TWI438010B - 卡奇黴素(calicheamicin)衍生物-載體共軛物 - Google Patents
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Description
本發明係關於產製具有高藥物裝載和實質上降低之低共軛部分(LCF)之單體胞毒藥物/載體共軛物(“共軛物”)的方法。特定而言,本發明係關於抗-CD22抗體-單體卡奇黴素共聚物。本發明亦關於本發明之共軛物,純化該共軛物的方法,包括該共軛物的醫藥組合物以及該共軛物之用途。
為了系統性藥理治療而發展的藥物共軛物,是標靶-專一的胞毒製劑。該概念涉及將治療劑與對已限定之標靶細胞族群具有專一性的載體分子偶聯。對抗原具有高親和力的抗體,是作為標靶部分的天然選擇。利用高親和力單株抗體的利用性,抗體-瞄準療法的展望,已經成為有希望的。已經與單株抗體共軛的毒性物質,包括毒素、低-分子量的胞毒藥物、生物學反應修飾因子以及放射性核素。通常將抗體-毒素共軛物稱為免疫毒素,但是,將由抗體和低-分子量之藥物,像是胺甲碟呤和亞德里亞黴素所組成的免疫共軛物,稱為化學免疫共軛物。免疫調節劑則含有已知其具有調節功能的生物反應修飾因子,像是淋巴細胞活素、生長因子以及補體-激活之眼鏡蛇毒液因子(CVF)。放射性免疫共軛物由放射性同位素所組成,其可用來作為治療劑,藉著它們的輻射殺死細胞,或用來顯影。預期抗體-調節之將胞毒藥物專一地遞送至腫瘤細胞,不僅增加其抗-腫瘤的效力,亦防止被正常組織未經瞄準的攝入,因此增加了其治療指標。
本發明係關於免疫共軛物,包括與胞毒藥物共軛的抗體,該抗體係作為瞄準媒介,並對在惡性腫瘤細胞之表面上的抗原性決定位具有專一性。本發明係關於胞毒藥物-抗體共軛物,其中該抗體對在B-惡性腫瘤、淋巴增生性疾病和慢性炎症性疾病上之抗原性決定位,具有專一性。本發明亦關於產製免疫共軛物的方法以及其治療用途(們)。
為了治療各種疾病,包括癌症和風濕性關節炎,已經批准許多以抗體為基礎的治療劑,可供臨床使用或對各種惡性腫瘤,包括B-細胞惡性腫瘤,像是非-霍奇金氏淋巴瘤,進行臨床試驗。一種以抗體為基礎的這類治療劑,是利妥昔單抗(rituximab)(美羅華(Rituxan)TM
),一種未經標示之嵌合型人類γ1(+mγ1V-區域)抗體,其對在B-細胞上表現之細胞表面抗原CD20是專一的。這些以抗體為基礎之治療劑依賴補體-調節的胞毒性(CDCC),或抗體-依賴性的細胞胞毒性(ADCC),來對抗B細胞,或依賴放射性核素的使用,像是131
I或90
Y,對於臨床醫師和患者而言,其與製備和使用的問題有關。結果,對於免疫共軛物的產製有需求,其可克服目前以抗體為基礎之治療劑的缺點,治療各種惡性腫瘤,包括造血的惡性腫瘤,像是非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL),可容易且有效地產製,並可重複地使用它,而不引起免疫反應。
為了應用在骨髓瘤的治療上,發展出包括有潛力之抗細菌和抗腫瘤劑家族之成員的免疫共軛物,集體地稱為卡奇黴素或LL-E33288複合物(參見美國專利第4,970,198號(1990))。將最有潛力的卡奇黴素命名為γ1
,在本文中將其簡稱為γ。這些化合物含有甲基三硫化物,其可與適當的硫醇反應,形成二硫化物,在相同的時間,導入諸如醯肼之類的官能基或其他官能基,其可用來使卡奇黴素附接載劑。(參見美國專利第5,053,394號)。在為了各式各樣癌症而正在發展的療法中,使用單體卡奇黴素衍生物/載體共軛物,已經受到專一性瞄準劑(載體)和共軛作用方法學兩者的限制,結果在增加與載劑共軛之卡奇黴素衍生物的用量(即藥物裝載)時,形成蛋白質聚集體。因為較高的藥物裝載,增加了共軛物固有的效力,所以想要在載體上,裝載與保留載體蛋白質之親和力一致那樣多的藥物。聚集之蛋白質的存在,其可能是具有非專一之毒性的且為免疫原性的,並因此必須為了治療應用而將其移除,使得遞增進行這些共軛物的產製變得更為困難,並降低產物的產量。在載體蛋白質上裝載的卡奇黴素量(藥物裝載),在共軛反應中形成之聚集體的量,以及可獲得的最終經過純化之單體共軛物的產量,均是相關的。因此,必需藉著調節加至共軛反應中之反應性卡奇黴素衍生物的量,在較高的藥物裝載和最終單體的產量之間達成妥協。
胞毒藥物共軛物,尤其是卡奇黴素共軛物至聚集體的趨勢,當與在美國專利第5,877,296號和美國專利第5,773,001號中描述之交聯劑進行共軛反應時,是特別有問題的,將其全部以引用的方式併入本文中。在該情況下,所產生的大部分共軛物為聚集的形式,且為了治療用途藉著這些原始的方法(CMA法)進行共軛物的純化,是相當困難的。對某些載體蛋白質而言,除非是以小規模,否則即使是製造適度裝載的共軛物,也幾乎是不可能的。結果,迫切地需要共軛胞毒藥物,像是卡奇黴素與載體的改良方法,其將聚集的量減至最少,並藉此容許儘可能高的藥物裝載,以及產物的合理產量。
先前,揭示了製備具有較高藥物裝載/產量和降低聚集作用之單體卡奇黴素衍生物/載體的共軛方法(參見美國專利第5,712,374號和美國專利第5,714,586號,全部以引用的方式併入本文中)。雖然這些方法導致具有實質上降低聚集體內含量之共軛物製品的結果,但其稍後揭示其產生的共軛物,含有不想要的高量(45-65% HPLC面積%)低共軛部分(LCF),主要由未共軛之抗體組成的部分。在產物中出現LCF,是抗體的無效率使用,因為其並未含有胞毒藥物。它亦可能與卡奇黴素-載體共軛物競爭標靶,並可能降低後者的可瞄準性,結果降低了胞毒藥物的效力。因此,想要經過改良的共軛方法,其結果將明顯地降低LCF之含量,並具有可接受含量的聚集作用,而不會明顯地改變共軛物的物理特性。
本發明係關於產製單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物(“共軛物”),並具有較高裝載和實質上降低之低共軛部分(LCF)的方法。特定而言,本發明係關於單體卡奇黴素衍生物-載體共軛物的產製、該共軛物、組合物、純化該共軛物的方法以及該共軛物的用途。更特定而言,本發明係關於產製單體卡奇黴素衍生物-抗-CD22抗體共軛物(CMC-544)的方法。
在一個具體實施例中,本發明揭示產製結果為明顯較低含量之LCF(低於10%),並對物理或化學特性沒有任何明顯改變之共軛物的經過改良之共軛方法。本發明亦揭示對共軛方法的進一步改良,其結果不僅明顯地降低了LCF之含量,亦比先前揭示的方法,明顯降低了聚集作用,且產生實質上增加的藥物裝載。本發明之共軛物具有下式:
Pr(-X-W)m
其中:Pr為蛋白質之載體,X為交聯劑,其包括任何可與蛋白質載體反應之反應基團的產物,W為胞毒藥物;m為經過純化之共軛產物的平均裝載,使得胞毒藥物按重量計構成共軛物的7-9%;且(-X-W)m
為胞毒藥物衍生物。
在一個具體實施例中,藉著包括下列步驟之本發明方法,來產製本發明之共軛物:(1)將胞毒藥物衍生物加至蛋白質載體中,其中該胞毒藥物衍生物按蛋白質載體之重量計,為4.5-11%;(2)在非-親核的、蛋白質-可相容的、具有範圍從大約7至9之pH值的緩衝溶液中,培養該胞毒藥物衍生物和蛋白質載體,產生單體胞毒藥物/載體共軛物,其中該溶液進一步包括(a)有機的共溶劑和(b)添加劑,包括至少一個C6
-C18
羧酸或其鹽,且其中係在從約30℃到大約35℃的溫度範圍下,進行該培養,持續大約15分鐘到24小時的期間並(3)使在步驟(2)中產生的共軛物接受層析分離方法,分離單體胞毒藥物衍生物/蛋白質載體共軛物,按胞毒藥物之重量計,裝載範圍為4-10%,並具有低於10%的低共軛部分,係來自未共軛蛋白質載體、胞毒藥物衍生物和聚集的共軛物。
在本發明的一項觀點中,共軛物之蛋白質載體係選自由荷爾蒙、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模仿物及其以遺傳方式或以酵素方式設計的配對物所組成之群。
在一個具體實施例中,該蛋白質載體為抗體。在較佳的具體實施例中,該抗體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2
片段所組成之群。
在另一個具體實施例中,該人類化抗體係針對細胞表面抗原CD22。
在一個較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,並包括輕鏈可變區5/44-gL1(序列識別19號)和重鏈可變區5/44-gH7(序列識別27號)。
在另一個較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈。
在另一個較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在另一個較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈和在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在另一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,其為藉著親和力成熟草案獲得的變種抗體,並對人類CD22具有增加的專一性。
在另一項觀點中,用來產製本發明之單體胞毒藥物/載體共軛物的胞毒藥物,是微管蛋白聚合作用之抑制劑、與DNA結合並使其中斷的烷基化製劑、蛋白質合成之抑制劑或酪胺酸激酶之抑制劑。
在一個具體實施例中,該胞毒藥物係選自卡奇黴素、噻替哌(thiotepa)、紫杉烷(taxanes)、長春新鹼、道諾紅菌素、阿黴素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾思普黴素(esperamicins)、放線菌素、奧索拉黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserines)、博菜黴素、他莫昔芬(tamoxifen)、伊達比星(idarubicin)、多拉斯塔汀(dolastatins)/奧雷斯塔汀(auristatins)、半阿斯特林(hemiasterlins)和類美登素(maytansinoids)。
在較佳的具體實施例中,該胞毒藥物是卡奇黴素。在特佳的具體實施例中,該卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ卡奇黴素衍生物。
在另一項觀點中,該胞毒藥物具有3-巰基-3-甲基丁醯肼之官能基,並經由能夠在與標靶細胞結合並進入其中之後,從該共軛物中釋放出胞毒藥物的可水解之交聯劑與蛋白質載體共軛。
在該項觀點之較佳的具體實施例中,可水解之交聯劑為4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。
在本發明的另一項觀點中,在共軛方法的期間,使用辛酸或其鹽,或癸酸或其鹽,作為添加劑,以便降低聚集作用並增加藥物裝載。
在本發明的另一項觀點中,藉著層析分離方法純化本發明之共軛物。
在一個具體實施例中,用來分離單體藥物衍生物-載體共軛物之層析分離方法定尺寸排阻層析法(SEC)。
在另一個具體實施例中,用來分離單體藥物衍生物-載體共軛物之層析分離方法是HPLC、FPLC或Sephacryl S-200層析法。
在較佳的具體實施例中,用來分離單體藥物衍生物-載體共軛物之層析分離方法是厭水性交互作用層析法(HIC)。在特佳的具體實施例中,使用苯基瓊脂糖6速流層析介質、丁基瓊脂糖4速流層析介質、辛基瓊脂糖4速流層析介質、Toyopearl醚-650M層析介質、Macro-Prep甲基HIC介質或Macro-Prep第三-丁基HIC介質,來進行HIC。在更特佳的具體實施例中,使用丁基瓊脂糖4速流層析介質來進行HIC。
在另一項觀點中,本發明針對藉著本發明之方法產製的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物。在該項觀點的較佳具體實施例中,所使用的胞毒藥物為卡奇黴素,且所使用之載體為抗體。
在另一個較佳的具體實施例中,該抗體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2
片段所組成之群。在更特佳的觀點中,使用針對細胞表面抗原CD22的人類化抗體。
在一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,並包括輕鏈可變區5/44-gL1(序列識別19號)和重鏈可變區5/44-gH7(序列識別27號)。
在另一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈。
在較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在另一個較佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈和在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在另一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,其為藉著親和力成熟草案獲得的變種抗體,並對人類CD22具有增加的專一性。
在較佳的具體實施例中,該卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ卡奇黴素衍生物。
在一個具體實施例中,該卡奇黴素衍生物具有3-巰基-3-甲基丁醯肼之官能基。
在另一個具體實施例中,用來共軛藥物與載體之交聯劑是能夠在與標靶細胞結合並進入其中之後,從該共軛物中釋放出胞毒藥物的可水解之交聯劑。在較佳的具體實施例中,該可水解之交聯劑為4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。
本發明之其他觀點係針對具有式Pr(-X-S-S-W)m
的單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物,其中:Pr為抗-CD22抗體;X為可水解之交聯劑,其包括任何可與該抗體反應之反應基團的產物;W為卡奇黴素基團;m為經過純化之共軛產物的平均裝載,使得卡奇黴素按重量計構成共軛物的4-10%;且(-X-S-S-W)m
為藉著本發明之方法產製的卡奇黴素衍生物。
在該項觀點的一個具體實施例中,該抗體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2
片段所組成之群。
在較佳的具體實施例中,該抗體為抗-CD22抗體,其對人類CD22具有專一性,並包括重鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個在圖1中以H1(序列識別1號)為CDR-H1提供的序列,在圖1中以H2(序列識別2號)或H2’(序列識別13號)或H2”(序列識別15號)或H2’’’(序列識別16號)為CDR-H2提供的序列或在圖1中以H3(序列識別3號)為CDR-H3提供的序列,並包括輕鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個在圖1中以L1(序列識別4號)為CDR-L1提供的序列,在圖1中以L2(序列識別5號)為CDR-L2提供的序列,或在圖1中以L3(序列識別6號)為CDR-L3提供的序列。
在另一個較佳的具體實施例中,該抗-CD22抗體包括重鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個以序列識別1號為CDR-H1提供之序列、以序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號為CDR-H2提供之序列或以序列識別3號為CDR-H3提供之序列,以及輕鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個以序列識別4號為CDR-L1提供之序列、以序列識別5號為CDR-L2提供之序列或以序列識別6號為CDR-L3提供之序列。
在另一個較佳的具體實施例中,該抗-CD22抗體包括序列識別1號之CDR-H1、序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。
在另一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗-CD22抗體,並包括可變功能部位,包括人類接受者架構區和非-人類捐贈者CDRs。
在另一個具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體具有人類接受者架構,其中該抗體之重鏈可變功能部位的區域是以人類亞-組I一致序列為基礎,並在位置1、28、48、71和93處,包括非-人類的供體殘基。在另一個具體實施例中,該人類化抗體進一步在位置67和69處,包括非-人類的供體殘基。
在一個較佳的具體實施例中,該CDR-移植的人類化抗體,包括輕鏈的可變功能部位,其包括以人類亞-組I一致序列為基礎的人類接受者架構區,並在位置2、4、37、38、45和60處,進一步包括非-人類的供體殘基。在另一個具體實施例中,該CDR-移植的抗體在位置3處,進一步包括非-人類的供體殘基。
在另一個具體實施例中,該CDR-移植的抗體包括輕鏈可變區5/44-gL1(序列識別19號)和重鏈可變區5/44-gH7(序列識別27號)。
在另一個具體實施例中,該CDR-移植的抗體包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈,以及具有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在另一個具體實施例中,該CDR-移植的抗體包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈,以及具有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在一個具體實施例中,該抗-CD22 CDR-移植的抗體是藉著親和力成熟草案獲得的變種抗體,並對人類CD22具有增加的專一性。
在另一個具體實施例中,該抗-CD22抗體是嵌合型抗體,其包括分別在序列識別7號和序列識別8號中陳述之單株抗體的輕和重鏈可變功能部位之序列。
在另一個具體實施例中,該抗-CD22抗體包括雜種的CDR,具有截短的捐贈者CDR序列,其中藉著不同的序列置換捐贈者CDR的漏失部分,並形成有功能的CDR。
在特佳的具體實施例中,該胞毒藥物衍生物是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ卡奇黴素衍生物。
在另一項觀點中,本發明係針對製備單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物的穩定之冷凍乾燥組合物的方法。在較佳的具體實施例中,藉著(a)使單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物溶解於下列溶液中:包括按重量計濃度為1.5%-5%之低溫保護劑、按重量計濃度為0.5-1.5%之聚合填充劑、濃度為0.01 M至0.1 M之電解質、按重量計濃度為0.005-0.05%之溶解促進劑、使得該溶液之終pH值為7.8-8.2、濃度為5-50 mM之緩衝劑和水,至0.5至2毫克/毫升之終濃度;(b)在+5℃至+10℃的溫度下,將上述的溶液分配至小瓶內;(c)在-35℃至-50℃的冷凍溫度下,將該溶液冷凍;(d)使已經冷凍的溶液,在-10℃至-40℃的存放溫度下,在20至80微米的最初乾燥壓力下,接受最初的冷凍乾燥步驟24至78小時;並(e)使步驟(d)之已經冷凍乾燥的產物,在+10℃至+35℃的存放溫度下,在20至80微米的乾燥壓力下接受二級乾燥步驟15至30小時,來製備單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物的穩定之冷凍乾燥組合物。
在一個具體實施例中,在胞毒藥物/載體共軛物之冷凍乾燥作用中所使用的低溫保護劑,係選自醛醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛酸(aldaric acid)、醛糖類、酮糖類、胺基糖類、醛醇類、肌醇類、甘油醛類、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內酯、山梨糖、葡糖二酸、赤癬糖、蘇糖、阿拉伯糖、異構糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤癬酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神經胺糖酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜膠、半乳卡洛羅糖(galactocarolose)、果膠、果膠酸、直鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原、澱粉果膠、纖維素、葡聚糖、石臍素、幾丁質、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、藻酸、黃酸樹膠、澱粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油和季戊四醇。
