CN100482277C - 加利车霉素衍生物-载体缀合物 - Google Patents
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Abstract
描述了用于制备具有比用以前报道的方法显著提高的载药量及显著减少的聚集和低缀合部分(LCF)的单体细胞毒性药物/载体缀合物的方法。也描述了细胞毒性药物衍生物/抗体缀合物、包含所述缀合物的组合物以及所述缀合物的用途。还描述了单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物、包含所述缀合物的组合物以及所述缀合物的用途。
Description
发明领域
本发明涉及用于制备具有较高载药量及显著减少的低缀合部分(LCF)的单体细胞毒性药物/载体缀合物(“缀合物”)的方法。具体地说,本发明涉及抗CD22抗体-单体加利车霉素缀合物。本发明也涉及本发明的缀合物、纯化所述缀合物的方法、包含所述缀合物的药用组合物以及所述缀合物的用途。
发明背景
开发用于系统药物疗法的药物缀合物是靶特异性细胞毒性药物。该概念涉及将治疗药与对确定的靶细胞群体具有特异性的载体分子偶联。对抗原具有高亲和力的抗体是作为靶向部分的自然选择。因为高亲和力单克隆抗体的利用度,抗体靶向治疗的前景才变得光明。已经与单克隆抗体缀合的毒性物质包括毒素、低分子量细胞毒性药物、生物反应调节剂和放射性核素。抗体-毒素缀合物通常称为免疫毒素,而由抗体和低分子量药物(例如甲氨蝶呤和多柔比星)组成的免疫缀合物则称为化学免疫缀合物。免疫调节剂包括已知具有调节功能的生物反应调节剂,例如淋巴因子、生长因子和补体激活眼镜蛇毒因子(CVF)。放射免疫缀合物由放射性同位素组成,可以用作治疗剂,通过它们的辐射来杀死细胞;或者用于造影。将具有细胞毒性药物抗体介导特异性靶向肿瘤细胞,预期不仅提高它们的抗肿瘤效果,而且阻止正常组织的非靶向摄入,因而增加了它们的治疗指数。
本发明涉及免疫缀合物,所述免疫缀合物包含与细胞毒性药物缀合的、作为靶向载体并且对恶性肿瘤细胞表面的抗原决定簇具有特异性的抗体。本发明涉及细胞毒性药物-抗体缀合物,其中所述抗体对B细胞恶性肿瘤、淋巴增生性疾病和慢性炎性疾病的抗原决定簇具有特异性。本发明也涉及用于制备免疫缀合物的方法以及它们的治疗用途。
许多用于治疗各种疾病(包括癌症和类风湿性关节炎)的基于抗体的疗法已获批准用于临床,或者用于各种恶性肿瘤(包括B细胞恶性肿瘤例如非霍奇金淋巴瘤)的临床试验。一种这样的基于抗体的疗法是利妥昔单抗(RituxanTM),这是一种未标记的嵌合人γ1(+mγ1V区)抗体,所述抗体对在B细胞上表达的细胞表面抗原CD20具有特异性。这些基于抗体的疗法或者依赖于补体介导细胞毒性(CDCC)或针对B细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC),或者依赖于使用放射性核素,例如131I或90Y,所述疗法对临床医生和患者来说都有相应的制备和应用问题。因此,需要生产能够克服现有基于抗体疗法缺点的免疫缀合物,以治疗各种恶性肿瘤,包括造血细胞恶性肿瘤如非霍奇金淋巴瘤(NHL);所述免疫缀合物能容易而高效地生产,可以重复使用而不诱导免疫应答。
已经开发了包含有效抗细菌剂和抗肿瘤剂家族成员的免疫缀合物,用于治疗骨髓瘤,所述有效抗细菌剂和抗肿瘤剂家族成员统称为加利车霉素或LL-E33288复合物(参见美国专利第4,970,198号(1990))。最有效的加利车霉素命名为γ1,在本文中简称为γ。这些化合物含有可以与合适的硫醇反应形成二硫化物的甲基三硫,同时引入一个用于将加利车霉素衍生物连接到载体上的官能团(例如酰肼或其它官能团)。(参见美国专利第5,053,394号)。特异性靶向剂(载体)的利用度和缀合方法都限制了单体加利车霉素衍生物/载体缀合物在开发用于各种各样的癌症的疗法中的应用,当与载体缀合的加利车霉素衍生物的量(即载药量)增加时,所述缀合方法导致形成蛋白聚集体。因为较高的载药量增加了缀合物的固有效力,所以载体上负载的药物量越高越好,只要能稳定保持载体蛋白的亲和力。聚集蛋白有非特异性毒性和免疫原性,因而在治疗应用中必须除去,否则,聚集蛋白的存在使得生产这些缀合物的规模化工艺更为困难,并且降低产物收率。载体蛋白上负载的加利车霉素的量(载药量)、在缀合反应中形成的聚集体量和最终可以获得的纯化单体缀合物的收率都是相关的。因此,必须通过调整加入到缀合反应中活性加利车霉素衍生物的量,在较高载药量和最终单体收率之间找到平衡。
当用交联剂进行描述于美国专利第5,877,296号和美国专利第5,773,001号的缀合反应时,细胞毒性药物缀合物、尤其是加利车霉素缀合物趋向聚集是个大问题,所述专利文献通过引用全部结合到本文中。在这种情况下,产生的大部分缀合物都呈聚集状态,很难纯化用原来的工艺(CMA工艺)制备的缀合物,用于治疗应用。对于某些载体蛋白来说,实际上甚至连中等负荷的缀合物都不能制备,除非是小规模制备。因此,关键是需要改进细胞毒性药物(例如加利车霉素)与载体缀合的方法,使聚集体量最小化,因而容许尽可能高的载药量并产生合理的产物收率。
先前已经公开了以较高载药量/收率并且减少聚集来制备单体加利车霉素衍生物/载体的缀合方法(参见美国专利第5,712,374号和美国专利第5,714,586号,通过引用全部结合到本文中)。虽然这些方法生产的缀合制备物具有显著减少的聚集体含量,但是后来发现所制备的缀合物含有不需要的高水平(HPLC面积百分比为45-65%)的低缀合部分(LCF),所述低缀合部分大多是由未缀合抗体组成的部分。产物中LCF的存在,低效利用了所述抗体,因为它不含有细胞毒性药物。它也会与加利车霉素-载体缀合物竞争靶,并有可能降低后者的中靶率(targetability),结果降低了细胞毒性药物的效果。因此,最好有改进的缀合方法,能导致显著较低水平的LCF并且具有可接受的聚集水平,而不显著改变缀合物的物理性能。
发明概述
本发明涉及用于制备具有较高负荷及显著减少的低缀合部分(LCF)的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物(“缀合物”)的方法。具体地说,本发明涉及单体加利车霉素衍生物-载体缀合物的生产、所述缀合物、组合物、所述缀合物的纯化方法和所述缀合物的用途。更具体地说,本发明涉及制备单体加利车霉素衍生物-抗CD22抗体缀合物(CMC-544)的方法。
在一个实施方案中,本发明公开了用于制备所述缀合物的改进的缀合方法,所述方法产生显著较低水平的LCF(低于10%)而不显著改变物理或化学特性。本发明也公开了对所述缀合方法的进一步改进,所述改进不仅显著降低了LCF的水平,而且比以前公开的方法显著减少的聚集,产生显著增加的载药量。本发明的缀合物具有下式:
Pr(-X-W)m
其中:
Pr为蛋白质性载体,
X为包含任何可与蛋白质性载体反应的反应基的产物的接头,
W为细胞毒性药物;
m为纯化缀合产物的平均负荷,致使细胞毒性药物占所述缀合物的7-9%(重量);且
(-X-W)m为细胞毒性药物衍生物。
在一个实施方案中,本发明的缀合物是通过包括下述步骤的本发明方法产生的:(1)向蛋白质性载体中加入细胞毒性药物衍生物,其中所述细胞毒性药物衍生物是所述蛋白质性载体的4.5-11%(重量);(2)在非亲核的、蛋白相容的、pH范围约7-9的缓冲溶液中,将所述细胞毒性药物衍生物和蛋白质性载体温育,产生单体细胞毒性药物/载体缀合物,其中所述溶液还包含(a)有机助溶剂,和(b)包含至少一种C6-C18羧酸或其盐的添加剂,其中所述温育是在约30℃至约35℃的温度范围内进行约15分钟至24小时;和(3)将步骤(2)产生的缀合物进行层析分离方法,以从未缀合蛋白质性载体、细胞毒性药物衍生物和聚集缀合物中分离出细胞毒性药物的负荷范围是4-10%(重量)、低缀合部分(LCF)小于10%的所述单体细胞毒性药物衍生物/蛋白质性载体缀合物。
在本发明的一个方面,所述缀合物的蛋白质性载体选自激素、生长因子、抗体、抗体片段、抗体模拟物以及它们的基因工程或酶工程对应物。
在一个实施方案中,所述蛋白质性载体是抗体。在一个优选的实施方案中,所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab)2片段。
在另一个实施方案中,所述人源化抗体针对细胞表面抗原CD22。
在一个优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体(CDR-grafted antibody),并且包含轻链可变区5/44-gL1(SEQ IDNO:19)和重链可变区5/44-gH7(SEQ ID NO:27)。
在另一个优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:28中所示的序列的轻链。
在一个更优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在另一个优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:28中所示的序列的轻链以及具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在另一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,所述抗体是通过亲和力成熟方案获得的变异抗体并且对人CD22具有增加的特异性。
在另一方面,用于产生本发明的单体细胞毒性药物/载体缀合物的细胞毒性药物是微管蛋白聚合抑制剂、与DNA结合并破坏DNA的烷化剂、蛋白质合成抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。
在一个实施方案中,所述细胞毒性药物选自加利车霉素、塞替派、紫杉烷类、长春新碱、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、埃斯波霉素、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、他莫昔芬、伊达比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins和美登素类(maytansinoids)。
在一个优选的实施方案中,所述细胞毒性药物是加利车霉素。在一个特别优选的实施方案中,所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素衍生物。
在又一方面,所述细胞毒性药物用3-巯基-3-甲基丁酰肼官能化,并通过可水解接头与蛋白质性载体缀合,所述接头能够在结合和进入靶细胞后能够从所述缀合物中释放所述细胞毒性药物。
在该方面的一个优选的实施方案中,所述可水解接头是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
在本发明的又一方面,辛酸或其盐、或癸酸或其盐在缀合方法中用作添加剂,以减少聚集并增加载药量。
在本发明的又一方面,本发明的缀合物用层析分离方法纯化。
在一个实施方案中,用于分离所述单体药物衍生物-载体缀合物的层析分离方法是大小排阻层析法(SEC)。
在另一个实施方案中,用于分离所述单体药物衍生物-载体缀合物的层析分离方法为HPLC、FPLC或葡聚糖凝胶S-200层析法。
在一个优选的实施方案中,用于分离所述单体药物衍生物-载体缀合物的层析分离方法是疏水作用层析法(HIC)。在一个特别优选的实施方案中,使用苯基琼脂糖凝胶6FF层析介质(Phenyl Sepharose 6Fast Flow chromatographic medium)、丁基琼脂糖凝胶4FF层析介质、辛基琼脂糖凝胶4FF层析介质、Toyopearl Ether-650M层析介质、常量制备(Macro-Prep)甲基HIC介质或常量制备叔丁基HIC介质来进行HIC。在一个更特别优选的实施方案中,使用丁基琼脂糖凝胶4FF层析介质进行HIC。
在另一方面,本发明涉及按照本发明的方法制备的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物。在该方面的一个优选的实施方案中,所用的细胞毒性药物是加利车霉素,所用的载体是抗体。
在另一个优选的实施方案中,所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab)2片段。在一个更特别优选的方面,使用针对细胞表面抗原CD22的人源化抗体。
在一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含轻链可变区5/44-gL1(SEQ ID NO:19)和重链可变区5/44-gH7(SEQ ID NO:27)。
在另一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:28中所示的序列的轻链。
在一个优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在另一个优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,并且包含具有SEQ ID NO:28中所示的序列的轻链和具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在又一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗体,所述抗体是通过亲和力成熟方案获得的变异抗体并且对人CD22具有增加的特异性。
在一个优选的实施方案中,所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素。
在一个实施方案中,所述加利车霉素衍生物用3-巯基-3-甲基丁酰肼官能化。
在另一个实施方案中,用于将所述药物与所述载体缀合的接头是可水解接头,所述接头能够在结合和进入靶细胞后能够从所述缀合物中释放所述细胞毒性药物。在一个优选的实施方案中,所述可水解接头是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
本发明的另一方面涉及具有下式的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物:Pr(-X-S-S-W)m,其中:Pr为抗CD22抗体;X为包含任何可与抗体反应的反应基的产物的可水解接头;W为加利车霉素基团;m为纯化缀合产物的平均负荷,致使加利车霉素占所述缀合物的4-10%(重量);且(-X-S-S-W)m为用本发明方法产生的加利车霉素衍生物。
在该方面的一个实施方案中,所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab)2片断。
在一个优选的实施方案中,所述抗体是对人CD22具有特异性的抗CD22抗体,并且包含重链和轻链,其中所述重链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:对于CDR-H1在图1中的H1(SEQ ID NO:1),对于CDR-H2在图1中的H2(SEQ IDNO:2)或H2’(SEQ ID NO:13)或H2”(SEQ ID NO:15)或H2”’(SEQ IDNO:16),或对于CDR-H3在图1中的H3(SEQ ID NO:3);而所述轻链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:对于CDR-L1在图1中的L1(SEQ ID NO:4)、对于CDR-L2在图1中的L2(SEQ ID NO:5)或对于CDR-L3在图1中的L3(SEQ IDNO:6)。
在另一个优选的实施方案中,所述抗CD22抗体包含重链和轻链,其中所述重链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:CDR-H1的SEQ ID NO:1,CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16,或CDR-H3的SEQ ID NO:3;而所述轻链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:CDR-L1的SEQ ID NO:4、CDR-L2的SEQID NO:5或CDR-L3的SEQ ID NO:6。
在一个更优选的实施方案中,所述抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQIDNO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
在另一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植抗CD22抗体,所述抗体包括含有人受体构架区和非人类供体CDR的可变区。
在另一个实施方案中,所述人源化抗CD22抗体具有人受体构架,其中所述抗体的重链可变区基于人亚型I共有序列并在位置1、28、48、71和93包含非人类供体残基。在另一个实施方案中,所述人源化抗体在位置67和69还包含非人类供体残基。
在一个优选的实施方案中,所述CDR移植人源化抗体包含轻链可变区,所述可变区包含基于人亚型I共有序列的人受体构架区,在位置2、4、37、38、45和60还包含非人类供体残基。在另一个实施方案中,所述CDR移植抗体在位置3还包含非人类供体残基。
在又一个实施方案中,所述CDR移植抗体包含轻链可变区5/44-gL1(SEQ ID NO:19)和重链可变区5/44-gH7(SEQ ID NO:27)。
在另一个实施方案中,所述CDR移植抗体包含具有SEQ IDNO:28中所示的序列的轻链和具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在又一个实施方案中,所述CDR移植抗体包含具有SEQ IDNO:28中所示的序列的轻链和具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
在一个实施方案中,所述抗CD22 CDR移植抗体是通过亲和力成熟方案获得的变异抗体并且对人CD22具有增加的特异性。
在另一个实施方案中,所述抗CD22抗体是嵌合抗体,所述嵌合抗体包含分别示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的单克隆抗体的轻链可变区序列和重链可变区序列。
在又一个实施方案中,所述抗CD22抗体包括含有截短的供体CDR序列的杂种CDR,其中供体CDR序列中的缺失部分被不同序列取代,形成功能性CDR。
在一个特别优选的实施方案中,所述细胞毒性药物衍生物是γ加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素衍生物。
在另一方面,本发明涉及用于制备单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物的稳定的冻干组合物的方法。在一个优选的实施方案中,所述单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物的稳定的冻干组合物通过下述步骤制备:(a)将所述单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物溶于溶液中,使其终浓度为0.5-2mg/ml,所述溶液包含浓度为1.5%-5%(重量)的防冻剂、浓度为0.5-1.5%(重量)的聚合填充剂、浓度为0.01M-0.1M的电解质、浓度为0.005-0.05%(重量)的增溶剂、浓度为5-50mM的缓冲剂(使得所述溶液的最终pH为7.8-8.2)和水;(b)在+5℃至+10℃的温度下,将以上溶液分装到小瓶中;(c)在-35℃至-50℃的冷冻温度下,将所述溶液进行冷冻;(d)在20-80微米汞柱(microns)的初始干燥压力下,在-10℃至-40℃的搁板温度下,对所述冷冻溶液进行初始冻干步骤达24-78小时;和(e)在20-80微米汞柱的干燥压力下,在+10℃至+35℃的搁板温度下,对步骤(d)的冻干产物进行第二个冻干步骤达15-30小时。
在一个实施方案中,用于将所述细胞毒性药物/载体缀合物冻干的防冻剂选自糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神经氨酸、阿聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻依聚糖、卡拉胶、半乳卡罗聚糖(galactocarolose)、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、石脐素、壳多糖、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原酸胶、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、丙三醇和季戊四醇。
在一个优选的实施方案中,所述防冻剂是蔗糖,其浓度为1.5%(重量)。
在一个实施方案中,用于冻干工艺的所述聚合填充剂选自葡聚糖40或羟乙基淀粉40,其浓度为0.9%(重量)。
在另一个实施方案中,用于冻干溶液的所述电解质是氯化钠,其浓度为0.05M。
在一个优选的实施方案中,在冻干工艺中使用增溶剂。优选的增溶剂是表面活性剂。在一个特别优选的实施方案中,所述表面活性剂是聚山梨酯80,其浓度为0.01%(重量)。
在一个实施方案中,所用的缓冲剂是氨丁三醇,其浓度为0.02M。在冻干工艺开始时,所述溶液的pH最好是8.0。在所述工艺开始之前,在+5℃的温度下,将含有所述细胞毒性药物/载体缀合物的溶液分装到小瓶中。
在一个优选的实施方案中,小瓶中的所述溶液在-45℃进行冷冻;在60微米汞柱的初始干燥压力下,在-30℃的搁板温度下,对所述冷冻溶液进行初始冻干步骤达60小时;在60微米汞柱的干燥压力下,在+25℃的搁板温度下,对所述冻干产物进行第二个冻干步骤达24小时。
本发明的另一方面涉及一种组合物,所述组合物包含治疗有效剂量的按照本发明方法制备的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物。
在一个实施方案中,所述单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物中的载体是选自以下的蛋白质性载体:激素、生长因子、抗体和抗体模拟物。
在一个优选的实施方案中,所述蛋白质性载体是人单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
在一个优选的实施方案中,所述人源化抗体针对细胞表面抗原CD22。
在本发明该方面的一个特别优选的实施方案中,所述抗CD22抗体对人CD22具有特异性,所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:对于CDR-H1在图1中的H1(SEQ ID NO:1),对于CDR-H2在图1中的H2(SEQ ID NO:2)或H2’(SEQ ID NO:13)或H2”(SEQ IDNO:15)或H2”’(SEQ ID NO:16),或对于CDR-H3在图1中的H3(SEQID NO:3);而所述轻链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:对于CDR-L1在图1中的L1(SEQ ID NO:4)、对于CDR-L2在图1中的L2(SEQ ID NO:5)或对于CDR-L3在图1中的L3(SEQ ID NO:6)。
在另一个优选的实施方案中,抗CD22抗体包含重链和轻链,其中所述重链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:CDR-H1的H1(SEQ ID NO:1),CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16,或CDR-H3的SEQ ID NO:3;而所述轻链的可变区包含CDR,所述CDR具有如下给出的序列中的至少一种:CDR-L1的SEQ ID NO:4、CDR-L2的SEQID NO:5或CDR-L3的SEQ ID NO:6。
