CN116041526A - 一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用，所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的CDR区包含如SEQ ID NO.3～5所示三个序列，轻链可变区的CDR区包含如SEQ ID NO.6～8所示三个序列；所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体可由保藏编号为CCTCC NO：C202288的杂交瘤细胞株IgT‑6H6G11分泌所得。本发明提供的鼠抗草鱼IgT单克隆抗体在还原条件下可以识别草鱼IgT重链，在非还原条件下，该单克隆抗体可以识别草鱼IgT的单体和多聚体形式，而且该单克隆抗体不会识别嵌合体IgMT1和IgMT2以及IgM。本发明为以草鱼抗体水平为指标的疫苗免疫效果评价方法的建立奠定了基础，有利于进一步建立快速、高效、统一的疫苗评价标准。

Description

一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一类常用的免疫酶技术，其利用抗原与抗体互相结合的特异性反应对蛋白进行定量或定性检测，主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，得到定性或定量的结果。通过ELISA检测鱼血清和黏液中的病原特异性的抗体水平，对于鱼类传染病的预防，鱼类疫苗免疫效果的精准评价，以及鱼类疫苗使用规程的制定具有重要意义。
草鱼(Ctenopharyngodon idella)具有肉质细嫩、个体大、肌间刺少等优点而备受消费者青睐，是我国养殖产量最大的鱼类品种。然而，随着高密度集约化养殖模式的发展，草鱼疾病频发，如败血症、出血病、肠炎病、烂鳃病和赤皮病等疾病，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。由于抗生素的不断使用，细菌耐药性问题日益严峻，严重影响水产养殖业的健康可持续发展，而接种疫苗可激活鱼类免疫系统，提高机体针对特定病原的抗病力，是预防草鱼病害的重要手段，也是未来鱼类疾病防控的主流方向。但对于疫苗免疫效果的精准评价往往过程繁琐，耗时较长，且缺乏评价标准。而以鱼类免疫球蛋白(Ig)的单克隆抗体为基础，通过分析被接种疫苗的鱼类的血液和黏液中的抗体(分泌到体液中的抗原特异性Ig)滴度的变化规律来评价疫苗的免疫效果，将为建立草鱼疫苗免疫效果的评价标准体系提供有力的工具。
作为在硬骨鱼类中最新被发现的一类免疫球蛋白，IgT已被证明在鱼体免疫系统中发挥着重要的免疫功能。因此对草鱼IgT单克隆抗体的研制有助于深入了解草鱼体液免疫应答规律，并能帮助建立草鱼抗体分析与检测方法，继而建立以草鱼抗体水平为基础评价疫苗免疫效果的方法并制定疫苗的使用规程，推动以疫苗接种为核心的草鱼传染病的免疫防控技术的发展。另外，值得一提的是，草鱼有3种IgT的亚型(分别命名为IgT、IgMT1和IgMT2)，制备仅识别某个IgT亚型的单克隆抗体十分困难，目前在所有鱼类中还没有报道研制出可特异性识别某个IgT亚型的单克隆抗体。
发明内容
针对现有技术中草鱼IgT单克隆抗体缺失的问题，本发明提供了一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体和分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体可特异性地识别草鱼IgT，而不与草鱼的其他免疫球蛋白(IgM、IgMT1、IgMT2)发生反应。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体为：
本发明的第一方面提供了一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区；
重链可变区的CDR区包含以下三个序列：
NYRMH(CDRH1，SEQ ID NO.3)，
VITVKSDNYRARYAESVKG(CDRH2，SEQ ID NO.4)，
EGPYYGNWVAMDY(CDRH3，SEQ ID NO.5)；
轻链可变区的CDR区包含以下三个序列：
RASQSISNYLH(CDRL1，SEQ ID NO.6)，
YASQSIS(CDRL2，SEQ ID NO.7)，
QQSHSWPYT(CDRL3，SEQ ID NO.8)。
优选地，在上述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体中，重链可变区的氨基酸序列为：
QVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQPPGKRLEWIAVITVKSDNYRARYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNRLREEDTATYFCSREGPYYGNWVAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.1)；
轻链可变区的氨基酸序列为：
DVVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTGFTLSINSVETEDFGMYFCQQSHSWPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.2)。
本发明第二方面提供了上述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的制备方法，具体为：上述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞株IgT-6H6G11(保藏编号CCTCC NO：C202288)或其传代细胞株分泌产生。