在較佳的具體實施例中,該低溫保護劑是蔗糖,其以按重量計1.5%的濃度存在。
在一個具體實施例中,在冷凍乾燥之期間中所使用的聚合填充劑,係選自葡聚糖40或羥乙基澱粉40,且濃度為按重量計0.9%。
在另一個具體實施例中,在冷凍乾燥溶液中所使用的電解質是氯化鈉,其以0.05 M之濃度存在。
在較佳的具體實施例中,在冷凍乾燥之期間中所使用的溶解-促進劑。該溶解促進劑最好界面活性劑。在特佳的具體實施例中,該界面活性劑是多乙氧基醚80,其以按重量計0.01%的濃度存在。
在一個具體實施例中,所使用之緩衝劑為三甲醇氨基甲烷,其以0.02 M之濃度存在。該溶液之pH值,在冷凍乾燥過程開始時,最好是8.0。在該過程開始之前,先在+5℃之溫度下,將含有胞毒藥物/載體共軛物之溶液分配到小瓶中。
在較佳的具體實施例中,在-45℃的溫度下冷凍在小瓶中的溶液;使已經冷凍的溶液,在60微米的最初乾燥壓力和-30℃的存放溫度下,接受最初的冷凍乾燥步驟60小時;並使已經冷凍-乾燥的產物,在60微米的乾燥壓力和+25℃的存放溫度下,接受二級乾燥步驟24小時。
本發明的其他觀點,係針對包括在治療上有效之劑量、藉著本發明之方法製備的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物之組合物。
在一個具體實施例中,在單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物中的載體是蛋白質載體,選自荷爾蒙、生長因子、抗體和抗體類似物。
在較佳的具體實施例中,該蛋白質載體是人類單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體或人類化抗體。
在較佳的具體實施例中,該人類化抗體係針對細胞表面抗原CD22。
在本發明該項觀點的特佳具體實施例中,該抗-CD22抗體對人類CD22具有專一性,並包括重鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個在圖1中以H1(序列識別1號)為CDR-H1提供的序列,在圖1中以H2(序列識別2號)或H2’(序列識別13號)或H2”(序列識別15號)或H2’’’(序列識別16號)為CDR-H2提供的序列或在圖1中以H3(序列識別3號)為CDR-H3提供的序列,並包括輕鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個在圖1中以L1(序列識別4號)為CDR-L1提供的序列,在圖1中以L2(序列識別5號)為CDR-L2提供的序列或在圖1中以L3(序列識別6號)為CDR-L3提供的序列。
在另一個較佳的具體實施例中,該抗-CD22抗體具有重鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個以序列識別1號為CDR-H1提供之序列、以序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號為CDR-H2提供之序列或以序列識別3號為CDR-H3提供之序列,以及輕鏈,其中可變功能部位包括CDR,具有至少一個以序列識別4號為CDR-L1提供之序列、以序列識別5號為CDR-L2提供之序列或以序列識別6號為CDR-L3提供之序列。
在另一個較佳的具體實施例中,該抗-CD22抗體包括序列識別1號之CDR-H1、序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。
在特佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的人類化抗-CD22抗體,並包括輕鏈可變區5/44-gL1(序列識別19號)和重鏈可變區5/44-gH7(序列識別27號)。
在另一個特佳的具體實施例中,該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體,對人類CD22具有專一性,並包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈,以及具有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。
在一個具體實施例中,該CDR-移植的抗體是變種抗體,其對人類CD22具有增加的專一性,並藉著親和力成熟草案獲得該抗體。
在一個具體實施例中,該單體胞毒藥物是卡奇黴素,且最好是選自γ卡奇黴素或N-乙醯基卡奇黴素。
在一個具體實施例中,該組合物可視需要含有額外的生物活性劑。這類生物活性劑可以是胞毒藥物、生長因子或荷爾蒙。
本發明的另一項觀點,係針對藉著對個體投予在治療上有效之劑量的本發明組合物,治療患有增生性疾病之個體的方法。可以皮下、腹腔內、靜脈內、動脈內、髓內、鞘內、經皮、經皮下、鼻內、局部、經腸、陰道內、舌下或經直腸之方式,投予該組合物。在較佳的具體實施例中,以靜脈內之方式投予本發明之組合物。
在一個具體實施例中,將組合物投予罹患增生性疾病,像是癌症的人類個體。在較佳的具體實施例中,該癌症為B-細胞惡性腫瘤。B-細胞惡性腫瘤可以是表現細胞表面抗原CD22的白血病或淋巴瘤。
在另一個具體實施例中,該癌症為癌或肉瘤。
本發明的另一項觀點,係針對藉著對患有這類惡性腫瘤之患者,投予包括本發明之胞毒藥物-抗-CD22-抗體共軛物的具有治療效力之組合物,治療B-細胞惡性腫瘤的方法。在較佳的具體實施例中,該B-細胞惡性腫瘤是淋巴瘤,特別是非-霍奇金氏淋巴瘤。
在一個具體實施例中,用來製備本發明之共軛物的胞毒藥物,係選自由卡奇黴素、噻替哌、紫杉烷、長春新鹼道諾紅菌素、阿黴素、表柔比星、放線菌素、奧索拉黴素、重氮絲胺酸、博菜黴素、他莫昔芬、伊達比星、多拉斯塔汀/奧雷斯塔汀、半阿斯特林、類美登素和艾思普黴素所組成之群。
在較佳的具體實施例中,該胞毒藥物是γ卡奇黴素或N-乙醯基卡奇黴素。
在另一個具體實施例中,該處理包括連同一或多個選自抗體、生長因子、荷爾蒙、細胞激動素、抗-荷爾蒙、黃嘌呤素、介白素、干擾素和胞毒藥物的生物活性劑,一起投予本發明之胞毒藥物共軛物。
在較佳的具體實施例中,該生物活性劑為抗體,並對抗在B-細胞惡性腫瘤上表現的細胞表面抗原。在較佳的具體實施例中,對抗在B-細胞惡性腫瘤上表現之細胞表面抗原的抗體,係選自由抗-CD19、抗-CD20和抗-CD33抗體所組成之群。這類抗體包括抗-CD20抗體,利妥昔單抗(美羅華TM
)。
在另一個具體實施例中,該生物活性劑是細胞激動素或生長因子,並包括但不限於介白素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
在另一個具體實施例中,該生物活性劑是荷爾蒙,並包括雌激素、雄激素、孕甾酮和皮質類固醇。
在另一個具體實施例中,該生物活性劑為胞毒藥物,選自阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、表柔比星、洋紅黴素I(carubicin)、諾加拉黴素(nogalamycin)、美諾立爾(menogaril)、匹塔路比星(pitarubicin)、瓦路比星(valrubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、曲氟尿苷(trifluridine)、環胞苷(ancitabine)、依諾他濱(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、噴司他丁(pentostatin)、脫氧溴尿苷(broxuridine)、截瘤達(capecitabine)、克拉君賓(cladribine)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、嘌羅黴素(puromycin)、替加氟(tegafur)、噻唑呋啉(tiazofurin)、亞德里亞黴素、順氯氨鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺、甲嗪咪唑胺(dacarbazine)、長春花鹼、長春新鹼、米托蒽醌、博菜黴素、氮芥(mechlorethamine)、強的松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、胺甲碟呤、氟尿嘧啶(flurouracils)、依托泊苷(etoposide)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇類似物和絲裂黴素。
在較佳的具體實施例中,將具有治療效力之胞毒藥物-抗-CD22-抗體共軛物的組合物,連同作為治療療程之一部分的胞毒製劑之一或多種組合一起投予,其中該胞毒製劑的組合係選自:CHOPP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松);COP(環磷醯胺、長春新鹼和強的松);CAP-BOP(環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、博菜黴素、長春新鹼和強的松);m-BACOD(胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松和甲醯四氫葉酸);ProMACE-MOPP(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博菜黴素和長春新鹼);MACOP-B(胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、強的松、博菜黴素和甲醯四氫葉酸);MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺);以ABV(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花鹼)加以改變的MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);以ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺)加以改變的MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ChlVPP(苯丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和強的松);IMVP-16(異環磷醯胺(ifosfamide)、胺甲碟呤和依托泊苷);MIME(丙酮雙咪腙(Methyl-gag)、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);DHAP(地塞米松、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);ESHAP(依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼、強的松和博菜黴素);CAMP(洛莫司汀(lomustine)、米托醌蒽、阿糖胞苷和強的松);以及CVP-1(環磷醯胺、長春新鹼和強的松)。
在較佳的具體實施例中,在投予胞毒藥物的一或多種上述組合之前,投予具有治療效力之胞毒藥物-抗-CD22-抗體共軛物的組合物。在另一個較佳的具體實施例中,在投予作為治療療程之一部分的胞毒藥物之一或多種上述組合之後,投予具有治療效力之胞毒藥物-抗-CD22-抗體共軛物的組合物。
本發明的另一項觀點,係針對治療侵略性淋巴瘤的方法,包括對需要該治療之患者,與一或多個生物活性劑一起,投予在治療上有效之單體卡奇黴素衍生物-抗-CD22-抗體共軛物的組合物。
本發明的另一項觀點,係針對本發明之組合物在治療患有增生性疾病,像是癌症之個體上的用途。特定而言,該癌症為在細胞表面上表現CD22抗原的B-細胞惡性腫瘤。特定而言,該B-細胞惡性腫瘤為白血病或淋巴瘤。在一個具體實施例中,該癌症為癌或白血病。
在一個具體實施例中,以皮下、腹腔內、靜脈內、動脈內、髓內、鞘內、經皮、經皮下、鼻內、局部、經腸、陰道內、舌下或經直腸之方式,投予在治療上有效劑量的組合物。
在較佳的具體實施例中,以靜脈內之方式投予在治療上有效之劑量的本發明之醫藥組合物。
本發明的另一項觀點,係針對本發明之單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22-抗體共軛物,在治療罹患B-細胞惡性腫瘤,像是非-霍奇金氏淋巴瘤之個體上的用途。在一個具體實施例中,將本發明之單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22-抗體共軛物與一或多個生物活性劑一起投予。
在一個具體實施例中,該生物活性劑係選自由抗體、生長因子、荷爾蒙、細胞激動素、抗-荷爾蒙、黃嘌呤素、介白素、干擾素和胞毒藥物所組成之群。
在較佳的具體實施例中,該生物活性劑為對抗在B-細胞惡性腫瘤上表現之細胞表面抗原的抗體,像是抗-CD19、抗-CD20和抗-CD33抗體。在較佳的具體實施例中,該抗-CD20抗體是利妥昔單抗(美羅華TM
)。
在另一個具體實施例中,該生物活性劑包括細胞激動素或生長因子,像是介白素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF或荷爾蒙,其包括雌激素、雄激素、孕甾酮和皮質類固醇。
在另一個具體實施例中,該生物活性劑為胞毒藥物,選自阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、洋紅黴素I、諾加拉黴素、美諾立爾、匹塔路比星、瓦路比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、環胞苷、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、脫氧溴尿苷、截瘤達、克拉君賓、地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、谷氏菌素、嘌羅黴素、替加氟、噻唑呋啉、亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡鉑、環磷醯胺、甲嗪咪唑胺、長春花鹼、長春新鹼、米托蒽醌、博菜黴素、氮芥、強的松、丙卡巴肼、胺甲碟呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉醇、紫杉醇類似物和絲裂黴素。
在較佳的具體實施例中,將在治療上有效劑量的單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22-抗體共軛物,與作為治療療程的一部分之胞毒製劑的一或多種組合一起投予,其中該胞毒製劑的組合係選自:CHOPP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松);COP(環磷醯胺、長春新鹼和強的松);CAP-BOP(環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、博菜黴素、長春新鹼和強的松);m-BACOD(胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松和甲醯四氫葉酸);ProMACE-MOPP(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博菜黴素和長春新鹼);MACOP-B(胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、強的松、博菜黴素和甲醯四氫葉酸);MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺);以ABV(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花鹼)加以改變的MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);以ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺)加以改變的MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ChlVPP(苯丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和強的松);IMVP-16(異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);MIME(丙酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);DHAP(地塞米松、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);ESHAP(依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼、強的松和博菜黴素);CAMP(洛莫司汀、米托醌蒽、阿糖胞苷和強的松);CVP-1(環磷醯胺、長春新鹼和強的松);ESHOP(依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞苷、長春新鹼和順氯氨鉑);EPOCH(依托泊苷、長春新鹼和阿黴素96小時,加環磷醯胺之團塊劑量,並口服強的松);ICE(異環磷醯胺、環磷醯胺和依托泊苷);CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼、強的松和博菜黴素);CHOP-B(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和博菜黴素);CEPP-B(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博菜黴素)以及P/DOCE(表柔比星或阿黴素、長春新鹼、環磷醯胺和強的松)。
在一個較佳的具體實施例中,在投予作為治療療程之一部分的胞毒製劑之一或多種組合之前,先投予單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物。
在另一個較佳的具體實施例中,在投予作為治療療程之一部分的胞毒製劑之一或多種組合之後,投予在治療上有效之劑量的單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物。
在另一個較佳的具體實施例中,連同對抗在B-細胞惡性腫瘤上之細胞表面抗原的抗體,一起投予在治療上有效之劑量的單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物,並可視需要包括作為治療療程之一部分的胞毒製劑之一或多種組合。
在另一項觀點中,本發明係針對本發明之單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物,在製造可用來治療增生性疾病之醫藥品上的用途。可單獨使用這類醫藥品或與其他生物活性劑併用,來治療B-細胞增生性疾病。
本發明之共軛物包括利用交聯劑衍生的胞毒藥物,其包含任何與蛋白質載體反應的反應性基團,形成胞毒藥物衍生物-蛋白質載體共軛物。更明確地說,本發明之共軛物包括利用交聯劑衍生之胞毒藥物,其包含任何與用來作為蛋白質載體之抗體反應的反應性基團,形成胞毒藥物衍生物-抗體共軛物。更明確地說,該抗體係針對在B-細胞惡性腫瘤上的細胞表面抗原反應。下文描述製造和純化這類共軛物的一種經過改良的方法。使用特殊的共溶劑、添加劑和特定的反應條件,連同分離方法一起,結果將形成單體胞毒藥物衍生物/抗體共軛物,並明顯地降低了LCF。單體的形式與聚集的形式相反,具有重大的治療價值,並使LCF減至最少,且實質上降低了聚集作用,結果藉著阻礙LCF與較高的共軛部分(HCF)競爭,以在治療上有意義之方式,利用抗體起始物質。
本發明之載體/瞄準劑最好是蛋白質的載體/瞄準劑。載體/瞄準劑包括荷爾蒙、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模仿物及其以遺傳方式或以酵素方式設計的配對物,在後文中以單數或以“載體”群稱呼之。載體之必要特性,是其認出並結合與不想要細胞有關連之抗原或受體,接著被內化的能力。在美國專利第5,053,394號中揭示了可應用於本發明中之載體的實例,將其全文以引用的方式併入本文中。可在本發明中使用的較佳載體,是抗體和抗體模仿物。
已經使用許多非-免疫球蛋白之蛋白質鷹架,來產製抗體模仿物,其與抗原之抗原決定位結合,具有抗體之專一性(PCT公開案第WO 00/34784號)。例如,“微型抗體(minibody)”鷹架,其與免疫球蛋白折疊有關,已經藉著從單株抗體之重鏈可變功能部位中刪除三個β股來設計之(Tramontano等人,J. Mol. Recognit. 7:9,1994)。該蛋白質包含61個殘基,並可用來提供兩個高變環。已經將這兩個環隨機化,並針對抗原結合來選擇產物,但因此遠離該架構,而多少限制了利用性,歸因於溶解性的問題。其他用來展示環的架構是坦德米塔(tendamistat),一種專一地抑制哺乳動物α-澱粉酶的蛋白質,並為74個殘基,藉著兩個二硫鍵使其結合在一起的六股β-片三明治(McConnell和Hoess,J. Mol. Biol. 250:460,1995)。該鷹架包括三個環,但迄今為止,僅已經針對其中的兩個進行無規則分布之可能的檢查。
