CN117420303A - 新型冠状病毒和恶性疟原虫间日疟原虫抗体制备方法及其检测试剂盒 - Google Patents

新型冠状病毒和恶性疟原虫间日疟原虫抗体制备方法及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体抗原制备领域，具体是一种同时检测新型冠状病毒和间日、恶性疟疾的抗原检测试剂盒，同时含有新型冠状病毒抗体和间日、恶性疟疾抗体。本发明产品性能符合质量标准的要求（阴性参考品检测结果全为阴性，阳性参考品检测结果全为阳性），产品特异性和干扰试验均符合产量质量要求（与呼吸道相关疾病无交叉反应，试剂盒不受干甘油三酯、胆红素等血清基质的影响），产品的加速稳定性实验符合1个月的要求。

Description

新型冠状病毒和恶性疟原虫间日疟原虫抗体制备方法及其检 测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种病原体检测领域，具体涉及新型冠状病毒和恶性疟原虫间日疟原虫抗体制备方法及其检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是继非典型性肺炎和中东呼吸综合症后当前发现的一种能够引起人严重急性呼吸系统病变的新疾病，具有传染性强、传播速度快等典型特征。
恶性疟原虫寄生于人体的四种疟原虫之一，造成恶性疟疾的病原体，恶性疟原虫以人和雌性按蚊作为宿主，在人体进行裂体增殖及配子生殖的开始，在蚊体完成配子生殖和孢子增殖。
发明内容
针对新型冠状病毒和恶性疟原虫的实际检测需求，本发明提供一种新型冠状病毒和恶性疟原虫间日疟原虫抗体制备方法及其检测试剂盒。
本发明是由以下技术方案来实现的：
本发明提供的一种同时检测新型冠状病毒和间日、恶性疟疾的抗原检测试剂盒，同时含有新型冠状病毒抗体和间日、恶性疟疾抗体。
所述新型冠状病毒抗体制备方法包括下列步骤：
(一)S重组蛋白制备
选取了S蛋白S1区段319-541aa，进行了细胞表达，并对表达产物进行了纯化、抗原性检测；
1、S蛋白表位选择分析
2、抗原位置确定
3、重组载体构建
4、细胞转染与筛选
采用Elisa间接法检测原理，将SARS-Cov-2 S(抗原)蛋白按照包被浓度2ug/ml、包被于96孔微孔板中，对照组按照饱和浓度2ug/ml进行包被，制成固相载体，向微孔中分别加入SARS-Cov-2 S质控ACE2-Q1，ACE2-Q2、NC和空白限质控，质控中的ACE2受体与连接于固相载体上的SARS-Cov-2 S蛋白结合，将未反应的组分洗净后，加入HRP标记的鼠抗人ACE2抗体，Elisa使用浓度为1/5K，充分反应，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色；
(二)N蛋白制备
1、N蛋白抗原序列同源性分析
2、抗原确定
3、表达载体构建及诱导表达鉴定
4、蛋白分离纯化与鉴定
本发明所述的间日、恶性疟疾抗体制备方法包括下列步骤：
(一)恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考Genbank:AAC47453.1 HRP2氨基酸序列，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的HRP2；
2.重组质粒构建
3.重组蛋白表达纯化(二)间日疟原虫裂殖子表面蛋白-1重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考GenBank:AAN86236.1序列，通过分析，选取其抗原优势表位，且保守性强的区域，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的MSP-1重组蛋白；
2.重组质粒构建
3.重组蛋白表达纯化(三)富组氨酸蛋白2和裂殖子表面蛋白-1抗体的制备
1.小鼠免疫
2.抗体制备
3、抗体纯化
4、抗体验证
采用双抗体夹心法，对抗体配对效果进行验证；将10个抗体分别进行HRP标记，采用棋盘法进行双抗体夹心检测；包被相应抗体，加入pfHRP2(或pvMSP-1)蛋白，再加入HRP标记的抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，在底物显色液的作用下，通过酶标仪检测OD450。
有益效果在于：
本发明产品性能符合质量标准的要求(阴性参考品检测结果全为阴性，阳性参考品检测结果全为阳性)，产品特异性和干扰试验均符合产量质量要求(与呼吸道相关疾病无交叉反应，试剂盒不受干甘油三酯、胆红素等血清基质的影响)，产品的加速稳定性实验符合1个月的要求。
附图说明
图1：PCR扩增；Line1：DL2000 Marker；line 2：SARS-COV-2-N。
图2：SDS-PAGE表达鉴定；Line1：蛋白Marker；line 2：pET28a/SARS-COV-2-N。
图3：PCR鉴定结果。
图4：SDS-PAGE诱导表达鉴定。
图5：SDS-PAGE纯化结果。
图6：PCR鉴定结果。
图7：SDS-PAGE诱导表达鉴定。
图8：SDS-PAGE纯化结果。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本发明提供的一种同时检测新型冠状病毒和间日、恶性疟疾的抗原检测试剂盒，同时含有新型冠状病毒抗体和间日、恶性疟疾抗体。
所述新型冠状病毒抗体制备方法包括下列步骤：
(一)S重组蛋白制备
选取了S蛋白S1区段319-541aa，进行了细胞表达，并对表达产物进行了纯化、抗原性检测；
1、S蛋白表位选择分析
参考Genbank ID MN908947.3，C0VID-19S蛋白具有1273aa，Mr＝141.2kDa，PI6.24；
2、抗原位置确定
选取无信号肽，无跨膜结构域，整体亲水性，抗原表位丰富区即319-541aa；序列信息如下：选取S1区段319-541aa，223aa，Mr＝25.1kDa，PI 8.91；
3、重组载体构建
上游引物：5’-GCGGATCCCGTGTGCAACCGACCGAAAGCA-3’
下游引物：5’-CCCTCGAGGAAGTTCACGCATTTGTTCTTCA-3’
选取表达质粒pCDNA-3，酶切位点：BamH I/Xho I；
重组蛋白Mr＝26.1kDa，PI 8.9；
