CN111690064A - 一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其ppi单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其ppi单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法，本发明制备抗胰岛素原前体蛋白（PPI）抗体，在此基础上建立双抗体夹心ELISA，为重组人胰岛素中PPI的检测方法的确立奠定基础。本发明可用于重组人胰岛素生产的过程控制和产品放行控制。

Description

一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制 备方法
技术领域
本发明属于重组人胰岛素中的胰岛素原前体蛋白的检测技术领域，涉及一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法，特别涉及一种双抗夹心ELISA的建立方法及其PPI单克隆抗体的制备方法。
背景技术
胰岛素参与调节糖代谢，控制血糖平衡是临床上用于治疗糖尿病的主要药物。现在临床常用的胰岛素多是采用重组DNA技术将含胰岛素DNA的质粒植入大肠杆菌或酵母菌中大量表达形成非活性的胰岛素原前体蛋白(Pre-proinsulin，PPI)，再经酶切、纯化，得到高纯度胰岛素。PPI的高效、稳定表达是获得高产率胰岛素的前提条件，但未被酶切、去除的PPI会严重影响胰岛素的质量安全。因此对PPI表达量进行测定，并对酶切、纯化过程中以及胰岛素中PPI残留量进行检测和控制具有非常重要的意义。
欧洲药典明确指出要对胰岛素中PPI进行检测和控制，但未对检测方法做出具体要求。目前，常用的方法主要有放射性免疫分析法、高效液相色谱法等。放射性免疫分析法因价格昂贵、容易造成环境污染、危害人体健康等不足逐渐被淘汰。高效液相色谱法方便、准确，常用来对纯化过程中PPI含量进行检测，但灵敏度较差，无法满足终产品中PPI残留检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种PPI单克隆抗体的制备方法，包括：用胰岛素原前体蛋白作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价高的小鼠于细胞融合前3天经腹腔注射免疫原胰岛素原前体蛋白100μg/只加强免疫；之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞；将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株；将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×106个/只的数量接种于已经腹腔注射弗氏不完全佐剂6～8周龄的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感时，用10ml针头采集腹水；将腹水离心，收集上清，用Protein G凝胶柱进行纯化，得到纯化后的PPI单克隆抗体。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种双抗夹心ELISA的建立方法，包括将制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1ug/ml，100ul/孔包被于酶标板中，每孔分别添加150ul的质量分数为2％的BSA溶液，37℃封闭60min，PBST洗涤3次；于检测孔加100ul的浓度为1ug/ml的胰岛素原前体蛋白水溶液，以质量浓度为1％的BSA溶液作为空白对照，37℃放置60min，PBST洗涤3次；按棋盘法排布，检测孔和空白对照分别加生物素标记的PPI单克隆抗体，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次；检测孔和空白对照分别加链霉亲和素，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次，检测孔和空白对照分别加TMB显色液避光5min，检测孔和空白对照分别加终止液，用酶标仪读取450nm波长处的吸光值，以检测孔吸光值大于2.1倍空白对照孔吸光值作为阳性检出孔；
步骤2：阳性检出孔所对应的包被PPI单克隆抗体和生物素标记的PPI单克隆抗体分别作为最佳固相抗体和检测抗体，将确定的最佳固相抗体包被于酶标板中，加入100μL系列浓度的胰岛素原前体蛋白：82.5pg/mL、41.25pg/mL、20.65pg/mL、10.31pg/mL、5.16pg/mL、2.58pg/mL、1.29pg/mL、0.645pg/mL、0pg/mL，37℃放置60min，PBST洗涤3次；再加入1ug/ml，100ul/孔最佳检测抗体，进行双抗夹心ELISA的操作，每个PPI浓度3复孔；以各浓度平均OD450为纵坐标，以PPI浓度为横坐标，用SkanIt RE进行标准曲线的拟合，确定检测的线性范围和定量方程。