已經測試其他作為架構的蛋白質,並已經用來展示在α螺旋表面上的隨機化殘基(Nord等人,Nat. Biotechnol. 15:772,1997;Nord等人,Protein Eng. 8:601,1995),在α螺旋束中在α螺旋之間的環(Ku和Schultz,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552,1995),以及由二硫橋約束的環,像是那些小的蛋白酶抑制劑(Markland等人,Biochemistry 35:8045,1996;Markland等人,Biochemistry 35:8058,1996;Rottgen和Collins,Gene 164:243,1995;Wang等人,J. Biol. Chem. 270:12250,1995)。
可在本發明中使用之抗體載體的實例,包括單株抗體、嵌合型抗體、人類化抗體、人類抗體及其具有生物活性的片段。這類抗體最好是在諸如癌症之類的增生性疾病中,對抗在標靶細胞及/或組織上表現的細胞表面抗原。對抗在標靶細胞上之細胞表面抗原的特異抗體之實例,包括但不限於對抗CD22抗原之抗體,其在大多數B-細胞淋巴瘤上過度表現;G5/44,一種老鼠抗-CD22單株抗體的人類化形式;對抗細胞表面抗原CD33的抗體,其普遍出現在某些人類髓樣腫瘤上,尤其是急性髓樣白血病;hP67.6,一種抗-CD33老鼠抗體的人類化形式(參見美國專利第5,773,001號);對抗在許多表皮起源之腫瘤上發現,命名為mP67.6之PEM抗原的抗體(參見I. D. Bernstein等人,J. Clin. Invest. 79
:1153(1987)和I.D. Bernstein等人,J. Immunol. 128
:867-881(1992));以及對抗在許多固體腫瘤上過度表現,命名為hu3S193之路易斯Y碳水化合物抗原的人類化抗體(參見美國專利第6,310,185B1號)。此外,有數個市售的抗體,像是利妥昔單抗(美羅華TM
)和搓杜滋美(trastuzumab)(賀癌平(Herceptin)TM
),其亦可用來作為載體/瞄準劑。利妥昔單抗(美羅華TM
)是嵌合型抗-CD20抗體,用來治療各種B-細胞淋巴瘤,而搓杜滋美(賀癌平TM
)是人類化的抗-Her2抗體,用來治療乳癌。
在本文中,以針對細胞表面抗體CD22之CDR-移植的人類化抗體分子,命名為G5/44,作為在本發明中用來作為載體的例證。該抗體是老鼠抗-CD22單株抗體的人類化形式,其係針對在某些人類淋巴瘤上普遍出現的細胞表面抗原CD22。當在本文中使用“CDR-移植之抗體分子”一詞時,意指其中包括含有一或多個互補性決定區(CDRs)之重及/或輕鏈的抗體分子,若需要可將來自捐贈者抗體(例如老鼠單株抗體)之經過修改的CDR(在後文中為CDR),移植到接受者抗體(例如人類抗體)的重及/或輕鏈可變區架構內。這類CDR-移植的抗體,最好具有包括人類接受者架構區的可變功能部位,以及一或多個上文提及之捐贈者CDRs。
在移植CDRs時,可使用與從其中衍生該CDRs之捐贈者抗體的種類/類型有關之任何適當的接受者可變區架構序列,包括老鼠、靈長類和人類架構區。可在本發明中使用之人類架構的實例,為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人,Seq. of Proteins of Immunol. Interest,1:310-334(1994))。例如,KOL和NEWM可供重鏈使用,REI可供輕鏈使用,而EU、LAY和POM可供重鏈和輕鏈兩者使用。
在本發明之CDR-移植的抗體中,最好是使用具有與捐贈者抗體之鏈同種的鏈者,作為接受者抗體。接受者重和輕鏈不一定要是衍生自相同抗體的,且若需要可包括具有衍生自不同鏈之架構區的綜合鏈。
再者,在本發明之CDR-移植的抗體中,架構區不必具有與接受者抗體的那些精確相同的序列。例如,可將不常見的殘基改為在接受者鏈的種類或類型中,較常出現的殘基。或者,可改變在接受者架構區中選出的殘基,使得其與在捐贈者抗體中之相同位置處發現的殘基一致。應將這類改變維持在最低需要,以便恢復捐贈者抗體的親和力。可能必需改變在PCT公開案第WO 91/09967號中陳述之在接受者架構區中選擇殘基的草案,將其全文以引用的方式併入本文中。
供體殘基是得自捐贈者抗體的殘基,即最初從其中衍生CDRs的抗體。
本發明之抗體可包括重鏈,其中可變功能部位包括稱為H2’的CDR-H2(按照Kabat等人(在前)之定義),其中已經移除可能的糖基化作用位置序列,以便增加該抗體對抗原的親和力。
或者或另外,本發明之抗體可包括重鏈,其中可變功能部位包括稱為H2”的CDR-H2(按照Kabat等人(在前)之定義),其中離胺酸殘基是在位置60處。以另一個可選的胺基酸置換位在CDR-H2中之暴露位置處的離胺酸殘基,並認為該離胺酸殘基具有與共軛劑反應的潛力,結果降低了抗原結合親和力。
另外,本發明之抗體可包括重鏈,其中可變功能部位包括稱為H2’’’的CDR-H2(按照Kabat等人(在前)之定義),其中利用另一個可選的胺基酸置換可能的糖基化作用位置序列和在位置60處的離胺酸殘基。
本發明之抗體可包括:具有全長重和輕鏈的完整抗體;其具有生物活性之片段,像是Fab、經過修改的Fab、Fab’、F(ab’)2
或Fv片段;輕鏈或重鏈單體或二聚體;或單鏈抗體,例如單鏈Fv,其中藉著肽交聯劑連接重和輕鏈可變功能部位。同樣地,可適當地將重和輕鏈可變區與其他抗體功能部位混合。
本發明之抗體亦可包含經過修改的Fab片段,其中該修改是添加一或多個胺基酸,而容許將效應物或受體分子附接在其重鏈的C-終端。該額外的胺基酸,最好是形成含有一或兩個半胱胺酸殘基的經過修改之絞鏈區,可將效應物或受體分子附接在其上。
本發明之抗體的恆定區功能部位,若出現,則可就所提出之抗體功能而加以選擇,且特別是可能需要或可能不需要的效應物功能。例如,恆定區功能部位可能是人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM功能部位。特定而言,當打算將抗體用於治療用途上,並需要抗體效應物功能時,可使用人類IgG恆定區功能部位,尤其是IgG1和IgG3同型物。或者,當打算將抗體用於治療目的,但不需要或希望效應物功能時,可使用IgG2和IgG4同型物,或可使IgG1 Fc區突變,廢除效應物功能。
本發明之抗體具有至少5x10-3
M,最好是至少1x10-9
M,更佳的是至少0.75x10-10
M,而最佳的是至少0.5x10-10
M的結合親和力。
在一個具體實施例中,本發明係關於免疫毒素共軛物,以及使用抗體變種或抗體模仿物製造這些共軛物的方法。在較佳的具體實施例中,本發明之抗體的變種,係針對CD22,並對CD22展現出改良的親和力。可藉著許多親和力成熟草案,包括使CDRs突變(Yang等人,J. Mol. Biol.,254
,392-403,1995)、鏈的洗牌(Marks等人,Bio/Technology,10
,779-783,1992)、使用大腸桿菌之增變品系(Low等人,J. Mol. Biol.,260
,359-368,1996)、DNA洗牌(Patten等人,Curr. Opin. Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌體展示(Thompson等人,J. Mol. Biol.,256
,77-88,1996)和有性的PCR(Crameri等人,Nature,391
,288-291,1988),獲得這類變種。
為了表現編碼包括本發明抗體之載體的DNA序列,可使用任何適當的宿主細胞/載體系統。為了表現諸如Fab和F(ab’)2
片段之類的抗體片段,且特別是Fv片段和單鏈抗體片段,例如單鏈Fvs,一部分可使用細菌,例如大腸桿菌和其他微生物系統。至於產製較大的抗體,包括完整的抗體分子,可使用真核生物,例如哺乳動物的宿主細胞表現系統。適當的哺乳動物宿主細胞,包括CHO、骨髓瘤、酵母菌細胞、昆蟲細胞、融合瘤細胞、NSO、VERO或PER C6細胞。適當的表現系統亦包含基因轉殖的動物和植物。
適用於本發明之治療劑,是抑制或瓦解微管蛋白聚合作用的胞毒藥物,結合並瓦解DNA的烷基化製劑,以及抑制蛋白質合成或必要之細胞蛋白質的製劑,像是蛋白質激酶、酵素和週期素(cyclin)。這類胞毒藥物的實例,包括但不限於噻替哌、紫杉烷、長春新鹼、道諾紅菌素、阿黴素、表柔比星、放線菌素、奧索拉黴素、重氮絲胺酸、博菜黴素、他莫昔芬、伊達比星、多拉斯塔汀/奧雷斯塔汀、半阿斯特林、卡奇黴素、艾思普黴素和類美登素。較佳的胞毒藥物是卡奇黴素,其為甲基三流化物抗腫瘤抗生素的實例。在例如美國專利第4,671,958號;美國專利第4,970,198號;美國專利第5,053,394號;美國專利第5,037,651號和美國專利第5,079,233號中,揭示了適用在本發明中之卡奇黴素的實例,將其全文以引用的方式併入本文中。較佳的卡奇黴素是γ-卡奇黴素衍生物或N-乙醯基γ-卡奇黴素衍生物。
本發明之共軛物,具有式Pr(-X-W)m
,其中:Pr為蛋白質之載體,X為交聯劑,其包括任何可與蛋白質載體反應之反應基團的產物,W為胞毒藥物;m為經過純化之共軛產物的平均裝載,使得胞毒藥物按重量計構成共軛物的4-10%;且(-X-W)m
為胞毒藥物。
較佳的是,X具有下式
(CO-Alk1
-Sp1
-Ar-Sp2
-Alk2
-C(Z1
)=Q-Sp)
其中Alk1
和Alk2
分別為一鍵結或分支或未分支之(C1
-C10
)伸烷基鏈;Sp1
為一鍵結、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR'-、-N(CH2
CH2
)2
N-或-X-Ar'-Y-(CH2
)n
-Z,其中X、Y和Z分別為一鍵結、-NR'-、-S-或-O-,其限制條件為當n=0時,Y和Z中至少有一個必需是一鍵結,且Ar'為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基,可視需要以1、2或3個(C1
-C5
)烷基、(C1
-C4
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'、-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代,其限制條件為當Alk1
為一鍵結時,Sp1
為一鍵結;n為從0至5之整數;R'為分支或未分支之(C1
-C5
)鏈,可視需要以1或2個-OH、(C1
-C4
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、(C1
-C3
)二烷胺基或(C1
-C3
)三烷基銨-A-
之基團取代,其中A-
為在藥學上可接受之陰離子,而完成鹽;Ar為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基,可視需要以1、2或3個(C1
-C6
)烷基、(C1
-C5
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'、-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代,其中n和R'如同前文之定義,或1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-伸萘基,或
每個伸萘基或啡噻,可視需要以1、2、3或4個(C1
-C6
)烷基、(C1
-C5
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代,其中n和R'如同上文之定義,其限制條件為Ar為啡噻時,Sp1
為一鍵結,僅與氮連接;Sp2
為一鍵結、-S-或-O-,其限制條件為當Alk2
為一鍵結時,Sp2
為一鍵結;Z1
為H、(C1
-C5
)烷基或苯基,可視需要以1、2或3個(C1
-C5
)烷基、(C1
-C5
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-ONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'、-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代,其中n和R'如同上文之定義;Sp為直線或支鏈的二價或三價(C1
-C18
)基團、二價或三價芳基或雜芳基基團、二價或三價(C3
-C18
)環烷基或雜環烷基基團、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基(C1
-C18
)基團、二價或三價環烷基-或雜環烷基-烷基(C1
-C18
)基團或二價或三價(C2
-C18
)不飽和的烷基基團,其中該雜芳基最好是呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基肼甲醯基、胺基薰草基或啡基,且其中若Sp為三價之基團,則Sp可額外地被低碳數(C1
-C5
)二烷胺基、低碳數(C1
-C5
)烷氧基、羥基或低碳數(C1
-C5
)烷硫基基團取代;且Q為=NHNCO-、=NHNCS-、=NHNCONH-、=NHNCSNH-或=NHO-。
較佳的是,Alk1
是分支或未分支之(C1
-C10
)伸烷基鏈;Sp'是一鍵結、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR',其中R'如同前文之定義,其限制條件為當Alk1
為一鍵結時,Sp1
為一鍵結;Ar為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基,可視需要以1、2或3個(C1
-C6
)烷基、(C1
-C5
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR',-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代,其中n和R'如同前文之定義,或Ar為1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-伸萘基,可分別視需要以1、2、3或4個(C1
-C6
)烷基、(C1
-C5
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'、-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代。
Z1
為(C1
-C5
)烷基或苯基,可視需要以1、2或3個(C1
-C5
)烷基、(C1
-C4
)烷氧基、(C1
-C4
)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2
)n
COOR'、-S(CH2
)n
COOR'、-O(CH2
)n
CONHR'或-S(CH2
)n
CONHR'之基團取代;Alk2
和Sp2
一起為一鍵結且Sp和Q如同僅接上文之定義。
美國專利第5,773,001號,將其全文以引用的方式併入本文中,揭示可與親核衍生物一起使用的交聯劑,特別是從卡奇黴素中製備之醯肼和相關的親核物質。這些交聯劑在其中獲得較佳之活性的那些案例中,是特別有用的,此時在藥物與交聯劑之間形成的鍵結為可水解的。這些交聯劑含有兩個官能基團。一個基團通常是羧酸,用來與載體反應。酸性的官能基團,當適度地激活時,可與載體之自由胺基形成醯胺鍵結,像是,例如在抗體或其他蛋白質載體的離胺酸之側鏈中的胺。其他的官能基通常是羰基基團,即醛或酮,其將與經適當修改之治療劑反應。羰基基團可與在藥物上的醯肼基團反應,形成腙鍵結。該鍵結是可水解的,容許在與標靶細胞結合之後,從共軛物中釋放出治療劑。
可供本發明使用之最佳雙重功能的交聯劑是4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut),結果產生較佳的產物,其中藉著與3-巰基-3-甲基丁醯肼、AcBut交聯劑和人類或人類化IgG抗體瞄準載體反應,將由β-卡奇黴素、γ-卡奇黴素或N-乙醯基γ-卡奇黴素組成的共軛物官能化。
許多胞毒藥物,包括卡奇黴素的天然厭水性質,使得在製備具有對於治療應用而言必要之良好藥物裝載和合理產量的單體藥物共軛物時出現困難。在美國專利第5,773,001號中,揭示了藉著諸如AcBut之類的交聯劑,更增加了鍵結的厭水性,且隔開治療劑與載體(抗體)之共價距離的增加,亦加劇了該問題。
發生具有較高藥物裝載之胞毒藥物衍生物/載體共軛物的聚集,係歸因於藥物的厭水性質。經常必須限制藥物的裝載,以便獲得合理產量的單體產物。在某些情況下,像是在美國專利第5,877,296號中的共軛物,通常不易使用在美國專利第5,053,394號中揭示的反應條件,以有用的產量,製造可供治療應用之有效裝載的共軛物,係歸因於過度的聚集。這些反應條件,在共軛反應中利用DMF作為共-溶劑。因此需要容許較高的藥物裝載/產量,但無聚集和喪失材料本質的方法。
在美國專利第5,712,374號和5,714,586號中描述了降低聚集的改良,將其全文以引用的方式併入本文中。在那些專利中,揭示了蛋白質載體,包括但不限於用來瞄準胞毒治療劑的蛋白質,像是人類或人類化的抗體,像是例如hP67.6以及其他在本文中揭示的人類化抗體。在那些專利中,發現含有(i)作為共溶劑之丙二醇和(ii)包括至少一個C6
-C18
羧酸之添加劑的非-親核性、蛋白質-可相容之緩衝溶液的使用,通常產生具有較高藥物裝載/產量並降低聚集的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物,具有優異的活性。在本文中描述的較佳酸類,是C7
至C12
的酸類,而最佳的酸是辛酸(像是辛酸)或其鹽類。對於用N-羥基琥珀醯亞胺(OSu)酯或其他可相比擬之活性酯製成的共軛物而言,較佳的緩衝溶液是磷酸-緩衝之生理鹽水(PBS)或N-2-羥乙基六氫吡-N'-2-乙烷磺酸(HEPES緩衝溶液)。在那些共軛反應中使用的緩衝溶液,不可含有自由胺或親核物質。至於其他類型的共軛物,可迅速地判定可接受的緩衝溶液。或者,亦發現含有正-丁醇但無額外添加劑的非-親核性、蛋白質-可相容之緩衝溶液的使用,產生具有較高藥物裝載/產量並降低聚集的單體卡奇黴素衍生物/載體共軛物。
形成單體共軛物所需之共溶劑的用量,多少隨著蛋白質而有所改變,並可由熟諳此藝者判定,不需過度的實驗。有效形成單體共軛物所需之添加劑的用量,亦將隨著抗體而有所不同。亦可由熟諳此藝者判定該用量,不需過度的實驗。在美國專利第5,712,374號和5,714,586號中,丙二醇的添加量,按總溶液之體積計,範圍是從10%至60%,較佳的是10%至40%,而最佳的是大約30%,並將範圍從20 mM至100 mM,較佳的是從40 mM至90 mM,而最佳的是大約60 mM至90 mM之包括至少一個C6
-C18
羧酸或其鹽,最好是辛酸或其鹽的添加劑,加至共軛反應中,產生具有較高藥物裝載/產量並降低聚集的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物。亦可使用丙二醇以外的其他蛋白質-可相容之有機共溶劑,像是乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等等。使用一些或全部的有機共溶劑,將藥物運送至共軛混合物內。
或者,在那些具體實施例中,可將C6
-C18
羧酸或其鹽的濃度增加至150-300 mM,並將共溶劑降低至1-10%。在一個具體實施例中,該羧酸是辛酸或其鹽。在較佳的具體實施例中,該羧酸是癸酸或其鹽。在另一個較佳的具體實施例中,該羧酸是辛酸或其鹽,其以200 mM辛酸之濃度,連同5%丙二醇或乙醇一起存在。
在那些專利中之其他交替的具體實施例中,可將按總溶液之體積計,濃度範圍從10%至25%,較佳的是15%之第三-丁醇,加至共軛反應中,產生具有較高藥物裝載/產量並降低聚集的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物。
將這些已確立之共軛條件應用在CMA-676(Gemtuzumab Ozogamicin)的形成上,其目前以MylotargTM
上市販售。自從為了急性髓樣白血病(AML)而導入該治療,已經經由離子-交換層析法的應用,學習到卡奇黴素並非以均一之方式分布在抗體上。大多數的卡奇黴素是在大約一半的抗體上,而另一半以LCF之形式存在,僅含有少量的卡奇黴素。結果,對於改良使胞毒藥物,像是卡奇黴素與載體的方法,有重大的需求,其將聚集的量減至最少,並容許較高的均等藥物裝載,以及明顯改善之共軛產物的產量。
特定的實例為G5/44-NAc-γ-卡奇黴素DMH AcBut共軛物,將其稱為CMC-544,並在圖17中以一般的方式展示。為了CMC-544的發展,希望將LCF的量降低至總抗體的<10%,並考量各種降低LCF含量的意見。免疫共軛物的其他屬性,像是抗原結合和胞毒性,必須不受最終溶液的影響。考量的意見包括抗體的遺傳或物理修改、層析分離技術或反應條件的修改。
