NO20161431A1 - Chalicheamicinderivat-bærerkonjugater. - Google Patents

Chalicheamicinderivat-bærerkonjugater. Download PDF

Info

Publication number
NO20161431A1
NO20161431A1 NO20161431A NO20161431A NO20161431A1 NO 20161431 A1 NO20161431 A1 NO 20161431A1 NO 20161431 A NO20161431 A NO 20161431A NO 20161431 A NO20161431 A NO 20161431A NO 20161431 A1 NO20161431 A1 NO 20161431A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
antibody
cdr
prednisone
vincristine
Prior art date
Application number
NO20161431A
Other languages
English (en)
Other versions
NO344509B1 (no
Inventor
John Mclean Simpson
Arthur Kunz
Justin Keith Moran
Joseph Thomas Rubino
Eugene Joseph Vidunas
Paul David Robbins
Nishith Merchant
John Dijoseph
Mark Edward Rubben
Nitin Krishnaji Damle
Andrew George Popplewell
Neera Jain
Original Assignee
Wyeth Holdings Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29401497&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20161431(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20161431A1 publication Critical patent/NO20161431A1/no
Application filed by Wyeth Holdings Llc filed Critical Wyeth Holdings Llc
Publication of NO344509B1 publication Critical patent/NO344509B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

OPPFINNELSESOMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av monomere cytotoksiske medikament/bærerkonjugater («konjugatene») med høyere medikamentlading og betydelig redusert lav konjugatandel (LCF). Særlig vedrører oppfinnelsen anti-CD22 antistoff-monomere calicheamicinkonjugater. Oppfinnelsen vedrører også konjugatene ifølge oppfinnelsen, fremgangsmåter for rensing av konjugatene, farmasøytiske blandinger som omfatter konjugatene og anvendelsene av konjugatene.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Medikamentkonjugater utviklet for systemisk farmakoterapi er målspesifikke cytotoksiske midler. Dette konsept involverer kobling av et terapeutisk middel med et bærermolekyl med spesifisitet for en definert målcellepopulasjon. Antistoffer med høy affinitet for antigener er et naturlig valg som måldeler. Som følge av tilgjengeligheten av monoklonale antistoffer med høy affinitet, er utsiktene for antistoff-målrettende terapeutika blitt lovende. Toksiske substanser som har vært konjugert til monoklonale antistoffer omfatter toksiner, lavmolekylære cytotoksiske medikamenter, biologisk respons-modifiserende midler og radionuklider. Antistoff-toksinkonjugater betegnes ofte immunotoksiner, mens immunkonjugater bestående av antistoffer og lavmolekylære medikamenter, så som metotreksat og adriamycin, kalles kjemoimmunokonjugater. hnmunmodulatorer inneholder biologiske responsmodifiserende midler som er kjent for å ha regulerende virkninger, så som lymfokiner, vekstfaktorer og komplement-aktiverende CVF (cobra venom factor). Radioimmunkonjugater består av radioaktive isotoper som kan benyttes som terapeutika for å drepe celler gjennom deres bestråling, eller benyttes for avbildning. Antistoff-mediert spesifikk avlevering av cytotoksiske medikamenter til tumorceller forventes ikke bare å øke deres antitumoreffektivitet, men også å forhindre utilsiktet opptak i normalt vev, og derved øke deres terapeutiske indeks.
Foreliggende oppfinnelse vedrører immunkonjugater som omfatter et antistoff som en målrettende bærer og som har spesifisitet for antigene determinanter på overflaten av maligne celler, konjugert til et cytotoksisk medikament. Oppfinnelsen vedrører cytotoksiske medikament-antistoffkonjugater, hvor antistoffet har spesifisitet for antigene determinanter på B-maligniteter, lymfoproliferative forstyrrelser og kronisk inflammatoriske sykdommer. Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåter for fremstilling av immunkonjugater og deres terapeutiske anvendelser.
En rekke antistoff-baserte terapeutika for behandling av diverse sykdommer, inklusivt cancer og reumatoid artritt, er godkjent for klinisk anvendelse eller er under klinisk utprøving for et utvalg av sykdommer, inklusivt B-cellemaligniteter, så som nonHodgkins lymfom. Et slikt antistoff-basert terapeutikum er rituximab (Rituxan™), et umerket kimært humant yl (+myl V-region) antistoff, som er spesifikt for celleoverflateantigen CD20, som uttrykkes på B-celler. Disse antistoffbaserte terapeutikaene bygger enten på komplement-mediert cytotoksisitet (CDCC) eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) overfor B-celler, eller på anvendelsen av radionuklider, så som 13 *I eller<90>Y som har medfølgende problemer ved fremstilling og anvendelse for behandlere og pasienter. Det er følgelig et behov for utviklingen av immunkonjugater som kan rette opp manglene ved dagens antistoff-baserte terapeutika til behandling av en rekke sykdommer, inklusivt hematopoetiske sykdommer som nonHodgkins lymfom (NHL), og som kan fremstilles lett og effektivt og som kan benyttes gjentatt uten å indusere en immunrespons.
Immunkonjugater som omfatter et medlem av den potente familie av antibakterie- og antitumormidler, kjent kollektivt som calicheamiciner eller LL-E33288-komplekset (se US-patent 4.970.198 (1990)), ble utviklet for bruk ved behandlingen av myelomer. Den mest potente av calicheamicinene betegnes yi,som her simpelthen omtales som gamma. Disse forbindelsene inneholder et metyltrisulfid som kan omsettes med passende tioler for å danne disulfider, samtidig som det innfører en funksjonell gruppe, så som en hydrazid- eller annen funksjonell gruppe som er egnet til å feste et calicheamicinderivat til en bærer. (Se US-patent 5.053.394). Anvendelsen av monomere calicheamicinderivat/bærerkonjugater ved utviklingen av terapier for en lang rekke cancere har vært begrenset både av tilgjengeligheten av spesifikke målrettende midler (bærere) så vel som konjugasjonsmetodikker som resulterer i dannelse av proteinaggregater når mengden av calicheamicinderivatet som er konjugert til bæreren (dvs. medikamentladingen) økes. Siden høyere medikamentlading øker konjugatets naturlige styrke, er det ønskelig å ha anbragt så meget medikament på bæreren at det er forenelig med oppretthold av affiniteten av bærerproteinet. Nærværet av aggregert protein som kan være uspesifikt toksisk og immunogent, og derfor må fjernes for terapeutiske anvendelser, gjør oppskaleringsprosessen for produksjonen av disse konjugatene vanskeligere og minsker utbyttet av produktene. Den mengde calicheamicin som er anbragt på bærerproteinet (medikamentladingen), mengden av aggregat som dannes ved konjugasjonsreaksjonen og det utbytte av endelig renset monomert konjugat som kan oppnås, er alle beslektet med hverandre. Det må derfor foretas et kompromiss mellom høyere medikamentlading og utbytte av den endelige monomer ved å justere den mengde av det reaktive calicheamicinderivat som tilsettes til konj ugasjonsreaksj onen.
Den tendens cytotoksiske medikamentkonjugater, spesielt calicheamicinkonjugater har til å aggregere, er spesielt problematisk når konj ugasjonsreaksj onene foretas med de linker e som er beskrevet i US-patent 5.877.296 og US-patent 5.773.001, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I dette tilfelle er en stor andel av de produserte konjugater i aggregert form, og det er ganske vanskelig å rense konjugater fremstilt etter disse opprinnelige prosessene (CMA prosess) for terapeutisk anvendelse. For enkelte bærerproteiner, er konjugater med selv moderate ladinger praktisk talt umulige å fremstille bortsett fra i liten skala. Det er følgelig et presserende behov for å forbedre metoder for konjugering av cytotoksiske medikamenter, så som calicheamicinene, til bærere som minimerer graden av aggregasjon og derved muliggjør høyest mulig medikamentlading med et rimelig produktutbytte.
Tidligere er konjugasjonsmetoder for fremstilling av monomere calicheamicinderivat/bærere med høyere medikamentlading/utbytte og nedsatt aggregasjon omtalt (se US-patent 5.712.374 og US-patent 5.714.586, som herved med hele deres innhold inkorporeres ved referanse). Selv om disse fremgangsmåtene resulterte i konjugatpreparater med betydelig redusert aggregatinnhold, ble det senere oppdaget at de produserte konjugater som inneholdt uønskede høye nivåer (45-65% HPLC-areal%) av en lavkonjugert fraksjon (LCF), en fraksjon som for det vesentlige besto av ukonjugert antistoff. Nærværet av LCF i produktet er en ineffektiv anvendelse av antistoffet, siden det ikke inneholder det cytotoksiske medikament. Det kan også konkurrere med calicheamicin-bærerkonjugatet om målet og eventuelt redusere treffsikkerheten av sistnevnte, hvilket resulterer i redusert effekt av det cytotoksiske medikament. En forbedret konjugasjonsprosess som ville resultere i vesentlig lavere nivåer av LCF og ha akseptabel grad av aggregasjon, uten vesentlig endring av de fysikalske egenskapene av konjugatet, er derfor ønskelig.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugater ("konjugatene") med høyere lading og betydelig redusert lavkonjugert fraksjon (LCF). Særlig vedrører oppfinnelsen fremstillingen av monomere calicheamicin-derivatbærerkonjugater, konjugatene, blandingene, en fremgangsmåte for rensing av konjugatene og anvendelsen av konjugatene. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av et monomert calicheamicinderivat-anti-CD22-antistoffkonjugat(CMC-544).
I én utførelsesform angir foreliggende oppfinnelse en forbedret konjugasjonsprosess for fremstillingen av konjugatene, som resulterer i betydelig lavere nivåer av LCF (mindre enn 10 prosent) uten noen vesentlig endring av de fysikalske eller kjemiske egenskapene. Oppfinnelsen angir også en ytterligere forbedring av konjugasjonsprosessen som ikke bare resulterer i en signifikant reduksjon i nivåene av LCF, men også resulterer i en signifikant reduksjon i aggregasjon i forhold til tidligere beskrevne fremgangsmåter og produserer betydelig øket medikamentlading. Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen:
Pr(-X-W)m
hvor:
Pr er en proteinholdig bærer,
X er en linker som omfatter et produkt av en hvilken som helst reaktiv gruppe som kan reagere med en proteinholdig bærer,
W er et cytotoksisk medikament;
m er den gjennomsnittlige lading for et renset konjugasjonsprodukt slik at det cytotoksiske medikament utgjør 7 - 9% av konjugatvekten; og
(-X-W)mer et cytotoksisk medikamentderivat.
Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles i en utførelsesform, etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som omfatter trinnene: (1) addering av det cytotoksiske medikamentderivat til den proteinholdige bærer, hvor det cytotoksiske medikamentderivat utgjør 4,5-11 vekt% av den proteinholdige bærer; (2) inkubering av det cytotoksiske medikamentderivat og en proteinholdig bærer i en ikke-nukleofil, proteinforlikelig buffret løsning som har en pH i området fra ca. 7 til 9 for å frembringe et monomert cytotoksisk medikament/bærerkonjugat, hvor løsningen videre omfatter (a) et organisk med-løsningsmiddel og (b) et tilsetningsstoff som omfatter minst en C6-Ci8karboksylsyre eller dens salt, og hvor inkuberingen foretas ved en temperatur varierende fra ca. 30°C til ca. 35°C over et tidsrom varierende fra ca. 15 minutter til 24 timer; og (3) underkastelse av konjugatet fremstilt i trinn (2) til en kromatografisk separasjonsprosess for å skille det monomere cytotoksiske medikamentderivat/proteinholdige bærerkonjugat med en lading i området 4-10 vekt% av cytotoksisk medikament og med lavkonjugert fraksjon (LCF) under 10 prosent fra ukonjugert proteinholdig bærer, cytotoksisk medikamentderivat og aggregerte konjugater.
I henhold til et aspekt ved oppfinnelsen velges den proteinholdige bærer av konjugatet fra en gruppe bestående av hormoner, vekstfaktorer, antistoffer, antistoff-fragmenter, antistoffmimetika og deres genetisk eller enzymatisk manipulerte motstykker.
I en utførelsesform er den proteinholdige bærer et antistoff. I en foretrukket utførelsesform velges antistoffer fra en gruppe bestående av et monoklonalt antistoff, et kimært antistoff, et humant antistoff, et humanisert antistoff, et enkelttrådet antistoff, et Fab-fragment og et F(ab)2-fragment.
I en annen utførelsesform er det humaniserte antistoff rettet mot celleoverflateantigenet CD22.
I en foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff, og omfatter en lett kjede variabel region 5/44-gLl (SEKV.ID.NR: 19), og en tung kjede variabel region 5/44-gH7 (SEKV.ID.NR: 27).
I en annen foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en lett kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:28.
I nok en annen foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en tung kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:30.
I en annen foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en lett kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:28 og en tung kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:30.
I en annen utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som er et variant-antistoff oppnådd gjennom en affinitetsmodning og som har øket spesifisitet for humant CD22.
I henhold til et annet aspekt er det cytotoksiske medikament benyttet til å frembringe det monomere cytotoksiske medikament/bærerkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse enten en inhibitor av tubulin-polymerisasjon, et alkyleringsmiddel som binder til og river opp DNA, en inhibitor-proteinsyntese eller en inhibitor av tyrosinkinaser.
I en utførelsesform er det cytotoksiske medikament valgt fra calicheamiciner, tiotepa, taxaner, vincristin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, esperamiciner, aktinomycin, autramycin, azaseriner, bleomyciner, tamoxifen, idarubicin, dolastatiner/auristatiner, hemiasterliner og maytansinoider.
I en foretrukket utførelsesform er det cytotoksiske medikament calicheamicin. I en særlig foretrukket utførelsesform er calicheamicinet et gamma-calicheamicin eller N-acetyl-gamma-calicheamicinderivat.
I henhold til nok et annet aspekt er det cytotoksiske medikament funksjonalisert med 3-merkapto-3-metyl-butanoyl-hydrazid og konjugert til en proteinholdig bærer via en hydrolyserbar linker som kan frigjøre det cytotoksiske medikament fra konjugatet etter binding og inngang i målcellene.
I en foretrukket utførelsesform av dette aspekt er den hydrolyserbare linker 4-(4-acetylfenoksy)-butansyre (AcBut).
I henhold til nok et annet aspekt ved oppfinnelsen benyttes oktansyre eller dens salt, eller dekansyre eller dens salt som et tilsetningsstoff under konjugasjonsprosessen for å nedsette aggregasjon og øke medikamentlading.
I henhold til nok et annet aspekt ved oppfinnelsen renses konjugatene ifølge oppfinnelsen ved en kromatografisk separasjonsprosess.
I én utførelsesform er den kromatografiske separasjonsprosess som benyttes til å separere det monomere medikamentderivat-bærerkonjugat SEC (size exclusion chromatography).
I en annen utførelsesform er den kromatografiske separasjonsprosess som benyttes til å separere det monomere medikamentderivat-bærerkonjugat HPLC, FPLC eller Sephacryl S-200 kromatografi.
I en foretrukket utførelsesform er den kromatografiske separasjonsprosess som benyttes til å separere det monomere medikamentderivat-bærerkonjugat hydrofob interaksjonskromotografi (HIC). I en særlig foretrukket utførelsesform foretas HIC ved å benytte Phenyl Sepharose 6 Fast Flow kromatografisk medium, Butyl Sepharose 4 Fast Flow kromatografisk medium, Octyl Sepharose 4 Fast Flow kromatografisk medium, Toyopearl Ether-650M kromatografisk medium, Macro-Prep Methyl HIC medium eller Macro-Prep t-Butyl HIC medium. I en mer særlig foretrukket utførelsesform foretas HIC ved å benytte Butyl Sepharose 4 Fast Flow kromatografisk medium.
I henhold til et annet aspekt er oppfinnelsen rettet mot et monomert cytotoksisk medikamentderivat/bærerkonjugat fremstilt etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en foretrukket utførelsesform av dette aspekt er det cytotoksiske medikament som benyttes, calicheamicin og bæreren som benyttes et antistoff.
I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffet valgt fra en gruppe bestående av et monoklonalt antistoff, et kimært antistoff, et humant antistoff, et humanisert antistoff, et enkelttrådet antistoff, et Fab-fragment og et F(ab)2-fragment. I henhold til et mer særlig foretrukket aspekt benyttes et humanisert antistoff rettet mot celleoverflateantigenet CD22.
I én utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff, og omfatter en lett kjede variabel region 5/44-gLl (SEKV.ID.NR: 19), og en tung kjede variabel region 5/44-gH7 (SEKV.ID.NR:27).
I en annen utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en lett kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:28.
I en foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en tung kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:30.
I en annen foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som omfatter en lett kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:28, og en tung kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR: 30.
I nok en annen utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som er en antistoff-variant oppnådd etter en affinitetsmodnings-protokoll, som har øket spesifisitet for humant CD22.
I en foretrukket utførelsesform er calicheamicinet gamma-calicheamicin eller N-acetyl-gamma-calicheamicin.
I én utførelsesform er calicheamicinderivatet funksjonalisert med 3-merkapto-3-metyl-butanoyl-hydrazid.
I en annen utførelsesform er linkeren som benyttes til å konjugere medikamentet til bæreren en hydrolyserbar linker som kan frigjøre det cytotoksiske medikament fra konjugatet etter binding og inngang i målcellene. I en foretrukket utførelsesform er den hydrolyserbare linker 4-(4-acetylfenoksy)-butansyre (AcBut).
Et annet aspekt ved oppfinnelsen er rettet mot et monomert calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat som har formelen Pr(-X-S-S-W)m, hvor: Pr er et anti-CD22-antistoff; X er en hydrolyserbar linker som omfatter et produkt av en hvilken som helst reaktiv gruppe som kan reagere med et antistoff; W er et calicheamicinradikal; m er den gjennomsnittlige lading for et renset konjugasjonsprodukt slik at calicheamicinet utgjør 4-10 vekt% av konjugatet; og (-X-S-S-W)mer et calicheamicinderivat utviklet etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
I én utførelsesform av dette aspekt er antistoffet valgt fra en gruppe bestående av et monoklonalt antistoff, et kimært antistoff, et humant antistoff, et humanisert antistoff, et enkelttrådet antistoff, et Fab-fragment og et F(ab)2-fragment.
I en foretrukket utførelsesform er antistoffet et anti-CD22-antistoff som har spesifisitet for humant CD22, og som omfatter en tung kjede hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt som Hl i Figur 1 (SEKV.ID.NR: 1) for CDR-Hl, som H2 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:2) eller H2' (SEKV.ID.NR: 13) eller H2"
(SEKV.ID.NR: 15) eller H2'" (SEKV.ID.NR: 16) for CDR-H2, eller som H3 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:3) for CDR-H3, og omfatter en lett kjede hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt som LI i Figur 1 (SEKV.ID.NR:4) for CDR-L1, som L2 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:5) for CDR-L2, eller som L3 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:6) for CDR-L3.
I en annen foretrukket utførelsesform omfatter anti-CD22-antistoffet en tung kjede, hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt i SEKV.ID.NR: 1 for CDR-H1, SEKV.ID.NR:2 eller SEKV.ID.NR: 13 eller SEKV.ID.NR: 15 eller SEKV.ID.NR: 16 for CDR-H2, eller SEKV.ID.NR:3 for CDR-H3, og en lett kjede hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst en av de sekvenser som er angitt i SEKV.ID.NR:4 for CDR-L1, SEKV.ID.NR:5 for CDR-L2 eller SEKV.ID.NR:6 for CDR-L3.
I nok en annen foretrukket utførelsesform omfatter anti-CD22-antistoffet SEKV.ID.NR: 1 for CDR-H1, SEKV.ID.NR:2 eller SEKV.ID.NR: 13 eller SEKV.ID.NR: 15 eller SEKV.ID.NR: 16 for CDR-H2, SEKV.K>.NR:3 for CDR-H3, SEKV.ID.NR: 4 for CDR-Ll, SEKV.ID.NR:5 for CDR-L2 og SEKV.ID.NR:6 for CDR-L3.
I en annen utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet anti-CD22-antistoff og omfatter et variabelt domene som omfatter humane akseptor-framework-regioner og ikke-humane donor CDR.
I en annen utførelsesform har det humaniserte anti-CD22-antistoff et humant akseptor-framework, hvor regioner av det variable domenet av den tunge kjede av antistoffet er basert på en human subgruppe I konsensussekvens og omfatter ikke-humane donorrester i posisjonene 1, 28, 48, 71 og 93.1 en annen utførelsesform omfatter det humaniserte antistoff videre ikke-humane donorrester i posisjonene 67 og 69.
I en foretrukket utførelsesform omfatter det CDR-podede humaniserte antistoff et variabelt domene av den lette kjede som omfatter en human akseptor-framework-region basert på en human subgruppe I konsensussekvens og omfatter videre ikke-humane donorrester i posisjonene 2, 4, 37, 38, 45 og 60.1 en annen utførelsesform omfatter det CDR-podede antistoff videre en ikke-human donorrest i posisjon 3.
I nok en annen utførelsesform omfatter det CDR-podede antistoff en lett kjede variabel region 5/44-gLl (SEKV.ID.NR: 19) og en tung kjede variabel region 5/44-gH7 (SEKV.K>.NR:27).
I en annen utførelsesform omfatter det CDR-podede antistoff en lett kjede som har sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:28 og en tung kjede som har sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:30.
I nok en annen utførelsesform omfatter det CDR-podede antistoff en lett kjede som har sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:28 og en tung kjede som har sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:30.
I en utførelsesform er det anti-CD22 CDR-podede antistoff en antistoffvariant oppnådd etter en affinitetsmodningsprotokoll som har øket spesifisitet for humant CD22.
I en annen utførelsesform er anti-CD22-antistoffet et kimært antistoff som omfatter sekvensene av den lette og tunge kjedes variable domener av det monoklonale antistoff angitt henholdsvis i SEKV.ID.NR:7 og SEKV.ID.NR: 8.
I nok en annen utførelsesform omfatter anti-CD22-antistoffet en hybrid CDR med en trunkert donor CDR-sekvens, hvor den manglende del av donor CDR er erstattet med en annen sekvens og danner en funksjonell CDR.
I en særlig foretrukket utførelsesform er det cytotoksiske medikamentderivat enten et gamma-calicheamicin eller et N-acetyl-gamma-calicheamicinderivat.
I henhold til et annet aspekt er oppfinnelsen rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil lyofilisert blanding av et monomert cytotoksisk medikamentderivat/bærerkonjugat. I en foretrukket utførelsesform fremstilles den stabile lyofiliserte blanding av det monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærer-konjugat ved (a) å løse opp det monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugat til en sluttkonsentrasjon på 0,5 til 2 mg/mL i en løsning som omfatter en kryoprotektant i en konsentrasjon på l,5%-5 vekt%, et polymert fyllstoff i en konsentrasjon på 0,5-1,5 vekt%, elektrolytter i en konsentrasjon på
0,01M til 0,1M, et løselighetsforbedrende middel i en konsentrasjon på 0,005-0,05 vekt%, et buffermiddel i en konsentrasjon på 5-50 mM slik at den endelige pH av løsningen er 7,8-8,2, og vann; (b) påfylling av ovennevnte løsning på ampuller ved en temperatur på +5°C til +10°C; (c) frysing av løsningen ved en innfrysningstemperatur på -35°C til -50°C; (d) underkaste den frosne løsning et initialt frysetørkingstrinn under et primært tørketrykk på 20
til 80 mikron ved en lagringstemperatur på -10°C til -40°C i 24 til 78 timer; og (e) underkaste det frysetørkede produkt fra trinn (d) et andre tørketrinn ved et tørketrykk på 20 til 80 mikron ved en lagringstemperatur på +10°C til +35°C i 15 til 30 timer.
I én utførelsesform er kryoprotektanten som benyttes ved lyofiliseringen av det cytotoksiske medikament/bærerkonjugat valgt fra alditol, mannitol, sorbitol, inositol, polyetylenglykol, aldonsyre, uronsyre, aldarsyre, aldoser, ketoser, aminosukkere, alditoler, inositoler, glyceraldehyder, arabinose, lyxose, pentose, ribose, xylose, galaktose, glukose, heksose, idose, mannose, talose, heptose, glukose, fruktose, glukonsyre, sorbitol, laktose, mannitol, metyl-a-glukopyranosid, maltose, isoaskorbinsyre, askorbinsyre, lakton, sorbose, glucarsyre, erytrose, treose, arabinose, allose, altrose, gulose, idose, talose, erytrulose, ribulose, xylulose, psikose, tagatose, glukuronsyre, glukonsyre, glucarsyre, galakturonsyre, mannuronsyre, glukosamin, galaktosamin, sakkarose, trehalose, neuraminsyre, arabinaner, fruktaner, fukaner, galaktaner, galakturonaner, glukaner, mannaner, xylaner, levan, fukoidan, karrageenan, galaktokarolose, pektiner, pektinsyrer, amylose, pullulan, glykogen, amylopektin, cellulose, dekstran, pustulan, chitin, agarose, keratin, kondroitin, dermatan, hyaluronsyre, alginsyre, xantangummi, stivelse, sakkarose, glukose, laktose, trehalose, etylenglykol, polyetylenglykol, polypropylenglykol, glycerol og pentaerytritol.
I en foretrukket utførelsesform er kryoprotektanten sakkarose, som inngår i en konsentrasjon på 1,5 vekt%.
I én utførelsesform er det polymere fyllstoff som benyttes under lyofiliseringsprosessen valgt fra Dextran 40 eller hydroksyetylstivelse 40 og inngår i en konsentrasjon på 0,9 vekt%.
I en annen utførelsesform er elektrolytten benyttet i lyofiliseringsløsningen, natriumklorid som inngår i en konsentrasjon på 0,05M.
I en foretrukket utførelsesform benyttes et løselighetsforbedrende middel under lyofiliseringsprosessen. Fortrinnsvis er dette løselighetsforbedrende middel et overflateaktivt middel. I en særlig foretrukket utførelsesform er det overflateaktive middel polysorbat 80, som inngår i en konsentrasjon på 0,01 vekt%.
I én utførelsesform er buffermidlet som benyttes trometamin, som inngår i en konsentrasjon på 0,02M. Det foretrekkes at pH av løsningen er 8,0 ved starten av lyofiliseringsprosessen. Løsningen inneholdende det cytotoksiske medikament/bærerkonjugat fordeles på ampuller ved en temperatur på +5°C før starten av prosessen.
I en foretrukket utførelsesform fryses løsningen i ampullene ved en temperatur på - 45°C; den frosne løsningen underkastes et initialt frysetørkingstrinn under et primært tørketrykk på 60 mikron og en lagringstemperatur på -30°C i 60 timer; og det frysetørkede produkt underkastes et andre tørketrinn under et tørketrykk på 60 mikron ved en lagringstemperatur på +25°C i 24 timer.
Et annet aspekt ved oppfinnelsen er rettet mot en blanding som omfatter en terapeutisk effektiv dose av et monomert cytotoksisk medikamentderivat/bærerkonjugat fremstillet etter en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.
I én utførelsesform er bæreren i det monomere cytotoksiske medikament-derival/bærerkonjugat en proteinholdig bærer valgt fra hormoner, vekstfaktorer, antistoffer og antistoffmimetika.
I en foretrukket utførelsesform er den proteinholdige bæreren et humant monoklonalt antistoff, et kimært antistoff, et humant antistoff eller et humanisert antistoff.
I en foretrukket utførelsesform er det humaniserte antistoffet rettet mot celleoverflateantigenet CD22.
I en særlig foretrukket utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen, har anti-CD22-antistoffet spesifisitet for humant CD22 og omfatter en tung kjede, hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av sekvenser som er angitt som Hl i Figur 1 (SEKV.ID.NR: 1) for CDR-H1, som H2 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:2) eller H2'