以C0VID-19-S质粒为模板，用上述上下游引物进行PCR扩增，扩增获得709bp的目的片段C0VID-19-S1-1，经凝胶回收试剂盒进行胶回收；PCR产物与pcDNA-3质粒同时用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化相应的DNA片段；用T4 DNA连接酶连接，构建真核表达载体pcDNA-3/C0VID-19-S1-1，转化至感受态细菌E.coli DH5ɑ，随机挑选氨苄抗性的转化克隆进行菌液PCR鉴定；将PCR阳性菌液送测序，测序正确菌液扩大培养用质粒提取试剂盒提取重组质粒pcDNA-3/C0VID-19-S1-1用于转染细胞；
4、细胞转染与筛选
4.1细胞培养
1)HEK293细胞转移到离心管，加入无血清培养基，离心；
2)用完全培养基重悬离心沉淀，转移到细胞培养瓶中，放入二氧化碳培养箱进行培养；
3)细胞长满后，去除上清，用胰酶消化细胞，消化完毕后加入完全培养基终止消化，轻拍培养瓶或用滴管轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀，转移到离心管，离心，分3个瓶进行培养；
4)细胞长满后，选择生长状态好的细胞，转移到6孔板进行培养，细胞密度生长到80％左右时，进行转染；
4.2细胞转染
1)采用用阳离子脂质体2000将质粒稳定转染到细胞内；
2)转染6小时后，更换完全培养基培养细胞；
3)转染24小时后，细胞传代，更换含600ug/ml G418的培养基进行培养；
4)3天后更换培养基，继续观察细胞生长情况；
5)待细胞开始大量死亡时(7天左右)，将G418浓度减半，继续筛选；
6)14天左右之后，明显可见有抗性的克隆团出现，转为完全培养基培养，细胞生长到一定的密度之后，进行有限稀释亚克隆，通过筛选得到稳定分泌的细胞株；
7)将稳定分泌的细胞株扩大培养，冻存保株；
8)将细胞放大培养，收集培养上清，进行蛋白纯化；
5、蛋白表达纯化与鉴定
1、收集细胞发酵上清液，经超滤浓缩后上样至预先通过Ni-IDA结合缓冲液平衡过的Ni-IDA-Bestarose 6FF亲和层析柱；
2、用Ni-IDA结合缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
3、用Ni-IDA洗杂缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
4、用Ni-IDA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液；
5、将上述收集的蛋白溶液加至透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜后进行SDS-PAGE分析；
采用Elisa间接法检测原理，将SARS-Cov-2 S(抗原)蛋白按照包被浓度2ug/ml、包被于96孔微孔板中，对照组按照饱和浓度2ug/ml进行包被，制成固相载体，向微孔中分别加入SARS-Cov-2 S质控ACE2-Q1，ACE2-Q2、NC和空白限质控，质控中的ACE2受体与连接于固相载体上的SARS-Cov-2 S蛋白结合，将未反应的组分洗净后，加入HRP标记的鼠抗人ACE2抗体，Elisa使用浓度为1/5K，充分反应，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色；
(二)N蛋白制备
1、N蛋白抗原序列同源性分析
将C0VID-19N蛋白序列同其他冠状病毒N蛋白的序列比对分析；新型冠状病毒的N蛋白与SARS同源性相对较高，与其他5种常见的冠状病毒同源性较低，说明其特异性较高，N蛋白适宜进行检测试剂盒开发；
通过B细胞表位分析软件分析N蛋白全长(1-419aa)：经抗原表位预测结果显示其全长具有丰富的抗原表位区；
2、抗原确定
运用基因工程方法对部分基因序列进行修饰和修改，避免了交叉反应，特异性优于原始序列表达蛋白；将N蛋白序列进行重组表达，序列信息如下：
基本信息：1-419aa，Mr＝45.6kDa，PI 10.07；
氨基酸信息：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
3、表达载体构建及诱导表达鉴定
3.1选取表达质粒pET28a，酶切位点：EcoR I/Xho I重组蛋白Mr＝49.4kDa，PI10.11
上游引物：5’-GCGAATTCATGAGCGATAACGGTCCGCAAA-3’
下游引物：5’-CCCTCGAGGTTACGCTTGGGTGCTATCCGCGCT-3’
3.2 DNA扩增及载体构建
以C0VID-19-N质粒为模板，用上下游引物扩增获得1268bp的目的片段SARS-COV-2-N(见图1)，经凝胶回收试剂盒进行胶回收；PCR产物与pET28a质粒同时用EcoR I、XhoⅠ双酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化相应的DNA片段；用T4DNA连接酶连接，构建原核重组表达载体pET28a/SARS-COV-2-N，转化至感受态细菌E.coli DH5ɑ，随机挑选卡那抗性的转化克隆进行菌液PCR鉴定；将PCR阳性菌液送测序，测序正确菌液扩大培养用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET28a/SARS-COV-2-N；
3.3表达鉴定
上述重组质粒转化至感受态细菌E.coli BL21，挑取单克隆，菌液到对数生长期时取出部分菌液继续培养用于保存菌种，剩余菌液中添加IPTG至终浓度1mM，37℃振荡培养诱导5h后经SDS-PAGE表达鉴定发现有蛋白表达且分子量与pET28a/SARS-COV-2-N理论大小49.4KDa保持一致(见图2)。
4、蛋白分离纯化与鉴定
4.1菌体发酵
a)种子液制备：取出菌种，接种，过夜培养；
b)发酵培养：将种子液接种至发酵培养基中，培养，加入终浓度为1mM IPTG继续培养，结束发酵；
c)将发酵液室温离心，收集菌体沉淀；
4.2蛋白纯化
a)收集的pET28a/SARS-COV-2-N发酵菌体，加入Ni-IDA破碎缓冲液，重悬后经超声波仪破碎，离心取上清，上样至预先通过Ni-IDA结合缓冲液平衡过的Ni-IDA-Bestarose6FF亲和层析柱；
b)用Ni-IDA结合缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
c)用Ni-IDA洗杂缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
d)用Ni-IDA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液；