在一个更优选的实施方案中,所述抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQID NO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
在一个特别优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是CDR移植人源化抗CD22抗体,所述抗体包含轻链可变区5/44-gL1(SEQ IDNO:19)和重链可变区5/44-gH7(SEQ ID NO:27)。
在另一个特别优选的实施方案中,所述人源化抗CD22抗体是对人CD22具有特异性的CDR移植抗体,所述抗体包含轻链和重链,所述轻链具有SEQ IDNO:28的序列,而所述重链具有SEQ ID NO:30的序列。
在一个实施方案中,所述CDR移植抗体是变异抗体,所述抗体对人CD22具有增加的特异性,所述抗体是通过亲和力成熟方案获得的。
在一个实施方案中,所述单体细胞毒性药物是加利车霉素,优选γ加利车霉素或N-乙酰加利车霉素。
在一个实施方案中,所述组合物可任选含有额外的生物活性剂。所述生物活性剂可以是细胞毒性药物、生长因子或激素。
本发明的又一方面涉及治疗增生性疾病患者的方法,所述方法通过给予所述患者治疗有效量的本发明的组合物。所述组合物可以通过以下途径给药:皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、髓内、鞘内、经皮、透皮、鼻内、局部、肠内(entereally)、阴道内、舌下或直肠。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物通过静脉内途径给药。
在一个实施方案中,将所述组合物给予增生性疾病例如癌症的人类患者。在一个优选的实施方案中,所述癌症是B细胞恶性肿瘤。所述B细胞恶性肿瘤可以是表达细胞表面抗原CD22的白血病或淋巴瘤。
在又一个实施方案中,所述癌症是癌或肉瘤。
本发明的另一方面涉及治疗B细胞恶性肿瘤的方法,所述方法通过给予所述恶性肿瘤患者治疗有效量的包含本发明细胞毒性药物-抗CD22抗体缀合物的组合物。在一个优选的实施方案中,所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤、尤其是非霍奇金淋巴瘤。
在一个实施方案中,用于制备本发明缀合物的细胞毒性药物选自以下药物:加利车霉素、塞替派、紫杉烷类、长春新碱、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、他莫昔芬、伊达比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、美登素类和埃斯波霉素。
在一个优选的实施方案中,所述细胞毒性药物是γ加利车霉素或N-乙酰加利车霉素。
在另一个实施方案中,所述治疗包括给予本发明的细胞毒性药物缀合物以及一种或多种选自以下的生物活性剂:抗体、生长因子、激素、细胞因子、抗激素、黄嘌呤、白介素、干扰素和细胞毒性药物。
在一个优选的实施方案中,所述生物活性剂是针对B细胞恶性肿瘤表达的细胞表面抗原的抗体。在一个更优选的实施方案中,针对B细胞恶性肿瘤表达的细胞表面抗原的抗体选自抗CD19抗体、抗CD20抗体和抗CD33抗体。所述抗体包括抗CD20抗体即利妥昔单抗(RituxanTM)。
在另一个实施方案中,所述生物活性剂是细胞因子或生长因子,包括但不限于白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
在另一个实施方案中,生物活性剂是激素,包括雌激素、雄激素、孕酮和皮质类固醇。
在又一个实施方案中,所述生物活性剂选自以下的细胞毒性药物:多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺拉霉素、美诺立尔、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉曲滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌罗霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、氮芥、泼尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(flurouracils)、依托泊苷、泰素、泰素类似物和丝裂霉素。
在一个优选的实施方案中,治疗有效的所述细胞毒性药物-抗CD22抗体缀合物的组合物与作为治疗方案组成部分的一种或多种细胞毒性药物组合联合给药,其中细胞毒性药物组合选自CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松);COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松);CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松);m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸);ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱);MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸);MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪);MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)与ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春碱)交替使用;MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)交替使用、ChIVPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和泼尼松);IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷);MIME(米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷);DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂);ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷和顺铂);CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素);CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松);以及CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)。
在一个优选的实施方案中,在给予一种或多种上述细胞毒性药物组合之前,先给予治疗有效的本发明细胞毒性药物-抗CD22抗体缀合物的组合物。在另一个优选的实施方案中,在给予作为治疗方案组成部分的一种或多种上述细胞毒性药物组合之后,再给予治疗有效的本发明细胞毒性药物-抗CD22抗体缀合物的组合物。
本发明的另一方面涉及治疗侵袭性淋巴瘤的方法,所述方法包括将治疗有效的单体加利车霉素衍生物-抗CD22抗体缀合物的组合物与一种或多种生物活性剂联合给予需要所述治疗的患者。
本发明的又一方面涉及本发明的组合物在治疗增生性疾病例如癌症患者中的用途。具体地说,所述癌症是在其细胞表面表达CD22抗原的B细胞恶性肿瘤。具体地说,所述B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一个实施方案中,所述癌症是癌或白血病。
在一个实施方案中,治疗有效量的所述组合物通过以下途径给药:皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、髓内、鞘内、经皮、透皮、鼻内、局部、肠内、阴道内、舌下或直肠给药。
在一个优选的实施方案中,治疗有效量的本发明的药用组合物通过静脉内途径给药。
本发明的另一方面涉及本发明的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物在治疗B细胞恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)患者中的用途。在一个实施方案中,本发明的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物与一种或多种生物活性剂一起给药。
在一个实施方案中,所述生物活性剂选自抗体、生长因子、激素、细胞因子、抗激素、黄嘌呤、白介素、干扰素和细胞毒性药物。
在一个优选的实施方案中,所述生物活性剂是针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原的抗体,例如抗CD19抗体、抗CD20抗体和抗CD33抗体。在一个优选的实施方案中,所述抗CD20抗体是利妥昔单抗(RituxanTM)。
在另一个实施方案中,所述生物活性剂包括细胞因子或生长因子,例如白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF或激素(包括雌激素、雄激素、孕酮和皮质类固醇)。
在另一个实施方案中,所述生物活性剂是选自以下的细胞毒性药物:多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺拉霉素、美诺立尔、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉曲滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌罗霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、氮芥、泼尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素类似物和丝裂霉素。
在一个优选的实施方案中,治疗有效量的所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物与作为治疗方案组成部分的一种或多种细胞毒性药物组合一起给药,其中所述细胞毒性药物组合选自CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松);COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松);CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松);m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸);ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱);MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸);MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼);ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪);MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)与ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春碱)交替使用;MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)交替使用;ChIVPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和泼尼松);IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷);MIME(米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷);DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂);ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷和顺铂);CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素);CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松);CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、ESHOP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂);EPOCH(依托泊苷、长春新碱和多柔比星给予96小时,同时给予快速浓注环磷酰胺和口服泼尼松)、ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素)、CHOP-B.(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和博来霉素)、CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博来霉素)以及P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和泼尼松)。
在一个优选的实施方案中,在给予作为治疗方案组成部分的一种或多种细胞毒性药物组合之前,先给予所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物。
在另一个优选的实施方案中,在给予作为治疗方案组成部分的一种或多种细胞毒性药物组合之后,再给予治疗有效剂量的所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物。
在又一个更优选的实施方案中,将治疗有效剂量的所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物与针对B细胞恶性肿瘤的细胞表面抗原的抗体联合给药,并任选包含作为治疗方案组成部分的一种或多种细胞毒性药物组合。
在另一方面,本发明涉及本发明的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。所述药物可以单独用于或与其它生物活性剂联合用于治疗B细胞增生性疾病。
附图简述
图1显示小鼠单克隆抗体5/44的CDR的氨基酸序列(SEQ IDNOS:1-6)。
图2显示小鼠单克隆抗体5/44轻链可变区(VL)的DNA序列和蛋白质序列。
图3显示小鼠单克隆抗体5/44重链可变区(VH)的全序列。
图4显示CDR-H2中的糖基化位点和活性赖氨酸的去除策略。
图5显示5/44轻链序列的移植设计。DPK-9是人种系受体构架序列。垂直线表示在鼠源残基和人源残基之间存在不同。下划线的序列表示保留在移植物中的供体残基。CDR以粗斜体字母表示(对于DPK-9未显示)。移植物gL1有6个供体构架残基,gL2有7个。
图6显示5/44重链序列的移植设计;DP7是人种系受体构架序列。垂直线表示在鼠源残基和人源残基之间存在不同。下划线的序列表示保留在移植物中的供体残基。CDR以粗斜体字母表示(对于DP7未显示)。移植物gH4和gH6有6个供体构架残基。移植物gH5和gH7有4个供体构架残基。
图7显示载体pMRR14的图谱。
图8显示载体pMRR10.1的图谱。
图9显示嵌合5/44突变体的Biacore测定结果。
图10显示5/44gH1和gL1基因装配的寡核苷酸。
图11显示中间载体pCR2.1(544gH1)的质粒图谱。
图12显示中间载体pCR2.1(544gL1)的质粒图谱。
图13显示用于制备其它移植物的寡核苷酸盒。
图14是一幅曲线图,显示荧光标记的小鼠5/44抗体和移植变异体之间的竞争测定。
图15是一幅曲线图,显示荧光标记的小鼠5/44抗体和移植变异体之间的竞争测定。
图16显示移植重链和移植轻链的全部DNA序列和蛋白质序列。
图17是抗体-NAc-γ加利车霉素DMH缀合物的示意图。
图18是一幅曲线图,显示CMC-544对RAMOS B细胞淋巴瘤生长的影响。
图19是一幅曲线图,显示在裸鼠的体内异种移植模型中CMC-544对大B细胞淋巴瘤的影响。
图20是一幅曲线图,比较了用CMA-676缀合方法和CMC-544缀合方法制备的CMC-544对RL淋巴瘤生长的影响。
图21是一幅曲线图,显示用利妥昔单抗(RituxanTM)治疗的大RL淋巴瘤对CMC-544治疗敏感。
图22是一幅曲线图,显示利妥昔单抗(RituxanTM)对CMC-544的细胞毒性效应的影响。
图23是一幅曲线图,显示CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)和CMA-676对带有弥散性早期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影响。
图24是一幅曲线图,显示CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)和CMA-676对带有弥散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影响。
图25是一幅曲线图,显示CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)和CMA-676对带有弥散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影响。
图26是一幅曲线图,显示CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)和CMA-676对带有弥散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影响。
图27是一幅曲线图,显示CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)和CMA-676对带有弥散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影响。
图28是一幅曲线图,显示CMC-544 +/-利妥昔单抗(RituxanTM)对RL非霍奇金淋巴瘤的抗肿瘤活性。
图29是一幅曲线图,显示CMC-544和CHOP对RL非霍奇金淋巴瘤的抗肿瘤活性。
发明详述
本发明的缀合物包含细胞毒性药物,所述细胞毒性药物是用包含任何与蛋白质性载体反应的反应基的接头衍生的,以形成细胞毒性药物衍生物-蛋白质性载体缀合物。具体地说,本发明的缀合物包含细胞毒性药物,所述细胞毒性药物是用包含任何与用作蛋白质性载体的抗体反应的反应基的接头衍生的,以形成细胞毒性药物衍生物-蛋白质性载体缀合物。具体地说,所述抗体针对B细胞恶性肿瘤上的细胞表面抗原。下面描述了制备和纯化所述缀合物的改进方法。使用具体的助溶剂、添加剂和具体的反应条件以及分离方法,结果形成了具有显著减少的LCF的单体细胞毒性药物衍生物/抗体缀合物。单体形式而不是聚集形式具有重大的治疗价值,而且LCF最小化以及显著减少的聚集导致以具有治疗意义的方式利用所述抗体原料,阻止LCF与较高缀合部分(HCF)竞争。
I.载体
本发明的载体/靶向剂最好是蛋白质性载体/靶向剂。载体/靶向剂包括激素、生长因子、抗体、抗体片段、抗体模拟物和它们的基因工程或酶工程对应物,在下文中以单独形式或以基团形式都称为“载体”。载体的基本特征是能识别和结合与不需要的细胞相关的抗原或受体,然后使其内化。应用于本发明的载体的实例公开于美国专利第5,053,394号,所述专利文献通过引用全部结合到本文中。用于本发明的优选的载体是抗体和抗体模拟物。
许多非免疫球蛋白的蛋白支架已经用于产生抗体模拟物,所述抗体模拟物以抗体特异性与抗原表位结合(PCT公布号WO00/34784)。例如,已经通过从单克隆抗体的重链可变区缺失3个β链,设计了与免疫球蛋白折叠有关的“微型抗体(minibody)”支架(Tramontano等,J.Mol.Recognit.7:9,1994)。该蛋白包括61个残基,可用于展示2个高变环。这两个环已经随机化,根据抗原结合选择的产物、但至此是所述构架看来因为溶解度问题而在应用方面受到一定的限制。另一种用于展示环的构架是淀粉酶抑肽,这是一种特异性抑制哺乳动物α-淀粉酶的蛋白,该蛋白具有74个残基,为6链β折叠夹心结构,由2个二硫键连接在一起(McConnell和Hoess,J.Mol.Biol.250:460,1995)。该支架包含3个环,但是迄今为止,这些环中只有2个检查到随机化潜力。
已检验了作为构架的其它蛋白,并已用于在α螺旋表面(Nord等,Nat.Biotechnol.15:772,1997;Nord等,Protein Eng.8:601,1995)、在α螺旋束中α螺旋之间的环上(Ku和Schutz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6552,1995)和在由二硫桥限制的环上(例如小蛋白酶抑制剂上的环)(Markland等,Biochemistry 35:8045,1996;Markland等,Biochemistry35:8058,1996;Rottgen和Collins,Gene 164;243,1995;Wang等,J.Biol.Chem.270:12250,1995)展示随机残基。
可用于本发明的抗体载体的实例包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及它们的生物活性片段。所述抗体最好是针对在增生性疾病例如癌症的靶细胞和/或组织上表达的细胞表面抗原。针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体的实例包括但不限于以下抗体:针对在大多数B细胞淋巴瘤上过量表达的CD22抗原的抗体;G5/44(鼠抗CD22单克隆抗体的人源化形式);针对细胞表面抗原CD33的抗体(所述细胞表面抗原在某些人骨髓瘤、尤其是急性髓样白血病中普遍存在);hP67.6(抗CD33鼠抗体的人源化形式)(参见美国专利第5,773,001号);针对PEM抗原的抗体(所述抗原存在于上皮起源的许多肿瘤,称为mP67.6(参见I.D.Bernstein等,J.Clin.Invest.79:1153(1987)和I.D.Bernstein等,J.Imnunol.128:867-881(1992));针对在许多实体瘤(称为hu3S193,(参见美国专利第6,310,185 B1号)上过量表达的Lewis Y糖抗原的人源化抗体。另外,有几种市售的抗体,例如利妥昔单抗(RituxanTM)和曲妥单抗(HerceptinTM),也可用作载体/靶向剂。利妥昔单抗(RituxanTM)是用于治疗各种B细胞淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体,而曲妥单抗(HerceptinTM)是用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2抗体。
在本文中用作本发明的载体的实例是针对细胞表面抗原CD22的CDR移植人源化抗体分子,称为G5/44。该抗体是针对在某些人淋巴瘤上普遍存在的细胞表面抗原CD22的鼠抗CD22单克隆抗体的人源化形式。本文所用的术语“CDR移植抗体分子”是指这样的抗体分子:其中重链和/或轻链包含一个或多个互补性决定区(CDR),必要时,包含从供体抗体(例如鼠单克隆抗体)移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区构架中的修饰CDR(下文称为CDR)。所述CDR移植抗体最好具有包含人受体构架区和一个或多个上述供体CDR的可变区。