(SEKV.ID.NR: 13) eller H2" (SEKV.ID.NR: 15) eller H2m (SEKV.ID.NR: 16) for CDR-H2, eller som H3 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:3) for CDR-H3, og omfatter en lett kjede, hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt som LI i
Figur 1 (SEKV.ID.NR:4) for CDR-L1, som L2 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:5) for CDR-L2 eller som L3 i Figur 1 (SEKV.ID.NR:6) for CDR-L3.
I en annen foretrukket utførelsesform har anti-CD22-antistoffet en tung kjede, hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt i SEKV.ID.NR: 1 for CDR-H1, SEKV.K>.NR:2 eller SEKV.ID.NR: 13 eller SEKV.ID.NR: 15 eller SEKV.ID.NR: 16 for CDR-H2, eller SEKV.K>.NR:3 for CDR-H3 og en lett kjede, hvor det variable domenet omfatter en CDR som har minst én av de sekvenser som er angitt i SEKV.ID.NR:4 for CDR-L1, SEKV.ID.NR:5 for CDR-L2 eller SEKV.ID.NR:6 for CDR-L3.
I ytterligere en annen foretrukket utførelsesform omfatter anti-CD22-antistoffet SEKV.ID.NR: 1 for CDR-H1, SEKV.ID.NR:2 eller SEKV.ID.NR: 13 eller SEKV.ID.NR: 15 eller SEKV.ID.NR: 16 for CDR-H2, SEKV.ID.NR:3 for CDR-H3, SEKV.ID.NR:4 for CDR-Ll, SEKV.ID.NR:5 for CDR-L2 og SEKV.ID.NR:6 for CDR-L3.
I en særlig foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet humanisert anti-CD22-antistoff og omfatter en lett kjede variabel region 5/44-gLl (SEKV.ID.NR: 19) og en tung kjede variabel region 5/44-gH7 (SEKV.ID.NR:27).
I en annen særlig foretrukket utførelsesform er det humaniserte anti-CD22-antistoff et CDR-podet antistoff som har spesifisitet for humant CD22 og omfatter en lett kjede som har en sekvens som angitt i SEKV.ID.NR:28 og en tung kjede som har en sekvens angitt i SEKV.ID.NR:30.
I en utførelsesform er det CDR-podede antistoff en antistoffvariant som har øket spesifisitet for humant CD22, og antistoffet oppnås etter en affinitetsmodnings-protokoll.
I én utførelsesform er det monomere cytotoksiske medikament calicheamicin og er fortrinnsvis valgt fra gamma-calicheamicin eller N-acetyl-calicheamicin.
I én utførelsesform kan blandingen eventuelt inneholde et ytterligere bioaktivt middel. Et slikt bioaktivt middel kan være et cytotoksisk medikament, en vekstfaktor eller et hormon.
Ytterligere et annet aspekt ved oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for behandling av et individ med en proliferativ forstyrrelse, ved å administrere vedkommende en terapeutisk effektiv dose av blandingen ifølge oppfinnelsen. Blandingen kan administreres subkutant, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, intramedullært, intratekalt, transdermalt, transkutant, intranasalt, topisk, enteralt, intravaginalt, sublingvalt eller rektalt. I en foretrukket utførelsesform administreres blandingen ifølge oppfinnelsen intravenøst.
I én utførelsesform administreres blandingen til et menneske som lider av en proliferativ forstyrrelse, så som cancer. I en foretrukket utførelsesform er canceren en B-cellemalignitet. B-cellemaligniteten kan være en leukemi eller et lymfom som uttrykker celleoverflateantigen CD22.
I nok en annen utførelsesform er canceren et karsinom eller et sarkom.
Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for behandling av en B-cellemalignitet, ved å administrere en pasient med en slik malignitet en terapeutisk effektiv blanding som omfatter et cytotoksisk medikament-anti-CD22-antistoffkonjugat ifølge oppfinnelsen. I en foretrukket utførelsesform er B-cellemaligniteten et lymfom, særlig nonHodgkins lymfom.
I én utførelsesform velges det cytotoksiske medikament som benyttes til å fremstille konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse blant gruppen bestående av calicheamiciner, tiotepa, taxaner, vincristin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, aktinomycin, autramycin, azaseriner, bleomyciner, tamoxifen, idarubicin, dolastatiner/auristatiner, hemiasterliner, maytansinoider og esperamiciner.
I en foretrukket utførelsesform er det cytotoksiske medikament gamma-calicheamicin eller N-acetyl-calicheamicin.
I en annen utførelsesform omfatter behandlingen administrering av det cytotoksiske medikamentkonjugat ifølge oppfinnelsen med ett eller flere bioaktive midler valgt fra antistoffer, vekstfaktorer, hormoner, cytokiner, anti-hormoner, xantiner, interleukiner, interferoner og cytotoksiske medikamenter.
I en foretrukket utførelsesform er det bioaktive middel et antistoff som er rettet mot et celleoverflateantigen uttrykt på B-cellemaligniteter. I en ytterligere foretrukket utførelsesform velges antistoffet rettet mot celleoverflateantigener uttrykt på B-cellemaligniteter, fra en gruppe bestående av anti-CD19, anti-CD20 og anti-CD33 antistoffer. Slike antistoffer inkluderer anti-CD20-antistoffet rituximab (Rituxan™).
I en annen utførelsesform er de bioaktive midlene cytokiner eller vekstfaktorer og omfatter, men er ikke begrenset til, interleukin 2 (TL-2), TNF, CSF, GM-CSF og G-CSF.
I en annen utførelsesform er bioaktive midler hormoner og omfatter østrogener, androgener, progestiner og kortikosteroider.
I nok en annen utførelsesform er det bioaktive middel et cytotoksisk medikament valgt fra doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, aclarubicin, zorubicin, mitoxantron, epirubicin, carubicin, nogalamycin, menogaril, pitarubicin, valrubicin, cytarabin, gemcitabin, trifluridin, ancitabin, enocitabin, azacitidin, doxifluridin, pentostatin, broxuridin, capecitabin, cladribin, decitabin, floxuridin, fludarabin, gougerotin, puromycin, tegafur, tiazofurin, adriamycin, cisplatin, carboplatin, cyclofosfamamid, dacarbazin, vinblastin, vincristin, mitoxantron, bleomycin, mecloretamin, prednison, procarbazin, metotreksat, fluoruraciler, etoposid, taxol, taxol-analoger og mitomycin.
I en foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive blanding av det cytotoksiske medikament anti-CD22-antistoffkonjugat sammen med én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske midler som del av et behandlingsregime, hvor kombinasjonen av cytotoksiske midler er valgt fra: CHOPP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og procarbazin); CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison); COP (cyklofosfamid, vincristin og prednison); CAP-BOP (cyklofosfamid, doxorubicin, procarbazin, bleomycin, vincristin og prednison); m-BACOD (metotreksat, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, deksametason og leucovorin); ProMACE-MOPP
(prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, mecloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ProMACE-CytaBOM (prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, cytarabin, bleomycin og vincristin); MACOP-B (metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, prednison, bleomycin og leucovorin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin) alternerende med ABV (adriamycin/doxorubicin, bleomycin og vinblastin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); alternerende med ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); ChlVPP (klorambucil, vinblastin, procarbazin og prednison); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat og etoposid); MIME (metyl-gag, ifosfamid, metotreksat og etoposid); DHAP (deksametason, høy-dose cytarabin og cisplastin); ESHAP (etoposid, metylprednisolon, høy-dose cytarabin og cisplatin); CEPP (B) (cyklofosfamid, etoposid, procarbazin, prednison og bleomycin); CAMP (lomustin, mitoxantron, cytarabin, og prednison); og CVP-1 (cyklofosfamid, vincristin og prednison).
I en foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive blanding av det cytotoksiske medikament anti-CD22-antistoffkonjugat før administreringen av én eller flere av ovennevnte kombinasjoner av cytotoksiske medikamenter. I en annen foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive blanding av det cytotoksiske medikament anti-CD22-antistoffkonjugat etter administreringen av én eller flere av ovennevnte kombinasjoner av cytotoksiske medikamenter som del av et behandlingsregime.
Et annet aspekt ved oppfinnelsen er rettet mot den fremgangsmåte for behandling av aggressive lymfomer som omfatter administrering til en pasient med behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv blanding av et monomert calicheamicinderivat anti-CD22-antistoffkonjugat sammen med ett eller flere bioaktive midler.
Ytterligere et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er rettet mot anvendelsen av blandingen ifølge oppfinnelsen til behandling av et individ med en proliferativ forstyrrelse, så som cancer. Spesielt er canceren en B-cellemalignitet som uttrykker CD22-antigen på celleoverflaten. Særlig er B-cellemaligniteten enten en leukemi eller et lymfom. I én utførelsesform er canceren et karsinom eller en leukemi.
I én utførelsesform administreres en terapeutisk effektiv dose av blandingen subkutant, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, intramedullært, intratekalt, transdermalt, transkutant, intranasalt, topisk, enteralt, intravaginalt, sublingvalt eller rektalt.
I en foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive dose av den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen intravenøst.
Et annet aspekt ved oppfinnelsen er rettet mot anvendelsen av et monomert calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk ved behandlingen av et individ med en B-cellemalignitet, så som nonHodgkins lymfom. I en utførelsesform administreres det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse med ett eller flere bioaktive midler.
I én utførelsesform velges de bioaktive midlene fra en gruppe bestående av antistoffer, vekstfaktorer, hormoner, cytokiner, antihormoner, xantiner, interleukiner, interferoner og cytotoksiske medikamenter.
I en foretrukket utførelsesform er det bioaktive middel et antistoff rettet mot et celleoverflateantigen som uttrykkes på B-cellemaligniteter, så som anti-CD19 -, anti-CD20 - og anti-CD3 3-antistoffer. I en foretrukket utførelsesform er anti-CD20-antistoffet rituximab (Rituxan™).
I en annen utførelsesform innbefatter de bioaktive midlene cytokiner eller vekstfaktorer, så som interleukin 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF og G-CSF eller hormoner, som inkluderer østrogener, androgener, progestiner og kortikosteroider.
I en annen utførelsesform er det bioaktive middel et cytotoksisk medikament valgt fra doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, aclarubicin, zorubicin, mitoxantron, epirubicin, carubicin, nogalamycin, menogaril, pitarubicin, valrubicin, cytarabin, gemcitabin, trifluridin, ancitabin, enocitabin, azacitidin, doxifluridin, pentostatin, broxuridin, capecitabin, cladribin, decitabin, floxuridin, fludarabin, gougerotin, puromycin, tegafur, tiazofurin, adriamycin, cisplatin, carboplatin, cyklofosfamid, dacarbazin, vinblastin, vincristin, mitoxantron, bleomycin, mecloretamin, prednison, procarbazin, metotreksat, fluoruacil, etoposid, taxol, taxol-analoger og mitomycin.
I en foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive dose av det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat sammen med én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske midler, som del av et behandlingsregime, hvor kombinasjonen av cytotoksiske midler er valgt fra: CHOPP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og procarbazin); CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison); COP
(cyklofosfamid, vincristin og prednison); CAP-BOP (cyklofosfamid, doxorubicin, procarbazin, bleomycin, vincristin og prednison); m-BACOD (metotreksat, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, deksametason og leucovorin); ProMACE-MOPP (prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, mecloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ProMACE-CytaBOM (prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, cytarabin, bleomycin og vincristin); MACOP-B (metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, prednison, bleomycin og leucovorin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin) alternerende med ABV (adriamycin/doxorubicin, bleomycin og vinblastin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin) alternerende med ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); ChlVPP (klorambucil, vinblastin, procarbazin og prednison); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat og etoposid); MIME (metyl-gag, ifosfamid, metotreksat og etoposid); DHAP (deksametason, høy-dose cytarabin og cisplastin); ESHAP (etoposid, metylprednisolon, høy-dose cytarabin og cisplatin); CEPP (B) (cyklofosfamid, etoposid, procarbazin, prednison og bleomycin); CAMP (lomustin, mitoxantron, cytarabin og prednison); CVP-1 (cyklofosfamid, vincristin og prednison), ESHOP (etoposid, metylprednisolon, høy-dose cytarabin, vincristin og cisplatin); EPOCH (etoposid, vincristin og doxorubicin i 96 timer med bolusdoser av cyklofosfamid og peroral prednison), ICE (ifosfamid, cyklofosfamid og etoposid), CEPP (B)
(cyklofosfamid, etoposid, procarbazin, prednison og bleomycin), CHOP-B (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og bleomycin), CEPP-B (cyklofosfamid, etoposid, procarbazin og bleomycin) samt P/DOCE (epirubicin eller doxorubicin, vincristin, cyklofosfamid og prednison).
I en foretrukket utførelsesform administreres det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat før administreringen av én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske midler som en del av et behandlingsregime.
I en annen foretrukket utførelsesform administreres den terapeutisk effektive dose av det monomere calicheamicin-derivat/anti-CD22-antistoffkonjugat etter administreringen av én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske midler som del av et behandlingsregime.
I nok en annen utførelsesform administreres den terapeutisk effektive dose av det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat sammen med et antistoff rettet mot et celleoverflateantigen på B-cellemaligniteter, og som eventuelt omfatter én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske midler som del av et behandlingsregime.
I henhold til et annet aspekt er oppfinnelsen rettet mot anvendelsen av det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22-antistoffkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremstillingen av et medikament for behandlingen av en proliferativ forstyrrelse. Et slikt medikament kan benyttes til å behandle B-celleproliferasjonsforstyrrelser enten alene eller i kombinasjon med andre bioaktive midler.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 viser aminosyresekvensen av CDR av monoklonalt mus-antistoff 5/44 (SEKV.ID.NR: 1 til 6). Figur 2 viser DNA- og proteinsekvensen av det lett kjede variable (Vl) domenet av monoklonalt mus-antistoff 5/44. Figur 3 viser den fullstendige sekvens av det tung kjede variable domenet (Vh) av monoklonalt mus-antistoff 5/44. Figur 4 viser strategien for fjerning av glykosyleringssetet og reaktivt lysin i CDR-H2. Figur 5 viser podingskonstruksjonen for 5/44 lett kjede sekvensen. DPK-9 er den humane kimlinjeakseptor-framework-sekvens. Vertikale linjer indikerer forskjeller mellom muse- og humane rester. Understrekede sekvenser indikerer donorrester som er blitt bibeholdt i podingen. CDR er indikert i fete kursive bokstaver (ikke vist for DPK-9). Poding gLl har 6 donor-framework-rester, gL2 har 7. Figur 6 viser podingskonstruksjonen for 5/44 tung kjede sekvensen. DP7 er den humane kimlinjeakseptor-framework-sekvens. Vertikale linjer indikerer forskjeller mellom muse- og humane rester. Understrekede sekvenser indikerer donorrester som er blitt bibeholdt i podingen. CDR er indikert kursivert, fete typer (ikke vist for DP7). Podingene gH4 og gH6 har 6 donor-framework-rester. Podinger gH5 og gH7 har 4 donor-framework-rester.
Figur 7 viser kartet over vektor pMRR14.
Figur 8 viser kartet over vektor pMRRl 0.1.
Figur 9 viser Biacore testresultatene av de kimære 5/44 mutantene.
Figur 10 viser oligonukleotidene for 5/44 gHl og gLl gen-sammenstillingene.
Figur 11 viser plasmidkartet av den intermediære vektor pCR2.1 (544gHl).
Figur 12 viser plasmidkartet av den intermediære vektor pCR2.1 (544gLl).
Figur 13 viser oligonukleotidkassettene benyttet til fremstilling av ytterligere podinger. Figur 14 er et diagram som viser en kompetitiv test mellom fluorescensmerket 5/44 mus-antistoff og podede varianter. Figur 15 er et diagram som viser en kompetitiv test mellom fluorescensmerket 5/44 mus-antistoff og podede varianter. Figur 16 viser den fullstendige DNA- og proteinsekvens av de podede tunge og lette kjeder. Figur 17 er en skjematisk fremstilling av et antistoff-NAc-gamma-calicheamicin-DMH-konjugat. Figur 18 er et diagram som viser effekten av CMC-544 på veksten av RAMOS B-cellelymfom. Figur 19 er et diagram som viser effekten av CMC-544 på store B-cellelymfomer i en in vivo xenotransplantatmodell i nakne mus. Figur 20 er et diagram som sammenligner virkningen av CMC-544 oppnådd med CMA-676-konjugasjonsprosessen og CMC-544-konjugasjonsprosessen på veksten av RL-lymfom. Figur 21 er et diagram som viser at rituximab (Rituxan™)-behandlet RL-lymfom er følsom for CMC-544-behandling. Figur 22 er et diagram som viser effekten av rituximab (Rituxan™) på den cytotoksiske effekt av CMC-544. Figur 23 er et diagram som viser effekten av CMC-544, rituximab (Rituxan™) og CMA-676 på overlevelsen til SCID-mus med disseminert tidlig RAMOS B-lymfom. Figur 24 er et diagram som viser effekten av CMC-544, rituximab (Rituxan™) og CMA-676 på overlevelsen til SCID-mus med disseminert sent RAMOS B-lymfom. Figur 25 er et diagram som viser effekten av CMC-544, rituximab (Rituxan™) og CMA-676 på overlevelsen til SCID-mus med disseminert sent RAMOS B-lymfom. Figur 26 er et diagram som viser effekten av CMC-544, rituximab (Rituxan™) og CMA-676 på overlevelsen til SCID-mus med disseminert sent RAMOS B-lymfom. Figur 27 er et diagram som viser effekten av CMC-544, rituximab (Rituxan™) og CMA-676 på overlevelsen til SCID-mus med disseminert sent RAMOS B-lymfom. Figur 28 er et diagram som viser antitumoraktiviteten av CMC-544 med og uten rituximab (Rituxan™) på RL nonHodgkins lymfom. Figur 29 er et diagram som viser antitumoraktiviteten av CMC-544 og CHOP på RL nonHodgkins lymfom.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et cytotoksisk medikament derivatisert med en linker som inkluderer en hvilken som helst reaktiv gruppe som reagerer med en proteinholdig bærer under dannelse av et cytotoksisk medikamentderivat-proteinholdig bærerkonjugat. Nærmere bestemt omfatter konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse et cytotoksisk medikament derivatisert med en linker som inkluderer en hvilken som helst reaktiv gruppe som reagerer med et antistoff benyttet som en proteinholdig bærer for å danne et cytotoksisk medikamentderivat-antistoffkonjugat. Nærmere bestemt reagerer antistoffet mot et celleoverflateantigen på B-cellemaligniteter. Nedenfor beskrives en forbedret fremgangsmåte for fremstilling og rensing av slike konjugater. Anvendelsen av spesielle med-løsningsmidler, tilsetningsstoffer og spesifikke reaksjonsbetingelser sammen med separasjonsprosessen, resulterer i dannelsen av et monomert cytotoksisk medikamentderivat/antistoffkonjugat med en betydelig reduksjon i LCF. Den monomere form har i motsetning til den aggregerte form en betydelig terapeutisk verdi, og minimering av LCF og betydelig reduksjon av aggregasjon resulterer i utnyttelsen av antistoff-utgangsmaterialet på en terapeutisk hensiktsmessig måte ved å forhindre LCF fra konkurranse med den mer høy-konjugerte fraksjon (HCF).
I. BÆRERE
Bærere/målsøkende midler ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis proteinholdige bærere/målsøkende midler. Som bærere/målsøkende midler inngår hormoner, vekstfaktorer, antistoffer, antistoff-fragmenter, antistoffmimetika og deres genetisk eller enzymatisk manipulerte motstykker, heretter omtalt enkeltvis eller som en gruppe som "bærere". Den essensielle egenskap ved en bærer er dens evne til å gjenkjenne og binde til et antigen eller en reseptor assosiert med uønskede celler for senere internalisering. Eksempler på bærere som er anvendelige for foreliggende oppfinnelse er angitt i US-patent 5.053.394, som herved inkorporeres med hele sitt innhold. Foretrukne bærere for bruk for foreliggende oppfinnelse er antistoffer og antistoffmimetika.
En rekke ikke-immunglobulin proteinskjeletter har vært benyttet for å frembringe antistoffmimetika som binder til antigene epitoper med spesifisitet som et antistoff (PCT publikasjonsnummer WO 00/34784). For eksempel har et "minibody" skjelett, som er relatert til immunglobulin-foldingen, blitt konstruert ved å utelate tre beta-tråder fra et tung kjede variabelt domene av et monoklonalt antistoff (Tramontano et al, J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Dette protein inkluderer 61 rester og kan benyttes til presentasjon av to hypervariable sløyfer. Disse to sløyfene har vært randomisert og produktene selektert med henblikk på antigenbinding, men så langt synes dette framework å ha noe begrenset anvendelighet som følge av løselighetsproblemer. Et annet framework benyttet til å fremvise sløyfer er tendamistat, et protein som spesifikt inhiberer pattedyrs alfa-amylaser og er et 74-resters, seks-trådet beta-ark sandwich som holdes sammen av to disulfidbindinger, (McConnell & Hoess, J. Mol. Biol. 250-460, 1995). Dette skjelett inkluderer tre sløyfer, men hittil har bare to av disse sløyfene vært undersøkt med henblikk på randomiseringspotensiale.
Andre proteiner er blitt testet som frameworks og har vært benyttet til å fremvise randomiserte rester på alfa-heliksflater (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995), sløyfer mellom alfa-helikser i alfa-heliksbunter (Ku & Schultz, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:6552, 1995), og sløyfer innesperret av disulfidbroer, så som de av de små proteaseinhibitorene (Markland et al., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland et al, Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen & Collins, Gene 164:243, 1995; Wang et al, J. Biol. Chem. 270:12250, 1995).
Eksempler på antistoffbærere som kan benyttes for foreliggende oppfinnelse er monoklonale antistoffer, kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, humane antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav. Slike antistoffer er fortrinnsvis rettet mot celleoverflateantigener som uttrykkes på målceller og/eller vev ved proliferative forstyrrelser, som f. eks. cancer. Eksempler på spesifikke antistoffer rettet mot celleoverflateantigener på målceller inkluderer, uten begrensning, antistoffer mot CD22-antigen som er overuttrykt på de fleste B-cellelymfomer, G5/44, en humanisert form
av et murint anti-CD22 monoklonalt antistoff; antistoffer mot celleoverflateantigen CD33, som er fremherskende på enkelte humane myeloidtumorer, spesielt akutt myeloid leukemi; hP67.6, en humanisert form av det anti-CD33 murine antistoff (se US-patent 5.773.001); et antistoff mot det PEM-antigen som finnes på mange tumorer av epitelial opprinnelse betegnet mP67.6 (se LD. Bernstein et al. J. Clin. Invest. 79:1153 (1987) og I D. Bernstein et al, !_ Immunol. 128:867-881 (1992));
og et humanisert antistoff mot Lewis Y karbohydrat-antigenet som er overuttrykt på mange solide tumorer betegnet hu3S193, (se US-patent 6.310.185 Bl). I tillegg finnes flere kommersielt tilgjengelige antistoffer, så som rituximab (Rituxan™) og trastuzumab (Herceptin™), som også kan benyttes som bærer/målsøkende midler. Rituximab (Rituxan™) er et kimært anti-CD20-antistoff som benyttes til å behandle forskjellige B-cellelymfomer, og trastuzumab (Herceptin™) er et humanisert anti-Her2-antistoff benyttet til behandling av brystkreft.
Som eksempel for bruk som en bærer i henhold til foreliggende oppfinnelse tjener her et CDR-podet humanisert antistoffmolekyl rettet mot celleoverflateantigen CD22, betegnet G5/44. Dette antistoff er en humanisert form av et murint anti-CD22 monoklonalt antistoff som er rettet mot celleoverflateantigenet CD22, som er fremherskende ved visse humane lymfomer. Betegnelsen "et CDR-podet antistoffmolekyl" refererer seg i denne sammenheng til et antistoffmolekyl hvor den tunge og/eller lette kjede inneholder én eller flere komplementaritets-bestemmende regioner (CDR) eventuelt inklusivt et modifisert CDR (heretter CDR) fra et donor-antistoff (f. eks. et murint monoklonalt antistoff) podet inn i framework av en tung og/eller lett kjede variabel region av et akseptor-antistoff (f.eks. et humant antistoff). Fortrinnsvis har et slikt CDR-podet antistoff et variabelt domene som omfatter humane akseptor-framework-regioner, så vel som én eller flere av de donor CDR som det er referert til ovenfor.
Når disse CDR podes kan enhver passende framework-sekvens for en akseptor-variabel region benyttes som tar hensyn til klassen/typen av det donor-antistoff som disse CDR er avledet fra, inklusivt mus-primat- og humane framework-regioner. Eksempler på humane framework som kan benyttes for foreliggende oppfinnelse er KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY og POM (Kabat et al, Seq. of Proteins of Immunol. Interest, 1:310-334
(1994)). For eksempel kan KOL og NEWM benyttes for den tunge kjede, REI kan benyttes for den lette kjede og EU, LAY og POM kan benyttes for både den tunge kjede og den lette kjede.
I et CDR-podet antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse foretrekkes det som akseptor-antistoffet å benytte ett som har kjeder som er homologe med kjedene til donor-antistoffet. Akseptor tung kjede og lett kjede trenger ikke nødvendigvis å være avledet fra det samme antistoff og kan, om ønskes, omfatte sammensatte kjeder som har framework i regioner avledet fra forskjellige kjeder.
I et CDR-podet antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse trenger dessuten framework-regionene ikke ha eksakt den samme sekvens som antistoff-akseptorens. For eksempel kan uvanlige rester endres til mer hyppig forekommende rester for vedkommende akseptor-kjedeklasse eller type. Alternativt kan utvalgte rester i akseptor-framework-regionene endres slik at de tilsvarer rester som finnes i den samme posisjon i donor-antistoffet, eller til en rest som er en konservativ substitusjon for den rest som finnes i den samme posisjon i donor-antistoffet. Slike endringer bør holdes på det minimum som er nødvendig for å gjenvinne affiniteten av donor-antistoffet. En fremgangsmåte for valget av rester i de akseptor-framework-regioner som trenger å endres, er angitt i PCT Publication No. WO 91/09967, som her i sin helhet inkorporeres ved referanse.
Donorrester er rester fra donor-antistoffet, dvs. det antistoff som disse CDR opprinnelig ble avledet fra.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en tung kjede, hvor det variable domenet som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., ( supra)) omfatter et H2' hvor en potensiell glykosyleringssetesekvens er blitt fjernet for å øke affiniteten av antistoffet for antigenet.
Alternativt eller i tillegg kan antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte en tung kjede hvor det variable domenet som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., ( supra)) omfatter et H2" hvor en lysinrest er i posisjon 60. Denne lysinrest som er lokalisert i en eksponert posisjon i CDR-H2, og som anses å ha evne til å reagere med konjugeringsmidler og resultere i en reduksjon av antigenbindingsaffinitet, erstattes med en alternativ aminosyre.
