BR122019027966B1 - conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina/anti-corpo anti-cd22 e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para a preparação de conjugados de droga citotóxica monomérica/carreador com uma carga de droga significantemente maior do que nos procedimentos anteriormente relatados e com agregação reduzida e fração de conjugado baixa (LCF) que são descritos. Os conjugados de derivado de droga citotóxica/anticorpo, composições compreendendo os conjugados e empregos dos conjugados são também descritos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a método para a produção de conjugados de droga citotóxica monomérica/carreador (os "conjugados") com carga de droga mais elevada e fração de conjugado baixa substancialmente reduzida (LCF). Particularmente, a invenção refere- se a conjugados de caliqueamicina nomomérica - anticorpo anti-CD22. A invenção também refere-se a conjugados da invenção, a métodos de purificação dos conjugados, a composições farmacêuticas compreendendo os conjugados, e aos empregos dos conjugados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os conjugados de droga desenvolvidos para farmacotera- pia sistêmica são agentes citotóxicos específicos para o alvo. O conceito envolve acoplar um agente terapêutico a uma molécula portadora com especificidade para uma população de célula alvo específica. Os anticorpos com alta afinidade com antígenos são uma escolha natural como porções de alvejamento. Com a disponibilidade de anticorpos monoclonais de alta afinidade, os prospectos de terapêuticos de alvejamento de anticorpo tem se tornado promissor. Substâncias tóxicas que foram conjugadas a anticorpos monoclonais incluem toxinas, dro-gas citotóxicas de peso molecular baixo, modificadores de resposta biológica, e radionuclídeos. Os conjugados de anticorpo - toxina são freqüentemente denominados de imunotoxinas, ao passo que os imu- noconjugados consistindo em anticorpos e drogas de peso molecular baixo, tais como metotrexato e Adriamicina® são chamados de qui- mioimunoconjugados. Os imunomoduladores contêm modificadores de resposta biológica que são conhecidos terem funções reguladoras, tais como linfocinas, fatores de crescimento, e fator de veneno de cobra de ativação de complemento (CVF). Os radioimunoconjugados consistem em isótopos radioativos, que podem ser empregados como terapêuticos para matar células por sua radiação ou empregados para image- amento. A liberação específica mediada por anticorpo de drogas cito- tóxicas para as células de tumor é esperada não somente aumentar sua eficácia antitumor, porém também prevenir a absorção não alvejada pelos tecidos normais, desse modo aumentando seus índices terapêuticos.

[0003] A presente invenção refere-se a imunoconjugados compreendendo um anticorpo como um carreador de alvejamento e tendo especificidade para determinantes antigênicos sobre a superfície de células malignas conjugadas para uma droga citotóxica. A invenção refere- se a conjugados de anticorpo - drogas citotóxicas, onde o anticorpo tem especificidade para determinantes antigênicos em B-malignida- des, distúrbios linfoproliferativos e doenças inflamatórias crônicas. A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de imunoconjugados e aos seus empregos terapêuticos.

[0004] Vários terapêuticos com base em anticorpo para tratar uma variedade de doenças incluindo câncer e artrite reumatóide têm sido aprovados para uso clínico ou estão em experiências clinicas para uma variedade de malignidades incluindo malignidades da célula B tal como linfoma não Hodgkin. Um tal terapêutico com base em anticorpo é rituximab (Rituxan®), um anticorpo humano quimérico não- rotulado (+mYlV-região), que é específico para antígeno de superfície de célula CD20, que é expresso em células B. Esses terapêuticos com base em anticorpos contam ou com a citotoxidade mediada por com-plemento (CDCC), ou citotoxidade celular dependente do anticorpo (ADCC) contra as células B, ou com o uso de radionuclídeos, tais como 1311 ou 90Y, que têm problemas de uso e de preparação associados para médicos e pacientes. Conseqüentemente há uma necessidade de geração de imunoconjugados que possam superar as deficiências dos terapêuticos com base em anticorpos correntes para tratar uma variedade de malignidades incluindo malignidades hematopoiéticas tipo lin- foma não Hodgkin (NHL), os quais possam ser produzidos facilmente e eficazmente, e que não sejam empregados repetidamente sem induzir uma resposta imune.

[0005] Os imunoconjugados compreendendo um membro da família potente de agentes antibacterianos e antitumor, conhecidos coletivamente como as caliqueamicinas ou o complexo LL-E33288, (observe a Patente U. S. n° 4.970.198 (1990)), foram desenvolvidos para uso no tratamento de mielomas. A mais potente das caliqueamicinas é designada y1, que é aqui referenciada simplesmente como gama. Esses compostos contêm um metiltrissulfeto que pode ser reagido com tióis apropriados para formar dissulfetos, ao mesmo tempo em que introduzindo um grupo funcional tal como um hidrazida ou outro grupo funcional que seja útil na ligação de um derivado de a um carreador. (observe a Patente U. S. n° 5.053.394). O uso dos conjugados de derivado de caliqueamicina monomérica/carreador no desenvolvimento de terapias para uma ampla variedade de cânceres tem sido limitado igualmente pela disponibilidade de agentes alvejantes específicos (carrea- dors) bem como pelas metodologias da conjugação que resultam na formação de agregados de proteína quando a quantidade de derivado de caliqueamicina que é conjugada para o carreador (isto é, a carga da droga) é aumentada. Uma vez que, a maior carga de droga aumenta a potência inerente do conjugado, é desejável ter tanta droga carregada sobre o carreador quanto seja consistente com a retenção da afinidade da proteína portadora. A presença da proteína agregada, que pode ser não-especificadamente tóxica e imunogênica, e portanto deve ser removida para aplicações terapêuticas, torna o processo de alta escala para a produção desses conjugados mais difícil e diminui a produção dos produtos. A quantidade de caliqueamicina carregada na proteína portadora (a carga da droga), a quantidade de agregado que é formado na reação de conjugação, e a produção do conjugado mo- nomérico purificado final que pode ser obtido são todos relacionados. Um compromisso deve portanto ser feito entre a maior carga de droga e o produto do monômero final ajustando-se a quantidade do derivado de caliqueamicina reativo que é adicionado à reação de conjugação.

[0006] A tendência para conjugados de droga citotóxica, especialmente conjugados de caliqueamicina agregarem-se, é especialmente problemática quando as reações de conjugação são realizadas com os ligantes descritos na Patente U. S. n° 5.877.296 e Patente U. S. n° 5.773.001, que estão incorporadas aqui em sua totalidade. Neste caso, um grande percentual dos conjugados produzidos estão em uma forma agregada, e é bastante difícil purificar os conjugados feitos por esse processo original (processo CMA) para uso terapêutico. Para algumas proteínas portadoras, os conjugados com cargas mesmo mo-destas são virtualmente impossíveis de preparar exceto em uma pequena escala. Conseqüentemente, há uma necessidade crítica de melhorar os método para a conjugação de drogas citotóxicas, tal como as caliqueamicinas, a carreadors que minimizam a quantidade de agregação e por meio do qual prover uma carga de droga tão elevada quanto possível com uma produção razoável do produto.

[0007] Previamente, os métodos de conjugação para a preparação de derivados de caliqueamicina/carreador com produção/carga de droga superior e agregação reduzida foram descritos (observe Patente U. S. n° 5.712.374 e Patente U. S. n° 5.714.586, incorporados aqui em sua totalidade). Embora esses processos resultassem em preparações conjugadas com conteúdo de agregado substancialmente reduzido, foi descoberto mais tarde que eles produziam conjugados contendo níveis indesejavelmente altos (45-65% de % de Área de HPLC) de uma fração de conjugado baixo (LCF), uma fração consistindo principalmente em anticorpo não-conjugado. A presença da LCF no produto é um uso ineficiente do anticorpo, uma vez que ela não contém a droga citotóxi- ca. Pode também competir com o conjugado de caliqueamicina - car- reador para o alvo e potencialmente reduzir a alvejabilidade do último resultando na eficácia reduzida da droga citotóxica. Portanto, um processo de conjugação melhorado que resultaria em níveis significante- mente reduzidos da LCF e que tenha níveis aceitáveis de agregação, sem significantemente alterar as propriedades físicas do conjugado, é desejado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção refere-se a métodos para a produção de conjugados de carreadors/derivados de droga citotóxica monoméri- ca (os "conjugados") com carga maior e fração de conjugado baixa substancialmente reduzida (LCF). Particularmente, a invenção refere- se à produção de conjugados de carreador - derivado de caliqueamicina, aos conjugados, às composições, a um método de purificação dos conjugados, e ao uso dos conjugados. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para a produção de um conjugado de anticorpo anti-CD22 - derivado de caliqueamicina monomérica (CMC-544).

[0009] Em uma modalidade, a presente invenção descreve um processo de conjugação melhorado para a produção dos conjugados que resultou em níveis significantemente reduzidos da LCF (abaixo de 10 por cento) sem qualquer alteração significante das propriedades físicas e químicas. A invenção também descreve uma outra melhora para o processo de conjugação que resulta em não somente uma redução significante nos níveis do LCF, porém também resulta em uma redução significante na agregação de processos previamente descritos, e produz carga de droga substancialmente aumentada. Os conju- gados da presente invenção têm a fórmula: Pr(-X-W)m onde:

[0010] Pr é um carreador proteináceo;

[0011] X é um ligador que compreende um produto de qualquer grupo reativo que possa reagir com um carreador proteináceo;

[0012] W é uma droga citotóxica;

[0013] m é a carga média para um produto de conjugação purificado tal que a droga citotóxica constitui 7-9% do conjugado em peso; e

[0014] (-X-W)m é um derivado de droga citotóxica.

[0015] Os conjugados da presente invenção, em uma modalidade, são gerados pelo método da invenção compreendendo as etapas de: (1) adicionar o derivado de droga citotóxica ao carreador proteináceo onde o derivado de droga citotóxica é 4,5-11% em peso do carreador proteináceo; (2) incubar o derivado de droga citotóxica e um carreador proteináceo em uma solução tamponada, compatível com a proteína, não-nucleofílica tendo um pH em uma faixa de cerca de 7 a 9 para produzir um conjugado carreador/droga citotóxica monomérica, onde a solução ainda compreende (a) um co-solvente orgânico, e (b) um aditivo compreendendo pelo menos um Cθ-Ciβ ácido carboxílico ou seu sal, e onde a incubação é conduzida em uma temperatura variando de cerca de 30°C a cerca de 35°C durante um período de tempo variando de cerca de 15 minutos a 24 horas; e (3) submeter o conjugado produzido na etapa (2) a um processo de separação cromatográfica para separar os conjugados de carreador proteináceo/derivado de droga citotóxica monomérica com uma carga na faixa de 4-10% em peso de droga citotóxica e com fração conjugada baixa (LCF) abaixo de 10 por cento do carreador proteináceo não-conjugado, derivado de droga citotóxica, e conjugados agregados.

[0016] Em um aspecto da invenção, o carreador proteináceo do conjugado é selecionado a partir de um grupo consistindo em hormônios, fatores de crescimento, anticorpos, fragmentos de anticorpos, mímicos de anticorpos, e suas contrapartes geneticamente ou enzima- ticamente construídas.

[0017] Em uma modalidade, o carreador proteináceo é um anticorpo. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é selecionado a partir de um grupo consistindo em um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de Fab e um fragmento de F(ab)2.

[0018] Em outra modalidade, o anticorpo humanizado é direcionado contra o antígeno de superfície de célula CD22.

[0019] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado com CDR, e compreende uma região variável de cadeia leve 5/44-gl_1 (SEQ ID NO: 19), e uma região variável de cadeia pesada 5-44-gH7 (SEQ ID NO:27).

[0020] Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado com CDR compreendendo uma cadeia leve tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 28.

[0021] Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo anti- CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0022] Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR compreendendo uma cadeia leve tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 28 e uma cadeia pesada tendo uma sequência apresentada na SEQ ID NO:30.

[0023] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado com CDR que é um anticorpo variante obtido por um protocolo de maturação de afinidade e tem afinidade aumentada para CD22 humano.

[0024] Em outro aspecto, a droga citotóxica empregada para gerar o conjugado carreador/droga citotóxica monomérica da presente invenção ou é um inibidor da polimerização da tublina, um agente alqui- lação que se aglutina a e rompe o DNA, um inibidor de síntese de proteína, ou um inibidor de tirosina cinase.

[0025] Em uma modalidade, a droga citotóxica é selecionada de caliqueamicinas, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorrubicina, doxorru- bicina, epirrubicina, esperamicinas, actinomicina, autramicina, azaseri- na, bleomicina, tamoxifeno, idarrubicina, dolastatinas/auristatinas, he- miasterlinas, e maitancinóides.

[0026] Em uma modalidade preferida, a droga citotóxica é a caliqueamicina. Em uma modalidade particularmente preferida, a caliqueamicina é gama caliqueamicina ou derivado de gama caliqueamicina de N-acetila.

[0027] Em ainda outro aspecto, a droga citotóxica é funcionalizada com hidrazida de butanoíla de 3-mercapto-3-metila e conjugada para um carreador proteináceo através de um ligador hidrolizável que seja capaz de liberar a droga citotóxica do conjugado após aglutinar-se e entrar nas células alvo.

[0028] Em uma modalidade preferida deste aspecto, o ligador hidrolizável é ácido 4-(4-acetilfenóxi)butanóico (AcBut).

[0029] Em ainda outro aspecto da invenção, o ácido octanóico ou seu sal, ou ácido decanóico ou seu sal é empregado como um aditivo durante o processo de conjugação para diminuir a agregação e aumentar a carga de droga.

[0030] Em ainda outro aspecto da invenção, os conjugados da invenção são purificados por um processo de separação cromatográfica.

[0031] Em uma modalidade, o processo de separação cromatográ- fico empregado para separar o conjugado de carreador - derivado de droga monomérica é a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).

