CN101687916A - 通过trem-1的炎症治疗、检测和监控 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过抑制/拮抗TREM－1表达/活性/信号转导和/或DAP12/TyroBP表达/活性而治疗受试者炎症性疾病/紊乱的方法。本发明还包括通过检测受试者或来自受试者的样本中TREM－1和/或DAPl2/TyroBP表达或活性来检测受试者中炎症性疾病存在的方法，其中升高的表达或活性是所述炎症性疾病的指征。本发明进一步提供了通过检测患者或来自患者的样本中分泌型磷蛋白1(SPP1)和/或一种或多种其他生物标志物的水平来评价给予患者的TREM－1调节剂的功效的方法。

Description

通过TREM-1的炎症治疗、检测和监控
相关申请的交叉引用
[0001]本申请主张2007年11月2日递交的美国临时专利申请No.61/001,687、2007年4月11日递交的美国临时专利申请No.60/923,131、2007年2月28日递交的美国临时专利申请No.60/904,264和2007年1月16日递交的美国临时专利申请No.60/880,804的优先权，其完整公开通过引用作为参考。
发明背景
[0002]类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性炎症性疾病，影响约1-2％的人口(Feldman(2002)Nature Rev.Immunol.2(5)：364-371；Mount等人(2005)Nature Rev.Drug Discovery 4(1)：11-12)。RA的特点是动关节中骨和软骨的慢性炎症及破坏。疾病发病通常是在25至50岁的年龄，其中三分之一的病人在20年之内会变得严重残疾。
[0003]虽然RA的确切病因不明，已有人提出RA的形成涉及传染病或环境暴露(Firestein(2005)J Clin.Rheumatology 11(3Supp.)：S39-44)。先天免疫的局部诱导可以激活滑膜内层中的细胞并准备好遗传性易感个体中后续适应性免疫应答的区域(Firestein(2005)J Clin.Rheumatology 11(3supp.)：S39-44)。已确诊的类风湿性关节炎患者滑膜的特征在于显著的滑膜内膜内层增生、血管分布增加和内层之下炎性细胞的积聚。对RA滑膜的活检也揭示了许多促炎细胞因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的自发产生(Feldman等。(1996)Ann.Rev.Immunol.14：397-440)。发现中和TNF-α活性的抗体取消了多种细胞因子的产生，这导致了新型抗TNF-α疗法治疗RA的发现。最近的临床结果显示了RA的不一致性，并提示了其他因素也可能导致这种疾病的发病机制。
[0004]髓样细胞表达的触发受体-1(TREM-1)是最近发现的免疫球蛋白样细胞表面受体，主要表达在中性粒细胞和CD14高单核细胞的亚群上(Colonna等。(2000年)Seminars in Immunol.12(2)：121-27)。TREM-1有短的细胞内结构域，且TREM-1信号传导是通过衔接蛋白DAP12/TyproBP介导的。DAP12/TyroBP是一种具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的跨膜蛋白，并作为衔接蛋白行使功能，与TREM-1和其他跨膜受体结合。
[0005]在急性炎症过程中，TREM-1表达被各种Toll样受体(TLR)配体上调(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Bleharski等人(2003)J.Immunol.170(7)：3812-18；Murakami等人(2006)54(2)：455-62)。例如，已经暗示TREM-1涉及与脓毒症相关的急性炎症(Colonna(2003)Nat.Rev.Immun.3(6)：445-53)。在脓毒症中，细胞表面TREM-1和可溶性TREM-1的表达以一种与疾病的严重程度相关的方式升高(Gibot等人(2005)New England J.Med.350(5)：451-58；Gibot等人(2005)Critical Care Med.33(4)：792-96)。在尿酸一钠(MSU)诱导的痛风炎症模型中，在浸润的腹膜巨噬细胞和中性粒细胞中快速诱导TREM-1的表达。此外，TREM-1的活化刺激多种促炎细胞因子和趋化因子的产生。
[0006]此外，TREM-1与TLR和Nod样受体在这些细胞因子产生中的协同效应放大了炎症反应(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Bleharski等人(2003)J.Immunol.170(7)：3812-18；Netea等人(2006)J.Leukocyte Biol.80(6)：1454-61)。这些数据表明了增加的TREM-1表达和TREM-1表达细胞向炎症位点的迁移可能通过炎症反应的放大而促成急性炎症。
[0007]TREM-1在急性炎症反应中的作用，还通过使用TREM-1胞外域-Fc融合蛋白或TREM-1胞外域合成肽保护小鼠免于致死性LPS或细菌诱导的脓毒性休克而证实(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Gibot等人(2004)J.Exp.Med.200(11)：1419-26)。TREM-1-FC的也可防止酵母多糖-A诱导的肉芽肿形成，这表明TREM-1可以在慢性炎症以及急性炎症中发挥作用(Nochi等人(2003)Am.J.Path.162(4)：1191-201)。此外，越来越多的证据表明，可溶形式TREM-1的循环水平是针对多种炎症性疾病的生物标志物，包括脓毒症、肺炎、急性胰腺炎、消化性溃疡(Gibot等人(2005)Intensive Care Med.31(4)：594-97；Gibot等人(2004)New England J.Med.350(5)：451-58；Wang等人(2004)World J.ofGastroenterology 10(18)：2744-46；Koussoulas等人(2006)Eur.J.Gastroenterology & Hepatology 18(4)：375-79)。
发明概述
[0008]本发明部分基于下述发现：TREM-1和/或DAP12/TyroBP的过表达与自身免疫性疾病和/或炎症性疾病的出现有关。因此，TREM-1和/或Dap12/TyroBP是用于自身免疫性疾病和炎症性疾病的预防和治疗的新型治疗靶标。一方面，本发明涉及使用TREM-1和/或DAP12/TyroBP拮抗剂治疗或预防炎症性疾病。能够用于本发明的拮抗剂包括，例如，抗体(包括例如：抗体片段、单链抗体Fv、产生自任何物种的单结构域抗体，所述物种包括例如：人、小鼠、骆驼、骆马、鲨鱼、山羊、兔和牛，更详细的说明见下文)；可溶性受体(包括截短的受体、天然可溶性受体、或包含与第二蛋白质(例如免疫球蛋白的Fc部分)融合的受体(或其片段)的融合蛋白)；肽抑制剂；小分子；配体融合物和结合蛋白。TREM-1和DAP12/TyroBP是类风湿性关节炎的有效生物标志物，因为这些基因在患有类风湿性性关节炎的个体中过表达。TREM-1是表达在特定细胞类型上的细胞受体，如中性粒细胞和单核细胞亚群，而且TREM-1也以可溶性形式存在。TREM-1信号转导由衔接蛋白DAP12/TyroBP介导。TREM-1的活化诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生。因此，TREM-1提高的表达可能会导致或促使在RA、哮喘和其它炎症疾病中观察到的炎症，如慢性炎症性疾病和呼吸系统炎症/疾病。所以，TREM-1和/或DAP12/TyroBP是用于治疗、调节和/或预防类风湿性关节炎和其它炎症疾病相关的症状有前途的治疗靶标。
[0009]一方面，本发明提供了一种通过减少TREM-1介导的信号转导来治疗炎症性疾病的方法，这种炎症性疾病诸如，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。减少TREM-1介导的信号转导可包括调节、抑制和/或拮抗TREM-1受体和/或涉及TREM-1信号转导的其他分子(如DAP12/TyroBP)，从而减轻、治疗、预防、缓和和/或改善与TREM-1介导的炎症相关的症状。在一些实施方案中，通过抑制TREM-1转录、选择性切割内源性TREM-1mRNA或抑制内源性TREM-1mRNA翻译来降低TREM-1蛋白表达。例如，TREM-1蛋白的表达可以通过给予干扰RNA来降低，例如shRNA(如，SEQ ID NO：9-22中任意一个编码的shRNA)或siRNA(例如SEQ ID NO：23-26中的任意一个)。在其他的实施方案中，TREM-1的活化通过给予小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、结合TREM-1的抗体或抗体片段、结合TREM-1配体的抗体或抗体片段、可溶性TREM-1受体或其配体结合部分、或可溶性TREM-1受体融合蛋白来抑制。本发明其它实施方案提供通过直接抑制TREM-1信号转导通路中的非TREM-1成员(例如，TREM-1辅助蛋白DAP12/TyroBP)治疗炎症性疾病的方法，该炎症性疾病诸如，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。在一些实施方案中，通过在受试者中对内源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白诱导免疫应答而在受试人中降低TREM-1介导的信号转导。例如，可对受试者施用包含佐剂和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物，以引发对该内源性蛋白的免疫应答。
[0010]本发明的另一方面提供了与TREM-1结合而不会激活受体的抗体或抗体片段。该抗体或抗体片段可以是例如单克隆抗体。本发明其它的实施方案提供治疗受试者(例如人)的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的结合TREM-1但不激活受体的抗体或抗体片段的步骤。
[0011]另一方面，本发明提供了SEQ ID NO：9-22中任意一个编码的shRNA。
[0012]本发明指出，TREM-1的活化导致许多基因的差异表达，如分泌型磷蛋白1(SPP1)，它可以作为TREM-1活性的标志物。因此，在另一方面，本发明提供特异性针对TREM-1活性和对TREM-1活性有指示性的标志物。一个或多个这些标志物水平的变化与TREM-1的活性变化相关。因此，本发明还提供通过检测这些标志物中的一个或多个的水平来评价TREM-1的活性，和/或评价给予需要这种治疗的患者(例如病人)TREM-1调节剂的疗效的方法。例如，可在患者或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白1(SPP1，也称为骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白I(BSPI)、早期T-淋巴细胞活化蛋白1(ETA-1)或MGCl10940)的水平，而且SPP1水平的变化与TREM-1的信号变化相关。SPP1水平可以在患者或来自患者的任何临床相关样本中检测，如体液样本(如血清、滑液、气管液，唾液)。在一个实施方案中，该方法进一步包括将SPP1水平与参考水平比较的步骤，其中与参考水平相比SPP1水平的增加可以是TREM-1活性增加的指征，其中相对于参考水平SPP1水平的下降可以是TREM-1活性降低的指征。该参考水平可以是，例如，在给予TREM-1调节剂之前患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。下面较详细的说明了根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，如图8A所示。
[0013]在又一方面，本发明提供了筛选能够调节TREM-1信号转导的候选试剂的方法。该方法包括将表达TREM-1的细胞与候选试剂接触，并检测该表达TREM-1的细胞的分泌性磷蛋白1(SPP1)的水平，以确定该候选试剂是否调节TREM-1活性。可以根据本发明筛选的候选试剂包括，例如，干扰RNA、小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、结合TREM-1的抗体或其片段、结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白，以及它们的组合。在其他的实施方案中，该方法包括将表达TREM-1的细胞与TREM-1激活剂(例如，交联抗体)接触。在又一些实施方案中，该方法可以包括将测得的SPP1水平与参考水平比较。SPP1水平相对于参考水平的增加可以作为TREM-1信号转导增加的指征，SPP1水平相对于参考水平的下降可以作为TREM-1信号转导下降的指征。在一个实施方案中，参考水平对应于将TREM-1表达细胞接触候选试剂之前测得的该细胞的SPP1水平。下面更详细说明根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，例如，参见图8A。
[0014]本发明的另一方面提供了监测治疗病人的炎症或慢性炎症的方法。该方法包括对有需要的患者(例如病人)施用TREM-1调节剂、检测患者或来自患者的样本中分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，并将检测到的SPP1水平与参考水平比较。SPP1水平可以在患者或来自患者的样本中检测，如体液样本(如血清、滑液、气管液、唾液)。与参考水平相比，SPP1水平的减少是TREM-1介导的炎症降低的指征，而与参考水平相比，SPP1水平没有改变或升高则分别表明TREM-1介导的炎症并没有改变或者有升高。在一些实施方案中，参考水平对应于在给予TREM-1调节剂之前或同时在患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。在其他的实施方案中，参考水平对应于对照受试者(例如人)或来自对照受试者的样本的SPP1水平，其中已知对照受试者没有慢性炎症。下面更详细说明根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，例如，参见图8A。
[0015]另一方面，本发明涉及检测受试者(例如人)患有炎症疾病的方法，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。炎症性疾病包括，例如，关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、与狼疮有关的关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、自身免疫性皮肤病、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、节段性回肠炎、结肠炎、溃疡性结肠炎、糖尿病(I型)、炎症，如皮肤(如牛皮癣，急性和慢性荨麻疹(风疹))、心血管系统(如动脉粥样硬化)、神经系统(如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症)、肝脏(如肝炎)、肾脏(如肾炎)和胰腺(例如，胰腺炎)；心血管疾病，如胆固醇代谢病、氧自由基损伤；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统疾病，如哮喘和COPD(例如，囊性纤维化)；急性炎症(如，内毒素血症、败血症、脓毒性休克、中毒性休克综合征和感染性疾病)；移植排斥反应和过敏症(比如过敏症、血管性水肿、特应性、昆虫叮咬变应性、变应性鼻炎)。可根据本发明检测的其他病症包括缺血。该方法包括在受试者或得自受试者的样本中检测TREM-1(例如，膜结合的TREM-1，可溶性TREM-1)或DAP12/TyroBP表达或活性的步骤。(在此申请中，“或”可以指“和/或”，因此，如果需要该方法可以包括检测TREM-1和DAP12/TyroBP两者，也可以包括表达及活性的检测)。用于实施本发明这个方法和其他方法的样本是其中的TREM-1和/或DAP12/TyroBP可以检测的任意样品，包括例如，包括关节组织、滑液、滑膜，或任何其他与临床有关的体液或组织的样本，无论是，例如，循环的样本(如血液，血浆或淋巴)，还是集中在慢性炎症位点、免疫系统的组织、或曾经暴露于慢性炎症位点的组织或体液的样本。检测到升高的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性是炎症疾病存在的指征，例如，慢性炎症性疾病，如RA。该方法可包括额外步骤来将受试者或来自受试者的样本中TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性与已知参考水平相比较。比较的结果(例如增加的表达或活性)，是炎症性疾病存在的指征。参考水平可以，例如，是炎症性疾病存在的指征，或是区分正常表达和表达升高的阈值等。
[0016]本发明还提供了通过如下步骤在受试者(如人)中检测诸如慢性炎症性疾病(诸如RA或哮喘等)等炎症性疾病存在的方法：检测TREM-1或DAP12/TyroBP在受试者或来自受试者的样本中的表达和将受试者或样本中的TREM-1或DAP12/TyroBP表达与参考水平比较。比较的结果(例如表达的增加)是炎症性疾病存在的指征。参考水平可以是炎症性疾病存在的指征，或是区分正常表达和表达升高的阈值等。
[0017]另一方面，本发明提供了在受试者(例如人)中监测诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的方法。该方法受益于如下了解：TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性在受试者中随时间的变化(对受试者或来自受试者的样本在不同时间测定)可以用作疾病状态改变的指征。该方法包括在两个或更多个不同的时间(此处有时称为第一时间和后来的第二时间)检测受试者或来自受试者的样本的TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性，并比较观察到的表达或活性。TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性随时间的降低可以作为炎症性疾病减轻的指征，而TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性随着时间的增加则可以是炎症性疾病严重的指征。