Dessuten kan antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte en tung kjede, hvor det variable domenet som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., ( supra)) omfatter en H2''' hvor både den potensielle glykosyleringssetesekvens og lysinresten i posisjon 60 erstattes med alternative aminosyrer.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte: et komplett antistoff som har tunge og lette kjeder av full lengde, et biologisk aktivt fragment derav, så som et Fab-, modifisert Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller Fv-fragment; en lett kjede- eller tung kjede-monomer eller -dimer; eller et enkeltkjede antistoff, f. eks. en enkeltkjede Fv, hvor de variable domener av tung og lett kjede er forbundet med en peptidlinker. Tilsvarende kan de variable regioner av tung og lett kjede kombineres med andre hensiktsmessige antistoff domener.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også innbefatte et modifisert Fab-fragment, hvor modifikasjonen er addisjonen av én eller flere aminosyrer for å muliggjøre tilkobling av et effektor- eller rapportørmolekyl til den C-terminale ende av dets tunge kjede. Fortrinnsvis danner de ytterligere aminosyrer en modifisert hengselregion som inneholder én eller to cysteinrester som effektor- eller rapportørmolekylet kan tilkobles.
Konstant-regiondomenene av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan dersom de forekommer, velges med henblikk på den ønskede funksjon av antistoffet, og særlig de effektorfunksjoner som eventuelt måtte trenges. For eksempel kan de konstante regiondomener være humane IgA-, IgD-, IgE-, IgG- eller IgM-domener. Særlig kan humane IgG konstant-regiondomener benyttes, spesielt av IgGl- og IgG3-isotypene når antistoffet er ment for terapeutiske anvendelser og det fordres antistoff-effektorfunksjoner. Alternativt kan IgG2- og IgG4-isotyper benyttes, eller IgGl Fc-regionen være mutert for å oppheve effektorfunksjonen når antistoffet er ment for terapeutiske formål og antistoff-effektorfunksjoner ikke trengs eller ønskes.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse har en bindingsaffinitet på minst 5xlO"<8>M, fortrinnsvis minst lxlO"<9>M, mer foretrukket minst 0,75xlO"<10>M og mest foretrukket minst 0,5x10-10M.
I én utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse immunotoksin-konjugater og fremgangsmåter for fremstilling av disse konjugatene ved å benytte antistoffvarianter eller antistoffmimetika. I en foretrukket utførelsesform er varianter av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse rettet mot CD22 og oppviser forbedret affinitet for CD22. Slike varianter kan oppnås etter en rekke affinitetsmodnings-protokoller, inklusivt mutering av disse CDR (Yang et al, J. Mol. Biol. 254, 392-403, 1995), kjede-stokking (Marks et al, J. Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), bruk av mutatorstammer av E. coli (Low et al, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA-stokking (Patten et al, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), fag-display (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) og kjønnsbundet PCR (Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998).
Ethvert passende vertscelle/vektorsystem kan benyttes for ekspresjonen av de DNA-sekvenser som koder for bæreren som inkluderer antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Bakterielle, for eksempel E. coli, og andre mikrobielle systemer kan benyttes, delvis for ekspresjon av antistoff-fragmenter, så som Fab- og F(ab')2-fragmenter, og spesielt Fv-fragmenter og enkeltkjede-antistoff-fragmenter, for eksempel enkeltkjede Fv. Eukaroyte, f.eks. pattedyr, vertscelle-ekspresjonssystemer kan benyttes for produksjon av større antistoff, inklusivt komplette antistoffmolekyler. Egnede pattedyr-vertsceller inkluderer CHO, myelom, gjærceller, insektceller, hybridomceller, NSO-, VERO- eller PER-C6-celler. Egnede ekspresjonssystemer omfatter også transgene dyr og planter.
H. TERAPEUTISKE MIDLER
De terapeutiske midlene som egner seg for bruk for foreliggende oppfinnelse er cytotoksiske medikamenter som inhiberer eller forstyrrer tubulinpolymerisasjon, alkyleringsmidler som binder til og forstyrrer DNA, og midler som inhiberer proteinsyntese eller essensielle celleproteiner som proteinkinaser, enzymer og cykliner. Eksempler på slike cytotoksiske medikamenter omfatter, men er ikke begrenset til, tiotepa, taxaner, vincristin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, aktinomycin, autramycin, azaseriner, bleomyciner, tamoxifen, idarubicin, dolastatiner/auristatiner, hemiasterliner, calicheamiciner, esperamiciner og maytansinoider. Foretrukne cytotoksiske medikamenter er calicheamicinene, som er et eksempel på metyl-trisulfid-antitumor-antibiotika. Eksempler på calicheamiciner egnet for bruk for foreliggende oppfinnelse er angitt for eksempel i US-patent 4.671.958; US-patent 4.970.198, US-patent 5.053.394, US-patent 5.037.651 og US-patent 5.079.233, som herved inkorporeres med hele deres innhold. Foretrukne calicheamiciner er gamma-calicheamicinderivatene eller N-acetyl-gamma-calicheamicinderivatene.
m. CYTOTOKSISKEMEDIKAMENTDERTVAT/BÆRERKONJUGATER
Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen Pr(-X-W)mhvor:
Pr er en proteinholdig bærer,
X er en linker som omfatter et produkt av en hvilken som helst reaktiv gruppe som kan reagere med en proteinholdig bærer,
W er det cytotoksiske medikament;
m er den gjennomsnittlige lading for et renset konjugasjonsprodukt, slik at calicheamicinet utgjør 4-10 vekt% av konjugatets; og
(-X-W)mer et cytotoksisk medikament.
Fortrinnsvis har X formelen
(CO - Alk<1>- Sp<1>- Ar - Sp2 - Alk<2>- C( Zl) = Q - Sp)
hvor
Alk<1>og Alk<2>uavhengig er en binding eller en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio)-alkylenkjede;
Sp<1>er en binding, -S-, -O-, -CONH-, NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z, hvor X, Y og Z uavhengig er en binding, -NR'-, -S- eller -O- med det forbehold at når n = 0, da må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3-eller 1,4-fenylen, eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C5)-alkyl, (C1-C4)-alkoxy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halgogen, nitro, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', - S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk<1>er en binding, da er Sp<1>en binding;
n er en heltall fra 0 til 5;
R' er en forgrenet eller uforgrenet (Ci-C5)-kjede som eventuelt er substituert med én eller to grupper av -OH, (Ci-C4)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3)-dialkylamino eller (Ci-C3)-trialkylammonium-A", hvor A"er et farmasøytisk akseptabelt anion som kompletterer et salt;
Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen som eventuelt er substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C6)-alkyl, (Ci-Cs)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR',
-CONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)„CONHR', hvor n og R' er som tidligere definert eller et 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-eller 2,7-naftyliden eller
hvor hver naftyliden eller fenotiazin eventuelt er substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-C6)-alkyl, (Ci-C5)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', -CONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR' eller -S(CH2)„CONHR', hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er fenotiazin, da er Sp<1>en binding som bare er forbundet med nitrogen; Sp2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk2 er en binding, da er Sp<2>en binding; Z<1>er H, (Ci-C5)-alkyl eller fenyl som eventuelt er substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C5)-alkyl, (Ci-C5)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -ONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)nCONHR' eller-S(CH2)„CONHR', hvor n og R' er som definert ovenfor;
Sp er et rettkjedet eller forgrenet divalent eller trivalent (Ci-Ci8)-radikal, divalent eller trivalent aryl- eller heteroarylradikal, divalent eller trivalent (C3-Ci8)-cykloalkyl- eller heterocykloalkylradikal, divalent eller trivalent aryl- eller heteroaryl (Ci-Ci8)-radikal, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkylalkyl (Ci-Ci8)-radikal eller divalent eller trivalent (C2-C18) umettet alkylradikal, hvor heteroaryl fortrinnsvis er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokurmarinyl eller fenazinyl og hvor, dersom Sp er et trivalent radikal, Sp ytterligere kan være substituert med lavere (Ci-C5)-dialkylamino, lavere-(Ci-C5)-alkoksy, hydroksy eller lavere-(Ci-C5)-alkyltio grupper; og
Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NHO-.
Fortrinnsvis er Alk<1>en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio)-alkylenkjede; Sp' er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO- eller -NR', hvor R' er som tidligere definert, med det forbehold at når Alk<1>er en binding, da er Sp<1>en binding;
Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen, som eventuelt er substituert med en, to eller tre grupper av (Ci-Ce)-alkyl, (Ci-Cs)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR',
-CONHR', -0(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -0(CH2)nCONHR' eller
-S(CH2)„CONHR', hvor n og R' er som tidligere definert, eller Ar er et 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden, som hver eventuelt er substituert med en, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce)-alkyl, (Ci-Cs)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR'
eller -S(CH2)„CONHR'.
Z<1>er (Ci-Cs)-alkyl, eller fenyl som eventuelt er substituert med en, to eller tre grupper av (Ci-C5)-alkyl, (Ci-C4)-alkoksy, (Ci-C4)-tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)nCONHR' eller -S(CH2)nCONHR'; Alk<2>og Sp<2>sammen utgjør en binding; og Sp og Q er som definert umiddelbart ovenfor.
US-patent 5.773.001 som herved inkorporeres med hele sitt innhold, omtaler linkere som kan benyttes med nukleofile derivater, særlig hydrazider og beslektede nukleofiler, fremstilt fra calicheamicinene. Disse linkerne er spesielt egnet i de tilfeller hvor det oppnås bedre aktivitet når den kobling som dannes mellom medikamentet og linkeren er hydrolyserbar. Disse linkerne inneholder to funksjonelle grupper. En gruppe er typisk en karboksylsyre som anvendes til å reagere med bæreren. Den sure funksjonelle gruppe kan, når den er riktig aktivert, danne en amidkobling med en fri aminogruppe på bæreren, som for eksempel aminet i sidekjeden av et lysin på et antistoff eller annen proteinholdig bærer. Den andre funksjonelle gruppe er vanligvis en karbonylgruppe, dvs. et aldehyd eller et keton, som vil reagere med det riktig modifiserte terapeutiske middel. Karbonylgruppene kan reagere med en hydrazidgruppe på medikamentet for å danne en hydrazontilkobling. Denne tilkoblingen er hydrolyserbar og muliggjør frigjøring av det terapeutiske middel fra konjugatet etter binding til målcellene.
En særlig foretrukket bifunksjonell linker for bruk for foreliggende oppfinnelse er 4-(4-acetylfenoksy)-butansyre (AcBut), som resulterer i et foretrukket produkt, hvor konjugatet består av P-calicheamicin, y-calicheamicin eller N-acetyl- y-calicheamicin funksjonalisert ved reaksjon med 3-merkapto-3-metyl-butanoylhydrazid, AcBut-linkeren og en human eller humanisert IgG antistoff målsøkende bærer.
IV. MONOMER KONJUGASJON
Den naturlige hydrofobe natur av mange cytotoksiske medikamenter, inklusivt calicheamicinene, forårsaker vanskeligheter ved fremstilling av monomere medikamentkonjugater med god medikamentlading og et rimelig utbytte som er nødvendig for terapeutiske anvendelser. Den økte hydrofobitet av den kobling som bevirkes av linkere, så som AcBut linkeren, angitt i US-patent 5.773.001, så vel som den økte kovalente distanse som separerer det terapeutiske middel fra bæreren (antistoff) forsterker dette problem.
Aggregasjon av cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugater med høyere medikamentladinger skjer som følge av medikamentenes hydrofobe natur. Medikamentladingen må ofte begrenses for å oppnå rimelige mengder monomert produkt. I enkelte tilfeller, som f.eks. med konjugatene i US-patent 5.877.296, er det ofte vanskelig å fremstille konjugater i rimelige utbytter med egnede ladinger for terapeutisk anvendelse ved å benytte de reaksjonsbetingelser som er angitt i US-patent 5.053.394 som følge av uvanlig sterk aggregasjon. Disse reaksjonsbetingelsene benyttet DMF som med-løsningsmiddel i konj ugasjonsreaksj onen. Det er derfor behov for metoder som muliggjør høyere medikamentlading/utbytte uten aggregering og det naturlige materialtap.
Forbedringer for å redusere aggregasjon er beskrevet i US-patent 5.712.374 og 5.714.586, som herved inkorporeres med hele deres innhold. I disse patentene omtales proteinholdige bærere som omfatter, men ikke er begrenset til, proteiner som f.eks. humane eller humaniserte antistoffer som benyttes til målretting av de cytotoksiske terapeutiske midlene, som for eksempel hP67.6 og de andre humaniserte antistoff som der er angitt. I patentene ble anvendelsen av en ikke-nukleofil, proteinforlikelig, bufferholdig løsning inneholdende (i) propylenglykol som med-løsningsmiddel og (ii) et additiv omfattende minst én C6-Ci8-karboksylsyre funnet generelt å produsere monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugater med høyere medikamentlading/utbytte og nedsatt aggregasjon som hadde utmerket aktivitet. Foretrukne syrer som der er beskrevet var C7til C12syrer, og den mest foretrukne syre var oktansyre (så som kaprylsyre) eller dens salter. Foretrukne bufferholdige løsninger for konjugater fremstilt av N-hydroksysuccinimid-(Osu) estere eller andre sammenlignbare aktiverte estere, var fosfatet-buffret saltvann (PBS) eller N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre (HEPES buffer). Den bufferholdige løsning benyttet i disse konj ugasjonsreaksj onene kan ikke fri aminer eller nukleofiler. For andre typer konjugater, kan akseptable buffere lett bestemmes. Som et alternativ ble anvendelsen av en ikke-nukleofil, proteinforlikelig, bufferholdig løsning inneholdende t-butanol uten det ytterligere additiv, funnet å gi monomere calicheamicinderivat/bærerkonjugater med høyere medikamentlading/utbytte og minsket aggregasjon.
Den mengde med-løsningsmiddel som trengs for å danne et monomert konjugat, varierer noe fra protein til protein og kan bestemmes av fagmannen uten urimelig eksperimentering. Den mengde additiv som er nødvendig for effektivt å danne et monomert konjugat varierer også fra antistoff til antistoff. Denne mengde kan også bestemmes av fagmannen uten urimelig eksperimentering. I US-patent 5.712.374 og 5.714. 586, ble det tilsatt propylenglykol i mengder varierende fra 10 vol% til 60 vol%, fortrinnsvis 10 vol% til 40 vol% og mest foretrukket ca. 30 vol% av den totale løsning, og en tilsetning omfattende minst én C6-Ci8-karboksylsyre eller dens salt, fortrinnsvis kaprylsyre eller dens salt, i mengder varierende fra 20 mM til 100 mM, fortrinnsvis fra 40 mM til 90 mM og mest foretrukket ca. 60 mM til 90 mM til konj ugasjonsreaksj oner for å fremstille monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugater med høyere medikamentlading/utbytte og minsket aggregasjon. Andre proteinforlikelige organiske med-løsningsmidler utenom propylenglykol, så som etylenglykol, etanol, DMF, DMSO, etc. kunne også benyttes. Enkelte, eller alle de organiske med-løsningsmidlene ble benyttet til å overføre medikamentet til konjuga-sjonsblandingen.
I nevnte patenter kan konsentrasjonen av C6-C18-karboksylsyren eller dens salt, alternativt økes til 150-300 mM og med-løsningsmidlet senkes til 1-10%. I én utførelsesform var karboksylsyren oktansyre eller dens salt. I en foretrukket utførelsesform var karboksylsyren dekansyre eller dens salt. I en annen foretrukket utførelsesform var karboksylsyren kaprylsyre eller dens salt, som inngikk i en konsentrasjon på 200 mM kaprylsyre sammen med 5% propylenglykol eller etanol.
I en annen alternativ utførelsesform av nevnte patenter kunne t-butanol tilsettes i konsentrasjoner varierende fra 10 vol% til 25 vol%, fortrinnsvis 15 vol% av totalløsningen, til konjugasjonsreaksjonen for å fremstille monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugater med høyere medikamentlading/utbytte og minsket aggregasjon.
Disse etablerte konjugasjonsbetingelsene ble anvendt for dannelsen av CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin), som nå omsettes kommersielt som Mylotarg™. Siden innføringen av denne behandling for akutt myeloid leukemi (AML) har man erfart gjennom bruk av ionebytter-kromatografi at calicheamicinet ikke fordeles på antistoffet på en jevn måte. Det meste av calicheamicinet er på ca. halvparten av antistoffet, mens den andre halvdel eksisterer i et LCF som inneholder kun små mengder calicheamicin. Det er følgelig et avgjørende behov for å forbedre fremgangsmåtene for konjugering av cytotoksiske medikamenter, så som calicheamiciner, til bærere som minsker graden av aggregasjon og som muliggjør en jevnere medikamentlading med et vesentlig forbedret utbytte av konjugatproduktet.
Et spesifikt eksempel er det hvor G5/44-NAc-gamma-calicheamicin DMH AcBut-konjugatet, som omtales som CMC-544 og som er vist generisk i Figur 17. Reduksjonen av mengden av LCF til <10% av det totale antistoff var ønskelig for utvikling av CMC-544 og ulike muligheter for reduksjon av nivåene av LCF ble vurdert. Andre egenskaper ved immunkonjugatet, så som antigenbinding og cytotoksisitet, må ikke påvirkes av den endelige løsning. De vurderte muligheter omfattet genetisk eller fysisk modifikasjon av antistoffet, de kromatografiske separasjonsteknikkene eller modifikasjonen av reaksjonsbetingelsene.
Reaksjon av G5/44 antistoffet med NAc-gamma-calicheamicin DMH AcBut Osu ved å benytte de gamle reaksjonsbetingelsene (CMA-676 Process Conditions) resulterte i et produkt med lignende fysiske egenskaper (medikamentlading, LCF og aggregasjon) som CMA-676. Det høye nivå (50-60%) av LCF som forekom etter konjugasjon ble imidlertid ansett som uønsket. Optimale reaksjonsbetingelser ble bestemt gjennom statistisk eksperimentell design metodikk, hvor vesentlige reaksjonsvariabler, så som temperatur, pH, tilførsel av calicheamicinderivat og additiv-konsentrasjon, ble vurdert. Analyse av disse eksperimentene viste at calicheamicin-tilførsel og additiv-konsentrasjon hadde de mest signifikante virkninger på nivået av den lavt konjugerte fraksjon LCF og aggregatdannelse, mens temperatur og pH ga mindre påvirkninger. I ytterligere forsøk ble det også vist at konsentrasjonene av proteinbærer (antistoff) og med-løsningsmiddel (etanol) likeledes var av mindre betydning (sammenlignet med calicheamicin-tilførsel og additiv-konsentrasjon) til å kontrollere LCF og aggregatnivåer. For å redusere LCF til <10% ble calicheamicinderivat-tilførselen øket fra 3% til 8,5% (vekt/vekt) i forhold til mengden antistoff i reaksjonen. Additivet ble endret fra oktansyre eller dens salt i en konsentrasjon på 200 mM (CMA-676 prosess) til dekansyre eller dens salt i en konsentrasjon på 37,5 mM. Konj ugasjonsreaksj onen forløp bedre ved svakt forhøyet temperatur (30-35°C) og pH (8,2-8,7). I reaksjonsbetingelsene hvor disse endringene inngikk, reduserte LCF til under 10% samtidig med økning av calicheamicin-lading, og er heretter omtalt som CMC-544 prosessbetingelsene eller "nye" prosessbetingelser. En sammenligning av resultatene oppnådd med CMA-676 og CMC-544 prosessbetingelsene er vist i Tabell 1.
Økningen i tilførselsen av calicheamicin økte medikamentladingen fra 2,5-
3,0 vektprosent til 7,0-9,0 (mest hyppig 7,5-8,5) vektprosent, og resulterte ikke i noen økning i proteinaggregasjon under reaksjonen. Som følge av reduksjon av aggregat og LCF resulterte CMC-544 prosessbetingelsene i et mer homogent produkt. CMC-544 har vært fremstilt reproduserbart ved hjelp av denne nye konjugasjonsprosess i multigram antistoffskala.
I ovennevnte reaksjoner kan konsentrasjonen av antistoff variere fra 1 til 15 mg/mL og konsentrasjonen av calicheamicinderivatet, f.eks. N-acetyl-gamma-calicheamicin DMH AcBut Osu-ester (benyttet til fremstilling av konjugatene vist i Figur 17), varierer fra ca. 4,5-11 vektprosent av antistoffet. Med-løsningsmidlet var etanol, og for dette har det vært vist gode resultater i konsentrasjoner varierende fra 6 til 11,4% (volumbasis). Reaksjonene ble foretatt i PBS, HEPES, N-(2-hydroksyetyl)piperazin-N'-(4-butansulfonsyre) (HEPBS) eller andre forlikelige buffere ved pH 8-9, ved en temperatur varierende fra 30°C til ca. 35°C og i tidsrom varierende fra 15 minutter til 24 timer. Fagmannen på området kan lett bestemme akseptable pH-områder for andre konjugattyper. For forskjellige antistoffer har anvendelsen av små variasjoner i kombinasjonene av ovennevnte tilsetningsstoffer vist seg å forbedre medikamentlading og utbytte av monomert konjugat, og det er underforstått at enhver proteinbærer kan fordre enkelte mindre endringer i de eksakte betingelser eller valg av additiver for å oppnå de optimale resultater.
V. KONJUGATRENSING OG SEPARASJON
Etter konjugering kan de monomere konjugatene separeres fra ukonjugerte reaktanter (så som proteinholdig bærer og fritt cytotoksisk medikament/calicheamicin og/eller den aggregerte form av konjugatene ved hjelp av konvensjonelle metoder som for eksempel SEC (size exclusion chromatography), hydrofob interaksjonskromotografi (HIC), ionebytterkromotografi (TEC) eller kromatofokusering (CF). De rensede konjugatene er monomere og inneholder vanligvis fra 4 til 10 vekt% cytotoksisk medikament/calicheamicin. I en foretrukket utførelsesform renses konjugatene ved å benytte hydrofob interaksjonskromotografi (HIC). I de fremgangsmåter som tidligere ble benyttet for fremstilling i produksjonsskala av cytotoksisk medikament/calicheamicin-antistoffkonjugater (CMA-676 prosess), var det eneste separasjonstrinn etter konjugasjon som ble benyttet, SEC. Selv om dette trinn er ganske effektivt, både til å fjerne aggregert konjugat og bevirke bufferutveksling for formulering, er det ineffektivt til å redusere LCF-innholdet. Den SEC-baserte prosess er fullstendig basert på kjemien i konj ugasjonsreaksj onen for å kontrollere LCF-innholdet av det endelige produkt. En annen ulempe ved SEC er begrensningen av det volum av konjugatreaksjonsblanding som påføres kolonnen (typisk ikke over 5% av prosesskolonnens pakningsvolum). Dette begrenser sterkt den satsstørrelse (og derfor produksjonskapasiteten) som kan understøttes i et gitt produksjonsrom. Endelig resulterer SEC-renseprosessen også i betydelig fortynning av konjugatløsningen, hvilket innsnevrer den proteinkonsentrasjon som med pålitelighet kan oppnås i formuleringen.
Når et cytotoksisk medikament har en sterkt hydrofob natur, så som et calicheamicinderivat, og benyttes i et konjugat, er hydrofob interaksjonskromotografi (HIC) en foretrukket kandidat for å gi effektiv separasjon av konjugert og ukonjugert antistoff. HIC byr på tre hovedfordeler fremfor SEC: (1) den har evne til effektivt å redusere LCF-innholdet så vel som aggregatet; (2) kolonnebelastningskapasiteten for HIC er meget høyere; og (3) HIC unngår urimelig sterk fortynning av produktet.
En rekke HIC-medier med høy kapasitet egnet for bruk i produksjonsskala, så som Butyl, Phenyl and Octyl Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Bioscienses, Piscataway, NJ), kan effektivt separere ukonjugerte komponenter og aggregater av konjugatet fra monomere konjugerte komponenter etter konjugasjonsprosessen.
VI. SAMMENSETNINGER OG FORMULERINGER
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk eller diagnostisk blanding/formulering som omfatter at det monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse blandes med et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, fortynningsmiddel eller bærer.
Det monomere cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugat kan være det eneste virkestoff i den terapeutiske eller diagnostiske blanding/formulering eller inngå sammen med andre virkestoffer, inklusivt andre antistoffingredienser, for eksempel anti-CD19, anti-CD20, anti-CD33, anti-T-celle, anti-IFNy eller anti-LPS-antistoffer, eller ikke-antistoffingredienser, så som cytokiner, vekstfaktorer, hormoner, antihormoner, cytotoksiske medikamenter og xantiner.
Cytokiner og vekstfaktorer som kan benyttes til å behandle proliferative sykdommer, så som cancer, og som kan benyttes sammen med de cytotoksiske
medikamentderivat/bærerkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter interferoner, interleukiner, så som interleukin 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF og G-CSF.
Hormoner som vanligvis benyttes til å behandle proliferative forstyrrelser, så som cancer og som kan benyttes sammen med de cytotoksiske medikamentderivat/- bærerkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter østrogener, så som dietylstilbøstrol og østradiol, androgener, så som testosteron og Halotestin, progestiner så som Megace og Provera, samt kortikosteroider, så som prednison, deksametason og hydrokortison.
Antihormoner som antiøstrogener, dvs. tamoxifen, antiandrogener dvs. flutamid og antiadrenale midler er vanlig benyttet til å behandle proliferative forstyrrelser, så som cancer, og kan benyttes sammen med det cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse.
Kjemoterapeutika/antineoplastiske midler som vanligvis benyttes til behandling av proliferative forstyrrelser, så som cancer, og som kan benyttes sammen med det cytotoksiske medikamentderivat/bærerkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter, men er ikke begrenset til, adriamycin, cisplatin, carboplatin, vinblastin, vincristin, bleomycin, metotreksat, doxorubicin, fluoruraciler, etoposid, taxol og dets forskjellige analoger, samt mitomycin.
Blandingene bør fortrinnsvis omfatte en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat ifølge oppfinnelsen. Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" refererer seg i denne sammenheng til en mengde av et terapeutisk middel som trengs for å behandle, lindre eller forhindre en målsøkt sykdom eller tilstand eller for å oppvise en påvisbar terapeutisk eller forebyggende effekt. For ethvert konjugat kan en terapeutisk effektiv dose initialt anslås enten i cellekulturtester eller i dyremodeller, vanligvis i gnagere, kaniner, hunder, svin eller primater. Dyremodellen kan også benyttes for å bestemme det riktige konsentrasjonsområdet og administrasjonsmåten. Slik informasjon kan deretter benyttes til å bestemme egnede doser og administrasjonsmåter for mennesker.
Den nøyaktige effektive mengde for et menneske vil avhenge av alvoret av sykdomstilstanden, individets generelle helsetilstand, alder, vekt og kjønn av vedkommende, diett, tidspunkt for og hyppigheten av administrering, medikamentkombinasjoner, reaksjonsfølsomheter og toleranse/respons på terapien. Denne mengde kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering og ligger innenfor klinikerens vurderingsevne. I alminnelighet vil en effektiv dose være fra 0,1 mg/m<2>, til 50 mg/m<2>, fortrinnsvis 0,4 mg/m<2>til 30 mg/m<2>, mer foretrukket 2 mg/m<2>til 9 mg/m<2>, en dose som beregnes på basis av den proteinholdige bærer.
Blandinger kan administreres individuelt til en pasient eller administreres i kombinasjon med andre midler, medikamenter eller hormoner. Dosen som det monomere cytotoksiske medikamentderivat/antistoffkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i, avhenger av naturen av den tilstand som skal behandles, graden av malignt lymfom eller leukemi og om hvorvidt konjugatet benyttes profylaktisk eller for å behandle en eksisterende tilstand.