当移植CDR时,可以使用任何合适的与所述CDR所来源的供体抗体的类别/类型有关的受体可变区构架序列,包括小鼠构架区、灵长类构架区和人构架区。可用于本发明的人构架的实例有KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等,Seq.of Proteinsof Immunol.Interest,1:310-334(1994))。例如,KOL和NEWM可用于重链,REI可用于轻链,而EU、LAY和POM既可用于重链又可用于轻链。
在本发明的CDR移植抗体中,最好使用具有与供体抗体的链同源的抗体作为受体抗体。受体的重链和轻链不必来源于同一抗体,并且如果需要,可包含具有来自不同链的构架区的混合链。
另外,在本发明的CDR移植抗体中,构架区不必具有与受体抗体的那些序列完全相同的序列。例如,罕见残基可变为更经常出现的该受体链类别或类型的残基。或者,可改变在受体构架区所选的残基以便它们对应于在供体抗体的相同位置存在的残基或对应于在供体抗体的相同位置存在的残基的保守取代的残基。应最小限度的保持这些使供体抗体的亲和力恢复必需的改变。PCT公布号WO91/09967中公开了在需要改变的受体构架区内选择残基的方案,所述专利文献通过引用全部结合到本文中。
供体残基是来自供体抗体(即来自最初获得CDR的抗体)的残基。
本发明的抗体可包含其中可变区包含作为CDR-H2(如Kabat等定义,(参见上文))的H2’的重链,其中为提高抗体对抗原的亲和力而去除潜在的糖基化位点序列。
另外,本发明的抗体可包含其中可变区包含作为CDR-H2(如Kabat等定义,(参见上文))的H2”的重链,其中赖氨酸位于位置60。该赖氨酸残基被其它氨基酸所取代,所述赖氨酸残基位于CDR-H2内暴露的位置并认为其有可能与缀合剂反应,从而导致抗原结合亲和力下降。
另外,本发明的抗体可包含其中可变区包含作为CDR-H2(如Kabat等定义,(参见上文))的H2”’的重链,其中潜在的糖基化位点序列和位置60的赖氨酸残基被其它氨基酸所取代。
本发明的抗体可包含:具有全长重链和轻链的完全抗体;其生物活性片段,例如Fab、修饰Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段;轻链或重链单体或二聚体;或单链抗体,例如其中重链可变区和轻链可变区通过肽接头连接的单链Fv。同样,重链可变区和轻链可变区可与其它合适的抗体结构域组合。
本发明的抗体也可包括修饰Fab片段,其中所述修饰是添加一个或多个氨基酸,以便让效应分子或报道分子连接到其重链的C末端。加入的氨基酸最好形成含有可以连接效应分子或报道分子的一个或两个半胱氨酸残基的修饰铰链区。
可以选择与所述抗体想要的功能、尤其是需要或不需要的效应物功能有关的本发明的抗体恒定区结构域(如果有的话)。例如,所述恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。具体地说,当所述抗体是准备用于治疗用途并且需要抗体效应物功能时,可以使用人IgG恒定区结构域、尤其是IgG1和IgG3同种型恒定区结构域。或者,当所述抗体准备用于治疗目的并且抗体效应物功能不需要或不必要时,可以使用IgG2和IgG4同种型,或者可以使IgG1Fc区突变,以消除所述效应物功能。
本发明抗体的结合亲和力至少5 x 10-8M、优选至少1 x 10-9M、更优选至少0.75 x 10-10M、最优选至少0.5 x 10-10M。
在一个实施方案中,本发明涉及免疫毒素缀合物和使用抗体变异体或抗体模拟物制备这样的缀合物的方法。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体的变异体针对CD22,显示出对CD22的改进的亲和力。所述变异体可以通过许多的亲和力成熟方案获得,所述亲和力成熟方案包括CDR突变(Yang等,J.Mol.Biol.254,392-403,1995)、链改组(Marks等,Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌(E.coli)增变株的应用(Low等,J.Mol.Biol.,260,359-368,1996)、DNA改组(Patten等,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和性PCR(Crameri等,Nature,391,288-291,1998)。
任何合适的宿主细胞/载体系统都可用于表达编码包含本发明抗体的载体的DNA序列。细菌系统例如大肠杆菌和其它微生物系统可部分用于表达抗体片段,例如Fab和F(ab’)2片段、尤其是Fv片段和单链抗体片段,例如单链Fv。真核生物(例如哺乳动物)的宿主细胞表达系统可用于制备较大抗体,包括完整抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤、酵母细胞、昆虫细胞、杂交瘤细胞、NSO、VERO或PER C6细胞。合适的表达系统也包括转基因动物和植物。
II.治疗药
适用于本发明的治疗药如下:抑制或破坏微管蛋白聚合的细胞毒性药物、与DNA结合和破坏DNA的烷化剂以及抑制蛋白质合成或必需的细胞蛋白质(例如蛋白激酶、酶和细胞周期蛋白)的药物。这样的细胞毒性药物的实例包括但不限于塞替派、紫杉烷类、长春新碱、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、他莫昔芬、伊达比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、加利车霉素、埃斯波霉素和美登素类。优选的细胞毒性药物是加利车霉素,所述药物是甲基三硫抗肿瘤抗生素的实例。适用于本发明的加利车霉素的实例已经公开于例如美国专利第4,671,958号、美国专利第4,970,198号、美国专利第5,053,394号、美国专利第5,037,651号和美国专利第5,079,233号,所述专利文献通过引用全部结合到本文中。优选的加利车霉素是γ-加利车霉素衍生物或N-乙酰γ-加利车霉素衍生物。
III.细胞毒性药物衍生物/载体缀合物
本发明的缀合物具有式Pr(-X-W)m,
其中:
Pr为蛋白质性载体,
X为包含任何可与蛋白质性载体反应的反应基的产物的接头,
W为细胞毒性药物;
m为纯化缀合产物的平均负荷,致使加利车霉素占所述缀合物的4-10%(重量);且
(-X-W)m为细胞毒性药物
优选X具有下式:
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)=Q-Sp)
其中
Alk1和Alk2独立地为化学键或支链或直链(C1-C10)亚烷基;
Sp1为化学键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR′-、-N(CH2CH2)2N-或-X-Ar′-Y-(CH2)n-Z,其中X、Y和Z独立地为化学键、-NR′-、-S-或-O-,条件是当n=0,则Y和Z中至少一个必须为化学键,且Ar′为任选被1个、2个或3个以下基团取代的1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基:(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′,条件是当Alk1为化学键,则Sp1为化学键;
n为0-5的整数;
R′为任选被1个或2个以下基团取代的支链或直链(C1-C5)链:-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基或(C1-C3)三烷基铵-A-,其中A-为形成盐的药学上可接受的阴离子;
Ar为任选被1个、2个或3个以下基团取代的1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基:(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′,其中n和R′如上定义,或是1,2-亚萘基、1,3-亚萘基、1,4-亚萘基、1,5-亚萘基、1,6-亚萘基、1,7-亚萘基、1,8-亚萘基、2,3-亚萘基、2,6-亚萘基或2,7-亚萘基或
其中每个亚萘基或噻吩嗪任选被1、2、3或4个以下基团取代:(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′或-S(CH2)nCONHR′,其中n和R′如上定义,条件是当Ar为噻吩嗪时,Sp1是一个仅与氮连接的化学键;
Sp2为化学键、-S-或-O-,条件是当Alk2为化学键,则Sp2为化学键;
Z1为H、(C1-C5)烷基或任选被1个、2个或3个以下基团取代的苯基:(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-ONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′,其中n和R′如上定义;
Sp为直链或支链二价或三价(C1-C18)基团、二价或三价芳基或杂芳基、二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基、二价或三价芳基-或杂芳基-芳基(C1-C18)基团、二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)基团)或二价或三价(C2-C18)不饱和烷基,其中杂芳基最好是呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、N-甲基咔唑基、aminocourmarinyl或吩嗪基,其中如果Sp为三价基团时,则Sp可以额外地被以下基团取代:低级(C1-C5)二烷基氨基、低级(C1-C5)烷氧基、羟基或低级(C1-C5)烷硫基;且
Q为=NHNCO-、=NHNCS-、=NHNCONH-、=NHNCSNH-或=NHO-。
Alk1最好为支链或直链(C1-C10)亚烷基;Sp1为化学键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR′,其中R′如上定义,条件是当Alk1为化学键时,Sp1为化学键;
Ar为任选被1个、2个或3个以下基团取代的1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基:(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′,其中n和R′如上定义,或者Ar为1,2-亚萘基、1,3-亚萘基、1,4-亚萘基、1,5-亚萘基、1,6-亚萘基、1,7-亚萘基、1,8-亚萘基、2,3-亚萘基、2,6-亚萘基或2,7-亚萘基,其中每个亚萘基任选被1、2、3或4个以下基团取代:(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′。
Z1为(C1-C5)烷基或任选被1个、2个或3个以下基团取代的苯基:(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、卤素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′;Alk2和Sp2同时为化学键;且Sp和Q如上定义。
美国专利第5,773,001号(通过引用全部结合到本文中)公开了从加利车霉素制备的并且与亲核衍生物、尤其是酰肼和相关亲核试剂一起使用的接头。这些接头在所述药物和接头之间形成的键是可以水解以获得更好活性的情况下尤其有用。这些接头含有两个官能团。一个官能团一般是用于与载体反应的羧基。酸性官能团被适当活化后,可以与载体的游离氨基(例如抗体或其他蛋白质性载体的赖氨酸侧链的氨基等)形成酰胺键。另一个官能团通常是羰基,即醛基或酮基,所述基团可以与适当修饰的治疗药反应。所述羰基可以与药物上的酰肼基团反应,形成腙键。该键是可水解的,可以在与靶细胞结合后让治疗药从所述缀合物中释放出来。
用于本发明的最优选的双官能接头是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut),所述接头产生优选的产物,其中所述缀合物由以下部分组成:通过与3-巯基-3-甲基丁酰肼反应而官能化的β-加利车霉素、γ-加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素、AcBut接头和人或人源化IgG抗体靶向载体。
IV.单体缀合
在制备具有用于治疗应用所必要的良好载药量和合理收率的单体药物缀合物中,许多细胞毒性药物(包括加利车霉素)的天然疏水性产生问题。由接头(例如美国专利第5,773,001号中公开的AcBut接头)带来的键疏水性增加,以及将所述治疗药物与所述载体(抗体)分开的共价距离的增加,使这一问题更加严重。
具有较高载药量的细胞毒性药物衍生物/载体缀合物发生聚集的原因是所述药物的疏水性。通常不得不限制载药量,以获得合理量的单体产物。因为过量聚集,在某些情况下,例如用美国专利第5,877,296号的缀合物、用美国专利第5,053,394号公开的反应条件,以用于治疗应用的收率和负荷制备缀合物常常是困难的。这些反应条件在缀合反应中使用DMF作为助溶剂。因此,需要有容许较高载药量/收率而不聚集、而且材料也没有内在损失的方法。
降低聚集的改进方法描述于美国专利第5,712,374号和第5,714,586号,所述专利文献通过引用全部结合到本文中。这些专利中公开的蛋白质性载体包括但不限于蛋白,例如用于靶向所述细胞毒性治疗药的人抗体或人源化抗体,例如在该专利文献中公开的hP67.6和其它人源化抗体等。在这些专利中,发现使用一种非亲核的、蛋白相容缓冲液,通常产生具有较高载药量/收率和减少的聚集、具有良好活性的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物,所述缓冲液含有:(i)作为助溶剂的丙二醇和(ii)包含至少一种C6-C18羧酸的添加剂。这些专利中所述优选的酸是C7-C12酸,最优选的酸是辛酸(例如辛酸)或其盐。用于从N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)酯或其它类似的活化酯制备缀合物的优选的缓冲液是磷酸缓冲盐溶液(PBS)或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES缓冲液)。用于这些缀合反应的缓冲液不能含有游离胺或亲核试剂。对于其它类型的缀合物,可接受的缓冲液可以容易地确定。或者,人们发现使用含有叔丁醇、不含其它添加剂的非亲核的、蛋白相容的缓冲液液,可以产生具有较高载药量/收率和减少聚集的单体加利车霉素衍生物/载体缀合物。
对于不同蛋白,形成单体缀合物所需的助溶剂的用量有所不同,可以由本领域普通技术人员确定,无需过度实验。对于不同抗体,有效形成单体缀合物所需的添加剂量也不相同。该用量也可以由本领域普通技术人员确定,无需过度实验。在美国专利第5,712,374号和第5,714,586号中,向缀合反应中加入丙二醇和添加剂,以产生具有较高载药量/收率和聚集减少的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物,其中加入丙二醇的用量范围是总溶液的10%-60%(体积)、优选10%-40%(体积)、最优选约30%(体积);而加入的添加剂包含至少一种C6-C18羧酸或其盐、优选辛酸或其盐,其用量范围是20mM-100mM、优选40mM-90mM、最优选约60mM-90mM。除了丙二醇外,也可以使用其它蛋白相容的有机助溶剂,例如乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等。可以使用一些或所有所述有机助溶剂,将所述药物转移到所述缀合混合物中。
或者,在这些专利中,所述C6-C18羧酸或其盐的浓度可以增至150-300mM,而所述助溶剂浓度可以降至1-10%。在一个实施方案中,所述羧酸是辛酸或其盐。在一个优选的实施方案中,所述羧酸是癸酸或其盐。在另一个优选的实施方案中,所述羧酸是辛酸或其盐,所述辛酸的浓度是200mM,与5%丙二醇或乙醇一起。
在这些专利的另一个替代的实施方案中,可以将浓度范围为总溶液的10%-25%(体积)、优选15%(体积)的叔丁醇加入到缀合反应中,产生具有较高载药量/收率和减少聚集的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物。
这些已确定的缀合条件已用于形成现已作为MylotargTM在市场上销售的CMA-676(吉姆单抗奥佐米星)。自从将该疗法引入到急性髓样白血病(AML)后,通过使用离子交换层析,已经知道加利车霉素不是以均匀方式在所述抗体上分布。大多数加利车霉素分布在约一半的所述抗体上,同时另一半以只含有少量加利车霉素的LCF形式存在。因此,关键是需要改进用于将细胞毒性药物(例如加利车霉素)缀合到载体上的方法,使聚集量最小化并且容许较高的均匀的载药量以及显著改进的缀合产物收率。
一个具体的实例是被称为CMC-544的G5/44-NAc-γ-加利车霉素DMH AcBut缀合物,一般性示于图17。为了开发CMC-544,希望LCF的量减少到小于总抗体量的10%,并且考虑了各种选择以降低LCF水平。所述免疫缀合物的其它特征,例如抗原结合和细胞毒性,必须不受最终解决方法的影响。所考虑的选择包括对所述抗体的遗传或物理修饰、层析分离技术或对反应条件的改进。
采用老的反应条件(CMA-676工艺条件),进行G5/44抗体与NAc-γ-加利车霉素DMH AcBut Osu的反应,生产出具有与CMA-676相似的物理性能(载药量、LCF和聚集)的产品。然而,人们认为缀合后高水平(50-60%)的LCF是不需要的。通过评价统计学实验设计方法中的关键反应变量(例如温度、pH、加利车霉素衍生物投入和添加剂浓度),确定最佳反应条件。对这些实验的分析证明,加利车霉素的投入和添加剂浓度对低缀合部分LCF水平和聚集体形成具有最显著影响,而温度和pH的影响较小。在另外的实验中,也显示出蛋白质性载体(抗体)和助溶剂(乙醇)的浓度对控制LCF和聚集体水平的影响都比较小(与加利车霉素投入和添加剂浓度相比)。为了使LCF降至<10%,将所述加利车霉素衍生物的投入增至相对于反应中抗体量的3%-8.5%(w/w)。将所述添加剂从浓度为200mM的辛酸或其盐(CMA-676工艺)改变成浓度为37.5mM的癸酸或其盐。在稍微升高的温度(30-35℃)和pH(8.2-8.7)下,所述缀合反应进行得更好。在所述反应条件中引入这些改变,将LCF降至小于10%,同时增加了加利车霉素负荷,所述改变的反应条件在下文中称为CMC-544工艺条件或“新”工艺条件。采用CMA-676和CMC-544工艺条件获得的结果比较示于表1。
表1:CMA-676和CMC-544工艺条件的比较
条件/结果 | CMA-676工艺条件 | CMC-544工艺条件 |
加利车霉素投入添加剂种类和浓度温度 | 3.0%(w/w,以药粉重量计)辛酸/辛酸钠200mM26℃ | 8.5%(w/w)癸酸/癸酸钠37.5mM31-35℃ |
pH加利车霉素负荷(%(重量);通过紫外检测)低缀合部分(LCF)(纯化前)聚集(纯化前)聚集(纯化后) | 7.82.4-3.545-65%(HPLC面积)~5%≤2% | 8.2-8.77.0-9.0<10%<5%<2% |
加利车霉素投入的增加使载药量从2.5-3.0%(重量)增至7.0-9.0(重量)(最通常为7.5-8.5%(重量)),而没有引起反应中蛋白聚集的增加。因为减少了聚集体和LCF,CMC-544工艺条件产生了更均一的产物。采用这一新缀合方法,以几克抗体的规模,已经重复制备了CMC-544。
在上述反应中,抗体的浓度范围可以是1-15mg/ml,加利车霉素衍生物(例如N-乙酰γ-加利车霉素DMH AcBut OSu酯(用于制备图17所示的缀合物))的浓度范围可以是所述抗体的约4.5-11%(重量)。所述助溶剂是乙醇,已经证明要得到好结果,乙醇的浓度范围为6-11.4%(体积)。在PBS、HEPES、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)(HEPBS)或其它pH为8-9的相容的缓冲液中,在温度范围为30℃至约35℃下以及在时间范围为15分钟至24小时内,进行所述反应。对于其它类型的缀合物,本领域技术人员可以容易地确定可接受的pH范围。对于不同抗体,已经发现使用稍有改动的上述添加剂组合能改进载药量和单体缀合物收率,人们知道在实际条件下或选用添加剂时,任何具体的蛋白质性载体需要稍加改动,以达到最佳结果。
V.缀合物的纯化和分离
缀合后,可采用常规方法,将所述单体缀合物从未缀合反应物(例如蛋白质性载体和游离细胞毒性药物/加利车霉素)和/或所述缀合物的聚集形式中分离出来,所述常规方法例如大小排阻层析法(SEC)、疏水作用层析法(HIC)、离子交换层析法(IEC)或层析聚焦(CF)。纯化的缀合物是单体,通常含有4-10%(重量)的细胞毒性药物/加利车霉素。在一个优选的实施方案中,所述缀合物采用疏水作用层析法(HIC)纯化。在上述用于生产规模制备细胞毒性药物/加利车霉素-抗体缀合物的工艺(CMA-676工艺)中,采用的单独的缀合后分离步骤是大小排阻层析法(SEC)。虽然该步骤对于去除聚集缀合物以及在制剂中完成缓冲交换来说都非常有效,但在降低LCF含量上却无效。因此,所述基于SEC的工艺完全依赖于所述缀合反应的化学特性,来控制终产物中LCF含量。SEC的另一个缺点是限制了用于上柱的缀合反应混合物的体积(一般不超过5%的工艺柱床体积)。这严重地限制了在给定的生产空间中可以进行的每批规模(因而限制了生产能力)。最后,所述SEC纯化方法也导致所述缀合物溶液的显著稀释,这限制了制剂中能可靠地达到的蛋白质浓度。
当具有高疏水性的细胞毒性药物(例如加利车霉素衍生物)用于缀合时,疏水作用层析法(HIC)是优选的候选方法,能有效分离缀合和未缀合的抗体。比起SEC,HIC具有三个主要优点:(1)具有有效降低LCF含量和聚集体的能力;(2)HIC的上柱量大得多;和(3)HIC避免了产物的过度稀释。
许多的高容量HIC介质适于生产规模应用,例如丁基、苯基和辛基琼脂糖凝胶4FF(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)可在缀合工艺后能够从单体缀合组分中有效地分离出未缀合组分和缀合物聚集体。
VI.组合物和制剂
本发明也提供用于制备治疗或诊断组合物/制剂的方法,所述方法包括将本发明的单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合在一起。
所述单体细胞毒性药物衍生物/载体缀合物可以是所述治疗或诊断组合物/制剂中唯一的活性组分,或者可以与其它活性组分(包括其它抗体组分或非抗体组分)一起使用,所述其它抗体组分例如抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD33抗体、抗T细胞抗体、抗IFNγ抗体或抗LPS抗体;所述非抗体组分例如细胞因子、生长因子、激素、抗激素、细胞毒性药物和黄嘌呤。
可用于治疗增生性疾病(例如癌症)并且可以与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体缀合物联合使用的细胞因子和生长因子包括:干扰素、白介素例如白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
通常用于治疗增生性疾病(例如癌症)并且可与本发明细胞毒性药物衍生物/载体缀合物联合使用的激素包括:雌激素,例如己烯雌酚和雌二醇;雄激素,例如睾酮和氟甲睾酮制剂;孕酮,例如梅格施和普维拉;以及皮质类固醇,例如泼尼松、地塞米松和氢化可的松。
抗激素例如抗雌激素(即他莫昔芬)、抗雄激素(即氟他胺)和抗肾上腺药通常用于治疗增生性疾病(例如癌症),并且可以与本发明细胞毒性药物衍生物/载体缀合物联合使用。
通常用于治疗增生性疾病(例如癌症)并且可与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体缀合物联合使用的化疗药/抗肿瘤药包括但不限于:阿霉素、顺铂、卡铂、长春碱、长春新碱、博来霉素、甲氨蝶呤、多柔比星、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素及其各种类似物以及丝裂霉素。