优选地，鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的制备过程为：取杂交瘤细胞株IgT-6H6G11的培养上清液和/或将杂交瘤细胞株IgT-6H6G11注射于小鼠体内后取小鼠腹水，经分离纯化后得到。
本发明第三方面提供了一株杂交瘤细胞株IgT-6H6G11，该杂交瘤细胞株IgT-6H6G11是采用大肠杆菌重组表达草鱼IgT重链恒定区CH1-CH2结构域蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，并已于2022年9月20日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为CCTCC NO：C202288。
本发明第四方面提供了编码上述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的核酸分子。
优选地，上述核酸分子包括编码鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的重链可变区的核酸分子A和编码鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的轻链可变区的核酸分子B。
更加优选地，当重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示时，核酸分子A的核苷酸序列可以为：
CAGGTGCAGCTTGTAGAGACCGGGGGAGGCTTGGTGAGGCCTGGAAATTCTCTGAAACTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAGTCTGATAATTATAGAGCAAGATATGCAGAGTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATTTCAAGAGATGATTCAAAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTATTTTTGTAGTAGAGAGGGGCCCTACTATGGTAACTGGGTGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.9)；
当轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示时，核酸分子B的核苷酸序列可以为：
GATGTTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGTCAAAGTATTAGCAACTACCTACACTGGTATCAGCAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGGTTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTCACAGCTGGCCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO.10)。
本发明第五方面提供了包含上述核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。
本发明第六方面提供了上述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体、杂交瘤细胞株IgT-6H6G11、核酸分子、表达盒、重组载体或转基因细胞系在制备草鱼IgT检测试剂中的应用。
优选地，所述检测试剂为ELISA检测试剂。
现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用大肠杆菌重组表达草鱼IgT重链恒定区CH1-CH2结构域蛋白作为抗原免疫小鼠并筛选得到了一株可特异性分泌鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株IgT-6H6G11，弥补了现有技术中草鱼IgT单克隆抗体缺失的问题。而且，杂交瘤细胞株IgT-6H6G11分泌产生的单克隆抗体可特异性地识别草鱼IgT，不与草鱼IgT另外两个亚型IgMT1和IgMT2反应，并且效价高，因此可用于特异性检测草鱼IgT，识别特异性高、反应灵敏。
附图说明
图1为本发明实施例1中SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测纯化的草鱼IgT的CH1-CH2结构域重组蛋白SUMO-IgT CH1-CH2并用考马斯亮蓝染色的结果图。
图2为本发明实施例2中通过ELISA分析鼠抗草鱼IgT单克隆抗体亚类的结果图。
图3为本发明实施例2中通过免疫印迹(Western blot)在还原条件下用鼠抗草鱼IgT单克隆抗体检测草鱼血清中天然IgT的重链结果图。
图4为本发明实施例2中通过免疫印迹分别在还原条件和非还原条件下用鼠抗草鱼IgT和IgM单克隆抗体检测草鱼血清和鳃黏液中经过凝胶过滤层析柱(GEHealthcareSuperdexTM200)分离后的天然IgT(血清中为单体，鳃黏液中为多聚体)和IgM的结果图。
图5为本发明实施例2中通过免疫印迹在还原条件下用鼠抗草鱼IgT单克隆抗体和鼠抗GST单克隆抗体检测重组表达的草鱼IgT和IgM的重链恒定区蛋白的结果图。
图6为本发明实施例2中通过免疫印迹在还原条件下用鼠抗草鱼IgT单克隆抗体和鼠抗GST单克隆抗体检测重组表达的草鱼3个IgT亚型(IgT、IgMT1和IgMT2)的重链恒定区蛋白的结果图。
图7为本发明实施例3中通过ELISA分析鼠抗草鱼IgT和IgM单克隆抗体检测草鱼血清和鳃黏液中经过凝胶过滤层析柱分离后的天然IgT和IgM的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的制备
本例采用大肠杆菌重组表达草鱼IgT重链恒定区CH1-CH2结构域蛋白，并以其为抗原免疫小鼠获得杂交瘤细胞株IgT-6H6G11，再由该杂交瘤细胞株IgT-6H6G11分泌产生鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，具体过程如下：