e)将上述收集的蛋白溶液加至透析袋中，透析过夜后进行SDS-PAGE分析；
采用Elisa间接法检测原理，建立包被抗原-抗体-酶标二抗反应模式；将待检N蛋白按照包被浓度2ug/ml包被于96孔微孔板中，对照组按照饱和浓度2ug/ml进行包被，制成固相载体，向微孔中分别加入N蛋白质控NP-Q1，NP-Q2、NC和空白限质控，质控兔抗N蛋白抗体与连接于固相载体上的N蛋白结合，将未反应的组分洗净后，加入HRP标记的羊抗兔(Elisa使用浓度为1/2W)，充分反应，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。
三、胶体金三线试纸条制备
1.胶体金制备与蛋白标记
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，分别以新冠S蛋白、新冠N蛋白和生物素化的BSA进行胶体金标记，采用速度离心法纯化胶体金标记后的蛋白。按照日常经验值10:1浓缩，10％比例固相于玻璃纤维上。
2.硝酸纤维素膜的制备与试纸条的组装
分别选取鼠抗人IgM单抗、鼠抗人IgG单抗及链霉亲和素分别划线作为试纸的检测线(T2、T1)和质控线(C)，完成硝酸纤维素膜的包被，包被浓度分别按照0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL完成包被，并组装胶体金试纸条进行测试。结果显示原料的包被浓度在0.4mg/mL时，阳性样本、阴性样本检测结果均符合要求，进一步提高包被浓度，阴性样本检测结果出现假阳性，说明包被浓度0.4mg/mL试剂灵敏度和特异性较好，是适宜的包被浓度。
3.样本稀释液的制备
根据实验的要求，制备三种样本稀释液，生理盐水、15mM PBS缓冲液、20mM PBS缓冲液，分别滴加于试纸条上，平行检测10次，从膜面层析速度、条带显色、背景底色、有无假阳性等方面对稀释液进行研究。结果显示20mM PBS缓冲液结果符合要求且最优，可作为样本稀释液。
4.产品性能分析
企业参考品制备，阳性参考品：选择13例经新冠IgM/IgG抗体检测试剂盒确定的样本，剔除数量较少或者外观异常的样本，选取10例作为阳性参考品，分别编号为P1～P10。阴性参考品：从32例新型冠状病毒IgM/IgG抗体阴性的样本(其中包含A型流感病毒抗体阳性样本1例、甲乙型流感病毒抗体阳性样本1例、呼吸道合胞病毒抗体阳性样本1例、肺炎支原体抗体阳性样本1例、肺炎衣原体抗体阳性样本1例)中剔除数量较少或者外观异常样本，选取15例作为阴性参考品，编号分别为N1～N15；经试纸条检测，结果阳性参考品可以全部检出，阴性参考品检测结果全部为阴性。
5.特异性验证
地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)-IgM/IgG抗体特异性样本是用Human anti-HCoV HKU1 IgM/IgG ELISA Kit、Human anti-HCoV OC43 IgM/IgG ELISAKit、Human anti-HCoV NL63 IgM/IgG ELISA Kit和Human anti-HCoV 229E IgM/IgGELISA Kit确认四种地方性人类冠状病毒IgM/IgG抗体阳性的样本各5例。另收集20例普通人阴性血样本，进行特异性验证分析。结果显示：本试剂与地方性人类冠状病毒(HKU1)IgM/IgG抗体、地方性人类冠状病毒(OC43)IgM/IgG抗体、地方性人类冠状病毒(NL63)IgM/IgG抗体、地方性人类冠状病毒(229E)IgM/IgG抗体阳性样本不发生交叉反应。
6.血清基质干扰验证
临床检验中，样本中常见的干扰物质如甘油三酯、胆红素，易对检测结果产生干扰。经文献检索和临床机构收集，同时参考卫生行业标准WS/T 416-2013《干扰实验指南》，得出每种物质人体内潜在的最大浓度，以此浓度为基准进行研究。甘油三酯人体内最大浓度约分别为63.10mmol/L，在收集到的IgM/IgG抗体阴性、弱阳性样本中分别添加甘油三酯64.0mmol/L，36.0mmol/L、24.0mmol/L、12.0mmol/L、6.0mmol/L、3.0mmol/L、1.0mmol/L，胆红素1000μmol/L，验证是否对检测结果产生干扰。结果显示：甘油三酯浓度为6.0mmol/L或低于此浓度时，胆红素浓度为1000μmol/L或低于此浓度时，对检验结果无干扰，不影响最终结果判读，可用作样本检测。
7.巯基乙醇破坏实验
2-巯基乙醇能将-S-S-键还原成-SH，破坏了IgM/IgG结构，从而使其失去活性。选取新型冠状病毒IgM/IgG抗体阳性血清样本5例。将血阳性样本分成试验组和对照组，试验组中加入等量0.2mol/L 2-巯基乙醇，对照组中加入等量PBS，同时置37℃作用1h。结果显示，经过2-巯基乙醇处理含有IgM/IgG抗体的样本后，抗体的检测结果由阳性转为阴性。从而影响了结果的判读，因此在整个试纸条制备和检测过程中不允许有巯基乙醇的存在。
8.加速稳定性实验
将试纸条用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于37℃存放，每隔1周检测1次，检测其稳定性，共检测6次，同时设立常温放置对照组。结果显示，用铝箔袋密封的胶体金成品试纸条，在37℃保存1个半月后，仍可以达到产品的以上性能指标，而且结果与对照组无显著差异，表明试纸条的加速稳定性实验较好。
本实施例所述的间日、恶性疟疾抗体制备方法包括下列步骤：
一、恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考Genbank:AAC47453.1 HRP2氨基酸序列，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的HRP2；
2.重组质粒构建
2.1目的基因获取
(1)设计引物以基因合成pfHRP2基因片段为模板设计扩增目的基因所需引物，同时根据所选择的在载体上的插入位点在引物5'端添加酶切位点NdeI、Xho I；
引物1：pf-F：5’-GGAATTCCATATGGTTTCTTTCTCTAAAAACAA-3’(NdeI)
引物2：pf-R：5’-CCCTCGAGGTGACGCAGGCAGTGGGTAGCA-3’(Xho I)
(2)PCR反应
按表1添加反应体系，通过表2扩增程序进行扩增；
表1 PCR反应体系
PCR反应组分 50μl体系
2*Taq mix 25
上游引物 1
下游引物 1
DNA模板 1