使用舊反應條件(CMA-676處理條件)之G5/44抗體與NAc-γ-卡奇黴素DMH AcBut OSu的反應,結果產生與CMA-676類似的物理特性(藥物裝載、LCF和聚集)。然而,認為在共軛作用之後出現的高程度LCF(50-60%)是不想要的。經由統計實驗設計方法學,其中評估關鍵性的反應可變數,像是溫度、pH值、卡奇黴素衍生物輸入和添加劑濃度,來判定最佳的反應條件。這些實驗的分析,證實卡奇黴素輸入和添加劑濃度,對低共軛分數LCF和凝集形成的程度,具有最顯著的影響,而溫度和pH值則發揮較少的影響。在額外的實驗中,亦顯示蛋白質載體(抗體)之濃度和共溶劑(乙醇),在控制LCF和聚集程度上,同樣是較不重要的(與卡奇黴素輸入和添加劑濃度相比較)。為了將LCF降低至<10%,將卡奇黴素衍生物的輸入,相對於在反應中的抗體含量,從3%增加至8.5%(重量/重量)。將添加劑從200 mM之濃度的辛酸或其鹽(CMA-676處理),變更為37.5 mM之濃度的癸酸或其鹽。在稍微升高的溫度(30-35℃)和pH值(8.2-8.7)下,進行共軛反應。併入這些改變的反應條件,降低LCF至10%以下,同時增加了卡奇黴素裝載,並在後文中稱為CMC-544處理條件或“新”處理條件。在表1中出示以CMA-676和CMC-544處理條件所獲得之結果的比較。
在卡奇黴素輸入上的增加,使藥物裝載從2.5-3.0重量%增加至7.0-9.0(最典型的是7.5-8.5)重量%,且在反應中沒有蛋白質聚集的增加。因為降低聚集體和LCF,CMC-544處理條件結果產生較均質的產物。已經藉著該新共軛程序,以多-克抗體規模,可再現地製備CMC-544。
在前述的反應中,抗體濃度的範圍可從1至15毫克/毫升,而卡奇黴素衍生物,例如N-乙醯基γ-卡奇黴素DMH AcBut OSu酯(用來製造在圖17中出示之共軛物)的濃度,按抗體之重量計,範圍是在大約4.5-11%。共溶劑為乙醇,已經在範圍從6至11.4%的濃度(按體積計)下,證實了該良好結果。在PBS、HEPES、N-(2-羥乙基)六氫吡-N’-(4-丁烷磺酸)(HEPES)或其他可相容之緩衝溶液中,以8至9之pH值,在範圍從30℃至大約35℃的溫度下,進行反應15分鐘至24小時。熟諳此藝者可輕易地判定其他類型共軛物之可接受的pH值範圍。對各種抗體而言,已經發現在前文提及之添加劑的組合中,使用微少的改變,改善了藥物裝載和單體共軛物產量,並了解任何特定的蛋白質載體,可能在精確的條件中需要一些較少的改變,或需要選擇添加劑,以便達到最佳的結果。
在共軛作用之後,可藉著傳統的方法,例如尺寸排阻層析法(SEC)、厭水性交互作用層析法(HIC)、離子交換層析法(IEC)或層析聚焦(CF),從未共軛的反應劑(像是蛋白質載體和自由的胞毒藥物/卡奇黴素)中分離單體共軛物及/或共軛物的聚集形式。經過純化的共軛物是單體的,且通常含有從4至10重量%的胞毒藥物/卡奇黴素。在較佳的具體實施例中,使用厭水性交互作用層析法(HIC)純化共軛物。在先前用來以生產-規模製造胞毒藥物/卡奇黴素-抗體共軛物的方法(CMA-676法)中,唯一使用的共軛後分離步驟,是尺寸排阻層析法(SEC)。雖然該步驟在為了調配而移除聚集之共軛物和完成緩衝劑交換兩者中是相當有效的,但它在降低LCF內含量上是無效的。結果以SEC-為基礎之方法,完全依賴共軛反應之化學來控制終產物的LCF內含量。SEC的其他缺點是限制施用於管柱中之共軛物反應混合物的體積(通常不超過處理管柱之床體積的5%)。這嚴格地限制了可在特定產製空間中容納的每批尺寸(並因此限制了產製容量)。最後,SEC純化法結果亦導致共軛物溶液的明顯稀釋,其使在調配時以可信賴之方式達到的蛋白質濃度受到束縛。
當胞毒藥物具有高厭水性質,像是卡奇黴素衍生物,並在共軛物中使用時,厭水性交互作用層析法(HIC)是提供已共軛和未共軛抗體之有效分離的較佳候選者。HIC提供三個勝過SEC的關鍵性優點:(1)其具有有效降低LCF內含量的和聚集體能力,(2) HIC之管柱裝載容量高很多且(3) HIC避免了產物的過度稀釋。
許多高容量的HIC介質適合產製規模應用,像是丁基、苯基和辛基瓊脂糖4速流(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ),可在共軛過程之後,有效地從單體共軛組份中分離共軛物的未共軛組份和聚集體。
本發明亦提供製備治療或診斷用之組合物/調配物的方法,包括將本發明之單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物與在藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑和載劑混合在一起。
單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物可以是在治療或診斷用之組合物/調配物中的唯一活性成分,或可伴隨有其他活性成分,包括其他的抗體成分,例如抗-CD19、抗-CD20、抗-CD33、抗-T細胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗體,或非-抗體成分,像是細胞激動素、生長因子、荷爾蒙、抗-荷爾蒙、胞毒藥物和黃嘌呤素。
可用來治療增生性疾病,像是癌症,並可與本發明之胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的細胞激動素和生長因子,包括干擾素、介白素,像是介白素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
經常用來治療增生性疾病,像是癌症,並可與本發明之胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的荷爾蒙,包括雌激素,像是己烯雌酚和雌二醇,雄激素,像是睪酮和鹵睪素(Halotestin),孕甾酮,像是美可治(Megace)和普羅弗(Provera),以及皮質類固醇,像是強的松、地塞米松和氫基可體松。
抗荷爾蒙,像是抗雌激素,即他莫昔芬,抗雄激素,即氟他胺(flutamide)和抗腎上腺製劑,經常用來治療增生性疾病,像是癌症,並可與本發明之胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用。
經常用來治療增生性疾病,像是癌症,並可與本發明之胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的化學治療/抗贅生物製劑,包括但不限於亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡鉑、長春花鹼、長春新鹼、博菜黴素、胺甲碟呤、阿黴素、氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉醇及其各種類似物和絲裂黴素。
組合物最好應包括在治療上有效之含量的本發明之共軛物。在本文中使用“在治療上有效之含量”一詞,意指治療、改善或預防目標疾病或狀況,或顯露出可檢測之治療或預防效果所需之治療劑的量。對任何共軛物而言,一開始可先在細胞培養測定中或在動物模式中,通常是在囓齒類、兔子、狗、豬或靈長類中,估計在治療上有效的劑量。亦可使用動物模式來判定適當的濃度範圍和投藥途徑。然後可使用這類資訊,判定在人類中的有用劑量和投藥途徑。
人類個體的實際有效量將視疾病狀態的嚴重性、個體的一般健康狀況、個體的年齡、體重和性別、飲食、投藥的時間和頻率、藥物組合(們)、對治療的反應敏感性和耐受性/反應性而定。可由例行的實驗判定該用量,並在臨床醫師的判斷範圍內。通常,有效劑量將從0.1毫克/平方公尺至50毫克/平方公尺,較佳的是0.4毫克/平方公尺至30毫克/平方公尺,更佳的是2毫克/平方公尺至9毫克/平方公尺,以蛋白質載體為基礎來計算劑量。
可將組合物分別投予患者,或可與其他製劑、藥物或荷爾蒙混合投予。所投予之本發明單體胞毒藥物衍生物/抗體共軛物的劑量,將視待治療之病況的性質、惡性淋巴瘤或白血病的等級,以及該共軛物是否用於預防上,或用來治療現存的病況而定。
投藥的頻率將視共軛物之半衰期,及其作用的期間而定。若共軛物具有短的半衰期(例如2至10小時),可能需要每天給予1或多個劑量。或者,若該共軛物分子具有長的半衰期(例如2至15天),則可能僅需每天給藥1次、每週給藥1次或甚至每1或2個月給藥1次。
為了投予抗體共軛物,組合物亦可含有在藥學上可接受的載劑。載劑本身不應誘導對接受該組合物之個體有害之抗體的產生,且不應是有毒性的。適當的載劑可以是大的、緩慢代謝的巨分子,像是蛋白質、多肽、微脂粒、多醣類、聚乳酸、聚甘醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和失活的病毒顆粒。
可使用在藥學上可接受的鹽類,例如無機酸鹽類,像是鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽,或有機酸的鹽類,像是醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
在這些組合物中之在藥學上可接受的載劑,可額外地含有液體,像是水、生理鹽水、甘油和乙醇。此外,在這類組合物中亦可存有輔助物質,像是濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝物質。這類載劑使該組合物得以調配成錠劑、藥丸、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿或懸浮液,以供患者攝食。
可供投藥的較佳形式,包括適合非經腸投藥的形式,例如藉著注射或輸液,例如藉著團塊注射或連續輸液。在用來注射或輸液的產物之處,可採用在油性或含水媒劑中之懸浮液、溶液或乳劑的形式,且其可含有調配劑,像是懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。
雖然經過緩衝之共軛物溶液的穩定性,足夠短期的穩定性,但長期穩定性是不佳的。欲促進共軛物的穩定性,並增加其儲存壽命,可將抗體-藥物共軛物冷凍乾燥,成為無水的形式,在使用之前以適當的無菌液體重建。與蛋白質溶液之冷凍乾燥有關的問題,已完全記載於文獻中。在冷凍和乾燥的處理期間,可能發生二級、三級和四級結構的喪失。結果,可能必須納入低溫保護劑,作為共軛物的非晶形穩定劑,並在冷凍乾燥的處理期間,維持蛋白質的結構完整。在一個具體實施例中,可用在本發明中的低溫保護劑是糖醇,像是醛醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇及其組合。在另一個具體實施例中,該低溫保護劑是糖酸,包括醛糖酸、糖醛酸、醛酸及其組合。
本發明之低溫保護劑亦可以是碳水化合物。適當的碳水化合物是含有二或多個羥基基團的醛或酮化合物。該碳水化合物可以是環狀或直線的,並包括例如醛糖類、酮糖類、胺基糖類、醛醇類、肌醇類、醛糖酸、糖醛酸或醛酸,或其組合。該碳水化合物亦可以是單-、二-或多-碳水化合物,像是例如雙醣或多醣。適當的碳水化合物包括,例如甘油醛、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內酯、山梨糖、葡糖二酸、赤癬糖、蘇糖、阿拉伯糖、異構糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤癬酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神經胺糖酸,或其衍生物。適當的多碳水化合物包括,例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(像是例如菊糖)、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜膠、半乳卡洛羅糖、果膠、果膠酸、直鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原、澱粉果膠、纖維素、葡聚糖、石臍素、幾丁質、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、藻酸、黃酸樹膠或澱粉。其中特別有用的碳水化合物是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖及其組合。蔗糖是特別有用的低溫保護劑。
本發明之低溫保護劑最好是碳水化合物或“糖”醇,其可以是多元醇。多羥基化合物是含有一個以上羥基基團的化合物。多羥基化合物最好是直線的。適當之多羥基化合物,包括例如二元醇,像是乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇、甘油或季戊四醇或其組合。
在一些較佳的具體實施例中,該低溫保護劑是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇或山梨糖醇。
一旦調配,便可將本發明之組合物直接投予個體。待治療之個體可以是動物。然而,最好為了投藥給人類個體而修改該組合物。
可藉著幾個路徑投予本發明之組合物,包括但不限於口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、經皮、經皮下(參見PCT公開案第WO 98/20734)、皮下、腹腔內、鼻內、經腸、局部、舌下、陰道內或經直腸之路徑。亦可使用低壓噴霧(hyposprays)來投予本發明之組合物。通常,可將組合物製備成注射用的液態溶液或懸浮液。亦可製備適用於溶液或懸浮液的固體形式,在注射之前才放在液態媒劑中。
通常將藉著皮下、腹腔內、靜脈內或肌肉內注射,完成組合物的直接遞送,或遞送至組織的間質隙。亦可將組合物投予至病變內。給藥處理可以是單次給藥的時間表或多次給藥的時間表。
將知曉在組合物中的活性成份,將是胞毒藥物/蛋白質載體共軛物。它本身在胃腸道中,將是易被降解的。因此,若欲藉著使用胃腸道之路徑投予該組合物,該組合物將需要含有保護共軛物免於降解的製劑,但當它一旦被胃腸道吸收,便釋放出該共軛物。
可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N. J. 1991)中,獲得在藥學上可接受之載劑的徹底討論。
本發明特別提供用來治療增生性疾病之單體卡奇黴素衍生物/人類化抗-CD22抗體(G5/44),CMC-544,該增生性疾病之特徵為細胞在其表面表現CD22抗原。
本發明更進一步提供CMC-544在製造用來治療增生性疾病之組合物或醫藥品上的用途,該增生性疾病之特徵為細胞表現CD22。
CMC-544亦可用在各種治療中,其中希望降低出現在欲以在本文中揭示之組合物或醫藥品治療的個體中之表現CD22之細胞的含量。明確地說,使用該組合物或醫藥品來治療患有增生性疾病,即淋巴瘤和白血病的人類或動物,其在細胞表面表現CD22抗原。這些表現CD22的細胞可能在體內循環,或以不想要的大量侷限在體內的特定地方。
最好亦使用CMC-544來治療B-淋巴細胞家系的惡性腫瘤,包括淋巴瘤和白血病,最好是非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。可單獨使用CMC-544,或與其他生物活性劑併用,治療罹患B-細胞惡性腫瘤的個體。
常用的生物活性劑包括生長因子、細胞激動素和胞毒藥物。經常用來治療增生性疾病,像是癌症,並可與CMC-544一起使用的胞毒藥物,包括氨茴環黴素,像是阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、洋紅黴素I、諾加拉黴素、美諾立爾、匹塔路比星和瓦路比星,高達3天;以及嘧啶或嘌呤核苷,像是阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、環胞苷、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、脫氧溴尿苷、截瘤達、克拉君賓、地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、谷氏菌素、嘌羅黴素、替加氟、噻唑呋啉。其他可與CMC-544一起投予的化學治療/抗贅生物製劑,包括亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡鉑、環磷醯胺、甲嗪咪唑胺、長春花鹼、長春新鹼、米托蒽醌、博菜黴素、氮芥、強的松、丙卡巴肼、胺甲碟呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉醇及其各種類似物以及絲裂黴素。CMC-544可與這些治療劑中的一或多個同時投予。或者,可在投予這些治療劑中的一或多個之後,連續投予CMC-544。
亦可單獨、與其他作為治療療程之一部分的生物活性劑之組合,像是生長因子、細胞激動素、類固醇、諸如抗-CD20抗體、利妥昔單抗(美羅華TM
)之類的抗體,以及化學治療劑,同時或之後投予CMC-544。針對惡性淋巴增生性疾病之治療所確立的治療療程,包括CHOPP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松);COP(環磷醯胺、長春新鹼和強的松);CAP-BOP(環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、博菜黴素、長春新鹼和強的松);m-BACOD(胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松和甲醯四氫葉酸);ProMACE-MOPP(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(強的松、胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博菜黴素和長春新鹼);MACOP-B(胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、固定劑量的強的松、博菜黴素和甲醯四氫葉酸);MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼);ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺);以ABV(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花鹼)加以改變的MOPP;以ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺)加以改變的MOPP(氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼)以及ChlVPP(苯丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和強的松)。治療可包括誘導治療期、鞏固治療期和維持治療期。亦可單獨、與任何上文確認之治療療程,作為誘導治療期、鞏固治療期和維持治療期的一部分,同時或之後投予CMC-544。
本發明之共軛物亦可與其他生物活性劑和化學治療劑一起投予,作為治療復發性侵襲性淋巴瘤之組合化療攝生法的一部分。這類治療療程包括IMVP-16(異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);MIME(丙酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);DHAP(地塞米松、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);ESHAP(依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑);EPOCH(依托泊苷、長春新鹼和阿黴素96小時,加環磷醯胺之團塊劑量,並口服強的松);CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼、強的松和博菜黴素);CAMP(洛莫司汀、米托醌蒽、阿糖胞苷和強的松);CVP-1(環磷醯胺、長春新鹼和強的松);CHOP-B(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和博菜黴素);CEPP-B(環磷醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博菜黴素)以及P/DOCE(表柔比星或阿黴素、長春新鹼、環磷醯胺和強的松)。侵襲性淋巴瘤的額外治療療程可包括在第一階段中,利用CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松)-利妥昔單抗(美羅華TM
)-CMC-544的第一線治療,接著在第二和第三階段,利用CHOP-利妥昔單抗(美羅華TM
)、CHOP-CMC-544或CHOP-利妥昔單抗(美羅華TM
)-CMC-544。或者,第一階段可具有利用COP(環磷醯胺、長春新鹼和強的松)-利妥昔單抗(美羅華TM
)-CMC-544的第一線治療,接著在第二和第三階段,利用COP-利妥昔單抗(美羅華TM
)、COP-CMC-544或COP-利妥昔單抗(美羅華TM
)-CMC-544。在更進一步的具體實施例中,侵襲性淋巴瘤的治療可包括在第一階段中,利用抗體藥物共軛物CMC-544的第一線或第二線治療,接著在第二和第三階段中,利用CMC-544和CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松)、CMC-544和COP(環磷醯胺、長春新鹼和強的松)、CMC-544與利妥昔單抗(美羅華TM