(1)草鱼IgT CH1-CH2基因的克隆。
根据GenBank中草鱼IgT(基因登录号：GQ201419.1)的基因序列设计特异性引物，上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入Xhol I酶切位点，所得引物序列具体如下所示(下划线处为酶切位点)：
上游引物：CGCGGATCCTCTAAATCACCACCGATTGTGTT(SEQ ID NO.11)，
下游引物：CCGCTCGAGTTATTTGAAGTTCTTCGTCACAG(SEQ ID NO.12)。
以草鱼头肾cDNA为模板，PCR扩增草鱼IgT CH1-CH2基因片段，将扩增到的片段用BamH I和Xhol I(TAKARA)进行双酶切，将酶切后的片段连接至经相同酶酶切后的pET28a-SUMO质粒上，转化DH5α感受态细胞(TransGen Biotech)，通过卡那霉素(Biosharp)抗性筛选并通过测序鉴定得到阳性质粒pET28a-SUMO-IgT CH1-CH2，再转化大肠杆菌BL21(DE3)(TransGen Biotech)，通过抗性筛选阳性表达菌株。
(2)重组草鱼IgT CH1-CH2蛋白的诱导表达及纯化。
①接种表达菌株至1L含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG(Biosharp)至终浓度为0.4mM，18℃、180rpm诱导培养12h。
②4℃、4000rpm离心15min收集菌体，然后将菌体重悬于30mL预冷的结合缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris，1mM EDTA，pH＝7.5)中，高压破碎(1200psi，破碎三次)，4℃，18000g离心20min，收集上清。
③将经过0.45μm滤膜过滤后的菌液上清与2mL NI-NTA填料(GE)(预先用结合缓冲液平衡)于4℃旋转孵育4h，使蛋白与NI-NTA填料充分结合。
④将混合物加入蛋白亲和纯化柱，弃掉流穿液。
⑤加入漂洗缓冲液1(500mM NaCl，20mM Tris，1mM EDTA，20mM Imidazole，pH＝7.5)洗涤NI-NTA至无蛋白流出。
⑥加入漂洗缓冲液2(500mM NaCl，20mM Tris，1mM EDTA，60mM Imidazole，pH＝7.5)洗涤NI-NTA至无蛋白流出。
⑦加入漂洗缓冲液3(500mM NaCl，20mM Tris，1mM EDTA，200mM Imidazole，pH＝7.5)洗涤NI-NTA至无蛋白流出。
⑧加入洗脱缓冲液4(500mM NaCl，20mM Tris，1mM EDTA，500mM Imidazole，pH＝7.5)洗涤NI-NTA至无蛋白流出。
⑨收集以上各洗脱样品进行SDS-PAGE检测蛋白纯度，检测结果如图1所示，与预测的SUMO-IgT CH1-CH2大小一致，纯度为90.2％。
⑩纯化的重组蛋白SUMO-IgT CH1-CH2装入孔径为3kDa的透析袋并放入PBS中透析，透析过程在4℃中搅拌进行；24h后，收集透析袋中液体，4℃，18000g离心20min，收集上清，用BCA试剂盒(Biosharp)测定蛋白浓度。
(3)小鼠免疫。
取6～8周龄BALB/c小鼠5只，用步骤(2)中制备的重组草鱼IgT蛋白SUMO-IgT CH1-CH2作为免疫原免疫小鼠。其中，免疫途径及程序为：重组草鱼IgT蛋白SUMO-IgT CH1-CH2约50μg与等体积弗氏完全佐剂充分混合乳化，于小鼠背部皮下多点注射。两周后加强免疫三次，每次间隔两周，加强免疫时重组SUMO-IgT CH1-CH2蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，背部皮下多点注射。第三次加强免疫后第7d取尾血进行ELISA检测抗体效价。
(4)细胞融合与培养。
①细胞融合：将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5:1的细胞比例混合，1000rpm离心10min，弃上清。吸取1mL PEG-4000(Sigma)，缓慢加入试管中，边加边晃动；随后缓慢多次加入共9mL完全培养基。整个过程须在37℃水浴中进行，随后1000rpm离心10min，去除上清，完成细胞融合。
②细胞培养：将离心后的细胞团块轻轻弹散，用HAT培养基重悬，铺于准备好的饲养细胞的96孔板中，每孔200μL。置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。一周后，于显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。待细胞生长至占培养孔底约1/3面积时，吸取培养液上清进行ELISA检测。
(5)阳性克隆的筛选与亚克隆。
①阳性克隆的筛选：以抗原蛋白SUMO-IgT CH1-CH2包被ELISA板，4℃孵育过夜，次日洗涤、封闭后每孔加入100μL待检测杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h；弃置上清后每孔加入100μL以1:2000稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG(Biolegend)，37℃孵育1h；弃置上清，每孔加入100μL TMB显色液(碧云天)，室温显色10～30min后，每孔加入50μL终止液终止反应。用酶标仪450nm检测吸光值，吸光值大于阴性对照2倍以上为阳性；再以同样的方法以SUMO标签蛋白进行反筛，保留特异性阳性克隆株进行亚克隆。