加ddH2O至 Up to50μl
表2扩增程序
(3)重组载体构建
将PCR扩增产物回收后，通过Nde I和XhoI双酶切，之后回收酶切产物，连接到NdeI和Xho I酶切之后的载体pET24a上，经过转化DH5α、以T7/T7TER通用引物PCR鉴定重组质粒，理论值1138bp，鉴定结果如图3，与理论值相符；得到的阳性转化子提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株Rosetta，获取pfHRP2重组抗原表达菌株：R/pET24a-pfHRP2；
3.重组蛋白表达纯化
3.1诱导表达
取10μl重组质粒表达菌种接种于含100ug/ml卡那霉素(Kan)(购自索莱宝)的5mlLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜(约16h)，从中取200μl菌液加入到含有相同浓度Kan的60ml LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将全部菌液接种至含有相同浓度Kan的1L LB培养基中，28℃，150rpm震荡培养2-2.5h后，测定OD600在0.5-0.8之间，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，继续以28℃，150rpm振荡培养4.5h。发酵完成后，以6000rpm离心5min，收集菌沉淀；菌沉淀用50ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，6000rpm离心15min，收集沉淀。表达鉴定结果见图4，目的蛋白理论大小33.8kD，结果表明与理论相符。
3.2高压破碎
菌沉淀用30ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，进行低温高压破碎，参数设置：压力值910-980bar，循环3次，温度设置4℃，实际运行温度不得高于13℃；破碎结束后，将破碎产物以9000rpm，低温离心30min，收集上清；
3.3蛋白纯化
取NI离子层析柱进行亲和层析，用10倍柱体积超纯水平衡层析柱；再用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)平衡层析柱后加入蛋白样；上样结束后，用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)洗去未结合的蛋白；最后用洗脱缓冲液(20mM PBS-250mM IMpH7.4)洗脱目的蛋白；
将收集的蛋白样品装入透析袋，放入装有透析液(20mM PBS，pH7.4)的烧杯中，4℃透析过夜；纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图5，pfHRP2纯度在95％以上。
二、间日疟原虫裂殖子表面蛋白-1重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考GenBank:AAN86236.1序列，通过分析，选取其抗原优势表位，且保守性强的区域，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的MSP-1重组蛋白；
2.重组质粒构建
1.1目的基因获取
(1)设计引物以基因合成pvMSP-1基因片段为模板设计扩增目的基因所需引物，同时根据所选择的在载体上的插入位点在引物5'端添加酶切位点NdeI、Xho I；
引物1：pv-F：5’-GGAATTCcatatgAAACTGGAAGAATACAAAAA-3’(NdeI)
引物2：pv-R：5’-CCctcgagAGAGCAGAAAACACCTTCGAA-3’(Xho I)
(2)PCR反应
按表1添加反应体系，通过表2扩增程序进行扩增
表1 PCR反应体系
PCR反应组分 50μl体系
2*Taq mix 25
上游引物 1
下游引物 1
DNA模板 1
加ddH2O至 Up to50μl
表2扩增程序
(3)重组载体构建
将PCR扩增产物回收后，通过Nde I和XhoI双酶切，之后回收酶切产物，连接到NdeI和Xho I酶切之后的载体pET24a上，经过转化DH5α、以T7/T7TER通用引物PCR鉴定重组质粒，理论值650bp，鉴定结果如图6，与理论值相符；得到的阳性转化子提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株Rosetta，获取pfHRP2重组抗原表达菌株：R/pET24a-pvMSP-1；
3.重组蛋白表达纯化
3.1诱导表达
取10μl重组质粒表达菌种接种于含100ug/ml卡那霉素(Kan)(购自索莱宝)的5mlLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜(约16h)，从中取200μl菌液加入到含有相同浓度Kan的60ml LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将全部菌液接种至含有相同浓度Kan的1L LB培养基中，28℃，150rpm震荡培养2-2.5h后，测定OD600在0.5-0.8之间，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，继续以28℃，150rpm振荡培养4.5h。发酵完成后，以6000rpm离心5min，收集菌沉淀；菌沉淀用50ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，6000rpm离心15min，收集沉淀。表达鉴定结果见图7，目的蛋白理论大小16.7kD，结果表明与理论相符。
3.2高压破碎
菌沉淀用30ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，进行低温高压破碎，参数设置：压力值910-980bar，循环3次，温度设置4℃，实际运行温度不得高于13℃；破碎结束后，将破碎产物以9000rpm，低温离心30min，收集上清；
3.3蛋白纯化
取NI离子层析柱进行亲和层析，用10倍柱体积超纯水平衡层析柱；再用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)平衡层析柱后加入蛋白样；上样结束后，用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)洗去未结合的蛋白；最后用洗脱缓冲液(20mM PBS-250mM IMpH7.4)洗脱目的蛋白。