[0018]该监测方法也用于评估对受试者(如人)的诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的治疗。在受试者中进行后来的第二时间的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性检测之前进行治疗，或在取后来的第二个样本之前进行治疗。治疗可以在监测方法开始之前或之后(第一时间对受试者进行检测之前或之后，或从受试者取第一个样本之前或之后)进行。此外，根据第一时间或在第一个样本中检测的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性与后来的第二时间或在第二个样本中检测的TREM-1或DAP12/TyroBP表达的比较，可以对治疗的疗程进行修改。
[0019]本发明这些和其他方面，以及实施方案也在本申请的下列部分中详细说明，这些说明只是为了突出说明本发明的具体实施方案，而不是为了限制本发明，本发明的范围由所附的权利要求书限定。
附图简要说明
[0020]本专利或专利申请文件中包含至少一个彩图。应请求并支付必要的费用后，本专利或本专利申请公开的带有彩图的副本可以由专利局提供。
[0021]图1是显示TREM-1和DAP12/TyroBP在RA患者滑膜中表达的条形图。
[0022]图2是显示在鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达的条形图。
[0023]图3A展示了在RA阳性滑膜切片中的人TREM-1的代表性免疫组织化学染色图，TREM-1阳性指数大于1000。
[0024]图3B显示在骨关节炎(OA)对照切片中人TREM-1的代表性免疫组化染色的图，TREM-1阳性指数小于20。
[0025]图4是用ELISA法检测的来自RA和对照(HVOS)患者的人血浆样本中可溶性TREM-1水平的图。
[0026]图5显示了描述TREM-1交联后促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)活化的随时间变化的示例性蛋白质印迹图。
[0027]图6显示了成簇分析调节大于2倍，p小于0.01的基因的示例性ANOVA热图(ANOVA heat map)。个体供体示于左侧，平均平均值强度示于右侧。
[0028]图7显示了所有存在的基因的示例性散点图(“回应(calls)”)。针对TREM-1(x-轴)和LPS(y-轴)标绘Ln倍数改变(Ln foldchanges)，下调转换为负值。选择的基因突出显示。其45°轴分开两种治疗可比调节的基因。
[0029]图8A为列出了在TREM-1活化下上调大于4倍的示例性基因的表格。
[0030]图8B为列出了用LPS处理时上调大于4倍的示例性基因。
[0031]图9a为列出了共同上调大于4倍的示例性基因的表格，也就是说，这些基因是在TREM-1活化和在用LPS处理时都上调的基因。
[0032]图9b为列出了或者是在TREM-1活化时，或者在用LPS处理时下调大于4倍的示例性基因的表格。
[0033]图10A-B显示了用表达绿色荧光蛋白的人单核细胞系THP-1细胞的示例性吞噬实验结果。1微米珠呈红色。图10A显示处理后THP-1细胞的形态学变化。图10B表明，用α-TREM-1和LPS的处理诱导了微球吞噬。
[0034]图11A-F为示例性时程ELISA(time-course ELISA)。图11A为GM-CSF，图11B为M-CSF，图11C为G-CSF、图11D为INHBA(抑制素，βA(激活蛋白A，激活蛋白ABα多肽))，图11E为SPP1，图11F为IL-23。
[0035]图12是一系列条形图，表示TREM-1的交联以剂量依赖的方式在RA组织样本中诱导多种细胞因子的产生。
[0036]图13A-B为表示在从三个不同供体制备的组织样本中多种细胞因子的产生的图表。图13A显示了在三个供体样本中自发产生的细胞因子的比较。图13B显示三个供体样本中TREM-1交联后，细胞因子产生的比较。
[0037]图14为表示在K/BxN爪中升高的TREM-1表达的条形图。
[0038]图15为显示在mTREM-1-hFC转基因小鼠和野生型小鼠中应答K/BxN血清转移的踝增厚的图表。
[0039]图16为显示mTREM-1-hFC转基因小鼠在第14天应答K/BxN血清转移的踝增厚的图表。
[0040]图17是表示在表达mTREM-1-hFc融合蛋白的转基因小鼠中用抗IgE抗体攻击后耳肿胀的图
[0041]图18是表示在用mTREM-1-mFc蛋白预处理的小鼠中以抗IgE抗体攻击后耳肿胀的图表。
[0042]图19是表示在用mTREM-1-mFc蛋白预处理的小鼠中以抗IgE抗体攻击后耳朵肿胀的剂量反应的图表。
[0043]图20是表示抗-IgE抗体攻击后TREM-1敲除小鼠耳朵肿胀的图表。
[0044]图21是表示shRNA或siRNA敲除后用RT-PCR检测的TREM-1表达的条形图。
[0045]图22A-B为在TREM-1过表达的细胞系中用慢病毒shRNA敲除TREM-1之后，说明TREM-1表达的代表性蛋白质印迹图。
[0046][0046]图23是一个表格，列出了利用的人类基因组U133_plus 2.0阵列总结的纯化的人单核细胞全基因表达谱的结果(见实施例6)。
[0047]图24是一个表格，其进一步利用
Figure A20088000837800152
的人类基因组U133_plus 2.0阵列总结了纯化的人单核细胞全基因表达谱的结果(见实施例6)。
发明具体说明
[0048]本文提到的术语“核酸”是指多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，和在适当情况下的核糖核酸(RNA)。这个词也应理解为包括，适用于所述实施方案的，单链(如正义或反义的)和双链多核苷酸。
[0049]本文提到的“RA阳性”、“RA样本”和“RA组织”是指患有类风湿性关节炎的受试者，或来自患有类风湿性关节炎的受试者的任何组织、体液、或其他样本。“RA阴性”指未受影响的受试者或来自未受影响的受试者的任何组织、体液、或其他样本。
[0050]本文提到的术语“RA”指的是类风湿性关节炎。本文中所使用的术语“OA”指的是骨关节炎。
[0051]术语“抗体”包括完整的分子以及其功能性片段，如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc、Fd、Fd′、Fv、单链抗体(如scFv)、单可变结构域抗体(Dab)、双抗体(二价和双特异性)、和嵌合(如，人化的)抗体，其可以通过对完整抗体的修饰得到，或者利用重组DNA技术从头合成。这些功能性抗体片段仍然保有选择性地与各自的抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体种类，包括，但不仅限于，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，也可来自抗体的任何亚类(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。该抗体也可以是人抗体、人化抗体、CDR嫁接的抗体，或在体外产生的抗体。该抗体可以具有选自例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。该抗体还可以有选自例如，κ或λ的轻链。该抗体恒定区可以经更改(如经突变)以修饰抗体的性质(例如，增加或减少下列中的一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。通常情况下，抗体与预定抗原特异性结合，如与例如神经退化、代谢、炎症、自身免疫和/或恶性疾病等疾病有关的抗原。
[0052]本发明的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可包括那些其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。其实例包括，但不限于，重链抗体、轻链天然缺失的抗体、来自传统的四链抗体的单结构域抗体、工程抗体和并非来自抗体的单结构域支架结构。单结构域抗体可以是本领域任何单结构域抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可能来自任何物种，包括但不限于，小鼠、人、骆驼、骆马、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。在本发明的一个方面，单结构域抗体可以源自鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如源自在鲨鱼血清中发现称作新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的。制备源自NAR(“IgNAR”)可变区的单结构域抗体的方法记载在WO 03/014161和Streltsov(2005)ProteinSci 14：2901-2909中。根据本发明另一方面，单结构域抗体是天然形成的、称为缺乏轻链的重链抗体的单结构域抗体。这样的单结构域抗体披露于例如WO9404678中。为了清楚起见，这个源于轻链天然缺失的重链抗体的可变结构域在此处被称为VHH或nanobody，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH相区分。这种VHH分子可以来自于骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、骆马、单峰驼、羊驼和原驼。除了骆驼科其它物种可能会产生轻链天然缺乏的重链抗体；这种VHH落在本发明的范围内。
[0053]本发明还设想使用小模块化免疫药物(Small ModularImmunoPharmaceuticals)(“SMIPsTM”)，其通常是指结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，包括融合到或者以另外的方式连接到免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽的结合结构域多肽，免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽又融合或以另外的方式连接到包括一个或多个天然或工程化的恒定区的区域，该恒定区来自除了CH1的免疫球蛋白重链，例如，IgG和IgA的CH2和CH3区，或IgE的CH3和CH4区(其更完整的描述见例如，Ledbetter，J.等的US 2005/0136049)。该结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括一个区域，其包括：融合或者以另外的方式连接到铰链区多肽的天然或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或者在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH3)；和天然或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH4)，该多肽融合或者以另外的方式连接到所述CH2恒定区多肽(或者在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH3)。通常情况下，这种结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白具有选自下组中的至少一种免疫活性：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、补体固定和/或结合靶标(例如靶抗原)。
[0054]本文中所使用的术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”是用来指与“正义”链互补的核酸链。反义分子可通过任何方法制备，包括通过以颠倒的方向将目的基因与病毒启动子连接，这允许互补链的合成。一旦引入细胞中，这种经转录的链结合细胞产生的天然序列形成二倍体。然后这些二倍体进一步阻断转录或翻译。“-”负标识有时用于指代反义链，和“+”正标识有时用于指代正义链。
[0055]本文提到的术语“受试者”和“患者”是指任何人类或非人类的哺乳动物。
[0056]本文提到的术语“检测”和以“检测”为词根的所有其他形式的词指的是确认一个或多个靶标的存在或不存在、一个或多个靶标的定量、或确定一个或多个生物标志物的阈值的存在或不存在。
[0057]本文提到的术语“关节组织”是指来自关节区域的任何组织或液体，非限制性包括：腱、韧带和滑膜。
[0058]本文提到的术语“炎症性疾病”以非限制性实例的方式包括，关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、与狼疮有关的关节炎或强直性脊柱炎)；硬皮病；系统性红斑狼疮；血管炎；多发性硬化；自身免疫性甲状腺炎；皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)；自身免疫性皮肤病；重症肌无力；炎症性肠病(EBD)；节段性回肠炎；结肠炎；溃疡性结肠炎；糖尿病(I型)；炎症，例如，皮肤(如牛皮癣，急性和慢性荨麻疹(风疹))、心血管系统(如动脉粥样硬化)、神经系统(如阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症)、肝脏(如肝炎)、肾(如肾炎)和胰腺(例如，胰腺炎)；心血管疾病，如胆固醇代谢病、氧自由基损伤；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统疾病，如哮喘和COPD(例如，囊性纤维化)；急性炎症(如，内毒素血症、败血症、脓毒性休克、中毒性休克综合征和感染性疾病)；移植排斥反应和过敏症(比如过敏症、血管性水肿、特应性、昆虫叮咬变应性、变应性鼻炎)。
[0059]本文提到的术语“慢性炎症性疾病”是指炎症反应长期持续(例如，几周，几月，甚至无限期)的任何疾病，且其延长的时间段是由组织中炎症的成因刺激物持续刺激引起的。术语“慢性炎症性疾病”包括，例如，类风湿性关节炎。
[0060]本文提到的术语“指征”(例如，炎症性疾病的指征)指征兆或指示，或需要考虑的因素，而不是确切的证据或是其本身。一般来说，增加的TREM-1表达水平与炎症性疾病(例如，RA)的增加的可能性相关；因此，增加的TREM-1表达是炎性性疾病(如RA)存在的指征。同样，正常TREM-1表达水平一般与无炎症性疾病(如RA)的增加的可能性相关。
[0061]本文提到的术语“PCR”指聚合酶链式反应。
[0062]本发明包括将TREM-1和DAP12/TyroBP作为炎症性疾病(诸如慢性炎症性疾病等)生物标记物的鉴定，更具体地说，作为RA的生物标志物的鉴定。RA和正常滑膜组织转录谱的比较发现，人RA样本中TREM-1mRNA表达比正常上调高6.5倍，人RA样本中DAP12/TyroBPmRNA表达比正常上调高2倍(见实施例1)。在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，TREM-1mRNA在CIA的爪中比在正常小鼠的爪中的表达上调132倍，并且DAP12/TyroBP mRNA在CIA的爪中比在正常小鼠的爪中的表达上调8.21倍(见实施例2)。采用免疫组织化学方法发现，人类RA滑液样本含有数量增加的TREM-1表达细胞(见实施例3)。此外，在滑液培养物中TREM-1的活化以剂量依赖的方式诱导促炎细胞因子和细胞因子产生(见实施例9)。此外，与对照患者相比，在RA患者的人临床血浆样本中可溶性TREM-1水平升高(见实施例4)。作为RA的生物标志物的TREM-1和DAP12/TyroBP的鉴定，和TREM-1诱导促炎症反应的能力使得TREM-1和TREM-1信号转导通路的成员成为诸如慢性炎症性疾病(特别是RA)等炎症性疾病的理想治疗靶标。
基因表达的检测
[0063]本发明提供了通过检测或定量TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性来检测和监测诸如慢性炎症性疾病等炎症性疾病的方法。众所周知许多蛋白质、核酸、或感兴趣的活性水平的定量或不定量的检测方法，且其可用于本发明的实践中。
[0064]目的基因转录物可以用多种本领域已知的技术检测。一些有用的核酸检测系统包括准备纯化的样品的核酸组分，以及对样品进行直接检测，或扩增过程之后进行检测，例如检测关节组织样本中的TREM-1mRNA。可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶(RT)和偶联的RT-PCR进行扩增。核酸的检测可以通过例如用与目的核酸杂交的探针探测纯化的核酸组分来达成，许多情况下还会涉及扩增。Northern印迹、点印迹、微阵列、定量PCR和定量RT-PCR都是用于检测样本中核酸的众所周知的方法。核酸扩增也可以通过连接酶链反应、链置换扩增、自主序列复制或基于核酸序列的扩增进行。参见例如，Lewis(1992)GeneticEngineering News 12(9)：1；Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878和Weiss(1991)Science 254：1292。核酸也可以通过测序检测，测序可以采用对目的核酸特异的引物(例如TREM-1cDNA序列)或针对连接到目的核酸的接头序列的引物。随机选择的mRNA或cDNA序列的测序可以提供对生物标志物的相对表达量的表征，这通过所有测序的含有对应于该生物标志物的核酸序列(例如TREM-1的cDNA或mRNA序列)的转录物的百分比来表征。或者，核酸可以原位检测而不经提取或纯化，例如通过杂交来检测。
[0065]例如，靶蛋白可以用一个或多个抗体免疫检测。在免疫检测中，可以直接或间接标记对生物标志物有特异结合亲和性的抗体，或与该抗体结合的第二抗体。抗体不需要是完整的：抗体可变结构域或其人工模拟物(如单链抗体)即可。合适的标记物包括但不限于，放射性核素(例如，125I、131I、35S、3H、32P、33P或14C)、荧光基团(例如，荧光素、FITC、多甲藻(黄)素叶绿素蛋白、罗丹明或PE)、发光基团(例如，加州帕洛阿尔托的量子点公司(Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA)提供的Qdot TM纳米颗粒)、吸收确定波长光的化合物或酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。可以通过与生物素结合然后用采用上述分子标记的亲和素或链霉素检测而间接标记抗体。根据标记的性质检测或定量标记物的方法是本领域已知的。检测器的例子包括但不限于X光片、辐射计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和光密度计。可以使用本领域熟悉的这些方法的组合(包括“多层”检测)来提高检测的灵敏度。