所述组合物最好包含治疗有效量的本发明缀合物。本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、缓解或预防目标疾病或病症所需的治疗药的剂量,或者是表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗药的剂量。对于任何缀合物,可以在开始的细胞培养实验中或在动物模型中评价所述治疗有效量,所述动物模型通常是啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类。所述动物模型也可用于确定合适浓度范围和给药途径。所述信息可以用来确定给予人体的有用剂量和途径。
给予人类患者的精确有效剂量将取决于所述患者的疾病状态的严重程度、一般健康状况、年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、对治疗的反应敏感性和耐受性/反应。该剂量可以通过常规实验来确定,并且由临床医生进行判断。一般来说,有效剂量为0.1mg/m2-50mg/m2、优选0.4mg/m2-30mg/m2、更优选2mg/m2-9mg/m2,所述剂量是以蛋白质性载体为基础来计算。
可以将组合物单独给予患者,或者可以与其它试剂、药物或激素联合给药。本发明的单体细胞毒性药物衍生物/抗体缀合物的给药剂量取决于待治疗病症的性质、恶性淋巴瘤或白血病的程度,并取决于将所述缀合物是用于预防还是用于治疗已有的病症。
给药频率取决于所述缀合物的半寿期及其效果的持续时间。如果所述缀合物的半寿期短(例如2-10小时),每天必须给予1次或多次。或者,如果所述缀合物分子的半寿期长(例如2-15天),可只须每天给药一次、每周一次、甚至每1个月或2个月一次。
组合物也可含有药学上可接受的载体,用于所述抗体缀合物的给药。所述载体自身不应诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体,也不应有毒。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子例如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒粒子。
可以使用药学上可接受的盐,例如无机酸的盐或有机酸的盐,所述无机酸的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐;所述有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
在这些组合物中的药学上可接受的载体可额外地包括液体,例如水、盐水、甘油和乙醇。另外,在所述组合物中可以存在辅料,例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质。所述载体使所述组合物能够配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂或混悬剂,用于让患者摄入。
优选的给药形式包括适于胃肠外给药的形式,例如通过注射或输注,例如通过快速浓注或连续输注。当产物用于注射或输注时,可以采用混悬剂、溶液剂或溶于油或水性溶媒的乳剂形式,而且可以含有配方剂,例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。
虽然缓冲的缀合溶液的稳定性对短时稳定性是足够的,但是长期稳定性差。为了增强所述缀合物的稳定性并增加其存放期,所述抗体-药物缀合物可以冻干成为干形式,临用前用合适的无菌液体重建。蛋白质溶液冻干的相关问题已有文献充分描述。在冷冻和干燥工艺中可发生二级、三级或四级结构的损失。因此,可以采用作为所述缀合物的非晶形稳定剂的防冻剂,在冻干工艺中保持所述蛋白的结构完整性。在一个实施方案中,用于本发明的防冻剂是糖醇,例如糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇和它们的组合。在另一个实施方案中,所述防冻剂是糖酸,包括醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸和它们的组合。
本发明的防冻剂也可以是糖类。合适的糖是含有两个或多个羟基的醛化合物或酮化合物。所述糖可以是环状或线状,包括例如醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸或醛糖二酸或它们的组合。所述糖也可以是单糖、二糖或多糖,例如二糖或多糖。合适的糖包括例如甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神经氨酸或它们的衍生物。合适的多糖包括例如阿聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如菊糖等)、果聚糖、岩藻依聚糖、卡拉胶、半乳卡罗聚糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、石脐素、壳多糖、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原酸胶或淀粉。其中尤其有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖以及它们的组合。蔗糖是特别有用的防冻剂。
本发明的防冻剂最好是糖或可以作为多羟基醇的糖醇。多羟基化合物是含有不止一个羟基的化合物。所述多羟基化合物最好是线状的。合适的多羟基化合物包括例如二元醇(例如乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇)、丙三醇或季戊四醇;或它们的组合。
在一些优选的实施方案中,所述防冻剂是蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇。
一旦配制好,本发明的组合物可以直接给予患者。待治疗的所述患者可以是动物。然而,最好所述组合物适合给予人类患者。
本发明的组合物可以通过任何常规途径给药,所述常规途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(参见PCT公布号WO 98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。也可采用无针注射器(Hyposprays)给予本发明的组合物。所述组合物通常可以制备成注射用溶液剂或混悬剂。也可在注射前,制备适于溶于液体溶媒的溶液剂或混悬剂的固体形式。
所述组合物的直接给药通常是通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来完成,或者通过向组织的胞间隙给药来完成。也可以将所述组合物给予病灶部位中。给药治疗可以是单给药时间表或多给药时间表。
人们知道,所述组合物中的活性组分是细胞毒性药物/蛋白质性载体缀合物。因此,它对胃肠道中的降解将会是敏感的。因此,如果所述组合物是采用胃肠道途径给药的话,需要让所述组合物含有保护所述缀合物免遭降解、但当它从胃肠道吸收后又能释放所述缀合物的试剂。
对药学上可接受的载体的充分讨论可见于Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
本发明尤其提供了单体加利车霉素衍生物/人源化抗CD22抗体(G5/44)即CMC-544,用于治疗以细胞在其表面表达CD22抗原为特征的增生性疾病。
本发明还提供CMC-544在制备用于治疗以细胞表达CD22为特征的增生性疾病的组合物或药物中的用途。
CMC-544也可用于任何疗法,其中最好是降低存在于用本文公开的所述组合物或药物治疗的患者中表达CD22的细胞水平。具体地说,所述组合物或药物用于治疗增生性疾病(即淋巴瘤和白血病)的人类患者或动物患者,所述淋巴瘤和白血病在其细胞表面表达CD22抗原。这些表达CD22的细胞可以在体内循环,或者以不需要的大量数目定位于体内特定部位。
CMC-544也优选用于治疗B淋巴细胞谱系恶性肿瘤包括淋巴瘤和白血病,最优选非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。CMC-544可单独使用或与其它生物活性剂联用,以治疗B细胞恶性肿瘤患者。
常用的生物活性剂包括生长因子、细胞因子和细胞毒性药物。常用于治疗增生性疾病(例如癌症)并且可与CMC-544联合使用的细胞毒性药物包括:蒽环霉素,例如多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺拉霉素、美诺立尔、pitarubicin和戊柔比星,至多3天;以及嘧啶核苷或嘌呤核苷,例如阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉曲滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌罗霉素、替加氟、噻唑呋林。可与CMC-544联用的其它化疗药/抗肿瘤药包括:阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、氮芥、泼尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素及其各种类似物以及丝裂霉素。CMC-544可以同时与一种或多种这样的治疗药一起给药。或者,CMC-544可以与一种或多种这样的治疗药序贯给药。
CMC-544也可单独给药,或者与作为治疗方案组成部分的其它生物活性剂和化疗药同时或序贯给药,所述其它生物活性剂例如生长因子、细胞因子、类固醇、抗体例如抗CD20抗体、利妥昔单抗(RituxanTM)。用于治疗恶性淋巴增生性疾病的确定治疗方案包括:CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)、CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)、COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松)、m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)、ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)、ProMACE-CytaBOM(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱)、MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量泼尼松、博来霉素和亚叶酸)、MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)、ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)、MOPP与ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春碱)交替使用以及MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)交替使用以及ChIVPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和泼尼松)。治疗可包含诱导治疗期、巩固治疗期和维持治疗期。CMC-544也可单独给药,或者与作为诱导治疗期、巩固治疗期和维持治疗期组成部分的任何上述治疗方案同时或序贯给药。
本发明的缀合物也可与作为组合化疗方案组成部分的其它生物活性剂和化疗药同时给药,用于治疗复发性侵袭性淋巴瘤。所述治疗方案包括:IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、MIME(米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、EPOCH(依托泊苷、长春新碱和多柔比星给予96小时,同时给予快速浓注环磷酰胺和口服泼尼松)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素)、CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松)、CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、CHOP-B.(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和博来霉素)、CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博来霉素)和P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和泼尼松)。用于侵袭性淋巴瘤的其它治疗方案可包括:在1期首先用CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)-利妥昔单抗(RituxanTM)-CMC-544治疗,接着在2期和3期用CHOP-利妥昔单抗(RituxanTM)CHOP-CMC-544或CHOP-利妥昔单抗(RituxanTM)-CMC-544治疗。或者,1期首先用COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)-利妥昔单抗(RituxanTM)-CMC-544,接着在2期和3期用COP-利妥昔单抗(RituxanTM)、COP-CMC-544或COP-利妥昔单抗(RituxanTM)-CMC-544治疗。在另一个实施方案中,侵袭性淋巴瘤的治疗可以包括在1期首先或第二用所述抗体药物缀合物CMC-544治疗,接着在2期和3期用以下治疗方案:CMC-544和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)、CMC-544和COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)或单用利妥昔单抗(RituxanTM)。在又一个实施方案中,侵袭性淋巴瘤的治疗可以包括首先或一线用抗体药物缀合物CMC-544治疗,接着在2期和3期单独用CMC-544或与其它治疗方案联用,所述其它治疗方案包括但不限于:ESHOP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂)、EPOCH(依托泊苷、长春新碱和多柔比星给予96小时,同时给予快速浓注环磷酰胺和口服泼尼松)、IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、ASHAP(多柔比星、甲强龙制剂、Ara-C和顺铂)、MIME(米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)和ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷)。该应用中提供的用于化学治疗恶性肿瘤的各种细胞毒性药物的细节(包括联合化疗方案、剂量等)可参见Cancer Principles and Practiceof Oncology,Vincent T,DeVita,Samuelo Hellman,Steven A.Rosenberg编著,第6版,Lippincott,Williams and Wilkins出版(2001)和Physician’s Cancer Chemotherapy Drug Manual,Edward Chu和VincentT.DeVita编著,Jones and Bartlett出版(2002)。
本发明也提供治疗患有以细胞表达CD22为特征的增生性疾病或有罹患该病风险的人类患者或动物患者的方法,所述方法包括给予所述患者有效量的本发明CMC-544。
在以下具体工作实施例中进一步描述了本发明,所述实施例是为了进一步描述本发明的目的,而不是限制本发明的范围。
实施例1
候选抗体的产生
一系列的抗CD22抗体是采用以下的选择标准从杂交瘤中选出的:与Daudi细胞结合,在Daudi细胞上内化,与外周血单核细胞(PBMC)结合,在PBMC上内化,亲和力(大于10-9M),小鼠γ1和产率。5/44是作为优选的抗体而被选出的。
I.嵌合5/44抗体分子的基因克隆和表达
a)5/44杂交瘤细胞的制备及其RNA制备
杂交瘤5/44是用人CD22蛋白免疫小鼠后通过常规杂交瘤技术产生的。RNA是采用RNEasy试剂盒(Qiagen,Crawley,UK;目录号74106)从5/44杂交瘤细胞制备的。如下所述,将所获得的RNA逆转录成cDNA。
b)CD22在NHL肿瘤上的分布
使用5/44抗CD22单克隆抗体进行免疫组织化学研究,来检查染色的发生率和分布。在该项研究中包括对照抗CD20抗体和抗CD79a抗体,以确定肿瘤的B细胞区。
共研究了50个肿瘤,并且采用Working Formulation和REAL分类系统将这些肿瘤如下分类:
·7个B成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(高/I)
·4个B-CLL/小淋巴细胞性淋巴瘤(低/A)
·3个淋巴浆细胞样瘤(lymphoplasmacytoid)/免疫细胞瘤(低/A)
·1个外套细胞淋巴瘤(中/F)
·14个滤泡性中心细胞淋巴瘤(低至中/D)
·13个弥散性大细胞淋巴瘤(中至高/G,H)
·6个不能分类的淋巴瘤(K)
·2个T细胞淋巴瘤
用0.1μg/ml的5/44抗体,有40个B细胞淋巴瘤对CD22抗原呈阳性,并且当将浓度提高至0.5μg/ml时,又有6个呈阳性。对于剩下的2个B细胞瘤来说,在0.1μg/ml时呈阴性,剩余的组织不足以用较高浓度测试。然而,用另一种称为6/13的抗CD22抗体(Celltech,Slough,UK)进行的平行试验给出比5/44更强的染色,结果所有48个B细胞淋巴瘤对CD22的染色呈阳性。
因此,可以推断CD22抗原在B细胞淋巴瘤上广泛表达并因此为NHL的免疫疗法提供了一个合适的靶。
c)5/44VH和VL的PCR克隆
使用逆转录酶合成编码5/44重链可变区和轻链可变区的cDNA序列,产生存在于总RNA中的mRNA的单链cDNA拷贝。然后采用特定的寡核苷酸引物,通过聚合酶链式反应(PCR),使用cDNA为模板用于扩增鼠V区序列。
i)cDNA合成
在含有以下试剂的20μl反应体积中合成cDNA:50mM Tris-HCl(pH 8.3),75mMKCl,10mM二硫苏糖醇,3mM MgCl2,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.5mM,20单位RNAsin,75ng随机六核苷酸引物,2μg 5/44RNA和200单位莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶。42℃保温60分钟后,通过95℃加热5分钟终止该反应。
ii)PCR
使用对重链和轻链具有特异性的引物组合,将cDNA的等分样品进行PCR。将设计成与信号肽的保守序列一起退火的简并引物库用作正向引物。所有这些序列都依次含有一个自其5’端7个核苷酸开始的限制位点(VL SfuI;VH HindIII)、使所获得的mRNA最佳翻译的序列GCCGCCACC(SEQ ID NO:50)、一个起始密码子和基于已知小鼠抗体的前导肽序列的20-30个核苷酸(Kabat等,Sequence ofproteins of immunological interest,第5版,1991,U.S.Department ofHealthand Human Services,Public Health Service,National Institutes ofHealth(美国健康与人类服务部,公共健康服务,国家健康协会))。
将3’引物设计成跨越该抗体的构架4 J-C接点并含有酶BsiWI的限制位点,以使VL PCR片段的克隆容易进行。重链3’引物为设计成跨越该抗体J-C接点的混合物。该3’引物包括ApaI限制位点,以使克隆容易进行。该引物的3’区含有基于在已知的小鼠抗体中发现的那些序列的混合序列(Kabat等,1991,参见上文)
上述引物组合能使VH和VL的PCR产物直接克隆到合适的表达载体中(参见下文),从而制备嵌合(小鼠-人)重链和轻链,并用于这些在哺乳动物细胞中表达的基因制备所需同种型的嵌合抗体。
按以下方法进行用于PCR的保温(100μl)。每份反应物含有10mMTris-HCl(pH 8.3),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.01% w/v明胶,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25mM,10pmole 5’引物混合物,10pmole 3’引物,1μlc DNA和1单位Taq聚合酶。将反应物在95℃保温5分钟然后经过以下循环:94℃ 1分钟、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟。30个循环后,通过琼脂糖凝胶电泳分析每份反应物的等分样品。
对于重链V区来讲,扩增的DNA产物只有当在构架I的起始位点内退火的引物库取代信号肽引物库时才能获得。将片段克隆到DNA测序载体中。测定DNA序列并翻译以给出推导出的氨基酸序列。该推导出的序列可通过参照通过实验确定的N端蛋白质序列来证实。图1显示小鼠单克隆抗体5/44的CDR的氨基酸序列。图2和图3分别表示小鼠单克隆抗体5/44的成熟轻链V区和重链V区的DNA/蛋白质序列。
iii)PCR片段的分子克隆
然后将鼠V区序列克隆到表达载体pMRR10.1和pMRR14(图7和图8)中。这些是用于分别含有编码人κ轻链和人γ-4重链恒定区的DNA的轻链和重链表达的载体。使用SfuI和BsiWI限制位点,通过限制性消化并与测序载体连接,将所述VL区亚克隆到表达载体中,产生质粒pMRR10(544cL)(图8)。使用5’引物通过PCR扩增重链DNA引入信号肽,由于这在所述克隆策略—使用来自不同的近交(in-house)杂交瘤(称为162)的小鼠重链抗体前导序列并没有获得。该5’引物具有以下的序列:5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’(SEQ ID NO:51)。
反向引物与用于最初的VH基因克隆的引物相同。将所得PCR产物用酶HindIII和ApaI消化,然后将其亚克隆,并确证其DNA序列,产生质粒pMRR14(544cH)(图7)。将这两种表达载体瞬时共转染到CHO细胞中,产生嵌合c5/44抗体。按照生产商的方案(InVitrogen:Life Technology,Groningen,The Netherlands.目录号11668-027),使用Lipofectamine试剂,完成这一步。
II.糖基化位点和活性赖氨酸的去除
在CDR-H2中观察到一个潜在的N-联糖基化位点序列,该序列具有氨基酸序列N-Y-T(图3)。对5/44及其片段(包括Fab)进行的SDS-PAGE、蛋白质印迹法和凝胶糖染色法表明该位点的确糖基化(未显示)。另外,在CDR-H2内暴露的位置观察到赖氨酸残基,其通过提供与可以缀合抗体的试剂缀合的额外位点,有可能降低所述抗体的结合亲和力。
一个PCR策略是用于在CDR-H2序列中引入氨基酸取代,以去除糖基化位点和/或活性赖氨酸,如图4所示。使用编码突变N55Q、T57A或T57V的正向引物来去除所述糖基化位点(图4),并产生含有取代K60R的第4个正向引物,以去除所述活性赖氨酸残基(图4)。在这些PCR扩增的每一个中都使用构架4反向引物。PCR产物用酶XbaI和ApaI消化并插入到pMRR14(544cH)(也用XbaI和ApaI切割)中,产生编码这些突变体的表达质粒。N55Q、T57A和T57V突变通过远离共有序列N-X-T/S处改变氨基酸序列可去除所述糖基化位点,同时K60R突变导致潜在的活性赖氨酸被带同样正电荷的残基精氨酸取代。将所得cH变异质粒与cL质粒一起共转染,产生已表达嵌合抗体变异体。