Doseringshyppigheten vil avhenge av halveringstiden av konjugatet og varigheten av dets effekt. Dersom konjugatet har en kort halveringstid (f.eks. 2 til 10 timer), kan det være nødvendig å gi én eller flere doser per dag. Dersom konjugatmolekylet alternativt har en lang halveringstid (f.eks. 2 til 15 dager), vil det bare være nødvendig å gi en dosering én gang per dag, en gang per uke eller endog én gang hver eller annenhver måned.
En blanding kan også inneholde en farmasøytisk akseptabel bærer for administrering av antistoffkonjugatet. Bæreren bør ikke selv indusere produksjonen av antistoffer som er skadelige for vedkommende som får blandingen og må ikke være giftig. Egnede bærere kan være store, langsomt metaboliserende makromolekyler, så som proteiner, polypeptider, liposomer, polysakkarider, poly-melkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyre-kopolymerer og inaktive viruspartikler.
Farmasøytisk akseptable salter, som for eksempel mineralsyresalter, så som hydroklorider, hydrobromider, fosfater og sulfater eller salter av organiske syrer, så som acetater, propionater, malonater og benzoater, kan benyttes.
Farmasøytisk akseptable bærere i disse blandingene kan dessuten inneholde væsker, så som vann, saltvann, glyserol og etanol. Dessuten kan hjelpesubstanser så som fukte- eller emulgeringsmiddel eller pH-buffere inngå i slike blandinger. Slike bærere gjør det mulig å benytte blandingene til formulering som tabletter, piller, drasjer, kapsler, væsker, gel, siruper, oppslemminger eller suspensjoner til inntak for pasienten.
Foretrukne former for administrering omfatter former egnet for parenteral administrering, f.eks. ved injeksjon eller infusjon, for eksempel ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Når produktet er for injeksjon eller infusjon, kan det ha form av en suspensjon, oppløsning eller emulsjon i en oljebasert eller vannbasert bærer og den kan inneholde formuleringsmidler, så som suspenderings-, konserverings-, stabiliserings- og/eller dispergeringsmidler.
Selv om stabiliteten av de buffrede konjugatløsningene er tilstrekkelig for korttids-stabilitet, er langtidsstabiliteten dårlig. For å forbedre stabiliteten av konjugatet og øke dets holdbarhet, kan antistoff-medikamentkonjugatet lyofiliseres til tørr form, for rekonstituering før bruk med en passende steril væske. De problemer som er forbundet med lyofilisering av en proteinløsning er grundig dokumentert. Tap av sekundær, tertiær og kvaternær struktur kan forekomme under fryse- og tørkeprosesser. Kryoprotektiva kan følgelig måtte inkluderes for å virke som en amorf stabilisator av konjugatet og for å opprettholde proteinets strukturelle integritet under lyofiliseringsprosessen. I én utførelsesform er den kryoprotektant som er egnet for foreliggende oppfinnelse en sukkeralkohol, så som alditol, mannitol, sorbitol, inositol, polyetylenglykol og kombinasjoner derav. I en annen utførelsesform er kryoprotektanten en sukkersyre, inklusivt en aldonsyre, en uronsyre, en aldarsyre og kombinasjoner derav.
Kryoprotektanten ifølge denne oppfinnelse kan også være et karbohydrat. Egnede karbohydrater er aldehyd- eller ketonforbindelser som inneholder to eller flere hydroksylgrupper. Karbohydratene kan være sykliske eller rettkjedede og omfatter for eksempel aldoser, ketoser, aminosukkere, alditoler, inositoler, aldonsyrer, uronsyrer eller aldarsyrer eller kombinasjoner derav. Karbohydratene kan også være et mono-, et di- eller et polykarbohydrat som for eksempel et disakkarid eller polysakkarid. Egnede karbohydrater er for eksempel glyceraldehyder, arabinose, lyxose, pentose, ribose, xylose, galaktose, glukose, heksose, idose, mannose, talose, heptose, glukose, fruktose, glukonsyre, sorbitol, laktose, mannitol, metyl- a-glukopyranosid, maltose, isoaskorbinsyre, askorbinsyre, lakton, sorbose, glutarsyre, erytrose, treose, arabinose, allose, altrose, gulose, idose, talose, erytrulose, ribulose, xylulose, psicose, tagatose, glukuronsyre, glukonsyre, glutarsyre, galakturonsyre, mannuronsyre, glukosamin, galaktosamin, sakkarose, trehalose eller neuraminsyre eller derivater derav. Egnede polykarbohydrater omfatter for eksempel arabinaner, fruktaner, fukaner, galaktaner, galakturonaner, glukaner, mannaner, xylaner (som for eksempel inulin), levan, fucoidan, karrageenan, galaktocarolose, pektiner, pektinsyrer, amylose, pullulan, glykogen, amylopektin, cellulose, dekstran, pustulan, chitin, agarose, keratin, kondroitin, dermatan, hyaluronsyre, alginsyre, xantingummi eller stivelse. Blant de særlig egnede karbohydrater er sakkarose, glukose, laktose, trehalose og kombinasjoner derav. Sakkarose er en særlig anvendelig kryoprotektant.
Fortrinnsvis er kryoprotektanten ifølge foreliggende oppfinnelse et karbohydrat eller en "sukker"-alkohol som kan være en flerverdig alkohol. Flerverdige alkoholforbindelser er forbindelser som inneholder mer enn en hydroksylgruppe. Fortrinnsvis er de flerverdige alkoholforbindelsene rettkjedede. Egnede flerverdige alkoholforbindelser innbefatter for eksempel glykoler, så som etylenglykol, polyetylenglykol og polypropylenglykol, glycerol eller pentaerytritol eller kombinasjoner derav.
I enkelte foretrukne utførelsesformer er kryoprotektanten sakkarose, trehalose, mannitol eller sorbitol.
Etter at blandingene ifølge oppfinnelsen er formulert kan de administreres direkte til angjeldende individ. De individer som behandles kan være dyr. Det er imidlertid å foretrekke at blandingene er tilpasset administrering til mennesker.
Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres etter en hvilken som helst administrasjonsmåte, inklusivt, men ikke begrenset til, peroralt, intravenøst, intramuskulært, intraarterielt, intramedullært, intratekalt, intraventrikulært, transdermalt, transkutant (se PCT publikasjon nr. WO 98/20734), subkutant, intraperitonealt, intranasalt, enteralt, topisk, sublingvalt, intravaginalt eller rektalt. Hypospray kan også benyttes for å administrere blandingene ifølge oppfinnelsen. I alminnelighet kan blandingene tilberedes som injeksjonvæsker, enten som flytende løsninger eller suspensjoner. Faste former egnet for oppløsning i eller suspensjon i flytende bærere før injeksjon, kan også fremstilles.
Direkte avlevering av blandingene vil i alminnelighet kunne oppnås ved injeksjon, subkutant, intraperitonealt, intravenøst eller intramuskulært eller avgis til det interstitielle rom i et vev. Blandingene kan også administreres i en lesjon. Doseringen kan være som en enkeltdose eller som flerdoser.
Virkestoffet i blandingen vil være et cytotoksisk medikament/proteinaktig bærerkonjugat. Det vil som sådant være utsatt for nedbryting i gastrointestinaltrakten. Dersom blandingen skal administreres via gastrointestinaltrakten må blandingen følgelig inneholde midler som beskytter konjugatet fra nedbrytning, men frigir konjugatet etter at det er absorbert fra gastrointestinaltrakten.
En grundig omtale av farmasøytisk akseptable bærere finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer særlig et monomert calicheamicinderivat/humanisert anti-CD22-antistoff (G5/44), CMC-544, for bruk ved behandling av proliferative forstyrrelser, som kjennetegnes ved at celler uttrykker CD22-antigen på deres overflate.
Foreliggende oppfinnelse sørger dessuten for anvendelsen av CMC-544 ved fremstillingen av en blanding eller et medikament til behandling av en proliferativ forstyrrelse som kjennetegnes ved at celler uttrykker CD22. CMC-544 kan også benyttes for enhver terapi hvor det er ønskelig å redusere det CD22-uttrykkende cellenivå som forekommer i individet som behandles med blandingen eller et her beskrevet medikament. Nærmere bestemt benyttes blandingen eller medikamentet til å behandle mennesker eller dyr med proliferative forstyrrelser, nemlig lymfomer og leukemier, som uttrykker CD22-antigen på celleoverflaten. Disse CD22-uttrykkende celler kan sirkulere i kroppen eller forekomme i et urimelig stort antall lokalisert i et bestemt sted i kroppen. CMC-544 kan også fortrinnsvis benyttes til behandling av sykdommer av B-lymfocyttlinjen, inklusivt lymfomer og leukemier, mest foretrukket nonHodgkins lymfom (NHL), akutt lymfatisk leukemi (ALL), multippelt myelom, akutt lymfatisk leukemi (ALL) og kronisk lymfatisk leukemi (KLL). CMC-544 kan benyttes alene eller i kombinasjon med andre bioaktive midler til å behandle individer som lider av B-cellesykdommer.
Bioaktive midler som vanligvis benyttes omfatter vekstfaktorer, cytokiner og cytotoksiske medikamenter. Cytotoksiske medikamenter som vanligvis benyttes til å behandle proliferative lidelser som cancer, og som kan benyttes sammen med CMC-544, omfatter et antracyklin, så som doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, aclarubicin, zorubicin, mitoxantron, epirubicin, carubicin, nogalamycin, menogaril, pitarubicin og valrubicin i opp til tre dager; og et pyrimidin- eller purinnukleosid, så som cytarabin, gemcitabin, trifluridin, ancitabin, enocitabin, azacitidin, doxifluridin, pentostatin, broxuridin, capecitabin, cladribin, dectabin, floxuridin, flutarabin, gougerotin, puromycin, tegafur, tiazofurin. Andre kjemoterapeutiske/antineoplastiske midler som kan administreres i kombinasjon med CMC-544 er adriamycin, cisplatin, carboplatin, cyklofosfamid, dacarbazin, vinblastin, vincristin, mitoxantron, bleomycin, mecloretamin, prednison, procarbazin, metotreksat, fluoruraciler, etoposid, taxol og dens forskjellige analoger, samt mitomycin. CMC-544 kan administreres samtidig med ett eller flere av disse terapeutiske midlene. Alternativt kan CMC-544 administreres suksessivt med ett eller flere av disse terapeutiske midlene. CMC-544 kan også administreres alene, sammen med eller suksessivt med en kombinasjon av andre bioaktive midler, som f.eks. vekstfaktorer, cytokiner, steroider, antistoffer, så som anti-CD20-antistoff, rituximab (Rituxan™) og kjemoterapeutiske midler som en del av et behandlingsregime. Etablerte behandlingsregimer for behandlingen av maligne lymfoproliferative forstyrrelser omfatter CHOPP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og procarbazin); CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison); COP (cyklofosfamid, vincristin og prednison); CAP-BOP (cyklofosfamid, doxorubicin, procarbazin, bleomycin, vincristin og prednison); m-BACOD (metotreksat, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, deksametason og leucovorin); ProMACE-MOPP (prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, mecloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ProMACE-CytaBOM (prednison, metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, cytarabin, bleomycin og vincristin); MACOP-B (metotreksat, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, fast dose prednison, bleomycin og leucovorin); MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin); ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin); MOPP alternerende med AB V (adriamycin/doxorubicin, bleomycin og vinblastin), og MOPP (mechloetamin, vincristin, prednison og procarbazin) alternerende med ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dacarbazin), og ChlVPP (klorambucil, vinblastin, procarbazin og prednison). Terapi kan omfatte en induksjonsterapifase, en konsolideringsterapifase og en vedlikeholdsterapifase. CMC-544 kan også administreres alene, samtidig med eller suksessivt med hvilken som helst av ovennevnte behandlingsregimer som del av en induksjonsterapifase, en konsolideringsterapifase og en vedlikeholdsterapifase.
Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres sammen med andre bioaktive og kjemoterapeutiske midler som en del av kombinasjonskjemoterapiregimet for behandlingen av residiv av aggressive lymfomer. Et slikt behandlingsregime inkluderer LMVP-16 (ifosfamid, metotreksat og etoposid), MLME (metyl-gag, ifosfamid, metotreksat og etoposid), DHAP (deksametason, høy-dose cytarabin og cisplatin), ESHAP (etoposid, metylprednisolon, høy-dose cytarabin og cisplatin), EPOCH (etoposid, vincristin og doxorubicin i 96 timer med bolusdoser av cyklofosfamid og peroral prednison), CEPP (B)
(cyklofosfamid, etoposid, procarbazin, prednison og bleomycin), CAMP (lomustin,
mitoxantron, cytarabin og prednison), CVP-1 (cyklofosfamid, vincristin og prednison), CHOP-B (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og bleomycin), CEPP-B (cyklofosfamid, etoposid, procarbazin og bleomycin), og P/DOCE (epirubicin eller doxorubicin, vincristin, cyklofosfamid og prednison). Ytterligere behandlingsregimer for aggressive lymfomer kan i fase 1 omfatte en førstelinjebehandling med CHOP-(cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison) rituximab (Rituxan™), CMC-544, etterfulgt i fase 2 og fase 3 med CHOP-rituximab (Rituxan™), CHOP-CMC-544 eller CHOP-rituximab (Rituxan™) -CMC-544. Alternativt kan fase 1 ha en førstelinjebehandling med COP- (cyklofosfamid, vincristin og prednison) rituximab (Rituxan™) -CMC-544, etterfulgt i fase 2 og fase 3 av COP-rituximab (Rituxan™) -COP-CMC-544 eller COP-rituximab (Rituxan™) -CMC-544.1 en ytterligere utførelsesform kan behandling av aggressive lymfomer inkludere en første- eller andrelinjebehandling med antistoffmedikamentkonjugatet CMC-544 i fase 1, etterfulgt i fase 2 og 3 av CMC-544 og CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison), CMC-544 og COP (cyklofosfamid, vincristin og prednison), CMC-544 med rituximab (Rituxan™) eller rituximab (Rituxan™) alene. I ytterligere en annen utførelsesform kan behandlingen av aggressive lymfomer inkludere en førstelinjebehandling med antistoffmedikamentkonjugatet CMC-544, etterfulgt i fase 2 og 3 med CMC-544 alene eller i kombinasjon med andre behandlingsregimer inklusivt, men ikke begrenset til, ESHOP (etoposid, metylprednisolon, høy-dose cytarabin, vincristin og cisplatin), EPOCH (etoposid, vincristin og doxorubicin i 96 timer med bolusdoser av cyklofosfamid og peroral prednison), IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat og etoposid), ASHAP (adriamycin, solumedrol, Ara-C og cisplatin), MIME (metyl-gag, ifosfamid, metotreksat og etoposid) og ICE (ifosfamid, cyklofosfamid og etoposid). Detaljer angående forskjellige cytotoksiske medikamenter benyttet innen kjemoterapi ved sykdommer, inklusivt kjemoterapeutiske kombinasjonsregimer, doseringer etc, som tilveiebringes gjennom denne søknad, finnes i Cancer Principles and Practice of Oncology, red. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, 6. utg. forlag: Lippincott, Williams and Wilkins (2001) og Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, red. Edward Chu og Vincent T. DeVita, forlag: Jones and Bartlett, (2002).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for behandling av mennesker og dyr som lider av eller er utsatt for en proliferativ forstyrrelse, som kjennetegnes ved celler som uttrykker CD-22, hvor fremgangsmåten omfatter at vedkommende administreres en effektiv mengde av CMC-544 ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse er nedenfor ytterligere beskrevet gjennom bestemte utførelseseksempler, som er ment å beskrive oppfinnelsen ytterligere uten å begrense rammen for denne.
EKSEMPEL 1
UTVIKLING AV ANUS TOFFKANDLDATER
Et utvalg av antistoffer mot CD-22 ble selektert fra hybridomer ved å benytte følgende seleksjonskriterier: binding til Daudi-celler, internalisering på Daudi-celler, binding til mononukleære perifere blodceller (PBMC), internalisering på PBMC, affinitet (høyere enn 10"<9>M), mus-yl og produksjonshastighet. 5/44 ble valgt som det foretrukne antistoff.
1. GENKLONTNG OG EKSPRESJON AV ET KLMÆRT 5/44-ANTISTOFFMOLEKYL
a) Fremstilling av 5/44-hybridomceller og fremstilling av RNA fra disse
Hybridom 5/44 ble utviklet ved konvensjonell hybridomteknologi etter immunisering
av mus med humant CD22-protein. RNA ble fremstilt fra 5/44-hybridomceller ved å benytte et RNEasy-kit (Qiagen, Crawley, UK; katalog nr. 74106). Det oppnådde RNA ble revers-transkribert til cDNA som beskrevet nedenfor
b) Fordeling av CD22 på NHL tumorer
En immunhistokjemisk studie ble foretatt for å undersøke insidensen og fordelingen av
farging ved å benytte de 5/44 anti-CD22 monoklonale antistoffene. Kontroll-anti-CD20- og anti-CD79a-antistoffer ble inkludert i studien for å bekrefte B-celleområder av tumorer.
Totalt 50 tumorer ble studert og disse ble kategorisert ved å benytte the Working Formulation and REAL classification systems som følger:
7 B lymfoblastom-leukemi/lymfom (Høy/I)
4 B-CLL/lite lymfocyttisk lymfom (Lav/A)
3 Lymfoplasmacytoid/immunocytom (Lav/A)
1 Mantel-celle (lut/F)
14 Follikkelcenter-lymfom (lav til middles/D)
13 Diffust storcelle-lymfom (middels til Høy/GH)
6 Uklassifiserbar (K)
2 T-cellelymfomer
40 B-cellelymfomer var positive for CD22-antigen med 5/44 antistoffet som
0,1 ng/mL, og ytterligere seks ble positive når konsentrasjonen ble øket til 0,5 ug/mL. For de gjenværende to B-celletumorene som var negative ved 0,1 ug/mL, var det utilstrekkelig vev igjen for testing ved den høyere konsentrasjon. Parallell testing med et annet anti-CD22-antistoff betegnet 6/13 (Celltech, Slough, UK), som ga sterkere farging enn 5/44, ga som resultat at alle 48 B-cellelymfomene farget positivt for CD22.
Det kan således konkluderes med at CD-22-antigenet i stor grad uttrykkes på B-cellelymfomer og derfor utgjør et egnet mål for immunterapi ved NHL.
c) PCR kloning av 5/44 Vh og Vl.
Det ble syntetisert cDNA sekvenser som koder for de variable domener av 5/44 tung
og lett kjede ved å benytte revers transkriptase for å frembringe enkelttrådede cDNA-kopier av den mRNA som var tilstede i den totale RNA. Disse ble deretter benyttet som templat for amplifikasjon av de murine V-regionsekvensene ved å benytte spesifikke oligonukleotidprimere ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR).
i) cDNA syntese
cDNA ble syntetisert i et 20 uL reaksjonsvolum inneholdende følgende reagenser:
50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KC1, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCb, 0,5 mM dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 20 enheter RNAsin, 75 ng tilfeldig heksanukleotidprimer, 2 ug 5/44 RNA og 200 enheter Moloney Murine Leukemia Virus revers-transkriptase. Etter inkubering ved 42°C i 60 minutter, ble reaksjonen avbrutt ved oppvarming til 95°C i 5 minutter.
ii) PCR
Alikvoter av denne cDNA ble underkastet PCR ved å benytte kombinasjoner av primere som er spesifikke for de tunge og lette kjeder. Degenererte primer-forråd beregnet på renaturering med de konserverte sekvensene av signalpeptidet ble benyttet som foroverprimere. Disse sekvensene inneholder alle i rekkefølge et restriksjonssete (VlSful; Vh Hindlll) med start 7 nukleotider fra deres 5'-ender, sekvensen GCCGCCACC (SEKV.ID.NR:50), for å muliggjøre optimal translasjon av de resulterende mRNA, et initieringskodon og 20-30 nukleotider basert på leder-peptidsekvensene av kjente muse-antistoffer (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg. 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
3'-primerne er beregnet på å spenne over framework 4 J-C-overgangen til antistoffet og inneholde et restriksjonssete for enzymet BsiWI for å lette kloningen av VlPCR-
fragmentet. De tung kjede 3'-primerne er en blanding beregnet på å spenne over J-C-overgangen til antistoffet. 3'-primeren inkluderer et Apal restriksjonssete for å lette kloning. 3'-regionen av primerne inneholder en blandet sekvens basert på de som er funnet i kjente muse-antistoffer (Kabat et al, 1991, supra).
Kombinasjonene av primerne beskrevet ovenfor gjør det mulig for PCR-produktene for Vh og Vldirekte å klones inn i en passende ekspresjonsvektor (se nedenfor) for å frembringe kimære (mus-humane) tunge og lette kjeder og for å uttrykke disse genene i pattedyrceller for å fremstille kimære antistoffer av den ønskede isotype.
Inkuberinger (100 uL) for PCR ble opprettet som følger. Hver reaksjonsblanding inneholdt 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mMMgCb, 50mMKCl, 0,01% (vekt/vol) gelatin, 0,25 mM av dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 10 pmol 5'-primerblanding, 10 pmol 3'-primer, 1 uL cDNA og 1 enhet Taq polymerase. Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 95°C i 5 minutter og deretter syklisert gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 runder ble alikvoter av hver reaksjonsblanding analysert ved elektroforese på en agarosegel.
For tung kjede V-regionen ble det bare oppnådd et amplifisert DNA-produkt når et primerforråd renaturert innenfor starten av framework I erstattet signalpeptid-primerforrådet. Fragmentene ble klonet inn i DNA-sekvenseringsvektorer. DNA-sekvensen ble bestemt og translatert for å gi en dedusert aminosyresekvens. Denne deduserte sekvens ble bekreftet ved referanse til den eksperimentelt bestemte N-terminale proteinsekvens. Figur 1 viser aminosyresekvensen av CDR av monoklonalt muse-antistoff 5/44. Figur 2 og 3 viser DNA/proteinsekvensen av henholdsvis de modne lette og tunge kjeders V-regioner av muse-monoklonalt 5/44.
iii) Molekylær kloning av PCR-fragmentene
De murine V-regionsekvensene ble deretter klonet inn i ekspresjonsvektorene pMRRlO. 1 og pMRR14 (Figur 7 og 8). Disse er vektorer for ekspresjonen av lett og tung kjede inneholdende DNA som koder for konstante regioner av human kappa lett kjede og human gamma-4 tung kjede. VL-regionen ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren ved restriksjonsoppslutning og ligering fra sekvenseringsvektoren ved å benytte Sful og BsiWI restriksjonsseter under dannelse av plasmid pMRR10(544cL) (Figur 8). Den tunge kjede DNA ble amplifisert ved PCR under bruk av en 5'-primer for å innføre et signalpeptid, siden dette ikke ble oppnådd under kloningsstrategien - en mus tung kjede antistoff ledersekvens fra et forskjellig egenprodusert hybridom (betegnet 162) ble benyttet. 5'-primeren hadde følgende sekvens:
Revers-primeren var identisk med den benyttet under den opprinnelige Vh genkloning. Det resulterende PCR-produkt ble oppsluttet med enzymene Hindm og Apal, ble subklonet og dets DNA-sekvens bekreftet under dannelse av plasmid pMRR14(544cH) (Figur 7). Transient ko-transfeksjon av begge ekspresjonsvektorene inn i CHO-celler førte til kimært c5/44-antistoff. Dette ble oppnådd ved å benytte lipofektaminreagenset i henhold til produsentens anvisninger (InVitrogen: Life Technology, Groningen, Nederland, katalog nr. 11668-027).
E. FJERNING AV GLYKOSYLERINGSSETET OG REAKTIVT LYSIN
En potensiell N-koblet glykosyleringssetesekvens med aminosyresekvensene N-Y-T (Figur 3) ble observert i CDR-H2. SDS-PAGE, western blotting og karbohydratfarging av gel av 5/44 og dets fragment (inklusivt Fab) tydet på at setet virkelig var glykosylert (ikke vist). I tillegg ble det observert en lysinrest ved en eksponert posisjon innen CDR-H2, og som hadde evnen til å redusere bindingsaffiniteten av antistoffet ved å fremby et ytterligere sete for konjugasjon med et middel som antistoffet kan konjugeres til.
Det ble benyttet en PCR-strategi for å innføre aminosyresubstitusjoner i CDR-H2-sekvensen i et forsøk på å fjerne glykosyleringssetet og/eller det reaktive lysin, som vist i
Figur 4. Foroverprimere som koder for mutasjonene N55Q, T57A eller T57V ble benyttet for å fjerne glykosyleringssetet (Figur 4) og en fjerde foroverprimer som inneholdt substitusjonen K60R, ble utviklet for å fjerne den reaktive lysinrest (Figur 4). En framework 4 revers-primer ble benyttet i hver av disse PCR-amplifikasj onene. PCR-produktene ble oppsluttet med enzymene Xbal og Apal og innført i pMRR14(544cH) (også spaltet med Xbal og Apal) for å utvikle ekspresjonsplasmider som koder for disse mutantene. N55Q-, T57A- og T57V-mutasjonene fjerner glykosyleringssetet ved å endre aminosyresekvensen bort fra konsensus N-X-T/S, mens K60R-mutasjonen erstatter det potensielt reaktive lysin med den likeledes positivt ladede resten arginin. De resulterende cH-plasmidvariantene ble ko-transfektert med cL-plasmidet for å frembringe uttrykte kimære antistoffvarianter.
LU. EVALUERING AV AKTIVITETER AV KIMÆRE GENER
Aktivitetene av de kimære genene ble evaluert etter transient transfeksjon inn i CHO-celler og bestemmelse av affinitetskonstanter ved BiaCore analyse.
Affinitetene av kimært 5/44 eller dets varianter, som har fått fjernet deres glykosyleringssete eller deres reaktive lysin, ble undersøkt ved å benytte BIA-teknologi for binding til CD22-mFc-konstruksjoner. Resultatene er vist i Figur 9. Alle bindingsmålinger ble foretatt i BIAcore™ 2000 instrumentet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige). Testen ble foretatt ved oppfanging av CD22mFc via det immobiliserte anti-mus Fc. Antistoffet var i den løselige fase. Prøver, standard og kontroller (50uL) ble injisert over immobilisert anti-mus Fc, etterfulgt av antistoff i den løselige fase. Etter hver syklus ble overflaten regenerert med 50 uL av 40 mM HC1 ved 30 uL/min. Kinetikkanalysen ble foretatt ved å benytte BIAevaluation 3.1 programvare (Pharmacia).
Fjerning av glykosyleringssetet i konstruksjon T57A resulterte i en litt hurtigere on-rate og en signifikant langsommere off-rate sammenlignet med det kimære 5/44, hvilket ga en affinitetsforbedring på ca. 5 ganger. N55Q-mutasjonen hadde ingen effekt på affiniteten. Dette resultatet var uventet idet det tyder på at fjerningen av karbohydratet som sådant tilsynelatende ikke har noen effekt på binding (som med N55Q-endringen). Den forbedrede affinitet ble observert bare med T57A-endringen. En mulig forklaring er at treoninet i posisjon 57, uansett nærværet av karbohydrat, utøver en negativ effekt på binding som fjernes ved omdannelse av treonin til alanin. Hypotesen at alaninets lille størrelse er viktig, og at den negative effekt av treonin er relatert til dens størrelse, understøttes av resultatet oppnådd ved å benytte T57V-mutasjonen: at erstatning med valin i posisjon 57 ikke er fordelaktig (resultater ikke vist).
Fjerning av lysinresten ved K60R-mutasjonen har en nøytral effekt på affiniteten, dvs. innføringen av argininresten fjerner et potensielt reaktivt sete uten å gå ut over affiniteten.
Mutasjonene for fjerning av glykosyleringssetet og for fjerning av det reaktive lysin ble derfor begge inkludert i denne humaniseringsdesign.
EKSEMPEL 2
CDR-PODING AV 5/44
Den molekylære kloning av gener for de variable regioner av tung og lett kjede av 5/44-antistoffet og deres anvendelse for å frembringe kimære (mus/humane) 5/44-antistoffer, er beskrevet ovenfor. Nukleotid- og aminosyresekvensene av mus 5/44 Vlog VH-domenene er vist henholdsvis i Figur 2 og 3 (SEKV.ID.NR:7 og 8). Dette eksempel beskriver CDR- podingen av 5/44-antistoffet til humane framework for å redusere eventuell immunogenitet hos mennesker, i henhold til metoden til Adair et al, (PCT søknad No. WO91/09967).
I. CDR-PODING AV 5/44 LETT KJEDE
Proteinsekvens-sammenligningsoppstilling med konsensussekvenser fra human subgruppe I kappa lett kjede V-region tydet på 64% sekvensidentitet. For å konstruere den CDR-podede lette kjede korresponderte følgelig de valgte akseptor framework-regioner med sekvensen av den humane VK-subgruppe I kimlinje 012, DPK9. Framework 4 akseptorsekvensen ble avledet fra den humane J-region-kimlinjesekvens JK1.
En sammenligning av aminosyresekvensene av framework-regionene av murint 5/44 og akseptorsekvensen er angitt i Figur 5 og viser at det mellom donor- og akseptorkj edene er 27 forskjeller. I hver posisjon ble det foretatt en analyse av murinrestens potensiale til å bidra til antigenbinding, enten direkte eller indirekte, gjennom effekter på pakking eller ved Vh/Vl-overgangen. Dersom en murinrest ble ansett viktig og tilstrekkelig forskjellig fra den humane rest med hensyn til størrelse, polaritet eller ladning, ble den murine rest bibeholdt. Basert på denne analyse ble det konstruert to versjoner av den CDR-podede lette kjede som hadde sekvensene angitt i SEKV.ID.NR: 19 og SEKV.LD.NR:20 (Figur 5).