②杂交瘤细胞的亚克隆：将ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞从培养板中轻轻洗脱计数，用培养液连续稀释细胞悬液按每孔100μL接种于96孔板中。培养10d左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。对有抗体活性的阳性克隆再进行亚克隆，共进行3次。反复筛选后最终获得一株稳定表达抗草鱼IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为杂交瘤细胞株IgT-6H6G11，已于2022年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C202288。
③单克隆抗体的大量生产。
给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1周后给每只预处理小鼠腹腔注射5×107个杂交瘤细胞，10～14d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽1次，抽取的腹水于10000r/min离心10min，取上清进行亲和层析纯化，即得所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，效价为1:64000。
实施例2鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的鉴定
(1)抗体亚类的检测，过程如下：
将纯化的SUMO-IgT CH1-CH2蛋白包被至ELISA板中，4℃孵育过夜；用洗涤液洗涤3次，随后每孔加入100μL鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，37℃孵育2h；洗涤3次后分别加入稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgA和IgM单克隆抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤3次后，每孔加入100μL TMB显色液(碧云天)，37℃避光孵育30min；随后每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应。用酶标仪在450nm波长下检测吸光值，以阳性反应孔所用的HRP标记的羊抗鼠Ig亚类为待测抗体类别。
鉴定结果如图2所示，表明本发明制备的鼠抗草鱼IgT单克隆抗体亚类为IgG2a。
(2)Western blot检测，过程如下：
①制备样品：制备健康草鱼的血清，用PBS稀释20倍后，分别加入1/4体积的5×还原型和非还原型SDS-PAGE上样缓冲液(Solarbio)，涡旋混匀，100℃金属浴加热10min，置于冰上备用或-80℃冻存；分别构建草鱼免疫球蛋白IgM、IgT、IgMT1、IgMT2的重链恒定区基因原核表达质粒：pGEX-6P-1-IgM CH、pGEX-6P-1-IgT CH、pGEX-6P-1-IgMT1 CH、pGEX-6P-1-IgMT2 CH，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑阳性单菌落并扩大培养至菌液OD600值为0.6～0.8时加入IPTG诱导表达目的蛋白，随后分别取菌液并加入1/4体积的5×还原型SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋混匀，100℃金属浴加热10min，置于冰上备用或-80℃冻存。
②SDS-PAGE：分别配制12％和8％ Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺下层分离胶和5％上层浓缩胶，上样进行电泳，电泳条件为80V，0.5h；120V，1h。
③转膜：将SDS-PAGE胶从胶板中卸下，浸泡在事先配制好的转膜缓冲液(25mMTris，192mMGlycine，15％甲醇)中，取0.22μm的PVDF膜，裁剪至合适大小，于甲醇中浸泡30s激活，再转入转膜缓冲液。按照滤纸-PVDF膜-胶-滤纸的顺序从下往上叠加，保证每层都不能有气泡，300mA半干转膜60min，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上。
④封闭：转膜完成后，将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉(Biosharp)的TBST(25mMTris，150mM NaCl，0.1％ Tween-20)溶液中，室温孵育2h。
⑤一抗孵育：弃去封闭液，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液将鼠抗草鱼IgT单克隆抗体稀释到2μg/mL，4℃孵育过夜。
⑥二抗孵育：去除一抗溶液，TBST洗膜3次，每次约10min，取HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体按1:5000的比例用含5％脱脂奶粉的TBST溶液稀释，室温孵育1h。
⑦ECL显色：去除二抗溶液，TBST洗膜3次，每次约10min，按1:1配制适量的ECL显色液(Biosharp)，将显色液滴加到膜上，充分接触后使用化学发光成像仪分析并拍照。
鼠抗草鱼IgT单克隆抗体对草鱼IgT的识别及特异性验证情况如图3-图6所示。在还原条件下，该单克隆抗体识别的是草鱼IgT的重链，大小约为75kD(图3)。在非还原条件下，该单克隆抗体可以识别草鱼IgT的单体(血清中)和多聚体形式(鳃黏液中)。而且无论是天然的IgM和IgT还是重组的IgM和IgT，鼠抗草鱼IgT单克隆抗体均只识别IgT，而不识别IgM(图4、图5)；除此之外，对于草鱼IgT的另外两个亚型IgMT1和IgMT2，IgT单克隆抗体也不会交叉识别，特异性好(图6)。
实施例3ELISA检测草鱼血清和鳃黏液中的IgT
取健康草鱼血清和鳃黏液分别过分子筛，分别取洗脱位置为8-15mL的样品用于ELISA检测，检测步骤如下：
(1)用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)分别稀释洗脱位置为8-15mL的样品，酶标板每孔包被100μL稀释后的样品，4℃孵育过夜。