III.嵌合基因活性的评价
瞬时转染到CHO细胞并通过BiaCore分析测定亲和力常数后,对所得嵌合基因的活性进行评价。
采用BIA技术,对嵌合5/44或其变异体与CD22-mFc构建体结合的亲和力进行研究,其中所述嵌合5/44或其变异体的糖基化位点或活性赖氨酸已被去除。结果示于图9。所有结合测定都在BIAcoreTM2000仪器(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)中进行。通过固定化抗小鼠Fc捕获CD22mFc,进行该项测定。该抗体存在于可溶相中。将样品、标准品和对照(50μl)注射到固定化抗小鼠Fc上,然后注射到可溶相中的抗体上。每个循环之后,所述表面用50μl的40mM HCl以30μl/min再生。运用BIAevaluation 3.1软件(Pharmacia),进行动力学分析。
与嵌合5/44相比,构建体T57A中糖基化位点的去除导致缔合速率(on-rate)稍微加快而解离速率(off-rate)显著减慢,得到的亲和力改进约为5倍。N55Q突变对亲和力没有影响。该结果是意想不到的,因为这表明糖本身的去除对结合没有明显的影响(如同N55Q改变一样)。仅在T57A改中中观察到改进的亲和力。一种可能的解释是,无论是否存在糖,位置57的苏氨酸对结合都产生负面影响,所述结合在苏氨酸转变成丙氨酸时去除。丙氨酸较小是重要的并且苏氨酸的负面影响与其大小有关的假设,可以从使用T57V突变得到的结果得到支持:57位被缬氨酸取代并不好(结果未显示)。
通过K60R突变去除赖氨酸残基对亲和力无影响,即引入精氨酸残基消除了潜在的活性位点而不影响亲和力。
因此,用于去除糖基化位点和用于去除活性赖氨酸的突变均包括在人源化设计中。
实施例2
5/44的CDR移植
上面已经描述了5/44抗体重链可变区和轻链可变区基因的分子克隆及其制备嵌合(小鼠/人)5/44抗体的用途。小鼠5/44 VL区和VH区的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于图2和图3(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。按照Adair等(PCT申请号WO 91/09967)的方法,本实施例描述了将5/44抗体CDR移植到人构架上,以降低人体内的可能免疫原性。
I.5/44轻链的CDR移植
蛋白质序列与来自人亚型Iκ轻链V区的共有序列比对表明有64%序列同一性。因此,为构建CDR移植轻链,所选的受体构架区对应于人VK亚型I种系O12,DPK9序列的那些序列。构架4受体序列来源于人J区种系序列JK1。
鼠5/44构架区的氨基酸序列与受体序列的比较在图5给出,并显示在供体链和受体链之间有27处不同。在每个位置,对鼠源残基通过对堆积(packing)或在VH/VL界面产生影响而直接或间接对抗原结合产生贡献的可能性进行分析。如果认为一个鼠源残基重要并且与人源残基在大小、极性或电荷方面明显不同,那么就该保留鼠源残基。基于此分析,构建了两种具有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20(图5)给出的序列的CDR移植轻链。
II.5/44重链的CDR移植
采用与用于轻链描述的方案相同的策略,完成5/44重链的CDR移植。发现5/44重链的V区与属于亚型I的人重链同源(70%序列同一性),因此用人亚型I种系构架VH1-3,DP7的序列作为受体构架。构架4受体序列来源于人J区种系序列JH4。
5/44重链与构架区的比较示于图6,其中可以发现5/44重链与受体序列在位置22不同。分析这些序列中的任何序列可能对抗原结合的贡献,从而构建了5种具有以下给定序列的CDR移植重链:SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:27(图6)。
III.用于移植序列的基因的构建
将基因设计成编码移植序列gH1和gL1,并设计和构建系列重叠寡核苷酸(图10)。采用PCR装配技术来构建CDR移植V区基因。配制100μl含有以下组分的反应体积:10mM Tris-HCl(pH8.3),1.5mMMgCl2,50mM KCl,0.001%明胶,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25mM,“内部”引物(T1、T2、T3、B1、B2、B3)各1pmole,“外部”引物(F1、R1)各10pmole和1单位Taq聚合酶(AmpliTaq,AppliedBioSystems,目录号N808-0171)。PCR循环参数为94℃ 1分钟、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟,30个循环。然后将反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,切下电泳条带,使用QIAGEN离心柱(QIAquick凝胶提取试剂盒,目录号28706)进行回收。用30μl体积洗脱DNA。然后按照生产商的说明,将gH1和gL1 DNA的等分样品(1μl)克隆到InVitrogen TOPO TA克隆载体pCR2.1 TOPO(目录号K4500-01)中。该非表达载体用作克隆中间体,以便于对大量克隆进行测序。使用载体特异性引物,通过DNA测序来鉴定含有gH1和gL1的正确克隆,产生质粒pCR2.1(544gH1)和pCR2.1(544gL1)(图11和图12)。
使用寡核苷酸盒置换法来产生人源化移植物gH4、gH5、gH6和gH7以及gL2。图13表示寡核苷酸盒的设计。为构建每种变异体,用所示的限制性酶(对于重链而言为XmaI/SacII,对于轻链而言为XmaI/BstEII)切下载体(pCR2.1(544gH1)或pCR2.1(544gL1))。将大载体片段用琼脂糖凝胶电泳纯化并用于与寡核苷酸盒连接。这些盒由2种互补寡核苷酸(如图13所示)组成,在200μl体积(12.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、2.5mM MgCl2、25mM NaCl、0.25mM二硫赤藓糖醇)中以0.5pmole/μl的浓度混合。通过在水浴(500ml体积)中加热至95℃达3分钟,然后让反应物慢慢冷却至室温,完成退火。将已退火的寡核苷酸盒用水稀释10倍,然后将其连接到合适的切割载体中。用DNA测序来证实正确的序列,产生质粒pCR2.1(5/44-gH4-7)和pCR2.1(5/44-gL2)。然后将这些经证实的移植序列亚克隆到表达载体pMRR14(重链)和pMR10.1(轻链)中。
IV.CDR移植序列的CD22结合活性
在各种组合中,将编码移植变异体的载体与原始嵌合抗体链一起共转染到CHO细胞中。在竞争测定中,比较原始小鼠5/44抗体的结合对与Ramos细胞(得自ATCC,一种表达表面CD22的伯基特淋巴瘤成淋巴细胞性人细胞系)结合的竞争的结合活性。该测定被认为是比较移植物与细胞表面CD22结合的能力的最佳方法。结果示于图14和图15。正如所见到的,在任何移植物之间存在非常小的差异,在竞争抗鼠亲代方面所有都表现出比嵌合体更有效。在CDR-H2(gH6和gH7)末端引入3个额外的人源残基并不会明显影响结合。
选择与最少数量的鼠源残基结合的移植物即gL1gH7。轻链移植物gL1有6个供体残基。残基V2、V4、L37和Q45是潜在的重要堆积残基。残基H38位于VH/VL界面。残基D60为靠近CDR-L2的表面残基并且可直接对抗原结合作出贡献。这些残基中,V2、L37、Q45和D60存在于来自其它亚型的人κ基因的种系序列。重链移植物gH7有4个供体构架残基(根据CDR移植中使用的结构定义(参见Adair等(1991)(PCT申请号WO 91/09967),残基R28被认为是CDR-H1的一部分)。残基E1和A71为靠近CDR的表面残基。残基I48为潜在的堆积残基。残基T93存在于VH/VL界面。这些残基中,E1和A71存在于人亚型I的其它种系基因中。残基I48存在于人种系亚型4中,而T73存在于人种系亚型3中。
轻链和重链两者的全部DNA序列和蛋白质序列,包括由载体提供的恒定区基因内的内含子的大致位置,如图16所示,并分别在SEQID NO:29和SEQ ID NO:28中给出(对于轻链)以及分别在SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:30中给出(对于重链)。
从这些载体中切下编码这些轻链和重链基因的DNA。重链DNA在5’HindIII位点消化,然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段处理,产生5’平端。在3’EcoRI位点切割,产生重链片段,然后通过琼脂糖凝胶纯化。以同样的方式,产生轻链片段,在5’SfuI位点平端化并用3’EcoRI位点。将这两个片段克隆到基于DHFR的表达载体中并用来在CHO细胞中产生稳定的细胞系。
实施例3
NAc-γ加利车霉素DMH ACBUT与人源化抗CD22抗体(G5/44)的缀合
在典型的缀合反应中,将人源化抗CD22抗体(G5/44)缀合到NAc-γ加利车霉素DMH AcBut OSu(加利车霉素衍生物)(参见图17)上,其中所述目标蛋白质浓度为7.5mg/ml,而所述目标加利车霉素衍生物负荷为蛋白的8.5%(重量)。目标反应的pH是8.5±0.2,其它反应组分的目标浓度如下:50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)(HEPBS)、37.5mM癸酸钠和9% v/v总乙醇。反应在33℃±2℃进行1小时。纯化前该典型反应的分析结果如下:蛋白:7.34mg/ml;加利车霉素负荷:82.7μg/mg;聚集体:93.25%;和未缀合蛋白(LCF):1.07%(HPLC的UV面积%)。
检测了不同的表面活性添加剂及其浓度对产物收率和纯度的影响,以确定它们对缀合单体生产的影响(参见表2)。除了添加剂及其浓度外,在所有条件都保持恒定下进行反应。分析这些反应产生的所述缀合物的蛋白质浓度、加利车霉素负荷、聚集体含量和LCF。虽然范围从C6(己酸)至C12(十二烷酸)的所有正羧酸都得到可接受的结果,但是用浓度为30mM-50mM的癸酸得到最佳的总体结果(低LCF、低聚集体和单体缀合物的高收率)。
表2:添加剂的种类和浓度对缀合结果的影响
添加剂/浓度 | 蛋白质收率(收率%) | 聚集体百分率 | LCF百分率 |
己酸-500mM | 51.3 | 3.36 | 38.3 |
庚酸-400mM | 49.9 | 4.7 | 20.6 |
辛酸-200mM | 57.3 | 3.27 | 10.6 |
壬酸-100mM | 54.7 | 1.41 | 0.3 |
癸酸-50mM | 56.7 | 1.35 | 0.2 |
十一烷酸-20mM | 46.9 | 2.95 | 0.6 |
十二烷酸-5mM | 65.6 | 0.78 | 7.0 |
实施例4
层析纯化方法
I.层析分离方法
虽然已鉴定丁基琼脂糖凝胶4FF为最好的HIC介质,但是使用其它树脂例如辛基琼脂糖凝胶FF、PPG-600C(Tosoh Biosep)、FractogelEMD Propyl(EM Processing)和Source 15ISO(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)、用略有变动的层析条件,也可得到可接受的结果。
用于纯化的原料是含有7.2mg/mL蛋白、加利车霉素衍生物负荷为83μg/mg、聚集体含量为10.1%(HPLC面积%)和LCF含量为5.6%(HPLC面积%)的缀合反应混合物。
缀合反应完成后,加入磷酸钾溶液,将反应混合物稀释4倍,使最终磷酸盐浓度为0.7M(pH 8.2)。混合后,将该溶液通过0.45μm滤器过滤。将稀释液加样到丁基琼脂糖凝胶4FF柱上。柱上负载的总蛋白量为29mg/ml床体积。用0.7M磷酸钾洗涤后,用0.7M-4 mM磷酸钾(pH 8.2)分步梯度洗脱柱子。将分步梯度洗脱的流分合并用于进一步处理,合并液由聚集体和LCF各小于1%(面积)的单体缀合物组成。将该合并液加样到葡聚糖凝胶G-25(Amersham Biosciences)脱盐柱上,用于与适合于制剂的缓冲液交换,所述缓冲液由20mMTris-Cl和100mM氯化钠(pH 8.0)组成。纯化并经缓冲液交换的CMC-544制备物具有以下特征:加利车霉素负荷:81μg/mg;聚集体:0.4%(HPLC面积%);LCF:0.8%(HPLC面积%)。
实施例5
NAc-γ加利车霉素DMH ACBUT-G5/44免疫缀合物(CMC-544)的结合分析
对用上述缀合方法产生的人源化抗CD22抗体(G5/44)与加利车霉素的免疫缀合物(CMC-544)进行结合研究分析,以确定使用改进工艺产生的所述缀合物是否具有任何对抗原结合的副作用。表3显示所述缀合方法对所述抗原与抗体结合亲和力没有任何影响。用老缀合方法或新缀合方法制备的CMC-544免疫缀合物均以相似的亲和力与靶抗原结合,所述亲和力与未缀合的抗体G5/44没有差异。
表3:用CMA-676缀合方法和CMC-544缀合方法制备的CMC-544的结合亲和力
抗CD22抗体 | K<sub>D</sub>(M) | K<sub>A</sub>(1/M) | K<sub>d</sub>(1/s) | K<sub>a</sub>(1/Ms) | LCF百分率 |
人源化B5/44 | 1.30×10<sup>-10</sup> | 7.90×10<sup>9</sup> | 2.80×10<sup>-5</sup> | 2.20×10<sup>5</sup> | 100 |
CMC-544(21μg/mg)(CMC-676工艺) | 1.20×10<sup>-10</sup> | 8.1×10<sup>9</sup> | 6.10×10<sup>-5</sup> | 4.90×10<sup>5</sup> | 25 |
CMC-544(87μg/mg)(CMC-544工艺) | 1.50×10<sup>-10</sup> | 6.60×10<sup>9</sup> | 6.90×10<sup>-5</sup> | 4.60×10<sup>5</sup> | 3.3 |
用BIAcore 2000(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)进行生物传感器分析。用标准胺偶联化学在蛋白密度约2000共振单位时,将CD22mFc共价固定在N-羟基琥珀酰亚胺活化的羧甲基葡聚糖包埋的生物传感器芯片(CM5)上。CMC-544样品或G5/44样品在HBS缓冲液(10mMHEPES(pH 7.4)、含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%聚山梨酯20(v/v))中稀释,然后以1-100nM的浓度范围、以30μl/分的流速、在3分钟内注射到CD22mFc包埋的生物传感器芯片表面,进行结合。结合后,用HBS缓冲液将所述芯片洗涤15分钟,来监测结合抗体的解离。用15μl再生缓冲液(10mM NaOH和200Mm NaCl)洗涤生物传感器芯片达30秒,使抗原表面再生,然后在下一次循环之前稳定2分钟。采用1:1朗缪尔结合曲线拟合模型和BIA评价程序(版本3.0,BIAcore),用非线性最小二乘方回归分析,来计算动力学常数。通过表面胞质基因共振分析,用共价固定在生物传感器芯片上的CD22mFc评价抗原与CMC-544的结合。CMC-544和G5/44与CD22mFc结合的动力学分析结果显示,当所述数据在补偿了质量转移后完全符合1:1朗缪尔结合模式,CMC-544和未缀合的G544均以相近的亲和力结合CD22(CMC-544:CD22 KD=200pM;G5/44:CD22 KD=235pM)。与加利车霉素的缀合不影响G5/44有效结合CD22mFc的能力。
用流式细胞仪也检测了CMC-544和G5/44与在B淋巴瘤细胞表面表达的CD22的结合。在该评价中,将抗CD33mAb吉姆单抗(hP67.6)及其加利车霉素缀合物CMA-676(吉姆单抗奥佐米星)用作同种型匹配的对照。利妥昔单抗(RituxanTM),即一种嵌合人IgG1抗人CD20 mAb用作阳性对照。纯化人多克隆IgG1和IgG4也可用作阴性对照。CMC-544和G5/44与Ramos或RL BCL上的CD22的结合是相似的,由人多克隆IgG4来区别。RL BCL显示出比Ramos BCL低的CD22表面表达。相反,CMA-676或gL1gH7与两种BCL的结合与人多克隆IgG4的结合相似,这与它们缺乏CD33表达是一致的(数据未显示)。相同细胞证明了抗CD20利妥昔单抗(RituxanTM)的强结合。与hP67.6和CMA-676不同,CMC-544和G5/44都证明不与CD22-CD33+HL-60白血病细胞结合(数据未显示)。这些结果表明,G5/44与加利车霉素的缀合不影响其抗原特异性。CMC-544特异性识别人B细胞上的CD22,但不能识别鼠、大鼠、犬、猪或灵长类(狒狒和猕猴)B细胞上的CD22(数据未显示)。
实施例6
CMC-544的体外和体内效应分析
I.体外细胞毒性
比较了用CMA-676和CMC-544工艺制备的CMC-544在体外对CD22+ B细胞淋巴瘤细胞系、RL、Daudi、Raji和Ramos生长的影响。靶向人CD33(CMA-676)的同种型匹配的加利车霉素缀合物用于显示所述缀合物的抗原非特异性效应。在评价中使用未缀合的NAcγ加利车霉素DMH(所述药物在酸水解时从所述缀合物中释放),显示所用的每种所述细胞系都对加利车霉素的致死效应敏感。表4显示这些基于加利车霉素等同物评价的结果,而表5是以缀合的抗体蛋白的浓度的表达方式来显示这些结果。CD22-介导的加利车霉素向CD22+细胞的传递,在杀死靶细胞的效率上是未缀合药物本身的至少10倍。同种型匹配的对照缀合物(CMA-676)显示细胞毒性小于或等于未缀合的加利车霉素衍生物。显然,表4中用CMC-544缀合方法制备的缀合物可以以比用CMA-676缀合方法制备的缀合物较低抗体浓度,产生相等的细胞毒性效应。
表4:缀合的加利车霉素对生长的抑制(加利车霉素的IC50Pm)
B细胞淋巴瘤系 | CMC-544工艺CMC-544负荷65μg/mg | CMC-676工艺CMC-544负荷35μg/mg | 阴性对照CMC-676负荷35μg/mg | N-乙酰γ加利车霉素DMH |
RL #1#2 | 612 | 3040 | 600400 | 226270 |
Daudi #1 | 21 | 80 | 1886 | 260 |
Raji #1#2 | 500560 | ND*520 | 28004100 | 460490 |
Ramos #1#2 | 200260 | 130ND | NDND | 7001000 |
*ND,未检测
表5:缀合的抗体对生长的抑制(抗体的IC50μg/ml)
B细胞淋巴瘤系 | CMC-544工艺CMC-544负荷65μg/mg | CMC-676工艺CMC-544负荷35μg/mg | 阴性对照CMC-676负荷35μg/mg | 抗体对照G5/44 |
RL #1#2 | 0.090.18 | 0.861.14 | 17.1411.43 | >100>100 |
Daudi #1 | 0.32 | 2.29 | 53.89 | >100 |
Raji #1#2 | 7.698.62 | *ND14.86 | 80.00117.14 | >100>100 |
Ramos #1#2 | 3.084.00 | 3.71ND | NDND | >100>100 |
*ND,未检测
体内细胞毒性。在B细胞淋巴瘤异种移植物中,进一步评价了用CMC-544工艺制备的CMC-544。在这些研究中,使用了两种B细胞淋巴瘤,即RAMOS和RL。RL淋巴瘤来源于非伯基特NHL的细胞系,而RAMOS最初来源于伯基特淋巴瘤。在图18所示的示例性实验中,显示了CMC-544及其鼠抗体对应物以剂量依赖性方式对抑制RAMOS B细胞淋巴瘤的生长有效。
所述人源化抗体缀合物显示出比其鼠对应物更有效。在这项研究中,能引起对淋巴瘤生长的显著抑制的加利车霉素缀合物最低剂量是10μg/kg缀合的NAc-γ加利车霉素DMH。相反,以与缀合物相似的时间表、10mg/Kg腹膜内给予未缀合的抗体G5/44,对肿瘤生长无效。
用RL淋巴瘤模型进行了同样的研究。表6显示对三次独立实验的综合分析,在所述实验中评价了CMC-544在裸鼠中对大小为300-400mg的RL NHL肿瘤的抗肿瘤效应。以剂量依赖性方式的CMC-544在3周期限内引起肿瘤消退。从这些研究的统计学分析中,确定了CMC-544在RL淋巴瘤模型中最小有效剂量为20μg/kg(基于加利车霉素含量)。这三次研究中都没有死亡。CMC-544的更高剂量(60-320μg/kg)引起RL淋巴瘤几乎完全消退。综上所述,从两个B细胞淋巴瘤模型中获得的结果清楚地证明了CMC-544引起肿瘤消退的能力。
表6:CMC-544对裸鼠体内RL NHL异种移植物的抗肿瘤效应
用RAMOS和RL淋巴瘤模型,也调查了所述新工艺制备的CMC-544抑制大的已建立的B细胞淋巴瘤异种移植物生长的能力。保持原来的第1天、第5天和第9天给药时间表,将CMC-544或同种型匹配的阴性对照缀合物(CMA-676)以160μg/Kg缀合的加利车霉素的剂量经腹膜内给予后,让肿瘤生长,直到肿瘤重量达1.5g或2g。所述同样的给药时间表较早显示出引起小的已分期的肿瘤的长时间持续消退(参见表6)。如图19所示,将CMC-544给予带有大RAMOS淋巴瘤的小鼠引起先前存在的淋巴瘤体积的逐渐消退,到第20天时,3/4带瘤小鼠已没有肿瘤。对这些无瘤小鼠监测到第50天,没有发现已消退的RAMOS淋巴瘤的任何重新生长。相反,一个同种型匹配的对照CMA-676对肿瘤生长没有影响。5只用CMA-676治疗的带有大肿瘤的小鼠中有4只在第15天前处死,因为它们的肿瘤负荷已达到接近其体重的15%。
在RL淋巴瘤模型中,使用CMC-544进行了相似的实验。以与上述相似的时间表、以160μg/kg的剂量腹膜内给予CMC-544,在30天内引起超过90%的先前存在的RL淋巴瘤块的消退。然而到第45天,该组有2只带有已缩小的淋巴瘤的小鼠显示出肿瘤重新生长。这些结果表明CMC-544能引起小的以及大的已建立的淋巴瘤的消退。在少数研究中(本文未显示),在原先CMC-544诱导的消退以后,少数重新生长的RL淋巴瘤用CMC-544再次治疗。这些研究显示RL肿瘤对CMC-544的第二次治疗仍有反应,重新消退。因此,用CMC-544的治疗对小的和大的B细胞淋巴瘤块有效,并具有重复治疗的潜力。
II.用CMA-676缀合方法和CMC-544缀合方法制备的缀合物的体内比较
图20显示代表性实验结果,其中带有分期的RL淋巴瘤的小鼠按照标准给药时间表接受用CMA-676缀合方法和CMC-544缀合方法制备的两个不同剂量(80μg/kg和320μg/kg CMC-544缀合的加利车霉素)的CMC-544。正如预期的一样,观察到的抗肿瘤效应是剂量依赖性的,两种CMC-544制备物在功效上没有差异。相反,未缀合的N-乙酰-γ加利车霉素DMH经腹膜内给予160μg/kg却是无活性的。然而,应该强调的是,对于每种剂量的缀合的加利车霉素,用CMA-676工艺制备的CMC-544比起用CMC-544工艺制备的以缀合物形式给予的抗体蛋白的量要高4倍。因为靶向缀合物中加利车霉素含量是引起抗肿瘤效应的根本原因,可通过采用新方法、使用小得多的靶向抗体的量制备所述缀合物,来传递所需量的加利车霉素。用CMC-544工艺制备的增加负荷的所述缀合物是有效的,是因为缺乏显著量的低缀合部分(LCF)。
III.利妥昔单抗(RituxanTM)抗肿瘤的治疗
有待探索的另一个问题是,在市售的抗CD20利妥昔单抗(RituxanTM)治疗终止后,B细胞淋巴瘤的生长是否还会对CMC-544治疗有反应。为了这一目标,用利妥昔单抗(RituxanTM)治疗发展中(未分期的)RL淋巴瘤达3周。只要在利妥昔单抗(RituxanTM)治疗持续期间,RL淋巴瘤的生长就受到抑制。当利妥昔单抗(RituxanTM)治疗一停止,RL淋巴瘤就快速生长到约1g的大小,这时用CMC-544以腹膜内给予160μg/Kg的剂量进行治疗。正如图21和图22所示,这些RL淋巴瘤仍然对CMC-544有反应,其中80%的小鼠到60天成为无瘤小鼠。因此,用3个剂量的CMC-544能引起B细胞淋巴瘤的消退,而所述淋巴瘤本来只能被连续给予利妥昔单抗(RituxanTM)来抑制。