[0032] Em outra modalidade, o processo de separação cromato- gráfico empregado para separar o conjugado de carreador derivado de droga monomérica é HPLC, FPLC ou cromatografia de Sefacril™ S- 200.

[0033] Em uma modalidade preferida, o processo de separação cromatográfico empregado para separar o conjugado de derivado de droga monomérica/carreador é a cromatográfica de interação hidrofó- bica (HIC). Em uma modalidade particularmente preferida, a HIC é realizada empregando um carreador cromatográfico de Fluxo Rápido Fenil Sefarose™ 6, carreador cromatográfico de Fluxo Rápido Butil Sefarose™ 4, carreador cromatográfico de Fluxo Rápido Octil Sefarose™ 4, carreador cromatográfico de Éter de 7byopea/7®-650M, carreador de HIC de metila Macro-Prep® ou carreador de HIC de t-Butila Ma- cro-Prep®. Em uma modalidade particularmente preferida, a HIC é realizada empregando carreador cromatográfico de Fluxo Rápido de Butil Sefarose™ 4.

[0034] Em outro aspecto, a invenção está direcionada a um conjugado de derivado de droga citotóxica monomérica/carreador produzido pelo método da invenção. Em uma modalidade preferida deste aspecto, a droga citotóxica empregada é a caliqueamicina e o carreador empregado é um anticorpo.

[0035] Em outra modalidade preferida, o anticorpo é selecionado a partir de um grupo consistindo em um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab e um fragmento F(ab)2. Em um aspecto mais particularmente preferido, um anticorpo humani-zado direcionado contra o antígeno de superfície de célula CD22 é empregado.

[0036] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR, e compreende uma região variável de cadeia leve 5/44-gL1 (SEQ ID N°: 19), e uma região variável de cadeia pesada 5/44-gH7 (SEQ ID NO:27).

[0037] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 é um anticorpo enxertado por CDR compreendendo uma cadeia leve tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 28.

[0038] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0039] Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR compreendendo uma cadeia leve tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 28 e uma cadeia pesada tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0040] Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR que é um anticorpo variante obtido por um protocolo de maturação de afinidade que tem afinidade aumentada para CD22 humano.

[0041] Em uma modalidade preferida, a caliqueamicina é gama caliqueamicina ou gama caliqueamicina de N-acetila.

[0042] Em uma modalidade, o derivado de caliqueamicina é funci- onalizado com hidrazida de butanoíla de 3-mercapto-3-metila.

[0043] Em outra modalidade, o ligador empregado para conjugar a droga para o carreador é um ligador hidrolizável que é capaz de liberar a droga citotóxica do ligador e entrada nas células. Em uma modalidade preferida, o ligador hidrolizável é ácido 4-(4-acetilfenóxi)butanóico (AcBut).

[0044] Outro aspecto da invenção está direcionado a um conjuga- do de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica tendo a fórmula, Pr(-X-S-S-W)monde: Pr é um anticorpo anti-CD22; X é um ligador hidrolizável que compreende um produto de qualquer grupo reativo que possa reagir com um anticorpo; W é um radical de caliqueamicina; m é a carga média para um produto de conjugação purificado tal que a caliqueamicina constitua 4-10% do conjugado em peso; e (-X-S-S-W)m é um derivado de caliqueamicina gerado pelo processo da invenção.

[0045] Em uma modalidade deste aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um grupo consistindo em um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab e um fragmento F(ab)2.

[0046] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-CD22 que tem especificidade para CD22 humano, e compreende uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas como H1 na Figura 1 (SEQ ID N°: 1) para CDR-H1, como H2 na Figura 1 (SEQ ID N°: 2) ou H2’ (SEQ ID N°: 13) ou H2" (SEQ ID N°: 15) ou H2’" (SEQ ID N°: 16) para CDR-H2, ou como H3 na Figura 1 (SEQ ID N°: 3) para CDR- H3, e compreende uma cadeia leve onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas como L1 na Figura 1 (SEQ ID N°: 4) para CDR-L1, como L2 na Figura 1 (SEQ ID N°: 5) para CDR-L2, ou como L3 na Figura 1 (SEQ ID N°: 6) para CDR-L3.

[0047] Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 compreende uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 15 ou SEQ ID N°: 16 para CDR-H2, ou SEQ ID N°: 3 para CDR- H3, e uma cadeia leve onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas na SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, SEQ ID N°: 5 para CDR-L2, ou SEQ ID N°: 6 para CDR- L3.

[0048] Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo anti- CD22 compreende SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 15 ou SEQ ID N°: 16 para CDR-H2, SEQ ID N°: 3 para CDR-H3, SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, SEQ ID N°: 5 para CDR-L2, e SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0049] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo anti-CD22 enxertado com CDR e compreende um domínio variável compreendendo regiões de estrutura de aceptor humano e CDRs de doador não-humano.

[0050] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 humanizado tem uma estrutura de aceptor humano onde as regiões do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo são com base em uma sequência de consenso do subgrupo I humano e compreende resíduos do doador não-humano nas posições 1, 28, 71 e 93. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado ainda compreende resíduos do doador não- humano nas posições 67 e 69.

[0051] Em uma modalidade preferida, o anticorpo humanizado enxertado por CDR compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma região de estrutura de aceptor humano com base em uma sequência de consenso do subgrupo I humano e ainda compreendendo resíduos do doador não-humano nas posições 2, 4, 37, 38, 45 e 60. Em outra modalidade, o anticorpo enxertado por CDR ainda compreende um resíduo do doador não-humano na posição 3.

[0052] Em ainda outra modalidade, o anticorpo enxertado por CDR compreende uma região variável de cadeia leve 5/44-gL1 (SEQ ID N°: 19) e uma região variável de cadeia pesada 5/44-gH7 (SEQ ID N°: 27).

[0053] Em outra modalidade, o anticorpo enxertado por CDR compreende uma cadeia leve tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 28 e uma cadeia pesada tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0054] Em ainda outra modalidade, o anticorpo enxertado por CDR compreende uma cadeia leve tendo a sequência com apresentada na SEQ ID N°: 28 e uma cadeia pesada tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0055] Em uma modalidade, o anticorpo enxertado por CDR anti- CD22 é um anticorpo variante obtido por um protocolo de maturação por afinidade e tem afinidade para CD22 humano.

[0056] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 é um anticorpo quimérico compreendendo as sequências dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal apresentado na SEQ ID N°: 7 e SEQ ID N°: 8, respectivamente.

[0057] Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-CD22 compreende um CDR híbrido com uma sequência de CDR de doador truncado onde a porção ausente do CDR doador é substituída por uma sequência diferente e forma um CDR funcional.

[0058] Em uma modalidade particularmente preferida, o derivado da droga citotóxica ou é uma gama caliqueamicina ou um derivado da gama calequeamicina de N-acetila.

[0059] Em outro aspecto, a invenção está direcionada a um método para a preparação de uma composição liofilizada estável de um conjugado derivado de droga citotóxica monomérica/carreador. Em uma modalidade preferida, a composição liofilizada estável do conjugado carreador/derivado de droga citotóxica monomérica é preparado (a) dissolvendo-se o conjugado carreador/derivado de droga citotóxica monomérica para uma concentração final de 0,5 a 2 mg/mL em uma solução compreendendo um crioprotetor em uma concentração de 1,5%-5% em peso, um agente encorpante polimérico em uma concentração de 0,5-1,5% em peso, eletrólitos em uma concentração de 0,01 M a 0,1M, um agente de facilitação de solubilidade em uma concentração de 0,005-0,05% em peso, agente de tamponamento em uma concentração de 5-50 mM tai que o pH final da solução seja 7,8- 8,2, e água; (b) dispensando-se a solução acima em frascos em uma temperatura de +5°C a +10°C; (c) congelando-se a solução em uma temperatura de congelamento de -35°C a -50°C; (d) submetendo-se a solução congelada a uma etapa de secagem por congelamento inicial em uma pressão de secagem primária de 20 a 80 microns em uma temperatura de prateleira de -10°C a -40°C durante 24 a 78 horas; e (e) submetendo-se o produto secado por congelamento da etapa (d) a uma etapa de secagem secundária em uma pressão de secagem de 20 a 80 microns em uma temperatura de prateleira de +10°C a +35°C durante 15 a 30 horas.

[0060] Em uma modalidade, o crioprotetor empregado na liofiliza- ção do conjugado de carreador/droga citotóxica é selecionado de alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietileno glicol, ácido aldônico, ácido urônico, ácido aldárico, aldose, cetose, açúcares de amino, alditol, inositol, gliceraldeídos, arabinose, lixose, pentose, ribose, xilose, galactose, glicose, hexose, idose, manose, talose, heptose, glicose, frutose, ácido glicônico, sorbitol, lactose, manitol, α-glicopiranosideo de metila, maltose, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbose, ácido glicárico, eritrose, treose, arabinose, alose, altrose, gulose, idose, talose, eritrulose, ribulose, xilulose, psicose, tagatose, ácido glicurônico, ácido glicônico, ácido glicárico, ácido galacturônico, ácido manurônico, glicosamina, galactosamina, sucrose, trealose, ácido neuramínico, arabinanos, frutanos, fucanos, galactanos, galacturonanas, glucanos, mananos, xilanos, levano, fucoidano, carragenina, galactocarolose, pectinas, ácido péctico, amilose, pululan, glicogênio, amilopectina, ce- lulose, dextran, pustulano, quitina, agarose, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurônico, ácido algínico, goma xantana, amido, sacarose, glicose, lactose, trealose, etileno glicol, polietileno glicol, po- lipropileno glicol, glicerol, e pentaeritritol.

[0061] Em uma modalidade preferida, o crioprotetor é sacarose, que está presente em uma concentração de 1,5% em peso.

[0062] Em uma modalidade, o agente encorpante polimérico empregado durante o processo de liofilização é selecionado de Dextran 40 ou amido de hidroxietila 40, e está em uma concentração de 0,9% em peso.

[0063] Em outra modalidade, o eletrólito empregado na solução de liofilização é cloreto de sódio, que está presente em uma concentração de 0,05M.

[0064] Em uma modalidade preferida, um agente de facilitação de solubilidade é empregado durante o processo de liofilização. Preferivelmente, este agente de facilitação de solubilidade é um tensoativo. Em uma modalidade particularmente preferida, o tensoativo é polis- sorbato 80, que está presente em uma concentração de 0,01% em peso.

[0065] Em uma modalidade, o agente de tamponamento empregado é trometamina, que está presente em uma concentração de 0,02M. É preferível para o pH da solução ser 8,0 no início do processo de liofilização. A solução contendo o conjugado de carreador/droga citotóxica é distribuída em frascos em uma temperatura de +5°C antes do início do processo.

[0066] Em uma modalidade, a solução nos frascos é congelada em uma temperatura de -45°C; a solução congelada é submetida a uma etapa de secagem por congelamento inicial em uma pressão de secagem primária de 60 microns e em uma temperatura de prateleira de -30°C durante 60 horas; e o produto secado por congelamento é submetido a uma etapa de secagem secundária em uma pressão de secagem de 60 microns em uma temperatura de prateleira de +25°C durante 24 horas.

[0067] Outro aspecto da invenção está direcionado a uma composição compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz de um conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica monomérica preparado por um método da invenção.

[0068] Em uma modalidade, o carreador no conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica monomérica é um carreador proteináceo selecionado de hormônios, fatores de crescimento, anticorpos e mímicos de anticorpos.

[0069] Em uma modalidade preferida, o carreador proteináceo é um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.

[0070] Em uma modalidade preferida, o anticorpo humanizado está direcionado contra o antígeno de superfície de célula CD22.

[0071] Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o anticorpo anti-CD22 tem especificidade para CD22 humano, e compreendem uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas como H1 na Figura 1 (SEQ ID N°: 1) para CDR-H1, como H2 na Figura 1 (SEQ ID N°: 2) ou H2’ (SEQ ID N°: 13) ou H2" (SEQ ID N°: 15) ou H2’" (SEQ ID N°: 16) para CDR-H2, ou como H3 na Figura 1 (SEQ ID N°: 3) para CDR-H3, e compreende uma cadeia leve onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas como L1 na Figura 1 (SEQ ID N°: 4) para CDR-L1, como L2 na Figura 1 (SEQ ID N°: 5) para CDR-L2, ou como L3 na Figura 1 (SEQ ID N°: 6) para CDR-L3.

[0072] Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22 tem uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 15 ou SEQ ID N°: 16 para CDR-H2, ou SEQ ID N°: 3 para CDR-H3, e uma cadeia leve onde o domínio variável compreende um CDR tendo pelo menos uma das sequências determinadas na SEQ ID N°: 4 para CDR- L1, SEQ ID N°: 5 para CDR-L2, ou SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0073] Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo anti- CD22 compreende SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 15 ou SEQ ID N°: 16 para CDR-H2, SEQ ID N°: 3 para CDR-H3, SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, SEQ ID N°: 5 para CDR-L2, e SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0074] Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo anti-CD22 humanizado enxertado por CDR e compreende uma região variável de cadeia leve 5/44- gL1 (SEQ ID N°: 19), e uma região variável de cadeia pesada 5/44- gH7 (SEQ ID N°: 27).

[0075] Em outra modalidade particularmente preferida, o anticorpo anti-CD22 humanizado é um anticorpo enxertado por CDR tendo especificidade para CD22 humano e compreende uma cadeia leve tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 28 e uma cadeia pesada tendo uma sequência apresentada na SEQ ID N°: 30.

[0076] Em uma modalidade, o anticorpo enxertado por CDR é um anticorpo variante que tem afinidade aumentada para CD22 humano, e o anticorpo é obtido por um protocolo de maturação por afinidade.

[0077] Em uma modalidade, a droga citotóxica monomérica é caliqueamicina e é preferivelmente selecionada de gama caliqueamicina ou gama caliqueamicina de N-acetila.