)或僅有利妥昔單抗(美羅華TM
)。在另一個具體實施例中,侵襲性淋巴瘤的治療可包括利用抗體藥物共軛物CMC-544的第一線治療,接著在第二和第三階段中,僅利用CMC-544,或與其他治療療程組合,包括但不限於ESHOP(依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞苷、長春新鹼和順氯氨鉑);EPOCH(依托泊苷、長春新鹼和阿黴素96小時,加環磷醯胺之團塊劑量,並口服強的松);IMVP-16(異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷);ASHAP(亞德里亞黴素、甲潑尼龍琥珀酸鈉(solumedrol)、Ara-C和順氯氨鉑);MIME(丙酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷)以及ICE(異環磷醯胺、環磷醯胺和依托泊苷)。在本申請案中提供之可用在惡性化療中之胞毒藥物的細節,包括組合化療攝生法、劑量等等,均可在Cancer Principles and Practice of Oncology,編輯Vincent T. DeVita,Samuelo Hellman,Steven A. Rosenberg,第6版,出版商:Lippincott,Williams and Wilkins(2001)和Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual,編輯Edward Chu和Vincent T. DeVita,出版商:Jones and Bartlett,(2002)中找到。
本發明亦提供治療罹患或有增生性疾病危險之人類或動物個體的方法,該增生性疾病之特徵為細胞表現CD22,該方法包括對該個體投予有效含量的本發明之CMC-544。
在下文特定的工作實例中進一步描述本發明,其僅企圖進一步描述本發明,並非限制其範圍。
使用下列的選擇基準,從融合瘤中選出對抗CD22之抗體的名單:與Daudi細胞結合,在Daudi細胞上內化,與周圍血液單核細胞(PBMC)結合,在PBMC上內化,親和力(大於10-9
M),老鼠γ1和產生速率。選出5/44為較佳的抗體。
a)製備5/44融合瘤細胞,並從其中製備RNA
藉著傳統的融合瘤技術產製融合瘤5/44,接著以人類CD22蛋白質免疫老鼠。使用RNEasy套組(Qiagen,Crawley,UK;目錄第74106號),從5/44融合瘤細胞中製備RNA。按照下述,將所獲得的RNA逆轉錄成cDNA。
b)將CD22分布在NHL腫瘤上
進行免疫組織化學研究,使用5/44抗-CD22單株抗體,檢查發生率和染色的分布。在研究中併入對照的抗-CD22和抗-CD79a抗體,證實腫瘤的B細胞面積。
總共研究50個腫瘤,如下藉著Working Formulation和REAL分類系統將這些腫瘤分類:
‧ 7個B淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤(高/I)
‧ 4個B-CLL/小淋巴細胞性淋巴瘤(低/A)
‧ 3個類淋巴漿細胞(lymphoplasmacytoid)/免疫細胞瘤(低/A)
‧ 1個外層細胞(中等/F)
‧ 14個濾泡中心淋巴瘤(低至中等/D)
‧ 13個瀰漫性大細胞淋巴瘤(中等至高/G,H)
‧ 6個無法分類的(K)
‧ 2個T細胞淋巴瘤
利用0.1微克/毫升之5/44抗體,40個B細胞淋巴瘤對CD22抗原是陽性的,而另有6個在濃度增加至0.5微克/毫升時變成陽性的。有2個B細胞腫瘤在0.1微克/毫升時仍維持陰性,但剩下的組織不夠在高濃度下進行測試。然而,利用命名為6/13的其他抗-CD22抗體(Celltech,Slough,UK)進行平行測試,其給予比5/44更強的染色,結果所有48個B細胞淋巴瘤對CD22均為染色陽性的。
因此,可推論CD22抗原在B細胞淋巴瘤上廣泛地表現,並因此在NHL中提供適合免疫療法的標靶。
c)5/44 VH
和VL
的PCR選殖
使用逆轉錄酶合成編碼5/44重和輕鏈之可變功能部位的cDNA序列,產生出現在總RNA中之mRNA的單股cDNA副本。然後藉著聚合酶連鎖反應(PCR),使用專一的寡核苷酸引子,用這個作為模板,擴大老鼠的V-區序列。
i) cDNA合成
在20微升含有下列製劑的反應體積中,合成cDNA:50 mM Tris-HCl pH 8.3,75 mM KCl,10 mM二硫蘇糖醇,3 mM MgCl2
,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.5 mM,20單位RNA素(RNAsin),75毫微克隨機的六核苷酸引子,2微克5/44 RNA和200單位莫洛尼老鼠白血病病毒逆轉錄酶。在42℃下培養60分鐘之後,藉著加熱至95℃ 5分鐘,中止該反應。
ii) PCR
使等份的cDNA接受PCR,使用對重和輕鏈專一的引子組合。設計降解引子集合,與信號肽之保留序列黏接,用來作為前進引子。這些序列均按順序含有限制位置(VL
Sful;VH
HindIII),從其5'端的7個核苷酸開始,序列GCCGCCACC(序列識別50號),容許所得的mRNAs、開始密碼子以及以已知老鼠抗體之前導肽序列為基礎的20-30個核苷酸(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,1991,U.S. Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health),進行最佳的轉譯。
設計跨越抗體之架構4 J-C接合點,並含有有助於選殖VL
PCR片段之酵素BsiWI限制位置的3’引子。重鏈3’引子是設計成跨越抗體之J-C接合點的混合物。3’引子包括有助於選殖的Apal限制位置。引子的3’區含有以在已知老鼠抗體中發現的那些(Kabat等人,1991,在前)為基礎的混合序列。
上述的引子組合,使得VH
和VL
的PCR產物,能夠直接被選殖到適當的表現載體(參見下文)內,產生嵌合型(老鼠-人類)重和輕鏈,並使那些在哺乳動物細胞中表現的基因,產生想要同型物的嵌合型抗體。
如下建立PCR的培養(100微升)。每個反應含有10 mM Tris-HCl pH 8.3,1.5 mM MgCl2
,50 mM KCl,0.01%重量/體積的明膠,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25 mM,10微微莫耳的5’引子混合物,10微微莫耳3’引子,1微升cDNA和1單位Taq聚合酶。在95℃下培養該反應5分鐘,然後經過94℃ 1分鐘,55℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘的循環。在30次循環之後,在瓊脂糖凝膠上,藉著電泳分析每個反應的等份。
至於重鏈V-區,僅在以在架構1的起點內黏接之引子集合置換信號肽引子集合時,才獲得已擴大之DNA產物。將該片段選殖到DNA定序載體內。定出DNA序列並轉譯,得到推衍的胺基酸序列。藉著參考以實驗判定的N-終端蛋白質序列,證實該推衍的序列。圖1顯示老鼠單株抗體5/44之CDRs的胺基酸序列。圖2和3分別顯示老鼠單株抗體5/44之成熟輕和重鏈V-區的DNA/蛋白質序列。
iii) PCR片段的分子選殖
然後將老鼠的V-區序列選殖到表現載體pMRR10.1和pMRR14內(圖7和8)。這些是表現含有編碼人類κ輕鏈和人類γ-4重鏈之DNA的輕和重鏈的載體。藉著限制消化,將VL
區繼代選殖到表現載體內,並連接定序載體,使用Sful和BsiWI限制位置,創造出質體pMRR10(544cL)(圖8)。藉著PCR擴大重鏈DNA,使用5'引子引入信號肽,因為未在選殖策略中獲得這個-使用得自不同的機構內融合瘤(稱為162)之老鼠重鏈抗體前導。5'引子具有下列的序列:5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’(序列識別51號)。
逆向引子與在原始之VH
基因選殖中使用的相同。將以酵素HindIII和ApaI消化而獲得之PCR產物繼代,並證實其DNA序列,創造出質體pMRR14(544cH)(圖7)。將兩個表現載體暫時地共同-轉移感染到CHO細胞內,產生嵌合型c5/44抗體。使用脂染胺(Lipofectamine)試劑,根據製造者的草案(InVitrogen: Life Technology,Groningen,The Netherlands.目錄第11668-027號)完成之。
在CDR-H2中觀察到可能的N-連接糖基化作用位置序列,具有胺基酸序列N-Y-T(圖3)。5/44及其片段(包括Fab)的SDS-PAGE、西方墨點和凝膠之碳水化合物染色,指出該位置確實是糖基化了的(未顯示)。此外,在CDR-H2內的暴露位置,觀察到離胺酸殘基,其藉著對抗體可與其共軛之製劑提供額外的共軛位置,而具有降低抗體之結合親和力的潛力。
使用PCR策略,在CDR-H2序列內導入胺基酸取代,企圖移除糖基化作用位置及/或反應性離胺酸,如同在圖4中所示。使用編碼突變N55Q、T57A或T57V的前進引子,移除糖基化作用位置(圖4),並產製含有取代K60R的第四個前進引子,移除反應性離胺酸殘基(圖4)。在這些PCR擴大作用的每一個中,使用架構4逆向引子。以酵素XbaI和ApaI消化PCR產物,並插入pMRR14(544cH)(亦利用XbaI和ApaI切開)內,產生編碼這些突變種的表現質體。N55Q、T57A和T57V突變,藉著使胺基酸序列改變,遠離一致序列N-X-T/S,剝奪了糖基化作用位置,而K60R突變亦利用類似的帶正電殘基精胺酸,置換了可能具有反應性的離胺酸。以cL質體共同-轉移感染所得的cH變種質體,產生經過表現的嵌合型抗體變種。
在暫時地轉移感染至CHO細胞內之後,評估嵌合型基因的活性,並藉著BiaCore分析,判定親和力常數。
使用BIA技術,針對與CD22-mFc構築體的結合,調查已經移除其糖基化作用位置或其反應性離胺酸之嵌合型5/44或其變種的親合力。在圖9中出示該結果。所有的結合測定均以BIAcoreTM
2000儀器(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)進行。藉著經由已經固定之抗-老鼠Fc捕捉CD22mFc,來進行測定。抗體是在可溶相中。將試樣、標準物和對照組(50微升)注射在已經固定的抗-老鼠Fc上,接著是在可溶相中的抗體。在每次循環之後,以30微升/分鐘,使用50微升40 mM HCl,使表面再生。使用BIA評估3.1軟體(Pharmacia),進行動力學分析。
在構築體T57A中移除糖基化作用位置,與嵌合型5/44相比較,結果產生稍快的開-速率和明顯較慢的關-速率,得到大約5-倍的親和力改良。N55Q突變種對親和力並無影響。該結果是沒有預料到的,因為它暗示碳水化合物本身的移除,對結合作用似乎沒有影響(如同N55Q的改變)。僅對T57A的改變,觀察到改良的親和力。一種可能的解釋為與碳水化合物的存在無關,移除在位置57處對結合作用發揮負面影響的蘇胺酸,將蘇胺酸轉變為丙胺酸。丙胺酸之小尺寸是重要的,且蘇胺酸的負面影響與其尺寸有關之假說,得到使用T57V突變作用所獲得之結果的支持:在位置57處以纈胺酸置換,不是有利的(結果未顯示)。
藉著K60R突變移除離胺酸殘基,對親和力有中立的影響,即導入精胺酸殘基,移除可能的反應性位置,並沒有損害親和力。
因此,移除糖基化作用位置和移除反應性離胺酸的突變,兩者均被包含在人類化作用的設計中。
在上文中已經針對5/44抗體之重和輕鏈的可變區,描述了基因的分子選殖,及其產製嵌合型(老鼠/人類) 5/44抗體的用途。在圖2和3中,分別出示老鼠之5/44 VL
和VH
功能部位的核苷酸和胺基酸序列(序列識別7和8號)。本實例描述5/44抗體在人類架構上的CDR-移植,在人類中降低可能的免疫原性,根據Adair等人的方法(PCT申請案第WO 91/09967號)。
與得自人類亞-組Iκ輕鏈V區之一致序列的蛋白質序列排列,指出64%的序列同一性。所以,為了建構CDR-移植之輕鏈,選出與人類VK亞-組I生殖種系O12,DPK9序列一致的接受者架構區。架構4接受者序列係衍生自人類J-區生殖種系序列JK1。
在圖5中提供老鼠5/44之架構區與接受者序列的胺基酸序列比較,並顯示在捐贈者和接受者鏈之間有27個差異。在每個位置,進行老鼠殘基促成抗原結合之可能性的分析,直接或間接地經由對包裝或在VH
/VL
界面之影響。若認為某個老鼠殘基是重要的,並從尺寸、極性或電荷的觀點來看,與人類殘基有充分的差異,此時便保留該老鼠殘基。以該分析為基礎,建構兩個版本的CDR-移植輕鏈,具有在序列識別19號和序列識別20號(圖5)中提供之序列。
使用與針對輕鏈描述的相同的策略,完成5/44重鏈的CDR-移植。發現5/44重鏈之V-功能部位,是與屬於亞-組I之人類重鏈同種的(70%序列同一性),並因此使用人類亞-組I生殖種系架構VH1-3,DP7作為接受者架構。架構4接受者序列係衍生自人類J-區生殖種系序列JH4。
在圖6中出示5/44重鏈與架構區的比較,其中可看出在22位置處,5/44重鏈與接受者序列有所不同。對於任何可促成抗原結合的分析,導致建構5個版本的CDR-移植重鏈,具有在序列識別23號、序列識別24號、序列識別25號、序列識別26號和序列識別27號中提供之序列(圖6)。
設計基因,使其編碼移植序列gH1和gL1,並設計和建構一連串重疊的寡核苷酸(圖10)。使用PCR裝配技術,建構CDR-移植之V-區基因。建立100微升之反應體積,含有10 mM Tris-HCl pH 8.3,1.5 mM MgCl2
,50 mM KCl,0.001%明膠,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25 mM,“部,引子(T1、T2、T3、B1、B2、B3)各1微微莫耳,‘外部’引子(F1、R1)各10微微莫耳和1單位Taq聚合酶(AmpliTaq,Applied BioSystems,目錄第N808-0171號)。PCR循環參數是94℃ 1分鐘,55℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘,30次循環。然後在1.5%瓊脂糖凝膠上跑該反應產物,切下並使用QIAGEN自旋管柱(QIAquick凝膠萃取套組,目錄第28706號)回收。以30微升之體積洗脫DNA。然後根據製造者的指示,將等份(1微升)的gH1和gL1 DNA選殖到InVitrogen TOPO TA選殖載體pCR2.1 TOPO(目錄第K4500-01號)內。該非-表現載體係作為選殖中間物,有助於大量純種系的定序。使用利用載體-專一之引子定序的DNA,確認含有gH1和gL1的正確純種系,創造出質體pCR2.1(544gH1)和pCR2.1(544gL1)(圖11和12)。
使用寡核苷酸卡匣置換法,創造人類化移植物gH4、5、6和7,以及gL2。圖13顯示寡核苷酸卡匣的設計。欲建構每個變種,利用所示之限制酵素(重鏈為XmaI/SacII,輕鏈為XmaI/BstEII),切開載體pCR2.1(544gH1)或pCR2.1(544gL1)。從瓊脂糖中以凝膠純化大的載體片段,並用來與寡核苷酸卡匣連接。這些卡匣由2個互補寡核苷酸組成(在圖13中出示),在200微升體積之12.5 mM Tris-HCl pH 7.5,2.5 mM MgCl2
,25 mM NaCl,0.25 mM二硫蘇糖醇中,以0.5微微莫耳/微升之濃度混合。藉著在水浴(體積500毫升)中加熱至95℃ 3分鐘,然後容許該反應慢慢-冷卻至室溫,而完成黏接。然後在連接到適當切開的載體內之前,以水稀釋已黏接之寡核苷酸卡匣10-倍。使用DNA定序,證實正確的序列,創造出質體pCR2.1(5/44-gH4-7)和pCR2.1(5/44-gL2)。然後將已經確證的移植序列,繼代選殖到表現載體pMRR14(重鏈)和pMR10.1(輕鏈)內。
以各種組合,與原始的嵌合型抗體鏈一起,將編碼移植變種的載體共同-轉移感染到CHO細胞內。在競爭性測定中比較結合活性,使對原始之老鼠5/44抗體的結合與對Ramos細胞(獲自ATCC,一種表現表面CD22之伯吉特氏(Burkitt’s)淋巴瘤淋巴母細胞人類細胞株)的結合競爭。認為該測定是比較移植物與細胞表面CD22結合之能力的最佳方法。在圖14和15中出示該結果。如同可看到的,在任何移植物之間有極少的差異,在對抗老鼠親代的競爭中,所有均比嵌合型更有效地進行,在CDR-H2之末端(gH6和gH7)導入3個額外的人類殘基,似乎不影響結合作用。
選出具有最少數目之老鼠殘基gL1gH7的移植組合。輕鏈移植物gL1具有6個供體殘基。殘基V2、V4、L37和Q45可能是重要的包裝殘基。殘基H38是在VH
/VL
界面處。殘基D60是靠近CDR-L2的表面殘基,並可直接促成抗原的結合。在這些殘基中,發現在人類κ基因之生殖種系序列中的V2、L37、Q45和D60,來自其他的亞-組。重鏈移植物gH7具有4個捐贈者架構殘基(在CDR-移植使用的結構定義之下,認為殘基R28是CDR-H1的一部分(參見Adair等人(1991),PCT申請案第WO 91/09967號))。殘基E1和A71是靠近CDRs的表面殘基。殘基148是可能的包裝殘基。殘基T93出現在VH
/VL
界面處。在這些殘基中,發現E1和A71是在人類亞-組I的其他生殖種系基因中。發現殘基148是在人類生殖種系亞-組4中,並發現T73是在人類生殖種系亞-組3中。
在圖16中顯示輕鏈和重鏈兩者的完整DNA和蛋白質序列,包括由載體提供之在恆定區基因內的插入序列之約略位置,並分別在序列識別29號和序列識別28號中提供輕鏈的,並分別在序列識別31號和序列識別30號中提供重鏈的。
從這些載體中切下編碼這些輕和重鏈基因的DNA。在5’HindIII位置處消化重鏈DNA,然後以大腸桿菌DNA聚合酶I的克勒諾片段處理,創造出5'弄鈍的末端。在3’EcoRI位置處切開,結果產生重鏈片段,從瓊脂糖凝膠中將其純化。以相同之方式,產生輕鏈片段,在5’SfuI位置處弄鈍,並帶有3’EcoRI位置。將兩個片段選殖到以DHFR為基礎的表現載體內,並用來在CHO細胞內產製穩定的細胞株。
在代表性的共軛反應中,將人類化抗-CD22抗體(G5/44)與NAc-γ卡奇黴素DMH AcBut OSu(卡奇黴素衍生物)共軛(參見圖17),其中標靶蛋白質濃度為7.5毫克/毫升,且標靶卡奇黴素衍生物的裝載,按蛋白質之重量計,為8.5%。標靶反應pH值為8.5±0.2,而其他反應成分的標靶濃度如下:50 mM N-(2-羥乙基)六氫吡-N'-(4-丁烷磺酸)(HEPBS),37.5 mM癸酸鈉以及9%體積/體積的總乙醇。在33±2℃下進行反應1小時。在純化之前,該代表性反應的分析結果如下:蛋白質:7.34毫克/毫升;卡奇黴素裝載:82.7微克/毫克;聚集體:93.25%以及未共軛的蛋白質(LCF):1.07%(按HPLC計之UV面積%)。
測試各種界面活性劑添加劑及其濃度對產物產量和純度的影響,以便判定其對共軛單體之產製的影響(參見表2)。在每件事均維持不變,除了添加劑及其濃度之外,執行該反應。就蛋白質濃度、卡奇黴素裝載、聚集體內含量和LCF,分析得自這些反應的共軛產物。雖然所有範圍在C6
(己酸)至C12
(十二烷酸)內的正-羧酸均提供可接受的結果,但在濃度範圍30 mM至50 mM之癸酸中,觀察到最佳的整體結果(低LCF、低聚集體和單體共軛物的高回收)。
雖然確認丁基瓊脂糖4速流為最佳的HIC介質,但可獲得之可接受的結果,與使用其他樹脂,像是辛基瓊脂糖速流、PPG-600C(Tosoh Biosep)、Fractogel EMD丙基(EM Processing)和Source 15ISO(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的層析法條件,稍有出入。
純化的起始物質是含有7.2毫克/毫升蛋白質,以83微克/毫克之卡奇黴素衍生物裝載,具有10.1%聚集體內含量(按HPLC計之面積%)和5.6% LCF內含量(以HPLC計之面積%)的共軛反應混合物。
在完成共軛反應之後,藉著加入磷酸鉀溶液至終磷酸濃度為0.7 M(pH 8.2),將反應混合物稀釋四倍。在混合之後,通過0.45-微米的濾紙過濾該溶液。將經過稀釋之溶液裝入丁基瓊脂糖4速流管柱中。裝入管柱中的蛋白質總量為每毫升床體積29毫克。在以0.7 M磷酸鉀沖洗之後,使用從0.7 M至4 mM磷酸鉀,pH 8.2的梯度洗脫管柱。收集在梯度中洗脫出的溶離份,進行進一步的處理,該集合由單體共軛物組成,帶有分別低於1面積%的聚集體和LCF。將該集合裝入交聯葡聚糖G-25(Amersham Biosciences)脫鹽管柱中,交換成適合調配的緩衝溶液,其由20 mM Tris-Cl和100 mM氯化鈉,pH 8.0組成。經過純化、交換緩衝溶液的CMC-544製品,具有下列特性:卡奇黴素裝載:81微克/毫克;聚集體:0.4%(按HPLC計之面積%);LCF:0.8%(按HPLC計之面積%)。
在結合測定中,分析藉著上文之共軛方法產製的帶有卡奇黴素之人類化抗-CD22抗體(G5/44)的免疫共軛物(CMC-544),判定使用改良方法產製的共軛物,是否對抗原結合作用具有任何不利的影響。表3顯示該共軛製程,對抗體之抗原結合親和力,沒有任何影響。藉著舊或新共軛製程製造的CMC-544免疫共軛物,以相同之親和力與標靶抗原結合,其與未共軛抗體G5/44的親和力沒有差異。