实施例8
CMC-544的体外和体外效应
I.结合和毒性研究
评价了CMC-544与CD22结合以及它在体外和体内模型中的活性。也比较了CMC-544与CMA-676即一种hP67.6(IgG4)与AcBut连接的加利车霉素的同种型匹配对照缀合物以及利妥昔单抗(RituxanTM),即一种嵌合IgG1抗CD20 mAb(IDEC Pharmceuticals,SanDiego,CA.),后者是市售的,购自Medworld Pharmacy(Chestnut Ridge,NY)。以下抗体用于G5/44结合结构域的研究:BU12(Celltech,Slough,UK);BLCAM、HD239(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA);RFB-4(Ancell Corp,Bayport,MN);SHCL-1、Leu 14(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ);4KB128和To 15(Dako Corp,Carpinteria,CA);M6/13和M5/44(Celltech,Slough,UK)。用于阻断研究的其它抗体是SJ10(Immunotech,Fullerton,CA)和M17.1.1、M19.1.1、M38.1.1(Celltech,Slough,UK)。用于研究的细胞系包括伯基特淋巴瘤细胞系Ramos(CRL-1923)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞系RL(CRL-2261),都来自American Type Culture Collection。通过聚合酶链式反应支原体检测实验(ATCC,Manassas,VA),来检查所述细胞系没有支原体。所述细胞系在加有以下成分的RPMI培养基中保持悬浮培养:10%FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、0.2%葡萄糖、100U/ml青霉素G钠和100μg/ml硫酸链霉素。
通过BIAcore分析、使用Fc-CD22固定化BIAcore CM5芯片,评价G5/44是否能抑制已知对CD22具有特异性的鼠mAb的结合。比较在有或没有用G5/44预先饱和固定化Fc-CD22所获得的表面胞质基因共振单位(RU)。用BIACORE 2000进行生物分子相互作用的分析。抗体通过空白对照表面(流动吸收池1,作为对照,没有偶联蛋白),Fc-CD22的检测表面(流动吸收池2)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片上,达到9,042RU水平。获得的传感器值(sensorgram)为流动吸收池2的响应值(RU)减去流动吸收池1的响应值(RU)。在引入针对CD22的鼠mAb(先前已表征它们的结合)之前,通过用G5/44(100μg/ml)饱和流动吸收池得到第二传感器值。在测定出G5/44的响应值后,立即将鼠抗CD22 mAb单独灌注,而不去除G544。也记录了由于鼠抗CD22 mAb与G5/44包埋的CD22的结合而产生的第二次组合响应值。如果所述鼠抗体结合CD22的位点与G5/44占据的位点无关,那么组合响应值将增加。如果G5/44与CD22的结合干扰或阻止了第二抗体的结合,那么组合响应值将不会增加。每个第二次组合测量值都用G5/44:CD22相互作用的“解离(off-rate)”而校正。
G5/44只阻断那些结合CD22表位A/Ig样结构域1(SHCL1 Leu 14和HD239)的抗体的结合,表明G5/44也结合在该CD22结构域中。与CD22表位B/Ig样结构域3(RFB-4)、CD22表位C/Ig样结构域4(To15)和CD22 Ig样结构域2(4KB128)结合的抗体不被G5/44阻断。这些结果表明,G5/44在CD22上的结合位点位于第一个Ig样结构域中,因为它阻止了那些识别第一个CD22的Ig样结构域(表位A)的抗CD22 mAb的结合。未知其亚型特异性的另一个抗CD22抗体即M6/13(Celltech,Slough,UK)也被G5/44(Celltech,Slough,UK)阻断,因而绘制出M6/13与CD22的表位A/Ig样结构域1的结合位点的图谱。所述抗体M5/44是具有与G5/44相同特异性的G5/44的鼠亲代,抑制G5/44的结合,作为阳性对照。在这些评价中,抗CD19抗体BU12作为阴性对照。结果概述于表7。
表7:具有确定特异性的鼠抗CD22 M/AB与用G544预处理的FC-CD22的结合。用表面胞质基因共振单位(RU)表示结合反应
抗体 | CD22的表位Ig结构域 | 用G544的响应值1 | 2次抗CD22mAb后的响应值2 | 响应值3(响应值2-1) | 响应值3 | 2次mAb的结合没有G544调节背景 | G544的抑制(%) |
抗CD22,SHCL-1Leu14 | A1.2 | 654.3 | 579.8 | -74.5 | 9 | 29.3 | 69 |
抗CD22HD239 | A1 | 710.5 | 628.7 | -81.8 | 1.7 | 19.3 | 91 |
抗CD22M6/13 | ?? | 710.0 | 652.7 | -57.3 | 26.2 | 152.4 | 83 |
抗CD22RFB-4 | B3 | 703.5 | 1108.5 | 405 | 488.5 | 534 | 9 |
抗CD224KB128 | ?2 | 691.0 | 1343.5 | 652.5 | 736.0 | 73B.8 | 0 |
抗CD22To16 | C4 | 676.9 | 1163.6 | 486.7 | 570.2 | 614.6 | 7 |
抗CD22M5/44 | 阳性对照 | 725.1 | 679.3 | -45.8 | 37.7 | 613.9 | 94 |
抗CD198U12 | 阴性对照 | 686.2 | 602.7 | -83.5 | 0 | 0 | 0 |
采用对CD22各个结构域具有已知结合特异性的鼠mAb,研究了G5/44阻断这些抗体结合B细胞的能力。另外,也研究了所述mAb阻断G5/44结合B细胞的能力。在这些研究中,1 x 105Ramos细胞首先在4℃暴露给鼠抗CD22抗体(10μg/ml人源化G5/44或小鼠单克隆抗CD22)达1小时,然后将所述细胞暴露给G5/44(10μg/ml)。细胞在4℃再保温1小时。当用所述抗体处理后,B细胞聚集成团,用PBS-1% BSA洗涤,然后在4℃加入100μl的1:100稀释度的溶于PBS-1% BSA的合适的第二抗体(或者FITC-山羊抗人(重链和轻链)或FITC-山羊抗小鼠(重链和轻链))达30分钟。细胞再次聚集成团,洗涤,重悬于PBS-1% BSA中,然后加入到盛有250μl PBS-1%甲醛的试管中。用BD FAC Sort流式细胞仪测定与细胞相关的荧光强度。
结果显示,先将G5/44暴露给CD22+ B细胞,导致随后抗CD22mAb M5/44和M6/13的结合受到显著抑制。相反,抗CD22 mAbRFB4、To15、HD239和4KB与B细胞的结合不被G5/44抑制。用流式细胞仪进行检测,G5/44不导致对HD239与B细胞结合的显著抑制,是意料之外的,尤其是当BIAcore分析表明G5/44能阻断HD239结合CD22时。可以根据它们与CD22相对亲和力的差异,来解释G5/44没有强烈抑制HD239的结合。当检验以上鼠抗CD22 mAb抑制G5/44结合CD22+ B细胞的能力时,SHCL1和M6/13、而不是其它抗CD22mAb抑制G5/44的结合。HD239和SHCL1与CD22的第一Ig样结构域的结合表位已经绘制成图。然而,M6/13或M5/44识别的表位没有绘制成图。以上阻断研究细节表明,以上抗体识别位于CD22第一Ig样结构域上的表位,该表位通称为表位A。
将两万个Ramos细胞在有或没有利妥昔单抗(RituxanTM)存在下,与不同剂量的CMC-544一起温育96小时。96小时后,通过流式细胞仪分析碘化丙锭排阻,测定细胞活力。计算3-6孔的平均活力,计算不同处理中细胞活力抑制的剂量反应。用零浓度的CMC-544计算细胞活力抑制的背景反应。用逻辑回归,在0.01-3ng加利车霉素DMH/ml的剂量范围内,检测CMC-544是否引起对Ramos细胞生长的统计学显著性的剂量依赖性抑制。也用逻辑回归确定CMC-544与利妥昔单抗(RituxanTM)的相互作用是否是统计学显著性的。还计算了半数抑制浓度(IC50),记录了相对于单独用CMC-544处理的每次处理的有效性。用SAS版本8.2的PROBIT程序进行统计学分析。
研究结果显示,CMC-544在0.01-3ng加利车霉素DMH/ml的剂量范围内引起对Ramos细胞生长的剂量依赖性抑制。单用CMC-544的半数抑制浓度(IC50)为0.029ng/ml。将浓度为2μg/ml、20μg/ml和200μg/ml的利妥昔单抗(RituxanTM)加入到用CMC-544处理过的细胞中,确定利妥昔单抗(RituxanTM)与CMC-544细胞毒性活性的相互作用是否是统计学显著性的。加入20μg/ml和200μg/ml的利妥昔单抗(RituxanTM)而不加CMC-544,对细胞生长没有显著影响(溶媒生长分别为111.7%和94.0%)。当与CMC-544联用时,所有这三个浓度的(RituxanTM)在CMC-544剂量反应曲线的斜率和截距上产生统计学显著性(p<0.05)左移。与2μg/ml和200μg/ml利妥昔单抗联用,在剂量反应曲线中产生最大改变。这两条曲线彼此没有统计学差异,但与20μg/ml剂量联用相比有显著性差异(p<0.05)。第二项研究(结果未报道)证实了在第一项研究中观察到的结果。2μg/ml、20μg/ml和200μg/ml利妥昔单抗(RituxanTM)加CMC-544的联用的半数抑制浓度分别为0.0072ng/ml、0.0081ng/ml和0.0072ng/ml。CMC-544加利妥昔单抗(RituxanTM)的半数抑制浓度比单用CMC-544的IC50效果高约4倍。
II在SCID小鼠中的体内抗肿瘤活性皮下异种移植和全身弥散性B细胞淋巴瘤
给予雌性、无胸腺裸小鼠(18-22g)全身辐射(400rads)。辐射进一步抑制小鼠的免疫系统,增加了对肿瘤的接受。辐射3天后,小鼠在右侧背部经皮下注射溶于Matrigel的107RL细胞(CollaborativeBiomedical Products,Belford,MA,在RPMI培养基中1:1稀释)。当肿瘤达到合适大小时(0.3g,一般在21天后),按0.2ml/只小鼠腹膜内给予溶于无菌盐水的CMC-544、利妥昔单抗(RituxanTM)或CHOP疗法(参见下文)。给药的头一天被认为是第1天。在第5天和第9天给予两个额外剂量(治疗=q4Dx3)。CHOP疗法由以下药物组成:环磷酰胺(C),(CytoxanTM,Bristol-Meyers Squibb Co.,Princeton,NJ)40mg/kg腹膜内;盐酸多柔比星(H),(Sigma-Aldrich,Co.,St Louis,MO)3.3mg/kg腹膜内;长春新碱(O),(GensiaSicor Pharmaceuticals,Irvine,CA)0.5mg/kg腹膜内;以及泼尼松(P)(Roxane Labs.,Columbia,OH)0.2mg/kg口服。按照与CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)相同的给药时间表(q4Dx3),给予CHO,而泼尼松是每两天口服给药一次,共5个剂量(q2Dx5)。至少每周测量一次肿瘤,计算肿瘤质量(g)=0.5(肿瘤宽度/2)(肿瘤长度)。计算组平均值SEM,并采用多重T-检验与溶媒治疗组比较统计学显著性。记录组平均50天,或直到小鼠死亡(所述死亡破坏了组平均值)或直到所述肿瘤生长太大(>3.5g)而不得不对该小鼠处以安乐死。之后,报告所有治疗组中每个小鼠的肿瘤大小。也记录在每次研究结束时每个治疗组中无瘤小鼠的数目。
为了确定CMC-544单用或与其它生物活性剂联用对弥散性淋巴瘤的效果,使用了SCID小鼠模型。通过鼠尾静脉给雄性SCID小鼠(CB17SCID)(20-25g)注射106Ramos细胞(0.2ml)。在细胞注射后或者3天或者9天,腹膜内给予所述小鼠溶媒、缀合物(CMC-544或CMC-676)或利妥昔单抗(RituxanTM),总共3个剂量。对于3天治疗时间表,小鼠在第3天、第7天和第11天给药。对于9天治疗时间表,小鼠在第9天、第13天和第17天给药。在9天治疗时间表中,也如下所述给予CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)的组合。每天监测小鼠,看是否有后肢瘫痪,如有则处死它们。每个治疗组使用7-10只小鼠。计算组平均存活时间(±SD)、存活时间的中位值、最小值和最大值。通过非参数显著性在0.05水平的对数-秩检验(Log-rank test),确定各组间存活分布差异。用Kaplan-Meier方法建立存活曲线。
开始的研究检查了两个不同给药时间表对带有弥散性淋巴瘤的SCID小鼠的效应。第一项研究检查在静脉内注射肿瘤细胞后第3天(发展中模型)开始给药,而第二项研究是在肿瘤细胞注射后延迟到第9天(已建立的模型)才给药。在每项研究中,腹膜内给予3个剂量的CMC-544(160μg/kg)、CMA-676(160μg/kg)或利妥昔单抗(RituxanTM)(20mg/kg),分别给予4天(Q4Dx3)。在发展中模型中,溶媒处理的小鼠平均存活时间是27天(图23,表8)。CMA-676即CMC-544的同种型匹配对照没有显著延长存活时间(p>0.05)。CMC-544显著延长存活时间至41天,而利妥昔单抗具有深远效应,延长存活时间至125天以上(显著大于CMC-544,p<0.05)。延迟给药直到肿瘤细胞有机会传播(归巢(homing))并沉积在靶细胞(已建立的模型)上,这改变了CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)的结果。再次使用CMA-676对存活时间没有显著影响(图24,表8)。利妥昔单抗(RituxanTM)增加了平均存活时间至62.6天,而CMC-544增加平均存活时间至83.5天。在所述已建立的模型中,CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)间没有显著性差异。
表8:存活时间的描述性测定
进行了初步研究,以确定利妥昔单抗(RituxanTM)对CMC-544的存活反应是否有效应,无论是正效应还是负效应。在有或没有利妥昔单抗(RituxanTM)(20mg/kg,标记为高剂量药物联用(HD))存在下,给予CMC-544(160μg/kg)。另外,较低剂量CMC-544(80μg/kg)与较低剂量的利妥昔单抗(RituxanTM)(10mg/kg)联合给药。因为该研究中小鼠量有限,所以没有分别以80μg/kg或10mg/kg的剂量单独给予所述化合物。将CMC-544(80μg/kg)与利妥昔单抗(RituxanTM)(10mg/kg)联用标记为中等剂量联用(MD),并用于确定药物低剂量联用对SCID小鼠存活的可行性。单独给予CMC-544(160μg/kg)和利妥昔单抗(RituxanTM)(20mg/kg),结果如在以上已建立的模型中报告所述。每次延长平均存活时间分别至58.5天和50.5天(图25,表9)。在联用中,高剂量联用的平均存活时间稍有(虽然在统计学上不显著,p>0.05)增加至64.4天。80μg/kg CMC-544和10mg/kg利妥昔单抗(RituxanTM)的中等剂量联用,显著增加了(p<0.05与溶媒处理相比)存活时间平均至92.4天。这些结果表明,CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)的低剂量联用是有保证的。
表9:最初联用研究的存活时间的描述性检测
化合物 | 平均存活时间 | 中位存活时间 | 标准差 | 最短存活时间 | 最长存活时间 | 动物数 |
CMC MD+Ritux MD | 92.4 | >100.0 | 16.0 | 62.0 | >100.0 | 10 |
CMC HD+Ritux HD | 64.4 | 58.5 | 26.7 | 29.0 | >100.0 | 10 |
CMC544 | 58.5 | 34.5 | 35.8 | 27.0 | >100.0 | 10 |
利妥昔单抗 | 50.5 | 41.0 | 26.4 | 30.0 | >100.0 | 10 |
溶媒 | 31.0 | 27.0 | 9.7 | 27.0 | 56.0 | 9 |
CMC MD=CMC544中等剂量,80μg/kg
CMC HD=CMC-544高剂量,160μg/kg
Ritux MD=利妥昔单抗中等剂量,10mg/kg
Ritux HD=利妥昔单抗高剂量,20mg/kg
用CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)进行了进一步联合用药研究。进行了下列治疗组的治疗:浓度为40μg/kg、80μg/kg和160μg/kg的CMC-544;浓度为5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的利妥昔单抗(RituxanTM);以及40μg/kg CMC-544加5mg/kg利妥昔单抗(RituxanTM)、80μg/kg的CMC-544加10mg/kg利妥昔单抗(RituxanTM)以及160μg/kg的CMC-544加20mg/kg利妥昔单抗(RituxanTM)。所有剂量的利妥昔单抗(RituxanTM)都稍微延长了平均存活时间至33-40天的范围,(与溶媒治疗组平均存活时间25.8相比,所有剂量p<0.05,图26,表10)。高剂量(160μg/kg)的CMC-544延长了平均存活时间至85天,与早期两项研究报告的结果一致。CMC-544与利妥昔单抗(RituxanTM)的联用对存活时间没有显著改善(图27,表10)。与高剂量CMC-544相比,两个低剂量的CMC-544(80μg/kg和40μg/kg)各自都显著改进了(p<0.05)平均存活时间。对于40μg/kg和80μg/kg剂量的CMC-544,90%和80%的小鼠仍然分别存活了125天。两个药物联用组中100%的小鼠存活至125天。低剂量的CMC-544比高剂量(160μg/kg)更有效。
在所实验的剂量(参见上文)内,利妥昔单抗(RituxanTM)与CMC-544联用,对CMC-544在SCID小鼠中弥散性B细胞模型的活性没有明显效应。在Balb/c裸鼠中,采用皮下RL B淋巴瘤异种移植模型,也评价了CMC-544与利妥昔单抗(RituxanTM)联用是否增强或抑制了抗肿瘤活性。在皮下B淋巴瘤模型中,选择平均肿瘤重量为300mg的肿瘤,然后在研究中,腹膜内给予两次治疗。在有或没有利妥昔单抗(RituxanTM)(20mg/kg Q4Dx3)存在下,使用20μg/kg或80μg/kg(Q4Dx3)的CMC-544。与利妥昔单抗(RituxanTM)的联用既不显著增强也不显著抑制(p>0.05)CMC-544的疗效(图28)。在该研究中,单独给予利妥昔单抗(RituxanTM),抑制RL B淋巴瘤生长(与溶媒治疗相比,在第20天对肿瘤生长有57%的抑制,p<0.05),与用低剂量CMC-544所观察的结果类似。
联合化疗方案CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)最常见用于治疗非霍奇金淋巴瘤患者。在已建立的RL B淋巴瘤异种移植物中,比较了CHOP与CMC-544的抗肿瘤效应。CHOP方案中单个组分均以它们各自在裸鼠中估计的最大耐受剂量(数据未报告)来使用,所述剂量如下:环磷酰胺(C)40mg/kg腹膜内、多柔比星(H)3.3mg/kg腹膜内、长春新碱(O)0.5mg/kg腹膜内和泼尼松(P)0.2mg/kg口服。CHO按Q4Dx3给药,P是口服给药,Q2Dx5。CMC-544以相当于160μg/kg加利车霉素的剂量经腹膜内给药,Q4Dx3。CHOP治疗一开始就引起对RL B淋巴瘤生长的显著抑制(图29)。然而,3周后,肿瘤以与溶媒治疗组相同的生长率重新生长。相反,CMC-544的抗肿瘤效应是完全的,持续整个实验周期。这些结果表明,用显著低于裸鼠中最大非致死剂量的剂量的CMC-544,比CHOP联合疗法更加有效。
这些研究显示,利妥昔单抗(RituxanTM)加上CMC-544显著增加了CMC-544在Ramos B淋巴瘤细胞中的细胞毒活性。最近,也报道了利妥昔单抗(RituxanTM)和糖皮质激素在Ramos细胞中的协同相互作用。另外,利妥昔单抗(RituxanTM)与10μM地塞米松联用时,观察到在8个额外细胞系中的4个有协同生长抑制。
已报道单独使用0.4-10μg/ml的利妥昔单抗(RituxanTM),引起对Ramos细胞生长的显著抑制,虽然抑制程度小(最大18%)。另外,当它以10μg/ml浓度与8个B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系温育(48小时温育)时,在其中的6个细胞系中有活性。Ghetie等证明,10μg/ml利妥昔单抗(RituxanTM)与Ramos细胞一起温育24小时后,增加了6.2%的凋亡(与溶媒治疗细胞中的3.5%相比)。在当前的研究中,剂量为20μg/ml和200μg/ml的利妥昔单抗(RituxanTM)在单独使用时,对Ramos细胞生长没有影响。在小鼠中,无论在弥散性模型或皮下异种移植模型中,CMC-544和利妥昔单抗(RituxanTM)之间都没有任何相互作用的证据。药物联合实验没有干扰彼此的效应,也没有增强它们。在弥散性模型中降低每种药物剂量是否将改变观察结果,还有待确定。
已由Flavell等描述了Ramos细胞的弥散性B细胞淋巴瘤模型。溶媒治疗的小鼠的中位存活时间据报告是34-36天。小鼠逐渐产生后肢瘫痪,发展到垂死,不久后死亡。对其器官进行组织学分析,揭示出最常见的受累器官是肾上腺、脾脏和蛛网膜下隙。蛛网膜下隙浸润常延伸到大脑。当将利妥昔单抗(RituxanTM)给予处于病程早期的弥散性SCID小鼠时,表现良好(图23),但当在模型建立期的第9天给予时,表现较差(图24)。利妥昔单抗(RituxanTM),作为IgG1同种型,最有可能是通过小鼠宿主效应机制起作用。这些机制包括补体介导的细胞毒性和/或通过存在于SCID小鼠的自然杀伤细胞募集的抗体依赖性细胞毒性。注射的Ramos肿瘤细胞可能在早期、在所述细胞有机会浸润到受累器官之前,对被利妥昔单抗(RituxanTM)激活的宿主免疫机制更敏感。在SCID小鼠的弥散性肿瘤模型中,尚未测试未缀合的G5/44抗体(CMC-544的靶向分子),但当将它给予皮下异种移植物时,没有影响。预期G5/44作为IgG4同种型,不会激活宿主效应机制,因此也不会产生抗肿瘤活性。
加利车霉素缀合的G5/44(CMC-544)与利妥昔单抗(RituxanTM)的作用相反,当给予所述疾病的建立期时产生更好的结果。CMC-544在建立期中表现更好的原因尚不清楚,但是建立期更能代表临床状况。CMA-676作为同种型匹配的未结合的对照缀合物,对平均存活时间没有显著影响。在弥散性SCID模型中的结果清楚地表明,需要降低CMC-544的剂量,以确定最大有效剂量(MED)。160μg/kg剂量的活性比80μg/kg和40μg/kg的较低剂量更小。尚不清楚为什么是这样,但是160μg/kg剂量可能超过MED。计划进一步研究该问题。