[0078] Em uma modalidade, a composição pode opcionalmente conter um agente bioativo adicional. Um tal agente bioativo pode ser uma droga citotóxica, um fator de crescimento ou um hormônio.

[0079] Ainda outro aspecto da invenção está direcionado a um método para tratamento de um indivíduo com um distúrbio proliferativo administrando-se ao indivíduo uma dose terapeuticamente eficaz da composição da invenção. A composição pode ser administrada subcu- taneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intra- arterialmente, intramedularmente, intratecalmente, transdermicamente, transcutaneamente, intranasalmente, topicamente, enteralmente, in- travaginalmente, sublingualmente ou retalmente. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção é administrada intravenosamente.

[0080] Em uma modalidade, a composição é administrada a um ser humano sofrendo de um distúrbio proliferativo tal como câncer. Em uma modalidade preferida, o câncer é uma malignidade da célula B. A malignidade da célula B pode ser uma leucemia ou linfoma que expressa o antígeno de superfície de célula CD22.

[0081] Em ainda outra modalidade, o câncer é um carcinoma ou um sarcoma.

[0082] Outro aspecto da presente invenção está direcionado a um método para tratamento de uma malignidade da célula B administran- do-se a um paciente com tal malignidade uma composição terapeuticamente eficaz compreendendo um conjugado de droga citotóxica - anticorpo anti-CD22 da invenção. Em uma modalidade preferida, a malignidade da célula B é um linfoma, particularmente linfoma não Hodgkin.

[0083] Em uma modalidade, a droga citotóxica empregada para preparar os conjugados da presente invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em caliqueamicinas, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, tamoxifeno, idarrubicina, dolastati- nas/auristatinas, hemiasterlinas, e maitancinóides, e esperamicinas.

[0084] Em uma modalidade preferida, a droga citotóxica é a gama caliqueamicina ou caliqueamicina de N-acetila.

[0085] Em outra modalidade, o tratamento compreende administrar o conjugado de droga citotóxica da invenção com um ou mais agentes bioativos selecionados de anticorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, anti-hormônios, xantinas, interleucinas, interferons, e drogas citotóxicas.

[0086] Em uma modalidade preferida, o agente bioativo é um anticorpo, e está direcionado contra um antígeno de superfície de célula expressado nas malignidades da célula B. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo direcionado contra os antígenos de superfície de célula expressado nas malignidades da célula B é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpos anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD33. Tais anticorpos incluem o anticorpo anti-CD20, rituximab (Rituxan®).

[0087] Em outra modalidade, os agentes bioativos são citocinas ou fatores de crescimento e incluem, porém não estão limitados a, inter- leucina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF e G-CSF.

[0088] Em outra modalidade, os agentes bioativos são hormônios e incluem estrogênios, androgênios, progestinas e corticosteróides.

[0089] Em ainda outra modalidade, o agente bioativo é uma droga citotóxica selecionada de doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, aclarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona, epirrubicina, carrubicina, no- galamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gemcitabi- na, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pen- tostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, Adriamicina®, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vin- cristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procar- bazina, metotrexato, flurouracil, etoposídeo, taxol, análogos de taxol, e mitomicina.

[0090] Em uma modalidade preferida, a composição terapeutica- mente eficaz do conjugado de droga citotóxica - anticorpo anti-CD22 é administrada junto com uma ou mais combinações de agentes citotó- xicos como uma parte de um regime de tratamento, onde a combinação de agentes citotóxicos é selecionada de: CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, e procarbazina); CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, prednisona); m-BACOD (meto- trexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexame- tasona, e leucovorina); ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina); ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorina, citarabina, bleomicina, e vincristina); MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leu-covorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina); ABVD (Adriamicina®/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina e da- carbazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABV (Adriamicina®/doxorrubicina, bleomicina e vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABVD (Adriamicina®/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina, e dacarbazina), ChIVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona); IMVP-16 (ifosfamida, metrotexato, e etoposídeo); MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato e etoposídeo); DHAP (dexametasona, citaribina de dose alta, e cisplatina); CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona, e bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, e prednisona); e CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina e prednisona).

[0091] Em uma modalidade preferida, a composição terapêutica- mente eficaz do conjugado droga citotóxica - anticorpo anti-CD22 é administrada subseqüente à administração de uma ou mais combinações acima de drogas citotóxicas como uma parte de um regime de tratamento.

[0092] Outro aspecto da invenção está direcionado a um método para tratar linfomas agressivos compreendendo administrar a um paciente, em necessidade do referido tratamento, uma composição tera- peuticamente eficaz de um conjugado de derivado de caliqueamicina monomérica - anticorpo anti-CD22 junto com um ou mais agentes bio- ativos.

[0093] Ainda outro aspecto da presente invenção está direcionado ao uso da composição da invenção no tratamento de um indivíduo com um distúrbio proliferativo tal como câncer. Em particular, o câncer é uma malignidade da célula B que expressa o antígeno CD22 na superfície da célula. Em particular, a malignidade da célula B ou é uma leucemia ou um linfoma. Em uma modalidade, o câncer é um carcinoma ou uma leucemia.

[0094] Em uma modalidade, uma dose terapeuticamente eficaz da composição é administrada subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intramedularmente, intratecal- mente, transdermicamente, transcutaneamente, intranasalmente, topicamente, enteralmente, intravaginalmente, sublingualmente ou retalmente.

[0095] Em uma modalidade preferida, a dose terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da invenção é administrada intravenosamente.

[0096] Outro aspecto da invenção está direcionado ao uso de um conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica da presente invenção para uso no tratamento de um indivíduo com uma malignidade da célula B tal como o linfoma não Hodgkin. Em uma modalidade, o conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica da presente invenção é administrado com um ou mais agentes bioativos.

[0097] Em uma modalidade, os agentes bioativos são selecionados a partir de um grupo consistindo em anticorpos, fatores de crescimento, homônios, citocinas, anti-hormônios, xantinas, interleucinas, interferons, e drogas citotóxicas.

[0098] Em uma modalidade preferida, o agente bioativo é um anticorpo direcionado contra um antígeno de superfície de célula expressado nas malignidades da célula B, tal como os anticorpos anti-CD19, anti-CD20 e anti CD-33. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CD20 é rituximab (Rituxan®).

[0099] Em outra modalidade, os agentes bioativos incluem citocinas ou fatores de crescimento tal como interleucina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF e G-CSF ou hormônios, que incluem estrógenos, an- drógenos, progestinas e corticosteróides.

[00100] Em outra modalidade, o agente bioativo é uma droga citotóxica selecionada de doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, aclarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona, epirrubicina, carrubicina, no- galamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gemcitabi- na, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pen- tostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, Adriamici- na®, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, pro- carbazina, metotrexato, flurouracil, etoposídeo, taxol, análogos de taxol, e mitomicina

[00101] Em uma modalidade preferida, a dose terapeuticamente eficaz do conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica é administrada junto com uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como uma parte de um regime de tratamento, onde a combinação dos agentes citotóxicos é selecionada de: CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, e procarbazina); CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, prednisona); m- BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, e leucovorina); ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina); ProMACE- CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorina, citarabina, bleomicina, e vincristina); MACOP- B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leucovorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina); alternando com ABVD (Adriamici- na®/doxorrubicina, bleomicina e vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABV (Adriami- cina®/doxorrubicina, bleomicina e vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABVD (Adria- micina®/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina); ChIVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona); IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, e etoposídeo); MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato e etoposídeo); DHAP (dexametasona, citaribina de dose alta, e cisplatina); ESHAP (etoposídeo, metilpredisolona, citarabina de dose alta, e cisplatina); CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona, e bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, e prednisona); e CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina e prednisona); ESHOP (etoposídeo, metilpredisolona, citarabina de dose alta vincristina e cisplatina); EPOCH (etoposídeo, vincristina e doxorrubicina durante 96 horas com doses de bolo de ciclofosfamida de prednisona oral), ICE (ifosfamida, ciclofosfamida e etoposideo), CEPP(B) (ciclofos- famida, etoposideo, procarbazina, prednisona e bleomicina), CHOP-B (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, e bleomicina); CEPP-B (ciclofosfamida, etoposideo, procarbazina e bleomicina), e P/DOCE (epirrubicina ou doxorrubicina, vincristina, ciclofosfamida, e prednisona).

[00102] Em uma modalidade preferida, o conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica é administrado antes da administração de uma ou mais combinações de agentes citotó- xicos como uma parte de um regime de tratamento.

[00103] Em outra modalidade preferida, a dose terapeuticamente eficaz do conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica é administrada subseqüente à administração de uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como parte de um regime de tratamento.

[00104] Em ainda outra modalidade preferida, a dose terapeuticamente eficaz do conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica é administrado junto com um anticorpo direcionado contra um antígeno de superfície de célula nas malignidades da célula B, e opcionalmente compreendendo uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como parte de um regime de tratamento.

[00105] Em outro aspecto, a invenção está direcionada ao uso do conjugado de anticorpo anti-CD22/derivado de caliqueamicina monomérica da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferativo. Um tal medicamento pode ser empregado para tratar distúrbios proliferativos da célula B, ou sozinho ou em combinação com outros agentes bioativos.

Breve Descrição das várias vistas dos Desenhos

[00106] A Figura 1 mostra a sequência de aminoácido dos CDRs do anticorpo monoclonal de camundongo 5/44 (SEQ ID NOS: 1 a 6).

[00107] Figura 2 mostra a sequência de proteína (SEQ ID NO: 7) e DNA (SEQ ID NOS: 52 e 53) do domínio da variável (VL) de cadeia leve do anticorpo monoclonal de camundongo 5/44.

[00108] Figura 3 mostra a sequência de proteína (SEQ ID NO: 8) e DNA (SEQ ID NOS: 54 e 55) do domínio da variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal de camundongo 5/44.

[00109] Figura 4 mostra a estratégia para a remoção do sítio de gli- cosilação e lisina reativa na CDR-H2 (SEQ ID NOS: 9-12 e 14).

[00110] Figura 5 mostra o desenho do enxerto para a sequência de cadeia leve 5/44 (SEQ ID NO: 7). DPK-9 é a sequência de estrutura aceptora de linha germinativa humana (SEQ ID NO: 17). As linhas verticais indicam diferenças entre os resíduos do camundongo e do ser humano. As sequências sublinhadas indicam resíduos de doadores que foram retidos no enxerto. Os CDRs são indicados nas letras em itálico em negrito (não-mostrado para DPK-9). O enxerto gL1 (SEQ ID NO: 19) tem 6 resíduos da estrutura do doador, gl_2 (SEQ ID NO: 20) tem 7.

[00111] Figura 6 mostra o desenho do enxerto para a sequência de cadeia pesada 5/44 (SEQ ID NO: 8); DP7 (SEQ ID NO: 21) é a sequência de estrutura aceptora de linha germinativa humana. As linhas verticais indicam diferenças entre os resíduos de camundongo e ser humano. As sequências sublinhadas indicam os resíduos dos doadores que foram retidos no enxerto. Os CDRs são indicados em letras em negrito, em itálico (não-mostrado para DP7). Os enxertos gH4 (SEQ ID NO: 24) e gH6 (SEQ ID NO: 26) têm 6 resíduos da estrutura do doador. Os enxertos gH5 (SEQ ID NO: 25) e gH7 (SEQ ID NOS: 27) têm 4 resíduos da estrutura do doador.

[00112] Figura 7 mostra o mapa do vetor pMRR14.

[00113] Figura 8 mostra o mapa do vetor pMRR10.

[00114] Figura 9 mostra os resultados do ensaio Biacore™ dos mu- tantes 5/44 quiméricos.

[00115] Figura 10 mostra os oligonucleotídeos para reunião dos genes gl_1 e gH1 5/44 (SEQ ID NOS: 32-47).

[00116] Figura 11 mostra o mapa do plasmídeo do vetor intermediário pCR2.1(544gH1).

[00117] Figura 12 mostra o mapa do plasmídeo do vetor intermediário pCR2.1(544gL1).

[00118] Figura 13 mostra os cassetes de oligonucleotídeo empregados para preparar outros enxertos (SEQ ID NOS: 56-65).

[00119] Figura 14 é um gráfico que mostra um ensaio de competição entre anticorpos 5/44 de camundongos fluorescentemente rotulados e variantes enxertadas.

[00120] Figura 15 é um gráfico que mostra um ensaio de competição entre anticorpo 5/44 de camundongos fluorescentemente rotulados e variantes enxertados.

[00121] Figura 16 mostra a sequência de proteína (SEQ ID NOS: 28 e 30) e DNA completa (SEQ ID NOS: 29, 31, 66 e 67) das cadeias leves e pesadas enxertadas.

[00122] Figura 17 é uma representação esquemática de um conjugado de DMH de caliqueamicina gama/anticorpo NAc.

[00123] Figura 18 é um gráfico que mostra o efeito do CMC-544 no crescimento do linfoma de célula B RAMOS.

[00124] Figura 19 é um gráfico que mostra o efeito do CMC-544 nos linfomas de célula B grandes em um modelo de xenoenxerto in vivo no camundongo nu.

[00125] Figura 20 é um gráfico que compara os efeitos do CMC-544 feito com o processo de conjugação CMC-676 e o processo de conjugação CMC-544 no crescimento do linfoma RL.

[00126] Figura 21 é um gráfico que mostra que o linfoma RL grande tratado por rituximab (Rituxan®) é susceptível ao tratamento com CMC-544.

[00127] Figura 22 é um gráfico que mostra o efeito da rituximab (Ri- tuxan®) no efeito citotóxico do CMC-544.

[00128] Figura 23 é um gráfico que mostra o efeito do CMC-544, rituximab (Rituxan®), e CMA-676 na sobrevivência de camundongos SCID com linfoma B RAMOS precocemente disseminado.