使用BIAcore 2000(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)進行生物感應器分析。將CD22mFc共價固定在N-羥基琥珀醯亞胺-激活之羧甲基葡聚糖塗覆的生物感應晶片(CM5)上,使用標準胺-偶聯化學,以大約2000共振單位的蛋白質密度。以HBS緩衝溶液(10 mM HEPES,pH 7.4,含有150 mM NaCl,3 mM EDTA和0.005%多乙氧基醚20(體積/體積))稀釋CMC-544或G5/44的試樣,並以1至100 nM之濃度範圍,以30微升/分鐘之流速,注射在CD22mFc-塗覆之生物感應晶片的表面上3分鐘,容許結合。在結合期之後,藉著在15分鐘的期間內,以HBS緩衝溶液沖洗晶片,監視已結合抗體的解離。藉著以15微升再生緩衝溶液(10 mM NaOH和200 mM NaCl)沖洗生物感應晶片30秒,使抗原性表面再生,接著在下一次循環之前,有2分鐘的穩定時間。藉著非線性最小二乘方回歸分析,使用1:1蘭格謬爾(Langmuir)結合曲線吻合模式和BIA評估程式(3.0版,BIAcore),計算動力學常數。藉著表面等離子體激光共振分析,使用共價固定在生物感應晶片上的CD22mFc,評估CMC-544的抗原結合作用。CMC-544和G5/44與CD22mFc結合之動力學分析的結果,在補償質量傳遞,使資料全面地吻合1:1蘭格謬爾結合模式之後,顯示CMC-544和未共軛之G5/44兩者與CD22結合,具有類似的親和力(CMC-544:CD22 KD
=200 pM;G5/44:CD22 KD
=235 pM)。與卡奇黴素的共軛作用,不影響G5/44有效結合CD22mFc的能力。
亦藉著流動細胞計數法,檢查CMC-544和G5/44與在B淋巴瘤細胞表面上表現之CD22的結合作用。在本評估中,使用抗-CD33 mAb吉姆單抗(gemtuzumab)(hP67.6)及其卡奇黴素共軛物CMA-676(滅髓瘤(gemtuzumab ozogamicin)),作為可匹敵之同型物的對照組。使用利妥昔單抗(美羅華TM
),一種嵌合型人類IgG1抗-人類CD20 mAb,作為陽性對照組。亦使用經過純化的人類多株IgG1和IgG4作為陰性對照組。CMC-544和G5/44與在Ramos或RL BCL上之CD22的結合作用是類似的,並可與人類多株IgG4區別。RL BCL展現出比Ramos BCL更低的CD22之表面表現。相反的,CMA-676或gL1gH7對BCL的結合作用,類似與人類多株IgG4的結合,符合其缺乏CD33的表現(資料未顯示)。相同的細胞證實了抗-CD20利妥昔單抗(美羅華TM
)的強結合。不像hP67.6和CMA-676,證實CMC-544和G5/44沒有任一個與CD22-
CD33+
HL-60白血病細胞結合(資料未顯示)。這些結果暗示G5/44與卡奇黴素的共軛作用,不影響其抗原專一性。CMC-544專一地認出在人類B細胞上的CD22,但不認得在老鼠、大鼠、狗、豬或靈長類(獼猴和恆河猴)B細胞上的(資料未顯示)。
在活體外生長的CD22+
B-細胞淋巴瘤細胞株,RL、Daudi、Raji和Ramos上,比較藉著使用CMA-676和CMC-544法製造之CMC-544的影響。使用瞄準人類CD33的可匹敵之同型物的卡奇黴素共軛物(CMA-676),反映共軛物的抗原-非-專一性影響。在本評估中,使用未共軛之N-Acγ卡奇黴素DMH(在酸性水解作用時,從共軛物中釋放出藥物),指出在所使用的這些細胞株中,每一個都是對卡奇黴素之致命影響敏感的。表4顯示這些評估的結果,是以卡奇黴素之當量為基礎,而表5則以共軛抗體蛋白質的濃度來表現這些結果。CD22-調節將卡奇黴素遞送至CD22+
細胞,在殺死標靶細胞方面,比未共軛藥物本身至少更有效10倍。可匹敵之同型物的對照組共軛物(CMA-676)所顯示出的胞毒性,比未共軛之卡奇黴素衍生物更低或與其類似。從表4中,似乎藉著CMC-544共軛法製造的共軛物,可在比藉著CMA-676共軛法製造之共軛物更低的抗體濃度下,產製相等的胞毒影響。
在活體內的胞毒性。在B-細胞淋巴瘤異種移植中,進一步評估藉著CMC-544法製造的CMC-544。在這些研究中,使用兩個B-細胞淋巴瘤腫瘤,RAMOS和RL。RL淋巴瘤是非-伯吉特氏NHL-衍生物的細胞株,而RAMOS則是一開始衍生自伯吉特氏淋巴瘤的。在圖18中出示的代表性實驗中,顯示CMC-544及其老鼠抗體配對物,以劑量-依賴性之方式,有效地抑制了RAMOS B-細胞淋巴瘤的生長。
顯示人類化抗體的共軛物,比其老鼠配對物更有效。在本研究中,能夠引起淋巴瘤之明顯生長抑制的最低劑量之卡奇黴素共軛物,為10微克/公斤之共軛的NAc-γ卡奇黴素DMH。相反的,未共軛的抗體G5/44,以類似共軛物之時間表,腹腔內投予10毫克/公斤,對腫瘤生長沒有影響。
使用RL淋巴瘤模式,進行類似的研究。表6顯示三個獨立實驗的組合分析,其中在在裸鼠上,分期至尺寸300-400毫克之RL NHL腫瘤中,評估CMC-544之抗-腫瘤效果。在3-週的時間體制內,CMC-544以劑量依賴之方式引起腫瘤退化。從這些研究的統計分析中,建立CMC-544在RL淋巴瘤模式中的最低有效劑量,以卡奇黴素內含量為基礎,為20微克/公斤。在這三個研究的任一個中,都沒有死亡。較高劑量(60-320微克/公斤)的CMC-544,幾乎導致RL淋巴瘤的完全退化。總而言之,藉兩個B-細胞淋巴瘤模式所獲得的結果,清楚地證實了CMC-544引起腫瘤退化的能力。
亦使用RAMOS和RL淋巴瘤模式兩者,調查藉著新製程製造之CMC-544抑制廣泛建立之B-細胞淋巴瘤異種移植之生長的能力。容許腫瘤生長,並在腹腔內投予CMC-544或可匹敵之同型物的陰性對照組共軛物(CMA-676)之後,分期至1.5或2克的腫瘤團塊,在第1、5和9天時,以160微克/公斤之共軛的卡奇黴素,維持給藥的原始時間表。相同的給藥時間表,顯示較早引起小的分期腫瘤之長期持續的退化(參見表6)。如同在圖19中所示,對攜帶大的RAMOS淋巴瘤之老鼠投予CMC-544,導致預先存在之淋巴瘤團塊的逐漸退化,並在20天之後,4隻攜帶腫瘤的老鼠中,有3隻沒有腫瘤了。監視這些沒有腫瘤的老鼠最多50天,未顯示任何已退化之RAMOS淋巴瘤的再度生長。相反的,可匹敵之同型物的對照組,CMA-676,對腫瘤的生長沒有影響。5隻CMA-676處理之攜帶大腫瘤的老鼠中,4隻在第15天之前就被犧牲了,因為牠們的腫瘤負荷達到接近其體重的15%。
在RL淋巴瘤模式中,進行使用CMC-544的類似實驗。按照前述,在類似的時間表上,以160微克/公斤之劑量,腹腔內注射CMC-544,在30天內引起>90%之RL淋巴瘤的現存團塊退化。然而,在45天之後,在這組中具有已萎縮之淋巴瘤的2隻老鼠顯示出腫瘤的再度-生長。這些結果表示CMC-544能夠導致小的和大的已確立之淋巴瘤的退化。在本文中未顯示的少數研究中,再度以CMC-544再處理在最初CMC-544-引起的退化之後,散發性地再度-生長之RL淋巴瘤。這些研究顯示RL腫瘤仍對利用CMC-544處理的第二次過程產生反應,並再度退化。因此,利用CMC-544的處理,可有效對抗小和大質量的B-細胞淋巴瘤,並具有重複治療的效力。
圖20顯示其中使用標準給藥時間表,使攜帶分期之RL淋巴瘤的老鼠接受兩種不同劑量(80和320微克/公斤共軛的卡奇黴素)、使用CMA-676共軛法和CMC-544共軛法製造的CMC-544之代表性實驗的結果。如同預期的,觀察到抗-腫瘤效力是劑量-依賴性的,且在兩種CMC-544製品的效力上並沒有差異。相反的,以160微克/公斤,腹腔內投予未共軛之N-乙醯基-γ卡奇黴素DMH,是無活性的。然而,應該強調的是,對每個劑量的共軛卡奇黴素而言,以共軛物形式投予之抗體蛋白質的含量,藉著CMA-676法製造的CMC-544比藉著CMC-544法製造的更高4倍。因為瞄準共軛物的卡奇黴素內含量,主要負責引起抗-腫瘤的效果,可能經由使用新製程製造之共軛物,來遞送卡奇黴素時所需要的用量,比瞄準抗體的量少很多。在效力上,增加藉著CMC-544法製造之共軛物的裝載,係歸因於缺乏大量的低共軛部分(LCF)。
下一個欲探究的問題,是在停止市售之抗-CD20利妥昔單抗(美羅華TM
)治療之後生長的B-細胞淋巴瘤,是否仍將對CMC-544治療有反應。為了這個目的,以利妥昔單抗(美羅華TM
)處理正在發育中(未分期)的RL淋巴瘤3週。只要繼續利妥昔單抗(美羅華TM
)治療,便抑制RL淋巴瘤的生長。當停止利妥昔單抗(美羅華TM
)治療時,RL淋巴瘤迅速地生長至大約1克團塊的尺寸,此時以160微克/公斤之腹腔內劑量的CMC-544處理它們。如同在圖21和22中所示,這些RL淋巴瘤仍對CMC-544起反應,有80%的老鼠在60天後變成沒有腫瘤的。因此,CMC-544能夠以3個劑量引起B-細胞淋巴瘤的退化,這僅能藉著連續的利妥昔單抗(美羅華TM
)給藥抑制之。
評估CMC-544與CD22的結合作用,並評估其在在活體外和在活體內之模式中的活性。亦比較CMC-544和CMA-676,hP67.6(IgG4)與AcBut連接之卡奇黴素的可匹敵之同型物的對照組共軛物,和利妥昔單抗(美羅華TM
),一種嵌合型IgG1抗-CD20 mAb(IDEC Pharmceuticals,San Diego,CA),其為市售的,並購自Medworld Pharmacy(Chestnut Ridge,NY)。在G5/44結合功能部位研究中,使用下列的抗體:BU12(Celltech,Slough,UK);BLCAM,HD239(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA);RFB-4(Ancell Corp,Bayport,MN);SHCL-1,Leu 14(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ);4KB128和To 15(Dako Corp,Carpinteria,CA);M6/13和M5/44(Celltech,Slough,UK)。在阻斷研究中使用的額外抗體是SJ10(Immunotech,Fullerton,CA)和M17.1.1,M19.1.1,M38.1.1(Celltech Slough,UK)。可供研究的細胞株包括伯吉特氏淋巴瘤細胞株Ramos(CRL-1923)和非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)細胞株RL(CRL-2261),均獲自美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collection)。藉著聚合酶連鎖反應黴漿菌檢測測定(ATCC,Manassas,VA),判定細胞株是無黴漿菌的。在加入10% FBS,10 mM HEPES,1 mM丙酮酸鈉,0.2%葡萄糖,青黴素G鈉100單位/毫升和硫酸鏈黴素100微克/毫升的RPMI培養基中,以懸浮培養物之形式維持細胞株。
藉著BIAcore分析,使用固定Fc-CD22之BIAcore CM5晶片,評估G5/44是否可抑制對CD22具有已知專一性之老鼠mAbs的結合作用。比較先前有或無已固定之Fc-CD22與G5/44的飽和作用,所獲得的表面等離子體激光共振單位(RU)。使用BIACORE 2000進行生物分子交互作用分析。使抗體越過空白的對照組表面(流動池1,作為對照組,沒有蛋白質被偶聯),和Fc-CD22之測試表面(流動池2),經由胺偶聯化學,以9,042 RU之含量,固定在CM5感應晶片上。所得的感應器圖(sensorgram),是在流動池2上的反應(RU)減在流動池1上的反應(RU)。藉著首先以G5/44(100微克/毫升)使流通池飽和,在導入先前已經定出其結合特徵之對抗CD22的老鼠mAbs,獲得第二個感應器圖。在測量G5/44反應時,立刻分別灌注老鼠抗-CD22 mAbs,不移除G5/44。亦記錄產生第二個混合反應,歸因於老鼠抗-CD22 mAb對G5/44-塗覆之CD22的結合作用。若老鼠抗體是在與被G5/44佔據的那些無關之位置與CD22結合,此時混合的反應將是加成的。若G5/44對CD22之結合作用,干擾或妨礙了二級抗體的結合作用,此時混合的反應將不是加成的。針對G5/44:CD22交互作用的“關閉速率”,修正每個二級混合測量。
G5/44僅阻斷與CD22之抗原決定位A/類Ig功能部位1(SHCL1 Leu 14和HD239)結合的那些抗體的結合,表示G5/44亦在CD22的該功能部位中結合。與CD22之抗原決定位B/類Ig功能部位3(RFB-4)、CD22之抗原決定位C/類Ig功能部位4(To 15)和CD22之類Ig功能部位2(4KB128)結合的抗體,不會被G5/44阻斷。這些結果表示在CD22上的G5/44-結合位置,係位在第一個類Ig功能部位,因為它阻礙了那些認得CD22的第一個類Ig功能部位(抗原決定位A)之抗-CD22 mAbs的結合作用。其他的抗-CD22抗體,M6/13(Celltech,Slough,UK),具有未知的感受性,亦被G5/44阻斷(Celltech,Slough,UK),因此對CD22之抗原決定位A/類Ig功能部位1,進行M6/13的結合位置作圖。抗體M5/44,G5/44的老鼠親代,具有與G5/44相同的專一性,抑制G5/44的結合,並作為陽性對照組。抗-CD19抗體BU12則在這些評估中,作為陰性對照組。在表7中概述結果。
使用對CD22之個別功能部位具有已知結合專一性的老鼠mAbs,調查G5/44阻斷這些抗體與B細胞結合的能力。此外,亦調查mAbs阻斷G5/44與B細胞結合的能力。在這些研究中,在使細胞暴露在G5/44(10微克/毫升)下之前,先在4℃下,使1x105
個Ramos細胞暴露在老鼠抗-CD22抗體(10微克/毫升之人類化G5/44或老鼠單株抗-CD22)下1小時。在4℃下培養細胞額外1小時。在抗體處理之後,吸移B細胞,並以PBS-1% BSA沖洗,並在4℃下,加入100微升,以PBS-1% BSA1:100稀釋之適當的二級抗體(FITC-山羊抗-人類(重和輕鏈)或FITC-山羊抗-老鼠(重和輕鏈))30分鐘。再度吸移細胞,沖洗,並再懸浮於PBS-1% BSA中,然後加至含有250微升PBS-1%甲醛的試管中。藉著流動細胞計數,使用BD FACSort流動細胞計數器,測量與細胞結合的螢光強度。
結果顯示之前使CD22+ B細胞暴露在G5/44下,結果導致後續抗-CD22 mAbs M5/44和M6/13之結合作用的明顯抑制。相反的,抗-CD22 mAbs RFB4,To 15,HD239和4KB對B細胞的結合作用,並未被G5/44抑制。藉著流動細胞計數,檢測到缺乏G5/44對HD239與B細胞結合的明顯抑制是意料之外的,尤其是因為BIAcore分析指出,G5/44可阻斷HD239對CD22的結合作用。可以在其對CD22之相對親和力上的差異為基礎,來解釋缺乏G5/44對HD239結合的強抑制作用。當針對其抑制G5/44對CD22+ B細胞之結合作用的能力,檢查上文的老鼠抗-CD22 mAbs時,SCHL1和M6-13,但不是其他抗-CD22 mAbs,抑制了G5/44的結合作用。已經對CD22的第一個類Ig功能部位,進行HD239和SHCL1之結合抗原決定位的作圖。然而,並未對由M6/13或M5/44認出的抗原決定位作圖。上文詳述的阻斷研究,指出上文的抗體認得位在CD22之第一個類Ig功能部位上的抗原決定位,集體地稱為抗原決定位A。
將2萬個Ramos細胞與各種劑量的CMC-544,有或無利妥昔單抗(美羅華TM
),一起培養96小時。在96小時之後,藉著流動細胞計數,分析藉著碘化丙錠(Propidium iodide)排阻測量的細胞存活力。計算3至6孔的平均存活力,並對各種處理計算細胞存活力的劑量反應抑制。從濃度0之CMC-544,計算細胞存活力的背景反應抑制。使用對數回歸,測試CMC-544是否在0.01至3毫微克之卡奇黴素DMH/毫升的劑量範圍內,引起在統計上顯著之Ramos細胞生長的劑量依賴性抑制作用。亦使用對數回歸,判定CMC-544與利妥昔單抗(美羅華TM
)之交互作用,是否在統計學上是顯著的。亦計算中間抑制濃度(IC50
),並記錄每種處理相對於僅以CMC-544處理的效力。使用在SAS 8.2版中的PROBIT程序,進行統計學分析。
研究的結果顯示,CMC-544在0.01至3毫微克卡奇黴素DMH/毫升的劑量範圍內,引起Ramos細胞生長的劑量-依賴性抑制作用。單獨CMC-544的中間抑制濃度(IC50
)為0.029毫微克/毫升。將濃度2、20和200微克/毫升的利妥昔單抗(美羅華TM
)加至CMC-544處理過的細胞中,判定利妥昔單抗(美羅華TM
)與CMC-544之胞毒性活性的交互作用,是否在統計學上是顯著的。以20和200微克/毫升加入利妥昔單抗(美羅華TM
),沒有CMC-544,對細胞生長本身並沒有顯著的影響(分別為111.7%和94.0%的媒劑生長)。當與CMC-544混合時,所有三種濃度的(美羅華TM
)均在統計學上產生顯著地(p<0.05)轉移,至CMC-544劑量-反應曲線之斜度和截取點的左邊。2和200微克/毫升利妥昔單抗的組合,在劑量-反應曲線中產生最大的轉移。這2個曲線彼此在統計學上並無差異,但在統計學上,與20微克/毫升之劑量組合是顯著不同的(p<0.05)。第二個研究(未報告結果)證實了在第一個研究中觀察到的結果。2、20和200微克/毫升之利妥昔單抗(美羅華TM
)加CMC-544之組合的中間抑制濃度,分別是0.0072、0.0081和0.0072毫微克/毫升。CMC-544加利妥昔單抗(美羅華TM
)之中間抑制濃度,比單獨CMC-544的IC50
更有效大約4倍。
給予18-22克雌性無胸腺裸鼠,全身照射(400雷德)。照射進一步壓抑老鼠的免疫系統,以便提高腫瘤的接納。在照射之後3天,以在Matrigel中的107 RL細胞(Collaborative Biomedical Products,Belford,MA,以RPMI培養基稀釋1:1),在背右側腹處,以皮下注射老鼠。當腫瘤達到適當的尺寸時(0.3克,通常在21天之後),以0.2毫升/老鼠,腹腔內投予在生理鹽水中的CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)或CHOP療法(參見下文)。將開始投藥的那天視為第1天。在第5和9天,給予2次額外的劑量(治療=每4天一次x3次)。CHOP療法由環磷醯胺(C),(CytoxanTM
,Bristol-Meyers Squibb Co.,Princeton,NJ) 40毫克/公斤腹腔內;阿黴素HCl(H)(Sigma-Aldrich,Co.,St Louis,MO)3.3毫克/公斤腹腔內;長春新鹼(O)(GensiaSicor Pharmaceuticals,Irvine,CA)0.5毫克/公斤腹腔內以及強的松(P)(Roxane Labs.,Columbia,OH) 0.2毫克/公斤口服所組成。CHO根據與CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)(每4天一次x3次)兩者相同的給藥時間表投藥,而每隔一天口服投予強的松,總共5個劑量(每2天一次x5次)。每週至少測量腫瘤一次,並按照腫瘤質量(克)=0.5(腫瘤寬/2)(腫瘤長)來計算之。計算SEM,並使用多T-檢定,與媒劑-處理組比較統計顯著性。記錄組平均值最多50天,或直到老鼠死亡(其中斷組平均值),或腫瘤生長太大(>3.5克)並將老鼠安樂死為止。之後,僅記錄在所有處理組中,每隻老鼠個別的腫瘤團塊。亦記錄每個處理組中,在每個實驗結束時無腫瘤老鼠的數目。
欲判定CMC-544單獨或與其他生物活性劑混合對散播性淋巴瘤的影響,使用SCID老鼠模式。經由尾靜脈,以106 Ramos細胞(0.2毫升)注射20-25克的雄性SCID老鼠(CB17 SCID)。在細胞注射之後3或9天,腹腔內投予老鼠媒劑、共軛物(CMC-544或CMA-676)或利妥昔單抗(美羅華TM
),總共3個劑量。關於3天的處理時間表,在第3、7和11天時投藥給老鼠。關於9天的處理時間表,在第9、13和17天時投藥給老鼠。在第9天的處理時間表,亦按照下述給予CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)的組合。每天監視老鼠後肢麻痺的出現,此時將老鼠殺死。每個處理組使用7至10隻老鼠。均計算每組的平均存活時間(+SD)、中間值、最低和最高存活時間。藉著使用非參數Log-排列檢定,以在0.05水準報告的顯著性,判定在各組之間存活分佈上的差異。使用Kaplan-Meier法,建構存活曲線。
最初的研究檢查兩種不同的給藥時間表,對患有散播性淋巴瘤之SCID老鼠之存活時間的影響。注意第一個研究是在靜脈內注射腫瘤細胞之後3天開始藥物的給予(發育模式),而第二個研究延遲了藥物的給予,直到腫瘤細胞注射之後9天才開始(確立模式)。在每個研究中,每隔4天腹腔內投予CMC-544(160微克/公斤)、CMA-676(160微克/公斤)或利妥昔單抗(美羅華TM