优选的技术方案为：将权利要求1制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的浓度为0.1M的PBS缓冲液稀释到浓度为1mg/mL，超滤去除干扰物质，加入水溶性生物素，室温反应1小时，超滤去除游离生物素，得到生物素标记的PPI单克隆抗体。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明制备获得了6株抗PPI单克隆抗体，初步建立了双抗体夹心ELISA检测方法，可用于重组人胰岛素生产的过程控制和产品放行控制。
2、本发明的双抗夹心ELISA检测PPI的定量曲线的线性范围0.645-82.5pg/mL，添加回收率为89％–95％，检测限为3.06pg/mL。
附图说明
图1为PPI单克隆抗体效价。
图2为PPI单克隆抗体纯化。(A)Reduced SDS-PAGE showing purification ofmonoclonal antibodies P1 and P2.1:10μL of P1；2:5μL of P1；3:10μL of P2；4:5μLof P2；(B)P3 and P4.1:10μL of P3；2:5μL of P3；3:10μL of P4；4:5μL of P4；(C)P5.1:10μL of P5；2:5μL of P5；(D)P6.1:10μL of P6；2:5μL of P6；M:molecularweight massstandards(kDa)。
图3为配对抗体的筛选。
图4为配对抗体特异性。A：Plating antibodies are listed below the x-axis，detection antibodie isP5。B：Plating antibodie isP5，detection antibodies arelisted below the x-axis。
图5为PPI定量曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法
1.材料与方法
1.1材料
PPI单克隆抗体的制备、纯化和标记：实验用动物为6～8周龄Balb/c小鼠，青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-羊抗鼠IgG)购自Frdbio公司，HAT(50×)、HT、PEG1450和弗氏完全佐剂不完全弗氏佐剂(Incompletefreund'sadjuvant)购自Sigma公司，DMEM培养基购自Wisent公司，细胞消化液(0.25％胰酶和0.02％EDTA)使用时配制。抗体纯化所用试剂包括抗体洗脱缓冲液、中和缓冲液、保存缓冲液、0.01M的PBS(pH 7.4)缓冲液以及叠氮钠均为自制。抗体洗脱缓冲液为浓度为300mmol/L的乙酸溶液、中和缓冲液为浓度为1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.0，包含2％的BSA。保存缓冲液中各成分含量如下：8g/L的NaCL，0.2g/L的KCl，0.24g/L的KH2PO4，1.44g/L的Na2HPO4，0.3g/L的NaN3，5g/L的BSA，pH＝7.4。
双抗体夹心方法建立中ELISA检测所用试剂如下：ELISA包被液、洗涤液(PBST)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，以下简称TMB)底物反应液、封闭液、通用稀释液、终止液均为自制。包被液是pH值为9.6的50mM碳酸盐缓冲液、稀释液为pH7.2、0.01M的PBS+0.1％Tween。终止液2mol/L浓硫酸。洗涤液是含0.05％Tween20的PBST溶液
动物免疫抗原PPI、间接ELISA方法的包被抗原PPI、双抗体夹心方法中的PPI标准品以及SOD、sIKR、IKR、IK均是收集重组人胰岛素生产过程中PPI及其酶切中间产物经纯化后获得，纯度达均95％以上。
1.2方法
1.2.1单克隆抗体的制备、纯化和标记：用PPI作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠，免疫前取血作为阴性血清对照。初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价较高的小鼠于细胞融合前3天经腹腔注射免疫原100μg/只加强免疫。之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞。将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株。将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×106个/只的数量接种于已经腹腔注射福氏不完全弗氏佐剂6～8周龄的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感时，用10ml针头采集腹水。将腹水离心，收集上清，测定效价。用Protein G凝胶柱进行纯化，并用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的单克隆抗体进行纯度鉴定。将获得的单抗用0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)稀释到1mg/mL，超滤去除干扰物质，加入水溶性生物素，室温反应1小时，超滤去除游离生物素。