[00129] Figura 24 é um gráfico que mostra o efeito de CMC-544, rituxamab (Rituxan®), e CMA-676 na sobrevivência de camundongos SCID com linfoma B RAMOS tardiamente disseminado.

[00130] Figura 25 é um gráfico que mostra o efeito de CMC-544, rituxamab (Rituxan®), e CMA-676 na sobrevivência de camundongos SCID com linfoma B RAMOS tardiamente disseminado.

[00131] Figura 26 é um gráfico que mostra o efeito de CMC-544, rituxamab (Rituxan®), e CMA-676 na sobrevivência de camundongos SCID com linfoma B RAMOS tardiamente disseminado.

[00132] Figura 27 é um gráfico que mostra o efeito de CMC-544, rituxamab (Rituxan®), e CMA-676 na sobrevivência de camundongos SCID com linfoma B RAMOS tardiamente disseminado.

[00133] Figura 28 é um gráfico que mostra a atividade antitumor de CMC-544 com e sem rituxamab (Rituxan®) em linfoma não Hodgkin RL.

[00134] Figura 29 é um gráfico que mostra a atividade antitumor de CMC-544 e CHOP em linfoma não Hodgkin RL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00135] Os conjugados da presente invenção compreendem uma droga citotóxica derivadas com um ligador que inclui qualquer grupo reativo que reage com um carreador proteináceo para formar um conjugado carreador proteináceo derivado de droga citotóxica. Especificamente, os conjugados da presente invenção compreendem uma droga citotóxica derivada com um ligador que inclui qualquer grupo reativo que reage com um anticorpo empregado como um carreador proteináceo para formar um conjugado de anticorpo derivado de droga citotóxica. Especificamente. O anticorpo reage contra um antígeno de superfície de célula nas malignidades da célula B. Descrito abaixo é um processo melhorado para preparar e purificar tais conjugados. O uso de co-solventes, aditivos e condições de reação específicas particulares junto com o processo de separação, resulta na formação de um conjugado de anticorpo/derivado de droga citotóxica monomérica com uma redução significante no LCF. A forma monomérica quando oposta a forma agregada tem valor terapêutico significante, e minimiza o LCF e substancialmente reduz os resultados de agregação na utilização do material de partida do anticorpo de uma maneira terapeuti- camente significativa prevenindo-se o LCF de competir com a fração mais altamente conjugada (HCF).

CARREADORS

[00136] Os carreadors/alvejantes da presente invenção são preferivelmente agentes alvejantes/carreadors proteináceos. Incluídos como agentes alvejantes/carreadors são hormônios, fatores de crescimento, anticorpos, fragmentos de anticorpos, mímicos de anticorpos, e suas contrapartes geneticamente ou enzimaticamente construídas, a seguir referido singularmente ou como um grupo como "carreadors". A propriedade essencial de um carreador é sua capacidade de reconhecer e aglutinar-se a um antígeno ou receptor associado com as células inde- sejadas e ser subseqüentemente internalizado. Os exemplos de carreadors que são aplicáveis na presente invenção são descritos na Patente U.S. N° 5.053.394, que está incorporada aqui em sua totalidade. Os carreadors preferidos para uso na presente invenção são anticorpos e mímicos de anticorpos.

[00137] Vários andaimes de proteína de não-imunoglobulina foram empregados para gerar mímicos de anticorpos que aglutinaram-se aos epitopos antigênicos com a especificidade de um anticorpo (Publicação PCT N° WO 00/34784). Por exemplo, um andaime de "minicorpo", que está relacionado com a dobra de imunoglobulina, foi designado se deletando três cepas beta de um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal (Tramontane e outros, J. Mol. Recognit, 7:9, 1994). Esta proteína inclui 61 resíduos e pode ser empregada para apresentar duas alças hipervariáveis. Essas duas alças foram alea- torizadas e os produtos selecionados para a ligação de antígeno, porém até agora a estrutura parece ter a utilidade um pouco limitada devido aos problemas de solubilidade. Outra estrutura empregada para exibir alças é tendamistat, uma proteína que especificamente inibe a alfa-amilase mamífera e é um sanduíche de lâmina beta de seis filamentos, de 74 resíduos mantidos juntos por duas ligações de dissulfe- to, (McConnell e Hoess, J. Mol.Biol. 250:460, 1995). Este andaime in-clui três alças, porém, até hoje, somente duas dessas alças foram examinadas para aleatorização potencial.

[00138] Outras proteínas foram testadas como estruturas e foram empregadas para exibir resíduos aleatorizados em superfícies alfa helicoidais (Nord e outros, Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord e outros, Protein Eng. 8:601, 1995), as alças entre as hélices alfa em feixes de hélice alfa (Ku e Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:6552, 1995), e as alças constra comprimidas por pontes de dissulfeto, tal como aquelas dos inibidores de protease pequenos (Markland e outros, Biochemistry 35:8045, 1996; Markland e outros, Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen e Collins, Gene 164;243, 1995; Wang e outros, J. Biol. Chem. 270:12250, 1995).

[00139] Os exemplos de carreadors de anticorpo que podem ser empregados na presente invenção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e fragmentos biologicamente ativos destes. Preferivelmente, tais anti- corpos estão direcionados contra antígenos de superfície de célula expressado em células alvo e/ou tecidos em distúrbios prol iterativos tal como câncer. Os exemplos de anticorpos específicos direcionados contra antígenos de superfície de célula em células alvo incluem sem limitação, anticorpos contra antígeno CD22 que é superexpresso na maioria dos linfomas de célula B; G5/44, uma forma humanizada de um anticorpo monoclonal anti-CD22 de camundongo; anticorpos contra antígenos de superfície de célula CD33, que é predominante em certos tumores mielóide humanos especialmente leucemia mielóide aguda; hP67.6, uma forma humanizada do anticorpo de camundongo anti-CD33 (observe Patente U.S. N° 5.773.001); um anticorpo contra o antígeno PEM encontrado em muitos tumores de origem epitelial designado mP67.6 (observe I.D. Bernstein e outros, J. Clin. Invest 79:1153 (1987) e I.D. Bernstein e outros, J. Immunol. 128:867-881 (1992)); e um anticorpo humanizado contra o antígeno de carboidrato Lewis Y superexpressado em muitos tumores sólidos designado hu3S193, (observe Patente U.S. N° 6.310.185 B1). Além disso, há vários anticorpos comercialmente disponíveis tal como rituximab (Rituxan®) e trastuzumab (Herceptin®), que podem também ser empregados como agentes alvejantes/carreadors. A rituximab (Rituxan®) é um anticorpo anti-CD20 quimérico empregado para tratar vários linfomas de célula B e trastuzumab (Herceptin®) é um anticorpo anti-Her2 humanizado empregado para tratar câncer de mama.

[00140] Exemplificado aqui para uso como um carreador na presente invenção é uma molécula de anticorpo humanizado enxertada direcionada contra o antígeno de superfície de célula CD22, designada G5/44. Este anticorpo é uma forma humanizada de um anticorpo monoclonal anti-CD22 de camundongo que é direcionado contra o antígeno de superfície de célula CD22, que é predominante em certos linfomas humanos. O termo "molécula de anticorpo enxertado por CDR" como empregado aqui se refere a uma molécula de anticorpo onde a cadeia pesada e/ou leve contém uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) incluindo, se desejado, um CDR modificado (a seguir CDR) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo) enxertado em uma estrutura de região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceptor (por exemplo, um anticorpo humano). Preferivelmente, um tal anticorpo enxertado por CDR tem um domínio variável compreendendo regiões de estrutura aceptora humana bem como um ou mais CDRs doa-dores referidos acima.

[00141] Quando os CDRs são enxertados, qualquer sequência da estrutura da estrutura variável aceptora apropriada pode ser empregada tendo referência à classe/tipo do anticorpo doador do qual os CDRs são derivados, incluindo regiões de estrutura de camundongo, primata ou humano. Os exemplos de estruturas de humano, que podem ser empregadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser empregados para a cadeia pesada, REI pode ser empregado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser empregados para ambas, cadeia pesada e cadeia leve.

[00142] Em um anticorpo enxertado por CDR da presente invenção, é preferido empregar como o anticorpo aceptor um tendo cadeias que sejam homólogas às cadeias do anticorpo doador. As cadeias pesadas e leves aceptoras não necessariamente precisam ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias de compósito tendo regiões de estrutura derivadas de diferentes cadeias.

[00143] Além disso, em um anticorpo enxertado por CDR da presente invenção, as regiões de estrutura não necessitam ter exatamen- te a mesma sequência como aquela do anticorpo aceptor. Por exemplo, os resíduos incomuns podem ser alterados por resíduos mais fre- qüentemente ocorrentes para aquela classe ou tipo de cadeia acepto- ra. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de estrutura aceptora podem ser alterados de modo que eles correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo do doador ou a um resíduo que seja uma substituição conservative para o resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo do doador. Tais alterações deveriam ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para seleção de resíduos nas regiões de estrutura aceptora que pode ser necessário ser alterado é apresentado na Publicação PCT N° WO 91/09967, que está incorporado aqui em sua totalidade.

[00144] Os resíduos doadores são resíduos do anticorpo doador, isto é, o anticorpo do qual os CDRs foram originalmente derivados.

[00145] O anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende um CDR-H2 (como definido por Kaba e outros, (supra)) um H2’ no qual uma sequência de sítio de glicosilação potencial foi removida a fim de aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno.

[00146] Alternativamente ou adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por Kabat et al, (supra)) um H2" no qual um resíduo de lisina está na posição 60. Este resíduo de lisina, que está localizado em uma posição exposta com CDR-H2, e é considerado ter o potencial de reagir com agentes de conjugação resultando em uma redução da afinidade de ligação de antígeno, é substituído com um aminoácido alternativo.

[00147] Adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada onde o domínio variável compreen- de como CDR-H2 (como definido por Kabat e outros, (supra)) um H2" no qual ambos, a sequência de sítio de glicosilação potencial e o resíduo de lisina na posição 60, são substituídos com aminoácidos alternativos.

[00148] O anticorpo da presente invenção pode compreender: um anticorpo completo tendo cadeias pesadas e leves de extensão total; um fragmento biologicamente ativo deste, tal como um Fab, Fab modificado, Fab’, F(ab’)2 ou fragmento de Fv; um dímero ou monômero de cadeia leve ou cadeia pesada; ou um anticorpo de cadeia única, por exemplo, um Fv de cadeia única no qual os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são unidos por um ligante de peptídeo. Similarmente, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve podem ser combinadas com outros domínios de anticorpo quando apropriado.

[00149] O anticorpo da presente invenção pode também incluir um fragmento de Fab modificado onde a modificação é a adição de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora ou repórter à extremidade C-terminal de sua cadeia pesada. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região de articulação modificada contendo um ou dois resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora ou repórter pode estar ligada.

[00150] Os domínios de região constante do anticorpo da presente invenção, se presente, podem ser selecionados levando em consideração a função proposta do anticorpo, e em particular às funções efe- toras que podem ou não ser requeridas. Por exemplo, os domínios de região constante podem ser domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humano. Em particular, os domínios de região constante IgG podem ser empregados, especialmente dos isotipos lgG1 e lgG3 quando o anticorpo é pretendido para uso terapêutico e as funções efetoras do anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isotipos lgG2 e lgG4 podem ser empregados ou a região Fc de lgG1 pode ser mutada para abolir a função efetora quando o anticorpo é pretendido para propósitos terapêuticos e as funções efetoras do anticorpo não são requeridas ou desejadas.

[00151] O anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de pelo menos 5x10'8 M, preferivelmente pelo menos 1x10'9 M, mais preferivelmente pelo menos 0,75x10'10 M, e mais preferivelmente pelo menos 0,5x10‘1° M.

[00152] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a conjugados de imunotoxina e métodos para preparar esses conjugados empregando variantes de anticorpo ou mímicos de anticorpo. Em uma modalidade preferida, os variantes do anticorpo da presente invenção estão direcionados contra CD22 e exibem afinidade melhorada para CD22. Tais variantes podem ser obtidos por vários protocolos de maturação de afinidade incluindo mutação dos CDRs (Yang e outros, J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), baralhamento de cadeia (Marks, e outros, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de linhagens mutantes de E. coli(Low e outros, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), baralhamento de DNA (Pattern e outros, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), exibição de fago (Thompson e outros, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri e outros, Nature, 391, 288-291, 1998).

[00153] Qualquer sistema de vetor/célula hospedeira adequado pode ser empregado para a expressão das sequências de DNA codificando o carreador incluindo anticorpos da presente invenção. A bactéria E. coli, por exemplo, e outros sistemas microbianos podem ser empregados, em parte, para a expressão de fragmentos de anticorpos tal como fragmentos Fab e F(ab’)2, e especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia única, por exemplo, Fvs de cadeia única. Os sistemas de expressão de célula hospedeira, por exemplo, mamária, eucariótica podem ser empregados para a produção de grandes anticorpos, incluindo moléculas de anticorpo completo. As cé lulas hospedeiras mamárias adequadas incluem CHO, mieloma, células de levedura, células de insetos, células hibridoma, células C6 NOS, VERO, ou PER. Os sistemas de expressão adequados também incluem plantas e animais transgênicos.

II. AGENTES TERAPÊUTICOS

[00154] Os agentes terapêuticos adequados para uso na presente invenção são drogas citotóxicas que inibem ou interrompem a polime- rização da tubulina, agentes de alquilação que ligam-se e interrompem o DNA; e agentes que inibem a síntese de proteína ou proteínas celulares essenciais tais como ciclinas, enzimas e cinases de proteínas. Os exemplos de tais drogas citotóxicas, porém não estão limitados a tiotepa, taxanos, vincristina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubici- na, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, tamoxifeno, idar- rubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, caliqueamicinas, esperamicina e maitancinóides. As drogas citotóxicas preferidas são as caliqueamicinas, que são um exemplo dos antibióticos antitumor de trissulfeto de metila. Os exemplos de caliqueamicinas adequados para uso na presente invenção são divulgados, por exemplo, na Patente U. S. n° 4.671.958; Patente U. S. n° 4.970.198, Patente U. S. n° 5.053.394; Patente U. S. n° 5.037.651 e Patente U. S. n° 5.079.233, que estão incorporadas aqui em sua totalidade. As caliqueamicinas preferidas são os derivados de gama-caliqueamicina ou os derivados de gama-caliqueamicina de N-acetila.