Mohammad等在弥散性大细胞淋巴瘤细胞系DLCL的皮下异种移植物模型中,使用CHOP疗法(环磷酰胺(C)40mg/kg IV、多柔比星(H)3.3mg/kg静脉内、长春新碱(O)0.5mg/kg静脉内和泼尼松(P)0.2mg/kg口服)。用于CHOP疗法的剂量确定为它们的最大耐受剂量。CHO疗法(静脉内和腹膜内给药,每天一次,共5天)被认为是“有活性的”,产生T/C为25.8%。没有记录到肿瘤治愈。在所述模型中的结果由Mohammad等描述,看来与在本文所述RL模型中的CHOP疗法(腹膜内给药,Q4Dx3)中观察的相似。在各项研究中,CHOP与CMC-544不同,都不导致长期治愈。
表10:联合用药研究中存活时间的描述性测定
治疗 | 平均存活时间 | 中位存活时间 | 标准差 | 最短存活时间 | 最长存活时间 | 动物数 |
CMC-54440μg/kg | 118.90 | 125.00 | 19.29 | 64.00 | 125.00 | 10 |
CMC LD+Ritux LD | 125.00 | 125.00 | 0.00 | 125.00 | 125.00 | 10 |
CMC-54480μg/kg | 118.22 | 125.00 | 17.86 | 71.00 | 125.00 | 9 |
CMC MD+Ritux MD | 125.00 | 125.00 | 0.00 | 125.00 | 125.00 | 10 |
CMC-544160μg/kg | 85.22 | 82.00 | 40.37 | 35.00 | 125.00 | 9 |
CMC HD+Ritux HD | 91.30 | 100.00 | 36.31 | 44.00 | 125.00 | 10 |
Rituxmab5mg/kg | 40.70 | 36.50 | 9.57 | 34.00 | 64.00 | 10 |
Rituxmab10mg/kg | 33.80 | 34.00 | 3.26 | 29.00 | 41.00 | 10 |
Rituxmab20mg/kg | 40.50 | 34.00 | 15.45 | 31.00 | 82.00 | 10 |
溶媒 | 25.80 | 25.00 | 3.12 | 22.00 | 34.00 | 10 |
CMC LD=CMC-544低剂量,40μg/kg Ritux LD=利妥昔单抗低剂量,5mg/kg
CMC MD=CMC-544中等剂量,80pg/kg Ritux MD=利妥昔单抗中等剂量,10mg/kg
CMC HD=CMC-544高剂量,160μg/kg Ritux HD=利妥昔单抗高剂量,20mg/kg
实施例9
稳定的CMC-544制剂
通过添加稀释剂、赋形剂、载体和稳定剂制备用于体内给药的稳定的CMC-544制剂。在HIC层析分析后,通过SEC-HPLC和多波长UV分析来分析层析部分。选取合适的流分合并,进行上述分析,所述分析提供聚集体含量、蛋白质浓度和加利车霉素负荷的信息。加入赋形剂、稳定剂、填充剂和缓冲剂以稳定所述溶液。因为CMC-544可通过许多降解途径而降解,在开发制剂时,需要考虑物理不稳定性。在开发制剂时,一个主要的考虑是加利车霉素从所述抗体上水解的速率必须最小化,而又必须保持所述抗CD-22抗体的物理和化学完整性。另外,在某些pH和浓度条件下会发生加利车霉素-抗体缀合物的沉淀也需要达到最小化。
在开发单体加利车霉素衍生物-抗体缀合物制剂中,所述制剂的pH是关键,因为它能使降解和物理不稳定性最小化。选择pH为8.0,以使加利车霉素的水解最小化,并保持所述缀合物适当的溶解性。用SDS-PAGE和抗原结合ELISA获得的额外数据表明,在pH为8.0时能保持所述抗体显著的结构完整性和特异性。因此,选择氨丁三醇为缓冲剂,以保持pH为8.0。一种替代的缓冲液可包括磷酸氢钠或磷酸氢钾。缓冲液浓度范围可以是5-50mM。认为优选的pH范围是7.5-8.5,使稳定性/溶解性最佳化。终产物的通用pH规范为7.0-9.0。
虽然所述缀合物的缓冲液的稳定性对短时间来说是足够的,但是长期稳定性差。冻干法用于延长所述缀合物的存放期。关于蛋白质溶液冻干的问题已有大量文献资料,在冷冻和干燥工艺中会发生二级结构、三级结构和四级结构的损失。所述制剂中包含作为所述缀合物的非晶形稳定剂的蔗糖,在冷冻和干燥工艺中,能保持所述抗体的结构完整性。采用浓度为1.5-5.0%w/v蔗糖。另外,一种浓度为0.5-1.5%(重量)的聚合填充剂,例如葡聚糖40或羟乙基淀粉,可以掺入以增加冻干饼的外观和物理硬度。这些材料以相当低的浓度构成了冻干饼,可用于使冻干制剂总固形物含量最小化,因而可以更快冻干。制剂研究采用浓度为0.9%(重量)的葡聚糖40。
制剂中包含聚山梨酯80,以提高所述缀合物的溶解性。采用优选的浓度为0.01%,有用的范围为0.005-0.05%。也向所述制剂中加入浓度为0.91-0.05%(体积)吐温。
所述制剂中也可以含有电解质,可用来改进最终纯化方法的效果。通常使用的氯化钠浓度为0.01M-0.1M。额外的电解质,例如硫酸钠,也可用来替代氯化钠,因为它能更容易地冻干。最好是,CMC-544终溶液中包含1.5%(重量)蔗糖、0.9%(重量)葡聚糖40、0.01%吐温80、50mM氯化钠、0.01%(重量)聚山梨酯80和20mM氨丁三醇。
所述溶液在冻干之前的代表性配方如下:0.5mg/mL CMC-544、1.5%(重量)蔗糖、0.9%(重量)葡聚糖40、0.05M氯化钠、0.01-0.05%(体积)吐温、0.01%(重量)聚山梨酯80、0.02M氨丁三醇和水,pH 8.0。在+5℃至10℃(最好在+5℃)的温度下,将所述溶液分装到安瓿中;将所述溶液在-35℃至-50℃(最好在-45℃)的温度下进行冷冻;对冷冻的溶液在20-80微米汞柱(最好在60微米汞柱)的冻干压力下进行初始冻干步骤;将冻干产品在-10℃至-40℃(最好在-30℃)的搁板温度下,保持24-72小时(最好60小时);最后在20-80微米汞柱(最好在60微米汞柱)的冻干压力下、在+10℃至+35℃(最好在+25℃)的搁板温度下,对冻干产品进行二次冻干达15-30小时(最好达24小时)。用升压实验检查初次干燥的终点。在冻干周期结束时,向安瓿内充氮并封口。
表11说明了用CMC-544和CMC-676的制剂的差异。CMA-676制剂和CMC-544制剂之间的显著性差异包括在新制剂中降低了蛋白质浓度(0.5mg/mL)、使用了氨丁三醇作为缓冲剂以及存在0.01%吐温80。这导致新制剂中的重建的CMC-544变得澄清,而重建的CMA-676制剂却是浑浊的(参见表12和表13)。
表11:CMA-676制剂和CMC-544制剂的比较
CMA-676制剂 | CMC-544制剂 | |
蛋白质浓度 | 1.0mg/mL | 0.5mg/mL |
制剂 | 1.5%蔗糖,0.9%葡聚糖40,100mM氯化钠,5mM磷酸缓冲液 | 1.5%蔗糖,0.9%葡聚糖40,0.01%吐温80,0.01%聚山梨酯80,50mM氯化钠,20mM氨丁三醇 |
表12:在5℃下,CMA-676制剂和CMC-544制剂的稳定性和理化结果
表13:冻干并储存在25℃下的CMA-676制剂和CMC-544制剂的稳定性和理化结果
以上引用的所有参考文献和专利通过引用结合到本文中。本发明的各种修改和变化都包括在上述说明书中并且对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。对所述缀合方法、对用所述方法制备的缀合物以及对包含所述缀合物的组合物/制剂的各种修改和变化都认为是包括在所附权利要求书的范围之内。
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序列表
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<120>加利车霉素衍生物—载体缀合物
<130>AM100788PCT
<160>51
<170>SeqWin99,version 1.02
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>5/44g CDR-H1
<220>
<221>
<400>1
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44CDR-H2gL1 T3
<220>
<221>
<400>2
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44CDR-H3
<220>
<221>
<400>3
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44 CDR-L1
<220>
<221>
<400>4
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44 CDR-L2
<220>
<221>
<400>5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44g CDR-L3
<220>
<221>
<400>6
<210>7
<211>113
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44 VL区
<220>
<221>
<400>7
<210>8
<211>121
<212>PRT
<213>小鼠单克隆抗体5/44 VH区
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44 VH区
<220>
<221>
<400>8
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>cH
<220>
<221>
<400>9
<210>10
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N55Q
<220>
<221>
<400>10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T57A
<220>
<221>
<400>11
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T57V
<220>
<221>
<400>12
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR-H2(T57)A H′
<220>
<221>
<400>13
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>K60R
<220>
<221>
<400>14
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR-H2(K60R)R H″
<220>
<221>
<400>15
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR-H2(T57A K60R)H″′
<220>
<221>
<400>16
<210>17
<211>70
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>DPK9
<220>
<221>
<400>17
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>JK1
<220>
<221>
<400>18
<210>19
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gL1
<220>
<221>
<400>19
<210>20
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gL2
<220>
<221>
<400>20
<210>21
<211>80
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>DP7
<220>
<221>
<400>21
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>JH4
<220>
<221>
<400>22
<210>23
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gH1
<220>
<221>
<400>23
<210>24
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gH4
<220>
<221>
<400>24
<210>25
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gH5
<220>
<221>
<400>25
<210>26
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gH6
<220>
<221>
<400>26
<210>27
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gH7
<220>
<221>
<400>27
<210>28
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>移植轻链的全序列
<220>
<221>
<400>28
<210>29
<211>781
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>移植轻链的全序列
<220>
<221>
<400>29
<210>30
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>移植重链的全序列
<220>
<221>
<400>30
<210>31
<211>2160
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>移植重链的全部DNA序列
<220>
<221>
<400>31
<210>32
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 T1
<220>
<221>
<400>32
<210>33
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 T2
<220>
<221>
<400>33
<210>34
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 T3
<220>
<221>
<400>34
<210>35
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 B1
<220>
<221>
<400>35
<210>36
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 B2
<220>
<221>
<400>36
<210>37
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 B3
<220>
<221>
<400>37
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 F1
<220>
<221>
<400>38
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gH1 R1
<220>
<221>
<400>39
<210>40
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 T1
<220>
<221>
<400>40
<210>41
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 T2
<220>
<221>
<400>41
<210>42
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 T3
<220>
<221>
<400>42
<210>43
<211>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 B1
<220>
<221>
<400>43
<210>44
<211>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 B2
<220>
<221>
<400>44
<210>45
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 B3
<220>
<221>
<400>45
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 F1
<220>
<221>
<400>46
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>544gL1 R1
<220>
<221>
<400>47
<210>48
<211>339
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44VL的DNA序列
<220>
<221>
<400>48
<210>49
<211>363
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>小鼠单克隆抗体5/44VH的DNA序列
<220>
<221>
<400>49
<210>50
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物内的序列
<400>50
<210>51
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5′寡核苷酸引物
<400>51
Claims (105)
1.一种用于制备具有减少的低缀合部分(LCF)的单体加利车霉素衍生物/抗体缀合物的方法,所述缀合物具有下式:
Pr(-X-S-S-W)m
其中:
Pr为抗体,
X为可水解接头,其在结合并进入靶细胞后能够从所述缀合物释放所述加利车霉素,
W为加利车霉素;
m为纯化缀合产物的平均负荷,致使所述加利车霉素占所述缀合物的4-10%重量;且
(-X-S-S-W)m为加利车霉素衍生物,
所述方法包括下述步骤:
(1)将所述加利车霉素衍生物加入到所述抗体中,其中所述加利车霉素衍生物是所述抗体的4.5-11%重量;
(2)将所述加利车霉素衍生物和抗体在非亲核的、蛋白相容的、pH范围为约7-9的缓冲液中温育,产生单体加利车霉素衍生物/抗体缀合物,其中所述溶液还包含(a)有机助溶剂和(b)包含至少一种C6-C18羧酸或其盐的添加剂,并且其中所述温育是在约30℃至约35℃的温度范围内进行约15分钟至24小时;和
(3)将步骤(2)产生的缀合物进行层析分离方法,以从未缀合抗体、加利车霉素衍生物和聚集缀合物中分离出加利车霉素的负荷范围是4-10%重量、低缀合部分(LCF)小于10%的单体加利车霉素衍生物/抗体缀合物。
2.权利要求1的方法,其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体和抗体生物活性片段,其中所述生物活性片段为Fab、修饰Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段,或重链单体或二聚体。
3.权利要求1的方法,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:19的轻链可变区和含有SEQ ID NO:27的重链可变区。
4.权利要求1的方法,其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:28的轻链的人源化抗体。
5.权利要求1的方法,其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:30的重链的人源化抗体。
6.权利要求1的方法,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:28的轻链以及含有SEQ ID NO:30的重链。
7.权利要求1的方法,其中所述抗体体包含CDR-H1的SEQ IDNO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:27的残基50-66;CDR-H3的SEQ IDNO:3;CDR-L1的SEQ ID NO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
8.权利要求7的方法,其中所述抗体体包含CDR-H2的SEQ IDNO:27的残基50-66。
9.权利要求1的方法,其中所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素。
10.权利要求1或9的方法,其中所述加利车霉素用3-巯基-3-甲基丁酰肼官能化。
11.权利要求1的方法,其中所述可水解接头是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
12.权利要求1的方法,其中步骤(2)(b)的添加剂是辛酸或其盐。
13.权利要求1的方法,其中步骤(2)(b)的添加剂是癸酸或其盐。
14.权利要求1的方法,其中步骤(3)的层析分离方法是大小排阻层析法(SEC)。
15.权利要求1的方法,其中步骤(3)的层析分离方法为HPLC、FPLC或葡聚糖凝胶S-200层析法。
16.权利要求1的方法,其中步骤(3)的层析分离方法是疏水作用层析法(HIC)。
17.权利要求16的方法,其中所述疏水作用层析法(HIC)是通过使用苯基琼脂糖凝胶6FF层析介质、丁基琼脂糖凝胶4FF层析介质、辛基琼脂糖凝胶4FF层析介质、Toyopearl Ether-650M层析介质、常量制备甲基HIC介质或常量制备叔丁基HIC介质来进行。
18.权利要求16的方法,其中所述疏水作用层析法(HIC)是通过使用丁基琼脂糖凝胶4FF层析介质来进行。
19.一种具有低于10%的减少的低缀合部分(LCF)的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,所述缀合物具有下式:
Pr(-X-S-S-W)m
其中:
Pr为抗CD22抗体;
X为可水解接头,其在结合并进入靶细胞后能够从所述缀合物释放所述加利车霉素;
W为加利车霉素;
m为纯化缀合产物的平均负荷,致使加利车霉素占所述缀合物的4-10%重量;且
(-X-S-S-W)m为加利车霉素衍生物。
20.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述CD22抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体和抗体生物活性片段,其中所述生物活性片段为Fab、修饰Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段,或重链单体或二聚体。
21.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQ ID NO:19的轻链可变区和含有SEQ ID NO:27的重链可变区。
22.权利要求20的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体为人源化抗体并且包含具有SEQ ID NO:28中所示的序列的轻链。
23.权利要求20的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体为人源化抗体并且包含具有SEQ ID NO:30中所示的序列的重链。
24.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQ ID NO:28的轻链和含有SEQ IDNO:30的重链。
25.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16或SEQID NO:27的残基50-66;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQ IDNO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
