CN114276456B - 分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学和体外诊断试剂技术领域，涉及一种分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。所述分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株18A10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021184。该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体，具有高效价、高亲和力和高特异性，在抗体稳定性方面，有很好的性能。该抗体可用于血清中人IgG抗体的检测，可用于一些体外诊断试剂盒中。

Description

分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克 隆抗体和应用

技术领域

本发明属于生物学和体外诊断试剂技术领域，涉及一种分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。

背景技术

免疫球蛋白是血清中含量最丰富的蛋白之一，在成人血清中，IgG的含量最高，且在血清中的半衰期长，是人体免疫反应的基础物质。

抗人IgG抗体是免疫实验和体外诊断试剂盒中的常用原料之一，用人IgG免疫动物制成的抗血清，是多种抗体混合物，相对来说，这种抗体特异性比较差，效价低，批间差异大，在原料生产过程中，难以保证抗体质量的一致性。杂交瘤技术的问世，为生产高度特异性的单克隆抗体提供了一种有效的方法。

结核分枝杆菌是分枝杆菌的一种，能够通过空气和呼吸道传播，主要感染肺部。针对结核病的检测和诊断，主要有一下几个方面：一是细菌学检测，有痰涂片或是菌培养实验，该方法的检出率和敏感性都比较低，周期长；二是分子生物学诊断，该方法虽然快速且特异性好，但阴阳性结果不好区分，且诊断结果的临床意义不明确；三是免疫学方法，该方法特异性和敏感性很高，检测周期短，方法简单易操作，是目前应用比较广泛的检测方法。

相对于其他免疫方法，胶体金法的检测方法操作简单，检测周期短。通过对血清中结合抗体IgG的检测，提高了结核病诊断的灵敏度和特异性，实现结核病的早发现，早诊断，早治疗，并在结核病的治疗过程中，进行用药指导。因此，寻找能够稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获得效价高，特异性好的抗人IgG单克隆抗体，具有重要的意义，是目前需要完善和解决的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并用体内腹水法培养这株杂交瘤细胞，制备鼠抗人IgG单克隆抗体。通过此种方法制备出的鼠抗人IgG单克隆抗体可用于制备检测人血清、血浆或全血中IgG的试剂盒。

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：本发明用纯化的人IgG作为抗原进行小鼠免疫，免疫雌性Balb/c小鼠，血清筛选后选取抗体效价较好的小鼠，取其脾脏的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆和筛选得到的该细胞株，命名为18A10，该细胞株能够稳定分泌鼠抗人IgG单克隆抗体。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021184。

本发明的第二个目的是，针对现有技术中存在的不足，提供了一种由鼠抗人IgG的杂交瘤细胞分泌的鼠抗人IgG的单克隆抗体。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：选取Balb/c雌鼠，向小鼠腹腔注射液体石蜡，一周后腹腔注射鼠抗人IgG的杂交瘤细胞，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，离心，收集上清液，纯化，得到鼠抗人IgG的单克隆抗体。

本发明提供的鼠抗人IgG单克隆抗体，亚型为IgG2a，效价高，稳定性好。

本发明提供的鼠抗人IgG单克隆抗体，不与人IgM、羊IgG、兔IgG反应，且与人IgG的Fc段有特异反应，特异性好。

本发明的第三个目的是，针对现有技术中存在的不足，提供了一种鼠抗人IgG单克隆抗体在体外诊断试剂盒胶体金法的应用。

具体是一种胶体金法试剂盒，本发明所述的鼠抗人IgG单克隆抗体在该试剂盒中作为标记抗体。

所述试剂盒，用于检测样品中的IgG蛋白。

所述样品为人血清、血浆或全血。

所述试剂盒，用于结核IgG抗体的检测和诊断。

本发明的有益效果：

本发明的杂交瘤细胞株为18A10及其传代细胞株能够稳定分泌抗人IgG单克隆抗体；分泌的抗体亚型为IgG2a，亚型单一，抗体效价高；该抗体能特异性结合人IgG的Fc段，特异性好；能够用于制备体外诊断胶体金法检测试剂盒。

生物保藏说明：

培养物名称：杂交瘤细胞株18A10，于2021年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021184。

附图说明

图1是实施例1人IgG纯度检测结果；

图2是实施例1人IgG线性检测结果；

图3是实施例1小鼠免疫结果；

图4是实施例1杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的检测结果；

图5是实施例3抗体效价、亲和力的检测结果；

图6是实施例3抗体亚型的检测结果；

图7是实施例3特异性的检测结果；

图8是实施例3抗体稳定性的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1分泌抗人IgG抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、抗原纯化

取30份阴性人血清，混合均匀，按照纯化规程，使用Pro-A柱进行纯化，经过SDS-PAGE验证，纯化的人IgG纯度在95以上，检测结果如图1所示；经过间接ELISA验证，该抗原的线性很好，检测结果如图2所示。通过不同样本的混合，保证抗原来源的广泛性，确保抗原结构的完整性。

2、小鼠免疫

用人IgG免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠。蛋白按照100μg/只的剂量与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。三周后加强免疫，蛋白按照50μg/只的剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。1周后，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价，检测结果如图3所示。选取血清效价达到10万以上的免疫小鼠，准备融合。融合前3天，对小鼠进行腹腔注射免疫，不加佐剂，免疫剂量为100μg/只。