III. CONJUGADOS DE DERIVADO DE DROGA CITOTÓXICA/CARRE- ADOR.

[00155] Os conjugados da presente invenção têm a fórmula Pr(-X- W)m onde:

[00156] Pr é um carreador proteináceo;

[00157] X é um ligante que compreende um produto de qualquer grupo reativo que possa reagir com um carreador proteináceo,

[00158] W é uma droga citotóxica

[00159] m é a carga média para o produto de conjugação purificado tal que a caliqueamicina constitua 4-10% do conjugado em peso; e

[00160] (-X-X)m é uma droga citotóxica.

[00161] Preferivelmente, X tem a fórmula (CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2C(Z1) = Q - Sp) onde

[00162] Alk1 e Alk2 sao independentemente uma ligação ou cadeia de alquileno ramificada ou não-ramificada (C1-C10);

[00163] Sp1 é uma ligação, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR’-, -N(CH2CH2)2N-, OU -X-Ar’-Y-(CH2)n-Z onde X, Y e Z são independentemente uma ligação de -NR’-, -S-, ou -O-, com a condição de que quando n= 0, então pelo menos um dos Y ou Z devam ser uma ligação e Ar' é 1,2-, 1,3- ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído com um, dois ou três grupos de (C1-C5) alquila, (C1-C4) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, -COOR’, -CONHR’, -(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, - O(CH2)nCONHR’, ou -S(CH2)nCONHR’, com a condição de que quando Alk1 for uma ligação, Sp1 será uma ligação.

[00164] n é um número inteiro de 0 a 5,

[00165] R’ é uma cadeia ramificada ou não-ramificada (C1C5) opcionalmente substituída por um ou dois grupos de -OH, (C1-C4) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, (C1-C3) dialquilamino, ou (C1-C3) tri- alquilamônio -A' onde A‘ é um ânion farmaceuticamente aceitável completando um sal;

[00166] Ar é 1,2-, 1,3- ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído com um, dois, ou três grupos de (C-i-Cβ) alquila, (C1-C5) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, - S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, ou -S(CH2)nCONHR’, onde n e R’ são como definidos acima ou um 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8, 2,3-, 2,6- ou 2,7-naftilidemo ou

[00167] Copiar o composto da página 27.

[00168] com cada naftilideno ou fenotiazina opcionalmente substituída com um, dois, três ou quatro grupos de (Ci-Cβ) alquila, (C1-C5) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)n COOR’, -S(CH2)nCOOR’, ou -S(CH2)nCONHR’, onde n e R’ são como definidos acima; com a condição de que quando Ar é fenotiazina, SP1 será uma ligação apenas conectada a nitrogênio;

[00169] Sp2 é uma ligação, -S-, ou -O-, com a condição de que quando Alk2 for uma ligação, Sp2 será uma ligação;

[00170] Z1 é H, (C1-C5) alquila ou fenila opcionalmente substituída com um, dois ou três grupos (Ci-Csjalquila, (Ci-Cs)alc0xi, (Ci-C4)tioal- cóxi; halogênio, nitro, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)n COOR', -O(CH2)nCONHR' ou -S(CH2)nCONHR' em que n e R' são como definidos acima;

[00171] Sp é um radical de cadeia reta ou ramificada divalente ou trivalente (C1-C18), radical de arila ou heteroarila divalente ou trivalente, radical de cicloalquila ou heterocicloalquila divalente ou trivalente (C3- Cie), radical de aril- ou heteroaril-arila divalente ou trivalente (C1-C18), radical de cicloalquil- ou heterocicloalquil-alquila divalente ou trivalente (C1-C18) ou radical de alquila não-saturada divalente ou trivalente (C2- Cie), onde heteroarila é preferivelmente furila, tienila, N-metilpirrolila, piridinila, N-metilimidazol, oxazolila, pirimidinila, quinolila, isoquinolila, N-metilcarbazoíla, aminocumarinila, ou fenazinila e onde se Sp é um radical trivalente, Sp pode ser adicionalmente substituído por grupos de (C1-C5) dialquilamino baixo, (C1-C5) alcóxi baixo, hidróxi, ou (C1-C5) alquiltio baixo; e

[00172] Q é =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, ou =NHO-.

[00173] Preferivelmente, Alk1 é uma cadeia de (C1-C10) alquileno ramificada ou não-ramificada; Sp’ é uma ligação, -S-, -O-, -CONH-, - NHCO- ou -NR’ onde R’ é como definido abaixo, com a condição de que quando Aik1 for uma ligação, Sp1será uma ligação;

[00174] Ar é 1,2-, 1,3- ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído com um, dois ou três grupos (Ci-Ce) alquila, (C1-C5) alcoxi, (C1-C4) tio- alcóxi, halogênio, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, - S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, ou -S(CH2)nCONHR’, onde n e R’ são como definidos acima, ou Ar é um 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- ou 2,7-naftilideno cada opcionalmente substituído com um, dois, três ou quatro grupos (CI-CΘ)alquila, (C1-C5) alcoxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, - S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, ou -S(CH2)nCONHR’; Z1 é (C1-C5) alquila ou fenila opcionalmente substituída com um, dois ou três grupos (Ci-Cδjalquila, (Ci-C4)alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, - COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH3)n COOR', -O(CH2)n CONHR' ou S(CH2)nCONHR', Alk2 e Sp2 são juntos uma ligação; e Sp e Q são como imediatamente definidos acima.

[00175] A Patente U. S. n° 5.773.001, incorporada aqui em sua totalidade, divulga ligantes que podem ser empregados com derivados nu- cleofílicos, particularmente hidrazidas e nucleófilos relacionados, preparados das caliqueamicinas. Esses ligantes são especialmente úteis naqueles casos onde melhor atividade é obtida quando a ligação formada entre a droga e o ligante é hidrolisável. Esses ligantes contêm dois grupos funcionais. Um grupo tipicamente é um ácido carboxílico que é utilizado para reagir com o carreador. O grupo funcional do ácido, quando apropriadamente ativado, pode formar uma ligação de amida com um grupo amina livre do carreador, tal como, por exemplo, a amina da cadeia lateral de uma lisina de um anticorpo ou outro carreador proteináceo. O outro grupo funcional comum é um grupo de carbonila, isto é, um aldeído ou uma cetona, que reagirá com 0 agente terapêutico apropriadamente modificado. Os grupos de carbonila po- dem reagir com um grupo de hidrazida na droga para formar uma ligação de hidrazona. Esta ligação é hidrolizável, permitindo a liberação do agente terapêutico do conjugado após a ligação às células alvo.

[00176] Um ligante bifuncional muito preferido para uso na presente invenção é o ácido 4-(4-acetilfenóxi)butânico (AcBut), que resulta em um produto preferido onde o conjugado consiste em β-caliqueamicina, y-caliqueamicina ou y-caliqueamicina de N-acetila funcionalizada pela reação com hidrazida de butanoíla de 3-mercapto-3-metila, o ligante AcBut, e um carreador alvejante de anticorpo IgG humanizado ou humano.

IV. CONJUGAÇÃO MONOMÉRICA

[00177] A natureza hidrofóbica natural de muitas drogas citotóxicas incluindo as caliqueamicinas cria dificuldades na preparação de conjugados de droga monomérica com boa carga de droga e produção razoável que são necessários para aplicações terapêuticas. A hidrofobi- cidade aumentada da ligação fornecida pelos ligadores, tal como o ligado de AcBut, divulgado na Patente U. S. n° 5.773.001, bem como a distância covalente aumentada separando o agente terapêutico do carreador (anticorpo), exacerba este problema.

[00178] A agregação dos conjugados de derivado de droga citotóxi- ca/carreador com carga de droga superior ocorre devido à natureza hidrofóbica das drogas. A carga de droga muitas vezes tem que ser limitada para obter quantidades razoáveis de produto monomérico. Em alguns casos, tal como com os conjugados na Patente U. S. n° 5.877.296, é muitas vezes difícil preparar os conjugados nas produções úteis com carga útil para aplicações terapêuticas empregando as condições de reação divulgadas na Patente U. S. n° 5.053.394 devido à agregação excessiva. Essas condições de reação utilizaram DMF como o co-solvente na reação de conjugação. Os métodos que permitem produção/carga de droga superior sem agregação e sem a perda inerente de material são portanto necessários.

[00179] Desenvolvimentos para reduzir a agregação são descritos nas Patentes U. S. nos 5.712.374 e 5.714.586, que são incorporadas aqui em sua totalidade. Divulgados nessas patentes são carreadors proteináceos incluindo, porém não limitados a, proteínas tais como anticorpos humanos ou humanizados que são empregados para alvejar os agentes terapêuticos citotóxicos, tais como, por exemplo, hP67.6 e os outros anticorpos humanizados divulgados aqui. Nessas patentes, o uso de uma solução não-nucleofílica, compatível com proteína tampo- nada contendo (i) propileno glicol como co-solvente e (ii) um aditivo compreendendo pelo menos um Ce-Cw ácido carboxílico foi constatado geralmente produzir conjugados de carreadors/derivados de droga citotóxica com produção/carga de droga superior e agregação reduzida tendo excelente atividade. Os ácidos preferidos descritos aqui foram C? a C12 ácidos, e 0 ácido mais preferido foi ácido octanóico (tal como ácido caprílico) ou seus sais. As soluções tamponadas preferidas para conjugados feitas de ésteres de N-hidroxissuccinimida (OSu) ou outros ésteres comparavelmente ativados foram, salina tamponada de fosfato (PBS) ou ácido piperazina-N’-2-etanossulfônico de 2- hidroxietila (tampão HEPES). A solução tamponada empregada nessas reações de conjugação não podem conter nucleófilos ou aminas livres. Para outros tipos de conjugados, os tampões aceitáveis podem ser facilmente determinados. Alternativamente, o uso de uma solução tamponada, compatível com proteína não-nucleofílica contendo t- butanol sem o aditivo adicional foi também constatado produzir conjugados de carreadors/derivados de caliqueamicina monomérica com produção/carga superior e agregação reduzida.

[00180] A quantidade de co-solvente necessária para formar um conjugado monomérico varia algumas vezes de proteína para proteína e pode ser determinado por aqueles versados na técnica sem experi- mentação indevida. A quantidade de aditivos necessários para eficazmente formar um conjugado monomérico também varia de anticorpo para anticorpo. Esta quantidade pode também ser determinada por alguém versado na técnica sem experimentação indevida. Nas Patentes U. S. nos 5.712.374 e 5.714.586, as adições de propileno glicol em quantidades variando de 10% a 60%, preferivelmente 10% a 40%, e mais preferivelmente cerca de 30% em volume da solução total, e um aditivo compreendendo pelo menos um Cθ-Ci8 ácido carboxílico ou seu sal, preferivelmente ácido caprílico ou seu sal, em quantidades variando de 20 mM a 100 mM, preferivelmente de 40 mM a 90 mM, e mais preferivelmente cerca de 60 mM a 90 mM foram adicionados às reações de conjugação para produzir conjugados de carrea- dors/derivados de droga citotóxica monomérica com produção/carga de droga superior e agregação reduzida. Outros solventes orgânicos compatíveis com proteína exceto propileno glicol, tais como etileno glicol, etanol, DMF, DMSO, etc., poderiam também ser empregados. Alguns ou todos os co-solventes orgânicos foram empregados para transferir a droga na mistura de conjugação.

[00181] Alternativamente, nessas patentes, a concentração do Ce- Ci8 ácido carboxílico ou seu sal poderia ser aumentada de 150-300 mM e o co-solvente reduzido de 1-10%. Em uma modalidade, o ácido carboxílico foi ácido octanóico ou seu sal. Em uma modalidade preferi-da, o ácido carboxílico foi ácido decanóico ou seu sal. Em outra modalidade preferida, o ácido carboxílico foi ácido caprílico ou seu sal, que estava presente em uma concentração de 200 mM de ácido caprílico junto com 5% de propileno glicol ou etanol.

[00182] Em outra modalidade alternativa nessas patentes, o t-bu- tanol em concentrações variando de 10% a 25%, preferivelmente 15% em volume da solução total poderia ser adicionado à reação de conjugação para produzir conjugados de carreadors/derivados de droga ci- totóxica monomérica com produção/carga de droga superior e agregação reduzida.

[00183] Essas condições de conjugação estabelecidas foram aplicadas à formação de CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin), que é atualmente comercialmente vendido como Mylotarg®. Desde a introdução deste tratamento para leucemia mielóide aguda (AML), foi descoberto através do uso de cromatografia de permuta de íon, que a caliqueamicina não está distribuída no anticorpo de uma maneira uniforme. A maioria da caliqueamicina está em aproximadamente metade do anticorpo, ao mesmo tempo em que a outra metade existe em um LCF que contém somente pequenas quantidades de caliqueamicina. Con-sequentemente, há uma necessidade crítica de melhorar os métodos para a conjugação de drogas citotóxicas tal como caliqueamicinas a carreadors que minimizem a quantidade de agregação e permitam uma carga de droga uniforme superior com uma produção significan- temente melhorada do produto conjugado.

[00184] Um exemplo específico é aquele do conjugado de AcBut de DMH de G5/44-Nac-gama-caliqueamicina, que é referido como CMC- 544 e é genericamente mostrado na Figura 17. A redução da quantidade de LCF para <10% do anticorpo total foi desejada para o desenvolvimento de CMC-544, e várias opções para redução dos níveis de LCF, foi considerada. Outros atributos do imunoconjugado, tal como ligação de antígeno e citotoxidade, não devem ser afetados pela última solução. As opções consideradas incluem modificação genética ou física do anticorpo, as técnicas de separação cromatográfica, ou a modificação das condições de reação.