)(20毫克/公斤)(每4天一次x3次)。在發育模式中,以媒劑處理的老鼠具有27天之平均存活時間(圖23,表8)。CMA-676,CMC-544的可匹敵之同型物對照組,未明顯地增加存活時間(p>0.05)。CMC-544明顯地增加存活時間至41天,而利妥昔單抗則有深遠的影響,增加存活時間至>125天(明顯比CMC-544更高,p<0.05)。延遲投藥直到腫瘤細胞有機會散播(成家)並存放在標靶組織內(確立模式),改變了CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)的結果。CMA-676再度對存活時間沒有顯著影響(圖24,表8)。利妥昔單抗(美羅華TM
)增加平均存活時間至62.6天,而CMC-544改善了平均存活時間至83.5天。在確立模式中,在CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)的影響之間,沒有顯著差異。
進行預備研究,判定利妥昔單抗(美羅華TM
)對CMC-544的存活反應,是否具有任何陽性或陰性的影響。在有或沒有利妥昔單抗(美羅華TM
)(20毫克/公斤,標示為高劑量藥物組合(HD))之下,投予CMC-544(160微克/公斤)。此外,將較低劑量的CMC-544(80微克/公斤)與低劑量的利妥昔單抗(美羅華TM
)(10毫克/公斤)共同投予。沒有分別給予個別的80微克/公斤或10毫克/公斤劑量之化合物,因為在研究中有限的老鼠數目。將該組合,CMC-544(80微克/公斤)與利妥昔單抗(美羅華TM
)(10毫克/公斤)標示為中間劑量組合(MD),並進行之,以便判定較低劑量組合之藥物,對SCID老鼠存活的可行性。按照在上文已確立之模式中報告的,進行CMC-544(160微克/公斤)和利妥昔單抗(美羅華TM
)(20毫克/公斤)的單獨投藥。每組延長平均存活時間,分別至58.5和50.5天(圖25,表9)。在組合中,高劑量組合的平均存活時間稍微(雖然在統計學上不是顯著的,p>0.05)改善至64.4天。80微克/公斤CMC-544和10毫克/公斤利妥昔單抗(美羅華TM
)之中間劑量組合顯著地(p<0.05對媒劑處理的)改善存活時間,至平均92.4天。這些結果暗示較低劑量組合的CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)被證明是合理的。
CMC MD=CMC-544中間劑量,80微克/公斤
CMC HD=CMC-544高劑量,160微克/公斤
利妥昔單抗MD=利妥昔單抗中間劑量,10毫克/公斤
利妥昔單抗HD=利妥昔單抗高劑量,20毫克/公斤
進行利用CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)的進一步組合研究。進行下列的治療組:40、80和160微克/公斤之CMC-544;5、10和20毫克/公斤的利妥昔單抗(美羅華TM
);以及40微克/公斤CMC-544加5毫克/公斤利妥昔單抗(美羅華TM
),80微克/公斤CMC-544加10毫克/公斤利妥昔單抗(美羅華TM
)和160微克/公斤CMC-544加20毫克/公斤利妥昔單抗(美羅華TM
)。所有劑量的利妥昔單抗(美羅華TM
)均稍微改善平均存活時間至33-40天的範圍,(所有劑量與媒劑-處理之25.8天的平均存活時間相比較,p<0.05,圖26,表10)。高劑量的CMC-544,160微克/公斤,改善平均存活時間至85天,與在較早兩個研究中報告的結果一致。混合CMC-544與利妥昔單抗(美羅華TM
),在存活時間上沒有造成明顯的改善(圖27,表10)。兩個較低劑量的CMC-544(80和40微克/公斤),分別明顯地改善了(p<0.05)平均存活時間,超過高劑量的CMC-544。至於40和80微克/公斤劑量之CMC-544,分別有90%和80%老鼠仍存活至125天。兩種藥物混合組均有100%老鼠存活直到125天。較低劑量的CMC-544比160微克/公斤之高劑量更有效。
與CMC-544混合的利妥昔單抗(美羅華TM
),在SCID老鼠之散播性B-細胞模式中,以受試之劑量(參見上文),對CMC-544之活性並無明顯的影響。亦在Balb/c裸鼠中,使用皮下RLB淋巴瘤異種移植模式,評估CMC-544與利妥昔單抗(美羅華TM
)共同投予,是否產生增強或抑制抗-腫瘤活性的結果。在皮下B淋巴瘤模式中,使腫瘤分期至300毫克之平均腫瘤質量,隨後以IP投予在研究中的兩個治療劑。使用20或80微克/公斤每4天一次x3次的CMC-544,有或無利妥昔單抗(美羅華TM
)(20毫克/公斤每4天一次x3次)利妥昔單抗(美羅華TM
)之共同-投藥,不明顯地提高也不抑制(p>0.05)CMC-544的治療效果(圖28)。單獨投予利妥昔單抗(美羅華TM
),在本研究中抑制了RL B淋巴瘤生長(在第20天抑制57%的腫瘤生長,p<0.05對媒劑-處理組),類似在低劑量CMC-544處觀察到的。
組合化療攝生法CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松)是非-霍奇金氏淋巴瘤患者最常用的治療用藥方式。在已確立之RL B淋巴瘤異種移植中,比較CHOP和CMC-544的抗-腫瘤效果。使用它們在裸鼠中評估之各自最大耐受劑量(未報告資料),使用CHOP攝生法的個別組份,且劑量如下:環磷醯胺(C) 40毫克/公斤腹腔內,阿黴素(H) 3.3毫克/公斤腹腔內,長春新鹼(O) 0.5毫克/公斤腹腔內和強的松(P) 0.2毫克/公斤口服。CHO是每4天一次x3次投予,而P是口服投予,每2天一次x5次。CMC-544是以160微克/公斤之卡奇黴素當量,每4天一次x3次腹腔內投予。CHOP療法最初導致RL B淋巴瘤生長的明顯抑制(圖29)。然而,3週之後,腫瘤以像媒劑-處理組一樣的生長速率再度生長。相反的,CMC-544之抗腫瘤效果,在整個實驗期間是完整且持續的。這些結果暗示CMC-544,以比在裸鼠中最大非致命劑量明顯更低之劑量,比CHOP組合治療更有效。
這些研究顯示將利妥昔單抗(美羅華TM
)與CMC-544加在一起,對Ramos B淋巴瘤細胞中觀察到,引起CMC-544之胞毒活性的明顯增加。最近在Ramos細胞中,亦報告了利妥昔單抗(美羅華TM
)和糖皮質激素的協同交互作用。此外,當利妥昔單抗(美羅華TM
)與10 μM地塞米松混合給予時,在8個額外細胞株的4個中,觀察到協同的生長抑制。
報告了利妥昔單抗(美羅華TM
)本身,0.4至10微克/毫升,對Ramos細胞生長引起明顯但小的(最多18%)抑制作用。此外,當以10微克/毫升培養(48小時培養)時,在8個B-細胞非-霍奇金氏淋巴瘤細胞株的6個中,是有活性的。Ghetie等人,顯示10微克/毫升的利妥昔單抗(美羅華TM
),在與Ramos細胞一起培養24小時之後,在細胞程式死亡方面引起6.2%的增加(對在媒劑-處理細胞中的3.5%)。在最近的研究中,單獨投予20和200微克/毫升之劑量的利妥昔單抗(美羅華TM
)時,對Ramos細胞生長沒有影響。在老鼠中,在散播性模式或皮下異種移植的模式中,沒有在CMC-544和利妥昔單抗(美羅華TM
)之間有任何交互作用的證據。受試的藥物組合,未干擾彼此的效力,也沒有提高它們。必須判定在散播性模式中,減少每個藥物之劑量是否將改變該觀察。
已經由Flavell等人描述了利用Ramos細胞的散播性B-細胞淋巴瘤模式。報告了媒劑-處理老鼠的中間存活時間是34-36天。老鼠發展出後肢麻痺,並進行成為垂死的,之後馬上死亡。器官的組織學分析顯示最常涉及的器官是腎上腺、脾臟和蜘蛛膜下腔。蜘蛛膜下腔的浸潤經常延伸至腦。當在散播性SCID老鼠之疾病過程早期投予時,利妥昔單抗(美羅華TM
)相當盡責(圖23),但當在模式之確立期中,在第9天投予時,則較不令人印象深刻(圖24)。利妥昔單抗(美羅華TM
),屬於IgG1同型物,最可能經由老鼠宿主之效應物機制來運作。這些機制包括補體-調節的胞毒性及/或抗體依賴性細胞的胞毒性,經由出現在SCID老鼠中之自然殺手細胞的新兵招募。注射之Ramos腫瘤細胞或許是較易受影響的,在宿主免疫機制開始被利妥昔單抗(美羅華TM
)激活時,在細胞有機會浸潤至受影響的器官內之前。在SCID老鼠之散播性腫瘤模式中,尚未測試未共軛的G5/44抗體(在CMC-544中的瞄準分子),但在將其投予皮下異腫移植物時,並沒有影響。預期G5/44(為IgG4的同型物)將不會活化宿主之效應物機制,也因此將不會產生抗-腫瘤活性。
卡奇黴素共軛之G5/44(CMC-544),以與利妥昔單抗(美羅華TM
)相反的方式運轉,當在疾病之確立期投予時,產生較佳的結果。CMC-544在確立期更為盡責的理由並不清楚,但確立期更密切地代表臨床狀態。CMA-676,可匹敵之同型物,未接合之對照共軛物,對平均存活時間沒有明顯的影響。在散播性SCID模式中的結果,清楚地暗示需要降低CMC-544之劑量,以便判定最大的有效劑量(MED)。160微克/公斤之劑量,比80和40微克/公斤的較低劑量更不具活性。不清楚為甚麼這樣,但160微克/公斤之劑量可能超過MED很多。策畫進一步的研究,來解決該爭論點。
Mohammad等人在利用瀰漫性大細胞淋巴瘤細胞株DLCL皮下異種移植的模式中,使用CHOP療法(環磷醯胺(C)40毫克/公斤靜脈內;阿黴素(H) 3.3毫克/公斤靜脈內;長春新鹼(O) 0.5毫克/公斤靜脈內以及強的松(P) 0.2毫克/公斤口服)。判定用在CHOP療法中之劑量為其最大耐受劑量。認為一次靜脈內給予CHO,且每天給予P持續5天的療法是'主動的',產生25.8%的T/C。記錄無腫瘤痊癒。在Mohammad等人描述之模式中的結果,似乎類似在本文描述之RL模式中,利用CHOP療法(腹腔內投予,每4天一次x3次)所觀察到的。在任一個研究中,CHOP均未產生長期的治癒,不像CMC-544。
CMC LD=CMC-544低劑量,40微克/公斤
CMC MD=CMC-544中間劑量,80微克/公斤
CMC HD=CMC-544高劑量,160微克/公斤
利妥昔單抗LD=利妥昔單抗低劑量,5毫克/公斤
利妥昔單抗MD=利妥昔單抗中間劑量,10毫克/公斤
利妥昔單抗HD=利妥昔單抗高劑量,20毫克/公斤
藉著加入稀釋劑、賦形劑、載劑和穩定劑,製備適合在活體內投藥之CMC-544的穩定調配物。在HIC層析法之後,藉著SEC-HPLC和多波長UV分析,來測定層析的溶離份。針對以上述分析為基礎之集合,選擇適當的溶離份,其提供在聚集體內含量、蛋白質濃度和卡奇黴素裝載方面的資訊。加入賦形劑、穩定劑、填充劑和緩衝劑,以便穩定該溶液。因為CMC-544可能經由許多降解路徑而經歷降解作用,故在調配物的發展中必須考慮物理上的不穩定性。在調配物之發展中一個主要的考量,是必須將卡奇黴素從抗體中水解的速率減至最低,同時必須維持抗-CD22抗體的物理和化學完整性。此外,必須將在某些pH值和濃度條件下,可能發生之卡奇黴素-抗體共軛物的沉澱作用減至最低。
在發展單體卡奇黴素衍生物-抗體共軛物的調配物中,調配物之pH值是很重要的,因為其將降解作用和物理不穩定性減至最少。選擇8.0之pH值,以便將卡奇黴素的水解作用減至最少,並維持適當的共軛物溶解度。使用SDS-PAGE和抗原結合ELISA獲得的額外資料,指出在8.0之pH值時,仍維持明顯的結構完整和抗體之專一性。因此,選擇三甲醇氨基甲烷作為緩衝劑,以便維持8.0之pH值。另一種緩衝劑可包括二價磷酸鈉或鉀。緩衝劑之濃度範圍可以是5至50 mM。暗示7.5至8.5之較佳的pH值範圍最適合穩定性/溶解度。目前特別適合終產物之pH值為7.0-9.0。
雖然經過緩衝之共軛物溶液的穩定性對於短期而言是足夠的,但長期穩定性仍不佳。使用冷凍乾燥來改善共軛物的儲存壽命。已為了與蛋白質溶液之冷凍乾燥有關的問題提供充分的文件,且在冷凍和乾造燥過程中可能發生二級、三級和四級結構的喪失。將蔗糖納入調配物中,作為共軛物的非晶形穩定劑,並在冷凍和乾燥期間,維持抗體的結構完整。已經使用濃度1.5-5.0%重量/體積的蔗糖。此外,亦可以按重量計0.5-1.5%之濃度,併入聚合填充劑,像是葡聚糖40或羥乙基澱粉,以便提高冷凍乾燥餅之外觀和物理剛度。這些形成冷凍乾燥餅的材料是以相對上較低的濃度,並可用來使冷凍乾燥配方之整體固體內含量減至最少,因此容許更快速地冷凍乾燥。調配物研究已經使用按重量計濃度為0.9%的葡聚糖40。
將多乙氧基醚80併入調配物中,提高共軛物的溶解度。使用0.01%的較佳濃度,而有效範圍是0.005%-0.05%。亦以按體積計0.91-0.05%之濃度,將吐溫加至調配物中。
在配方中亦可出現電解質,並可用來改善終純化方法。通常使用0.01 M至0.1 M之濃度的氯化鈉。亦可使用額外的電解質,像是硫酸鈉,來置換氯化鈉,因為其可能較易被冷凍乾燥。最佳的是,最後的CMC-544溶液包括1.5%蔗糖(按重量計),0.9%葡聚糖40(按重量計),0.01%吐溫80,50 mM氯化鈉,0.01%多乙氧基醚80(按重量計)和20 mM三甲醇氨基甲烷。
在下文中提供在冷凍乾燥之前的溶液之代表性配方:CMC-5440.5毫克/毫升,蔗糖1.5%按重量計,葡聚糖400.9%按重量計,氯化鈉0.05 M,吐溫0.01-0.05%按體積計,多乙氧基醚800.01%按重量計,三甲醇氨基甲烷0.02 M,pH 8.0和水。在+5℃至10℃(最好是在+5℃)的溫度下,將溶液分送至琥珀色小瓶中;在-35℃至-50℃(最好是-45℃)的冷凍溫度下冷凍該溶液;使已冷凍的溶液在20至80微米(最好是60微米)的最初乾燥壓力下,接受最初的冷凍乾燥步驟;將已冷凍乾燥的產物維持在-10℃至-40℃(最好是-30℃)之存放溫度下24至72小時(最好是60小時);且最後使已冷凍乾燥的產物在20-80微米(最好是60微米)的乾燥壓力下,在+10℃至+35℃(最好是+25℃)的存放溫度下,接受二級乾燥步驟15至30小時(最好是24小時)。使用壓力升高試驗,判定最初乾燥的終點。在冷凍乾燥循環終了時,以氮氣回填小瓶,並塞住。
表11陳述CMC-544使用之調配物與CMA-676使用之調配物上的差異。在CMA-676調配物和CMC-544所使用之調配物之間的明顯差異,包括在新的調配物中,降低蛋白質濃度(0.5毫克/毫升),使用三甲醇氨基甲烷作為緩衝劑以及0.01%吐溫80的出現。在新調配物中,重建CMC-544的結果是澄清的,與在重建CMA-676調配物時所見的混濁相反(參見表12和13)。
將在上文提及的所有參考文獻和專利,以引用的方式併入本文中。在上文-確認的專利說明書中,包括許多本發明的修改和變化,並預期對熟諳此藝者而言是明顯的。咸相信這類針對共軛方法、藉著該方法製造之共軛物以及包括該共軛物之組合物/調配物的修改和改變,均包括在申請專利範圍的範圍內。
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<212> 蛋白質
<213> 老鼠
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<223> 5/44g CDR-H1
<220>
<221>
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 CDR-H2gL1 T3
<220>
<221>
<400> 2
<210> 3
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 CDR-H3
<220>
<221>
<400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 CDR-L1
<220>
<221>
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 CDR-L2
<220>
<221>
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 CDR-L3
<220>
<221>
<400> 6
<210> 7
<211> 113
<212> 蛋白質
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44g VL功能部位
<220>
<221>
<400> 7
<210> 8
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 老鼠單株5/44 VH功能部位
<220>
<223> 老鼠單株5/44 VH功能部位
<220>
<221>
<400> 8
<210> 9
<211> 13
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> cH
<220>
<221>
<400> 9
<210> 10
<211> 13
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> N55Q
<220>
<221>
<400> 10
<210> 11
<211> 13
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> T57A
<220>
<221>
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> T57V
<220>
<221>
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> CDR-H2(T57)A H'
<220>
<221>
<400> 13
<210> 14
<211> 13
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> K60R
<220>
<221>
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> CDR-H2(K60R)R H"
<220>
<221>
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> CDR-H2(T57A K60R)H"'
<220>
<221>
<400> 16
<210> 17
<211> 70
<212> 蛋白質
<213> 人類
<220>
<223> DPK9
<220>
<221>
<400> 17
<210> 18
<211> 11
<212> 蛋白質
<213> 人類
<220>
<223> JK1
<220>
<221>
<400> 18
<210> 19
<211> 113
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gL1
<220>
<221>
<400> 19
<210> 20
<211> 113
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gL2
<220>
<221>
<400> 20
<210> 21
<211> 80
<212> 蛋白質
<213> 人類
<220>
<223> DP7
<220>
<221>
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> 蛋白質
<213> 人類
<220>
<223> JH4
<220>
<221>
<400> 22
<210> 23
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gH1
<220>
<221>
<400> 23
<210> 24
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gH4
<220>
<221>
<400> 24
<210> 25
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gH5
<220>
<221>
<400> 25
<210> 26
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gH6
<220>
<221>
<400> 26
<210> 27
<211> 121
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> gH7
<220>
<221>
<400> 27
<210> 28
<211> 239
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> 移植輕鏈的完整序列
<220>
<221>
<400> 28
<210> 29
<211> 781
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 移植輕鏈的完整序列
<220>
<221>
<400> 29
<210> 30
<211> 467
<212> 蛋白質
<213> 人造的序列
<220>
<223> 移植重鏈的完整序列
<220>
<221>
<400> 30
<210> 31
<211> 2160
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 移植重鏈的完整DNA序列
<220>
<221>
<400> 31
<210> 32
<211> 94
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 T1
<220>
<221>
<400> 32
<210> 33
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 T2