1.2.2双抗体夹心ELISA筛选配对抗体
将纯化后的单抗用PBS(pH 7.4)稀释至1ug/ml，100ul/孔分别包被于酶标板中。2％BSA，150ul/孔，37℃封闭60min，PBST洗涤3次。于检测孔加1ug/ml的PPI，100ul/孔，以1％BSA作为空白对照，37℃放置60min，PBST洗涤3次。按棋盘法排布，分别加生物素标记的各单抗，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次。加链霉亲和素HRP，100ul/孔，37℃放置60min。PBST洗涤3次，加TMB显色液避光5min，加终止液，读取450nm波长处的吸光值。以样品孔吸光值大于2.1倍空白对照孔吸光值作为阳性检出孔。
1.2.3配对抗体特异性评价
以1.2.2中阳性检出孔所对应的包被抗体和生物素标记的抗体分别作为固相抗体和检测抗体，于检测孔中分别加1ug/ml的PPI、SOD、sIKR、IKR和IK，以1％BSA作为空白对照，按1.2.2中所述方法检测各配对抗体的特异性。
1.2.4定量曲线的构建
将确定的最佳固相抗体包被于酶标板中，加入100μL系列浓度的PPI：82.5pg/mL、41.25pg/mL、20.65pg/mL、10.31pg/mL、5.16pg/mL、2.58pg/mL、1.29pg/mL、0.645pg/mL、0pg/mL，37℃放置60min，PBST洗涤3次。再加入1ug/ml，100ul/孔最佳检测抗体，按1.2.2中所述方法进行双抗夹心ELISA的操作，每个PPI浓度3复孔。以各浓度平均OD450为纵坐标，以PPI浓度为横坐标，用SkanIt RE进行标准曲线的拟合，确定检测的线性范围和定量方程。
1.2.5准确度和灵敏度评价
准确称取重组人胰岛素，用通用稀释液配制成2ug/ml，取2ug/ml重组人胰岛素溶液200ul分别加入等体积的82.5pg/mL、20.58pg/mL和5.16pg/mL的PPI标准品，配制成终浓度分别为41.25pg/mL、10.31pg/mL和2.58pg/mL的质控样品。将2ug/ml重组人胰岛素溶液稀释成1ug/ml，作为待检样品。将标准品、待检样品、质控样品分别加入到包被完成的ELISA板中，以通用稀释液作为空白，每样3个复孔，按上述建立的ELISA方法进行测定。准确度用添加回收率表示，即实测质控样品浓度平均值减去实测待检样品浓度平均值的差与理论添加浓度的比值(％)。
用上述建立的双抗夹心ELISA方法测定12个空白样品即通用稀释液在450nm波长处的吸光值，将测定的平均值加上3倍标准差所得的吸光值代入定量方程，所得到的样品浓度值即为该检测方法的最低检测下限即灵敏度。
2.结果与分析
2.1单克隆抗体的制备和纯化
用PPI免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，经多轮筛选和3次亚克隆后，获得了6株稳定分泌抗PPI单克隆抗体的细胞株，分别为P1、P2、P3、P4、P5和P6。在后续研究中，各单克隆抗体以其来源的细胞株命名。将筛选出的各细胞株以1～5×106个/只的数量分别注射到小鼠腹腔内，制备腹水，并对收集的腹水上清进行了效价测定(图1)，结果显示P5效价最高，P1效价次之，P3效价最低。但总体来说，各单抗效价均在1:7.29×105以上，可开展进一步研究。用Protein G柱对单抗P1、P2、P3、P4、P5和P6进行亲和层析，纯化后的单抗用还原性SDS-PAGE检测纯度(图2)。结果显示，各单抗纯度较高，除免疫球蛋白轻链和重链外不含杂蛋白。
2.2双抗体夹心ELISA筛选配对抗体
以P1、P2、P3、P4、P5和P6依次作为固相抗体包被于酶标板中，加入PPI作为抗原，以1％BSA作为空白对照，分别加入生物素标记的各单抗，进行双抗夹心ELISA检测。以大于空白孔吸光值的2.1倍的检测孔所对应的抗体作为阳性配对抗体(图3)。结果显示，P5作为固相抗体时，生物素标记的P1、P2、P3、P4和P6均可作为检测抗体。P2作为固相抗体时没有成功配对的检测抗体。P1、P3、P4和P6作为固相抗体时都只能用生物素标记的P5作为检测抗体。
2.3配对抗体特异性评价