E. CDR-PODING AV 5/44 TUNG KJEDE
CDR-poding av den 5/44 tunge kjede ble oppnådd ved å benytte den samme strategi som beskrevet for den lette kjede. V-domenet av 5/44 tung kjede ble funnet å være homologt med humane tunge kjeder tilhørende subgruppe I (70% sekvensidentitet) og sekvensen av den humane subgruppe I kimlinjes framework VH1-3, DP7 ble derfor benyttet som et akseptor framework. Framework 4 akseptorsekvensene ble avledet fra human J-region kimlinjesekvens JH4.
En sammenligning av den 5/44 tunge kjede med framework-regionene er vist i Figur 6, hvorav det fremgår at den 5/44 tunge kjede adskiller seg fra akseptorsekvensen i 22 posisjoner. Analyse av det bidrag som enhver at disse måtte gi til antigenbinding førte til at 5 versjoner av de CDR-podede tunge kjeder ble konstruert med de sekvenser som er angitt i SEKV.ID.NR:23, SEKV.ID.NR:24, SEKV.ID.NR:25, SEKV.ID.NR:26 og SEKV.ID.NR:27 (Figur 6).
LU. KONSTRUKSJON AV GENER FOR PODEDE SEKVENSER
Gener ble konstruert for å kode de podede sekvensene gHl og gLl, og en rekke overlappende oligonukleotider ble designet og konstruert (Figur 10). En PCR-sammenstillingsteknikk ble benyttet for å konstruere de CDR-podede V-regiongenene. Det ble fremstilt reaksjonsvolumer på 100 uL inneholdende 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCb, 50 mM KC1, 0,001% gelatin, 0,25 mM dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 1 pmol hver av de "interne" primerne (Tl, T2, T3, Bl, B2, B3) 10 pmol hver av de "eksterne" primerne (Fl, RI) og 1 enhet Taq polymerase (AmpliTaq, Applied BioSystems, katalog nr. N808-0171). PCR-sykliseringsparametere var 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt i 30 sykluser. Reaksjonsproduktene ble deretter analysert på en 1,5% agarosegel, snittet ut og gjenvunnet ved å benytte QIAGEN roterende kolonner (QIAquick gel extraction kit, katalog nr. 28706). DNA ble eluert i et volum på 30 uL. Alikvoter (1 uL) av gHl - og gLl-DNA ble deretter klonet inn i InVitrogen TOPO TA-kloningsvektor pCR2.1 TOPO (katalog nr. K4500-01) i henhold til produsentens anvisninger. Denne ikke-uttrykkende vektor tjente som et klonings-mellomprodukt for å lette sekvensering av et stort antall kloner. DNA-sekvensering ved å benytte vektor-spesifikke primere ble benyttet for å identifisere riktige kloner inneholdende gHl og gLl, under dannelse av plasmidene pCR2.1 (544gHl) og pCR2.1 (544gL.l) (Figur 11 og 12).
En metode til erstatning for en oligonukleotidkassett ble benyttet for å frembringe de humaniserte podingene gH4, 5, 6 og 7, og gL2. Figur 13 viser utformingene av oligonukleotidkassettene. For å konstruere hver variant ble vektoren pCR2.1 (544gHl) eller pCR2.1 (544gLl)) kuttet med de viste restriksjonsenzymene (XmaI/SacII for den tunge kjede, Xmal/BstEJJ for den lette kjede). Det store vektorfragmentet ble gelrenset fra agarose og benyttet i ligering med oligonukleotidkassetten. Disse kassettene sammensettes av 2 komplementære oligonukleotider (vist i Figur 13), blandes i en konsentrasjon på 0,5 pmol/uL i et volum på 200 uL 12,5 mM Tris-HCI pH 7,5, 2,5 mM MgCb, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioerytritol. Renaturering ble oppnådd ved oppvarming til 95°C i 3 minutter i et vannbad (volum 500 mL) hvorpå reaksjonsblandingen langsomt fikk avkjøles til romtemperatur. Den renaturerte oligonukleotidkassett ble deretter fortynnet 10 x i vann før ligering inn i den passende kuttede vektor. DNA-sekvensering ble benyttet for å bekrefte den riktige sekvens ved å danne plasmidene pCR2.1 (5/44-gH4-7) og pCR2.1 (5/44-gL2). De verifiserte podede sekvensene ble deretter subklonet inn i ekspresjonsvektorer pMRR14 (tung kjede) og pMRlO.l (lett kjede).
IV. CD22 BINDINGSAKTIVITET AV CDR-PODEDE SEKVENSER
Vektorene som koder for podede varianter ble ko-transfektert inn i CHO-celler i et utvalg av kombinasjoner, sammen med de opprinnelige kimære antistoffkjeder. Bindingsaktivitet ble sammenlignet i en kompetitiv test med konkurranse om bindingen av det opprinnelige mus-5/44-antistoff om binding til Ramos-celler (oppnådd fra ATCC, et Burkitts-lymfom lymfoblast humancellelinje uttrykkende overflate CD22). Denne test ble ansett som den beste måte å sammenligne podingene med henblikk på deres evne til å binde til celleoverflate CD22. Resultatene er vist i Figur 14 og 15. Det fremgår at det er meget liten forskjell mellom noen av podingene, alle oppførte seg mer effektivt enn kimæren ved konkurranse mot det murine opphav. Innføringen av de 3 ytterligere humane restene ved enden av CDR-H3 (gH5 og gH7) syntes ikke å ha påvirket binding.
Podekombinasjonen med det minste antall murine rester gLlgH7 ble selektert. Den lette kjedepodingen gLl har 6 donorrester. Restene V2, V4, L37 og Q45 er potensielt viktige pakkingsrester. Rest H38 er ved Vii/VL-overgangen. Rest D60 er en overflaterest nær CDR-L2 og kan bidra direkte til antigenbinding. Av disse restene finnes V2, L37, Q45 og D60 i kimlinjesekvenser av humane kappa-gener fra andre subgrupper. Den tunge kjedepodingen gH7 har 4 donor framework-rester (rest R28 anses å være del av CDR-H1 under strukturdefinisjonen benyttet ved CDR-poding (se Adair et al. (1991), PCT søknad nr. WO91/09967)). Restene El og A71 er overflaterester nær disse CDR. Resten 148 er en potensiell pakkingsrest. Rest T93 er tilstede ved Vii/VL-overgangen. Av disse restene finnes El og A71 i andre kimlinjegener av human subgruppe I. Rest 148 finnes i human kimlinje subgruppe 4 og T73 finnes i human kimlinje subgruppe 3.
Den fullstendige DNA- og proteinsekvens av både den lette og den tunge kjede, inklusivt tilnærmet posisjon av intr oner innenfor de konstante regiongenene tilveiebragt gjennom vektorene, er vist i Figur 16, og er angitt i henholdsvis SEKV.ID.NR:29 og SEKV.ID.NR:28 for den lette kjede og henholdsvis SEKV.ID.NR:31 og SEKV.LD.NR:30 for den tunge kjede.
DNA som koder for disse gener for lett og tung kjede ble snittet ut fra disse vektorene. Tung kjede DNA ble oppsluttet i 5' HindlH-setet, deretter behandlet med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase I for å frembringe en 5' butt ende. Spaltning av 3' EcoRI-setet resulterte i tung kjede fragmentet, som ble renset fra agarosegel. På samme måte ble det fremstilt et lett kjede fragment, som ble gjort butt ved 5' Sful-setet og med et 3' EcoRI-sete.
Begge fragmentene ble klonet inn i DHFR-baserte ekspresjonsvektorer og benyttet for å frembringe stabile cellelinjer i
i CHO-celler.
EKSEMPEL 3
KONJUGASJON AV NAc-GAMMA-CALICHEAMICIN DMH ACBUT TIL
HUMANISERT ANTI-CD22-ANTISTOFF (G5/44)
I en typisk konj ugasjonsreaksj on ble humanisert anti-CD22-antistoff (G5/44) konjugert til NAc-gamma-calicheamicin DMH AcBut OSu (calicheamicinderivat) (se Figur 17), hvor målproteinkonsentrasjonen var 7,5 mg/mL og mål-calicheamicinderivatladingen var 8,5% av proteinvekten. Den tilsiktede reaksjons pH var 8,5 ± 0,2 og de tilsiktede konsentrasjoner av de øvrige reaksjonskomponentene var som følger: 50 mM N-(2-hydroksyetyl)piperazin-N'-(4-butansulfonsyre) (HEPBS), 37,5 mM natriumdekanoat og 9 vol% total etanol. Reaksjonen ble foretatt ved 33° ± 2°C i en time. Analyseresultatene for denne typiske reaksjon, før rensing, var som følger: Protein: 7,34 mg/mL; calicheamicinlading: 82,7 ug/mg; aggregat: 93,25% og ukonjugert protein (LCF): 1,07% (UV-areal % ifølge HPLC).
Effekten av forskjellige tilsetninger av overflateaktive midler og deres konsentrasjoner på produktutbytte og renhet ble testet for å bestemme deres effekt på produksjonen av konjugert monomer (se Tabell 2). Det ble foretatt reaksjoner hvor alt ble holdt konstant bortsett fra tilsetningsmidlet og konsentrasjonen av dette. Konjugatene produsert ved disse reaksjonene ble analysert med henblikk på proteinkonsentrasjon, calicheamicinlading, aggregatinnhold og LCF. Selv om alle n-karboksylsyrene i området fra C6(heksanoat) til C12(dodekanoat) ga akseptable resultater, ble de totalt sett beste resultater (lav LCF, lavt aggregat og høy gjenvinning av monomert konjugat) oppnådd med dekanoat i konsentrasjonsområdet 30 mM til 50 mM.
EKSEMPEL 4
KROMATOGRAFISK RENSEPROSESS
1. KROMATOGRAFISKE SEPARASJONSPROSESSER
Selv om Butyl Sepharose 4 Fast Flow ble identifisert som det beste HIC-medium, kan akseptable resultater oppnås med små endringer i de kromatografiske betingelsene ved å benytte andre harpikser, så som Octyl Sepharose Fast Flow, PPG-600C (Tosoh Biosep), Fractogel EMD Propyl (EM Processing) og Source 15ISO (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.).
Utgangsmaterialet for rensingen var en konjugasjonsreaksjonsblanding inneholdende 7,2 mg/mL protein ved en calicheamicinderivat-lading på 83 ug/mg, med et aggregatinnhold på 10,1% (arealprosent ved HPLC), og et LCF-innhold på 5,6% (arealprosent ved HPLC).
Etter at konjugasjonsreaksjonen var fullført ble reaksjonsblandingen fortynnet fire ganger ved tilsetning av kaliumfosfatløsning til en endelig fosfatkonsentrasjon på 0,7M (pH 8,2). Etter blanding ble løsningen filtrert gjennom 0,45 mikronfiltere. Den fortynnede løsningen ble avsatt på en Butyl Sepharose 4 Fast Flow kolonne. Den totale proteinmengde avsatt på kolonnen var 29 mg per mL resinvolum. Etter en vask med 0,7M kaliumfosfat ble kolonnen eluert ved å benytte en trinngradient fra 0,7M til 4 mM kaliumfosfat, pH 8,2. Fraksjonene som eluertes under trinngradienten ble slått sammen for videre bearbeiding, med forrådet bestående av monomert konjugat med mindre enn 1 arealprosent for hver av aggregatet og LCF. Dette forråd ble avsatt på en Sepharose G-25 (Amersham Biosciences) avsaltende kolonne for utskifting til en buffer passende for formulering, bestående av 20 mM Tris-Cl og 100 mM natriumklorid ved pH 8,0. Den rensede, bufferutskiftede CMC-544-tilberedning hadde følgende egenskaper: calicheamicin-lading: 81 ug/mg; aggregat: 0,4%
(arealprosent ved HPLC) LCF: 0,8% (arealprosent ved HPLC).
EKSEMPEL 5
BINDINGS ANALYSE AV NAC-GAMMA-CALICHEAMICIN DMH ACBUT-G5/44
IMMUNKONJUGAT (CMC-544)
Immunkonjugat av humanisert anti-CD22-antistoff (G5/44) med calicheamicin (CMC-544) utviklet ved hjelp av ovennevnte konjugasjonsprosess, ble analysert i en bindingsstudie for å bestemme hvorvidt konjugatet frembragt ved å benytte den forbedrede prosess hadde noen ugunstig effekt på antigenbinding. Tabell 3 viser at konjugasjonsprosessen ikke har noen innvirkning på antigenbindingsaffiniteten til antistoffet. CMC-544-immunkonjugat fremstillet etter enten den gamle eller nye konjugasjonsprosessen, bandt målantigenet med lignende affiniteter, som ikke adskilte seg fra de av de ukonjugerte antistoff G5/44.
Biosensor-analyse ble foretatt ved å benytte BIAcore 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Sverige). CD22mFc ble kovalent immobilisert på den N-hydroksysuccinimid-aktiverte karboksymetyl-dekstran-belagte biosensorbrikke (CM5) ved å benytte standard aminkoblingskjemi ved en proteintetthet på ca. 2000 resonansenheter. Prøver av CMC-544 eller G5/44 ble fortynnet i HBS-bufferen (10 mM HEPES, pH 7,4, inneholdende 150 mM NaCl, 3 mM EDTA og 0,005% polysorbat 20 (volumdeler)) og injisert i konsentrasjonsområdet fra 1 til 100 nM over den CD22mFc-belagte biosensorbrikkes overflate ved en strømningshastighet på 30 uL/min i 3 min for å muliggjøre binding. Etter bindingsfasen ble dissosiasjonen av bundet antistoff overvåket ved å vaske brikken med HBS-buffer over en 15 minutters periode. Antigenoverflaten ble regenerert ved å vaske biosensorbrikken med 15 uL av regenereringsbufferen (10 mM NaOH og 200 mM NaCl) i 30 sekunder, etterfulgt av en stabiliseringstid på 2 minutter før neste syklus. Kinetiske konstanter ble beregnet ved ulineær minste kvadraters regresjonanalyse under bruk av en 1:1 Langmuir bindingskurve tilpasningsmodell og BIAevaluation Program (versjon 3.0 BIAcore). Antigenbindingen av CMC-544 ble evaluert ved overflateplasmon-resonansanalyse ved å benytte CD22mFc kovalent immobilisert på en biosensorbrikke. Resultatene av kinetiske analyser av bindingene av CMC-544 og G5/44 til CD22mFc viser at, etter at dataene var tilpasset globalt til en 1:1 Langmuir bindingsmodell med kompensasjon for masseoverføring, både CMC-544 og ukonjugert G5/44 bandt CD22 med lignende affinitet (CMC-544:CD22 KD= 200 pM; G5/44:CD22 KD= 235 pM). Konjugasjon til calicheamicin hindret ikke G5/44 i effektivt å binde CD22mFc.
Bindingen av CMC-544 og G5/44 til CD22 uttrykt på overflaten av B-lymfomceller ble også undersøkt ved strømningscytometri. Anti-CD33 mAb gemtuzumab (hP67.6) og dets calicheamicinkonjugat CMA-676 (gemtuzumab ozogamicin) ble benyttet som isotype-overensstemmende kontroller ved denne evaluering. Rituximab (Rituxan™), et kimært humant IgGl anti-humant CD20 mAb, ble benyttet som positiv kontroll. Renset humant polyklonalt IgGl og IgG4 ble også benyttet som negative kontroller. Binding av CMC-544 og G5/44 til CD22 på Ramos eller RL BCL lignet hverandre og kunne skjelnes fra den for humant polyklonalt IgG4. RL BCL oppviste lavere overflateekspresjon av CD22 enn Ramos BCL. Derimot tilsvarte bindingen av CMA-676 eller gLlgH7 til begge BCL den av humant polyklonalt IgG4 i overensstemmelse med deres manglende ekspresjon av CD33 (data ikke vist). De samme cellene oppviste sterk binding av anti-CD20 rituximab (Rituxan™). Til forskjell fra hP67.6 og CMA-676 oppviste verken CMC-544 eller G5/44 noen binding til CD22"CD33<+>HL-60 leukemiceller (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at konjuger-ingen av G5/44 til calicheamicin ikke påvirker dets antigenspesifisitet. CMC-544 gjenkjenner spesifikt CD22 på humane B-celler, men ikke på B-celler fra mus, rotte, hund, svin eller primater (cynomolgus og rhesus) (data ikke vist).
EKSEMPEL 6
ANALYSE AV IN VITRO OG IN VIVO EFFEKTER AV CMC-544
I. IN VITRO CYTOTOKSISITET
Effekten av CMC-544 som oppnås ved å benytte CMA-676- og CMC-544-prosesser på in vitro veksten av CD22<+>B-celle lymfomcellelinjer RL, Daudi, Raji og Ramos, ble sammenlignet. Et isotype-tilpasset calicheamicinkonjugat målrettet mot humant CD33 (CMA-676) ble benyttet for å gjenspeile antigen-ikke-spesifikke virkninger av konjugatet. Anvendelsen av ukonjugert N-Ac gamma-calicheamicin DMH (medikamentet frigitt fra konjugatet etter sur hydrolyse) indikerte ved denne evaluering at hver av disse anvendte cellelinjer var følsomme for calicheamicinets letale effekter. Tabell 4 viser resultatet av disse evalueringene på basis av calicheamicin-ekvivalensen, og Tabell 5 viser disse resultatene uttrykt som konsentrasjonene av konjugert antistoffprotein. CD22-mediert avlevering av calicheamicin til CD22<+->celler var minst ti ganger mer effektiv med hensyn til å drepe målceller enn det ukonjugerte medikament som sådant. Det isotype-overensstemmende kontrollkonjugat (CMA-676) oppviste en cytotoksisitet som enten var mindre enn eller lik det ukonjugerte calicheamicinderivat. Det fremgår av Tabell 4 at konjugatet fremstilt ved CMC-544 konjugasjonsprosessen, kan frembringe en tilsvarende cytotoksisk effekt ved lavere antistoffkonsentrasjoner enn konjugat fremstilt ved CMA-676 konjugasjonsprosessen.
In vivo cytotoksisitet. CMC-544 fremstilt etter CMC-544-prosessen ble ytterligere evaluert i B-cellelymfom xenotransplantater. I disse studiene ble det benyttet to B-cellelymfomtumorer, RAMOS og RL. RL-lymfom er en ikke-Burkitts NHL-avledet cellelinje, mens RAMOS opprinnelig ble avledet fra et Burkitts lymfom. I et representativt forsøk vist i Figur 18 ble det vist at CMC-544 og dets murine antistoff-motstykke var effektivt til doseavhengig inhibering av veksten av RAMOS B-cellelymfom.
Konjugatet av det humaniserte antistoff ble vist å være mer potent enn dets murine motstykke. I denne studien var den laveste dose av calicheamicinkonjugat som kunne bevirke signifikant vekstinhibering av lymfom, 10 ug/kg konjugert NAc-gamma-calicheamicin DMH. Det ukonjugerte antistoff, G5/44 hadde ved administrering av 10 mg/kg intraperitonealt etter en lignende plan som konjugater, ingen effekt på tumorvekst.
Lignende studier ble foretatt ved å benytte RL-lymfommodellen. Tabell 6 viser de kombinerte analyser av tre uavhengige forsøk, hvor antitumorvirkningene av CMC-544 ble målt på RL NHL-tumorer utviklet til 300-400 mg størrelse i nakne mus. CMC-544 forårsaket en doseavhengig regresjon av tumorer over et 3 ukers tidsrom. Den minste effektive dose av CMC-544 ble i RL-lymfommodellen fastslått fra statistiske analyser av disse studier å være 20 ug/kg basert på calicheamicininnhold. Ingen dyr døde i noen av disse tre studiene. Høyere doser (60-320 ug/kg) CMC-544 forårsaket nesten fullstendig regresjon av RL-lymfom. Alt i alt viser resultatene oppnådd med de to B-cellelymfommodellene klart den evne CMC-544 har til å forårsake tumorregresjon.
Den evne CMC-544, fremstilt etter den nye fremgangsmåte, har til å inhibere vekst av store etablerte B-cellelymfom xenotransplantater ved å benytte både RAMOS- og RL-lymfommodellene ble også undersøkt. Tumorene fikk vokse for å utvikles til 1,5 eller 2 g tumormasse, hvoretter CMC-544 eller et isotype-tilpasset negativt kontrollkonjugat (CMA-676) ble administrert intraperitonealt i dosen 160 ug/kg konjugert calicheamicin under opprettholdelse av den opprinnelige doseringsplan på dag 1, 5 og 9. Den samme doseringsplan ble tidligere vist å bevirke langvarig regresjon av små arrangerte tumorer (se Tabell 6). Som vist i Figur 19 forårsaket administrering av CMC-544 til store RAMOS lymfom-bærerende mus gradvis regresjon av den forutgående lymfommasse, og på dag 20 var 3 av 4 tumor-bærende mus tumorfrie. Overvåkning av disse tumorfrie mus opp til dag 50 tydet ikke på noen ny vekst av RAMOS-lymfomer med regresjon. Derimot hadde en isotype-tilpasset kontroll CMA-676, ingen effekt på tumorveksten. Fire av fem CMA-676-behandlede mus med store tumorer måtte avlives før dag 15 på grunn av at deres tumorbelastning nådde tett opp til 15% av deres kroppsvekt.
Et lignende forsøk ved å benytte CMC-544, ble foretatt i RL-lymfommodellen. Intraperitoneal administrering av CMC-544 i en dose på 160 ug/kg etter en lignende plan som beskrevet ovenfor, forårsaket >90% regresjon av den på forhånd foreliggende masse av RL-lymfom i løpet av 30 dager. På dag 45 oppviste imidlertid 2 mus i denne gruppe med innskrumpede lymfomer, gjenvekst av tumorene. Disse resultatene tyder på at CMC-544 kan bevirke regresjon av små, så vel som store, etablerte lymfomer. I et lite antall studier som ikke er vist her, ble RL-lymfomer som sporadisk begynte å vokse igjen etter den initiale CMC-544-induserte regresjon, behandlet på nytt med CMC-544. Disse studiene viste at RL-tumorer fremdeles responderte på den andre behandlingsrunden med CMC-544 og igjen avtok. Behandlingen med CMC-544 kan således være effektiv både mot små og store masser av B-cellelymfomer med potensiale for gjentatt behandling.
E. IN VIVO SAMMENLIGNING AV KONJUGAT FREMSTILT VED HJELP AV CMA-676 OG CMC-544 KONJUGASJONSPROSESSER
Figur 20 viser resultatene av et representativt forsøk hvor arrangerte RL-lymfombærende mus fikk to forskjellige doser (80 og 320 ug/kg konjugert calicheamicin) av CMC-544 fremstilt ved å benytte CMA-676 konjugasjonsprosessen og CMC-544 konjugasjonsprosessen ved å benytte standard doseringsplanen. Den observerte antitumoreffekt var doseavhengig slik som forventet, og det var ingen forskjell i effekten av de to CMC-544 tilberedningene. Derimot var ukonjugert N-acetyl-gamma-calicheamicin DMH, administrert intraperitonealt som 160 ug/kg, inaktivt. Det skal imidlertid understrekes at for hver dose konjugert calicheamicin var mengden antistoffprotein administrert i form av et konjugat fire ganger høyere for CMC-544 fremstilt etter CMA-676-prosessen enn den fremstilt ved CMC-544-prosessen. Siden calicheamicin-innholdet av det tilsiktede konjugat primært er ansvarlig for å bevirke antirumoreffekten, er det mulig å avlevere den nødvendige mengde calicheamicin via konjugatet fremstilt etter den nye fremgangsmåte ved å benytte meget mindre mengder av det målrettede antistoff. Den økte lading av konjugatet fremstilt etter CMC-544-prosessen skyldes faktisk mangelen på signifikante mengder av den lavkonjugerte fraksjon (LCF).
LU. BEHANDLING AV RITUXIMAB- (RITUXAN™) RESISTENTE TUMORER
Det neste spørsmål som måtte utforskes var hvorvidt B-cellelymfomer dyrket etter avbrutt behandling med kommersielt tilgjengelige anti-CD20 rituximab (Rituxan™) fremdeles ville respondere på CMC-544-behandlingen. I den anledning ble utviklende (ikke arrangerte) RL-lymfomer behandlet med rituximab (Rituxan™) i 3 uker. Så lenge rituximab-(Rituxan™) behandlingen ble fortsatt, var veksten av RL-lymfom inhibert. Etter opphør av rituximab- (Rituxan™) behandlingen, vokste RL-lymfomer hurtig til størrelsen~1 g masse, og på dette tidspunkt ble de behandlet med CMC-544 i den intraperitoneale dose 160 ug/kg. Som vist i Figur 21 og 22 responderte disse RL-lymfomene fremdeles på CMC-544, idet 80% av musene var tumorfrie på dag 60. CMC-544 kan således bevirke regresjon av B-cellelymfomer med tre doser som bare kunne inhiberes gjennom den kontinuerlige dosering av rituximab (Rituxan™).
EKSEMPEL 8
IN VIVO OG IN VITRO EFFEKT AV CMC-544
I. BINDINGS- OG TOKSISITETSSTUDIER
CMC-544 ble evaluert med henblikk på dets binding til CD22 og også på dets aktivitet i in vitro og in vivo modeller. CMC-544 ble også sammenlignet med CMA-676, et isotype-tilpasset kontrollkonjugat av hP67.6 (IgG4) med AcBut-koblet calicheamicin og med rituximab (Rituxan™), et kimært IgGl anti-CD20 mAb, (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), som er kommersielt tilgjengelig, og ble anskaffet fra Medworld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY). De følgende antistoffer ble benyttet i G5/44 bindingsdomenestudiene: BUI2 (Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 og To 15 (Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13 og M5/44 (Celltech, Slough, UK). Andre antistoffer benyttet i blokkeringsstudiene var SJ10 (hnmunotech, Fullerton, CA) og M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1 (Celltech, Slough, UK). Cellelinjer for studiene inkluderte Burkitts lymfomcellelinje RAMOS (CRL-1923) og nonHodgkins lymfom (NHL) cellelinjen RL (CRL-2261) ble alle anskaffet fra the American Type Culture Collection. Cellelinjene ble fastslått å være mykoplasmafrie ved en mykoplasma-deteksjonspolymerase-kjedereaksjon (ATCC, Manassas, VA). Cellelinjene ble holdt som suspensjonskulturer i RPMI medium pluss 10% FBS, 10 mMHEPES, 1 mM natriumpyruvat, 0,2% glukose, penicillin G-natrium 100 U/mL og streptomycinsulfat 100 ug/mL.
Hvorvidt G5/44 kan inhibere bindingen av murine mAb av kjent spesifisitet til CD22 ble evaluert ved BIAcore-analyse under bruk av Fc-CD22 immobilisert på en BIAcore CM5 brikke. De overflateplasmon-resonansenheter (RU) som ble oppnådd med og uten forutgående metning av det immobiliserte Fc-CD22 med G5/44 ble sammenlignet. Biomolekylær interaksjonsanalyse ble foretatt ved å benytte en BIACORE 2000. Antistoffer ble sendt over en kontrollflate som blank (gjennomstrømningskyvette 1, tjener som kontroll, intet protein ble koblet) og testflaten av Fc-CD22 (gjennomstrømningskyvette 2) immobilisert på en CM5 sensorbrikke via aminkoblingskjemi til et nivå på 9,042 RU. Det resulterende sensorgram var responsen (RU) på gjennomstrømningskyvette 2 minus responsen (RU) på gjennomstrømningskyvette 1. Et andre sensorgram ble oppnådd ved først å mette gjennomstrømningskyvettene med G5/44 (100 ug/mL) før innføringen av murine mAb mot CD22 som tidligere varkarakterisertmed henblikk på deres binding. Umiddelbart etter måling av G5/44-responsen ble murine anti-CD22 mAb individuelt perfundert uten å fjerne G544. Den andre kombinerte respons frembragt som følge av bindingen av murint anti-CD22 mAb til G5/44-belagt CD22, ble også registrert. Dersom det murine antistoff bandt til CD22 til seter som ikke var relatert til de seter som var okkupert av G5/44, ville de kombinerte responsene være additive. Dersom bindingen av G5/44 til CD22 interfererte med eller forhindret, bindingen av det andre antistoff, ville de kombinerte responsene ikke være additive. Hver av de andre kombinerte målingene ble korrigert for "off-rate" av G5/44:CD22-interaksjonen.
G5/44 blokkerte bindingen bare av de antistoffer som bandt til epitop A/Ig-lignende domene 1 av CD22 (SHCL1 Leu 14 og HD239), hvilket indikerer at G5/44 også binder i dette domenet av CD22. Antistoffer som binder til epitop B/Ig-lignende domene 3 av CD22 (RFB-4), epitop C/Ig-lignende domene 4 av CD22 (til 15) og lg-lignende domene 2 av CD22 (4KB128), ble ikke blokkert av G5/44. Disse resultatene tyder på at G5/44-bindingssetet på CD22 er lokalisert på det første Ig-lignende domene, siden det forhindrer bindingen av de anti-CD22 mAb som gjenkjenner det første Ig-lignende domene av CD22 (epitop A). Et annet anti-CD22-antistoff, M6/13 (Celltech, Slough, UK) av ukjent subspesifisitet ble også blokkert av G5/44 (Celltech, Slough, UK) og kartlegger således bindingssetet av M6/13 til epitop AÆg-lignende domene 1 av CD22. Antistoffet M5/44, det murine opphav til G5/44 som har den samme spesifisitet som G5/44, inhiberer bindingen av G5/44 og tjener som en positiv kontroll. Anti-CD19-antistoff BU12 tjener som en negativ kontroll for disse evalueringene. Resultatene er sammenfattet i Tabell 7.
Ved å benytte murine mAb av kjente bindingsspesifisiteter for individuelle domener til CD22, ble den evne G5/44 har til å blokkere bindingene av disse antistoffene til B-celler, undersøkt. Dessuten ble også den evne mAb har til å blokkere bindingen av G5/44 til B-celler undersøkt. I disse studiene ble 1 x IO<5>Ramos-celler først eksponert for murint anti-CD22-antistoff (10 ug/mL humanisert G5/44 eller monoklonalt mus-anti-CD22) i 1 time ved 4°C før eksponering av cellene for G5/44 (10 ug/mL). Celler ble inkubert i ytterligere 1 time ved 4°C. Etter antistoffbehandlingene ble B-celler sentrifugert og vasket med PBS-1% BSA og det passende sekundære antistoff tilsatt (enten FITC-geit anti-human (tung og lett kjede) eller FITC-geit anti-mus (tung og lett kjede)) som 100 uL av en 1:100 fortynning i PBS-1% BSA i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble igjen sentrifugert, vasket og resuspendert i PBS-1% BSA og tilsatt til et reagensrør inneholdende 250 uL PBS-1% formaldehyd. Fluorescensintensitet assosiert med celler, ble målt ved strømningscytometri under bruk av BD FACSort strømningscytometer.
Resultatene viste at forutgående eksponering av G5/44 til CD22+ B-celler resulterte i signifikant inhibering av den etterfølgende binding av anti-CD22 mAb M5/44 og M6/13. Derimot ble bindingen av anti-CD22 mAb RFB4, Tol 5, HD239 og 4KB til B-celler ikke inhibert av G5/44. Mangelen på signifikant inhibering av HD239-binding til B-celler med G5/44, som påvist ved strømningscytometri, var uventet, spesielt siden BIAcore-analysen tydet på at G5/44 kan blokkere bindingen av HD239 til CD22. Mangelen på sterk inhibering av HD239-binding av G5/44 kan forklares på grunnlag av forskjeller i deres relative affiniteter for CD22. Når ovennevnte murine anti-CD22 mAb ble undersøkt med henblikk på deres evne til å inhibere bindingen av G5/44 til CD22+ B-celler, inhiberte SHCL1 og M6/13, men ikke de andre anti-CD22 mAb, bindingen av G5/44. Bindingsepitopene av HD239 og SHCL1 har vært kartlagt til det første Ig-lignende domene av CD22. Epitopene som gjenkjennes av M6/13 eller M5/44 har imidlertid ikke vært kartlagt. De blokkeringsstudier som er utførlig beskrevet ovenfor indikerer at ovennevnte antistoffer gjenkjenner epitoper lokalisert på det første Ig-lignende domene av CD22, kollektivt kjent som epitop A.
