛素抗体特异性反应的任意抗体,并且可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体B可以是完整的抗体分子以及抗体与本发明的抗-人胰岛素抗体反应的功能片段。如果本发明的抗体是小鼠产生的单克隆抗体,则抗体B可以包括抗-小鼠IgG抗体。
如果本发明的抗体与抗体A组合使用,则使用前,本发明的抗体和 抗体A中的一种以上可以用标记物质进行标记或者可以固定到不溶性载体上。在这种情形中,具体的形式包括夹心ELISA和粒子凝集免疫测定法。
本发明提供的测定试剂(试剂盒)的形式不受特别限制,只要该试剂能够测定人胰岛素。公知的标记免疫测定法,即夹心ELISA和免疫层析,和公知的粒子凝集免疫测定法,即胶乳免疫凝集测定法(以下还称为LTIA)将在下文中作为实例进行描述。
<标记免疫测定法:夹心ELISA>
检测存在于样品中的人胰岛素的测定试剂(试剂盒)的形式可包括下述需要组分(a)和(b)的两种形式A和B:
A.(a)固定了本发明的抗-人胰岛素抗体的固相,和(b)用标记物质标记的且至少具有与人胰岛素的反应性的抗体A(以下还称为标记的抗体A);和
B.(a)用标记物质标记的本发明的抗-人胰岛素抗体,和(b)具有至少与固定的人胰岛素反应的抗体A的固相。
固定到固相上的抗体捕获样品中的人胰岛素以在所述固相上形成复合物。用标记物质标记的抗体与所捕获的人胰岛素结合,从而与所述复合物形成夹心。样品中的人胰岛素可通过用适于所述标记物质的方法测量标记物质的量来测定。关于配置测定试剂(试剂盒)的具体方法,如用于固定抗体的方法和用于通过标记物质标记抗体的方法,除了本文描述的那些之外还可以在不受特别限制的条件下使用本领域技术人员熟知的技术。这种配置可以优选地作为均质测定系统或异质测定系统而形成。
<标记免疫测定法:免疫层析>
典型的免疫层析按照在片状固相(如膜)上测试样品在溶液扩散方向与边缘的距离的顺序如下配置:测试样品溶液由于毛细管现象连续移动经过装有下述各项的测试条:“1.样品上样位点,”“2.标记的试剂位点,其在膜上以可扩散的方式保持标记的抗体A(用胶体金或有色胶乳标记),”和“3.固定有本发明的抗体的捕获试剂位点,其用于捕获由标记的抗体A和人 胰岛素形成的复合物”。
具体而言,当预定量的含有胰岛素的测试样品添加到样品上样位点时,样品由于毛细管现象渗入标记的试剂位点,并且胰岛素结合标记的抗体A以形成胰岛素与标记的抗体A的复合物。该复合物继续在膜上扩散和移动,当渗入膜上的捕获试剂位点(其含有本发明的抗体)时,该复合物被固定于固相上的捕获试剂捕获从而在该捕获试剂位点形成捕获试剂-胰岛素-标记的抗体A的三元复合物。胰岛素的存在可通过检测标记的试剂来检测,该检测通过人们选择的方法,例如在可见标记如胶体金的情况下检测凝集作用的外观(凝集图像/图片)和在酶的情况下由于添加底物来检测显色反应。
<粒子凝集免疫测定法:LTIA>
用于检测样品中存在的人胰岛素的测定试剂(试剂盒)的形式可以是下述需要组分(a)和(b)或仅(a)的四种形式A至D:
A.(a)固定有本发明的抗-人胰岛素抗体的胶乳粒子和(b)固定有至少与人胰岛素反应的抗体A的胶乳粒子;
B.(a)固定有本发明的抗-人胰岛素抗体的胶乳粒子和(b)至少与人胰岛素反应的抗体A;
C.(a)本发明的抗-人胰岛素抗体和(b)固定有至少与人胰岛素反应的抗体A的胶乳粒子;
D.(a)固定有本发明的抗-人胰岛素抗体和至少与人胰岛素反应的抗体两者的胶乳粒子。
这些测定试剂(试剂盒)可以优选的方式特别用于LTIA中。为了获得期望的能力,如增强的灵敏性,A至D中使用的胶乳粒子可根据粒径和类型适当选择。胶乳粒子可以是适合用于装载抗原或抗体的那些。例如,胶乳粒子可以是聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(磺酸酯)共聚物、苯乙烯-异丁烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物或乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物。尽管胶乳粒子的形状不受特别限制,但是优选地,平均粒径如此限定,以使得所产生的凝聚物(作为胶乳粒子表面上的抗体(或抗原)与分析物之间凝集反应的结果)具有足够通过视觉或光学检 测的尺寸。当使用透射电子显微镜时,平均粒径优选为0.02至1.6μm,特别是0.03至0.5μm。替代胶乳粒子,可以使用由金属胶体、明胶、脂质体、微胶囊、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性材料制造的粒子。
临床检查中使用的LTIA试剂通常以第一和第二试剂(溶液)的形式提供,它们与所用的测试样品顺次混合。A至D每种形式中(a)和(b)之一或两者可包含在第一或第二试剂中。包含(a)和(b)的方法可适当根据用于临床检查的测量装置和测定试剂的设计(如能力和可用性)进行选择。尽管优选地,形式A中的(a)和(b)两者均包含于第二试剂中,但是形式A中的(a)和(b)也可以优选方式分别包含于第一和第二试剂中。
尽管已经作为实例描述了本发明的测定法和测定试剂的代表性形式,显然能够理解,在使用本发明的抗体的条件下,本发明可以本领域技术人员公知的多种形式实施,如竞争性免疫测定法。
在上述本发明的测定法和测定试剂中,与猪胰岛素的交叉反应性小于18%。所需要的交叉反应性水平取决于人胰岛素测定法的目的而变化,并且优选为小于15%,更优选小于10%,进一步优选小于5%至小于2%,特别优选小于1%。如果使用本发明的抗体,则基本的交叉反应性可以评估为0%,并且因此,所述测定法和测定试剂可以设计具有小于1%如0.9%至0.01%的交叉反应性。
在所述测定法和测定试剂中交叉反应性的定量评估方法包括使用所需的测定法和测定试剂来评估交叉反应性,从而(1)通过用测试化合物进行竞争性测试而获得IC50(50%抑制浓度),(2)通过测量测试化合物的浓度而获得与理论浓度的比率,或(3)通过测量测试化合物的连续稀释样品而获得算数平均值(平均交叉反应性)并且获得(2)中每种样品的交叉反应性。(2)的特定计算式可以是下述:
交叉反应性(率)(%)=测量的测试化合物的浓度/测试化合物的理论浓度×100。
尽管在严格意义上,应该以摩尔形式进行交叉反应性的比较,但是 交叉反应性物质如本发明的人胰岛素和猪胰岛素的分子量是相同或相似的,因此,评价可以通过仅关于质量进行的计算无需摩尔转化进行。