26.权利要求25的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含CDR-H2的SEQ ID NO:27的残基50-66。
27.权利要求20的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体是CDR移植抗CD22抗体。
28.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包括含有人受体构架区和非人类供体CDR的可变区。
29.权利要求28的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗体的重链可变区的人受体构架区基于SEQ ID NO:21和22并且在SEQ ID NO:8中的位置1、28、48、72和97包含供体残基。
30.权利要求29的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体在SEQ ID NO:8中的位置68和70还包含供体残基。
31.权利要求28的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含基于SEQ ID NO:17和18并且在SEQ ID NO:7中的位置2、4、42、43、50和65还包含供体残基。
32.权利要求31的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体在SEQ ID NO:7中的位置3还包含供体残基。
33.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQ ID NO:7的轻链可变区和含有SEQ ID NO:8的重链可变区。
34.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰γ加利车霉素衍生物。
35.权利要求19或34的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述加利车霉素用3-巯基-3-甲基丁酰肼官能化。
36.权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,其中所述可水解接头是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
37.一种制备单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物的稳定的冻干组合物的方法,所述方法包括:
(a)将所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物溶于溶液中,使其终浓度为0.5-2mg/ml,所述溶液包含浓度为1.5%-5%重量的防冻剂、浓度为0.5-1.5%重量的聚合填充剂、浓度为0.01M-0.1M的电解质、浓度为0.005-0.05%重量的增溶剂、致使所述溶液的最终pH为7.8-8.2的浓度为5-50mM的缓冲剂以及水;
(b)在+5℃至+10℃的温度下,将上述溶液分装到小瓶中;
(c)在-35℃至-50℃的冷冻温度下,将所述溶液进行冷冻;
(d)在20-80微米汞柱的初始干燥压力下,在-10℃至-40℃的搁板温度下,对所述冷冻溶液进行初始冻干步骤达24-78小时;和
(e)在20-80微米汞柱的干燥压力下,在+10℃至+35℃的搁板温度下,对步骤(d)的冻干产物进行第二个冻干步骤达15-30小时。
38.权利要求37的方法,其中所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰加利车霉素。
39.权利要求37的方法,其还任选包含治疗有效浓度的生物活性剂。
40.权利要求39的方法,其中所述生物活性剂是细胞毒性药物。
41.权利要求39的方法,其中所述生物活性剂是生长因子。
42.权利要求39的方法,其中所述生物活性剂是激素。
43.权利要求39的方法,其中所述生物活性剂为抗体。
44.权利要求37的方法,其中所述防冻剂选自糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神经氨酸、阿聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻依聚糖、卡拉胶、半乳卡罗聚糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、石脐素、壳多糖、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原酸胶、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、丙三醇和季戊四醇。
45.权利要求44的方法,其中所述防冻剂是蔗糖。
46.权利要求45的方法,其中所述蔗糖浓度为1.5%重量。
47.权利要求37的方法,其中所述聚合填充剂是葡聚糖40,其浓度为0.9%重量。
48.权利要求37的方法,其中所述聚合填充剂是羟乙基淀粉40,其浓度为0.9%重量。
49.权利要求37的方法,其中所述电解质是氯化钠,其浓度为0.05M。
50.权利要求37的方法,其中所述增溶剂是表面活性剂。
51.权利要求50的方法,其中所述表面活性剂是聚山梨酯80,其浓度为0.01%重量。
52.权利要求37的方法,其中所述缓冲剂是氨丁三醇,其浓度为0.02M。
53.权利要求37的方法,其中步骤(a)的溶液pH为8.0。
54.权利要求37的方法,其中将步骤(b)的溶液在+5℃的温度下分装到小瓶中。
55.权利要求37的方法,其中步骤(c)的小瓶中所述溶液在-45℃的冷冻温度下进行冷冻。
56.权利要求37的方法,其中步骤(d)的冷冻溶液在60微米汞柱的初始干燥压力下,在-30℃的搁板温度下,进行初始冻干步骤达60小时。
57.权利要求37的方法,其中步骤(d)的冻干产物在步骤(e)中在60微米汞柱的干燥压力下,在+25℃的搁板温度下,进行第二个冻干步骤达24小时。
58.一种组合物,所述组合物包含治疗有效量的权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物,所述缀合物通过包括下述步骤的方法制备:
(a)将所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物溶于溶液中,使其终浓度为0.5-2mg/ml,所述溶液包含浓度为1.5%-5%重量的防冻剂、浓度为0.5-1.5%重量的聚合填充剂、浓度为0.01M-0.1M的电解质、浓度为0.005-0.05%重量的增溶剂、致使所述溶液的最终pH为7.8-8.2的浓度为5-50mM的缓冲剂以及水;
(b)在+5℃至+10℃的温度下,将上述溶液分装到小瓶中;
(c)在-35℃至-50℃的冷冻温度下,将所述溶液进行冷冻;
(d)在20-80微米汞柱的初始干燥压力下,在-10℃至-40℃的搁板温度下,对所述冷冻溶液进行初始冻干步骤达24-78小时;和
(e)在20-80微米汞柱的干燥压力下,在+10℃至+35℃的搁板温度下,对步骤(d)的冻干产物进行第二个冻干步骤达15-30小时。
59.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体和抗体生物活性片段,其中所述生物活性片段为Fab、修饰Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段,或重链单体或二聚体。
60.权利要求59的组合物,其中所述抗CD22抗体是人单克隆抗体。
61.权利要求59的组合物,其中所述抗CD22抗体是嵌合抗体。
62.权利要求59的组合物,其中所述抗CD22抗体是人抗体。
63.权利要求59的组合物,其中所述抗CD22抗体是人源化抗体。
64.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQID NO:19的轻链可变区和含有SEQ ID NO:27的重链可变区。
65.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQID NO:28的轻链和含有SEQ ID NO:30的重链。
66.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:27的残基50-66;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQ ID NO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
67.权利要求66的组合物,其中所述抗CD22抗体包含CDR-H2的SEQ ID NO:27的残基50-66。
68.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体包括含有人受体构架区和非人类供体CDR的可变区。
69.权利要求68的组合物,其中所述抗CD22抗体的重链可变区的人受体构架区基于SEQ ID NO:21和22并且在SEQ ID NO:8中的位置1、28、48、72和97包含供体残基。
70.权利要求69的组合物,其中所述抗CD22抗体在SEQ IDNO:8中的位置68和70还包含供体残基。
71.权利要求68的组合物,其中所述抗CD22抗体包含轻链可变区,所述可变区包含基于SEQ ID NO:17和18的人受体构架区并且在SEQ ID NO:7中的位置2、4、42、43、50和65还包含供体残基。
72.权利要求71的组合物,其中所述抗CD22抗体在SEQ IDNO:7中的位置3还包含供体残基。
73.权利要求58的组合物,其中所述抗CD22抗体包含含有SEQID NO:7的轻链可变区和含有SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
74.权利要求58的组合物,其中所述加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰加利车霉素。
75.权利要求58的组合物,所述组合物还任选包含生物活性剂。
76.权利要求75的组合物,其中所述生物活性剂是细胞毒性药物。
77.权利要求75的组合物,其中所述生物活性剂是生长因子。
78.权利要求75的组合物,其中所述生物活性剂是激素。
79.权利要求75的组合物,其中所述生物活性剂是抗体。
80.包含权利要求19的单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物的组合物在制备治疗增生性疾病患者的药物中的用途。
81.权利要求80的用途,其中所述患者是人类患者,而所述增生性疾病是癌症。
82.权利要求81的用途,其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
83.权利要求82的用途,其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病。
84.权利要求83的用途,其中所述白血病表达细胞表面抗原CD22。
85.权利要求82的用途,其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
86.权利要求85的用途,其中所述淋巴瘤表达细胞表面抗原CD22。
87.权利要求82的用途,其中所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
88.权利要求81的用途,其中所述癌症是癌。
89.权利要求81的用途,其中所述癌症是肉瘤。
90.权利要求80的用途,其中所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物中的加利车霉素是γ加利车霉素或N-乙酰加利车霉素。
91.权利要求80的用途,其中所述药物还包括一种或多种生物活性剂。
92.权利要求91的用途,其中所述一种或多种生物活性剂选自抗体、生长因子、激素、细胞因子、抗激素、黄嘌呤、白介素、干扰素和细胞毒性药物。
93.权利要求92的用途,其中所述生物活性剂是抗体。
94.权利要求93的用途,其中所述抗体针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原。
95.权利要求94的用途,其中针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原的所述抗体选自抗CD19抗体、抗CD20抗体和抗CD33抗体。
96.权利要求95的用途,其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。
97.权利要求92的用途,其中所述细胞因子或生长因子选自白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
98.权利要求92的用途,其中所述激素是类固醇激素并且选自雌激素、雄激素、孕酮和皮质类固醇。
99.权利要求92的用途,其中所述细胞毒性药物选自多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺拉霉素、美诺立尔、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉曲滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌罗霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、氮芥、泼尼松、丙卡巴肼甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素类似物和丝裂霉素。
100.权利要求80的用途,其中所述药物还包含一种或多种细胞毒性药物组合,其中所述细胞毒性药物组合选自:
A.CHOPP,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
B.CHOP,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松;
C.COP,即环磷酰胺、长春新碱和泼尼松;
D.CAP-BOP,即环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松;
E.m-BACOD,即甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸;
F.ProMACE-MOPP,即泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
G.ProMACE-CytaBOM,即泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱;
H.MACOP-B,即甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸;
I.MOPP,即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
J.ABVD,即阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪;
K.MOPP即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼与ABV即阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春碱交替使用;
L.MOPP即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼与ABVD即阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪交替使用;
M.ChIVPP,即苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和泼尼松;
N.IMVP-16,即异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷;
O.MIME,即米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷;
P.DHAP,即地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂;
Q.ESHAP,即依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷和顺铂;
R.CEPP(B),即环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素;
S.CAMP,即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松;
T.CVP-1,即环磷酰胺、长春新碱和泼尼松;
U.ESHOP,即依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂;
V.EPOCH,即依托泊苷、长春新碱和多柔比星给予96小时,同时给予快速浓注环磷酰胺和口服泼尼松;
W.ICE,即异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷;
X.CEPP(B),即环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素;
Y.CHOP-B.,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和博来霉素;和
Z.P/DOCE,即表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和泼尼松。
权利要求80的用途,其中所述药物还包含针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原的抗体,并且任选包含一种或多种细胞毒性药物组合,其中所述细胞毒性药物组合选自:
A.CHOPP,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
B.CHOP,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松;
C.COP,即环磷酰胺、长春新碱和泼尼松;
D.CAP-BOP,即环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松;
E.m-BACOD,即甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸;
F.ProMACE-MOPP,即泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
G.ProMACE-CytaBOM,即泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱;
H.MACOP-B,即甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸;
I.MOPP,即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼;
J.ABVD,即阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪;
K.MOPP即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼与ABV即阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春碱交替使用;
L.MOPP即氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼与ABVD即阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪交替使用;
M.ChIVPP,即苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和泼尼松;
N.IMVP-16,即异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷;
O.MIME,即米托胍腙、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷;
P.DHAP,即地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂;
Q.ESHAP,即依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷和顺铂;
R.CEPP(B),即环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素;
S.CAMP,即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松;
T.CVP-1,即环磷酰胺、长春新碱和泼尼松;
U.ESHOP,即依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂;
V.EPOCH,即依托泊苷、长春新碱和多柔比星给予96小时,同时给予快速浓注环磷酰胺和口服泼尼松;
W.ICE,即异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷;
X.CEPP(B),即环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松和博来霉素;
Y.CHOP-B.,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和博来霉素;和
Z.P/DOCE,即表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和泼尼松。
权利要求80的用途,其中所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物中的抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:27的残基50-66;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQ ID NO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
权利要求80的用途,其中所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物中的抗CD22抗体包含含有SEQ ID NO:19的轻链可变区和含有SEQ ID NO:27的重链可变区。
权利要求80的用途,其中所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物中的抗CD22抗体包含含有SEQ ID NO:28的轻链可变区以及含有SEQ ID NO:30的重链可变区。
权利要求80的用途,其中所述单体加利车霉素衍生物/抗CD22抗体缀合物中的抗CD22抗体包含CDR-H1的SEQ ID NO:1;CDR-H2的SEQ ID NO:27的残基50-66;CDR-H3的SEQ ID NO:3;CDR-L1的SEQ ID NO:4;CDR-L2的SEQ ID NO:5;和CDR-L3的SEQ ID NO:6。
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