[00185] A reação do anticorpo G5/44 com OSu de AcBut de DMH de Nac-gama-caliqueamicina empregando as condições de reação de antigas (Condições do processo de CMA-676) resultou em um produto com propriedades físicas similares (carga de droga, LCF, e agregação) como CMA-676. Entretanto, o nível elevado (50-60%) de LCF presente após a conjugação foi julgado indesejável. As condições de reação ótimas nas quais as variáveis de reação principais tais como temperatura, pH, fornecimento de derivado de caliqueamicina e concentração de aditivo, foram avaliadas. A análise dessas experiências demonstrou que o fornecimento de caliqueamicina e concentração de aditivo teve os efeitos mais significantes no nível da formação de agregado e LCF de fração conjugada baixa, ao mesmo tempo em que a temperatura e pH exerceram influências menores. Nas experiências adicionais, foi também mostrado que as concentrações de carreador de proteína (anticorpo) e co-solvente (etanol) foram similarmente de menor importância (comparadas com o fornecimento de caliqueamicina e concentração do aditivo) no controle de LCF e níveis de agregados. A fim de reduzir o LCF para < 10%, o fornecimento de derivado de caliqueamicina foi aumentado de 3% para 8,5% (peso/peso) relativo à quantidade de anticorpo na reação. O aditivo foi alterado de ácido octanóico ou seu sal em uma concentração de 200 mM )processo de CMA-676) para ácido decanóico ou seu sal em uma concentração de 37,5 mM. A reação de conjugação procedeu melhor em temperatura (30-35°C) e pH (8,2-8,7) suavemente elevados. As condições de reação incorporando essas alterações reduziram a LCF para abaixo de 10 por cento ao mesmo tempo em que aumentando a carga de caliqueamicina, e é a seguir referido como Condição do Processo de CMC-544 ou "novas" condições do processo. Uma comparação dos resultados obtidos com as Condições do Processo de CMA-676 e CMC-544 é mostrada na Tabela 1.

[00186] O aumento no fornecimento de caliqueamicina aumentou a carga da droga de 2,5-3,0 por cento em peso para 7,0-9,0 (mais tipicamente 7,5-8,5) por cento em peso, e resultou em nenhum aumento na agregação de proteína na reação. Devido à redução do agregado e LCF, as Condições do Processo de CMC-544 resultaram em um produto mais homogêneo. O CMC-544 foi reproduzivelmente preparado por este novo procedimento de conjugação na escala de anticorpo multigrama.

[00187] Nas reações anteriores, a concentração de anticorpo pode variar de 1 a 15 mg/ml e a concentração do derivado de caliqueamicina, por exemplo, éster de OSu de AcBut de DMH de gama-caliqueamicina de N-acetila (empregado para preparar conjugados mostrados na Figura 17), varia de cerca de 4,5-11% em peso do anticorpo. O co- solvente foi etanol, para que bons resultados fossem demonstrados em concentrações variando de 6 a 11,4% (base em volume). As reações foram realizadas em PBS, HEPES, N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(ácido 4- butanossulfônico) (HEPBS), ou outro tampão compatível em um pH de 8 a 9, em uma temperatura variando de 30°C a cerca de 35°C, e durante um tempo variando de 15 minutos a 24 horas. Aqueles que são versados na técnica podem facilmente determinar faixas de pH aceitáveis para outros tipos de conjugados. Para vários anticorpos o uso de variações suaves nas combinações dos aditivos acima mencionados foi constatado melhorar a carga da droga e produção de conjugado monomérico, e é entendido que qualquer carreador de proteína particular pode requerer alguma pequena alteração nas condições exatas ou escolha de aditivos para alcançar os resultados ótimos.

V. PURIFICAÇÃO E SEPARAÇÃO DO CONJUGADO

[00188] Seguinte a conjugação, os conjugados monoméricos podem ser separados dos reagentes não-conjugados (tal como carreador proteináceo e droga citotóxica livre/caliqueamicina) e/ou a forma agregada dos conjugados por métodos convencionais, por exemplo, cro- matografia por exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de ion (IEC), ou cro- matofocagem (CF). Os conjugados purificados são monoméricos, e freqüentemente contêm de 4 a 10% em peso de droga citotóxica/cali- queamicina. Em uma modalidade preferida, os conjugados são purificados empregando cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Nos processos previamente empregados para a preparação em escala de produção de conjugados de droga citotóxica/caliqueamicina - anticorpo (processo de CMA-676), a etapa de separação pós-conjugação sozinha empregada foi cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Ao mesmo tempo em que esta etapa é muito eficaz igualmente na remoção de conjugados agregados e na conclusão da permuta do tampão para formulação, ela é ineficaz na redução do conteúdo de LCF. Con- seqüentemente, o processo com base em SEC conta totalmente com a química da reação de conjugação para controlar o conteúdo de LCF do produto final. Outra desvantagem de SEC é a limitação do volume da mistura de reação do conjugado, aplicada à coluna (tipicamente não excedendo a 5 por cento do volume do leito da coluna do processo). Isto gravemente limita o tamanho da batelada (e portanto a capacidade da produção) que pode ser suportada em um determinado espaço de produção. Finalmente, o processo de purificação de SEC também resulta em diluição significante da solução do conjugado, que coloca restrições sobre a concentração de proteína que pode ser seguramente obtida na formulação.

[00189] Quando uma droga citotóxica tem uma natureza altamente hidrofóbica, tal como um derivado de caliqueamicina, e é empregada em um conjugado, a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é um candidato preferido para fornecer a separação eficaz do conjugado e anticorpo não-conjugado. A HIC apresenta três vantagens principais sobre a SEC: (1) ter a capacidade de eficientemente reduzir o conteúdo de LCF bem como o agregado; (2) capacidade da carga da coluna para HIC ser muito maior; e (3) HIC evitar a diluição excessiva do produto.

[00190] A quantidade de carreadors de HIC de capacidade elevada, adequados para uso em escala de produção, tal como Fluxo Rápido de Butila, Fenila e Octila Sefarose™ 4 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), pode eficazmente separar os componentes não-conju- gados e agregados do conjugado de componentes conjugados mono- méricos seguinte ao processo de conjugação.

VI. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES

[00191] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma formulação/composição diagnóstica ou terapêutica compreendendo misturar o conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica monomérica da presente invenção juntamente com um exci- piente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00192] O conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica mo- nomérica pode ser o ingrediente ativo sozinho na formulação/compo- sição diagnóstica ou terapêutica ou pode ser acompanhado por outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo, anticorpos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD33, anti-célula T, anti-IFNy ou anti-LPS, ou ingredientes de não-anticorpos tais como citocinas, fatores de crescimento, hormônios, anti-hormônios, drogas citotóxicas e xantinas.

[00193] As citocinas e fatores de crescimento que podem ser empregados para tratar distúrbios proliferativos tais como câncer, e que podem ser empregados juntamente com os conjugados de carrea- dors/derivados de droga citotóxica da presente invenção incluem interferons, ineterleucinas tais como interleucina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM- CSF e G-CSF.

[00194] Os hormônios comumente empregados para tratar distúrbios proliferativos tal como câncer e que podem ser empregados juntamente com os conjugados de carreadors/derivados de droga citotóxica da presente invenção incluem estrogênios tais como dietilestilbes- trol e estradiol, andrógenos tais como testosterona e Halotestina®, pro- gestina tal como Megace® e Provera®, e corticosteróides tal como prednisona, dexametasona e hidrocortisona.

[00195] Os anti-hormônios tais como anti-estrogênios, isto é, tamo- xifeno, anti-andrógenos, isto é, agentes flutamidas e anti-adrenais são comumente empregados para tratar distúrbios proliferativos tal como câncer, e podem ser empregados juntamente com o conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica da presente invenção.

[00196] Os agentes quimioterapêuticos/antineoplásticos comumente empregados para tratar distúrbios proliferativos tal como câncer, e que podem ser empregados juntamente com o conjugado de carreador/derivado de droga citotóxica da presente invenção, incluem porém não estão limitados a, Adriamicina®, cisplatina, carboplatina, vinblasti- na, vincristina, bleomicina, metotrexato, doxorrubicina, flurouracil, etoposideo, taxol, e seus vários análogos de taxol, e mitomicina.

[00197] As composições deveriam preferivelmente compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado da invenção. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como empregado aqui refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma condição ou doença alvejada, ou para exibir um efeito preventivo ou terapêutico detectável. Para qualquer conjugado, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente ou nos ensaios de cultura de células ou em modelos de animais, freqüentemente em roedores, coelhos, cachorros, porcos ou primatas. O modelo de animal pode ser empregado para determinar a faixa de concentração apropriada e rota de administração em seres humanos.

[00198] A quantidade eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e freqüência de administração, combinação(s) de droga, sensibilidade à reação e tolera ncia/res posta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está no julgamento do médico. Geralmente, uma dose eficaz será de 0,1 mg/m2 a 50 mg/m2, preferivelmente 0,4 mg/m2 a 30 mg/m2, mais preferivelmente 2 mg/m2 a 9 mg/m2, cuja dose é calculada com base no carreador proteináceo.

[00199] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação com outros agentes, drogas ou hormônios. A dose na qual o conjugado de anticorpo/derivado de droga citotóxica monomérica da presente inven-ção é administrado depende da natureza e condição a ser tratada, do grau da malignidade do linfoma ou leucemia e se o conjugado está sendo empregado profilaticamente ou se é para tratar uma condição existente.

[00200] A freqüência da dose dependerá da meia-vida do conjugado e da duração do seu efeito. Se o conjugado tem uma meia-vida curta (por exemplo, 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula do conjugado tem uma meia-vida longa (por exemplo 2 a 15 dias) pode ser necessário dar uma dosagem única por dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez a cada 1 ou 2 meses.

[00201] Uma composição pode também conter um carreador far- maceuticamente aceitável para administração do conjugado de anticorpo. O carreador poderia não propriamente induzir a produção de anticorpos nocivos ao indivíduo recebendo a composição e não deveria ser tóxico. Os carreadors adequados podem ser macromoléculas lentamente metabolizadas grandes tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inativo.

[00202] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser empregados, por exemplo, sais de ácido mineral, tais como cloridratos, bromi- dratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00203] Os carreadors farmaceuticamente aceitáveis nessas composições podem adicionalmente conter líquidos tais como água, salina, glicerol, e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias de tampona- mento de pH, podem estar presentes em tais composições, tais carreadors fazem com que as composições sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas ou suspensões, para ingestão pelo paciente.

[00204] As formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, ele pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um carreador oleoso ou aquoso e pode conter agentes formuladores, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes.

[00205] Embora a estabilidade das soluções de conjugado tampo- nadas seja adequada para estabilidade em curto prazo, para estabilidade em longo prazo ela é fraca. Para melhorar a estabilidade do conjugado e aumentar sua meia-vida, o conjugado de droga de anticorpo pode ser liofilizado para uma forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado. Os problemas associados com a liofilização de uma solução de proteína são bem documentados. A perda de estrutura secundária, terciária e quaternária pode ocorrer durante os processos de congelamento e secagem. Conseqüentemente, os crioprotetores podem ter que ser incluídos para atuarem como um estabilizador amorfo do conjugado e para manter a integridade estrutural da proteína durante o processo de liofilização. Em uma modalidade, o crioprotetor útil na presente invenção é um álcool de açúcar, tal como alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietileno glicol, e combinações destes. Em outra modalidade, o crioprotetor é um ácido de açúcar, incluindo um ácido aldônico, um ácido urônico, um ácido aldárico e combinações destes.

[00206] O crioprotetor desta invenção pode também ser um carboidrato. Os carboidratos adequados são compostos de aldeído ou ceto- na contendo dois ou mais grupos de hidroxila. Os carboidratos podem ser cíclicos ou lineares e incluem, por exemplo, aldoses, cetoses, açúcares de amino, alditois, inositois, ácidos aldônicos, ácidos urônicos, ou ácidos aldáricos, ou combinações destes. O carboidrato pode tam bém ser um mono-, um di-, ou um policarboidrato, tal como, por exemplo, um dissacarídeo ou polissacarídeo. Os carboidratos adequados incluem, por exemplo, gliceraldeídos, arabinose, lixose, pentose, ribose, xilose, galactose, glicose, hexose, idose, manose, talose, heptose, glicose, frutose, ácido glicônico, sorbitol, lactose, manitol, α-glicopira- nosídeo de metila, maltose, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lacto- na, sorbose, ácido glucárico, ácido galacturônico, ácido manurônico, glicosamida, galactosamina, sacarose, trealose ou ácido neuramínico, ou derivados destes. Os policarboidratos adequados incluem, por exemplo, arabinanos, frutanos, fucanos, galactanos, galacturonanas, glucanos, mananos, xilanos (tal como, por exemplo, inulina), levano, fucoidano, carragenina, galactocarolose, pectinas, ácido péctico, ami- lose, pululano, glicogênio, amilopectina, celulose, dextrano, pustulano, quitina, agarose, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurônico, ácido algínico, goma xantano, ou amido. Entre os carboidratos particularmente úteis estão, sacarose, glicose, lactose, trealose e combinações destes. A sacarose é um crioprotetor particularmente útil.

[00207] Preferivelmente, o crioprotetor da presente invenção é um carboidrato ou álcool de "açúcar", que pode ser um álcool poliídrico. Os compostos poliídricos são compostos que contêm mais do que um grupo hidroxila. Preferivelmente, os compostos poliídricos são lineares. Os compostos poliídricos adequados incluem, por exemplo, glicóis tais como etileno glicol, polietileno glicol, e polipropileno glicol, glicerol ou pentaeritritol; ou combinações destes.