本发明还提供一种测量治疗所施用的外源性胰岛素如胰岛素类似物和来源于除人之外的动物物种的胰岛素的方法,并且所述方法包括下述步骤。治疗所施用的外源性胰岛素的浓度可以这样获得:通过人胰岛素测定法获得人胰岛素浓度,组合测量人胰岛素和外源性胰岛素的步骤,从而获得人胰岛素和外源性胰岛素的总浓度,并且从所述总浓度减去人胰岛素浓度。
在使用本发明的抗体的测定法中要检测的“样品”可以主要是来源于活体(生物体)的体液(生物样品),并且没有特别限制,只要所述样品包含人胰岛素。样品可以优选地包括血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、胰腺提取物等,优选地包括血液、血清和血浆。
尽管参考实施例将更详细地描述本发明,但是本发明不限于这些实施例。
实施例
[试验例1]生成本发明的单克隆抗体的方法
1.制备免疫抗原
在人胰岛素(重组的;Fitzgerald Industries International,30-AI51)与完全弗氏佐剂(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)1∶1混合后,使用连接注射器来生成将要用作免疫抗原的乳剂。
2.杂交瘤的产生
免疫抗原皮下注射到雌性BALB/c小鼠(20至50μg/小鼠)背侧区。这一操作(免疫)每周重复两次。在免疫开始三周后,从血液样品中获得抗血清,从在后述使用固相抗原ELISA的测试中具有针对所述抗血清的高抗体滴度的小鼠中提取脾,通过常规程序使用50%PEG 1450(Sigma)进行细胞融合。使用SP2/O骨髓瘤细胞。将获得的融合细胞以2.5×106细胞/mL(关于脾细胞)悬浮在含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)、15%胎牛血清和10%BM-Condimed H1Hybridoma Cloning Supplement (BM-调节H1杂交瘤克隆添加物)(Roche Diagnostics K.K.)的RPMI 1640培养基 中,以0.2-mL等份地分配在96-孔培养板中。融合细胞在37℃于5%CO2的培养箱中培养。
3.筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤
从细胞融合开始七天后,培养物上清用于进行固相抗原ELISA(下文描述)作为初级筛选来选择对人胰岛素显示高反应性的孔作为初级阳性孔。将初级阳性孔中的细胞在24-孔板中连续传代。连续培养两天后,培养物上清用于进行人胰岛素的竞争性ELISA(下文描述)作为二级筛选来选择对人胰岛素表现出高反应性的孔作为二级阳性孔。进行使用Biacore(注册商标)的反应性测定法作为三级筛选来选择具有仅对人胰岛素的特异性反应性而对胰岛素原、胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)、猪胰岛素和牛胰岛素没有交叉反应性的孔作为三级阳性孔。对于四级筛选,培养三级阳性孔中的细胞,并且培养物上清用于进行在人胰岛素和由人胰岛素β链C端区域的序列″RGFFYTPKT″组成的肽片段之间的竞争性ELISA,从而选择对所述肽片段没有反应性而对人胰岛素具有高反应性的孔作为四级阳性孔(所述肽片段由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成;该肽的氨基酸序列仅在于C端氨基酸是″T″而不同于猪胰岛素(猪胰岛素的C端氨基酸是″A″))。
3-1.产生固相抗原ELISA板
将使用含有150mM氯化钠的10mM磷酸缓冲盐水(PBS)(pH 7.2)以1μg/mL的浓度制备的人胰岛素(Fitzgerald Industries International,30-AI51)在96-孔板上以50μL/孔固相化作为筛选抗原,并允许在4℃放置过夜。用400μL/孔的PBS溶液(含有0.05%吐温(注册商标)20和0.1%ProClin 300(Supelco;PBST))洗涤三次后,将含有1%BSA的PBST(BSA-PBST)以100μL/孔分配并允许在室温放置一小时用于封闭,从而产生固相抗原ELISA板。固相抗原ELISA板用PBST洗涤三次并用于固相抗原ELISA以及测试实施例和实施例中描述的测试。本文所述的测试实施例和实施例中所用的人胰岛素转换为国际单位为26IU/mg。
3-2.固相抗原ELISA
(i)将由用BSA-PBST逐步稀释的血压样品获得的小鼠抗血清或融合细胞的培养物上清在固相抗原ELISA板上以50μL/孔分配并允许在室温 放置一小时。
(ii)用PBST洗涤三次后,将用BSA-PBST 5000倍稀释的HRP-GtF(ab’)2-抗-小鼠Ig′s(BioSource,AMI4404)溶液以50μL/孔分配并允许在室温放置一小时。
(iii)用PBST洗涤三次后,将OPD(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(东京化学工业有限公司))以2mg/mL溶解在含有0.02%过氧化氢/水的0.2M柠檬酸盐缓冲溶液(以下称为底物溶解溶液)中,以50μL/孔添加,并允许在室温放置一小时。
(iv)另外,以50μL/孔添加含有1mM EDTA的1.5N硫酸(以下称为反应终止液),并且使用Titertek(注册商标)Multiskan Plus MK II(Flow Laboratories Inc)在波长492nm测量吸光度。
3-3.人胰岛素的竞争性ELISA
(i)将用BSA-PBST以0,2.5,5和10μg/mL稀释的人胰岛素(Fitzgerald Industries International,30-AI51)溶液在固相抗原ELISA板上以25μL/孔分配。
(ii)然后,将用BSA-PBST稀释至5和25倍的融合细胞培养物上清液或其未稀释的培养物上清液溶液以25μL/孔分配并允许在室温放置一小时。
(iii)以与上述“3-2.固相抗原ELISA”中的步骤(ii)至(iv)相同的方式进行后继操作。
3-4.使用Biacore(注册商标)进行抗体和测试化合物之间的反应性测定法
使用抗体的反应特异性作为指标,使用Biacore(注册商标)T100(GEhealthcare,JJ-1037-02)进行杂交瘤的筛选测试。
(i)小鼠抗体捕获试剂盒(GE Healthcare,BR-1008-38)和胺偶联试剂盒(GE Healthcare,BR-1000-50)用于将抗-小鼠IgG抗体固定到传感器芯片CM5(GE Healthcare,BR-1005-30)上。