<220>
<221>
<400> 33
<210> 34
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 T3
<220>
<221>
<400> 34
<210> 35
<211> 94
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544 gH1 B1
<220>
<221>
<400> 35
<210> 36
<211> 97
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 B2
<220>
<221>
<400> 36
<210> 37
<211> 93
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1B3
<220>
<221>
<400> 37
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 F1
<220>
<221>
<400> 38
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gH1 R1
<220>
<221>
<400> 39
<210> 40
<211> 87
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 T1
<220>
<221>
<400> 40
<210> 41
<211> 90
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 T2
<220>
<221>
<400> 41
<210> 42
<211> 91
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 T3
<220>
<221>
<400> 42
<210> 43
<211> 88
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 B1
<220>
<221>
<400> 43
<210> 44
<211> 88
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 B2
<220>
<221>
<400> 44
<210> 45
<211> 90
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1B3
<220>
<221>
<400> 45
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 F1
<220>
<221>
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 544gL1 R1
<220>
<221>
<400> 47
<210> 48
<211> 339
<212> DNA
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 VL的DNA序列
<220>
<221>
<400> 48
<210> 49
<211> 363
<212> DNA
<213> 老鼠
<220>
<223> 老鼠單株5/44 VH的DNA序列
<220>
<221>
<400> 49
<210> 50
<211> 9
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子內的序列
<400> 50
<210> 51
<211> 101
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 5'寡核苷酸引子
<400> 51
圖1顯示老鼠單株抗體5/44之CDRs的胺基酸序列(序列識別1至6號)。
圖2顯示老鼠單株抗體5/44之輕鏈可變(VL
)功能部位的DNA和蛋白質序列。
圖3顯示老鼠單株抗體5/44之重鏈可變功能部位(VH
)的完整序列。
圖4顯示移除在CDR-H2中之糖基化作用位置和反應性離胺酸的策略。
圖5顯示5/44輕鏈序列的移植設計。DPK-9是人類生殖種系接受者架構序列。垂直線代表在老鼠和人類殘基之間的差異。加下標線之序列代表已經被保留在移植物中的供體殘基。以粗斜體字母表示CDRs(對於DPK-9則未顯示)。移植物gL1有6個捐贈者架構殘基,gL2有7個。
圖6顯示5/44重鏈序列的移植設計;DP7是人類生殖種系接受者架構序列。垂直線代表在老鼠和人類殘基之間的差異。加下標線之序列代表已經被保留在移植物中的供體殘基。以斜粗體字母表示CDRs(對於DP7則未顯示)。移植物gH4和gH6有6個捐贈者架構殘基。移植物gH5和gH7有4個捐贈者架構殘基。
圖7顯示載體pMRR14的輿圖。
圖8顯示載體pMRR10.1的輿圖。
圖9顯示嵌合型5/44突變種的Biacore測定結果。
圖10顯示5/44 gH1和gL1基因組合的寡核苷酸。
圖11顯示中間物載體pCR2.1(544gH1)的質體輿圖。
圖12顯示中間物載體pCR2.1(544gL1)的質體輿圖。
圖13顯示用來製造更多移植物的寡核苷酸卡匣。
圖14為顯示在螢光標示之老鼠5/44抗體和經移植變種之間競爭測定的圖。
圖15為顯示在螢光標示之老鼠5/44抗體和經移植變種之間競爭測定的圖。
圖16顯示經移植之重和輕鏈的完整DNA和蛋白質序列。
圖17為抗體-NAc-γ卡奇黴素DMH共軛物的圖解表現。
圖18為顯示CMC-544對RAMOS B-細胞淋巴瘤之生長的影響的圖。
圖19為顯示在活體內異種移植之模式中,在裸鼠中,CMC-544對大B-細胞淋巴瘤之影響的圖。
圖20是比較使用CMC-544對CMA-676共軛過程所造成之影響和CMC-544共軛過程對RL淋巴瘤生長之影響的圖。
圖21是顯示經利妥昔單抗(美羅華TM
)-治療之大RL淋巴瘤,易感受CMC-544治療的圖。
圖22為顯示利妥昔單抗(美羅華TM
)對CMC-544之胞毒效應的圖。
圖23為顯示CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)和CMA-676,對患有散播性早期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影響的圖。
圖24為顯示CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)和CMA-676,對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影響的圖。
圖25為顯示CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)和CMA-676,對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影響的圖。
圖26為顯示CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)和CMA-676,對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影響的圖。
圖27為顯示CMC-544、利妥昔單抗(美羅華TM
)和CMA-676,對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影響的圖。
圖28為顯示與或不與利妥昔單抗(美羅華TM
)一起,CMC-544對RL非-霍奇金氏淋巴瘤之抗-腫瘤活性的圖。
圖29為顯示CMC-544和CHOP對RL非-霍奇金氏淋巴瘤之抗-腫瘤活性的圖。
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(無元件符號說明)
Claims (46)
- 一種組合物,其包含具有低於10%低共軛部分(LCF)之單體卡奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物,該共軛物具有下式:
- 如請求項1之組合物,其中該抗體是CDR-移植之抗-CD22抗體。
- 如請求項2之組合物,其中該抗體包含可變功能部位,其包含人類接受者架構區和非-人類供體CDRs。
- 如請求項3之組合物,其中該抗體之重鏈可變功能部位之人類接受者架構區是以序列識別21及22號為基礎,且於序列識別8號之位置1、28、48、72及97處包含供體殘基。
- 如請求項4之組合物,其中該抗體進一步於序列識別8號之位置68及70處包含非-人類供體殘基。
- 如請求項4之組合物,其中該抗體包含輕鏈可變功能部位,其包含以序列識別17及18號為基礎的人類接受者架構區,並進一步於序列識別7號之位置2、4、42、43、50和65處包含供體殘基。
- 如請求項6之組合物,其中該抗體於序列識別7號之位置3處進一步包含供體殘基。
- 如請求項6之組合物,其中該抗體包含含有序列識別19號之輕鏈可變區及含有序列識別27號之重鏈可變區。
- 如請求項8之組合物,其中該抗體包含一輕鏈,其係包含於哺乳動物細胞中表現序列識別29號所得之胺基酸序列,及一重鏈,其係包含於哺乳動物細胞中表現序列識別31號所得之胺基酸序列。
- 如請求項9之組合物,其中該抗體包含具有序列識別28號所示序列之輕鏈及具有序列識別30號所示序列之重鏈。
- 一種組合物,其包含下列方法產生的具有低於10%低共軛部分(LCF)之單體卡奇黴素(calicheamicin)衍生物/抗-CD22抗體共軛物:(1)將單體卡奇黴素衍生物加至抗-CD22抗體中,其中該卡奇黴素衍生物為抗-CD22抗體重量之4.5-11%;(2)在非親核性且蛋白質可相容之具有約7至9之pH值的緩衝溶液中培養該單體卡奇黴素衍生物和抗-CD22抗體,其中該溶液進一步包含(a)有機共溶劑及(b)添加 劑,其包含至少一個C6 -C18 羧酸或其鹽,且其中係在約30℃至約35℃的溫度範圍下及約15分鐘至24小時之期間內進行該培養,及產生具有式Pr(-X-W)m 之單體卡奇黴素/抗-CD22抗體共軛物,其中;Pr為抗-CD22抗體,X為具有下式的可水解之交聯劑,(CO-Alk1 -Sp1 -Ar-Sp2 -Alk2 -C(Z1 )=Q-Sp),其中Alk1 和Alk2 分別為一鍵結或分支或未分支之(C1 -C10 )伸烷基鏈;Sp1 為一鍵結、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR'-、-N(CH2 CH2 )2 N-或-X-Ar'-Y-(CH2 )n -Z,其中X、Y和Z分別為一鍵結、-NR'-、-S-或-O-,其限制條件為當n=0時,Y和Z中至少有一個必需是一鍵結,且Ar'為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基,可視需要以1、2或3個(C1 -C5 )烷基、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-(CH2 )n COOR'、-S(CH2 )n COOR'、-O(CH2 )n CONHR'或-S(CH2 )n CONHR'之基團取代,其限制條件為當Alk1 為一鍵結時,Sp1 為一鍵結;n為從0至5之整數;R'為分支或未分支之(C1 -C5 )鏈,可視需要以1或2個下列基團取代:-OH、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫烷氧基、鹵素、硝基、(C1 -C3 )二烷胺基或(C1 -C3 )三烷基銨-A- 基團,其中A- 為形成鹽之藥學上可接受之陰離子;Ar為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基,可視需要以1、2或3 個下列基團取代:(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2 )n COOR'、-S(CH2 )n COOR'、-O(CH2 )n CONHR'或-S(CH2 )n CONHR',其中n和R'如同前文之定義,或1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-伸萘基,或
- 如請求項11之組合物,其中步驟(2)(a)中之有機共溶劑係選自由丙二醇、乙二醇、乙醇、DMF及DMSO所組成之群。
- 如請求項11之組合物,其中步驟(2)(b)中之添加劑係選自 由壬酸、癸酸、十一烷酸及十二烷酸或其鹽所組成之群。
- 如請求項13之組合物,其中步驟(2)(b)中之添加劑係以小於200mM之濃度提供。
- 如請求項14之組合物,其中該添加劑係以小於100mM之濃度提供。
- 如請求項15之組合物,其中該添加劑係以小於50mM之濃度提供。
- 如請求項11之組合物,其中步驟(3)之層析分離方法是尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography;SEC)。
- 如請求項11之組合物,其中步驟(3)之層析分離方法是HPLC、FPLC或Sephacryl S-200層析法。
- 如請求項18之組合物,其中步驟(3)之層析分離方法是厭水性交互作用層析法(hydrophobic interaction chromatography;HIC)。
- 如請求項19之組合物,其中係使用苯基瓊脂糖6速流層析介質(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow chromatographic medium)、丁基瓊脂糖4速流層析介質(Butyl Sepharose 4 Fast Flow chromatographic medium)、辛基瓊脂糖4速流層析介質(Octyl Sepharose 4 Fast Flow chromatographic medium)、Toyopearl醚-650M層析介質(Toyopearl Ether-650M chromatographic medium)、Macro-Prep甲基HIC介質(Macro-Prep methyl HIC medium)或Macro-Prep第三-丁基HIC介質(Macro-Prep t-Butyl HIC medium),來進行該厭水性交互作用層析法(HIC)。
- 如請求項20之組合物,其中係使用丁基瓊脂糖4速流層析介質來進行該厭水性交互作用層析法(HIC)。
- 如請求項11之組合物,其中該抗-CD22抗體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體及具有生物活性的抗體片段所組成之群,其中該具有生物活性的片段為Fab、經修飾之Fab、Fab'、(Fab')2 或Fv,或重鏈單體或二聚體。
- 如請求項22之組合物,其中該抗-CD22抗體為人類化抗體。
- 如請求項23之組合物,其中該抗-CD22抗體為CDR-移植抗體。
- 如請求項24之組合物,其中該抗-CD22抗體包括重鏈,其中之可變功能部位包括CDR,其具有至少一個以下序列:序列識別1號之CDR-H1,序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別23號之殘基50至66或序列識別27號之殘基50至66之CDR-H2,或序列識別3號之CDR-H3;及包括輕鏈,其中之可變功能部位包括CDR,其具有至少一個以下序列:序列識別4號之CDR-L1,序列識別5號之CDR-L2或序列識別6號之CDR-L3。
- 如請求項25之組合物,其中該抗-CD22抗體包括序列識別1號之CDR-H1、序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別23號之殘基50至66或序列識別27號之殘基50至66之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。
- 如請求項26之組合物,其中該抗-CD22抗體包括序列識別1號之CDR-H1、序列識別27號之殘基50至66之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。
- 如請求項27之組合物,其中該抗-CD22抗體包括可變功能部位,其包括人類接受者架構區和非-人類供體CDRs。
- 如請求項28之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有重鏈架構區之重鏈可變功能部位,其中重鏈架構區包含分別位於序列識別8號之位置1、28、48、72及97處之Glu、Arg、Ile、Ala、及Thr供體殘基,其中重鏈架構區之其餘部分係由序列識別21或22號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項29之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有重鏈架構區之重鏈可變功能部位,其中重鏈架構區包含分別位於序列識別8號之位置1、28、48、68、70、72及97處之Glu、Arg、Ile、Ala、Leu、Ala及Thr供體殘基,其中重鏈架構區之其餘部分係由序列識別21或22號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項29之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有輕鏈架構區之輕鏈可變功能部位,其中輕鏈架構區包含分別位於序列識別7號之位置2、4、42、43、50及65處之Val、Val、Leu、His、Gln及Asp供體殘基,其中輕鏈架構區之其餘部分係由序列識別17或18號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項30之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有輕鏈架構區之輕鏈可變功能部位,其中輕鏈架構區包含分別位於序列識別7號之位置2、4、42、43、50及65處之Val、Val、Leu、His、Gln及Asp供體殘基,其中輕鏈架構區之其餘部分係由序列識別17或18號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項31之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有輕鏈架構區之輕鏈可變功能部位,其中輕鏈架構區包含分別位於序列識別7號之位置2、3、4、42、43、50及65處之Val、Val、Val、Leu、His、Gln及Asp供體殘基,其中輕鏈架構區之其餘部分係由序列識別17或18號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項32之組合物,其中該抗-CD22抗體包含含有輕鏈架構區之輕鏈可變功能部位,其中輕鏈架構區包含分別位於序列識別7號之位置2、3、4、42、43、50及65處之Val、Val、Val、Leu、His、Gln及Asp供體殘基,其中輕鏈架構區之其餘部分係由序列識別17或18號之人類受體架構之對應殘基構成。
- 如請求項29之組合物,其中該抗-CD22抗體包含重鏈可變功能部位,該重鏈可變功能部位包含序列識別27號。
- 如請求項31之組合物,其中該抗-CD22抗體包含重鏈可變功能部位,該重鏈可變功能部位包含序列識別27號。
- 如請求項35之組合物,其中該抗-CD22抗體包含輕鏈可變功能部位,該輕鏈可變功能部位包含序列識別19號。
- 如請求項36之組合物,其中該抗-CD22抗體包含輕鏈可變功能部位,該輕鏈可變功能部位包含序列識別19號。
- 如請求項38之組合物,其中該抗-CD22抗體包含輕鏈,該輕鏈係由序列識別28號之殘基21至239所組成,及包含重鏈,該重鏈係由序列識別30號之殘基20至466所組成,且其中該抗體係於哺乳動物細胞中表現。
- 如請求項39之組合物,其中該抗-CD22抗體係於哺乳動物細胞中表現序列識別29號及序列識別31號所得。
- 如請求項11至40中任一項之組合物,其中該抗-CD22抗體包含一包含序列識別28號之輕鏈。
- 如請求項11至40中任一項之組合物,其中該抗-CD22抗體包含一包含序列識別30號之重鏈。
- 如請求項11至40中任一項之組合物,其中該抗-CD22抗體包含一包含序列識別28號之輕鏈,及包含一包含序列識別30號之重鏈。
- 如請求項11至40中任一項之組合物,其中該卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ卡奇黴素。
- 如請求項44之組合物,其中該卡奇黴素係以3-巰基-3-甲基丁醯肼(3-mercapto-3-methyl butanoyl hydrazide)將其官能化。
- 如請求項45之組合物,其中該可水解之交聯劑包含4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(4-(4-acetylphenoxy)butanoic acid;AcBut)。
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