[0066]检测目标蛋白质的免疫学检验可以以各种已知方式进行，包括夹心法、竞争法(竞争RIA)，或桥免疫测定(bridge immunoassay)。参见，例如，美国专利NO.5,296,347、4,233,402、4,098,876和4,034,074.。检测目标蛋白质的方法一般包括将生物学样本与结合该蛋白质的抗体接触，并检测该蛋白质与该抗体的结合。例如，可以通过本领域已知的各种方法中的任何方法将对TREM-1有特异性结合亲和力的抗体固定在固体基质上，然后将该抗体暴露给该生物学样本。TREM-1与固体基质上的抗体的结合可利用表面等离子体共振的现象来检测，结合后会导致表面等离子体共振强度的改变，这种改变可以用适当仪器定性或定量检测到，例如
Figure A20088000837800211
设备(Biacore International AB，瑞典Rapsgatan)。或者，可以如上所述标记和检测该抗体。可以用已知量的蛋白质作出标准曲线以协助生物标志物水平的定量。
[0067]在其他实施方案中，使用捕获抗体被固定于固体基质的“夹心”检测法来检测目的蛋白质的水平。该固体基质可以与生物学样本接触，从而使得该样本中的任何目的蛋白质能够结合到该固定化的抗体上。可以利用对目的蛋白质有特异性结合亲和性的“检测”抗体来测定结合到上述捕获抗体的目的蛋白质的水平，方法如上所述。应了解，在这些夹心检验法中，捕获抗体不应该结合到与检测抗体所结合的抗原表位相同的抗原表位上(或在使用多克隆抗体的情况下，捕获抗体结合的抗原表位的范围不应该与检测抗体所结合的抗原表位的范围相同)。因此，如果一种单克隆抗体用作捕获抗体，检测抗体可以是另一种单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获单克隆抗体结合的抗原表位在物理上完全分隔，或者仅仅与其部分重叠；检测抗体也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获单克隆抗体结合的抗原表位上或结合到除捕获单克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。如果多克隆抗体作为捕获抗体，检测抗体可以是单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获多克隆抗体结合的任何抗原表位在物理上完全分隔，或者与其部分重叠；检测抗体或也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获多克隆抗体结合的抗原表位上，或结合到除捕获多克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。夹心检测可以作为夹心ELISA法、夹心蛋白质印迹检测或夹心免疫磁性检测法来实施。
[0068]适用的抗体(如捕获抗体)可以结合的固体基质包括但不限于，微孔板、管、如尼龙膜或硝酸纤维素膜等的膜、和珠子或颗粒(如，琼脂糖、纤维素、玻璃、聚苯乙烯，聚丙烯酰胺、磁性的、或可磁化珠或颗粒)。当使用自动免疫检测系统时，特别适用磁性颗粒或可磁化颗粒。
[0069]检测目标多肽的其他技术包括质谱-分光光度技术，例如电喷射离子化(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。参见，例如，Gevaert等人(2001)Electrophoresis 22(9)：1645-51；Chaurand等人(1999)J.Am.Soc.Mass Spectrom.10(2)：91-103。用于这种用途的质谱仪可购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城)；BrukerDaltronics(马萨诸塞州比尔里卡)和通用电气医疗集团(GE Healthcare)(新泽西州Piscataway)。
[0070]应理解，采用上述技术中的一种或多种可以容易地检测根据本发明的任何目的基因转录物或目的蛋白质的表达。
TREM-1活性的检测
[0071]可以评价TREM-1或DAP12/TyroBP的活性，例如，通过评价一个或多个(例如，两个或两个以上，三个以上，四个以上，五个以上，十个以上，或二十个以上)TREM-1响应基因的表达水平。表达水平可以是绝对或相对的，例如，如与对照样本或参考水平比较。可以通过测试样本和任选的对照样本的转录谱来测定基因差异表达。参考水平可以是对应于已知疾病状态样本的转录谱。阳性对照可以是，例如，其中TREM-1和/或DAP12/TyroBP已有意在一个或多个细胞中过表达的样本，其中已经通过例如加入交联抗体激活TREM-1或DAP12/TyroBP内源性或重组表达的细胞样本，或来自患有已知其严重程度的炎症性疾病或慢性炎症性疾病(例如RA)的受试者的样本。阴性对照可以是，例如，其中TREM-1和/或DAP12/TyroBP没有表达或激活的样本，或来自无炎症性疾病或慢性炎症性疾病(如，RA)的受试者的样本。
[0072]许多用核酸微阵列得到转录谱的实验方案都可以得到。示例性实验方案包括由Affymetrix结合使用其
Figure A20088000837800231
阵列而提供的实验方案。适合进行核酸微阵列杂交的样本可以从任何人的细胞或组织制备。当核酸微阵列包括用于非人类药物目的基因的探针时，可以制备用于相应的非人类物种的细胞或组织的样本。
[0073]用于与核酸微阵列杂交的样本可以是RNA(如mRNA或cRNA)或DNA(如cDNA)。多种方法可用于从组织分离RNA。这些方法包括但不限于试剂盒(德国希尔敦的Qiagen公司提供)，MasterPureTM试剂盒(Epicentre Technologies提供)和
Figure A20088000837800233
(加州卡尔斯巴德的Gibco BRL公司提供)。也可以使用由Affymetrix公司提供的RNA分离的实验方案。
[0074]在一个实施方案中，分离出的RNA在与核酸微阵列杂交之前被扩增或标记。适用于RNA的扩增方法包括，但不仅限于，逆转录酶聚合酶链式反应，等温扩增，连接酶链反应，Qbeta复制酶方法。扩增产物可以是cDNA或cRNA。在一个实施方案中，用逆转录酶和引物将分离的mRNA反转录成cDNA，该引物由寡聚d(T)和编码噬菌体T7启动子的序列组成。该cDNA是单链的。该cDNA的第二链可以用DNA聚合酶合成，与RNase联合使用以破坏DNA/RNA杂交体。合成该双链cDNA后，加入T7RNA聚合酶以从双链cDNA的第二链转录cRNA。在一个实施方案中，最初分离出的RNA可以不经扩增而与核酸微阵列杂交。
[0075]cDNA、cRNA或其他核酸样本可以用一个或多个标记基团标记，以便对杂交的多核苷酸复合物检测。标记基团可以包括可以用光谱、光化学、生化、生物电子、免疫化学、电子、光学或化学检测手段检测的组合物。标记基团包括放射性同位素、化学发光化合物、标记的结合蛋白、重金属原子、光谱标志物如荧光标记物和染料、磁性标记物、结合的酶、质谱标签、自旋标记物、电子传递供体和受体，等等。
[0076]杂交反应可以以绝对或差异杂交的形式进行。在绝对杂交形式中，来自一个样本的多核苷酸与核酸微阵列的探针杂交。形成杂交复合物后检测的信号与样本中的多核苷酸水平相关。在差异杂交形式中，来自两个样本的多核苷酸用不同的标记基团标记。将这些不同标记的多核苷酸混合物添加到核酸微阵列。然后在来自两个不同的标记发出的光可单独检测的条件下，检测该核酸微阵列。在一个实施方案中，荧光团Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，新泽西州皮斯卡塔韦)被用作差异杂交形式的标记基团。
[0077]可以用可商购的软件分析从核酸微阵列收集的信号，例如由Affymetrix或安捷伦科技公司(Agilent Technologies)提供的商业软件。用于扫描灵敏度、探针标记和cDNA或cRNA定量的对照也可以包括在杂交实验中。在进行进一步分析之前，杂交信号可以进行协调或标准化。例如，对于每个探针杂交信号可以标准化，以将在相似实验条件下使用多于一个微阵列时杂交强度的变化考虑在内。杂交信号也可以使用每个微阵列中含有的内部标准化对照所产生的强度来标准化。此外，可以使用具有在各个样本间相对一致的表达水平的基因来标准化其他基因的表达水平。在一个实施方案中，针对某些维持基因(看家基因)的探针包括在核酸微阵列中。选择这些基因，是因为它们显示出跨越各种组织的稳定表达水平。杂交信号可以以这些维持基因的表达水平为基础标准化或协调。
疾病或治疗的监测和评价
[0078]本发明提供了在受试者中监测诸如慢性炎症性疾病(例如，RA)等炎症性疾病的方法。对受试者的炎症性疾病的进展可以通过测量对应于诸如TREM-1或DAP12/TyroBP等一个或多个生物标志物的mRNA，或所编码的蛋白质表达水平或其活性来检测。靶基因mRNA或蛋白质表达水平可以在体内检测，或在取自例如，关节组织、滑液、滑膜或任何其他临床相关来源的样本中检测。对应于靶基因的mRNA和/或蛋白质的表达水平可以通过如上所述的标准方法检测。通过将受试者的靶标蛋白质或RNA水平与该受试者靶标蛋白质或RNA基线水平比较，可以监测受试者的疾病状态(例如，疾病的改善、加剧或复发)。例如，第一时间检测的受试者的TREM-1表达水平可以与后来的第二时间受试者的TREM-1表达水平比较。TREM-1mRNA或蛋白质的表达水平随时间的升高是炎症性疾病发展的指征。TREM-1mRNA或蛋白质的表达水平随时间的降低是炎症性疾病减轻的指征。
[0079]受试者中例如TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白质或RNA的水平也可用于监测治疗效果。通常，获得受试者目的蛋白质或RNA的基线水平(例如治疗前的)，并且与在治疗后或治疗期间的多个时间点(例如治疗后1天或更多天、数周或数月)测得的目的蛋白质或RNA的水平相比较。比较的结果可表明过去治疗的效果，并可由此对未来的治疗作出相应的修改。例如，在TREM-1蛋白质或RNA水平相对于以前检测水平的减少一般表明对治疗方案的阳性应答，因此，类似的治疗应继续下去。同样，通过将受试者的目的蛋白质或RNA水平与其目的蛋白质或RNA基线水平比较，或与之前检测的目的蛋白质或RNA水平比较，可以监测受试者的疾病状态(例如，疾病的改善、加剧或复发)。
治疗
[0080]本发明提供通过抑制和/或拮抗TREM-1介导的信号转导来治疗诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的方法。抑制和/或拮抗TREM-1介导的信号转导可以通过直接抑制TREM-1或通过抑制和/或拮抗TREM-1信号通路中的非TREM-1成员来达成，如TREM-1辅助蛋白DAP12/TyroBP。适合的抑制剂和/或拮抗剂可以，例如，降低编码TREM-1的核酸的表达、降低TREM-1蛋白质水平，或抑制TREM-1的活性。抑制剂和/或拮抗剂的例子以非限制举例的方式包括，例如：反义寡核苷酸；干扰RNA；TREM-1的抗体；TREM-1配体的抗体；TREM-1配体结合位点的竞争剂，包括TREM-1受体与其配体结合片段、可溶性截短的TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白，例如包含IgG免疫球蛋白的Fc部分的TREM-1融合蛋白、配体融合蛋白；拟肽；肽抑制剂；小分子；及其组合。
反义寡核苷酸
[0081]反义寡核苷酸可以通过降低下述靶标的mRNA和蛋白质的水平用来抑制TREM-1、DAP12/TyroBP、或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员。反义抑制是指给予或原位产生在细胞条件下与编码一个或更多个受试者目的等位基因的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交或结合的核酸序列或其衍生物，以通过例如抑制其转录和/或翻译来抑制该目的等位基因的表达。其结合可以通过传统的碱基对互补，或例如，在结合到DNA双链体的情况下，通过在双螺旋的大沟内的特异性相互作用而实现。一般情况下，反义抑制涉及本领域常用的技术范围，包括任何依靠对核酸序列特异性结合的抑制。本发明的反义构建体可以作为，例如表达质粒来输送，该表达质粒当在细胞中转录时，产生与细胞mRNA的至少唯一的一部分互补的RNA，该细胞mRNA编码内源性基因的目的序列或目的等位基因。另外，反义构建体可以是离体产生的核酸，该核酸当引入细胞中时，通过与内源性基因的目的等位基因的mRNA和/或基因组序列杂交而引起其表达抑制。这种核酸优选是耐内源性核酸酶(如外切核酸酶和/或内切核酸酶)的修饰的寡核苷酸，因此在体内稳定。对核酸进行诸如硫代磷酸酯的修饰，以提高他们抵抗核酸酶降解的抗性、亲和力和被摄取的能力。用作反义寡核苷酸的示例性核酸为DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯以及甲基膦酸酯类似物(参见美国专利NO 5,176,996；5,264,564和5,256,775)。
[0082]反义核酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或“其修饰体”，可以是单链或双链。如此处所述，“其修饰体”涉及修饰过的核酸，例如在其碱基基团、糖基或磷酸盐骨架上修饰过的核酸，例如，以提高稳定性、半衰期、杂交、效果等。可能的修饰包括但不仅限于：向分子的5′和/或3′端加入核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸侧翼序列；在寡聚脱氧核糖核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯键连接。该核酸可包括其他附加基团，例如肽(例如，靶向体内宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜(例如，见PCT公开号WO88/09810，1988年12月15号出版)或血脑屏障(例如公开号WO 89/10134，1988年4月25日公开)转运的试剂，杂交触发的裂解剂或嵌入剂。为此，该寡核苷酸可以连接到另一分子上，例如，肽，杂交触发的交联剂，转运剂，杂交触发的裂解剂等
[0083]该反义核酸可以任选地包括选自下组的至少一个修饰的碱基基团，该组包括但不限于，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖辫苷(galactosylqueosine)，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶，β-D-甘葡聚糖辫苷(mannosylqueosine)，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N-6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-乙醇酸(oxyacetic acid)(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，辫苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
[0084]反义寡核苷酸的合成方法是已知的，包括固相合成技术。用于这种合成的设备可从包括如应用生物系统公司(加利福尼亚州福斯特城)等一些厂商那里商购。另外，含有指导反义转录物的产生的调节元件的表达载体可用于生产反义分子。
[0085]本领域可以理解，反义寡核苷酸序列不需要与其要杂交的目的核酸序列在生理条件下100％互补。在生理条件下当反义寡核苷酸与TREM-1核酸的结合干扰TREM-1核酸的正常功能，而且其对非靶序列的非特异性结合被最小化时反义寡核苷酸得到杂交。
RNAi
[0086]本发明还涉及使用RNA干扰(RNAi)抑制TREM-1、DAP12/TyroBP或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员的表达。本发明的RNAi分子可以被设计为特异性抑制TREM-1、DAP12/TyroBP、或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员。任何类型的RNA干扰序列都可用于本发明。其非限制性的例子包括短干扰RNA(siRNA)分子或短发夹RNA(shRNA)。可用多种算法进行RNAi序列设计。在一个实施方案中，用于siRNA的目的序列包括大约18，19，20个或更多个核苷酸。2dT可以在siRNA合成过程中添加到3′端，从而形成“AA”悬垂。在许多情况下，目的序列中的GC含量为35％至55％，而该序列不包括任何连续4个A或T(即AAAA或TTTT)、连续3个G或C(即GGG或CCC)，或一行中的7个“GC”。也可以采用更严格的标准。例如，目的序列的GC含量可限定为45％至55％，并排除任何含有三个连续相同碱基(即GGG、CCC、TTT或AAA)或具有5个或更多个碱基的回文序列的任何序列。此外，目的序列可以选择为具有与其他变种或基因序列同源性低的序列。可以通过在表达目的基因产物的细胞中引入或表达该RNAi序列来对RNAi分子的效果进行评估。目的基因产物的mRNA或蛋白质水平的实质改变是RNAi分子在抑制该基因表达中的有效性的指征。在细胞中表达RNAi分子的方法为本领域所公知，其中包括，例如，慢病毒载体。
免疫原性组合物
[0087]可采用激发对TREM-1或DAP12/TyroBP免疫应答的组合物来减少TREM-1信号。该组合物可以包括TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其片段或变体(例如，具有增强的与人MHC分子结合能力的变体或片段)用于激发对人TREM-1或人DAP12/TyroBP的免疫应答。这些蛋白质、片段或变体可以提供为分离的多肽，或带有额外的肽序列，例如，在融合蛋白或与诸如载体蛋白等其他多肽的共轭物中的额外的肽序列。在一些实施方案中，在免疫原性组合物中提供编码蛋白质、片段或变体的核酸，来代替这些蛋白质、片段或变体自身。
[0088]优选免疫原性组合物还包含佐剂。佐剂可以是增强或加强对外源性抗原免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包括：铝盐；可生物降解的微球(如polylactic galactide)；脂质体(化合物被包含其中)；细胞因子(诸如例如GM-CSF或IL-2、IL-7、IL-12，或编码它们的核酸)和CpG多核苷酸。
[0089]如上所述，疫苗可以包含编码TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白质或其部分或变体的DNA，还可以含有编码如细胞因子等佐剂蛋白质的DNA，从而使多肽可以在体内生成。该DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的各种DNA输送系统中，包括核酸表达载体，基因输送载体和细菌表达系统。各种基因输送技术为本领域公知。适宜的核酸表达系统包含在受试者中表达所必需的DNA序列(如合适的启动子和终止信号)。细菌输送系统涉及给予在其细胞表面表达多肽的免疫原性部分或分泌该抗原表位的细菌(如卡介苗)。在一个实施方案中，用病毒表达系统引入DNA(例如，牛痘或其他痘病毒，逆转录病毒或腺病毒)，这可能涉及使用非致病性(缺陷型)、具备复制能力的病毒。将DNA纳入这种表达系统的技术是本领域普通技术人员所公知的。也可以是“裸”DNA，例如Ulmer等人(1993)Science 259：1745-1749中所述。裸DNA的摄取通过将DNA包被到生物可降解珠上来提高，该生物可降解珠能够有效地运送到细胞内。疫苗可既包括多核苷酸又包括多肽成分。这种疫苗可提供增强的免疫应答。