(ii)将融合细胞的培养物上清的未稀释的溶液以30μL/min的流速添加到固定有抗-小鼠IgG抗体的传感器芯片CM5上,历时300秒,从而用抗-小鼠IgG抗体捕获所述培养物上清中包含的抗体。
(iii)用NaOH将HBS-EP+10×(运行缓冲液)(GE Healthcare,BR-1006-69)调节至pH 8.5,然后用纯水最终稀释10倍,以制备HBS-EP+工作溶液,其用于将下述测试化合物稀释至10ng/mL。将测试化合物的稀释溶液以两种浓度0ng/mL和10ng/mL每种以30μL/min的流速添加到固定有抗-小鼠IgG抗体的传感器芯片CM5上,历时120秒。在这种情形中,自由运行解离的时间设定为120秒。HBS-EP+工作溶液的制剂由0.01M HEPES(pH 8.5),0.15M氯化钠,3mM EDTA,和0.005%表面活性剂P20组成。
<测试化合物>
(1)人胰岛素:Fitzgerald Industries International,30-AI51
(2)胰岛素原:IRR,胰岛素原,人,用于免疫测定;NIBSC编号:84/611
(3)胰岛素类似物
赖脯胰岛素,100单位/mL:Eli Lilly Japan K.K.
门冬胰岛素,100单位/mL:Novo Nordisk Pharma Ltd.
甘精胰岛素,100单位/mL:sanofi-aventis K.K.
地特胰岛素,100单位/mL:Novo Nordisk Pharma Ltd.
格鲁辛胰岛素,100单位/mL:sanofi-aventis K.K.
(4)来源于除人之外的动物物种的胰岛素
牛胰岛素:SIGMA I5500
猪胰岛素:WAKO 091-04211
(iv)将甘氨酸1.5(GE Healthcare,BR-1003-54)和甘氨酸2.0(GEHealthcare,BR-1003-55)1∶1混合,以形成再生溶液,并且进行再生处理180秒。
3-5.合成的肽片段的竞争性ELISA
(i)制备由人胰岛素β链C端区域的序列″RGFFYTPKT″(SEQ IDNO.1)组成的肽片段。所述肽片段由肽自动化合成仪制备,并且按照Fmoc方法合成和纯化。HPLC用于验证肽的纯度等于或大于95%。质谱(MALDI-TOF)用来验证分子量与理论值相同。
(ii)将用BSA-PBST以0,2.5,5,和10μg/mL稀释的(i)中制备的合成肽片段或人胰岛素(Fitzgerald Industries International,30-AI51)以25μL/ 孔分散到固相抗原ELISA板上。
(iii)以与上述“3-3.人胰岛素的竞争性ELISA”中步骤(ii)和(iii)相同的方式进行后续操作。
4.筛查产生与本发明的单克隆抗体组合使用的单克隆抗体A的杂交瘤
从细胞融合开始七天后,培养物上清用于进行固相抗原ELISA作为初级筛选来选择对人胰岛素显示高反应性的孔作为初级阳性孔。将初级阳性孔中的细胞在24-孔板中连续传代。连续培养两天后,培养物上清用于进行竞争性ELISA作为二级筛选来选择对人胰岛素表现出高反应性的孔作为二级阳性孔。
5.克隆和单克隆抗体收集
通过上文描述的3(完成四级筛选后)和4(完成二级筛选后)的筛选选择的杂交瘤通过有限稀释法进行克隆从而分别获得杂交瘤66224和66408。为收集杂交瘤产生的单克隆抗体,以对应于0.5×106细胞的量向12-周龄雌性BALB/c小鼠腹膜内施用杂交瘤,该小鼠在施用该杂交瘤两周前用0.5mL的降植烷腹膜内注射。14天后收集腹水,通过离心获得上清液。上清液与等量的吸附缓冲液(3mol/L NaCl,1.5mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液,pH 8.5)混合,然后过滤。滤出液通过用吸附缓冲液平衡的蛋白质A琼脂糖柱以使用该柱吸附滤出液中的抗体,并且该抗体用0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱。洗脱液用1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和后,用PBS进行透析以收集抗体。
所述抗体,称为66224-抗体和66408-抗体,随后用于测试中。
产生66224-抗体和66408-抗体的杂交瘤于2009年6月26日分别以保藏号FERM BP-11314和FERM BP-11315通过国际专利生物保藏中心,日本产业技术综合研究所(International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(地址:Tsukuba Central 6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki,日本)进行保藏。
[试验例2]本发明的单克隆抗体与人胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物、猪胰岛素和牛胰岛素的交叉反应性
使用Biacore(注册商标)T100对于66224-抗体或66408-抗体与胰岛 素原、胰岛素类似物、猪胰岛素和牛胰岛素的交叉反应性进行测试。测试的方法与第一试验例的3-4相同,并且对于66224-抗体在抗体纯化后进行测试来验证与测试化合物的特异性反应性,并且对于66408-抗体也在抗体纯化后进行测试来验证与测试化合物的特异性反应性。
1.测试方法
66224-抗体或66408-抗体通过固定在传感器芯片CM5上的抗-小鼠IgG抗体捕获,并且加入胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素和牛胰岛素作为测试化合物来评价反应性。具体的操作程序如下,并且测试化合物与第一试验例相同。
(i)将抗-小鼠IgG抗体固定在传感器芯片CM5上。
(ii)将66224-抗体或66408-抗体用HBS-EP+工作溶液(pH 8.5)稀释至5μg/mL并且以30μL/min的流速加入,历时300秒,以允许传感器芯片CM5固定的抗-小鼠IgG抗体捕获所述66224-抗体或66408-抗体。
(iii)将用HBS-EP+工作溶液(pH 8.5)稀释的测试化合物以两种浓度0 ng/mL或10ng/mL以30μL/min的流速添加到固定有抗-小鼠IgG抗体的传感器芯片CM5上,历时120秒。在这种情形中,自由运行解离的时间设定为120秒。