(2)用PBST(10mM PBS，0.05％ Tween-20)洗涤5次后，每孔加入250μL含5％脱脂奶粉的PBST溶液，37℃孵育2h。
(4)用PBST洗涤5次后，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液将鼠抗草鱼IgT和IgM单克隆抗体稀释到2μg/mL作为一抗，每孔加入100μL，37℃孵育1h。
(5)用PBST洗涤5次后，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液按1:2000的比例稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体作为二抗，每孔加入100μL，37℃孵育1h。
(6)用PBST洗涤5次后，每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色30min。
(7)每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应10min，混匀后用酶标仪在450nm波长下检测吸光值。
检测结果如图7所示，表明鼠抗草鱼IgT单克隆抗体可用于ELISA实验特异性检测草鱼天然IgT，而不识别草鱼天然IgM，特异性好。
实施例4单克隆抗体重链可变区和轻链可变区核酸序列的测定
取对数生长期的IgT-6H6G11杂交瘤细胞，采用Trizol(TAKARA)法抽提总RNA，用oligo(dT)20(Invitrogen)为引物，逆转录生成cDNA；然后以cDNA为模板，利用特异性PCR引物(见表1～表4，其中d表示引物的变异程度，即混合碱基编码的特异性序列的数目)分别扩增其重链可变区和轻链可变区基因；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并回收纯化后，通过TA克隆连入pMD-18T载体，随后进行测序和序列分析，确定了本发明提供的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的序列，具体如SEQ ID NO.1～10所示。
表1扩增轻链可变区基因正向引物
Figure BDA0003942757430000091
表2扩增轻链可变区基因反向引物
Figure BDA0003942757430000092
表3扩增重链可变区基因正向引物
Figure BDA0003942757430000093
Figure BDA0003942757430000101
表4扩增重链可变区基因反向引物
Figure BDA0003942757430000102
综上所述，本发明通过杂交瘤细胞技术成功制备了鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性识别草鱼IgT，而不会识别嵌合体IgMT1和IgMT2以及IgM，可以使用该单克隆抗体检测草鱼血清和黏液中的天然IgT，对于鱼类传染病的预防有重要意义。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，其特征在于，所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的CDR区中包含三个序列，且分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5所示；
所述轻链可变区的CDR区中包含三个序列，且分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种制备权利要求1所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的方法，其特征在于，所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体由杂交瘤细胞株IgT-6H6G11或其传代细胞株分泌产生，所述杂交瘤细胞株IgT-6H6G11于2022年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为CCTCC NO：C202288。
4.根据权利要求3所述制备鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的方法，其特征在于，取杂交瘤细胞株IgT-6H6G11的培养上清液和/或将所述的杂交瘤细胞株IgT-6H6G11注射于小鼠体内后取小鼠腹水，经分离纯化后得到所述鼠抗草鱼IgT单克隆抗体。
5.一株杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株名为IgT-6H6G11，并于2022年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为CCTCC NO：C202288。
6.一种核酸分子，其特征在于，具体为编码权利要求1～4中任一项所述的鼠抗草鱼IgT单克隆抗体的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
8.含有权利要求6所述核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。
9.权利要求1～4任一项所述的鼠抗草鱼IgT单克隆抗体，或权利要求6所述的杂交瘤细胞株，或权利要求6～7任一项所述的核酸分子，或权利要求8所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系在制备草鱼IgT检测试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为ELISA检测试剂。
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