[00208] Em algumas modalidades preferidas, o agente crioprotetor é sacarose, trealose, manitol ou sorbitol.

[00209] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. Entretanto, é preferido que as composições sejam adaptadas para administração a indivíduos humanos.

[00210] As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer quantidade de rotas incluindo, porém não limitadas a, rotas orais, intravenosas, intramusculares, intra-arteriais, intramedu- lares, intratecais, intraventriculares, transdérmicas, transcutâneas (observe, Publicação PCT N° WO 98/20734), subcutâneas, intraperitone- ais, intranasais, enterais, tópicas, sublinguais, intravaginais ou retais. Os hiposprayspodem também ser empregados para administrar as composições da invenção. Tipicamente, as composições podem ser preparadas como injetáveis, ou como suspensões ou soluções líquidas. As formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão em carreadors líquidos antes da injeção podem também ser preparadas.

[00211] A liberação direta das composições geralmente será concluída por injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou liberada ao espaço intersticial de um tecido. As composições podem também ser administradas em uma lesão. O tratamento da dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de dose múltipla.

[00212] Será apreciado que o ingrediente ativo na composição seja um conjugado de carreador proteináceo/droga citotóxica. Como tal será susceptível à degradação no trato gastrointestinal. Desse modo, se a composição é para ser administrada por uma rota empregando o trato gastrointestinal, a composição necessitará conter agentes que protejam o conjugado da degradação, porém que libere o conjugado uma vez que ele tenha sido absorvido do trato gastrointestinal.

[00213] Uma discussão completa de carreadors farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

[00214] A presente invenção, em particular, fornece um anticorpo anti-CD22 humanizado/derivado de caliqueamicina monomérica (G5/44), CMC-544, para uso no tratamento de distúrbios proliferativos caracte- rizados pelas células expressando o antígeno CD22 em sua superfície.

[00215] A presente invenção ainda fornece o uso de CMC-544 na preparação de uma composição ou um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferativo caracterizado por células expressando CD22.

[00216] CMC-544 pode também ser utilizado em qualquer terapia onde seja desejado reduzir o nível de células expressando CD22 que esteja presente no indivíduo sendo tratado com a composição ou um medicamento divulgado aqui. Especificamente, a composição ou medicamento é empregado para tratar seres humanos ou animais com distúrbios proliferativos, isto é, linfomas e leucemias, que expressem o antígeno CD22 na superfície da célula. Essas células de expressão de CD22 podem ser circulantes no corpo ou estar presente indesejavel- mente em uma grande quantidade, localizadas em um sítio particular no corpo.

[00217] CMC-544 pode também ser preferivelmente empregado para o tratamento de malignidades de linhagens de B-linfócitos incluindo linfomas e leucemias, mais preferivelmente Linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), mieloma múltiplo, leucemia de linfócito aguda (ALL) e leucemia linfocítica crônica (CLL). O CMC-544 pode ser empregado sozinho ou em combinação com outros agentes bioativos para tratar indivíduos sofrendo de malignidades da célula B.

[00218] Os agentes bioativos comumente empregados incluem fatores de crescimento, citocinas e drogas citotóxicas. As drogas citotóxicas comumente empregadas para tratar distúrbios proliferativos tal como câncer, e que podem ser empregadas juntamente com CMC-544 incluem uma antraciclina tal como doxorrubicina, daunorrubicina, idar- rubicina, aclarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona, epirrubicina, carrubi- cina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina durante até três dias; e um nucleosídeo de pirimidina ou purina tais como, citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluri- dina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur e tiazofurina. Outros agentes quimioterapêuticos/antineoplásticos que podem ser administrados em combinação com CMC-544 incluem Adriamicina®, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato, fluorouracilas, etoposideo, taxol e seus vários análogos e mitomicina. CMC-544 pode ser administrado concomitantemente com um ou mais destes agentes terapêuticos. Alternativamente, CMC-544 pode ser administrado seqüencialmente com um ou mais destes agentes terapêuticos.

[00219] CMC-544 pode da mesma forma ser administrado sozinho ou seqüencialmente com uma combinação de outros agentes bioativos tais ∞mo, fatores de crescimento, citocinas, esteróides, anticorpos, tal ∞mo, anticorpo anti-CD20, rituximab (Rituxan®) e agentes quimiotera- pêuticos como uma parte de um regime de tratamento. Os regimes de tratamento estabelecidos para o tratamento de distúrbios linfoprolifera- tivos malignos incluem CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona e procarbazina), CHOP (ciclofosfamida,doxorrubicina, vincristina, e prednisona),COP

[00220] (ciclofosfamida, vincristina, e prednisona), CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, e prednisona), m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, e leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposideo, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona, e procarbazina), ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposideo, leucovorina, citarabina, bleomicina, e vincristina), MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona em dose fixada, bleomicina e leucovorina), MOPP (mecloe- tamina, vincristina, prednisona, e procarbazina), ABVD (Adriamici- na®/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina, e dacarbazina), MOPP alternando com ABV (Adriamicina®/doxorrubicina, bleomicina, e vinblastina) e MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona, e procarbazina) alternando com ABVD (Adriamicina®/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina) e ChlVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona). A terapia pode compreender uma fase de terapia de indução, uma fase de terapia de consolidação e terapia de fase de manutenção. CMC-544 pode da mesma forma ser administrado sozinho, concomitantemente ou seqüencialmente com quaisquer dos regimes de terapia identificados como uma parte da fase de terapia de indução, uma fase de terapia de consolidação e uma fase de terapia de manutenção.

[00221] Os conjugados da presente invenção podem da mesma forma ser administrados juntos com outros agentes de bioativos ou quimioterapêuticos como uma parte do regime de quimioterapia de combinação para o tratamento de linfomas agressivos recaídos. Um tal regime de tratamento inclui IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, e eto- posídeo), MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, e etoposídeo), DHAP (dexametasona, citaribina em dose elevada e cisplatina), ESHAP (etoposídeo, metilpredisolona, citarabina em dose elevada e cisplatina), EPOCH (etoposídeo, vincristina, e doxorrubicina durante 96 horas com doses de bolo de ciclofosfamida e prednisona oral), CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona, e bleomicina), CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina, e prednisona), CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina e prednisona), CHOP-B. (ciclo-fosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona e Bleomicina), CEPP- B (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina e bleomicina) e P/DOCE (epirrubicina ou doxorrubicina, vincristina, ciclofosfamida e predniso- na). Os regimes de tratamento adicionais para linfomas agressivos podem incluir na fase 1 uma primeira linha de tratamento com CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisona)-rituximab (Ritu- xan®)-CMC-544, seguido na fase 2 e fase 3 com CHOP-rituximab (Rituxan®), CHOP-CMC-544 ou CHOP-rituximab (Rituxan®)-CMC-544. Alternativamente, a fase 1 pode ter uma primeira linha de tratamento com COP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona)-rituximab (Ritu- xan®)-CMC-544, seguido na fase 2 e fase 3 com COP-rituximab (Rituxan®), COP-CMC-544 ou COP-rituximab (Rituxan®)-CMC-544. Em uma outra modalidade, o tratamento de linfomas agressivos pode incluir uma primeira ou segunda linha de tratamento com o CMC-544 de conjugado de droga de anticorpo na fase 1, seguido nas fases 2 e 3 com CMC-544 e CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona), CMC-544 e COP (ciclofosfamida, vincristina, e prednisona), CMC-544 com rituximab (Rituxan®) ou rituximab (Rituxan®) sozinho. Em ainda outra modalidade o tratamento de linfomas agressivos pode incluir uma linha de tratamento com o CMC-544 de conjugado de droga de anticorpo seguido nas fases 2 e 3 com CMC-544 sozinho ou em combinação com outros regimes de tratamento incluindo, porém não limitados a, ESHOP (etoposídeo, metilpredisolona, citarabina, em dose elevada, vincristina e cisplatina), EPOCH

[00222] (etoposídeo, vincristina, e doxorrubicina durante 96 horas com doses de bolo de ciclofosfamida e prednisona oral), IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato e etoposídeo), ASHAP (Adriamicina®, solu- medrol, Ara-C, e cisplatina), MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato e etoposídeo) e ICE (ifosfamida, ciclofosfamida, e etoposídeo). Os detalhes de várias drogas citotóxicas usadas na quimioterapia de malignidades incluindo regimes quimioterapêuticos de combinação, dosagens etc., que são fornecidos neste pedido podem ser constatados em Cancer Principles e Practice of Oncology, Eds. Vincent T. DeVita, Sa- muelo Hellman, Steven A. Rosenberg, 6a. Edição, Editores: Lippincott, Williams e Wilkins (2001) e Phisician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, Eds. Edward Chu e Vincent T. DeVita, Editores: Jones e Bartlett, (2002).

[00223] A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratar indivíduos humanos ou animais sofrendo de ou em risco de um distúrbio proliferativo caracterizado por células expressando CD22, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de CMC-544 da presente invenção.

[00224] A presente invenção é também descrita abaixo em exemplos de trabalho específico que são pretendidos para também descrever a invenção sem limitar seu escopo.

EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE ANTICORPOS CANDIDATOS

[00225] Um painel de anticorpos contra CD22 foi selecionado de hibridomas empregando-se os seguintes critérios de seleção; ligação às células de Daudi, internalização em células de Daubi, ligação às células mononucleares de sangue periférico (PBMC), internalização em PBMC, afinidade (maior do que 10'9M), taxa de produção e y1 de camundongo. 5/44 foi selecionado como o anticorpo preferido.

CLONAGEM DE GENE E EXPRESSÃO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO DE 5/44 QUIMÉRICO

[00226] Preparação de Células de Hibridoma de 5/44 e Preparação de RNA Destas

[00227] Hibridoma 5/44 foi gerado por tecnologia de hibridoma convencional seguindo imunização de camundongos com proteína de CD22 humana. O RNA foi preparado a partir de células de hibridoma 5/44 empregando-se um kit RNEasy (Qiagen, Crawley, UK; Catálogo No. 74106). O RNA obtido foi transcrito reverso ao cDNA, como abaixo descrito. b) Distribuição de CD22 em Tumores de NHL

[00228] Um estudo imunohistoquímico foi empreendido para examinar a incidência e distribuição de manchamento usando os anticorpos monoclonais anti-CD22 5/44. Anticorpos anti-CD79a e anti-CD20 de controle foram incluídos no estudo para confirmar as áreas de célula B de tumores.

[00229] Um total de 50 tumores foram estudados e estes foram categorizados como segue usando-se a Formulação de Funcionamento e sistemas de classificação REAL: 7 B leucemia linfoblástica/linfoma (Alto/I) 4 B-CLL/linfoma linfocítico pequeno (Baixo/A) 3 linfoplasmacitóide/lmunocitoma (Baixo/A) 1 célula de manto (Int/F) 14 linfomas de centro de Folículo (Baixo a Int/D) 13 linfomas de célula grandes difusos (Int a Alto/G.H 6 Não-classificáveis (K) 2 linfomas de célula T

[00230] Quarenta linfomas de célula B foram positivos para antígeno CD22 com o anticorpo 5/44 em 0,1 pg/ml e mais seis tornaram positivos quando a concentração foi aumentada para 0,5 pg/rnl. Para os restantes dois tumores de célula B que foram negativos em 0,1 pg/ml, houve tecido insuficiente sobrando para testar na concentração mais alta. Entretanto, o teste paralelo com outro anticorpo anti-CD22 designado 6/13 (Celltech, Slough, UK), que produziu manchamento mais forte do que 5/44, resultou em todos 48 linfomas de célula B de manchamento positivo para CD22.

[00231] Desse modo, é possível concluir que o antígeno CD22 é amplamente expresso em linfomas de célula B e portanto fornece um alvo adequado para imunoterapia em NHL.

c) Clonagem de PCR de 5/44 VH e VL

[00232] sequências de cDNA codificando para os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas de 5/44 foram sintetizadas usando transcriptase reversa para produzir cópias de cDNA de filamento único do mRNA presente no RNA total. Isto foi então usado como o padrão para amplificação das sequências de região V de murino usando iniciadores de oligonucleotídeo específicos pela Reação em Cadeia de Po- limerase (PCR).

síntese de cDNA

[00233] O cDNA foi sintetizado em um volume de reação de 20 pl contendo os seguintes reagentes: 50 mM de Tris-HCI pH 8,3, 75 mM de KCI, 10 mM de ditiotreitol, 3 mM de MgCh, 0,5 mM de dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 20 unidades RNAsin, 75 ng de iniciador de hexanucleo- tídeo aleatório, 2 pg de RNA 5/44 e 200 unidades de transcriptase reversa de Vírus da Leucemia de Murino Moloney. Após a incubação a 42°C durante 60 minutos, a reação foi terminada aquecendo-se a 95°C durante 5 minutos.

ii) PCR

[00234] Alíquotas do cDNA foram submetidas a PCR empregando- se combinações de iniciadores específicos para as cadeias pesada e leve. Os lagos de iniciador degenerados designados para anelar com as sequências conservadas do peptídeo sinal foram empregados como iniciadores dianteiros. Estas sequências todas contêm, em ordem, um sítio de restrição (VLSful; VH Hindlll) iniciando de 7 nucleotídeos de suas extremidades 5', a sequência GCCGCCACC (SEQ ID N°: 50), para permitir translação ideal dos mRNAs resultantes, um códon de iniciação e 20-30 nucleotídeos com base nas sequências de peptídeo líder de anticorpos de camundongo conhecidos (Kabat et al, (supra)).

[00235] Os iniciadores 3' são designados para unir a junção J-C da estrutura 4 do anticorpo e contêm um sítio de restrição para a enzima BsiWI para facilitar a clonagem do fragmento de PCR VL. OSiniciadores 3' de cadeia pesada são uma mistura designada para unir a junção J-C do anticorpo. O iniciador 3' inclui um sítio de restrição Apal para facilitar a clonagem. A região 3' dos iniciadores contém uma sequência mista com base naquelas encontradas em anticorpos de camundongo conhecido (Kabat e outros, 1991, supra).