(iv)将甘氨酸1.5和甘氨酸2.0以1∶1混合,以形成再生溶液,并且进行再生处理180秒。
2.结果
2-1.66224-抗体的反应性
对于66224-抗体,使用Biacore(注册商标)T100来验证与人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)、猪胰岛素和牛胰岛素的反应性。结果显示在图2中。在图2中,垂直轴表示由于在传感器表面上反应(抗原与抗体的结果)导致的质量变化(反应),″RU″表示Biacore(注册商标)测定系统特有的单位。水平轴表示以“秒(s)”为单位的时间(时间)(以下相同)。尽管以10ng/mL的人胰岛素浓度检测到2.0RU的反应性,但是对于其他测试化合物(10ng/mL)RU计算为0,并且没有检测到反应性(图2)。因此, 证实66224-抗体是本说明书中的“与人胰岛素反应而不与猪胰岛素反应的抗体”以及“不与牛胰岛素、胰岛素原和胰岛素类似物中的一种或多种反应的抗体”。
2-2.66408-抗体的反应性
对于66408-抗体,使用Biacore(注册商标)T100来验证与胰岛素原、各种胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素)、猪胰岛素和牛胰岛素的反应性。结果显示在图3中。尽管以10ng/mL的人胰岛素浓度检测到2.5RU的反应性,牛胰岛素的RU计算为0,并且没有检测到针对牛胰岛素的反应性。另一方面,对于其他测试化合物,RU计算为0.6至13,并且检测到反应性(图3)。因此,证实66408-抗体是本说明书中的″至少与人胰岛素反应的抗体A″(与人胰岛素反应并且与来源于除人之外的动物物种的胰岛素(子集)和胰岛素类似物反应的抗体)。
[试验例3]66224-抗体识别的表位的验证
作为第二试验例的结果,其证实66224-抗体与人胰岛素反应而不与猪胰岛素反应。人胰岛素和猪胰岛素彼此仅在β链C端区域氨基酸是″T″还是″A″而不同(图1),并且相信66224-抗体由一个氨基酸的差异鉴定并且识别人胰岛素与猪胰岛素。因此,为了验证66224-抗体的识别表位,使用包括在人胰岛素与猪胰岛素之间不同的氨基酸序列位点的合成的肽片段(在上述[试验例1]中的3-5中制备)进行竞争性ELISA,如果在该测试中,66224-抗体与所述合成的肽片段反应(竞争),则相信66224-抗体识别包括胰岛素β链C端的氨基酸序列的一级结构中的差异(置换)。如果66224-抗体不与所述合成的肽片段反应,则可以相信66224-抗体识别由人胰岛素分子中β链C端氨基酸序列形成的构象。
1.测试方法
按照下述程序检验所述合成的肽与66224-抗体之间反应性的存在。
(i)将人胰岛素(Fitzgerald Industries International,30-AI51)用PBS稀释至1μg/mL,以每孔50μL加入到96-孔板中,并允许在室温放置两小时。
(ii)用400μL/孔包含0.05%吐温(注册商标)20和0.1%ProClin 300(Supelco)的PBS溶液(PBST)进行洗涤3次。
(iii)以每孔100μL加入BSA-PBST,并且允许在室温放置一小时。
(iv)通过吸出完全去除加入的BSA-PBST溶液。
(v)作为竞争性测试化合物,将人胰岛素或合成的肽片段用BSA-PBST稀释为0,2.5,5和10μg/mL,并且以每孔25μL加入,并且将66224-抗体用BSA-PBST稀释至2μg/mL,以每孔25μL加入,并且允许在室温放置一小时。
(vi)用400μL/孔的PBST溶液进行洗涤三次。
(vii)将HRP--标记的山羊抗-小鼠IgGγ(SouthernBiotech,1030-05)稀释5000倍,以每孔50μL加入,并且允许在室温放置一小时。
(viii)用400μL/孔的PBST溶液进行洗涤三次。
(ix)将OPD(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)以2mg/mL溶解在底物溶解溶液中,每个孔中加入50μL,并且允许在室温放置一小时。
(x)以每孔50μL加入反应终止液,并且使用Titertek(注册商标)Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories Inc)在492nm波长测量吸光度。
除非另外指明,稀释溶液是BSA-PBST。
2.结果
测试结果显示在表1和图4中。
由于66224-抗体表现出与人胰岛素的反应性,当将人胰岛素用作与固相人胰岛素竞争的测试化合物时,反应性随浓度减小。这是因为由于66224-抗体被竞争溶液中的人胰岛素吸收,因此与固相人胰岛素反应的66224-抗体的量减少。然而,当将合成的肽片段用作竞争性检测化合物时,没有观察到反应性随所述合成的肽片段的浓度的变化。因此,证实了66224-抗体与所述合成的肽片段没有反应性。由上述结果,相信66224-抗体与包括人胰岛素β链C端氨基酸的氨基酸序列的一级结构没有反应性,并且识别由人胰岛素分子中β链C端氨基酸序列区域形成的构象。
[表1]
[实施例1]使用本发明的单克隆抗体和至少与人胰岛素反应的抗体A的组合的人胰岛素测定法:1
<LTIA>
1.胶乳粒子的产生
将装配有搅拌机、回流冷凝器、热传感装置、氮导入管和护套的玻璃反应容器(容量:2L)填充1100g蒸馏水,200g苯乙烯,0.2g苯乙烯磺酸钠和溶解在50g蒸馏水中的1.5g过硫酸钾水溶液,并且在容器内用氮气置换后,在70℃搅拌下进行聚合48小时。聚合结束后,该溶液用滤纸过滤以提取胶乳粒子。透射电子显微镜仪器(JEOL Ltd.,型号“JEM-1010”)用于在10000倍放大率对胶乳粒子成像并分析至少100个获得的胶乳粒子的直径以确定平均粒径。所获得的平均粒径是0.3μm。
2.抗-胰岛素抗体-敏化的胶乳粒子的制备
2-1.66224-抗体-敏化的胶乳粒子溶液的产生
向具有平均粒径0.3μm的1.0%胶乳溶液[在5mM Tris-HCl缓冲液(下文称为Tris-HCl),pH 8.5中]中添加用5mM Tris-HCl(pH 8.5)稀释至0.60mg/mL的等体积66224-抗体溶液,并在4℃搅拌两小时。随后向上述胶乳和抗体的混合溶液中添加等体积的含有0.5%BSA的5mMTris-HCl(pH 8.5)并在4℃搅拌一小时。离心溶液并去除上清液后,将沉淀重悬浮在5mM Tris-HCl(pH 8.5)中以产生66224-抗体-敏化的胶乳粒子溶液。
具有平均0.3μm粒径的胶乳以与上文相同的方式用于产生66408-抗体-敏化的胶乳粒子溶液。