将收集的蛋白样品装入透析袋，放入装有透析液(20mM PBS，pH7.4)的烧杯中，4℃透析过夜。
纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图8，pvMSP-1纯度在95％以上。
三、富组氨酸蛋白2和裂殖子表面蛋白-1抗体的制备
1.小鼠免疫
用富组氨酸蛋白2(HRP-2)和裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)作为免疫原，选取6-8周龄雌性balb/c小鼠，分别进行皮下多点注射免疫。3次免疫后，断尾采血，收集血清，用间接ELISA方法，检测免疫血清效价，效价合格后取小鼠脾脏进行实验。
2.抗体制备
利用杂交瘤制备平台，将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按照10:1的比例混合，用PEG进行融合。融合细胞经HAT培养基筛选后，用ELISA方法进行阳性筛选，并通过有限稀释法对阳性细胞进行亚克隆，确保每个细胞系的单一性。两个蛋白各筛选得到5个细胞株。将筛选到的10株抗体进行扩大培养，按照5×105-106的密度注射到小鼠腹腔，进行腹水制备，7d左右收集腹水，离心后-20℃冻存保存。
3、抗体纯化
采用Protein-A柱的纯化方法，按照粗处理-平衡-上样-洗杂-洗脱-中和-透析的过程进行抗体纯化。收集洗脱液进行透析，置换缓冲液，透析结束后，离心取上清，-20℃冻存保存。
4、抗体验证
采用双抗体夹心法，对抗体配对效果进行验证。将10个抗体分别进行HRP标记，采用棋盘法进行双抗体夹心检测。包被相应抗体，加入pfHRP2(或pvMSP-1)蛋白，再加入HRP标记的抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，在底物显色液的作用下，通过酶标仪检测OD450。
HRP-2抗体配对结果
MSP-1配对结果
结果分析：
酶免结果显示抗体1作为包被抗体，抗体2作为标记抗体，检测恶性疟原虫HRP2蛋白的线性和灵敏度最好，检测背景值低。
抗体10作为包被抗体，抗体6作为标记抗体，检测间日疟原虫MSP-1蛋白的线性和灵敏度最好，检测背景值低。
一、胶体金检测试剂盒的研发
本试剂利用胶体金免疫层析作用原理，在硝酸纤维素膜上包被抗间日疟原虫单克隆抗体(裂殖子表面蛋白-1(MSP-1))、恶性疟原虫单克隆抗体(抗组氨酸富集蛋白Ⅱ)、和羊抗鼠IgG抗体，在金标垫上固定抗间日疟原虫配对抗体和抗恶性疟原虫配对单克隆抗体。如果样本中存在P.v.间日疟原虫裂殖子表面蛋白抗原时，将与预标记的抗间日疟原虫抗体反应形成复合物，在层析作用下，被预先固定在膜上的抗间日疟原虫抗体捕获，在检测区内形成一条紫红色P.v.(T1)条带，此时为间日疟阳性结果；如果样本中存在P.f.恶性疟原虫富组氨酸蛋白(HRP-2)抗原时，将与预标记的抗恶性疟原虫抗体反应形成复合物，在层析作用下，被预先固定在膜上的抗恶性疟原虫抗体捕获，在检测区内形成一条紫红色P.f.(T2)条带，此时为恶性疟阳性结果；如果血样中存在P.f.恶性疟原虫抗原和P.v.间日疟原虫时，将分别与预标记的抗恶性疟原虫抗体和间日疟原虫抗体发生反应形成复合物，在层析作用下，分别与被预先固定在膜上的抗恶性疟原虫抗体和间日疟原抗体捕获，在检测区内形成一条紫红色P.f.(T2)条带和一条紫红色P.v.(T1)条带，此时为恶性疟和间日疟混合型阳性结果；
如果样本中不存在P.v.间日疟原虫抗原或者P.f.恶性疟原虫抗原时，质控区(C)会形成一条紫红色C条带，在检测区内没有形成P.v.(T1)或者P.f.(T2)紫红色条带，此时为阴性结果；1.胶体金制备与蛋白标记
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，分别以间日疟原虫和恶性疟原虫标记抗体进行胶体金标记，采用速度离心法纯化胶体金标记后的蛋白。按照日常经验值10:1浓缩，10％比例固相于玻璃纤维上。
2.硝酸纤维素膜的制备与试纸条的组装
分别选取间日疟原虫和恶性疟原虫包被抗体和羊抗鼠IgG抗体划线作为试纸的检测线(T1、T2)和质控线(C)，完成硝酸纤维素膜的包被，包被浓度分别按照0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL完成梯度包被，并组装胶体金试纸条进行测试。结果显示蛋白的包被浓度在0.6mg/mL时，阳性样本、阴性样本检测结果均符合要求，进一步提高包被浓度，阴性样本检测结果出现假阳性，说明包被浓度0.6mg/mL试剂灵敏度和特异性较好，是适宜的包被浓度。
3.样本稀释液的制备
根据实验的要求，制备三种样本稀释液，生理盐水、15mM PBS缓冲液、20mM PBS缓冲液，分别滴加于试纸条上，平行检测10次，从膜面层析速度、条带显色、背景底色、有无假阳性等方面对稀释液进行研究。结果显示20mM PBS缓冲液结果符合要求且最优，可作为样本稀释液。
4.产品性能分析
企业参考品制备，阳性参考品：选择13例经间日疟原虫和恶性疟原虫检测试剂盒确定的阳性样本，剔除数量较少或者外观异常的样本，选取10例制作为阳性参考品，分别编号为P1～P10。阴性参考品：从20例阴性的样本(包含乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和人类免疫缺陷病毒阳性样本)中剔除数量较少或者外观异常样本，选取15例制作为阴性参考品，编号分别为N1～N15；经试纸条检测，结果阳性参考品可以全部检出，阴性参考品检测结果全部为阴性。
5.特异性验证
交叉反应病毒(乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和人类免疫缺陷病毒阳性样本)特异性样本是用四种检测试剂盒确认阳性的样本。另收集20例普通人阴性血样本，进行特异性验证分析。结果显示：本试剂与乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和人类免疫缺陷病毒阳性样本不存在交叉反应，与正常人血清不发生交叉反应。
6.血清基质干扰验证