配体结合竞争剂
[0090]TREM-1信号也可以通过给予结合TREM-1配体的竞争剂来抑制。这可以例如通过给予TREM-1细胞外结构域的可溶性片段来达成，其可选择地偶联到载体蛋白(如本领域已知的IgG免疫球蛋白)上。例如，已经公开了给予用TREM-1片段和人IgG1的Fc部分形成的TREM-1-Fc融合蛋白，并且其证明能够有效保护防止微生物败血症(见例如，美国专利公开号No.2005-0260670，其以整体合并于此作为参考)。融合蛋白的IgG Fc部分可来自任何IgG亚类(如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)。TREM-1/IgG融合蛋白的制备方法是已知的。例如Bouchon等人(2000)Am.Assoc.Immun.164(10)：4991-95描述和教导了如何产生可溶性TREM-1-Fc融合蛋白。基于TREM-1和DAP12/TyroBP与RA的相关性，目前预计，相似地将适宜的TREM-1片段给予RA患者会降低疾病的严重程度。重要的是，对人的治疗并不一定需要给予野生型的人TREM-1片段：也可以使用来自其他哺乳动物的其他TREM-1片段，而且其中可以引入一个或多个氨基酸取代，只要该片段还保有与内源性人TREM-1竞争与配体结合的能力即可。
结合配偶体
[0091]治疗例如RA和哮喘等炎症性疾病的其他手段包括给予结合剂，如蛋白质，肽和/或抗体或其部分(例如，Fab，F(ab′)2，Fv或单链Fv片段)，这种结合剂与治疗靶点相互作用，例如结合和/或中和治疗靶点。本发明的治疗靶点包括，例如，TREM-1、TREM-1配体、DAP12/TyroBP和TREM-1信号转导通路的任何其他成员。对RA或哮喘患者给予抗TREM-1结合剂，例如抗TREM-1抗体，可以通过抑制和/或拮抗TREM-1或DAP12/TyroBP活性或TREM-1信号传导而减轻疾病的症状。该抗体可以是分离的抗体。在一个实施方案中，该抗体是拮抗性抗体。在另一实施方案中，该抗体是中和抗体。在进一步的实施方案中，抗体调节、降低和/或抑制一个或多个TREM-1相关的活性，包括但不限于调节、降低和/或抑制TREM-1与TREM-1配体和/或DAP12/TyroBP相互作用；调节、降低和/或抑制TREM-1介导的信号转导；调节、降低和/或抑制TREM-1激活的促炎症细胞因子和/或趋化因子的表达；和调节、降低和/或抑制TREM-1激活的基因的表达，例如SPP1。本发明的抗TREM-1抗体可以包括，例如，特异性结合TREM-1的抗体和/或结合TREM-1受体的膜结合形式而不激活TREM-1受体的抗体。在某些实施方案中，抗体或其片段直接或间接用可检测物质标记，以方便结合或未结合的抗体的检测。适用的可检测物质包括，例如，酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。制备和筛选用于本发明的实施的抗体的方法为本领域所公知(参见，例如Harlow等人(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，(New York：ColdSpring Harbor Laboratory)。本发明的抗TREM-1抗体也可包括来自任何物种的单结构域抗体。也可以使用替代的结合结构域多肽来抑制和/或拮抗TREM-1或DAP12/TyroBP活性或TREM-1信号转导，例如SMIPTM。这些抗体或其片段也可以用于诊断、监测和/或预防受试者的炎症性疾病，例如RA和哮喘。
实施例
[0092]实施例1：TREM-1和DAP12/TyroBP的转录谱分析
[0093]用基因表达分析的信使RNA的整体分析已经成功用于许多疾病来鉴别导致疾病发病的基因和用于新型治疗的潜在靶点(Battiwalla等人(2005)Genes and Immunity 6(5)：388-97)。利用基因表达分析，TREM-1和DAP12/TyroBP被鉴定为治疗炎症疾病(例如，RA)的潜在靶标。
[0094]简单地说，按照美国风湿病学会(American College ofRheumatology criteria)的标准，经当地的研究伦理委员会的预先批准，在手术过程中从RA患者中取了24个滑膜组织样本。在这24样本中，10个样本来自关节滑膜，14个样品来自腱滑膜。八个未受累(即正常)的滑膜组织来自非RA患者。未受累的滑膜组织来自3位因钝挫伤需要截肢的病人，而且滑膜分离自远离创伤点的位点。收获RA患者和非RA患者滑膜样本，并在液态氮中快速冷冻，并-80℃保存，直至处理。用
Figure A20088000837800321
(Santa Clara，CA)HG_U95A和B(人样本)
Figure A20088000837800322
寡核苷酸微阵列分离和分析总RNA。用
Figure A20088000837800323
MAS4算法得到来自阵列的表达测量值，并参照内在的(spiked-in)标准对其进行标准化以估计每百万记录的转录物(Hill等人(2001)Genome Biol.2(12)：RESEARCH0055)。
RNA分离
[0095]用PowerGenTM 700匀浆机(Fisher Scientific，宾州匹斯堡)在组织裂解缓冲液(
Figure A20088000837800324
试剂盒，Promega，威斯康星州麦迪逊)中将冷冻的样品打散并裂解。用修订的制造商的建议方法提取总RNA。简单来说，加入异丙醇沉淀RNA，并用冷的75％乙醇洗涤两次。将沉淀溶于
Figure A20088000837800325
minikit的样本裂解缓冲液(RLT)中，根据制造商的建议纯化RNA(Qiagen，德国Hilden)。对于每个样品，在260nm测量紫外吸收以定量总RNA，并取等份样用2100BioanalyzerTM(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)分析，以确定RNA的完整性。
用于寡核苷酸阵列分析的杂交溶液的制备
[0096]用
Figure A20088000837800327
ChoiceTM试剂盒(Invitrogen公司，加州卡尔斯巴德)和33pMol含有T7RNA聚合酶启动子的寡聚dT引物(Proligo有限责任公司，科罗拉多州博尔德)从5微克总RNA制备双链cDNA。通过加入下列试剂盒成分启动第一链cDNA合成：1×第一链缓冲液，10mM的DTT，500μM的dNTP，400U的
Figure A20088000837800331
RT II，40U的RNAase抑制剂。该反应在47℃下进行1小时。通过加入下列试剂盒成分进行第二链合成：1×第二链缓冲液，200μM再加入的dNTP，40U的大肠杆菌DNA聚合酶I，2U的大肠杆菌RNaseH，10U的大肠杆菌DNA连接酶。该反应在15.8℃进行2小时。在第二链反应的最后五分钟，加入T4DNA聚合酶(New England BioLabs，马萨诸塞州贝弗利)，使其终浓度为6U。采用固相可逆固定化技术纯化双链cDNA，并收集在20μl的10mMTris乙酸盐(pH 7.8)中。根据说明书用Bio ArrayTM High YieldTM RNA转录标记试剂盒(T7)(纽约法明代尔的Enzo公司)转录纯化的cDNA(10μl)。根据说明书使用
Figure A20088000837800332
小试剂盒(Qiagen，德国Hilden)纯化生物素标记的反义cRNA。在260nm测量紫外吸收来测定cRNA产量。
寡核苷酸微阵列杂交方法
[0097]为提高杂交效率，15微克的cRNA被片段化。根据制造商的建议，片段化的cRNA探针被用来形成寡核苷酸微阵列杂交溶液(Affymetrix，Santa Clara，CA)。杂交溶液含有11种原核RNA的混合物，每种具有不同的已知浓度，用来建立每个微阵列的内部标准曲线，并加入以测定待测基因的频率。在45℃将杂交溶液与两个玻璃珠(FisherScientific，Pittsburgh，PA)预杂交过夜。将杂交溶液转移到干净的试管中，在95℃加热1-2分钟，在最高速度微离心2分钟以沉淀不溶的碎片。标记的cRNA溶液与
Figure A20088000837800333
(Santa Clara，CA)Hg_U95Av2 & B
Figure A20088000837800334
寡核苷酸微阵列杂交，该微阵列上排列有25,128个人类基因序列。杂交后，回收cRNA溶液，按照Affymetrix的实验方案，洗涤微阵列，准备扫描。收集原始荧光数据，并用
Figure A20088000837800335
3.2 application(Affymetrix，Santa Clara，CA)简化(reduced)。
表达谱数据分析
[0098]使用Hill等人(2001)Genome Biol.2(12)：RESEARCH0055所述的杂化物经协调的频率标准化对原始数据进行加工。用GeneSpringGXTM v7.3(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司)进行该经协调的频率数据的简化和分析。进行两种类型的分析。在第一种中，将所有的患病样本与正常样本比较。在第二种分析中，根据疾病的位点将数据细分，以便关节RA滑膜数据根据对照关节滑膜样本的平均值进行标准化，腱滑膜RA样本根据对照腱滑膜样本的平均值进行标准化。
[0099]为了确定那些与RA相关的转录物，来自各个疾病样本的基因转录物经协调的频率根据所有非类风湿基因转录物频率的平均值进行标准化。通过过滤那些相对于对照的平均值表达水平升高或降低的基因转录物，总数据减少。除了数据标准化的步骤，在过滤得到的数据上进行几个统计分析。用0.05的临界p值来确定假阳性率(False discovery rates，FDR)和Bonferroni的误差率判断族(family-wise error rates，FWER)。此外，在GeneSpringTM中进行数据组的无监督分层聚类分析(unsupervisedhierarchical cluster analysis)和k最近邻分析(k-nearest neighbor)。用无监督分层聚类分析将得到的数据组可视化。
[00100]在第二次分析中，对关节和腱样本分别进行了分析。关节滑膜和腱滑膜样本根据它们各自位置特异性的对照的平均值进行标准化。如上所述相同的过滤和统计参数应用于每个分析。两套产生的数据组使用Venn分析组合，并接受基因和样本的无监督分层聚类分析。使用k最近邻分析法进行分析以区分四个参数：疾病，非疾病，关节和腱。此分析过程描述如下。然后具有最好区别的基因进行样本和基因的无监督分层聚类分析。
[00101]表达数据的统计分析在log-2经转化的表达测量上执行。样本组之间的倍数变化通过取每组log-2表达水平平均值的差异进行计算，和后端转化生成的log倍数变化为线性比例。各群体之间的差异表达的显著性由置换检验确定。简单地说，在每个关注的比较中，为每个probeset计算F-统计，采用组内误差估计，衍生于相似强度水平的集中的probesets的误差估计。观察到的F-统计涉及在样本标签的随机置换后，从同一数据组经相同计算的F-统计的空分布。差异表达的p值定义为置换F-统计的分数，比观察到的每个probeset的F-统计值大(Edington(1995)Randomization Tests(New York：Marcel Dekker)；Zar(1999)Biostatistical Analysis(New Jersey：Simon & Shuster))。
结果
[00102]滑膜活组织检查的基因表达分析表明，在RA患者中，TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达显著上调。图1是显示RA患者滑膜中TREM-1和DAP12/TyroBP表达的条形图。TREM-1表达的倍数变化根据正常滑膜样本进行标准化。RA阳性样本(n＝24)较未受累的样本(n＝8)的TREM-1 mRNA上调6.5倍(p值为1.98×10-6)(图1)。此外，RA阳性样本(n＝24)较未受累的样本(n＝8)的DAP12/TyroBPmRNA上调2倍(p值为7.83×10-4)(图1)。
[00103]除了在RA中上调外，TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达水平随RA的严重性而变化。RA患者中14例腱样本划分为两类临床定义的疾病亚型，侵入型和胞囊化型(encapsulated)，侵入型RA更具进行形式。侵入型腱滑膜样本(n＝7)与胞囊化型腱滑膜样本(n＝7)相比，TREM-1mRNA上调2.64倍(p值为1.36×10-4)(图1)。同样，浸润型样本(n＝7)与胞囊化型样本(n＝7)相比，DAP12/Tyro12 mRNA表达上调1.4倍(p值为1.67×10-2)(图1)。
[00104]在单核细胞，中性粒细胞和巨噬细胞中比较细胞特异性基因表达，表明在RA阳性滑膜组织中，炎性细胞浸润只构成TREM-1表达水平的部分增加。为了确定是否TREM-1表达的增加是由于RA滑膜中TREM-1阳性炎性细胞的侵入，我们全面研究了特异性表达在单核细胞(182个基因)，中性粒细胞(328个基因)和巨噬细胞(34个基因)中的基因的表达水平。这些基因的表达水平平均范围从1.22至1.59，标准差较大。TREM-1表达的增加主要是由于TREM-1基因的表达上调，而不是细胞浸润的大量增加。
实施例2：TREM-1和DAP12/TyroBP的定量实时PCR
[00105]在胶原诱导的关节炎模型中，TREM-1和DAP12/TyroBPmRNA过表达。在雄性DBA/1小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)上使用牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)构建胶原诱导的关节炎(CIA)。小鼠至少每周3次监测疾病进展。个体四肢依据以下指标指定临床评分：(0)正常；(1)可见红斑，伴随一至两个肿胀的趾；(2)明显红斑，特点为爪肿胀和/或多趾肿胀；(3)大量肿胀延伸到踝或腕关节；及(4)四肢使用困难或关节僵硬。对于任何给定的小鼠所有肢体评分的总和产生潜在的全身最高评分为16。在不同疾病阶段使动物安乐死并收获组织。患病动物RNA从三个评分为3的爪和1个评分为4的爪制备。正常动物中提取的RNA由4个评分为0的爪制备。TREM-1mRNA使用下面的引物和探针定量：
正向引物CAGATGTGTTCACTCCTGTCATCA(413-436)(SEQ IDNO：1)；
反向引物CTGGGTGAGTATTTTGTGGT AATAAGG(494-468)(SEQ ID NO：2)；
探针：CCTATTACAAGGCTGACAGAGCGTCCCA(439-466)(EQID NO：3)。
标准曲线由已知浓度的mTREM-1生成。DAP12/TyroBP mRNA使用下面的引物和探针定量：
正向引物：CCTGGTCTCCCGAGGTCAA(255-273)(SEQ ID NO：4)；
反向引物：GGCGACTCAGTCTCAGCAATG(323-302)(SEQ IDNO：5)；
探针：TTGTTTCCGGGTCCCTTCCGCT(300-279)(SEQ ID NO：6)。
[00106]为了计算表达倍数的变化，TREM-1 RNA水平和DAP12/TyroBP RNA水平根据GAPDH mRNA的表达进行标准化。通过RT-PCR测得，CIA爪比正常小鼠爪的TREM-1mRNA上调132倍(图2)，而DAP12/TyroBP上调8.21倍(图2)。这些结果进一步证实，TREM-1和TREM-1信号相关蛋白的表达在RA疾病的患病位置是上升的。
实施例3：免疫组织化学检测TREM-1表达
[00107]多种滑膜样本进行免疫组织化学检测，以确定在蛋白质水平TREM-1表达是否增加。简单地说，通过肯尼迪风湿病学院(KennedyInstitute of Rheumatology)在患者手术过程中获得5例RA滑液样本，并且从New England Baptist医院获得两例OA组织。组织经福尔马林固定，石蜡包埋。免疫组化在4微米组织切片上进行。切片首先在二甲苯中脱蜡，并在系列梯度乙醇中再次水化。用PBS洗涤后，恢复抗原，并且细胞用Tween20透化。样本用小鼠抗TREM-1抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)在BiogenexTM i6000TM系统中按照标准方案进行免疫染色。所用的二级抗体和检测试剂来自Mach3TM小鼠探针HRP聚合物试剂盒(Biocare，Concord，CA)。免疫组织化学染色阳性的细胞定义为染为棕色的那些细胞。对于每一张切片，随机选取10个200x临近滑膜表面的观察视野，并对免疫组化阳性细胞进行计数和计算总和，作为免疫组化阳性细胞指数。
[00108]来自5例RA患者的切片免疫组化显示五例病人中三例具有高TREM-1水平，一例病人——RA4(表1)具有极高的水平。RA样本的两例(RA1和RA2)有低TREM-1水平并与来自骨关节炎患者的对照样本类似(OA1和OA2)(见表1)。图3A描述一个抗TREM-1标记的RA滑液组织样本的代表性视野。图3B描述抗TREM-1标记的，来自对照OA患者的滑液组织样本的一个代表性视野。
[00109]为了确定RA样本中TREM-1阳性细胞的细胞类型，TREM-1和CD163，CD14，CD68或髓过氧化物酶的双重免疫组化依次进行，首先使用TREM-1抗体，其次使用CD163(10D16，来自Labvision，Freemont，CA)，CD14(Labvision，Freemont，CA)，CD68(PG-Ml，来自Biocare，Concord，CA)，或髓过氧化物酶(Abeam，Cambridge，UK)抗体各自进行染色。没有切片得到髓过氧化物酶的染色，表明缺乏中性粒细胞。令人惊讶的是，只有来自RA5的切片得到CD68的染色，但这些切片没有得到TREM-1的共染色。来自RA3和RA5的TREM-1阳性细胞的一小部分(3-10％)被CD14或CD163共染色。在五个RA滑膜切片中，这些标志和TREM-1存在的差异反映了该疾病的异质性。
表1.RA和对照(OA)滑膜样本中TREM-1阳性细胞的指数。
  样本号   患者样本   IHC阳性细胞指数
  1   RA1   27
  2   RA2   20
  3   RA3   129
  4   RA4   ＞1000
  5   RA5   297
  6   OA1   27
  7   OA2   5
实施例4：人体临床血浆样本中可溶性TREM-1的检测