3.试剂的制备
3-1.第一试剂的制备
含有500mM氯化钠和0.2%BSA的五(5)毫摩尔Tris-HCl(pH 8.5)用作第一试剂。
3-2.第二试剂的制备
混合等体积的66224-抗体-敏化的胶乳粒子溶液和66408-抗体-敏化的胶乳粒子溶液并用5mM Tris-HCl(pH 8.5)稀释,从而获得波长600nm处5.0Abs的吸光度来制备第二试剂。
4.测定
组合第一和第二试剂,使用Hitachi 7170自动分析仪鉴定人胰岛素浓度-依赖性粒子凝聚物形成。具体而言,添加150μL的第一试剂至10μL的浓度为0、5、25、50、100和200μU/mL的人胰岛素溶液中并在37℃加热5分钟。随后,添加50μL的第二试剂,然后搅拌。五分钟后,与凝集形成相关的吸光度变化在主波长570nm和亚波长800nm测量。
5.测定结果
测定结果显示在图2中。从表2中证实信号随着人胰岛素浓度增加并且可以定量。
[表2]
[实施例2]使用本发明的单克隆抗体的人胰岛素测定法:2
<夹心ELISA>
将66224-抗体或66408-抗体的每一种固相化(一级抗体)并且与作为标记的抗体的其余抗体(二级抗体)组合。夹心ELISA用于测量与人胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物、兔胰岛素、犬胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素的反应性。
1.所用的抗体和测试化合物
(1)单克隆抗体
66224-抗体:4.03mg/mL
66408-抗体:9.04mg/mL
(2)测试化合物
所用的人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和格鲁辛胰岛素)、猪胰岛素和牛胰岛素与第一和第二试验例相同。兔胰岛素和犬胰岛素如下:
兔胰岛素:Morinaga Institute of Biological Science,Inc.,200723;和
犬胰岛素:Morinaga Institute of Biological Science,Inc.,200722。
2.夹心ELISA测定法
(i)将用PBS稀释至2μg/mL的66224-抗体或66408-抗体的溶液在96-孔板中以50μU/孔固相化并允许在室温放置两小时。
(ii)用400μU/孔的PBST洗涤三次后,以100μL/孔分配BSA-PBST并允许在室温放置一小时用于封闭,从而产生夹心ELISA板。
(iii)将用BSA-PBST稀释至0、2.5、5和10 ng/mL的人胰岛素、胰岛素原、各种胰岛素类似物、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素和犬胰岛素中每一种的溶液在夹心ELISA板上以50μL/孔分配并允许在室温放置一小时。
(iv)用PBST洗涤三次后,将用BSA-PBST稀释至1μg/mL的生物素标记的66224-抗体或66408-抗体溶液以50μL/孔分配并允许在室温放置一小时。
(v)用PBST洗涤三次后,将用BSA-PBST稀释5000倍的HRP-缀合的Immuno Pure(注册商标)链霉抗生物素蛋白(PIERCE,Prod#21126)溶液 以50μL/孔分配并允许在室温放置一小时。
(vi)用PB ST洗涤三次后,将OPD(Tokyo Chemical Industry)以2mg/mL溶解在底物溶解溶液中,以50μL/孔添加并允许在室温放置一小时。
(vii)以50μL/孔添加反应终止溶液,使用Titertek(注册商标)Multiskan Plus MK II(Flow Laboratories)测量492nm的吸光度。
3.结果
3-1.66224固相抗体板测定结果
测试结果描述于表3和图5中。
当66224-抗体用作一级抗体,66408-抗体用作二级抗体时,对于人胰岛素观察到吸光度的浓度依赖性增加,而对于其余测试化合物没有观察到吸光度的浓度依赖性增加,并且测量的吸光度局限在测量误差的程度内。
[表3]
吸光度(Abs)
吸光度(Abs)
3-2.66408固相抗体板测定结果
测试结果描述于表4和图6中。
当66408-抗体用作一级抗体,66224-抗体用作二级抗体时,对于人胰岛素观察到吸光度的浓度依赖性增加,而对于其余测试化合物没有观察到吸光度的浓度依赖性增加,并且测量的吸光度局限在测量误差的程度内。
[表4]
吸光度(Abs)
吸光度(Abs)
4.讨论
由实施例2的结果,不管是66224-抗体还是66408-抗体用作一级或二级抗体,除人胰岛素外没有测试化合物被检测到,因此,应该理解,只有人胰岛素可以通过本发明的测定法定量而不受测试化合物的影响。换言之,使用本发明的测定法,只有人胰岛素能够被特异性测定,而不受胰岛素原、胰岛素类似物、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素和犬胰岛素的影响。基于实施例2的结果,可以形成这样的人胰岛素测定法和测定试剂,即,与商业试剂(例如与猪胰岛素有小于18%的交叉反应性)相比,其与除人胰岛素之外的测试化合物具有极低的交叉反应性或者具有基本上为0%的交叉反应性。
在第二试验例中使用Biacore(注册商标)T100进行的本发明的单克隆抗体的交叉反应性测试的结果中,66224-抗体与人胰岛素反应,并且不与任一种其它测试化合物反应。另一方面,由于66408-抗体具有与除牛胰岛素外所有测试化合物的反应性,相信66224-抗体针对人胰岛素的更高的特异性能够进行人-胰岛素-特异性测定。
由第三试验例,相信66224-抗体识别涉及人胰岛素β链C端区域的氨基酸序列的人胰岛素的构象,并且因此,利用使用人胰岛素和猪胰岛素的某些立体差异性位点作为表位的性质,能够进行人-胰岛素-特异性测定,这是本发明的一个特征。
工业可利用性
利用本发明,可以准确测定人胰岛素,而不受来源于除人之外的动物物种的胰岛素如猪胰岛素、胰岛素原和胰岛素类似物的影响。具体地,由于甚至在进行胰岛素类似物等给药的糖尿病患者的情形中也只有由糖尿病患者的β细胞分泌的内源性人胰岛素可以通过本发明准确进行测定,所以可以准确地知晓所述糖尿病患者的临床状况。
通过组合本发明的测定法的测定结果与,例如,来自常规胰岛素测定法(除与人胰岛素之外,其还表现出与来自除人之外的动物物种的胰岛素和胰岛素类似物的交叉反应性)的测定结果,由糖尿病患者产生的内源性胰岛素可以与胰岛素类似物和来源于除人之外的动物物种的胰岛素区分开来并且与它们一起测定;可以知晓施用的外源性胰岛素对医药治疗的贡献;并且因此,本发明是非常有用的。