临床检验中，样本中常见的干扰物质如甘油三酯、胆红素，易对检测结果产生干扰。经文献检索和临床机构收集，同时参考卫生行业标准WS/T 416-2013《干扰实验指南》，得出每种物质人体内潜在的最大浓度，以此浓度为基准进行研究。甘油三酯人体内最大浓度约分别为63.10mmol/L，在收集到的阴性、弱阳性样本中分别添加甘油三酯64.0mmol/L，36.0mmol/L、24.0mmol/L、12.0mmol/L、6.0mmol/L、3.0mmol/L、1.0mmol/L，胆红素1000μmol/L，验证是否对检测结果产生干扰。结果显示：甘油三酯浓度为6.0mmol/L或低于此浓度时，胆红素浓度为1000μmol/L或低于此浓度时，对检验结果无干扰，不影响最终结果判读，可用作样本检测。
7.加速稳定性实验
将试纸条用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于37℃存放，每隔1周检测1次，检测其稳定性，共检测6次，同时设立常温放置对照组。结果显示，用铝箔袋密封的胶体金成品试纸条，在37℃保存6周后，仍可以达到产品的以上性能指标，而且结果与对照组无显著差异，表明试纸条的加速稳定性实验较好。
结论，由重组蛋白富组氨酸蛋白2和裂殖子表面蛋白-1抗体的制备制备的间日疟原虫和恶性疟原虫测试剂盒，产品性能符合质量标准的要求(阴性参考品检测结果全为阴性，阳性参考品检测结果全为阳性)，产品特异性和干扰试验均符合产量质量要求(与乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和人类免疫缺陷病毒阳性样本不在交叉反应，试剂盒不受干甘油三酯、胆红素等血清基质的影响)，产品的加速稳定性实验符合1个月的要求。该产品的研发参数详细，制备工艺明确，制备关键点清晰，达到项目研发的目的。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种同时检测新型冠状病毒和间日、恶性疟疾的抗原检测试剂盒，其特征在于，同时含有新型冠状病毒抗体和间日、恶性疟疾抗体。
2.根据权利要求1所述的抗原检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒抗体制备方法包括下列步骤：
(一)S重组蛋白制备
选取了S蛋白S1区段319-541aa，进行了细胞表达，并对表达产物进行了纯化、抗原性检测；
1、S蛋白表位选择分析
参考Genbank ID MN908947.3，C0VID-19S蛋白具有1273aa，Mr＝141.2kDa，PI 6.24；
2、抗原位置确定
选取无信号肽，无跨膜结构域，整体亲水性，抗原表位丰富区即319-541aa；序列信息如下：选取S1区段319-541aa，223aa，Mr＝25.1kDa，PI 8.91；
3、重组载体构建
上游引物：5’-GCGGATCCCGTGTGCAACCGACCGAAAGCA-3’
下游引物：5’-CCCTCGAGGAAGTTCACGCATTTGTTCTTCA-3’
选取表达质粒pCDNA-3，酶切位点：BamH I/Xho I；
重组蛋白Mr＝26.1kDa，PI 8.9；
以C0VID-19-S质粒为模板，用上述上下游引物进行PCR扩增，扩增获得709bp的目的片段C0VID-19-S1-1，经凝胶回收试剂盒进行胶回收；PCR产物与pcDNA-3质粒同时用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化相应的DNA片段；用T4 DNA连接酶连接，构建真核表达载体pcDNA-3/C0VID-19-S1-1，转化至感受态细菌E.coliDH5ɑ，随机挑选氨苄抗性的转化克隆进行菌液PCR鉴定；将PCR阳性菌液送测序，测序正确菌液扩大培养用质粒提取试剂盒提取重组质粒pcDNA-3/C0VID-19-S1-1用于转染细胞；
4、细胞转染与筛选
4.1细胞培养
1)HEK293细胞转移到离心管，加入无血清培养基，离心；
2)用完全培养基重悬离心沉淀，转移到细胞培养瓶中，放入二氧化碳培养箱进行培养；
3)细胞长满后，去除上清，用胰酶消化细胞，消化完毕后加入完全培养基终止消化，轻拍培养瓶或用滴管轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀，转移到离心管，离心，分3个瓶进行培养；
4)细胞长满后，选择生长状态好的细胞，转移到6孔板进行培养，细胞密度生长到80％左右时，进行转染；
4.2细胞转染
1)采用用阳离子脂质体2000将质粒稳定转染到细胞内；
2)转染6小时后，更换完全培养基培养细胞；
3)转染24小时后，细胞传代，更换含600ug/ml G418的培养基进行培养；
4)3天后更换培养基，继续观察细胞生长情况；
5)待细胞开始大量死亡时(7天左右)，将G418浓度减半，继续筛选；
6)14天左右之后，明显可见有抗性的克隆团出现，转为完全培养基培养，细胞生长到一定的密度之后，进行有限稀释亚克隆，通过筛选得到稳定分泌的细胞株；
7)将稳定分泌的细胞株扩大培养，冻存保株；
8)将细胞放大培养，收集培养上清，进行蛋白纯化；
5、蛋白表达纯化与鉴定
1、收集细胞发酵上清液，经超滤浓缩后上样至预先通过Ni-IDA结合缓冲液平衡过的Ni-IDA-Bestarose 6FF亲和层析柱；
2、用Ni-IDA结合缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
3、用Ni-IDA洗杂缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
4、用Ni-IDA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液；
5、将上述收集的蛋白溶液加至透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜后进行SDS-PAGE分析；
采用Elisa间接法检测原理，将SARS-Cov-2 S(抗原)蛋白按照包被浓度2ug/ml、包被于96孔微孔板中，对照组按照饱和浓度2ug/ml进行包被，制成固相载体，向微孔中分别加入SARS-Cov-2 S质控ACE2-Q1，ACE2-Q2、NC和空白限质控，质控中的ACE2受体与连接于固相载体上的SARS-Cov-2 S蛋白结合，将未反应的组分洗净后，加入HRP标记的鼠抗人ACE2抗体，Elisa使用浓度为1/5K，充分反应，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色；
(二)N蛋白制备
1、N蛋白抗原序列同源性分析
将C0VID-19N蛋白序列同其他冠状病毒N蛋白的序列比对分析；新型冠状病毒的N蛋白与SARS同源性相对较高，与其他5种常见的冠状病毒同源性较低，说明其特异性较高，N蛋白适宜进行检测试剂盒开发；