[00110]酶联免疫吸附试验(ELISA)法用于证明TREM-1蛋白水平在人RA样本中不但可检测到而且是升高的。RA患者血浆来自于第二阶段、双盲、安慰剂对照、平行、随机，多中心、门诊病人、比较研究中，该研究在患有活性RA并且对于恒定剂量的(每周一次7.5-20毫克)氨甲蝶呤(MTX)应答不足的受试者中进行。受试者招募自世界范围的81个地点。在选定的地点，32名同意自愿参与收集样本的受试者，为生物标志物的探索性研究提供血液样本。在此报告的数据是从第1天(给药前)采取的血浆样本。对照组血浆采集自健康志愿者多中心、具前瞻性、非介入观察研究所招募的受试者。每个临床站点的机构审查委员会或伦理委员会均允许了的这些研究，并且在获得每个病人的知情同意前没有执行任何程序。
[00111]用于检测人体临床血浆样本可溶性TREM-1的ELISA方法改编自
Figure A20088000837800391
ELISA开发系统，购自R&D Systems(Minneapolis，MN；目录号DY1278)。改编的ELISA方法减少了假阳性，并提高了标准曲线的线性动态范围。简单地说，ELISA以夹心形式进行，捕获抗体为4.0μg/ml和检测抗体为200ng/ml。血浆样本按1∶2倍稀释于购自Meso ScaleDiscovery(Gaithersburg，Maryland；目录号R54BB-3)的GFl缓冲液中。标准品也按1∶2用GFl缓冲液稀释纯净血浆。以范围为1.37至1000pg/ml的R2为0.999的四参数曲线拟合(XL-Fit IDBS，Burlington，MA)，检测限为1.37pg/ml。
[00112]使用上述ELISA法，检测RA患者32例，健康志愿者(HVOS)25例。图4所示为用ELISA法检测来自RA和对照组(HVOS)的人血浆中可溶性TREM-1蛋白水平的图。如图4所示，RA血浆中可溶性TREM-1平均量为10.04±1.626pg/ml(n＝32)，而健康志愿者(HVOS)中可溶性TREM-1平均量为2.549±0.6253pg/ml(n＝25)。RA血浆的可溶性TREM-1水平高于健康志愿者的水平(超过3倍)，p值为小于0.0001(未配对t检验)。因此，血浆中人可溶性TREM-1水平升高的检测与RA相关，并且是RA的指征。
[00113]此外，检测到升高的血浆TREM-1水平与类风湿因子升高水平之间的显著关联性。
实施例5：交联TREM-1后促分裂原激活的蛋白激酶的活化
[00114]纯化的人单核细胞接种入同种型匹配对照抗体或α-TREM-1交联抗体预包被的孔中，以确定是否TREM-1受体激活触发促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化。简单地说，健康志愿者的人leukopacks(血沉棕黄层蟾蜍色素(Buffycoats))，获自马萨诸塞州总医院临床血液学实验室(Massachusetts General Hospital Clinical HematologyLaboratory，Boston，MA)。血沉棕黄层蟾蜍色素存放于4℃过夜以便第二天细胞分离。单核细胞以
Figure A20088000837800392
(StemCell Technologies，Vancouver，BC；15068)依产品方法经
Figure A20088000837800401
(SIGMA，H8889)密度离心通过负选择分离。所有培养都在37℃组织培养箱，维持5％CO2条件下进行。纯化的单核细胞置于含有10％的热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中。组织培养处理的平板用5μg/ml的α-TREM-1交联抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN；MAB1278)PBS溶液处理，组织培养箱中过夜。对照孔以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的同种型匹配抗体(Wyeth，Madison，NJ)进行相似处理。临加入细胞前用PBS洗两次培养孔。经5至180分钟的时间以标准方法进行蛋白质印迹(见图5)。α-磷-ERK、α-磷-p38和α-磷-JNK抗体购自Cell Signaling Technologies(Danvers，MA；分别为9101、9211和9251)，α-肌动蛋白抗体购自Sigma(St.Louis，MO；A2103)。如图5所示，交联抗体对TREM-1的激活使MAPK广泛激活。以前未知p38和JNK对TREM-1激活有响应。在纯化的人单核细胞中，这些广泛促炎症反应由TREM-1激活引起的整体基因表达的变化所确认(见实施例10)。
实施例6：α-TREM-1和LPS处理后的转录谱分析
[00115]用转录谱分析来鉴别在TREM-1受体激活的情况下差异表达的基因。利用转录谱，分泌型磷蛋白1(SPP1，也称为骨桥蛋白(OPN)，骨涎蛋白(BSPI)，早期T-淋巴细胞活化蛋白1(ETA-1)，或MGCl10940)被鉴定为TREM-1激活的特异性标记，而不是作为一个必要的促炎症结果(readout)。
组织培养物的制备和RNA分离
[00116]来自多个供体的纯化的人单核细胞如实施例9所述制备，并接种至组织培养处理孔。组织培养处理孔或者不经处理(用于不处理对照和脂多糖(LPS)处理)，或如实施例9所述，用同种型对照抗体或α-TREM-1交联抗体预包被。对于LPS处理，添加凝胶过滤层析纯化的美国沙门氏菌(S.enterica)的LPS(Sigma，St.Louis，MO；L2262)，终浓度为1ng/ml。随后，5×106个单核细胞接种至未处理或抗体包被的12孔组织培养处理板。经2小时处理后，用
Figure A20088000837800411
QIAshredderTM柱和RNeasy
Figure A20088000837800412
Mini试剂盒(alencia，CA；分别为79654和74104)按照制造商的方法提取总RNA。选择2小时的时间点，以尽量减少二级和/或差异产生的影响，而产生适合高可信分析的基因表达变化。总RNA产量介于1-6μg。总RNA以标准流程进一步通过DNase处理纯化，接着进行酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。以HG_U133 2.0+阵列按照既定流程进行微阵列分析。对于每个阵列，所有探针组根据平均强度值100进行标准化。默认的
Figure A20088000837800414
Operating System(GCOS)统计值被用于所有的分析。对11个健康供者的单核细胞进行了分析。
表达谱数据的分析
[00117]将信号大于50，而且在大于66％的处理组中出现的限定基因(Qualifiers)计入分析中。标准化信号值在ANOVA分析之前转化为log2值。在任何处理组之间的表达≥2倍变化(Fold Change，FC)和P＜0.01的限定基因用于生成图6中的热图和随后的分析。倍数减少作为负的倍数变化报告。对于代表多个限定基因的基因，选择在未处理样本中具有最高平均强度的限定基因用于进一步分析。
[00118]图6显示了转录谱数据的热图聚类分析。在图6中，个体供体显示在左边(每列代表一个个体供体)和平均均值强度在右边显示，每行代表个体限定基因。显示荧光强度。α-TREM-1处理的样本与对照抗体处理的样本进行比较，和LPS处理的样本与未经处理的进行比较。分层聚类算法用于进行具有相似表达模式的限定基因的分组。在图6中，括号内的区域表明对应于由TREM-1激活上调的，LPS上调的，共同下调的，TREM-1激活下调的或LPS下调的限定基因的热图区域。
[00119]图7显示所有存在的回应(calls)的示例性散点图。对于散点图分析，对于TREM-1(X轴)和LPS(Y轴)绘制ln-倍数变化，下调转换为负值。计算对所有存在的回应的lnFC(α-TREM-1/对照抗体和LPS/未经处理)并绘图，下调基因绘制成ln(-1/FC)。选择的基因高亮标记。45°轴分开由两种处理可比较地调节的基因。
[00120]图23和24是列出基因的表格，这些基因被确定对TREM-1和/或LPS处理作出响应。图23显示限定基因、基因名称、基因的描述，和采用多种处理处理的经鉴定基因的平均强度。处理包括：未经处理的(对照)，同种型抗体(对照)，α-TREM-1抗体，LPS，同种型抗体加α-TREM-1抗体，和α-TREM-1抗体加LPS。图24显示经鉴定基因的限定基因以及比较不同处理方法之间的p值和比例。比较了下列处理：α-TREM-1对同种型；LPS对未经处理的，α-TREM-1对LPS；α-TREM-1加LPS对同种型，α-TREM-1对α-TREM-1加LPS和LPS对α-TREM-1加LPS。
结果
[00121]多条基因鉴定为差异表达以应答α-TREM-1处理和/或LPS处理(见图7，8A-B，9A-B和23-34)，因此可以作为生物标志物来评价调节TREM-1和/或LPS信号的试剂。差异表达基因分成三大类：TREM-1偏向基因，LPS偏向基因，和对α-TREM-1和LPS处理都响应而同等表达的基因。图8A-B中所列基因按照TREM-1/LPS比例或LPS/TREM-1比例分别排名。TREM-1/LPS比例(见图8A)和LPS/TREM-1比例(见图8B)是由直接成对比较计算的，用于解释个别处理中关于倍数变化的任何变化。由双重处理(即α-TREM-1抗体和LPS共同处理)产生的基因表达的倍数变化，也显示在图8A-B，9A-B，23和24中。
[00122]考虑对已经通过上述筛选条件，而且表明表达大于4倍变化的基因进一步分析。通过这些标准，以TREM-1激活或LPS处理，238条基因表达上调大于4倍。其中，69条基因在两种处理方法中都被诱导大于4倍，或仅在一种处理方法中大于4倍，但在两种处理方法间直接成对比较时在2倍以内的，这些基因已被列为普遍上调。其余的基因或者因TREM-1激活(62条基因)或因LPS处理(101条基因)而上调大于4倍的，已被归类为处理特异性的基因(即处理偏向的基因)。
[00123]TREM-1偏向基因的总结如图8A所示，这些基因响应TREM-1激活而上调大于4倍。图中提供的是在TREM-1激活(TREM)，LPS(LPS)，和TREM-1激活加LPS组合(双重)下的倍数变化，按照TREM-1/LPS的比例排列。TREM-1激活上调大于4倍的基因的p值在7.7×10-4到2.6×10-12的范围内。被确定为优先由TREM-1激活诱导的基因包括SPRY2，细胞因子及相关分子(TNFSF14、CSFl、SPP1、CCL7、IL1F5、LIF)，金属硫蛋白(MTlK、MTlE、MTlF)，磷酸酶(DUSP14、DUSP4)，转录因子(EGR2、ATF3)，参与脂质代谢和/或信号传递的因子(EDG3、LPL、PPAP2B、PLCXDl、NPCl、FABP3、ACSL3)，MMP19和PPARG。这些基因中，响应于TREM-1的激活，SPP1上调了28.0倍(p＝1.2×10-07)(见图8A及11E)，但LPS处理后没有明显上调。因此，SPP1不是必要的促炎症结果，而可以在患者(或患者样本)中作为TREM-1活性的标志和在筛选检测中用于鉴定TREM-1调节剂。此外，对于患者的炎症或慢性炎症(如RA)治疗，SPP1也可作为TREM-1治疗的疗效或潜在疗效的指征。对于可被用作TREM-1活性标记的其它基因列在图8A，23和24。对于符合筛选标准，但没有在图8A中列出的那些基因包括C6orf 114，C6orgl28，C9orf47，KIAAl199，KIAA1393，LOC440995和MGC33212。一般情况下，由TREM-1激活优先诱导的基因很大程度上不受LPS处理影响。
[00124]总结的LPS偏向性基因如图8B所示，这些基因响应LPS处理耳被上调大于4倍。图中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1活化和LPS的组合(双重)得到的倍数变化，根据LPS/TREM-1比例排列。该表中用LPS处理后上调大于4倍的基因的p值在1.2×10-3-3.6×10-14范围内。被鉴定为优先由LPS诱导的基因包括白介素(IL23A、IL12B、EBI3、IL1F9、ILl0、ILIA、ILl8)、白介素受体(IL15RA、IL2RA、IL7R)、细胞因子和相关分子(CSF3、CCL23、CXCLl、TSLP、CCL5、CLC、EREG、TNFSF9)、参与脂质代谢和/或信号传递的因子(SGPP2、PLAlA、MGLL)、激酶(MAP3K8、RIPK2、MAP3K4、TBKl、PIM3)、NF-κB信号调节子(TNIP3、NFKBIZ)、CCR7和CIASl。对于符合筛选标准，但没有在图8B中列出的那些基因包括C10orf78、C21orf71、FLJ14490、FLJ23231、FLJ25590、FLJ32499、KIAA0286、KIAA0376、LOC90167、LOC123872、LOC285628、LOC338758、LOC341720、LOCLOC374443、LOC387763、LOC400581、LOC441366、MGC10744和MGCl1082。
[00125]图9A显示共同上调基因的总结(即通过TREM-1激活和LPS处理而上调的基因)。图中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的组合(双重)得到的倍数变化，根据TREM-1激活而诱导的倍数排列。TREM-1激活处理后而上调大于4倍的基因的p值在1.7×10-3-1.5×10-10范围内，用LPS处理后上调大于4倍的基因的p值在4.1×10-3～2.0×10-14范围内。被鉴定为共同上调的基因包括TNF超家族成员和调节因子(TNFSF15，BRE、TNF)、趋化因子(CXCL3、CXCL2、CCL20、CXCL5、CCL3)、其他细胞因子和促有丝分裂因子(CSF2、IL-6、AREG)、基质金属蛋白酶(MMPl、MMPl0)和PTGS2/COX2。这些结果既符合TREM-1激活也符合LPS引发的促炎症反应。还有INHBA，凝血和血管生成因子(F3、EDNl、TFPI2、SERPINB2)，转录和DNA结合因子(HES4、EGRl、FOSLl、E2F7、EGR3、MAFF、ETS2、HESl)，脂质代谢和/或信号传递涉及的因子(PLDl、ELOVL7、SYNJ2、GLA、STARD4)。对于符合筛选标准，但没有在图9A中列出的那些基因包括C20orfl39，KIAA1718，LOC348938，LOC401151，LOC401588，LOC92162和MGC4504。
[00126]在组合(双重)处理方法中，在图9A中的大多数基因的表达变化在单独处理中的那些的总和的2倍以内。一个例外是CSF2(即GM-CSF)，在组合处理方法中，其mRNA诱导就单独处理而言显著增高(以TREM-1激活，LPS和组合处理的增高分别为9.6，18.9和192.4倍)。
[00127]或者TREM-1激活或者LPS处理导致的倍数变化小于-4(即下调大于4倍)的基因总结如图9B所示。图中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的组合(双重)得到的倍数变化，根据TREM-1激活诱导的倍数排列。该表中用TREM-1激活处理后下调大于4倍的基因的p值在5.6×10-3-5.7×10-12范围内，用LPS处理后下调超过4倍的基因的p值在2.4×10-3-1.1×10-14范围内。如图6所示，在我们的分析中，虽然在这些基因中处理特异性更少，但是与上调基因一样，有相当数量的基因出现下调。被鉴定为下调的基因包括趋化因子受体(CCR2，CX3CR1)，转录因子(OLIGl，ZNF555，OLIG2)，免疫相关蛋白的GTP酶(GIMAP6，GIMAP7，GIMAP8，GIMAP1)和CCL8。CCR2在α-TREM-1和LPS处理中都是下调的(参见图9B)，它的下调是单核细胞对巨噬细胞分化的一个标记。此外，TLRl和NOD样受体(CARD12，NALP12)也下调。对于符合筛选标准，但没有在图9B中列出的那些基因包括C9orf59，FLJ12442，FLJ33641，LOC90120，MGC2941和MGC17791。考虑到mRNA半衰期对于分析有限的动力作用，正如预期的那样，下调的动态范围低于上调的。
[00128]一般情况下，较少基因会在一种处理中下调而在另一种处理中不下调。一个不是共同下调的基因是少突胶质细胞转录因子OLIG2，其经TREM-1激活上调3.1倍而经LPS处理下调5.6倍(参见图9B)。
[00129]此外，TREM-1和LPS差异地调节CSF生成，M-CSF是TREM-1偏向的，G-CSF是LPS特异性的(见图7，8A-B)。
实施例7：细胞吞噬试验
[00130]将人THP-1细胞用α-TREM-1和LPS处理以比较α-TREM-1处理和LPS处理对THP-1细胞形态和行为的影响。按照建议的增殖方法培养人THP-1细胞(ATCC，TIB-202)。为加强可视化，在进行所述处理之前，对THP-1细胞转导表达GFP慢病毒，组织培养处理孔内培养5天。吞噬试验通过加入FluoresbriteTM polychromatic red 1.0微米微球(Polysciences，Inc.，Warrington，PA；18660)，组织培养箱中孵育30分钟、成像前以培养基洗涤以去除未吞噬的微珠来进行。α-TREM-1处理引起THP-1细胞的形态学变化(图10a)。此外，α-TREM-1和LPS处理都诱导了标记的微球吞噬(1μM珠显示红色)，与TREM-1活化在刺激免疫应答中的作用一致(图10B)。
实施例8：基因表达的ELISA分析谱
[00131]选定的基因应答针对α-TREM-1和LPS处理的差异表达经ELISA法证实。按制造商的实验方案在条件培养基中进行ELISA。在8小时的时间段内测量TREM-1激活或者LPS处理后分泌进入培养基的蛋白质的水平。GM-CSF是定制的涂层板上的分析物，该板订购自MesoScale Discovery(Gaithersburg，MD)。M-CSF，G-CSF，INHBA和SPP1检测试剂盒均购自R&D Systems(Minneapolis，MN；分别为DMC00、DCS50、DY338和DOST00)。IL-23检测试剂盒购自eBioscience(San Diego，CA；88-7237)。
[00132]靶蛋白水平的检测(针对TREM-1和LPS处理的转录水平的倍数变化，在括号内)证实SPP1(28.0和3.7，图11E)和M-CSF(22.0和1.8；图11B)对TREM-1激活的响应是上调，而不对LPS处理响应。这些结果也表明分泌的SPP1蛋白质在细胞外液(如组织培养基)中是可以检测的。此外，G-CSF(1.3和45.2；图11C)和IL-23(-1.1和31.8；图11F)的蛋白质水平证实了这些基因对LPS处理的响应是上调的。最后，INHBA(96.7和97.0；图11D)和GM-CSF(9.6和18.9；图11A)的蛋白质水平证实，这些基因对TREM-1激活和LPS处理的响应是可比较的上调。