分别以P1、P3、P4和P6作为固相抗体，用PPI及其酶切中间产物SOD、sIKR、IKR和IK作为抗原，P5作为检测抗体，测定各配对抗体的特异性(图4的A)。结果显示，P3作为固相抗体时，空白对照吸光值最高，配对抗体未与各抗原发生免疫反应；P4作为固相抗体时，配对抗体与PPI、sIKR和IKR均可发生免疫反应，特异性较差；P1作为固相抗体，配对抗体只与PPI发生免疫反应，但吸光值较低仅为0.293；P6作为固相抗体，配对抗体对PPI和sIKR均产生免疫反应，特异性较差且sIKR的吸光值1.44远高于PPI的吸光值0.58。以P5作为固相抗体，用PPI及其酶切中间产物SOD、IK、IKR和SIKR作为抗原，分别以P1、P2、P3、P4和P6作为检测抗体，测定各配对抗体的特异性(图4的B)。结果显示，P4和P6作为检测抗体时配对抗体特异性较差，与PPI、sIKR、IKR和IK均可发生免疫反应，且吸光值较为接近；P3作为检测抗体时，IK吸光值最高且不与PPI发生免疫反应；P1和P2作为检测抗体时，PPI吸光值最高分别为2.47和2.46，但配对抗体对IKR、IK反应均呈阳性，吸光值分别为0.56、0.81和0.36、0.61，远低于PPI吸光值，对PPI检测干扰较小，因此用P5作为固相抗体，P2作为检测抗体开展后续研究。
2.4定量曲线的构建
P5作为固相抗体，加入系列浓度的PPI标准品，以生物素标记的P2作为检测抗体，进行双抗夹心ELISA测定PPI。以OD450为纵坐标，以PPI浓度为横坐标，进行四参数拟合，绘制标准曲线(图4)，得到拟合曲线方程：y＝7.92579+[(0.130957-7.92579)/(1+(x/96.6272)^1.51852)](R2＝1)，该检测方法的线性范围为0.645-82.5pg/mL。
2.5双抗夹心ELISA检测PPI方法的准确度和灵敏度评价
按照准确度测定方法检测高(41.25pg/mL)、中(10.31pg/mL)、低(2.58pg/mL)三个浓度质控样品的回收率(表2)。结果显示，1ug/ml重组人胰岛素溶液中测得PPI浓度为0.638pg/mL，各质控样品添加回收率分别为91.4％、88.62％和95.41％，准确度较好。
按照灵敏度的测定方法，测定了12个空白样品即样品稀释液的OD450值，测定的平均值加上3倍标准差所得的值为0.172，代入回归方程，计算出最低检测下限为3.06pg/mL，满足重组人胰岛素中PPI检测灵敏度的要求。
表2 PPI残留量ELISA检测方法的添加回收率(准确度)
Figure BDA0002554883810000061
3.讨论
除《欧洲药典》外2020版《中国药典》重组人胰岛素篇也提出了要对生产工艺过程中胰岛素前体进行控制，由此可见，胰岛素前体的检测已成为过程控制和终产品放行中不可或缺的环节。过程控制多采用适当的HPLC方法进行，但由于终产品中前体物质含量较低，对检测方法的灵敏度要求较高，成为各企业产品放行控制检测中的难点。
酶联免疫吸法灵敏度较高，但多用于血清中天然胰岛素原的检测。与之相比，胰岛素中前体物质的检测存在中间产物种类较多且分子结构相似，容易发生交叉反应，以及检测样品中胰岛素浓度较高，容易干扰检测结果等问题。本研究用从重组人胰岛素生产过程中收集纯化的胰岛素前体作为抗原，制备单克隆抗体，将单抗两两配对筛选配对抗体，并对配对抗体的特异性进性检测，筛选出特异性较好的配对抗体初步建立双抗夹心ELISA检测胰岛素前体的方法。此外，对该方法的准确度以及灵敏度进行验证，与Leng等人建立的方法相比，灵敏度明显提升，且准确度验证中排除胰岛素干扰，初步确立了较为理想的胰岛素前体的检测方法。
实施例2：
一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法
一种PPI单克隆抗体的制备方法，包括：用胰岛素原前体蛋白作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价高的小鼠于细胞融合前3天经腹腔注射免疫原胰岛素原前体蛋白100μg/只加强免疫；之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞；将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株；将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×106个/只的数量接种于已经腹腔注射弗氏不完全佐剂6～8周龄的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感时，用10ml针头采集腹水；将腹水离心，收集上清，用Protein G凝胶柱进行纯化，得到纯化后的PPI单克隆抗体。
一种双抗夹心ELISA的建立方法，包括将制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1ug/ml，100ul/孔包被于酶标板中，每孔分别添加150ul的质量分数为2％的BSA溶液，37℃封闭60min，PBST洗涤3次；于检测孔加100ul的浓度为1ug/ml的胰岛素原前体蛋白水溶液，以质量浓度为1％的BSA溶液作为空白对照，37℃放置60min，PBST洗涤3次；按棋盘法排布，检测孔和空白对照分别加生物素标记的PPI单克隆抗体，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次；检测孔和空白对照分别加链霉亲和素，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次，检测孔和空白对照分别加TMB显色液避光5min，检测孔和空白对照分别加终止液，用酶标仪读取450nm波长处的吸光值，以检测孔吸光值大于2.1倍空白对照孔吸光值作为阳性检出孔；