通过B细胞表位分析软件分析N蛋白全长(1-419aa)：经抗原表位预测结果显示其全长具有丰富的抗原表位区；
2、抗原确定
运用基因工程方法对部分基因序列进行修饰和修改，避免了交叉反应，特异性优于原始序列表达蛋白；将N蛋白序列进行重组表达，序列信息如下：
基本信息：1-419aa，Mr＝45.6kDa，PI 10.07；
氨基酸信息：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
3、表达载体构建及诱导表达鉴定
3.1选取表达质粒pET28a，酶切位点：EcoR I/Xho I重组蛋白Mr＝49.4kDa，PI 10.11
上游引物：5’-GCGAATTCATGAGCGATAACGGTCCGCAAA-3’
下游引物：5’-CCCTCGAGGTTACGCTTGGGTGCTATCCGCGCT-3’
3.2DNA扩增及载体构建
以C0VID-19-N质粒为模板，用上下游引物扩增获得1268bp的目的片段SARS-COV-2-N，经凝胶回收试剂盒进行胶回收；PCR产物与pET28a质粒同时用EcoR I、Xho Ⅰ双酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化相应的DNA片段；用T4 DNA连接酶连接，构建原核重组表达载体pET28a/SARS-COV-2-N，转化至感受态细菌E.coli DH5ɑ，随机挑选卡那抗性的转化克隆进行菌液PCR鉴定；将PCR阳性菌液送测序，测序正确菌液扩大培养用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET28a/SARS-COV-2-N；
3.3表达鉴定
上述重组质粒转化至感受态细菌E.coli BL21，挑取单克隆，菌液到对数生长期时取出部分菌液继续培养用于保存菌种，剩余菌液中添加IPTG至终浓度1mM，37℃振荡培养诱导5h后经SDS-PAGE表达鉴定发现有蛋白表达且分子量与pET28a/SARS-COV-2-N理论大小49.4KDa保持一致。
4、蛋白分离纯化与鉴定
4.1菌体发酵
a)种子液制备：取出菌种，接种，过夜培养；
b)发酵培养：将种子液接种至发酵培养基中，培养，加入终浓度为1mM IPTG继续培养，结束发酵；
c)将发酵液室温离心，收集菌体沉淀；
4.2蛋白纯化
a)收集的pET28a/SARS-COV-2-N发酵菌体，加入Ni-IDA破碎缓冲液，重悬后经超声波仪破碎，离心取上清，上样至预先通过Ni-IDA结合缓冲液平衡过的Ni-IDA-Bestarose 6FF亲和层析柱；
b)用Ni-IDA结合缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
c)用Ni-IDA洗杂缓冲液洗涤，至流出液OD280值到达基线；
d)用Ni-IDA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液；
e)将上述收集的蛋白溶液加至透析袋中，透析过夜后进行SDS-PAGE分析；
采用Elisa间接法检测原理，建立包被抗原-抗体-酶标二抗反应模式；将待检N蛋白按照包被浓度2ug/ml包被于96孔微孔板中，对照组按照饱和浓度2ug/ml进行包被，制成固相载体，向微孔中分别加入N蛋白质控NP-Q1，NP-Q2、NC和空白限质控，质控兔抗N蛋白抗体与连接于固相载体上的N蛋白结合，将未反应的组分洗净后，加入HRP标记的羊抗兔(Elisa使用浓度为1/2W)，充分反应，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。
3.根据权利要求1所述的抗原检测试剂盒，其特征在于，所述间日、恶性疟疾抗体制备方法包括下列步骤：
一、恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考Genbank:AAC47453.1 HRP2氨基酸序列，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的HRP2；
2.重组质粒构建
2.1目的基因获取
(1)设计引物以基因合成pfHRP2基因片段为模板设计扩增目的基因所需引物，同时根据所选择的在载体上的插入位点在引物5'端添加酶切位点NdeI、Xho I；
引物1：pf-F：5’-GGAATTCCATATGGTTTCTTTCTCTAAAAACAA-3’(NdeI)
引物2：pf-R：5’-CCCTCGAGGTGACGCAGGCAGTGGGTAGCA-3’(Xho I)
(2)PCR反应
按表1添加反应体系，通过表2扩增程序进行扩增；
表1 PCR反应体系
PCR反应组分 50μl体系 2*Taq mix 25 上游引物 1 下游引物 1 DNA模板 1 加ddH2O至 Up to50μl
表2扩增程序
(3)重组载体构建
将PCR扩增产物回收后，通过Nde I和XhoI双酶切，之后回收酶切产物，连接到Nde I和Xho I酶切之后的载体pET24a上，经过转化DH5α、以T7/T7TER通用引物PCR鉴定重组质粒，理论值1138bp，鉴定结果如图1，与理论值相符；得到的阳性转化子提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株Rosetta，获取pfHRP2重组抗原表达菌株：R/pET24a-pfHRP2；
3.重组蛋白表达纯化
3.1诱导表达
取10μl重组质粒表达菌种接种于含100ug/ml卡那霉素(Kan)的5mlLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，从中取200μl菌液加入到含有相同浓度Kan的60ml LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将全部菌液接种至含有相同浓度Kan的1L LB培养基中，28℃，150rpm震荡培养2-2.5h后，测定OD600在0.5-0.8之间，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，继续以28℃，150rpm振荡培养4.5h；发酵完成后，以6000rpm离心5min，收集菌沉淀；菌沉淀用50ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，6000rpm离心15min，收集沉淀；
3.2高压破碎