20.000 Ramos-celler ble inkubert med forskjellige doser CMC-544 med og uten rituximab (Rituxan™) i 96 timer. Etter 96 timer ble cellelevedyktigheten målt ved propidiumjodid-eksklusjon analysert ved strømningscytometri. Den midlere levedyktighet av 3 til 6 brønner ble beregnet og doseresponsinhibering av celle-levedyktighet ble beregnet for de forskjellige behandlingene. Bakgrunnsrespons-inhiberingen av cellelevedyktighet ble beregnet fra en null-konsentrasjon av CMC-544. Logistisk regresjon ble benyttet til å teste hvorvidt CMC-544 forårsaket en statistisk signifikant doseavhengig inhibering av Ramos-cellevekst over doseområdet fra 0,01 til 3 ng calicheamicin DMH/mL. Logistisk regresjon ble også benyttet for å bestemme hvorvidt interaksjonen av CMC-544 med rituximab (Rituxan™) var statistisk signifikant. Midlere inhiberende konsentrasjoner (IC50) ble også beregnet og effektiviteten av hver behandling i forhold til behandlingen med CMC-544 alene, ble
registrert. Den statistiske analyse ble foretatt ved å benytte PROBIT prosedyren i SAS versjon 8.2.
Resultatene fra denne studien viste at CMC-544 forårsaket en doseavhengig inhibering av RAMOS-cellevekst over doseringsområdet fra 0,01 til 3 ng calicheamicin DMH/mL. Den midlere inhiberende konsentrasjon (IC50) av CMC-544 alene var 0,029 ng/mL. Konsentrasjonene 2, 20 og 200 ug/mL rituximab (Rituxan™) ble tilsatt til CMC-544-behandlede celler for å bestemme hvorvidt interaksjonen av rituximab (Rituxan™) med den cytotoksiske aktivitet av CMC-544 er statistisk signifikant. Rituximab (Rituxan™) tilsatt som 20 og 200 ug/mL uten CMC-544, hadde som sådan ingen signifikant effekt på cellevekst (henholdsvis 111,7% og 94,0% av bærervekst). I kombinasjon med CMC-544, bevirket alle tre konsentrasjonene av rituximab (Rituxan™) statistisk signifikante (p <0,05) forskyvninger mot venstre i stigningen og skjæringen av CMC-544 dose/responskurven. Kombinasjonen med 2 og 200 ug/mL rituximab førte til de største forskyvninger i dose/responskurvene. Disse 2 kurvene var ikke statistisk forskjellige fra hverandre, men var signifikant forskjellige (p<0,05) fra 20 ug/mL dosekombinasjonen. En andre studie (resultater ikke angitt) bekreftet resultatene observert i den første studien. De midlere inhiberende konsentrasjoner for kombinasjonene av 2, 20 og 200 ug/mL rituximab (Rituxan™) pluss CMC-544 er henholdsvis 0,0072, 0,0081 og 0,0072 ng/mL. De midlere inhiberende konsentrasjoner av CMC-544 pluss rituximab (Rituxan™) er tilnærmet fire ganger mer potente enn IC50av
CMC-544 alene.
E IN VIVO ANTI-TUMORAKTIVITET SUBKUTANE XENOTRANSPLANTATER OG SYSTEMATISK DISSEMINERTE B-CELLELYMFOMERI SCLD-MUS
Atymiske nakne hunnmus, 18-22 g ble gitt total kroppsbestråling (400 rads). Bestrålingen undertrykket musenes immunsystem ytterligere for å forsterke tumoropptaket. Tre dager etter bestråling ble musene subkutant injisert 107 RL-celler i Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA, fortynnet 1:1 i RPMI medium) i den dorsale, høyre side. Når tumorene nådde den riktige størrelse (0,3 g, typisk 21 dager senere), ble CMC-544, rituximab (Rituxan™) eller CHOP-terapi (se nedenfor) administrert i sterilt saltvann, 0,2 mL/mus i.p. Den første dag med medikamentadministrasjon, ble ansett som dag 1. To ytterligere doser ble gitt på dagene 5 og 9 (behandling = q4Dx3). CHOP-terapi besto av cyklofosfamid (C), (Cytoxan™, Bristol-Meyers Squibb, Co., Princeton, NJ) 40 mg/kg ip.; doxorubicinxHCl (H), (Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO) 3,3 mg/kg ip.; vincristin (O),
(GensiaSicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) 0,5 mg/kg ip.; og prednison (P), (Roxane Labs., Columbia, OH) 0,2 mg/kg po. CHO ble administrert etter den samme doseringsplan som både CMC-544 og rituximab (Rituxan™) (q4Dx3) mens prednison ble administrert peroralt annenhver dag i 5 doser (q2Dx5). Tumorer ble målt minst én gang per uke og beregnet som tumormasse (g) = 0,5 (tumorbredde/2)(tumorlengde). Gruppegjennomsnitt, SEM ble beregnet og sammenlignet med den bærerbehandlede gruppe med henblikk på statistisk signifikans ved å benytte multiple T-tester. Gruppegjennomsnitt ble registrert opp til 50 dager eller inntil enten en mus døde (hvilket forstyrret gruppegjennomsnittet) eller tumoren vokste seg for stor (>3,5g) og musen måtte avlives. Deretter ble tumormassen angitt bare for hver enkelt mus i alle behandlingsgrupper. Antallet tumorfrie mus på slutten av studien for hver behandlingsgruppe ble også registrert.
For å bestemme effekten av CMC-544 alene eller i kombinasjon med andre bioaktive midler på disseminerte lymfomer, ble SCID-musemodellen benyttet. SCLD hannmus (CB17 SCID), 20-25g, ble injisert 106 RAMOS-celler gjennom halevenen (0,2 mL). Enten 3 eller 9 dager etter celleinjeksjon, ble musene administrert bærer, konjugater (CMC-544 eller CMC-676) eller rituximab (Rituxan™), ip., i totalt 3 doser. For dag 3-behandlingsplanen ble mus gitt doser på dagene 3, 7 og 11. For dag 9-behandlingsplanen ble musene gitt doser på dagene 9, 13 og 17. For dag 9-behandlingsplanen ble det også gitt kombinasjoner av CMC-544 og rituximab (Rituxan™) som beskrevet nedenfor. Musene ble daglig overvåket med henblikk på forekomst av paralyse av bakfoten, idet de da ble avlivet. 7 til 10 mus per behandlingsgruppe ble benyttet. Gruppens gjennomsnittlige overlevelsestid (±SD), median, minimum og maksimum overlevelsestid ble alle beregnet. Forskjellen i overlevelsesfordeling mellom grupper ble bestemt ved å benytte en ikke-parametrisk Log-rangeringstest med signifikans rapportert på 0,05 nivået. Overlevelseskurvene ble konstruert ved å benytte Kaplan-Meier-metoden.
Den første studien undersøkte effekten av to ulike doseringsplaner på overlevelsestiden av SCLD-musene med de disseminerte lymfomene. Den første studien så på initiering av medikamentdosering 3 dager etter tumorcellene var injisert intravenøst (utviklingsmodell), mens den andre studien utsatte medikamentdoseringen til 9 dager etter tumorcelleinjeksjon (etablert modell). For hver studie ble CMC-544 (160 ug/kg), CMA-676 (160 ug/kg) eller rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg) administrert 3 doser ip. med 4 dagers mellomrom (Q4Dx3). I utviklingsmodellen hadde bærerbehandlede mus en gjennomsnittlig overlevelsestid på 27 dager (Figur 23, Tabell 8). CMA-676, den isotype-tilpassede kontroll for
CMC-544, øket ikke overlevelsestiden signifikant (p>0,05). CMC-544 øket signifikant overlevelsestiden til 41 dager, mens rituximab hadde en betydelig effekt og øket overlevelsestiden til >125 dager (signifikant høyere enn CMC-544, p<0,05). Forsinkelse av doseringen inn til tumorcellene hadde mulighet til å sirkulere (homing) og deponeres i målvevet (etablert modell), endret resultatene for CMC-544 og rituximab (Rituxan™). CMA-676 hadde igjen ingen signifikant effekt på overlevelsestider (Figur 24, Tabell 8). Rituximab (Rituxan™) øket den gjennomsnittlige overlevelsestid til 62,6 dager, mens CMC-544 forbedret den gjennomsnittlige overlevelsestid til 83,5 dager. Ingen signifikant forskjell forekom mellom virkningene av CMC-544 og rituximab (Rituxan™) i den etablerte modell.
En preliminær undersøkelse ble foretatt for å bestemme om rituximab (Rituxan™) hadde noen effekt, enten positiv eller negativ, på overlevelsesresponsen av CMC-544. CMC-544 (160 ug/kg) ble administrert med og uten rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg, merket høydose-medikamentkombinasjon (HD)). Dessuten ble lavere doser av CMC-544 (80 ug/kg) administrert sammen med lavere doser av rituximab (Rituxan™) (10 mg/kg). Forbindelsene ble ikke gitt separat ved de respektive 80 mg/kg eller 10 mg/kg dosene som følge av det begrensede antall mus i undersøkelsen. Denne kombinasjon, CMC-544 (80 ug/kg) med rituximab (Rituxan™) (10 mg/kg), ble merket den mediane dosekombinasjon (MD) og ble tatt med for å bestemme muligheten for lavere dosekombinasjoner av medikamentet på SCID-mus overlevelse. CMC-544 (160 ug/kg) og rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg), administrert alene, oppførte seg som ovenfor angitt i den etablerte modell. Hver av disse forlenget gjennomsnittlig overlevelsestid til henholdsvis 58,5 og 50,5 dager (Figur 25, Tabell 9). I kombinasjon var den gjennomsnittlige overlevelsestid svakt, (om ikke statistisk signifikant, p>0,05) forbedret til 64,4 dager for høydosekombinasjonen. Den midlere dosekombinasjon på 80 ug/kg CMC-544 og 10 mg/kg rituximab (Rituxan™) forbedret signifikant (p<0,05 vs bærerbehandlet) overlevelsestid til gjennomsnittlig 92,4 dager. Disse resultatene tydet på at lavere dosekombinasjoner av CMC-544 og rituximab (Rituxan™) var berettiget.
En ytterligere kombinasjonsstudie med CMC-544 og rituximab (Rituxan™) ble foretatt. Følgende behandlingsgrupper ble benyttet: CMC-544 med 40, 80 og 160 ug/kg; rituximab (Rituxan™) med 5, 10 og 20 mg/kg; og CMC-544 som 40 ug/kg pluss rituximab (Rituxan™) 5 mg/kg, CMC-544 som 80 ug/kg pluss rituximab (Rituxan™) 10 mg/kg og CMC-544 som 160 ug/kg pluss rituximab (Rituxan™) 20 mg/kg. Alle doser av rituximab (Rituxan™) forbedret svakt gjennomsnittlig overlevelsestid til området 33-40 dager (alle doser p<0,05 sammenlignet med den bærermiddel-behandlede gjennomsnittlige overlevelsestid på 25,8, Figur 26, Tabell 10). Den høye CMC-544 dose, 160 ug/kg, forbedret gjennomsnittlig overlevelsestid til 85 dager, i overensstemmelse med resultatene angitt for de to tidligere studiene. Kombinering av CMC-544 med rituximab (Rituxan™) ga ingen signifikant forbedring av overlevelsestidene (Figur 27, Tabell 10). De to lavere dosene av CMC-544 (80 og 40 ug/kg) forbedret begge signifikant (p<0,05) gjennomsnittlig overlevelsestid over den for den høye dose CMC-544. For 40 og 80 ug/kg dosene av CMC-544, var henholdsvis 90% og 80% av musene fremdeles i live etter 125 dager. Begge medikamentkombinasjonsgruppene hadde 100% overlevelse av musene inntil dag 125. Lavere doser av CMC-544 er mer effektiv enn den høye dose på 160 ug/kg.
Rituximab (Rituxan™) i kombinasjon med CMC-544, hadde ingen klar effekt på aktiviteten av CMC-544 i den disseminerte B-cellemodell i SCID-mus i de undersøkte doser (se ovenfor). Hvorvidt CMC-544, koadministrert med rituximab (Rituxan™), resulterte i enten økning eller inhibering av antitumoraktivitet ble også vurdert ved å benytte den subkutane RL B-lymfom xenotransplantatmodellen i Balb/c nakne mus. I den subkutane B-lymfommodell ble tumorene utviklet til en gjennomsnittlig tumormasse på 300 mg, hvoretter de to medikamenter som var gjenstand for studien ble administrert ip. CMC-544 ble benyttet som 20 eller 80 ug/kg Q4Dx3 med eller uten rituximab (Rituxan™) (20 mg/kg Q4Dx3). Samtidig administrering av rituximab (Rituxan™) verken øket eller inhiberte signifikant (p>0,05) den terapeutiske effekt av CMC-544 (Figur 28). Rituximab (Rituxan™) administrert alene, inhiberte RL B-lymfomvekst (57% inhibering av tumorvekst på dag 20, p<0,05 vs bærermiddelbehandlet) i denne studien, tilsvarende den observert med den lavere dosering av CMC-544.
Det kombinerte kjemoterapeutiske regime CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison) er det mest alminnelig anvendte til behandling av non-Hodgkins lymfompasienter. Antitumoreffekten av CHOP ble sammenlignet med den for CMC-544 i etablerte RL B-lymfom xenotransplantater. De enkelte komponenter av CHOP-regimet ble benyttet i deres respektivt maksimalt tolererbare doser, bestemt i nakne mus (data ikke rapportert), og var som følger: Cyklofosfamid (C) 40 mg/kg ip., doxorubicin (H) 3,3 mg/kg ip., vincristin (O), 0,5 mg/kg ip. og prednison (P) 0,2 mg/kg po. CHO ble administrert Q4Dx3, og P ble administrert po. Q2Dx5. CMC-544 ble administrert ip., Q4Dx3 i en dosering på 160 ug/kg calicheamicin-ekvivalenter. CHOP-behandlingen forårsaket initialt en signifikant inhibering av RL B-lymfomvekst (Figur 29). 3 uker senere vokste imidlertid tumorer på nytt med lignende veksthastigheter som for den bærermiddel-behandlede gruppe. Derimot var antitumoreffekten av CMC-544 fullstendig og vedvarte gjennom hele forsøks-perioden. Disse resultatene tyder på at CMC-544, i en betydelig lavere dose enn den maksimale ikke-dødelige dose i nakne mus, var mer effektiv enn CHOP-kombinasj onsterapien.
Disse studiene viste at rituximab (Rituxan™) tilsatt til CMC-544 forårsaket en signifikant økning i den cytotoksiske aktivitet av CMC-544 som ble observert med Ramos B-lymfomceller. En synergistisk interaksjon i Ramos-celler av rituximab (Rituxan™) og glukokortikoider er også nylig rapportert. Dessuten ble det observert en synergistisk vekstinhibering i 4 av 8 ytterligere cellelinjer med rituximab (Rituxan™) når det ble gitt i kombinasjon med 10 uM deksametason.
Rituximab (Rituxan™) 0,4 til 10 ug/mL, ble som sådan rapportert å bevirke en signifikant, men likevel liten (18% maksimum) inhibering av Ramos-cellevekst. Det var dessuten aktivt i 6 av 8 B-celle nonHodgkins lymfomcellelinjer ved inkubering som 10 ug/mL (48 timer inkubering). Ghetie et al, viste at rituximab (Rituxan™), 10 ug/mL, forårsaket en 6,2% økning i apoptose ( versus 3,5% i bærerbehandlede celler) etter 24 timers inkubering med Ramos-celler. I de foreliggende studier hadde rituximab (Rituxan™), i doser på 20 og 200 ug/mL, ingen effekt på Ramos-cellevekst når det ble administrert alene. I mus var det ingen indikasjon på interaksjon mellom CMC-544 og rituximab (Rituxan™) verken i den disseminerte modell eller den subkutane xenotransplantatmodell. De undersøkte medikamentkombinasjonene forstyrret verken hverandres effekt eller øket den. Hvorvidt redusering av dosen av hvert medikament i den disseminerte modell ville endre denne observasjon, trenger å bestemmes.
Den disseminerte B-cellelymfom-modell med Ramos-celler har vært beskrevet av Flavell et al. Median overlevelsestid for bærerbehandlede mus ble rapportert å være 34-36 dager. Mus utviklet bakfotparalyse som etter hvert ble dødelig, hvor dyrene døde kort tid etter. Histologisk analyse av organene viste at de mest vanlig involverte organer var binyrekjertler, milt og subaraknoidalrommet. Subaraknoidalromsinfiltrat strekker seg ofte inn i hjernen. Rituximab (Rituxan™) virket godt når det ble administrert i den tidlige fase av sykdomsprosessen i de disseminerte SCLD-mus (Figur 23), men var mindre imponerende ved administrering på dag 9 i den etablerte fase av modellen (Figur 24). Rituximab (Rituxan™) som er av IgGl isotype, virker mest sannsynlig gjennom musevertens effektormekanismer. Disse mekanismene inkluderer komplement-mediert cytotoksisitet og/eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet gjennom rekruttering av naturlige dreperceller som er tilstede i SCID-mus. De injiserte Ramos-tumorceller er antagelig mer følsomme tidlig for de immunmekanismer hos verten som aktiveres av rituximab (Rituxan™), før cellene har mulighet til å infiltrere de affiserte organene. Det ukonjugerte G5/44-antistoff (målmolekylet i CMC-544) hadde hittil ikke vært testet i den disseminerte tumormodell i SCLD-mus, men det hadde ingen effekt når det ble administrert i subkutane xenotransplantater. G5/44, som er av IgG4 isotypen, skulle ikke forventes å aktivere effektormekanismer i verten og ville derfor ikke frembringe antitumoraktivitet.
Calicheamicin-konjugert G5/44 (CMC-544) oppførte seg omvendt i forhold til rituximab (Rituxan™), ved å produsere bedre resultater når det ble administrert i den etablerte fase av sykdommen. Grunnen til at CMC-544 virket bedre i den etablerte fase er ikke klarlagt, men den etablerte fase representerer bedre den kliniske situasjon. CMA-676, det isotype-tilpassede, ikke-bindende kontrollkonjugat hadde ingen vesentlig effekter på de gjennomsnittlige overlevelsestider. Resultatene i den disseminerte SCLD-modell tyder klart på at dosene av CMC-544 må reduseres for å bestemme den maksimale effektive dose (MED). Dosen på 160 ug/kg var mindre aktiv enn de lavere dosene på 80 og 40 ug/kg. Det er ikke klart hvorfor dette er slik, men dosen på 160 ug/kg kan være over MED. Ytterligere studier er planlagt for å finne ut av dette.
Mohammad et al, benyttet CHOP-terapi (cyklofosfamid (C) 40 mg/kg iv., doxorubicin (H) 3,3 mg/kg iv., vincristin (O) 0,5 mg/kg iv. og prednison (P) 0,2 mg/kg po.) i en modell av subkutane xenotransplantater med en diffus storcellelymfom-cellelinje, DLCL. De doser som ble benyttet for CHOP-terapien ble bestemt til å være deres maksimalt tolererbare dose. Terapi, CHO gitt én gang iv. og P, daglig i 5 dager, ble vurdert som "aktiv" og førte til en T/C på 25,8%. Ingen tumorhelbredelser ble registrert. Resultatene i modellen beskrevet av Mohammad et al, synes å tilsvare de som ble observert med CHOP-terapi (administrert ip., Q4Dx3) i den her beskrevne RL-modell. Ikke i noen av studiene frembragte CHOP langtidshelbredelse, til forskjell fra CMC-544.
EKSEMPEL 9
STABILE FORMULERINGER AV CMC-544
Stabile formuleringer av CMC-544 for in vivo administrering ble fremstilt ved å tilsette fortynningsmidler, hjelpestoffer, bærere og stabilisatorer. Etter HIC-kromatografi ble de kromatografiske fraksjonene analysert ved SEC-HPLC og UV-analyse ved flere bølgelengder. Passende fraksjoner ble selektert for sammenslåing på grunnlag av ovennevnte analyser, som ga informasjon angående aggregatinnhold, proteinkonsentrasjon og calicheamicinlading. Hjelpestoffer, stabilisatorer, fyllmidler og buffermidler ble tilsatt for å stabilisere løsningen. Siden CMC-544 kan nedbrytes via enn rekke nedbrytningsveier må fysikalsk ustabilitet tas i betraktning ved utviklingen av formuleringer. En av hovedbetraktningene ved utviklingen av formuleringer er at hydrolysehastigheten av calicheamicin fra antistoffet må minimaliseres samtidig som den fysikalske og kjemiske integritet av anti-CD-22-antistoffet opprettholdes. Dessuten må utfelling av calicheamicin-antistoffkonjugatet, som kan forekomme under visse pH- og konsentrasjonsbetingelser, minimaliseres.
Ved utvikling av en formulering av et monomert calicheamicin-derivat-antistoffkonjugat er pH av formuleringen avgjørende, siden denne minsker nedbrytning og fysisk ustabilitet. En pH på 8,0 ble valgt for å minske hydrolysen av calicheamicin og oppretthold av riktig løselighet av konjugatet. Ytterligere data, oppnådd ved å benytte SDS-PAGE og antigenbindende ELISA, tydet på at den vesentlige strukturelle integritet og spesifisitet av antistoffet opprettholdes ved en pH på 8,0. Trometamin ble følgelig valgt som buffermiddel for å holde en pH på 8,0. En alternativ buffer kunne innbefatte dibasisk natrium-eller kaliumfosfat. Bufferkonsentrasjonsområdet kan være 5 til 50 mM. Et foretrukket pH-område på 7,5 til 8,5 foreslås for optimal stabilitet/løselighet. Den gjeldende pH-spesifikasjon for det ferdige produkt er 7,0-9,0.
Selv om stabiliteten av de buffrede konjugatløsningene er passende over kort tid, er langtidsstabiliteten dårlig. Lyofilisering benyttes for å bedre holdbarheten av konjugatene. De problemene som er forbundet med lyofilisering av en proteinløsning er godt dokumentert, og tapet av sekundær, tertiær og kvaternær struktur kan inntre under fryse- og tørkeprosesser. Sakkarose inkluderes i formuleringen for å virke som en amorf stabilisator av konjugatet og for å opprettholde strukturintegriteten av antistoffet under frysing og tørking. Konsentrasjoner på 1,5-5,0% (veki/vol) sakkarose har vært benyttet. Dessuten kan et polymert fyllstoff, så som Dextran 40 eller hydroksyetylstivelse, inkorporeres for å forbedre utseende og fysisk fasthet av de lyofiliserte kaker ved en konsentrasjon på 0,5-1,5 vekt%. Disse materialene danner lyofiliserte kaker ved relativt lave konsentrasjoner og kan benyttes til å minske det totale faststoffinnhold av den lyofiliserte formulering og derved tillate hurtigere frysetørking. Formuleringsstudier har benyttet en Dextran 40 konsentrasjon på 0,9 vekt%.
Polysorbat 80 inkluderes i formuleringen for å bedre løseligheten av konjugatet. En foretrukket konsentrasjon på 0,01% benyttes, innenfor et eventuelt område på 0,005-0,05%. Tween tilsettes også til formuleringen i en konsentrasjon på 0,91-0,05 vol%.
En elektrolytt kan også inngå i formuleringen og kan benyttes til å forbedre effektiviteten av den endelige renseprosess. Typisk benyttes natriumklorid i en konsentrasjon på 0,01M til 0,1M. Ytterligere elektrolytter som f.eks. natriumsulfat kan også benyttes som en erstatning for natriumklorid siden det lettere kan lyofiliseres. Optimalt utgjør den endelige CMC-544-løsning 1,5 vekt % sakkarose, 0,9 vekt% Dextran 40, 0,01% Tween 80, 50 mM natriumklorid, 0,01 vekt% polysorbat 80 og 20 mM trometamin.
En representativ formulering for løsningen før lyofilisering er angitt nedenfor: CMC-544 0,5 mg/mL, sakkarose 1,5 vekt%, Dextran 40 0,9 vekt%, natriumklorid 0,05M, Tween 0,01-0,05 vol%, polysorbat 80 0,01 vekt%, trometamin 0,02M, pH 8,0 og vann. Løsningen fylles over på ravgule ampuller ved en temperatur på +5° til 10°C (eventuelt ved +5°C); løsningen fryses ved en frysetemperatur på -35°C til -50°C (optimalt ved -45°C); den nedfryste løsning utsettes for et initialt frysetørkingstrinn ved et primært tørketrykk på 20 til 80 mikron (optimalt ved 60 mikron); det frysetørkede produkt holdes ved en lagringstemperatur på -10°C til -40°C (optimalt -30°C) i 24 til 72 timer (optimalt i 60 timer); og til slutt underkastes det frysetørkede produkt et andre tørketrinn ved et tørketrykk på 20-80 mikron (optimalt ved 60 mikron) ved en lagringstemperatur på +10°C til + 35°C (optimalt +25°C) i 15 til 30 timer (optimalt i 24 timer). En trykkøkningstest benyttes for å bestemme slutten av primærtørkingen. Ved avslutning av lyofiliseringssyklusen fylles ampullene med nitrogen og proppes.
Tabell 11 angir forskjeller i formuleringen benyttet for CMC-544 og formuleringen benyttet for CMC-676. Vesentlige forskjeller mellom CMA-676-formuleringen og formuleringen benyttet for CMC-544 omfatter redusert proteinkonsentrasjon i den nye formuleringen (0,5 mg/mL), anvendelsen av trometamin som buffer og innholdet av 0,01% Tween 80. Dette resulterer i at det rekonstituerte CMC-544 i den nye formuleringen er klart til forskjell fra den turbiditet som ses i den rekonstituerte CMA-676-formulering (se Tabelll2 og 13).
Alle referanser og patenter som er sitert ovenfor inkorporeres her ved referanse. En rekke modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse er inkludert i beskrivelsen ovenfor og anses åpenbare for fagmannen. Slike modifikasjoner og endringer av konjugasjonsprosessen, konjugatene fremstilt etter prosessen og de blandinger/formuleringer som omfatter konjugater, anses å falle inn under rammen av patentkravene.
BIBLIOGRAFI
1. G. Kohler and Milstein, C„ Naturs, 256:495 (1975).
2. T. G. Hose and Blair, A.H. CRC Critical Rev. Drug Carrier Systems 3:263
(1987).
3. U.S. Patent No. 5,877,296
4. U.S. Patent No. 5,773,001
5. U.S. Patent No. 5,714,586
6. U.S. Patent No. 5,712,374
7. U.S. Patent. No. 5,053,394
8. J. Tramontano; et al., J. Mol. Recognit. 7:9 (1994).
9. H. McConnell and Hoess, J., J. Mol. Biol. 250:460 (1995).
10. Nord et al., Nat Biotechnol. 15:772 (1997).
11. Nord eta!., Protein Eng. 8:601 (1995).
12. Ku and Schultz, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 92:6552 (1995).
13. Markand et al., Biochemistry 35:8045 (1996).
14. Markand et al., Biochemistry 35:8098 (1996).
15. Rottgen and Collins, Gene 164:243 (1995).
16. Wang et al, J. Biol. Chem., 270:12250 (1995).
17. l.D. Bernstein et al., J. Clin. Invest. 79:1153 (1987).
18. t.D. Bernstein et al., J. Immunol. 128:867-881 (1992).
19. Kabat ef al. Seqencitvg. of Proteins of Immunological . Interest, 1:310-334
(1994).
20. PCT publication No. WO 91/09967.
21. Yang ef a/., J. Mol. Biol., 254, 392-403 (1995).
22. Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368 (1996).
23. Patten ef al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, (1997).
24. Thompson ef al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, (1996).
25. Crameri et al., Nature, 391, 288-291, (1998).
26. U.S. Patent No. 4,671,958
27. U.S. Patent No. 4,970,198
28. U.S. Patent No. 5,037,651
29. U.S. Patent No. 5,079,233
30. U.S. Patent No. 5,877,296
31. PCT publication No. WO 98/20734
32. Trail P and Bianchi A„ Current Opin. Immunol., 11:584-588, (1999). 33. Dubowchik G. and Walker M., Pharmacol. & Therapeutics, 83:67-123 (1999). 34. Bross P.F., Beitz J., Chen G., Chen X.H., Duffy E., Keiffer-Bross P., Befc J., Chen G., Chen X., Duffy E., Kieffer L., Roy S., Sridhara R., Rahman A.,
Williams G., Pazdur R., Clin. Cancer Res., 7:1490-1496 (2001).
35. Berger NI., Leopold L, Dowell J., Korth-Bradley J., Sherman M„ Invest. New
Drugs; 20: 395-406 (2002). 36. Sievers E., Larson R., Stadmauer E., Estey E., Lowenberg B., Dombret H., Karanes C, Theobald M., Bennet J., Sherman M., et al., J. Clin. Oncol.;
19:3244-3254 (2001).
37. Larson R., Boogaerts M., Estey E., Karanes C, Stadtmauer E., Sievers E., Mineur P., Bennett J„ Berger M., Eten C. et al. Leukemia; 16:1627-1636
(2002). 38. Hamann P., Hinman L, Beyer C, Kindh D., Upeslacis J., Flowers D„
Bernstein 1„ Choice of Linker. Bioconj. Chem.; 13:40-46 (2002).
39. Hamann P., Hinman L, Hollander I., Beyer C, Lindh D., Holcomb R., Hallet W., Tsou H„ Upeslacis J., Shochat D., et al., Bioconj. Chem.; 13:47-58
(2002).
40. Lee M., Dunne T., Chang C, Siegal NI., Morton G., Ellestad G„ McGahren
W., Borders D.., J. Am. Chem. Soc. 1992; 114:985-987 (1992).
41.2ein N., Sinha A., McGahren W., Ellestad G., Science; 240:1198-1201
(1988).42. Thorson J., Sievers E., Ahlert J., Shepard E., Whitwam R., Onwueme K.,
Ruppen M., Current Pharmaceut. Design; 6:1841-1879 (2000).
43. Andrews R., Singer J., Bernstein I., J. Exp. Med.; 169:1721-1731 (1989).
44. Kreitman R.J., Current Pharmaceut. Biotech.; 2:313-325 (2001).
45. Pastan I., Kreitman R.J., Current Opin. Investig. Drugs, 3{7}:1089-1091
(2002).
46. Kreitman R.J., Curr. Opin. Mol. Ther.; 5:44-551 (2003).
47. Crocker P.R. and Varki A. Siglecs, Trends in Immunol.; 22:337-342 (2001). 48. Hursey M., Newton D.L., Hansen H.J., Ruby D., Goldenberg D.M., Rybak S.M., Leukemia and Lymphoma; 43:953-959 (2002). 49. Nitschke L, Fioyd H., and Crocker P.R., Scand. J. (immunol.; 53:227-234
(2001). 50. Moyron-Quiroz J.E., Partida-Sanchez S., Donis-Hernandez R., Sandoval-Montes C. and Santos-Argumedo L, Scand. J. Immunol.; 55:343-351 (2002). 51. TedderT.F., Tuscano J., SatoS., Kehrl J.H., Ann. Rev. Immunol.; 15:481-504
(1997).
52. Hanna R., Ong G.L, Mattes M.J., Cancer Res.; 56:3062-3068 (1996).
53. Shan D. and Press O.W., J. Immunol. 1995; 154:4466-4475 (1995). 54. Dowell JA, Korth-Bradley J., Liu H„ King S.P., Berger M.S., J. Clin.
Pharmacol.; 41:1206-1214 (2001).
55. Gibaldi M., Perrier D., Pharmacokinetics, 2"" ed., Marcel-Dekker lnc.; NY
(1982).
56. Van Horssen P.J., Preijers, F.W., Van Oosterhout, Y.V., Eting W.M. and De
Witte, T., Leukemia & Lymphoma; 39(5-6):591-599 (2000).
57. Hinman L.M., Hamann P.R., Wallace R„ Menendez A.T., Durr F.E., Upeslacis
J., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993).58. Kreitman R.J., Wilson W.H., Bergeren K., Raggio M., Stetler-Stevenson M.,
Fitzgerald D.J., Pastan I., N. Engl. J. Med.; 345:241-247 (2001).
59. Leonard J.P. and Link B.K., Sem. Oncol. 29:81-86 (2002).
60.Schindler J., Sausville E., Messmann R., Uhr J.W. & Vitetta, E.S., Clin.Cancer
Res., 7,255-258 (2001). 61. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, Eds., Cancer Principles and Fractice of Oncology, 6th Editlon, Publishers: Lippincott,
Williams and Wilkins (2001).
62. Edward Chu and Vincent T, DeVita, Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, Publishers: Jones and Bartlett (2002).