保藏号
(1)FERM BP-11314
(2)FERM BP-11315
(3)FERM BP-11233
(4)FERM BP-11234
[保藏的生物材料的参考]
(1)产生66224-抗体的杂交瘤66224
i)保藏生物材料的保藏单位的名称和地址。
国际专利生物保藏中心,日本产业技术综合研究所(International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)
Tsukuba Central6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki305-8566,日本
ii)在i)中保藏单位保藏生物材料的日期
2009年6月26日(最初保藏日期)
2010年11月19日(从最初保藏移送至布达佩斯条约的日期)
iii)在i)中保藏单位对该保藏指定的保藏号。
FERM BP-11314
(2)产生66408-抗体的杂交瘤66408
i)保藏生物材料的保藏单位的名称和地址。
同(1)
ii)在i)中保藏单位保藏生物材料的日期
2009年6月26日(最初保藏日期)
2010年11月19日(从最初保藏移送至布达佩斯条约的日期)
iii)在i)中保藏单位对该保藏指定的保藏号。
FERM BP-11315
(3)产生66221-抗体的杂交瘤66221
i)保藏生物材料的保藏单位的名称和地址。
同(1)
ii)在i)中保藏单位保藏生物材料的日期
2009年4月8日(最初保藏日期)
2010年2月17日(从最初保藏移送至布达佩斯条约的日期)
iii)在i)中保藏单位对该保藏指定的保藏号。
FERM BP-11233
(4)产生66226-抗体的杂交瘤66226
i)保藏生物材料的保藏单位的名称和地址。
同(1)
ii)在i)中保藏单位保藏生物材料的日期
2009年4月8日(最初保藏日期)
2010年2月17日(从最初保藏移送至布达佩斯条约的日期)
iii)在i)中保藏单位对该保藏指定的保藏号。
FERM BP-11234
Claims (27)
1.一种抗-人胰岛素抗体,其具有下述性质(a)和(b):
a)所述抗体与人胰岛素反应,并且
b)所述抗体不与猪胰岛素反应。
2.权利要求1的抗-人胰岛素抗体,其还具有一种或多种下述性质:
c)所述抗体不与牛胰岛素反应,
d)所述抗体不与犬胰岛素反应,
e)所述抗体不与兔胰岛素反应,
f)所述抗体不与胰岛素原反应,
g)所述抗体不与胰岛素类似物反应,和
h)所述抗体不与由序列RGFFYTPKT(SEQ ID NO.1)组成的肽片段反应。
3.权利要求2的抗-人胰岛素抗体,其中所述胰岛素类似物选自由下列各项组成的组:赖脯胰岛素,门冬胰岛素,甘精胰岛素,地特胰岛素,和格鲁辛胰岛素。
4.权利要求1-3中任一项的抗-人胰岛素抗体,其还具有下述性质:
(i)所述抗体识别人胰岛素分子中β-链C-端RGFFYTPKT区的构象。
5.权利要求4的抗-人胰岛素抗体,其中人胰岛素分子中β-链C-端RGFFYTPKT区的构象是可在下述溶液中得到的构象:
0.01M HEPES(pH 8.5),0.15M氯化钠,3mM EDTA,和0.005%表面活性剂P20。
6.权利要求1-5中任一项的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体是单克隆抗体。
7.权利要求6的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体由保藏号为FERM BP-11314的杂交瘤产生。
8.权利要求6的抗-人胰岛素抗体,其中所述抗-人胰岛素抗体能够识别与保藏号为FERM BP-11314的杂交瘤产生的单克隆抗体所识别的表位相同的表位。
9.一种人胰岛素测定法,其包括使权利要求1至8中任一项的抗体与生物样品接触的步骤,从而检测通过接触形成的所述抗体与人胰岛素的复合物。
10.权利要求9的人胰岛素测定法,其中权利要求1至8中任一项的抗体用可检测的标记物质标记。
11.一种使用下述两种抗体的人胰岛素测定法:
1)权利要求1至8中任一项的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有至少与人胰岛素反应的性质的抗体A。
12.一种使用下述两种抗体的人胰岛素测定法:
1)权利要求1至8中任一项的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有特异性识别1)中的抗体的性质的抗体B。
13.权利要求11或12的人胰岛素测定法,其中1)和2)中的两种抗体均为单克隆抗体。
14.权利要求11或12的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体是单克隆抗体,并且其中2)中的抗体是多克隆抗体。
15.权利要求11至14中任一项的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体和/或2)中的抗体被固定到固相上。
16.权利要求15的人胰岛素测定法,其中所述固相是胶乳,并且其中胰岛素通过胶乳免疫凝集测定法测定。
17.权利要求16的人胰岛素测定法,其中1)中的抗体被固定到固相上,其中2)中的抗体用标记物质标记,并且其中胰岛素通过ELISA或免疫层析测定。
18.一种外源性胰岛素测定法,其包括下述步骤:
(1)获得人胰岛素和外源性胰岛素的总浓度;
(2)用权利要求9至17中任一项的胰岛素测定法获得人胰岛素的浓度;和
(3)通过从(1)获得的浓度减去(2)获得的浓度而得到外源性胰岛素的浓度。
19.一种胰岛素测定试剂,其中所述胰岛素测定试剂使用权利要求1至8中任一项的抗体。
20.一种胰岛素测定试剂,其使用下述两种抗体:
1)权利要求1至8中任一项的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有至少与人胰岛素反应的性质的抗体A。
21.一种胰岛素测定试剂,其使用下述两种抗体:
1)权利要求1至8中任一项所述的抗-人胰岛素抗体,和
2)具有特异性识别1)中的抗体的性质的抗体B。
22.权利要求20或21的胰岛素测定试剂,其中1)和2)中的两种抗体均为单克隆抗体。
23.权利要求20或21的胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体是单克隆抗体,并且其中2)中的抗体是多克隆抗体。