菌沉淀用30ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，进行低温高压破碎，参数设置：压力值910-980bar，循环3次，温度设置4℃，实际运行温度不得高于13℃；破碎结束后，将破碎产物以9000rpm，低温离心30min，收集上清；
3.3蛋白纯化
取NI离子层析柱进行亲和层析，用10倍柱体积超纯水平衡层析柱；再用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)平衡层析柱后加入蛋白样；上样结束后，用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)洗去未结合的蛋白；最后用洗脱缓冲液(20mM PBS-250mM IMpH7.4)洗脱目的蛋白；
将收集的蛋白样品装入透析袋，放入装有透析液(20mM PBS，pH7.4)的烧杯中，4℃透析过夜；纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图3，pfHRP2纯度在95％以上；
二、间日疟原虫裂殖子表面蛋白-1重组蛋白制备
1.目的基因的选择
参考GenBank:AAN86236.1序列，通过分析，选取其抗原优势表位，且保守性强的区域，对其进行密码子优化，基因合成，构建至原核表达载体pET24a，转化大肠杆菌，进行重组表达、纯化获得大量纯度高、抗原性强的MSP-1重组蛋白；
2.重组质粒构建
1.1目的基因获取
(1)设计引物以基因合成pvMSP-1基因片段为模板设计扩增目的基因所需引物，同时根据所选择的在载体上的插入位点在引物5'端添加酶切位点NdeI、Xho I；
引物1：pv-F：5’-GGAATTCcatatgAAACTGGAAGAATACAAAAA-3’(NdeI)
引物2：pv-R：5’-CCctcgagAGAGCAGAAAACACCTTCGAA-3’(Xho I)
(2)PCR反应
按表1添加反应体系，通过表2扩增程序进行扩增
表1 PCR反应体系
PCR反应组分 50μl体系 2*Taq mix 25 上游引物 1 下游引物 1 DNA模板 1 加ddH2O至 Up to50μl
表2扩增程序
(3)重组载体构建
将PCR扩增产物回收后，通过Nde I和XhoI双酶切，之后回收酶切产物，连接到Nde I和Xho I酶切之后的载体pET24a上，经过转化DH5α、以T7/T7TER通用引物PCR鉴定重组质粒，理论值650bp，鉴定结果如图1，与理论值相符；得到的阳性转化子提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株Rosetta，获取pfHRP2重组抗原表达菌株：R/pET24a-pvMSP-1；
3.重组蛋白表达纯化
3.1诱导表达
取10μl重组质粒表达菌种接种于含100ug/ml卡那霉素(Kan)的5mlLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，从中取200μl菌液加入到含有相同浓度Kan的60ml LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将全部菌液接种至含有相同浓度Kan的1L LB培养基中，28℃，150rpm震荡培养2-2.5h后，测定OD600在0.5-0.8之间，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，继续以28℃，150rpm振荡培养4.5h；发酵完成后，以6000rpm离心5min，收集菌沉淀；菌沉淀用50ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，6000rpm离心15min，收集沉淀；
3.2高压破碎
菌沉淀用30ml 20mM PBS(pH 7.4)重新悬起，进行低温高压破碎，参数设置：压力值
910-980bar，循环3次，温度设置4℃，实际运行温度不得高于13℃；破碎结束后，将破碎产物以9000rpm，低温离心30min，收集上清；
3.3蛋白纯化
取NI离子层析柱进行亲和层析，用10倍柱体积超纯水平衡层析柱；再用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)平衡层析柱后加入蛋白样；上样结束后，用10倍柱体积平衡缓冲液(20mM PBS pH7.4)洗去未结合的蛋白；最后用洗脱缓冲液(20mM PBS-250mM IMpH7.4)洗脱目的蛋白；
将收集的蛋白样品装入透析袋，放入装有透析液(20mM PBS，pH7.4)的烧杯中，4℃透析过夜；纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测，pvMSP-1纯度在95％以上；
三、富组氨酸蛋白2和裂殖子表面蛋白-1抗体的制备
1.小鼠免疫
用富组氨酸蛋白2(HRP-2)和裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)作为免疫原，选取6-8周龄雌性balb/c小鼠，分别进行皮下多点注射免疫；3次免疫后，断尾采血，收集血清，用间接ELISA方法，检测免疫血清效价，效价合格后取小鼠脾脏进行实验；
2.抗体制备
利用杂交瘤制备平台，将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按照10:1的比例混合，用PEG进行融合；融合细胞经HAT培养基筛选后，用ELISA方法进行阳性筛选，并通过有限稀释法对阳性细胞进行亚克隆，确保每个细胞系的单一性；两个蛋白各筛选得到5个细胞株；将筛选到的10株抗体进行扩大培养，按照5×105-106的密度注射到小鼠腹腔，进行腹水制备，7d左右收集腹水，离心后-20℃冻存保存；
3、抗体纯化
采用Protein-A柱的纯化方法，按照粗处理-平衡-上样-洗杂-洗脱-中和-透析的过程进行抗体纯化；收集洗脱液进行透析，置换缓冲液，透析结束后，离心取上清，-20℃冻存保存；
4、抗体验证
采用双抗体夹心法，对抗体配对效果进行验证；将10个抗体分别进行HRP标记，采用棋盘法进行双抗体夹心检测；包被相应抗体，加入pfHRP2(或pvMSP-1)蛋白，再加入HRP标记的抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，在底物显色液的作用下，通过酶标仪检测OD450。
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