Claims (127)

1. Metode for fremstilling av et preparat med redusert lav konjugert fraksjon (LCF) under 10 prosent omfattende monomere calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugater og ukonjugerte anti-CD22 antistoffer, hvor de monomere calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugater har formelen, Pr(-X-W)m, hvor: Pr er et antistoff; X er en hydrolyserbar linker som har formelen (CO - Alk<1>- Sp<1>- Ar - Sp<2>- Alk<2>- C(Z<!>) =Q - Sp), hvor Alk<1>og Alk2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede; Sp<1>er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)„- Z hvor X, Y og Z uavhengig er en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', -(CH2)„COOR, -S(CH2)„COOR', - 0(CH2)nCONHR' eller -S(CH2)„CONHR', med det forbehold at når Alk<1>er en binding, er Sp<1>en binding; n er et helt tall fra 0 til 5; R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino, eller (C1-C3) trialkylammonium -A- hvor A- er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt; Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', - 0(CH2)nCOOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller
med hver naftyliden eller fenotiazin eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', -0(CH2)„COOR', -S(CH2)„COOR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Spl en binding bare forbundet med nitrogen; Sp2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk2 er en binding, er Sp<2>en binding; Z<1>er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR, -ONHR, - 0(CH2)nCOOR, -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor; Sp er en lineære eller forgrenede divalent eller trivalent (Ci-Cis) rest, divalent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3-C18) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroaryl-aryl (Ci-Cis) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkyl-alkyl (Ci-Cis) rest eller divalent eller trivalent (C2-Ci8) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er fortrinnsvis furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminocourmarinyl eller fenazinyl og hvor hvis Sp er en trivalent rest, kan Sp i tillegg være substituert med lavere (C1-C5) dialkylamino, lavere (C1-C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (C1-C5) alkyltiogrupper; og Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NHO-; W er en calicheamicin; m er den gjennomsnittlige belastning for et renset konjugeringsprodukt slik at calicheamicin utgjør 4-10% av konjugatet etter vekt; og (-X-W)m er et calicheamicinderivat; idet metoden omfatter trinnene: (1) tilsetning av calicheamicinderivatet til antistoffet hvor calicheamicinderivåtet er 4,5-11 vekt% av antistoffet; (2) inkubering av calicheamicinderivatet og antistoffet i en ikke-nukleofil, protein-kompatibel, bufiret løsning som har en pH i området fra ca. 7 til 9 for å produsere et preparat omfattende monomere calicheamicinderivatet/antistoff konjugater, hvor løsningen videre omfatter (a) et organisk medløsningsmiddel og (b) minst én C6-C18karboksylsyre eller dens salt og hvor inkuberingen blir utført ved en temperatur i området fra omtrent 30°C til ca. 35°C i et tidsrom i området fra ca. 15 minutter til 24 timer; og (3) utsette preparatet produsert i trinn (2) for en kromatografisk separeringsprosess for å separere monomere calicheamicinderivat/antistoffkonjugater med en belastning i området 4-10 vekt% calicheamicin og med lav konjugert fraksjon (LCF) under 10 prosent fra ukonjugerte antistoff, calicheamicinderivatet og aggregerte konjugater.
2. Metode ifølge krav 1, hvor antistoffet er valgt fra gruppen bestående av et monoklonalt antistoff, et kimært antistoff, et humant antistoff, et humanisert antistoff, et enkelt kjede antistoff og et biologisk aktivt antistoffragment hvor det biologiske aktive fragmentet er en Fab, en modifisert Fab, Fab', F(ab')2, F v og en tungkjede monomer eller dimer.
3. Metode ifølge hvilket som helst et av kravene 1 og 2, hvor antistoffet er et anti-CD22 antistoff.
4. Metode ifølge krav 3, hvor anti-CD22 antistoffet er et CDR-podet antistoff.
5. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3 og 4, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede hvor den variable domenen omfatter en CDR som har minst en av sekvensene gitt i SEKV LD NR: 1 for CDR-H1, SEKV LD NR: 2 eller SEKV ID NR: 13 eller SEKV LD NR: 15 eller SEKV LD NR: 16 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 23 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 27 for CDR-H2 og SEKV LD NR: 3 for CDR-H3 og omfatter en lettkjede hvor den variable domenen omfatter en CDR som har minst én av sekvensene gitt i SEKV ID NR: 4 for CDR-L1, SEKV ID NR: 5 for CDR-L2 og SEKV ID NR: 6 for CDR-L3.
6. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-5, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter SEKV LD NR: 1 for CDR-H1, SEKV LD NR: 2 eller SEKV LD NR: 13 eller SEKV LD NR: 15 eller SEKV LD NR: 16 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 23 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 27 for CDR-H2, SEKV ID NR: 3 for CDR-H3, SEKV LD NR: 4 for CDR-L1, SEKV LD NR: 5 for CDR-L2 og SEKV ID NR: 6 for CDR-L3.
7. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-6, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter SEKV ID NR: 1 for CDR-H1, residiene 50-66 til SEKV LD NR: 27 for CDR-H2, SEQ LD NO: 3 for CDR-H3, SEKV LD NR: 4 for CDR-L1, SEKV ID NR: 5 for CDR-L2 og SEQ LD NO: 6 for CDR-L3.
8. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-7, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en variabel domene omfattende humane akseptor rammeverksregioner og ikke-humane donor CDRs.
9. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-8, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende en tungkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 1, 28, 48, 72 og 97 til SEKV LD NR: 8 okkupert av henholdsvis Glu, Arg, Ile, Ala og Thr, hvor resten av tungkjede rammeverksregionen er okkupert av tilsvarende residier av det humane akseptor rammeverket til SEKV LD NRs: 21 eller 22.
10. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-8, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende en tungkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 1, 28, 48, 68, 70, 72 og 97 til SEKV ID NR: 8 okkupert av henholdsvis Glu, Arg, Ile, Ala, Leu, Ala og Thr, hvor resten av tungkjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 21 eller 22.
11. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lettkjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
12. Metode ifølge krav 10, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lett kjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av Val, Val, Leu, His, Gin, og Asp, henholdsvis, hvor resten av lettkjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV LD NRs: 17 eller 18.
13. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9 og 11, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 3, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val, Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lett kjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
14. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 10 og 12, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregionen omfattende donorresidiene i stillingene 2, 3, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val,Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lett kjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
15. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9 og 11, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende SEKV ID NR: 27.
16. Metode ifølge krav 13, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tung kjede variabel domene omfattende SEKV ID NR: 27.
17. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, 11 og 15, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende SEKV ID NR: 19.
18. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 10 og 12, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende SEKV LD NR: 19.
19. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, 11, 15 og 17, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede bestående av residiene 20-466 til SEKV LD NR: 30 og hvor antistoffet er uttrykt hos en pattedyrcelle.
20. Metode ifølge krav 16, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tung kjede bestående av residiene 20-466 til SEKV LD NR: 30 og hvor antistoffet er uttrykt hos en pattedyrcelle.
21. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, 11, 15, 17 og 19, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede bestående av residiene 21-239 til SEKV LD NR: 28 og hvor antistoffet er uttrykt hos en pattedyrcelle.
22. Metode ifølge krav 18, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lett kjede bestående av residiene 21-239 til SEKV LD NR: 28 og hvor antistoffet er uttrykt hos en pattedyrcelle.
23. Metode ifølge krav 19, hvor anti-CD22 antistoffet er et resultat av ekspresjon av SEKV LD NR: 31 i pattedyrcellen.
24. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 21 eller 23, hvor anti-CD22 antistoffet er et resultat fra ekspresjon av SEKV LD NR: 29 i pattedyrcellen.
25. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, 11, 15, 17, 19, 21, 23 og 24, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede omfattende SEKV ID NR: 30.
26. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-9, 11,15, 17, 19, 21 og 23-25, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede omfattende SEKV ID NR: 28.
27. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 3-26, hvor anti-CD22 antistoffet er et variant antistoff oppnådd ved en affinitets modningsprotokoll og har øket affinitet for humant CD22.
28. Metode ifølge krav 3, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lett kjede variabel region omfattende SEKV LD NR: 7 og en tungkjede variabel region omfattende SEKV ID NR: 8.
29. Metode ifølge krav 3, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en hybrid CDR omfattende en forkortet donor CDR sekvens hvor den manglende delen av donor CDR blir erstattet med en annen sekvens og danner en funksjonell CDR.
30. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-29, hvor calicheamicin er gamma calicheamicin eller N-acetyl gamma calicheamicin.
31. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1 -30, hvor calicheamicin er funksjonalisert med 3-merkapto-3-metyl butanoyl hydrazid.
32. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-31, hvor den hydrolyserbare linkeren omfatter 4-(4-acetylfenoksy) smørsyre (AcBut).
33. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-32, hvor det organiske medløsningsmidlet er valgt fra gruppen bestående av propylenglykol, etylenglykol, etanol, DMF og DMSO.
34. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-33, hvor minst én karboksylsyre er valgt fra gruppen bestående av nanonoinsyre, decansyre, undecansyre, og dodecansyre eller dens salt.
35. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-34, hvor minst én karboksylsyre er gitt i en konsentrasjon på mindre enn 200 mM.
36. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-35, hvor minst én karboksylsyre er gitt i en konsentrasjon på mindre enn 100 mM.
37. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-36, hvor minst én karboksylsyre er gitt i en konsentrasjon på mindre enn 50 mM.
38. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, hvor den kromatografiske separeringsprosessen i trinn (3) er størrelse eksklusjonskromatografi (SEC).
39. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, hvor den kromatografiske Separeringsprosessen i trinn (3) er HPLC, FPLC eller Sephakryl S-200 kromatografi.
40. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, hvor den kromatografiske separeringsprosessen i trinn (3) er hydrofob interaksjonskromatografi (HIC).
41. Metode ifølge krav 40, hvor den hydrofobe interaksjonskromatografien (HIC) blir utført ved anvendelse av hvor den hydrofobe interaksjonskromatografien (HIC) er utført ved anvendelse av et fenyl-basert kromatografisk medium, et butyl-basert kromatografisk medium, et oktyl-basert kromatografisk medium, et eter-basert kromatografisk medium, eller et metyl-basert kromatografisk medium.
42. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 40 og 41, hvor den hydrofobe interaksjonskromatografien (HIC) blir utført ved anvendelse av et butyl-basert kromatografisk medium.
43. Preparat produsert ved metoden ifølge hvilket som helst av kravene 1 -42.
44. Preparat med redusert lav konjugert fraksjon (LCF) under 10 prosent omfattende monomert calicheamicinderivatet/anti-CD22 antistoffkonjugater og ukonjugerte anti-CD22 antistoffer, hvor det monomere calicheamicinderivat/anti-CD22 antistoffkonjugater har formelen, Pr(-X-W)m, hvor: Pr er et antistoffet; X er en hydrolyserbar linker som har formelen (CO - Alk<1>- Sp<1>- Ar - Sp2 - Alk<2>- C(Z<!>) =Q - Sp), hvor Alk<1>og Alk2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylen kjede; Spl er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z uavhengig er en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må deretter minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR, -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)„COOR', - 0(CH2)nCONHR' eller -S(CH2)„CONHR', med det forbehold at når Alk<1>er en binding, er Sp<1>en binding; n er et helt tall fra 0 til 5; R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino, eller (C1-C3) trialkylammonium -A- hvor A- er et farmasøytisk akseptabelt anion completing en salt; Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -CONHR', - 0(CH2)nCOOR', -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller
med hver naftyliden eller fenotiazin eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR, - CONHR', -0(CH2)„COOR, -S(CH2)„COOR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Spl en binding bare forbundet med nitrogen; Sp<2>er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk2 er en binding, er Sp<2>en binding; Z<1>er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C5)alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, -COOR', -ONHR', - 0(CH2)nCOOR, -S(CH2)„COOR', -0(CH2)„CONHR' eller -S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor; Sp er en lineær eller forgrenet divalent eller trivalent (Ci-Cis) rest, divalent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3-C18) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroaryl-aryl (Ci-Cis) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkyl-alkyl (Ci-Cis) rest eller divalent eller trivalent (C2-Ci8) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er fortrinnsvis furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminocourmarinyl eller fenazinyl og hvor hvis Sp er en trivalent rest, Sp kan være i tillegg substituert med lavere (C1-C5) dialkylamino, lavere (C1-C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (C1-C5) alkyltiogrupper; og Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NHO-; W er et calicheamicin; m er en gjennomsnittlig belastning for et renset konjugeringsprodukt slik at calicheamicin utgjør 4-10% av konjugatet etter vekt; og (-X-W)m er et calicheamicinderivatet.
45. Preparat ifølge krav 44, hvor anti-CD22 antistoffet er valgt fra gruppen bestående av et monoklonalt antistoffet, et kimært antistoff, et humant antistoff, et humanisert antistoff, et enkel kjede antistoff og et biologisk aktivt antistoffragment hvor det biologiske aktive fragmentet er en Fab, en modifisert Fab, Fab', F(ab')2, Fv og en tungkjede monomer eller dimer.
46. Preparat ifølge krav 45, hvor anti-CD22 antistoffet er et CDR podet antistoff.
47. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45 og 46, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede hvor den variable domenen omfatter en CDR som har minst én av sekvensene gitt i SEKV LD NR: 1 for CDR-H1, SEKV ID NR: 2 eller SEQ LD NO: 13 eller SEKV LD NR: 15 eller SEKV ID NR: 16 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 23 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 27 for CDR-H2 og SEKV LD NR: 3 for CDR-H3 og omfatter en lettkjede hvor den variable domenen omfatter en CDR som har minst én av sekvensene gitt i SEKV ID NR: 4 for CDR-L1, SEKV ID NR: 5 for CDR-L2 og SEQ LD NO: 6 for CDR-L3.
48. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 45-47, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter SEKV LD NR: 1 for CDR-H1, SEKV LD NR: 2 eller SEKV LD NR: 13 eller SEKV LD NR: 15 eller SEKV LD NR: 16 eller residiene 50-66 til SEKV LD NR: 23 eller residiene 50-66 til SEKV ID NR: 27 for CDR-H2, SEKV ID NR: 3 for CDR-H3, SEKV LD NR: 4 for CDR-L1, SEKV LD NR: 5 for CDR-L2 og SEKV ID NR: 6 for CDR-L3.
49. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 45-48, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter SEKV ID NR: 1 for CDR-H1, residiene 50-66 til SEKV LD NR: 27 for CDR-H2, SEQ LD NO: 3 for CDR-H3, SEKV LD NR: 4 for CDR-L1, SEKV ID NR: 5 for CDR-L2 og SEQ LD NO: 6 for CDR-L3.
50. Preparat ifølge av hvilken som helst av kravene 45-49, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en variabel domene omfattende humane akseptor rammeverksregioner og ikke-humane donor CDRs.
51. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-50, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende en tungkjede rammeverksregionen omfattende donorresidiene i stillingene 1, 28, 48, 72 og 97 til SEKV ID NR: 8 okkupert av Glu, Arg, Ile, Ala og Thr, henholdsvis, hvor resten av tungkjede rammeverksregionen er okkupert av de de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 21 eller 22.
52. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-50, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende en tungkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 1, 28, 48, 68, 70, 72 og 97 til SEKV ID NR: 8 okkupert av Glu, Arg, Ile, Ala, Leu, Ala og Thr, henholdsvis, hvor resten av tungkjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 21 eller 22.
53. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lettkjede rammeverksregionen er okkupert av de de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
54. Preparat ifølge krav 52, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donor residiene i stillingene 2, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, henholdsvis, hvor resten av lettkjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: Heller 18.
55. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51 og 53, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 3, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val,Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lett kjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
56. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 52 og 54, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende en lettkjede rammeverksregion omfattende donorresidiene i stillingene 2, 3, 4, 42, 43, 50 og 65 til SEKV ID NR: 7 okkupert av henholdsvis Val,Val, Val, Leu, His, Gin og Asp, hvor resten av lett kjede rammeverksregionen er okkupert av de tilsvarende residiene av det humane akseptor rammeverket til SEKV ID NRs: 17 eller 18.
57. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51 og 53, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende SEKV ID NR: 27.
58. Preparat ifølge krav 55, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede variabel domene omfattende SEKV LD NR: 27.
59. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, 53 og 57, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende SEKV LD NR: 19.
60. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 52 og 54, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende SEKV ID NR: 19.
61. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, 53, 57 og 59, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede bestående av residiene 20-466 til SEKV ID NR: 30 og hvor antistoffet blir uttrykt hos en pattedyrcelle.
62. Preparat ifølge krav 58, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede bestående av residiene 20-466 til SEKV LD NR: 30 og hvor antistoffet blir uttrykt hos en pattedyrcelle.
63. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, 53, 57, 59 og 61, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede bestående av residiene 21-239 til SEKV ID NR: 28 og hvor antistoffet blir uttrykt hos en pattedyrcelle.
64. Preparat ifølge krav 60, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede bestående av residiene 21-239 til SEKV LD NR: 28 og hvor antistoffet blir uttrykt hos en pattedyrcelle.
65. Preparat ifølge krav 61, hvor anti-CD22 antistoffet er et resultat av ekspresjon av SEKV LD NR: 31 i pattedyrcellen.
66. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 63 og 65, hvor anti-CD22 antistoffet er et resultat av ekspresjon av SEKV ID NR: 29 i pattedyrcellen.
67. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, 53, 57, 59, 61, 63, 65 og 66, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en tungkjede omfattende SEKV ID NR: 30.
68. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-51, 53, 57, 59, 61, 63 og 65-67, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede omfattende SEKV LD NR: 28.
69. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 45-68, hvor anti-CD22 antistoffet er et variant antistoff oppnådd ved en affinitets modningsprotokoll og har øket affinitet for human CD22.
70. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 44, 45 og 48-50, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en lettkjede variabel region omfattende SEKV LD NR: 7 og en tungkjede variabel region omfattende SEKV LD NR: 8.
71. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 44 og 45, hvor anti-CD22 antistoffet omfatter en hybrid CDR omfattende en forkortet donor CDR sekvens hvor den manglende delen av donor CDR blir erstattet med en annen sekvens og danner en funksjonell CDR.
72. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 44-71, hvor calicheamicin er gamma calicheamicin eller N-acetyl gamma calicheamicin.
73. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 44-72, hvor calicheamicin er funksjonalisert med 3-merkapto-3-metyl butanoyl hydrazid.
74. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 44-73, hvor den hydrolyserbare linkeren omfatter 4-(4-acetylfenoksy) smørsyre (AcBut).
75. Preparat omfattende monomere calicheamicinderivatet/anti-CD22 antistoffet konjugater og ukonjugerte anti-CD22 antistoffer, hvor monomere calicheamicinderivatet/anti-CD22 antistoff konjugater har formelen:
hvor antistoffet omfatter SEKV ID NR: 1 for CDR-H1, residiene 50-66 av SEQ LD NO: 27 for CDR-H2, SEKV ID NR: 3 for CDR-H3, SEKV LD NR: 4 for CDR-L1, SEQ LD NO: 5 for CDR-L2 og SEKV ID NR: 6 for CDR-L3; hvor n er 3 til 9; og hvor preparatet er mindre enn 10 vekt% av ukonjugerte anti-CD22 antistoffer.
76. Preparat ifølge krav 75, hvor antistoffet omfatter en lettkjede variabel region som angitt i SEKV LD NR: 19 og en tungkjede variabel region som angitt i SEKV LD NR: 27.
77. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 75 og 76, hvor antistoffet omfatter en lettkjede bestående av residiene 21 til 239 til SEKV LD NR: 28 og en tungkjede bestående av residiene 20-466 til SEKV ID NR: 30 og hvor antistoffet blir uttrykt i en pattedyrcelle.
78. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 75-77, hvor antistoffet omfatter en lettkjede bestående av en aminosyresekvens som er et resultat av ekspresjon av SEQ LD NO: 29 hos en pattedyrcelle og en tungkjede bestående av en aminosyresekvensen som er et resultat av ekspresjon av SEKV ID NR: 31 hos en pattedyrcelle.
79. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 75-78, som videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel, fortynningsmiddel eller bærer.
80. Metode for fremstilling av en stabil lyofilisert formulering av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 44-79, idet metoden omfatter: (a) oppløsning av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 44-79 til en endelig konsentrasjon på 0,5 til 2 mg/ml i en løsning omfattende et cryobeskyttelsesmiddel i en konsentrasjon på l,5%-5% av vekt, et polymert bulk middel i en konsentrasjon på 0,5-1,5 vekt%, elektrolytter ved en konsentrasjon på 0,01 M til 0,1 M, et oppløselighets lettende middel i en konsentrasjon på 0,005-0,05 vekt%, bufferingsmiddel i en konsentrasjon på 5-50 mM slik at den endelige pH til løsningen er 7,8-8,2 og vann; (b) dispensering av løsningen ovenfor i medisinglass ved en temperatur på +5°C til +10°C; (c) frysing av løsningen ved en frysetemperatur på -30°C til -50°C; (d) utsette den frosne løsningen for et innledende fryse-tørke trinn ved et primært tørke trykk på 20 til 80 mikron ved en hylle-temperatur ved -10°C til -40°C i 24 til 78 timer; og (e) utsette det frysetørkede produktet fra trinn (d) for et sekundært tørketrinn ved et tørke trykk på 20 til 80 mikron ved en hylle-temperatur på +10°C til +35°C i 15 til 30 timer.
81. Metode ifølge krav 80, hvor den stabile lyofiliserte formuleringen videre omfatter et cytotoksisk medikament.
82. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80 og 81, hvor den stabile lyofiliserte formulering videre omfatter en vekstfaktor.
83. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-82, hvor stabil lyofilisert formulering videre omfatter en hormon.
84. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-83, hvor stabil lyofilisert formulering videre omfatter et antistoffet valgt fra gruppen bestående av anti-CD19 antistoffet, anti-CD20 antistoffet og anti-CD33 antistoffet.
85. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-84, hvor cryoprotectant er valgt fra gruppen bestående av agarose, aldaric syre, alditol, aldonic syre, aldoses, alginsyre, allose, altrose, amino sukkere, amylopectin, amylose, arabinans, arabinose, askorbinsyre, carrageenan, cellulose, chitin, chondroitin, dermatan, dekstran, erythrose, erythrulose, etylenglykol, fructans, fruktose, fucans, fucoidan, galactans, galactocarolose, galactosamin, galaktose, galacturonans, galakturonsyre syre, glucans, glucaric syre, glukonsyre syre, glucosamin, glukose, glucuronsyre, glyceraldehyder, glycerol, glykogen, gulose, heptose, heksose, hyaluronic syre, idose, inositol, isoaskorbinsyre, keratin, ketoses, lakton, laktose, levan, lyxose, maltose, mannans, mannitol, mannose, mannuronic syre, metyl a-glucopyranosid, neuraminic syre, pectic syrer, pectins, pentaerytritol, pentose, polyetylenglykol, polypropylenglykol, psicose, pullulan, pustulan, ribose, sorbitol, sorbose, stivelse, sukrose, tagatose, talose, threose, trehalose, uronic syre, xantan gummi, xylans, xylose og xylulose.
86. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-85, hvor cryobeskyttende middel er sukrose.
87. Metode ifølge krav 86, hvor sukrosen er til stede i en konsentrasjon på 1,5 vekt%.
88. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-87, hvor det polymere bulkmidlet er Dekstran 40 og er i en konsentrasjon på 0,9 vekt%.
89. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-88, hvor det polymere bulkmidlet er hydroksyetyl stivelse 40 og er i en konsentrasjon på 0,9 vekt%.
90. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-89, hvor elektrolytten er natrium klorid og er til stede i en konsentrasjon på 0,05 M.
91. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-90, hvor oppløselighets hjelpe midlet er et overflateaktivt middel.
92. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-91, hvor det overflateaktive midlet er polysorbat 80 og er til stede i en konsentrasjon på 0,01 vekt%.
93. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-92, hvor bufferingsmidlet er tromethamin og er til stede i en konsentrasjon på 0,02 M.
94. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-93, hvor pH i løsningen i trinn (a) er 8,0.
95. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-94, hvor løsningen i trinn (b) er dispensert i medisinglass ved en temperatur på +5°C.
96. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-95, hvor i trinn (c) frysing av løsningen i medisinglasset blir utført ved en frysetemperatur på -45°C.
97. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-96, hvor i trinn (d) den frosne løsningen blir underkastet et innledende frysetørke trinn ved et primært tørke trykk på 60 mikron og ved en hylle temperatur på -30°C i 60 timer.
98. Metode ifølge hvilket som helst av kravene 80-97, hvor i trinn (e), det frysetørkete produktet i trinn (d) blir underkastet et sekundært tørke trinn ved et tørke trykk på 60 mikron ved en hylle (shelf) temperatur på +25°C i 24 timer.
99. Stabil lyofilisert formulering fremstilt ved metoden ifølge hvilket som helst av kravene 80-98.
100. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller den stabilt lyofiliserte formuleringen ifølge krav 99 for behandling av en B-celle ondartet sykdom.
101. Anvendelse ifølge krav 100, hvor den B-celle ondartete sykdommen er valgt fra gruppen bestående av et leukemi, et lymfom, et Lkke-Hodgkin's lymfom (NHL), akutt lymfocytisk leukemi (ALL), kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) og multippelt myelom.
102. Anvendelse ifølge krav 100 eller krav 101, hvor preparatet ifølge hvilket som helst et av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare subkutant, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, intramedullært, intratekalt, transdermalt, transkutant, intranasalt, topisk, enterealt, intravaginalt, sublingvalt eller rektalt.
103. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-102, hvor preparatet ifølge hvilket som helst et av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare ved en effektiv dose fra 0,1 mg/m2 til 50 mg/m2.
104. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-103, hvor preparatet ifølge hvilket som helst én av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare ved en effektiv dose fra 0,4 mg/m2 til 30 mg/m2.
105. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-104, hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med én eller flere antistoffer, vekstfaktorer, hormoner, cytokiner, anti-hormoner, xantiner, interleukiner, interferoner og cytotoksiske medikamenter.
106. Anvendelse ifølge krav 105, hvor et eller flere antistoffer omfatter et antistoff valgt fra gruppen bestående av anti-CD19 antistoffet, anti-CD20 antistoffet og anti-CD33 antistoffet.
107. Anvendelse ifølge krav 106, hvor anti-CD20 antistoffet er rituximab.
108. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-107, hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med et cytokin eller vekstfaktor valgt fra gruppen bestående av interleukin 2 (LL-2), TNF, CSF, GM-CSF og G-CSF.
109. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-108, hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med et hormon valgt fra gruppen bestående av et østrogen, et androgen, et progestin og et kortikosteroid.
110. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-109, hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med et cytotoksisk medikament valgt fra gruppen bestående av aclarubicin, adriamycin, ancitabin, azacitidin, bleomycin, broxuridin, capecitabin, karboplatin, carubicin, cisplatin, cladribin, cyklofosfamid, cytarabin, dakarbazin, daunorubicin, decitabin, doxifluridin, doxorubicin, enocitabin, epirubicin, etoposid, floxuridin, fludarabin, flurouracils, gemcitabin, gougerotin, idarubicin, mechlorethamin, menogaril metotrexat, mitomycin, mitoksantron, nogalamycin, pentostatin, pitarubicin, prednison, prokarbazin, puromycin, taxol, taxol analoger, tegafur, tiazofurin, trifluridin, valrubicin, vinblastin, vincristin og zorubicin.
111. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 100-110, hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare før, etter eller samtidig med administrering av én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske medikamenter, hvor én eller flere kombinasjoner av de cytotoksiske medikamentene er valgt fra gruppen bestående av: A. CHOPP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og prokarbazin); B. CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison); C. COP (cyklofosfamid, vincristin og prednison); D. CAP-BOP (cyklofosfamid, doxorubicin, prokarbazin, bleomycin, vincristin og prednison); E. m-BACOD (metotrexat, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, dexamethason og leucovorin); F. ProMACE-MOPP (prednison, metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin); G. ProMACE-CytaBOM (prednison, metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, cytarabin, bleomycin og vincristin); H. MACOP-B (metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, prednison, bleomycin og leucovorin); I. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin); J. ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dakarbazin); K. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin) alternerende med ABV (adriamycin/doxorubicin, bleomycin og vinblastin); L. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin) alternerende med ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dakarbazin); M. ChlVPP (chlorambucil, vinblastin, prokarbazin og prednison); N. LMVP-16 (ifosfamid, metotrexat og etoposid); O. MIME (metyl-gag, ifosfamid, metotrexat og etoposid); P. DHAP (dexamethason, høy-dose cytarabin og cisplatin); Q. ESHAP (etoposid, metylpredisolon, høy-dose cytarabin og cisplatin); R. CEPP(B) (cyklofosfamid, etoposid, prokarbazin, prednison og bleomycin); S. CAMP (lomustin, mitoksantron, cytarabin og prednison); T. CVP-1 (cyklofosfamid, vincristin og prednison); U. ESHOP (etoposid, metylpredisolon, høy-dose cytarabin, vincristin og cisplatin); V. EPOCH (etoposid, vincristin og doxorubicin i 96 timer med bolus doser av cyklofosfamid og oral prednison); W. ICE (ifosfamid, cyklofosfamid og etoposid); X. CHOP-B (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og bleomycin); og Y. P/DOCE (epirubicin eller doxorubicin, vincristin, cyklofosfamid og prednison).
112. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 for behandling av Ikke-Hodgkin's lymfom (NHL), hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med én eller flere cytotoksiske medikamenter som en del av et behandlingsregime, hvor de cytotoksiske medikamentene er valgt fra gruppen bestående av: A. rituximab; B. en kombinasjon av rituximab, gemcitabin, dexamethason og cisplatin; og C. en kombinasjon av rituximab, cyklofosfamid, vincristin og prednison.
113. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 for behandling av akutt lymfocytisk leukemi (ALL), hvor preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 er administrerbare med én eller flere cytotoksiske medikamenter er valgt fra gruppen bestående av: A. rituximab; B. en kombinasjon av rituximab, cyklofosfamid, vincristin og prednison; C. en kombinasjon av cyklofosfamid, vincristin, metotrexat og cytarabin; og D. en kombinasjon av dexamethason, vincristin, asparaginase og metotrexat.
114. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 ved fremstilling av et medikament for behandling av en B-celle ondartet sykdom.
115. Anvendelse ifølge krav 114, hvor den B-celle ondartete sykdommen er valgt fra gruppen bestående av en leukemi, et lymfom, et Ikke-Hodgkin's lymfom (NHL), akutt lymfocytisk leukemi (ALL), kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) og multippelt myelom.
116. Anvendelse ifølge krav 114 eller krav 115, hvor medikamentet er administrerbart subkutant, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, intramedullært, intratekalt, transdermalt, transkutant, intranasalt, topisk, enterealt, intravaginalt, sublingvalt eller rektalt.
117. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-116, hvor medikamentet er administrerbart ved en effektiv dose fra 0,1 mg/m2 til 50 mg/m2.
118. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-117, hvor medikamentet er administrerbart ved en effektiv dose fra 0,4 mg/m2 til 30 mg/m2.
119. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-118, hvor medikamentet er administrerbart med et eller flere antistoffer, vekstfaktorer, hormoner, cytokiner, antihormoner, xantiner, interleukiner, interferoner og cytotoksiske medikamenter.
120. Anvendelse ifølge krav 119, hvor et eller flere antistoffer omfatter et antistoff valgt fra gruppen bestående av anti-CD19 antistoffet, anti-CD20 antistoffet og anti-CD33 antistoffet.
121. Anvendelse ifølge krav 120, hvor anti-CD20 antistoffet er rituximab.
122. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-121, hvor medikamentet er administrerbart med et cytokin eller vekstfaktor valgt fra gruppen bestående av interleukin 2 (TL-2), TNT, CSF, GM-CSF og G-CSF.
123. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-122, hvor medikamentet er administrerbart med et hormon valgt fra gruppen bestående av et østrogen, et androgen, et progestin og et kortikosteroid.
124. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-123, hvor medikamentet er administrerbart med et cytotoksisk medikament valgt fra gruppen bestående av aclarubicin, adriamycin, ancitabin, azacitidin, bleomycin, broxuridin, capecitabin, karboplatin, carubicin, cisplatin, cladribin, cyklofosfamid, cytarabin, dakarbazin, daunorubicin, decitabin, doxifluridin, doxorubicin, enocitabin, epirubicin, etoposid, floxuridin, fludarabin, flurouracils, gemcitabin, gougerotin, idarubicin, mechlorethamin, menogaril metotrexat, mitomycin, mitoksantron, nogalamycin, pentostatin, pitarubicin, prednison, prokarbazin, puromycin, taxol, taxol analoger, tegafur, tiazofurin, trifluridin, valrubicin, vinblastin, vincristin og zorubicin.
125. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 114-124, hvor medikamentet er administrerbart før, etter eller samtidig med administrering av én eller flere kombinasjoner av cytotoksiske medikamenter, hvor én eller flere kombinasjoner av de cytotoksiske medikamentene er valgt fra gruppen bestående av: A. CHOPP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og prokarbazin); B. CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin og prednison); C. COP (cyklofosfamid, vincristin og prednison); D. CAP-BOP (cyklofosfamid, doxorubicin, prokarbazin, bleomycin, vincristin og prednison); E. m-BACOD (metotrexat, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, dexamethason og leucovorin); F. ProMACE-MOPP (prednison, metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin); G. ProMACE-CytaBOM (prednison, metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, etoposid, leucovorin, cytarabin, bleomycin og vincristin); H. MACOP-B (metotrexat, doxorubicin, cyklofosfamid, vincristin, prednison, bleomycin og leucovorin); I. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin); J. ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dakarbazin); K. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin) alternerende med AB V (adriamycin/doxorubicin, bleomycin og vinblastin); L. MOPP (mechloethamin, vincristin, prednison og prokarbazin) alternerende med ABVD (adriamycin/doxorubicin, bleomycin, vinblastin og dakarbazin); M. ChlVPP (chlorambucil, vinblastin, prokarbazin og prednison); N. LMVP-16 (ifosfamid, metotrexat og etoposid); O. MIME (metyl-gag, ifosfamid, metotrexat og etoposid); P. DHAP (dexamethason, høy-dose cytarabin og cisplatin); Q. ESHAP (etoposid, metylpredisolon, høy-dose cytarabin og cisplatin); R. CEPP(B) (cyklofosfamid, etoposid, prokarbazin, prednison og bleomycin); S. CAMP (lomustin, mitoksantron, cytarabin og prednison); T. CVP-1 (cyklofosfamid, vincristin og prednison); U. ESHOP (etoposid, metylpredisolon, høy-dose cytarabin, vincristin og cisplatin); V. EPOCH (etoposid, vincristin og doxorubicin i 96 timer med bolus doser av cyklofosfamid og oral prednison); W. ICE (ifosfamid, cyklofosfamid og etoposid); X. CHOP-B (cyklofosfamid, doxorubicin, vincristin, prednison og bleomycin); og Y. P/DOCE (epirubicin eller doxorubicin, vincristin, cyklofosfamid og prednison).
126. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 for fremstilling av et medikament for behandling av Ikke-Hodgkin's lymfom (NHL), hvor medikamentet er administrerbart med én eller flere cytotoksiske medikamenter som en del av et behandlingsregime, hvor de cytotoksiske medikamentene er valgt fra gruppen bestående av: A. rituximab; B. en kombinasjon av rituximab, gemcitabin, dexamethason og cisplatin; og C. en kombinasjon av rituximab, cyklofosfamid, vincristin og prednison.
127. Anvendelse av preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 43-79 eller stabil lyofilisert formulering ifølge krav 99 for fremstilling av et medikament for behandling av akutt lymfocytisk leukemi (ALL), hvor medikamentet er administrerbart med et eller flere cytotoksiske medikamenter valgt fra gruppen bestående av: A. rituximab; B. en kombinasjon av rituximab, cyklofosfamid, vincristin og prednison; C. en kombinasjon av cyklofosfamid, vincristin, metotrexat og cytarabin; og D. en kombinasjon av dexamethason, vincristin, asparaginase og metotrexat.
NO20161431A 2002-05-02 2016-09-08 Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat omfattende monomer calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugat, preparat fremstilt derved samt anvendelse av preparatet. NO344509B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37744002P 2002-05-02 2002-05-02
PCT/US2003/013910 WO2003092623A2 (en) 2002-05-02 2003-05-02 Calicheamicin derivative-carrier conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20161431A1 true NO20161431A1 (no) 2005-01-25
NO344509B1 NO344509B1 (no) 2020-01-20