24.权利要求20至23中任一项的人胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体和/或2)中的抗体被固定到固相上。
25.权利要求24的人胰岛素测定试剂,其中所述固相是胶乳,并且其中胰岛素通过胶乳免疫凝集测定法测定。
26.权利要求24的人胰岛素测定试剂,其中1)中的抗体被固定到固相上,其中2)中的抗体用标记物质标记,并且其中胰岛素通过ELISA或免疫层析测定。
27.一种外源性胰岛素测定试剂盒,其包括下述测定试剂:
(1)用于测量人胰岛素和外源性胰岛素的总胰岛素浓度的试剂,和
(2)权利要求19至26中任一项的人胰岛素测定试剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009295260 | 2009-12-25 | ||
JP2009-295260 | 2009-12-25 | ||
PCT/JP2010/073633 WO2011078384A1 (ja) | 2009-12-25 | 2010-12-27 | ヒトインスリン測定方法及び測定試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103328509A true CN103328509A (zh) | 2013-09-25 |
Family
ID=44195906
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800592610A Pending CN103328509A (zh) | 2009-12-25 | 2010-12-27 | 人胰岛素测定法和测定试剂 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20130004976A1 (zh) |
EP (1) | EP2518084B1 (zh) |
JP (2) | JP6027744B2 (zh) |
CN (1) | CN103328509A (zh) |
CA (1) | CA2785678C (zh) |
WO (1) | WO2011078384A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106483302A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种胰岛素的测定试剂及其制备方法 |
CN106918708A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒 |
CN111690064A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-22 | 合肥天麦生物科技发展有限公司 | 一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其ppi单克隆抗体的制备方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015118843A1 (ja) * | 2014-02-04 | 2015-08-13 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | 試料検出プレート、これを用いた蛍光検出システム及び蛍光検出方法 |
CN108912223A (zh) * | 2018-03-28 | 2018-11-30 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 胰岛素免疫原、其制备方法、胰岛素抗体及试剂盒 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2013688B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Insolubilised proteins and immunoassays utilising them |
JPS60188327A (ja) | 1984-03-08 | 1985-09-25 | Sekisui Chem Co Ltd | ブタインスリンもしくはヒトインスリンに対する単クロ−ン性抗体およびその製造方法 |
JPH0198968A (ja) * | 1987-10-12 | 1989-04-17 | Tosoh Corp | ヒス・インスリンの測定方法 |
JPH01148962A (ja) | 1987-12-07 | 1989-06-12 | Tosoh Corp | インスリン免疫測定法 |
JPH03118472A (ja) | 1989-09-29 | 1991-05-21 | Sekisui Chem Co Ltd | インスリン定量方法及び定量試薬 |
KR20090069330A (ko) * | 2006-10-12 | 2009-06-30 | 와이어쓰 | 유백광/응집체를 감소시키기 위한 항체 용액 중의 이온 강도의 변화 |
MX2009012493A (es) * | 2007-05-21 | 2010-01-20 | Alder Biopharmaceuticals Inc | Metodos de humanizacion de anticuerpo de conejo novedosos y anticuerpos de conejo humanizados. |
AR071885A1 (es) * | 2008-05-23 | 2010-07-21 | Wyeth Corp | Proteinas de union al receptor de interleuquina 21 |
-
2010
- 2010-12-27 JP JP2011547704A patent/JP6027744B2/ja active Active
- 2010-12-27 WO PCT/JP2010/073633 patent/WO2011078384A1/ja active Application Filing
- 2010-12-27 US US13/518,788 patent/US20130004976A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-27 EP EP10839612.8A patent/EP2518084B1/en active Active