步骤2：阳性检出孔所对应的包被PPI单克隆抗体和生物素标记的PPI单克隆抗体分别作为最佳固相抗体和检测抗体，将确定的最佳固相抗体包被于酶标板中，加入100μL系列浓度的胰岛素原前体蛋白：82.5pg/mL、41.25pg/mL、20.65pg/mL、10.31pg/mL、5.16pg/mL、2.58pg/mL、1.29pg/mL、0.645pg/mL、0pg/mL，37℃放置60min，PBST洗涤3次；再加入1ug/ml，100ul/孔最佳检测抗体，进行双抗夹心ELISA的操作，每个PPI浓度3复孔；以各浓度平均OD450为纵坐标，以PPI浓度为横坐标，用SkanIt RE进行标准曲线的拟合，确定检测的线性范围和定量方程。
优选的技术方案为：将权利要求1制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的浓度为0.1M的PBS缓冲液稀释到浓度为1mg/mL，超滤去除干扰物质，加入水溶性生物素，室温反应1小时，超滤去除游离生物素，得到生物素标记的PPI单克隆抗体。
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以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (3)

1.一种PPI单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：用胰岛素原前体蛋白作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价高的小鼠于细胞融合前3 天经腹腔注射免疫原胰岛素原前体蛋白100μg/只加强免疫；之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞；将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株；将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×106个/只的数量接种于已经腹腔注射弗氏不完全佐剂6～8周龄的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感时，用10ml针头采集腹水；将腹水离心，收集上清，用Protein G 凝胶柱进行纯化，得到纯化后的PPI单克隆抗体。
2.一种胰岛素原前体蛋白的检测方法，其特征在于：包括将权利要求1制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1ug/ml，100ul/孔包被于酶标板中，每孔分别添加150ul的质量分数为2%的BSA溶液，37℃封闭60min，PBST洗涤3次；于检测孔加100ul的浓度为1ug/ml的胰岛素原前体蛋白水溶液，以质量浓度为1%的BSA溶液作为空白对照，37℃放置60min，PBST洗涤3次；按棋盘法排布，检测孔和空白对照分别加生物素标记的PPI单克隆抗体，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次；检测孔和空白对照分别加链霉亲和素，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗涤3次，检测孔和空白对照分别加TMB显色液避光5min，检测孔和空白对照分别加终止液，用酶标仪读取450nm波长处的吸光值，以检测孔吸光值大于2.1倍空白对照孔吸光值作为阳性检出孔；
步骤2：阳性检出孔所对应的包被PPI单克隆抗体和生物素标记的PPI单克隆抗体分别作为最佳固相抗体和检测抗体，将确定的最佳固相抗体包被于酶标板中，加入100 μL系列浓度的胰岛素原前体蛋白：82.5pg/mL、41.25pg/mL、20.65pg/mL、10.31pg/mL、5.16pg/mL、2.58pg/mL、1.29pg/mL、0.645pg/mL、0pg/mL，37℃放置60min，PBST洗涤3次；再加入1ug/ml，100ul/孔最佳检测抗体，进行双抗夹心ELISA 的操作，每个PPI浓度3 复孔；以各浓度平均OD450为纵坐标，以PPI浓度为横坐标，用SkanIt RE进行标准曲线的拟合，确定检测的线性范围和定量方程。
3.根据权利要求2所述的胰岛素原前体蛋白的检测方法，其特征在于：将权利要求1制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的浓度为0.1M的PBS缓冲液稀释到浓度为1mg/mL，超滤去除干扰物质，加入水溶性生物素，室温反应1小时，超滤去除游离生物素，得到生物素标记的PPI单克隆抗体。
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