Family

ID=29401497

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20044663A NO339730B1 (no) 2002-05-02 2004-10-28 Et monomer calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugat samt anvendelse derav.
NO20161431A NO344509B1 (no) 2002-05-02 2016-09-08 Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat omfattende monomer calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugat, preparat fremstilt derved samt anvendelse av preparatet.
NO2017061C NO2017061I1 (no) 2002-05-02 2017-11-21 inotuzumab ozogamicin

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20044663A NO339730B1 (no) 2002-05-02 2004-10-28 Et monomer calicheamicin derivat/anti-CD22 antistoff konjugat samt anvendelse derav.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2017061C NO2017061I1 (no) 2002-05-02 2017-11-21 inotuzumab ozogamicin

Country Status (34)

Country Link
US (6) US8153768B2 (no)
EP (3) EP2371392B1 (no)
JP (5) JP5153057B2 (no)
KR (2) KR101125524B1 (no)
CN (1) CN100482277C (no)
AU (2) AU2003231293A1 (no)
BE (1) BE2017C049I2 (no)
BR (3) BR122019027966B8 (no)
CA (2) CA2483552A1 (no)
CR (3) CR7557A (no)
CY (4) CY1116634T1 (no)
DK (3) DK2371392T3 (no)
EC (1) ECSP045445A (no)
ES (3) ES2545745T3 (no)
FR (1) FR17C1054I2 (no)
HK (2) HK1162926A1 (no)
HU (4) HUE027590T2 (no)
IL (2) IL164946A (no)
LT (3) LT3127553T (no)
LU (1) LUC00044I2 (no)
MX (1) MXPA04010792A (no)
NL (1) NL300903I2 (no)
NO (3) NO339730B1 (no)
NZ (2) NZ586071A (no)
PH (2) PH12013501159A1 (no)
PL (5) PL224001B1 (no)
PT (3) PT2371392E (no)
RU (3) RU2422157C3 (no)
SG (3) SG187991A1 (no)
SI (3) SI3127553T1 (no)
TW (2) TWI438010B (no)
UA (1) UA88599C2 (no)
WO (1) WO2003092623A2 (no)
ZA (2) ZA200409752B (no)

Families Citing this family (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6905669B2 (en) 2001-04-24 2005-06-14 Supergen, Inc. Compositions and methods for reestablishing gene transcription through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase
US20110045005A1 (en) * 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
BR122019027966B8 (pt) 2002-05-02 2021-07-27 Wyeth Corp conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina/anti-corpo anti-cd22 e uso dos mesmos
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
AR048098A1 (es) * 2004-03-15 2006-03-29 Wyeth Corp Conjugados de caliqueamicina
US9237744B2 (en) * 2004-05-26 2016-01-19 National University Corporation Kagawa University Preservative solution for cells, tissues and organs containing rare sugar and preservative method thereof
TW200621282A (en) * 2004-08-13 2006-07-01 Wyeth Corp Stabilizing formulations
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
US7300773B2 (en) 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
US20060045877A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
WO2006031653A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Wyeth Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody / calicheamicin conjugates
EP1661584A1 (en) * 2004-11-26 2006-05-31 Heinz Dr. Faulstich Use of conjugates of amatoxins and phallotoxins with macromolecules for cancer and inflammation therapy
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US7250416B2 (en) 2005-03-11 2007-07-31 Supergen, Inc. Azacytosine analogs and derivatives
US20070003559A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Wyeth Methods of determining pharmacokinetics of targeted therapies
JP2009504740A (ja) 2005-08-16 2009-02-05 シンタ ファーマシューティカルズ コーポレーション ビス（チオ−ヒドラジドアミド）製剤
BRPI0615049B1 (pt) 2005-08-24 2023-04-25 Immunogen, Inc Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo- maitansinóide
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
ES2564241T3 (es) * 2005-12-02 2016-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanopartículas para su uso en composiciones inmunogénicas
US20070160577A1 (en) * 2005-12-06 2007-07-12 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
AU2007226696C1 (en) 2006-03-10 2016-02-04 Wyeth Llc Anti-5T4 antibodies and uses thereof
EP1859811B1 (en) * 2006-05-27 2011-08-24 Faulstich, Heinz, Dr. Use of conjugates of amatoxins or phallotoxins with macromolecules for tumor and inflammation therapy
KR101495549B1 (ko) 2006-07-13 2015-02-25 와이어쓰 엘엘씨 당단백질의 생산
TWI440632B (zh) 2006-08-21 2014-06-11 Synta Pharmaceuticals Corp 用於治療增生性疾病的化合物
JP2010506839A (ja) * 2006-10-12 2010-03-04 ワイス エルエルシー 乳光の低減を伴う方法および組成物
CA2666317C (en) 2006-11-03 2013-08-06 Wyeth Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
CN101626782B (zh) 2006-12-01 2013-03-27 梅达雷克斯公司 结合cd22的人抗体及其用途
EP2117601A2 (en) * 2006-12-22 2009-11-18 The Regents of the University of California Macromolecular conjugates of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein inhibitors and uses thereof
CN101687916A (zh) * 2007-01-16 2010-03-31 惠氏公司 通过trem-1的炎症治疗、检测和监控
AU2008223133A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Wyeth Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides
MX2009012587A (es) * 2007-05-22 2010-05-14 Wyeth Llc Proceso mejorado para la elaboracion de hidrazidas.
PE20090309A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-18 Wyeth Corp Conjugado portador-caliqueamicina y un metodo de deteccion de caliqueamicina
US7968687B2 (en) * 2007-10-19 2011-06-28 Seattle Genetics, Inc. CD19 binding agents and uses thereof
AU2008342956A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
CN101945892B (zh) * 2007-12-26 2017-11-24 生物测试股份公司 用于改进对表达cd138的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂
ES2475201T3 (es) * 2007-12-26 2014-07-10 Biotest Ag Agentes dirigidos contra CD138 y usos de los mismos
EP2238169A1 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
PL2242772T3 (pl) * 2007-12-26 2015-05-29 Biotest Ag Immunokonjugaty nakierowane na CD138 i ich zastosowanie
US20090186026A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Wyeth Ephrin and eph receptor agonists for modulation of bone formation and resorption
WO2009124109A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 The Government Of The U.S. A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health &Human Services Human monoclonal antibodies specific for cd22
FR2930443B1 (fr) 2008-04-29 2010-06-25 Oreal Produit extemporane de soin a base d'un lyophilisat de microorganisme et de tensioactif(s) de hlb superieur ou egal a 12
SI2281006T1 (sl) * 2008-04-30 2017-12-29 Immunogen, Inc. Premreževalci in njihova uporaba
DK2437790T3 (da) * 2009-06-03 2019-05-20 Immunogen Inc Konjugeringsfremgangsmåder
WO2011098518A2 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Ablynx Nv Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP2013535981A (ja) 2010-08-20 2013-09-19 ワイス・エルエルシー 成長因子不含適合細胞の細胞培養
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
WO2012065161A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Scott & White Healthcare Antibodies to tumor endothelial marker 8
US8512679B2 (en) * 2011-03-04 2013-08-20 Elwha Llc Glassy compositions
US8795673B2 (en) 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP2750768B1 (en) 2011-08-30 2018-10-03 Astex Pharmaceuticals, Inc. Decitabine derivative formulations
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2707251C2 (ru) 2011-10-03 2019-11-25 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
US20140322758A1 (en) 2011-10-21 2014-10-30 Pfizer Inc. Addition of iron to improve cell culture
MX358680B (es) 2011-12-08 2018-08-31 Biotest Ag Usos de inmunoconjugados dirigidos a cd138.
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
RU2668159C2 (ru) 2012-07-03 2018-09-26 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
US8883979B2 (en) 2012-08-31 2014-11-11 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
CN105209592A (zh) 2012-10-04 2015-12-30 伊缪诺金公司 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
AU2012395148B2 (en) 2012-11-24 2016-10-27 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
SG11201504887TA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
NZ711867A (en) * 2013-05-02 2020-07-31 Hoffmann La Roche Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a cd22 antibody-drug conjugate
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
KR101932824B1 (ko) * 2013-11-04 2018-12-27 화이자 인코포레이티드 칼리케아미신 유도체를 합성하기 위한, 중간체 및 방법
AU2014342610A1 (en) 2013-11-04 2016-06-02 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-EFNA4 antibody-drug conjugates
WO2015127685A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Charged linkers and their uses for conjugation
WO2015140708A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Pfizer Inc. Method of cell culture
US11998594B2 (en) 2014-04-02 2024-06-04 Case Western Reserve University Anti-cancer plant virus particles linked to HER2 antigens
MX2016016490A (es) 2014-06-20 2017-07-28 Bioalliance Cv Conjugados de farmaco-anticuerpo anti-receptor de folato alfa (fra) y metodos de uso de los mismos.
TWI664190B (zh) 2014-06-27 2019-07-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗－ｔａｕ抗體
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
US9925281B2 (en) 2014-08-05 2018-03-27 Case Western Reserve University Coated plant virus imaging agents
EP3957644A1 (en) 2014-11-07 2022-02-23 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
EP3280454A1 (en) 2015-04-07 2018-02-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanoparticle immunoconjugates
AR104333A1 (es) * 2015-04-21 2017-07-12 Stemcentrx Inc Constructos de calicheamicina y métodos de uso
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
WO2017004123A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Case Western Reserve University Anticancer drug-containing plant virus particles
JP6768722B2 (ja) 2015-07-02 2020-10-14 大塚製薬株式会社 凍結乾燥医薬組成物
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
US10478510B2 (en) 2015-07-16 2019-11-19 Case Western Resrve University Plant virus particles for delivery of antimitotic agents
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA2999224C (en) 2015-09-23 2023-10-24 Pfizer Inc. Cells and method of cell culture
CN108350416A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 百时美施贵宝公司 操纵在cho细胞中产生的多肽的品质属性的方法
TWI753875B (zh) 2016-01-08 2022-02-01 美商美國全心醫藥生技股份有限公司 四價抗psgl-1抗體及其用途
US20170281758A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Sorrento Therapeutics, Inc. Calicheamicin antibody drug conjugates linking an amidoacetyl group to a sugar moiety on calicheamicin
MX2018012129A (es) 2016-04-05 2018-12-17 Pfizer Proceso de cultivo celular.
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
GB201610512D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
WO2018017985A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Case Western Reserve University Plant virus or virus-like particle constructs
AU2017354004C1 (en) 2016-11-03 2023-08-31 Case Western Reserve University Melt processed viral nanoparticle constructs
KR102459469B1 (ko) 2016-11-14 2022-10-26 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
US11590183B2 (en) 2017-03-10 2023-02-28 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
US20200056190A1 (en) 2017-03-16 2020-02-20 Pfizer Inc. Tyrosine prototrophy
US10543271B2 (en) 2017-05-12 2020-01-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018213587A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Case Western Reserve University Anticancer trail-targeted plant virus particles
AU2018310857A1 (en) 2017-08-03 2020-02-13 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Drug compound and purification methods thereof
KR20200047702A (ko) 2017-09-15 2020-05-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 관심 폴리펩티드 대규모 생산 동안의 온라인 바이오매스 정전용량 모니터링
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
US11739301B2 (en) 2017-10-27 2023-08-29 Case Western Reserve University Tymovirus virus and virus-like particles as nanocarriers for imaging and therapeutic agents
US20210010055A1 (en) 2018-03-16 2021-01-14 Bristol-Myers Squibb Company Metabolic enzyme activity and disulfide bond reduction during protein production
CN110507824A (zh) * 2018-05-21 2019-11-29 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种抗间皮素抗体及其抗体药物缀合物
CR20200623A (es) * 2018-05-30 2021-07-01 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugados de fármaco y anticuerpo anti-sez6 y métodos de uso
IL297931A (en) 2018-09-25 2023-01-01 Harpoon Therapeutics Inc dll3 binding proteins and methods of use
WO2020106886A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Cornell University Macrocyclic complexes of radionuclides and their use in radiotherapy of cancer
WO2020115655A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Pfizer Inc. Cells with reduced inhibitor production and methods of use thereof
WO2020187998A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Fundació Privada Institut D'investigació Oncològica De Vall Hebron Combination therapy with omomyc and an antibody binding pd-1 or ctla-4 for the treatment of cancer
US11390853B2 (en) 2019-04-26 2022-07-19 Case Western Reserve University Freeze dried viral nanoparticle constructs
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US11896676B2 (en) 2019-08-07 2024-02-13 Case Western Reserve University Targeting cancer cells and tissue using filamentous plant virus particles
WO2021113740A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for reducing off-target toxicity of antibody drug conjugates
AU2021306613A1 (en) 2020-07-07 2023-02-02 BioNTech SE Therapeutic RNA for HPV-positive cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
CN112724263B (zh) * 2021-04-02 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 改造抗cd20单克隆抗体以提高其药物疗效的方法及其应用
WO2023285552A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023148598A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Pfizer Inc. Cysteine prototrophy
WO2024058201A1 (ja) * 2022-09-16 2024-03-21 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット
WO2024089013A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Peptomyc, S.L. Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6183744B1 (en) * 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4771128A (en) * 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5134075A (en) * 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2264239T3 (es) * 1990-06-27 2006-12-16 Princeton University Complejo de proteinas p53/p90'.
SK281142B6 (sk) * 1991-03-06 2000-12-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung Humanizovaná monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5686072A (en) * 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5484892A (en) * 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
US6180377B1 (en) * 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) * 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US6310185B1 (en) 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
CA2195557C (en) * 1994-08-12 2006-10-17 Shui-On Leung Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
AU686004B2 (en) 1994-08-12 1998-01-29 Myriad Genetics, Inc. In vivo mutations and polymorphisms in the 17q-linked breast and ovarian cancer susceptibility gene
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US7147851B1 (en) * 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US20020141990A1 (en) * 1996-11-01 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Anti-RSV human monoclonal antibodies
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
WO1998041641A1 (en) 1997-03-20 1998-09-24 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to cd-22 bearing cells and tumors
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
AT408613B (de) * 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
US6183477B1 (en) * 1998-09-04 2001-02-06 Smith & Nephew, Inc. Attachment tool for drill guide
KR100345463B1 (ko) * 1998-11-19 2003-01-08 주)녹십자 B형간염바이러스의표면항원프리-s1에대한인간화항체및이의제조방법
JP2000226336A (ja) * 1998-11-30 2000-08-15 Sankyo Co Ltd 免疫グロブリン製剤
EP2154535A1 (en) 1998-12-10 2010-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7074403B1 (en) * 1999-06-09 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
ATE264340T1 (de) * 1999-08-17 2004-04-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Stabilisierung von gefriergetrocknetem kuchen
JP2003511698A (ja) * 1999-10-12 2003-03-25 コンネクス・ゲゼルシャフト・ツーア・オプティミエルング・フォン・フォルシュング・ウント・エントヴィックルング・エムベーハー 便中の酸耐性微生物の改良された検出方法
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
BR122019027966B8 (pt) 2002-05-02 2021-07-27 Wyeth Corp conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina/anti-corpo anti-cd22 e uso dos mesmos

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6183744B1 (en) * 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US20180339058A1 (en) 2018-11-29
LT1507556T (lt) 2016-10-10
JP2015061875A (ja) 2015-04-02
EP2371392B1 (en) 2015-07-08
CR20130390A (es) 2013-11-08
PL224844B1 (pl) 2017-02-28
BRPI0309868B8 (pt) 2021-05-25
EP3127553B1 (en) 2021-12-01
MXPA04010792A (es) 2005-03-07
US8153768B2 (en) 2012-04-10
EP3127553A1 (en) 2017-02-08
ES2916174T3 (es) 2022-06-28
LTC2371392I2 (lt) 2019-03-25
TWI379693B (en) 2012-12-21
AU2009202609A1 (en) 2009-07-16
ES2545745T3 (es) 2015-09-15
CY1117973T1 (el) 2017-05-17
NO2017061I1 (no) 2017-11-21
PL228741B1 (pl) 2018-05-30
US20040082764A1 (en) 2004-04-29
RU2011108928A (ru) 2012-09-20
AU2003231293A1 (en) 2003-11-17
JP5756489B2 (ja) 2015-07-29
KR20050006220A (ko) 2005-01-15
NZ573563A (en) 2010-10-29
CY1124900T1 (el) 2023-01-05
ECSP045445A (es) 2005-01-28
US8835611B2 (en) 2014-09-16
PL374523A1 (en) 2005-10-31
RU2602878C3 (ru) 2021-11-24
HUE057124T4 (hu) 2022-02-28
JP2012051900A (ja) 2012-03-15
IL230659A0 (en) 2014-03-31
EP1507556A2 (en) 2005-02-23
EP1507556A4 (en) 2009-01-07
HK1162926A1 (en) 2012-09-07
RU2422157C3 (ru) 2021-04-23
LTPA2017036I1 (lt) 2017-11-27
LT3127553T (lt) 2022-04-11
EP2371392A1 (en) 2011-10-05
BRPI0309868B1 (pt) 2020-04-28
PH12013501158A1 (en) 2015-11-09
PL411824A1 (pl) 2015-08-17
BE2017C049I2 (no) 2022-08-09
FR17C1054I2 (fr) 2019-01-11
FR17C1054I1 (no) 2018-01-12
BR122019027966B8 (pt) 2021-07-27
DK2371392T3 (en) 2015-08-31
NO20044663L (no) 2005-01-25
CY1116634T1 (el) 2017-03-15
UA88599C2 (ru) 2009-11-10
RU2678818C2 (ru) 2019-02-04
TWI438010B (zh) 2014-05-21
PL222725B1 (pl) 2016-08-31
HUE057124T2 (hu) 2022-04-28
PH12013501159B1 (en) 2015-12-02
HK1070825A1 (zh) 2005-06-30
PT1507556T (pt) 2016-09-28
SG187991A1 (en) 2013-03-28
ZA200409752B (en) 2010-08-25
PT3127553T (pt) 2022-01-24
RU2602878C2 (ru) 2016-11-20
IL230659A (en) 2016-02-29
JP6872376B2 (ja) 2021-05-19
NZ586071A (en) 2012-02-24
NO344509B1 (no) 2020-01-20
PL224150B1 (pl) 2016-11-30
US20040192900A1 (en) 2004-09-30
CY2017035I1 (el) 2018-04-04
KR101125524B1 (ko) 2012-03-22
PL413302A1 (pl) 2016-05-23
PL410218A1 (pl) 2015-03-30
RU2016141576A (ru) 2018-05-03
CY2017035I2 (el) 2018-04-04
ES2593304T3 (es) 2016-12-07
PL410219A1 (pl) 2015-03-30
EP1507556B1 (en) 2016-07-27
BR122019027966B1 (pt) 2020-11-17
US20120213804A1 (en) 2012-08-23
CR7557A (es) 2008-10-03
DK1507556T3 (en) 2016-09-12
JP5153057B2 (ja) 2013-02-27
US9351986B2 (en) 2016-05-31
PT2371392E (pt) 2015-10-07
BR0309868A (pt) 2005-10-18
SI1507556T1 (sl) 2016-10-28
JP5441971B2 (ja) 2014-03-12
SI2371392T1 (sl) 2015-10-30
KR101062628B1 (ko) 2011-09-07
IL164946A (en) 2015-06-30
WO2003092623A3 (en) 2004-03-18
JP2005524700A (ja) 2005-08-18
CN1665532A (zh) 2005-09-07
PH12013501158B1 (en) 2015-11-09
LUC00044I1 (no) 2017-11-03
WO2003092623A2 (en) 2003-11-13
HUS1700038I1 (hu) 2017-11-28
CA2871117A1 (en) 2003-11-13
RU2004135101A (ru) 2005-06-27
TW201231089A (en) 2012-08-01
KR20110050753A (ko) 2011-05-16
IL164946A0 (en) 2005-12-18
SI3127553T1 (sl) 2022-02-28
DK3127553T3 (da) 2022-01-31
RU2422157C2 (ru) 2011-06-27
CR20120364A (es) 2012-10-05
CN100482277C (zh) 2009-04-29
US20140235835A1 (en) 2014-08-21
NO339730B1 (no) 2017-01-23
SG165158A1 (en) 2010-10-28
BR122019027974B1 (pt) 2022-06-14
CA2483552A1 (en) 2003-11-13
SG10201700289RA (en) 2017-02-27
TW200404005A (en) 2004-03-16
NL300903I2 (nl) 2018-02-08
PH12013501159A1 (en) 2015-12-02
HUE027590T2 (hu) 2016-11-28
AU2009202609B2 (en) 2012-07-26
ZA201003874B (en) 2019-12-18
RU2016141576A3 (no) 2018-05-03
PL224001B1 (pl) 2016-11-30
US20160303252A1 (en) 2016-10-20
JP2017105801A (ja) 2017-06-15
US8747857B2 (en) 2014-06-10
HUE030806T2 (hu) 2017-05-29
JP2013163678A (ja) 2013-08-22
LUC00044I2 (no) 2018-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO20161431A1 (no) Chalicheamicinderivat-bærerkonjugater.
AU2017204487B2 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates
AU2012244218C1 (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates
NZ734179A (en) Calicheamicin derivative-carrier conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: WYETH HOLDINGS LLC, US

MK1K Patent expired