3、细胞融合

本发明在进行杂交瘤制备过程中，通过调整胎牛血清的品质和使用量，选择优质骨髓瘤细胞和小鼠免疫淋巴细胞，增强细胞融合效率。

融合时，在无菌环境下，取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，离心后收集小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照5-10:1的比例进行混合，离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无胎牛血清。在37℃水浴中，用1mLPEG进行细胞融合，在1min内边滴加PEG，边轻柔混合，静置30s，使PEG充分作用。

融合结束后，用20mL无血清DMEM终止融合，加入速度有慢到快，在8min内加完。终止结束后，将细胞放入二氧化碳培养箱中孵育20min，800rpm/min离心10min，用HAT培养基重悬融合细胞，置于96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱进行培养。

4、杂交瘤细胞筛选和亚克隆

融合后第五天用HAT培养基全换液，第七天通过间接ELISA的方法检测培养上清。具体检测方法如下：

(1)包被：用CBS缓冲液将人IgG稀释成0.5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μL/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用HAT培养基做空白对照，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。

第一次筛选结束后，重新用HAT培养基全部换液，隔天进行间接ELISA筛选，挑选两次筛选结果均为强阳性(OD₄₅₀强于阳性对照)的细胞进行亚克隆，其余阳性孔(OD₄₅₀>1)进行细胞冻存。亚克隆采用倍比稀释法，取200-500个细胞，转移到新的96孔细胞培养板的A1孔，按照纵向和横向各2倍稀释，进行亚克隆。七天后用间接ELISA的方法检测培养上清，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100％。继续重复2次亚克隆，阳性率均在100％，结束亚克隆，保证杂交瘤细胞株的稳定性。

5、杂交瘤细胞株保存

选取生长稳定的杂交瘤细胞株，进行扩大培养。细胞密度达到80％时，收集细胞，用细胞冻存液冻存细胞，保存于本公司的细胞库中。

6、杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测

将杂交瘤细胞株18A10进行传代培养，共培养30代，分别在1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30代时收集培养上清，用ELISA的方法检测人IgG质控品，分析细胞分泌抗体的稳定性。

具体检测方法如下：

(1)包被：用CBS缓冲液将鼠抗人IgG稀释成5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。检测结果如图4所示。

实施例2鼠抗人IgG单克隆抗体的制备

1、腹水制备

选取12周龄左右的Balb/c雌鼠，每只小鼠腹腔注射500μL的液体石蜡，一周后腹腔注射杂交瘤细胞，剂量为10⁶个/只。5天后，持续观察小鼠，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，12000rpm/min离心，去除杂质，置于-80℃冰箱保存。

2、腹水纯化

将腹水从冰箱取出，融化后离心，用0.22μm滤膜进行过滤。参照博格隆protein-A柱说明书进行纯化。收集纯化的抗体，用20mM PB进行透析，48h后收集抗体，0.22μm滤膜过滤后，分装，置于-80℃冰箱中保存，用于后续检测和验证。

实施例3单克隆抗体鉴定

1、抗体效价和亲和力测定

采用间接ELISA的方法，对抗体的效价和亲和力进行检测。

检测结果如图5所示：抗体效价达到200万以上，效价和亲和力均高于对照抗体。

具体检测方法如下：

(1)包被：用CBS缓冲液将鼠抗人IgG稀释成5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。

2、抗体亚型检测

使用Southern Biotech公司的SBA亚型检测试剂盒，按照说明书进行检测。

检测结果如图6所示：本发明的抗体亚型为IgG2a，轻链为κ型。

具体检测方法如下：

(1)包被：用CBS缓冲液将试剂盒中的包被抗原稀释成5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中(每个抗体做8个检测)，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体(包含IgA-HRP、IgM-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、κ-HRP、λ-HRP)500倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。

3、抗体特异性检测

按上述1的包被抗原的方法，包被不同抗原，间接ELISA方法检测抗体的特异性，

检测结果如图7所示：本发明的抗体能特异性结合人IgG的Fc段，不与人IgM以及羊和鼠的IgG发生交叉反应。

4、抗体稳定性检测

将单克隆抗体18A10和对照厂家的抗体同时置于37℃水浴中加热破坏7天和15天，按上述1的方法，间接ELISA方法检测抗体的效价，检测结果如图8所示，其中1、对照组；2、37℃破坏7天；3、37℃破坏15天。

检测结果如图8所示：自产抗体的稳定性明显优于对照抗体。

实施例4单克隆抗体的应用

以实施例2制备的鼠抗人IgG的单克隆抗体(自产)标记到金颗粒上，搭配结核抗原结合实验室现有体外诊断试剂盒制备技术，制成胶体金检测试剂盒，通过对67例阳性样本和33例阴性样本的检测进行产品的性能。以所述鼠抗人IgG的单克隆抗体为标记蛋白与外购对照K厂家鼠抗人IgG抗体标记的蛋白分别制成胶体金检测试剂盒，所述的IgG抗体蛋白制备的试剂盒性能优于K厂家鼠抗人IgG抗体。检测结果如表1所示：

表1试剂盒阴/阳性符合率检测结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.分泌鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2021184。

2.一种鼠抗人IgG单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型为IgG2a。

4.权利要求3所述的鼠抗人IgG单克隆抗体在制备体外诊断试剂盒中的应用，其特征在于，作为体外诊断试剂盒的标记抗体。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒是体外诊断检测试剂胶体金法检测试剂盒。

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