[00133]这些ELISA结果验证了转录谱分析用以识别对TREM-1激活和LPS处理响应的基因的用途。这些结果还首次鉴定出了由TREM-1激活诱导的，但不被LPS诱导的细胞因子或相关因子。此外，ELISA结果表明，SPP1在蛋白质水平上对于TREM-1激活的响应是上调的，并且SPP1可以作为TREM-1激活的标记物使用。可被用作TREM-1活性的标记的其他基因列在图8A，23和24中。
实施例9：分析来自TREM-1激活的RA患者滑膜的细胞因子的产生
[00134]用交联抗体活化的TREM-1已经显示出在人单核细胞和中性粒细胞二者中都触发促炎症因子的产生。因此，我们测试在RA阳性滑膜培养物中，是否TREM-1激活具有类似的促炎性效应。滑膜培养物测定如早先Brennan等(1989)J.Autoimmunity 2 Supp：177-86所述进行。简言之，滑膜组织是在三个不同的RA患者膝关节镜手术中获得的(Arthritisand Osteoporosis Center of Maryland in Frederick，MD)。样本置于含5％胎牛血清(FCS)的RPMI中用于运输。为破坏组织并释放细胞，来自供体1和供体2的组织以50ml含5％FCS的RPMI处理，其中含5mg/mlIV型胶原酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.15mg/ml DNase I(Sigma，St.Louis，MO)，并在37℃旋转90分钟。来自供体3的组织以相似方法制备，只是以Liberase Blendzyme 4(Roche)替换胶原酶/DNase，并根据制造商的建议流程使用。Liberase Blendzyme 4是被作为实际上无内毒素的产品而提出的。样本通过100μm尼龙网眼去除碎片。洗涤细胞和重悬于含0.5％FCS的RPMI中以备接种。对于TREM-1的抗体激活，组织培养处理平板以100μl抗体溶液包被，其中含有或者抗-hTREM-1抗体(MAB 1278，R&D Systems，Minneapolis，MN)或同种型匹配对照抗体，抗柔嫩艾美耳球虫(Wyeth，Madison，New Jersey)，上述包被在加入细胞之前以指示的浓度进行3小时。抗-hTREM-1抗体以0.12、0.37、1.11、3.33和10μg/ml浓度进行检测；对照抗体以0.12、1.11、10μg/ml浓度进行检测。在加入100μl细胞密度为6×105个细胞/ml的重悬细胞前，孔以PBS洗涤两次。24小时后，针对指定的因子使用多重ELISA板(Meso-Scale Discovery，Gaithersburg，Maryland)测定上清液。
[00135]如图12所示，代表来自一个个体的数据，在这些培养物中使用交联抗体激活的TREM-1以剂量依赖性的方式诱导了TNF-α，IL-6，IL-1β和GM-CSF的产生。所有三个供体样本都得到类似的结果。此外，图13A显示在三个供体样本的每个自发细胞因子产生的比较，图13B显示在三个供体样本的每个中TREM-1交联所产生的细胞因子的比较。如图13A所示，供体3的自发细胞因子水平大大低于供体1和2的，这与内毒素的污染较少一致，但也可能是由于供体的可变性。所有三个供体的结果表明，TREM-1具有功能性地存在于RA培养物中，而且TREM-1能放大在RA滑膜组织中的炎症反应。
实施例10：mTREM-1-hFc转基因小鼠
[00136]制备转基因小鼠以便组成性地表达一种融合蛋白，其包括小鼠TREM-1胞外域和人IgG1的Fc部分(“mTREM-1-hFc”)。该融合蛋白构建体的核苷酸和蛋白质序列各自显示在SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8中。另外，可制备如下的转基因小鼠，其TREM-1-hFc的构建体受控于诱导型启动子，而不是组成型表达。可溶性TREM-1-Fc融合蛋白也是本领域众所周知的，并已证明可以防止LPS和脓毒性休克以及酵母多糖A诱导的肉芽肿的形成。
mTREM-1-hFc转基因小鼠中的K/BxN调用(transfer)
[00137]鼠科的K/BxN模型是一种小鼠模型，类似于人类炎症性关节炎的许多形式，包括RA(Ditzel(2004)Trends Mol.Med.10(1)：40-45)。如图14所示，与正常爪比较，K/BxN爪中TREM-1mRNA表达显着增加。因此，来自关节炎K/BxN小鼠的血清或抗体可以转移到实验动物，以确定是否mTREM-1-hFc构建体抑制对K/BxN血清或抗体的炎症应答。
[00138]在一项实验中，表达可溶性mTREM-1-hFc融合蛋白的转基因小鼠用K/BxN血清攻击，以评估是否可溶性TREM-1减少关节炎的炎症。简言之，C57BL/6的背景下制备TREM-1转基因(“Tg”)小鼠以表达受控于CAGGS启动子的可溶性mTREM-1-hFc融合蛋白，这是一个广泛性的强大融合启动子，由CMV增强子和β-肌动蛋白启动子组成。整体构造是CAGGS/mTREM-1-hFc/兔β-球蛋白polyA。转基因小鼠血浆中可溶性mTREM-1-hFc蛋白水平约为1-2mg/ml。TREM-1转基因雄性小鼠(n＝7)和野生型雄性小鼠(n＝7)在第0天和第2天腹膜内注射(ip)150μl的K/BxN血清。踝直径定期测量直到第14天。
[00139]图15显示C57BL/6-TREM-1转基因小鼠与野生型对照比较的平均踝增厚。如图15所示，直到第6天TREM-1转基因小鼠发展与野生型小鼠类似的表型。第7天起，TREM-1转基因小鼠踝肿胀减退，而在野生型对照中继续肿胀。随后，观察到从9-14天与野生型对照比较TREM-1转基因小鼠踝肿胀明显减少(p＜0.05)。此外，TREM-1转基因小鼠的肿胀高峰约是野生型对照中观察到的肿胀高峰的一半左右。到第14天，TREM-1转基因小鼠的踝肿胀约是野生型对照观察到的肿胀量的四分之一(图16)。因此，可溶性TREM-1有效地显著减少了与关节炎炎症有关的炎症量，表明使用TREM-1拮抗剂，例如，TREM-1融合蛋白和/或抗-TREM-1抗体，来调节、减少和/或抑制TREM-1和/或TREM-1信号传递是治疗炎症性疾病(包括，例如，RA)的有效的方法，。
[00140]用于产生本发明融合蛋白的转录和翻译调控序列，可包括，但不仅限于，启动子序列，核糖体结合位点，转录启始和终止序列，翻译启动和终止序列，和增强子或激活子序列。在一个实施方案中，调控序列包括启动子和转录启始和终止序列。
[00141]启动子序列可编码组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然产生的启动子或杂合启动子。杂合启动子，其中集成了一个以上的启动子元件，也是本领域所熟知的，并可在本发明使用。
[00142]其它的实验动物可以通过mTREM-1-hFc杂合子小鼠与野生型小鼠回交而产生，野生型后代可以作为同窝对照。实验动物可在多种本领域所知的炎症性疾病的动物模型中进行测试，例如，LPS和CIA，以确定是否各种mTREM-1-hFc构建体对炎症性疾病有保护。mTREM-1-hFc构建体可以是组成型表达的，或mTREM-1-hFc构建体的表达可以在用LPS和CIA攻击之前、同时、和/或之后的一个或多个时间点得到诱导。也可制备表达TREM-1受体的可溶性形式的转基因小鼠以筛选炎症性疾病推定的抑制剂。
[00143]在内毒素休克的脂多糖(LPS)模型中，对实验动物注射LPS以确定mTREM-1-hFc构建体在减少对LPS诱导的震扰响应的炎症的有效性。此外，实验动物可以在CIA模型中进行测试，例如在实施例2中，以确定mTREM-1-hFc构建体在减少对CIA响应的炎症的有效性。
[00144]基于TREM-1和DAP12/TyroBP与RA的相关性，预期mTREM-1-hFc构建体对小鼠中LPS和CIA攻击有保护作用。同样，施用适当的TREM-1构建体和/或适当的TREM-1蛋白给患有炎症性疾病(如RA)的人受试者，可以降低炎症性疾病的严重程度。
实施例11：抗-hTREM-1抗体
[00145]在人类RA滑膜培养物检测中，筛选抗-hTREM-1抗体抑制促炎性细胞因子产生的能力。RA和哮喘模型，如实施例9和实施例12中所示，已被成功地用作炎性疾病模型，来开发中和炎症反应的一个或多个方面的治疗性抗体。部分基于TREM-1与炎症疾病如RA和哮喘的相关性，预期抗-hTREM-1抗体在RA滑膜培养物检测和哮喘模型中抑制促炎性细胞因子的产生。同样，施用适当抗体给患有炎症性疾病(如RA或哮喘)的人类受试者，应减少炎症疾病的严重程度和/或减轻疾病的症状。
实施例12：TREM-1和用抗IgE抗体的攻击
[00146]因为肥大细胞的表面IgE的交联会引起信号事件，导致肥大细胞活化和脱粒，肥大细胞和IgE是变态反应中已得到公认的参与者，例如，在急性呼吸系统疾病，如哮喘，过敏反应中。这个肥大细胞活化和脱粒的信号级联和下游后果可使用被动皮肤过敏反应(PCA)的模型在小鼠体内调查，该模型中大鼠抗小鼠IgE皮内注射(id)注入到耳。抗IgE抗体将结合和交联IgE，而IgE结合到肥大细胞表面的FcεRI受体上，诱导肥大细胞活化和脱粒。随后的炎症/水肿反应导致耳内可测量的肿胀，可以用工程师的千分尺计算。Inagaki等人，“Mouse ear PCA as a model forevaluating antianaphylactic agents”Int Arch Allergy Appl Immunol.，74(1)：91-2(1984)。
转基因TREM-1小鼠中抗IgE的攻击
[00147]转基因TREM-1小鼠和野生型小鼠以耳肿胀模型用抗IgE抗体攻击。转基因小鼠如实施例10所述制备。在这个实验中使用的转基因小鼠品系含有mTREM-1-hFc蛋白的血浆水平约为200μg/ml。在异氟醚(isofluorane)麻醉期间，对TREM-1野生型小鼠和转基因杂合mTREM-1-hFc小鼠耳的耳厚度进行测量。抗小鼠IgE在0.9％生理盐水中稀释至10ng/20μl。转基因和野生型小鼠在第0时刻于左耳用抗IgE抗体(BD PharMingen，San Diego，CA；catalog 553413)攻击，而另外单独的转基因和野生型小鼠组用无内毒素的0.9％生理盐水载体攻击，如表2所示。在攻击后的+1小时，+2小时，+4小时，和+6小时进行耳测量。
表2：抗IgE抗体注射。
  WT雌性，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳   N＝3
  WT雌性，载体，20μl皮内注射左耳   N＝3
  WT雄性，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳   N＝4
  WT雄性，载体，20μl皮内注射左耳   N＝3
  mTREM-1-hFC杂合子+/-雌性，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳   N＝4
  mTREM-1-hFC杂合子+/-雌性，载体，20μl皮内注射左耳   N＝3
  mTREM-1-hFC杂合子+/-雄性，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳 N＝3
[00148]如图17所示，与野生型对照比较，TREM-1转基因小鼠中观察到减少的耳肿胀。由于过表达mTREM-1-hFC嵌合蛋白的C57BL/6小鼠已经减少了皮肤耳肿胀，TREM-1可能因此在体内的变态反应中发挥作用。因此，可溶性TREM-1在减少与抗IgE攻击的相关炎症中是有效地。例如，可溶性TREM-1预计将有效调节哮喘，过敏性反应，急性和慢性荨麻疹(风疹)，血管性水肿，变应性鼻炎，昆虫叮咬变应性和特应性。
抗IgE攻击用可溶性TREM-1预处理的野生型小鼠
[00149]小鼠以可溶性TREM-1融合蛋白预处理，以评估在耳肿胀模型中施用可溶性TREM-1是否有炎症的保护作用。研究前一天，小鼠或者腹膜内注射0.9％标准生理盐水，mTREM-1-mFc(500μg/400μl、250μg/400μl或100μg/400μl)或抗柔嫩艾美尔球虫-IgG 2a(500μg/400μl)，如表3所示。抗小鼠IgE在0.9％标准生理盐水中稀释至10ng/20μl。制备重组mTREM-1-mFc，包括小鼠TREM-1的胞外区和突变的小鼠IgG2a的Fc部分(“mTREM-1-mFc”)(SEQ ID NO：27)。突变Fc区域以减少补体和Fc受体结合。mTREM-1-MFc和抗柔嫩艾美尔球虫-IgG 2a(Wyeth，Madison NJ)PBS稀释到所需的剂量水平。攻击之前，所有的小鼠耳进行测量，以确定耳厚度的基线。小鼠在第0时间于左耳用抗IgE(10ng/20μl/皮内注射)攻击，而右耳用0.9％生理盐水(20μl/皮内注射)攻击。在攻击后的+1小时，+2小时，+4小时，+5小时进行耳测量。
表3：处理方案
  C57BL/6雌性，500μg/400μl ip，mTREM-1-mFc(+17小时预攻击)，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳，0.9％标准盐水，20μl皮内注射右耳 N＝7
  C57BL/6雌性，250μg/400μl ip，mTREM-1-mFc(+17小时预攻击)，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳，0.9％标准盐水，20μl皮内注射右耳 N＝7
  C57BL/6雌性，100μg/400μl ip，mTREM-1-mFc(+17小时预攻击)，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳， N＝7
 0.9％标准盐水，20μl皮内注射右耳
 C57BL/6雌性，500μg/400μl ip，IgG 2a(+17小时预攻击)，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳，0.9％标准生理盐水，20μl皮内注射右耳 N＝7
 C57BL/6雌性，PBS/400μl ip，(+17小时预攻击)，抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳，0.9％标准生理盐水，20μl皮内注射右耳 N＝7
[00150]如图18所示，与对照相比，以可溶性mTREM-1-mFc蛋白预处理的小鼠减少了耳的肿胀。此外，如图19所示，耳肿胀减少是剂量依赖性的。这些数据进一步表明，可溶性TREM-1减少了与抗IgE攻击相关的炎症，而TREM-1和/或TREM-1信号转导的拮抗剂，例如，可溶性TREM-1融合蛋白和/或抗-TREM-1抗体，可施用给病人以治疗与抗IgE的攻击相关的炎症。例如，可溶性TREM-1和/或抗-TREM-1抗体，预计将有效调节哮喘、过敏反应、急性和慢性荨麻疹(风疹)、血管性水肿、变应性鼻炎有效、昆虫叮咬变应性和特应性。
在TREM-1敲除小鼠中的抗IgE攻击
[00151]制备TREM-1杂合子(+/-)和纯合子(-/-)敲除小鼠，以评估在缺乏功能性TREM-1的情况下耳肿胀是否减少。制备直接TREM-1敲除小鼠，其中TREM-1基因的外显子1和2由以lox P为侧翼的双启动子驱动的Neo抗性基因取代，导致TREM-1基因阅读框的移位。在C57BL/6小鼠胚胎干细胞中进行基因靶向。以鱼精蛋白-Cre小鼠育种TREM-1敲除小鼠，产生Nco删除的TREM-1敲除小鼠。在第0天，在异氟醚麻醉下，对所有小鼠的耳进行测量，以确定耳厚度的基线。在时间0，用抗IgE(10ng/20ul/皮内注射)攻击小鼠左耳，而右耳用0.9％标准生理盐水(20ul/皮内注射)攻击，如表4所示。抗小鼠IgE以0.9％生理盐水稀释至10ng/20μl。耳测量在攻击后+1小时进行。
表4：在TREM-1敲除小鼠中的抗IgE攻击
  野生型抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳0.9％标准盐水，20μl，皮内注射右耳5只雄性和3只雌性 N＝8
  TREM-1杂合子敲除抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳0.9％标准盐水，20μl，皮内注射右耳5只雄性和4只雌性 N＝9
  TREM-1纯合子敲除抗-IgE，10ng/20μl皮内注射左耳0.9％标准盐水，20μl，皮内注射右耳2只雄性和4只雌性 N＝6
[00152]如图20所示，TREM-1基因杂合子(+/-)小鼠和纯合子(-/-)敲除小鼠与野生型对照(+/+)相比，在用抗-IgE皮内注射攻击后具有降低的耳肿胀反应。这进一步表明，TREM-1参与了炎症反应，TREM-1是用于IgE介导的炎症性疾病/紊乱(例如哮喘，过敏反应，急性和慢性荨麻疹(风疹)，血管性水肿，变应性鼻炎，昆虫叮咬变应性和特应性等)的治疗靶标。因而，拮抗和/或抑制TREM-1和/或TREM-1信号可有效用于显著减少与IgE介导的炎症性疾病/紊乱相关的炎症的量，说明使用TREM-1拮抗剂，例如，TREM-1融合蛋白质和/或抗TREM-1抗体，来调节、减少和/或抑制TREM-1和/或TREM-1信号，是治疗IgE介导的炎症性疾病/紊乱的有效方法。
实施例13：TREM-1的shRNA和siRNA敲除
[00153]为了说明RNA干扰为基础的治疗在炎症性疾病中的用途，在shRNA及siRNA敲除后测量THP-1单核细胞中TREM-1的表达。简单地说，产生多种人TREM-1和鼠TREM-1 shRNA序列，并各个检测其降低TREM-1表达的能力。典型的shRNA序列如表5所示。通过慢病毒转导，在THP-1单核细胞中表达shRNA。人TREM-1 siRNA可以从Dharmacon(Lafayette，CO)商购，并通过核转染(nucleofection)引入THP-1单核细胞。代表性siRNA序列见表6。敲除后，在转导后72小时(在shRNA的情况下)或在核转染后48小时(在siRNA的情况下)用
Figure A20088000837800551
RT-PCR测量TREM-1的表达。
[00154]图21是显示shRNA或siRNA敲除后用RT-PCR测得的TREM-1表达的图。如图21，与vGFP和混杂的(scramble)siRNA对照相比，sh247，sh533，sh382，和汇集的TREM-1 siRNA有效地敲除了在THP-1单核细胞中内源性TREM-1的表达。因此，shRNA及siRNA敲除是降低TREM-1表达的有效手段，因此可以用于治疗炎症性疾病。
[00155]为了证明基于RNA的处理可以有效地敲除TREM-1的过表达，在慢病毒shRNA敲除前TREM-1在CHO细胞中过表达。在一项实验中，在CHO细胞系中稳定过表达人TREM-1-FLAG融合蛋白。在另一个实验中，在CHO细胞系中稳定过表达小鼠TREM-1-FLAG融合蛋白。继TREM-1-FLAG过表达之后，用慢病毒在各个CHO细胞系中表达shRNA。制备多种人类和小鼠TREM-1 shRNA序列，并单独检测其减少TREM-1过表达的能力。代表性shRNA序列如表5所示。在暴露于慢病毒shRNA之后，使用抗-FLAG抗体作为探针用蛋白质印迹法检测TREM-1表达水平。