- 2010-12-27 CN CN2010800592610A patent/CN103328509A/zh active Pending
- 2010-12-27 CA CA2785678A patent/CA2785678C/en active Active
-
2015
- 2015-10-15 JP JP2015203456A patent/JP6055062B2/ja active Active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
I.H. MIRZA ET AL: "Antigenicity of the carboxyl terminus of insulin: isolation of human insulin-specific monoclonal antibodies", 《IMMUNOLOGY》 * |
LINDSTRÖM T. ET AL: "Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs", 《DIABETES CARE》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106918708A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒 |
CN106483302A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种胰岛素的测定试剂及其制备方法 |
CN111690064A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-22 | 合肥天麦生物科技发展有限公司 | 一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其ppi单克隆抗体的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130004976A1 (en) | 2013-01-03 |
JP6027744B2 (ja) | 2016-11-16 |
CA2785678C (en) | 2018-12-18 |
EP2518084B1 (en) | 2016-11-30 |
WO2011078384A1 (ja) | 2011-06-30 |
JP2016053044A (ja) | 2016-04-14 |
JPWO2011078384A1 (ja) | 2013-05-09 |
EP2518084A4 (en) | 2013-06-05 |
EP2518084A1 (en) | 2012-10-31 |
CA2785678A1 (en) | 2011-06-30 |
JP6055062B2 (ja) | 2016-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2739310C (en) | Insulin assay | |
EP2322562B1 (en) | Monoclonal antibody, and immunoassay using same | |
KR101669918B1 (ko) | 사람 체액 중의 시스타틴 c의 측정방법 | |
AU5188401A (en) | Immunoassay for measuring human C-peptide and kit therefor | |
US8026107B2 (en) | Agglutination inhibition assay method and reagent | |
CN104470942B (zh) | 生物标志物 | |
JP6055062B2 (ja) | ヒトインスリン測定方法及び測定試薬 | |
CN109387627A (zh) | 一种基于胎盘样硫酸软骨素a的癌症筛查和早期诊断的试剂方法 | |
CN109596839A (zh) | 人和肽素快速定量检测方法与试剂盒 | |
US7241578B2 (en) | Immunoassay method/equipment, biological component measurable toilet, anti-albumin monoclonal antibody, cell strain producing the same, and albumin detection kit | |
CN114134123A (zh) | 妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用 | |
CN112074738B (zh) | 心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以及抗体的组合 | |
AU9239498A (en) | Method for immunological assay | |
CN111732656B (zh) | 一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用 | |
US20240133904A1 (en) | Monoclonal antibody against d-dimer and diagnosis agent for detecting d-dimer, crosslinked fibrin and its derivatives containing d-dimer by using the antibody | |
JP3778979B2 (ja) | N−ペプチドのサンドイッチ免疫学的測定法 | |
Nilsson et al. | Immunological characterization of human luteinizing hormone with special regard to a common genetic variant | |
JP2002243740A (ja) | 免疫測定試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130925 |