[00156]图22A-B显示了说明在TREM-1过表达细胞系中用慢病毒shRNA敲除TREM-1之后TREM-1表达的代表性蛋白质印迹。如图22A所示，与对照相比，sh114、sh247、sh247、sh280、sh315、sh360、sh450和sh533有效敲除人TREM-1-FLAG过表达，而sh382和sh600在敲除人TREM-1-FLAG过表达中无效。如图22B所示，与对照相比，sh75、sh284和sh414有效敲除小鼠TREM-1-FLAG过表达，而sh591在敲除小鼠TREM-1-FLAG过表达中无效。因此，shRNA敲除是减少TREM-1过表达进而治疗TREM-1相关的炎性疾病的有效手段。
表5：慢病毒shRNA序列。该序列结构为正义-环-反义
  shRNA   序列   SEQ IDNO：
hTREM-1 sh114   GTGAAATGTGACTACACGCTTCAAGAGAGCGTGTAGTCACATTTCAC   9
hTREM-1 sh155   GAAAGCTTGGCAGATAATATTCAAGAGATATTATCTGCCAAGCTTTC 10
hTREM-1 sh247   GGAGGATCATACTAGAAGATTCAAGAGATCTTCTAGTATGATCCTCC   11
hTREM-1 sh280   GTTTACTGCGCGTCCGAATTTCAAGAGAATTCGGACGCGCAGTAAAC 12
hTREM-1 sh315   GAAGATTCTGGACTGTATCTTCAAGAGAGATACAGTCCAGAATCTTC   13
hTREM-1 sh360   GAGCCTCACATGCTGTTCGTTCAAGAGACGAACAGCATGTGAGGCTC 14
hTREM-1 sh382   GCATCCGCTTGGTGGTGACTTCAAGAGAGTCACCACCAAGCGGATGC   15
hTREM-1 sh450   GTGTATAAGATTCCTCCTATTCAAGAGATAGGAGGAATCTTATACAC 16
hTREM-1 sh533   GTCAACTGCCGATGTCTCCTTCAAGAGAGGAGACATCGGCAGTTGAC   17
hTREM-1 sh600   GTTCCGGTGTTCAACATTGTTCAAGAGACAATGTTGAACACCGGAAC 18
mTREM-1 sh75   GAAGAAAGGTATGACCTAGTTCAAGAGACTAGGTCATACCTTTCTTC 19
mTREM-1 sh284   GCTACAAGTTCAAATGACTTTCAAGAGAAGTCATTTGAACTTGTAGC 20
mTREM-1 sh414   GATGTGTTCACTCCTGTCATTCAAGAGATGACAGGAGTGAACACATC   21
mTREM-1 sh591   GTCTCCACATCCAGTGTTATTCAAGAGATAACACTGGATGTGGAGAC 22
表6：
Figure A20088000837800581
人TREM-1 siRNA序列。
  siRNA   序列   SEQ IDNO：
siRNA153 CCAGAAAGCUUGGCAGAUAAUAA 23
  siRNA206   GCACAGAGAGGCCUUCAAAUU   24
  siRNA49   GAACUCCGAGCUGCAACUAUU   25
  siRNA251   GGAUCAUACUAGAAGACUAUU   26
参考文献的合并
[00157]本申请中引用的所有出版物和专利文件如各自单独合并一样，均整体合并于此作为参考。
序列表
<110>惠氏公司
     蒯军
     K·道尔
     J·L·费尔德曼
     D·D·皮特曼
     M·查特吉-肖基尔
     D·温克勒
     林俐伶
     S·A·叶林斯基
     C·威廉姆斯
<120>通过TREM-1的炎症治疗、检测和监控
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<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的TREM-1正向引物
<400>1
cagatgtgtt cactcctgtc atca                     24
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的TREM-1反向引物
<400>2
ctgggtgagt attttgtggt aataagg                  27
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的TREM-1探针
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cctattacaa ggctgacaga gcgtccca                 28
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DAP12/TyroBP正向引物
<400>4
cctggtctcc cgaggtcaa                           19
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的AP12/TyroBP反向引物
<400>5
ggcgactcag tctcagcaat g                                               21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DAP12/TyroBP探针
<400>6
ttgtttccgg gtcccttccg ct                                              22
<210>7
<211>1311
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码小鼠TREM-1/人Fc融合蛋白的序列
<400>7
atgaggaagg ctgggctctg gggactgctg tgcgtgttct ttgtctcaga agtcaaagct     60
gccattgttc tagaggaaga aaggtatgac ctagtggagg gccagacttt gacagtgaag    120
tgtcccttca acatcatgaa gtatgccaac agccagaagg cttggcagag actaccagac    180
gggaaggaac ccttgaccct ggtggtcaca cagaggccct ttacaagacc cagtgaagtc    240
cacatgggga agttcaccct gaaacatgac cctagtgagg ccatgctaca agttcaaatg    300
actgaccttc aagtgacaga ctctggattg tatcgttgtg tgatttacca tcctccgaat    360
gaccctgttg tgctcttcca tcctgtccgc ctggtggtga ccaagggttc ttcagatgtg    420
ttcactcctg tcatcattcc tattacaagg ctgacagagc gtcccatcct tattaccaca    480
aaatactcac ccagtgacac aactacaacc cgatccctac ccaagcccac tgcggttgtt     540
tcctctcctg gtcttggagt cactatcata aatgggacag atgctgacag tggtagcggc     600
tccggaagtg gggagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca     660
cctgaagccc tgggggcacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc     720
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct     780
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg     840
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag     900
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc     960
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg    1020
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc    1080
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac    1140
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc    1200
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct    1260
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaatg a             1311
<210>8
<211>436
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠TREM-1/人Fc融合蛋白
<400>8
Met Arg Lys Ala Gly Leu Trp Gly Leu Leu Cys Val Phe Phe Val Ser
1               5                   10                  15
Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu Val
            20                  25                  30
Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys Tyr
        35                  40                  45
Ala Asn Ser Gln Lys Ala Trp Gln Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu Pro
    50                  55                  60
Leu Thr Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val
65                  70                  75                  80
His Met Gly Lys Phe Thr Leu Lys His Asp Pro Ser Glu Ala Met Leu
                85                  90                  95
Gln Val Gln Met Thr Asp Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg
            100                 105                 110
Cys Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Val
    130                 135                 140
Ile Ile Pro Ile Thr Arg Leu Thr Glu Arg Pro Ile Leu Ile Thr Thr
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Ser Pro Ser Asp Thr Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro
                165                 170                 175
Thr Ala Val Val Ser Ser Pro Gly Leu Gly Val Thr Ile Ile Asn Gly
            180                 185                 190
Thr Asp Ala Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser
        195                 200                 205
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu
    210                 215                 220
Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225                 230                 235                 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                245                 250                 255
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
            260                 265                 270
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
        275                 280                 285
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
    290                 295                 300
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
305                 310                 315                 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
                325                 330                 335
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
            340                 345                 350
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
        355                 360                 365
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
    370                 375                 380
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
385                 390                 395                 400
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
                405                 410                 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
            420                 425                 430
Ser Pro Gly Lys
        435
<210>9
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA114的序列
<400>9
gtgaaatgtg actacacgct tcaagagagc gtgtagtcac atttcac                47
<210>10
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA155的序列
<400>10
gaaagcttgg cagataatat tcaagagata ttatctgcca agctttc                47
<210>11
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA247的序列
<400>11
ggaggatcat actagaagat tcaagagatc ttctagtatg atcctcc                  47
<210>12
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA280的序列
<400>12
gtttactgcg cgtccgaatt tcaagagaat tcggacgcgc agtaaac                  47
<210>13
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA315的序列
<400>13
gaagattctg gactgtatct tcaagagaga tacagtccag aatcttc                  47
<210>14
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA360的序列
<400>14
gagcctcaca tgctgttcgt tcaagagacg aacagcatgt gaggctc              47
<210>15
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA382的序列
<400>15
gcatccgctt ggtggtgact tcaagagagt caccaccaag cggatgc              47
<210>16
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA450的序列
<400>16
gtgtataaga ttcctcctat tcaagagata ggaggaatct tatacac              47
<210>17
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA533的序列
<400>17
gtcaactgcc gatgtctcct tcaagagagg agacatcggc agttgac              47
<210>18
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA600的序列
<400>18
gttccggtgt tcaacattgt tcaagagaca atgttgaaca ccggaac           47
<210>19
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA75的序列
<400>19
gaagaaaggt atgacctagt tcaagagact aggtcatacc tttcttc           47
<210>20
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA284的序列
<400>20
gctacaagtt caaatgactt tcaagagaag tcatttgaac ttgtagc           47
<210>21
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA414的序列
<400>21
gatgtgttca ctcctgtcat tcaagagatg acaggagtga acacatc           47
<210>22
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的编码shRNA591的序列
<400>22
gtctccacat ccagtgttat tcaagagata acactggatg tggagac                  47
<210>23
<211>23
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DHARMACON hTREM-1 siRNA153
<400>23
ccagaaagcu uggcagauaa uaa                                            23
<210>24
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DHARMACON hTREM-1 siRNA206
<400>24
gcacagagag gccuucaaau u                                              21
<210>25
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的：DHARMACON hTREM-1 siRNA49
<400>25
gaacuccgag cugcaacuau u                     21
<210>26
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DHARMACON hTREM-1 siRNA251
<400>26
ggaucauacu agaagacuau u                     21
<210>27
<211>436
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠TREM-1/小鼠IgG2a Fc融合蛋白
<400>27
Met Arg Lys Ala Gly Leu Trp Gly Leu Leu Cys Val Phe Phe Val Ser
1               5                   10                  15
Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu Val
            20                  25                  30
Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys Tyr
        35                  40                  45
Ala Asn Ser Gln Lys Ala Trp Gln Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu Pro
    50                  55                  60
Leu Thr Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val
65                  70                  75                  80
His Met Gly Lys Phe Thr Leu Lys His Asp Pro Ser Glu Ala Met Leu
                85                  90                  95
Gln Val Gln Met Thr Asp Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg
            100                 105                 110
Cys Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Val
    130                 135                 140
Ile Ile Pro Ile Thr Arg Leu Thr Glu Arg Pro Ile Leu Ile Thr Thr
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Ser Pro Ser Asp Thr Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro
                165                 170                 175
Thr Ala Val Val Ser Ser Pro Gly Leu Gly Val Thr Ile Ile Asn Gly
            180                 185                 190
Thr Asp Ala Asp Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro
        195                 200                 205
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu
    210                 215                 220
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
225                 230                 235                 240
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                245                 250                 255
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
            260                 265                 270
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
        275                 280                 285
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
    290                 295                 300
Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
305                 310                 315                 320
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
                325                 330                 335
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
            340                 345                 350
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
        355                 360                 365
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
    370                 375                 380
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
385                 390                 395                 400
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
                405                 410                 415
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
            420                 425                 430
Thr Pro Gly Lys
        435

Claims (41)

1、一种治疗受试者炎症性疾病的方法，所述方法包括降低TREM-1介导的信号转导的步骤。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病由IgE介导。
3、如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病为呼吸系统疾病。
4、如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为哮喘。
5、如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病为类风湿性关节炎。
6、如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括降低TREM-1的表达。
7、如权利要求6所述的方法，其中所述降低步骤包括向受试者施用干扰RNA。
8、如权利要求7所述的方法，其中所述干扰RNA为shRNA。
9、如权利要求8所述的方法，其中所述shRNA包括SEQ ID NO：9-18中任一个所编码的RNA。
10、如权利要求7所述的方法，其中所述干扰RNA为siRNA。
11、如权利要求10所述的方法，其中所述siRNA包括SEQ IDNO：23-26中的任一个。
12、如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括抑制TREM-1活性。
13、如权利要求12所述的方法，其中通过施用选自小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、特异性结合TREM-1的抗体或其片段、特异性结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白及其组合的化合物来抑制TREM-1活性。
14、如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括直接抑制TREM-1介导的信号转导中的非TREM-1蛋白质的表达或活性。
15、如权利要求14所述的方法，其中所述非TREM-1蛋白质为DAP12/TyroBP。
16、如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括在受试者中诱导对内源性TREM-1或DAPl2/TyroBP蛋白的免疫应答。
17、如权利要求16所述的方法，其中所述降低步骤包括向受试者施用包含佐剂和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物。
18、特异性结合TREM-1的抗体或其片段。
19、如权利要求18所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单克隆抗体或单克隆抗体片段。
20、如权利要求18所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单结构域抗体。
21、一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求19所述的抗体或其片段的步骤。
22、包含SEQ ID NO：9-22中任一个所编码的RNA的shRNA。
23、一种治疗有需要的受试者的炎症性疾病的方法，所述方法包括通过施用选自小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、特异性结合TREM-1的抗体或其片段、特异性结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白及其组合的化合物来降低TREM-1介导的信号转导的步骤。
24、评价向有需要的患者所施用TREM-1调节剂的功效的方法，所述方法包括在患者中或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白1(SPP1)的水平。
25、如权利要求24所述的方法，其中所述SPPl水平在来自患者的体液样本中检测。
26、如权利要求24所述的方法，进一步包括将SPP1水平与参照比较的步骤，其中与参照相比SPP1水平的升高是TREM-1活性升高的指征，其中与参照相比SPP1水平的降低是TREM-1活性降低的指征。
27、如权利要求26所述的方法，其中所述参照对应于在施用所述TREM-1调节剂之前的时间点在患者或者来自患者的样本中测得的SPP1水平。
28、筛选能够调节TREM-1信号的候选试剂的方法，所述方法包括步骤：
将表达TREM-1的细胞与候选试剂接触；和
评价所述表达TREM-1的细胞的分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，以确定所述候选试剂是否调节TREM-1活性。
29、监测治疗慢性炎症的患者的方法，所述方法包括步骤：
向有需要的患者施用TREM-1调节剂；
在患者或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白(SPP1)水平；和
将所检测到的SPP1水平与参照比较，从而监测所述患者。
30、如权利要求29所述的方法，其中所述SPP1水平在来自患者的体液样本中检测。
31、如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平的降低是TREM-1介导的炎症减轻的指征。
32、如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平没有变化是TREM-1介导的炎症没有变化的指征。
33、如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平的升高是TREM-1介导的炎症加重的指征。
34、如权利要求29所述的方法，其中所述参照对应于在施用所述TREM-1调节剂之前的时间点或同时在患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。
35、如权利要求29所述的方法，其中所述参照对应于已知未患慢性炎症的对照受试者的SPP1水平。
36、检测受试者中存在炎症性疾病的方法，所述方法包括步骤：
在受试者或来自受试者的样本中检测TREM-1或DAPl2/TyroBP的表达或活性，其中升高的表达或活性是所述炎症性疾病的指征。
37、在受试者中监测炎症性疾病的方法，所述方法包括步骤：
(a)在第一时间对患者或来自患者的第一样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(b)在后来的第二时间对患者或来自患者的后来的第二样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；和
(c)比较(a)和(b)的所述表达或活性，其中表达或活性的改变是疾病状态改变的指征。
38、如权利要求37所述的方法，其中所述炎症性疾病是类风湿性关节炎。
39、评价受试者中炎症性疾病的治疗的方法，所述方法包括步骤：
(a)在第一时间对患者或来自患者的第一样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(b)在后来的第二时间对患者或来自患者的后来的第二样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(c)在所述后来的第二时间或后来的第二样本之前进行治疗；和
(d)比较(a)和(b)的所述表达或活性，其中表达或活性的改变是疾病状态改变的指征。
40、如权利要求39所述的方法，其中在第一时间或第一样本之后给予所述治疗。
41、如权利要求39所述的方法，进一步包括基于所述比较的结果修改对受试者治疗的疗程。
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