[00236] As combinações de iniciadores acima descritas possibilitam os produtos de PCR para VH e VL a serem clonados diretamente em um vetor de expressão apropriado (veja abaixo) para produzir cadeias pesadas e leves quiméricas (camundongo-humano) e para estes genes a serem expressos em células mamíferas para produzir anticorpos quiméricos do isótipo desejado.

[00237] Incubações (100 pJ) para o PCR foram estabelecidas como segue. Cada reação continha 10 mM de Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM de MgCh, 50 mM de KCI, 0,01% peso/volume de gelatina, 0,25 mM de dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 10 pmoles de mistura de iniciador 5', 10 pmoles de iniciador 3', 1 pl de cDNA e 1 unidade de Taq polimerase. As reações foram incubadas a 95°C durante 5 minutos e em seguida ciclizadas em 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, alíquotas de cada reação foram analisadas por eletroforese sobre um gel de agarose.

[00238] Para a região V de cadeia pesada, um produto de DNA amplificado foi apenas obtido quando um lago de iniciador anelando dentro do início de estrutura I substituiu o lago de iniciador de peptídeo sinal. Os fragmentos foram clonados em vetores de seqüenciamento de DNA. A sequência de DNA foi determinada e transladada para fornecer uma sequência de aminoácido deduzida. Esta sequência deduzida foi verificada por referência à sequência de proteína de terminal N determinada experimentalmente. A Figura 1 mostra a sequência de aminoácido das CDRs do anticorpo 5/44 monoclonal de camundongo. As Figuras 2 e 3 mostram a sequência de proteína/DNA das regiões V de cadeia pesada e leve maduras de 5/44 monoclonal de camundongo, respectivamente.

iii) Clonagem dos Fragmentos de PCR.

[00239] As sequências de região V de murino foram então clonadas nos vetores de expressão pMRR10.1 e pMRR14 (Figuras 7 e 8). Estes são vetores para a expressão de cadeia leve e pesada contendo regiões constantes codificando DNA de cadeia leve kapa humana e cadeia pesada gama-4 humana. A região VL foi subclonada no vetor de ex-pressão por digestão de restrição e ligação do vetor de seqüenciamen- to, empregando-se os sítios de restrição Sful e BsiWI, criando o plas- mídeo pMRR10(544cL) (Figura 8). O DNA de cadeia pesada foi amplificado por PCR empregando-se um iniciador 5' para introduzir um pep- tídeo sinal, uma vez que este não foi obtido na estratégia de clonagem - um anticorpo líder de cadeia pesada de camundongo de um hibrido- ma alojado diferente (denominado 162) foi empregado. O iniciador 5' teve a seguinte sequência: 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGT GTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCT CGTCGAGTCTGG3' (SEQ ID NO:51).

[00240] O iniciador reverso foi idêntico àquele empregado na clonagem de gene VH original. O produto de PCR resultante foi digerido com enzimas Hindlll e Apal, foi subclonado, e sua sequência de DNA foi confirmada, criando o plasmídeo pMRR14(544cH) (Figura 7). A co- transfecção transitória de ambos os vetores de expressão em células CHO geraram o anticorpo c5/44 quimérico. Isto foi obtido empregando- se o reagente de Lipofectamina de acordo com os protocolos do fabricante (lnVitrogen:Life Technology, Groningen, The Netherlands. Catálogo n° 11668-027).

IL REMOÇÃO DE SÍTIO DE GLICOSILAÇÃO E LISINA REATIVA.

[00241] Uma sequência de sítio de glicosilação ligada por N potencial foi observada em CDR-H2 tendo a sequência de aminoácido N-Y- T (Figura 3). SDS-PAGE, western blotting e manchamento de carboidrato de géis de 5/44 e seus fragmentos (incluindo Fab) indicaram que este sítio foi realmente glicosilado (não-mostrado). Além disso, um resíduo de lisina foi observado em uma posição exposta dentro da CDR- H2, que teve o potencial para reduzir a afinidade de ligação do anticorpo fornecendo um sítio adicional para conjugação com um agente com o qual o anticorpo pode ser conjugado.

[00242] Uma estratégia de PCR foi empregada para introduzir substituições de aminoácido na sequência de CDR-H2 em uma tentativa de remover o sítio de glicosilação e/ou a lisina reativa, como mostrado na Figura 4 (SEQ ID NOS: 9-12 e 14). Os iniciadores dianteiros codificando as mutações N55Q, T57A ou T57V foram empregados para remover o sítio de glicosilação (Figura 4, SEQ ID NOS: 10-12) e um quarto iniciador dianteiro contendo a substituição K60R, foi gerado para remover o resíduo de lisina reativo (Figura 4, SEQ ID NO: 14). Um iniciador reverso de estrutura 4 foi empregado em cada destas amplificações de PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas Xbal e Apal e foram inseridos no pMRR14(544cH) (também clivados com Xbal e Apal) para gerar plasmídeos de expressão codificando estes mutantes. As mutações N55Q, T57A e T57V amputam o sítio de glicosilação alterando a sequência de aminoácido distante do consenso N-X-T/S enquanto que a mutação de K60R substitui a lisina potencialmente reativa com a arginina de resíduo similarmente carregado positivamente. Os plasmídeos de variante cH resultantes foram co- transfectados com o plasmídeo cL para gerar variantes de anticorpo quimérico expressas.

HL AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES DE GENES QUIMÉRICOS,

[00243] As atividades dos genes quiméricos foram avaliadas seguindo transfecção transitória em células CHO e determinação de constantes de afinidade por Análise BiaCore™.

[00244] As afinidades de 5/44 quimérico ou suas variantes, que têm tido seus sítios de glicosilação ou suas lisinas reativas removidas, foram investigadas empregando-se a tecnologia BI A para ligação à construções CD22-mFc. Os resultados são mostrados na Figura 9. Todas as medições de ligação foram realizadas no instrumento BIAco- re™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia). O ensaio foi realizado por captura de CD22mFc por meio da Fc anticamundongo imobilizado. O anticorpo estava na fase solúvel. Amostras, padrão, e controles (50 pl) foram injetadas sobre Fc anticamundongo imobilizado seguido por anticorpo na fase solúvel. Após cada ciclo, a superfície foi regenerada com 50 pl de 40 mM de HCI a 30 pl/min. A análise cinética foi realizada empregando-se o software BIAevaluation 3.1 (Pharmacia).

[00245] A remoção do sítio de glicosilação na construção T57A resultou em uma "on-rate" ligeiramente mais rápida e uma "off-rate" sig- nificantemente mais lenta comparado com o 5/44 quimérico, fornecendo um desenvolvimento de afinidade de aproximadamente 5 vezes. A mutação N55Q não teve nenhum efeito sobre a afinidade. Este resultado foi inesperado quando ele sugere que a remoção do próprio carboidrato aparentemente não teve nenhum efeito sobre a ligação (como com a alteração de N55Q). A afinidade melhorada foi observada apenas com a alteração de T57A. Uma explanação possível é que, independente da presença de carboidrato, a treonina na posição 57 exerce um efeito negativo sobre a ligação que é removida em conversão de treonina a alanina. A hipótese de que o tamanho pequeno de alanina é importante, e que o efeito negativo de treonina seja relacionado com seu tamanho, é sustentada do resultado obtido empregando-se a mutação T57V: cuja substituição com valina na posição 57 não é benéfica (resultados não-mostrados).

[00246] A remoção do resíduo de lisina pela mutação de K60R teve um efeito neutro sobre a afinidade, isto é, a introdução do resíduo de arginina remove um sítio reativo potencial sem comprometer a afinidade.

[00247] As mutações para remoção do sítio de glicosilação e para remoção da lisina reativa foram portanto ambas incluídas no projeto de humanização.

EXEMPLO 2 ENXERTO DE CDR DE 5/44

[00248] A clonagem molecular de genes para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 5/44 e seu emprego para produzir anticorpos 5/44 quiméricos (camundongo/humano) foram descritos acima. As sequências de nucleotídeo e aminoácido dos domínios VL e VH 5/44 de camundondo são mostradas nas Figuras 2 e 3 (SEQ ID NOS: 7 e 8), respectivamente. Este exemplo descreve o enxerto de CDR do anticorpo 5/44 sobre as estruturas humanas para reduzir a imunogenicidade potencial em seres humanos, de acordo com o método de Adair e outros, (Publicação PCT N° WO 91/09967).

ENXERTO DE CDR DE CADEIA LEVE DE 5/44.

[00249] O alinhamento de sequência de proteína com sequências de consenso de região V de cadeia leve kapa de subgrupo I indicou 64% de identidade de sequência. Conseqüentemente, para construir a cadeia leve enxertada por CDR, as regiões de estrutura aceptoras escolhidas corresponderam àquelas da sequência DPK9, linha germina-tiva 012, subgrupo I, VK humana. A sequência aceptora de estrutura 4 foi derivada da sequência JK1 (SEQ ID NO: 18) da linha germinativa de região J humana.

[00250] Uma comparação das sequências de aminoácido das regiões de estrutura de 5/44 de murinho (SEQ ID NO: 7) e a sequência aceptora (SEQ ID NO: 17) é fornecida na Figura 5 e mostra que existem 27 diferenças entre as cadeias doadoras e aceptoras. Em cada posição, uma análise foi feita do potencial do resíduo de murino para contribuir com a ligação de antígeno, ou diretamente ou indiretamente, através dos efeitos sobre empacotamento ou na interface VH /VL. Se um resíduo de murino foi considerado importante e suficientemente diferente do resíduo humano em termos de tamanho, polaridade ou carga, então aquele resíduo de murino foi retido. Com base nesta análise, duas versões das cadeia leve enxertada com CDR, tendo as sequências dadas na SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20 (Figura 5), foram construídas.

II. ENXERTO DE CDR DE CADEIA PESADA DE 5/44.

[00251] O enxerto de CDR da cadeia pesada de 5/44 foi realizado empregando-se a mesma estratégia como descrito para a cadeia leve. O domínio V da cadeia pesada de 5/44 foi descoberto ser homólogo às cadeias pesadas humanas pertencendo ao subgrupo I (70% de identidade de sequência) e portanto a sequência da estrutura VH1-3 da linha germinativa de subgrupo I humana, DP7, foi empregada como uma estrutura aceptora. As sequências aceptoras de estrutura 4 foram derivadas da sequência JH4 da linha germinativa de região J humana (SEQ ID NO: 22).

[00252] Uma comparação da cadeia pesada de 5/44 com as regiões de estrutura é mostrada na Figura 6, onde pode ser observado que a cadeia pesada de 5/44 (SEQ ID NO: 8) difere da sequência aceptora em 22 posições (SEQ ID NO: 21). A análise da contribuição que quaisquer destas pode dar à ligação de antígeno induziu a 5 versões das cadeias pesadas enxertadas por CDR sendo construídas, tendo as sequências dadas em SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e SEQ ID N°: 27 (Figura 6).

III. CONSTRUÇÃO DE GENES PARA SEQUÊNCIAS ENXERTADAS

[00253] Os genes foram projetados para codificar as sequências enxertadas gH1 e gL1, e uma série de oligonucleotídeos em sobreposições foi projetada e construída (Figura 10, SEQ ID NOS: 32-47). Uma técnica de montagem de PCR foi empregada para construir os genes de região V enxertados por CDR. Os volumes de reação de 100 pl foram estabelecidos contendo 10 mM de Tris-HCI pH8,3, 1,5 mM de MgCI2, 50 mM de KCI, 0,001% de gelatina, 0,25 mM de dATP, dTTP, dCTP, e dGTP, 1 pmol cada dos iniciadores ‘internos’ (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmoles cada dos iniciadores ‘externos’ (F1, R1), e 1 unidade de Taq polimerase (AmpliTaq, Applied BioSystems, catalogo no. N808-0171). Os parâmetros de ciclo de PCR foram 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, para 30 ci-clos. Os produtos de reação foram então deixados em um gel de agarose a 15% , cortados e recuperados usando colunas de rotação QIAGEN {kit de extração de gel QIAquick®, catálogo n° 28706). O DNA foi eluído em um volume de 30 pL. As alíquotas (1 pl) do DNA gH1 e gl_1 foram então clonadas no vetor de clonagem InVitrogen TOPO® TA pCR2.1 TOPO® (catálogo n° K4500-01) de acordo com as instruções do fabricante. Este vetor de não-expressão serviu como um intermediário de clonagem para facilitar o seqüenciamento de um grande número de clones. O seqüenciamento de DNA usando os iniciadores espe-cíficos de vetor foi usado para identificar os clones corretos contendo gH1 e gl_1, plasmídeos de criação pCR2.1 (544gH1) e pCR2.1 (544gL1) (Figuras 11 e 12).

[00254] Um método de substituição de cassete de oligonucleotídeo (SEQ ID NOS: 56-65) foi usado para criar os enxertos humanizados gH4, 5, 6 e 7, e gl_2. Figura 13 mostra o projeto dos cassetes de oligonucleotídeo. Para construir cada variante, o vetor pCR2.1(544gH1) ou pCR2.1(544gL1)) foi cortado com as enzimas de restrição mostradas (Xmal/Sacll para a cadeia pesada, Xmal/BstEII para a cadeia leve). O fragmento de vetor grande foi purificado com gel de agarose e foi usado em ligação com o cassete de oligonucleotídeo. Estes cassetes são compostos de 2 oligonucleotídeos complementares (mostrados na Figura 13, SEQ ID NOS: 56-65), misturados em uma concentração de 0,5 pmol/pl em um volume de 200 pl de 12,5 mM de Tris-HCI pH 7,5, 2,5 mM de MgCh, 25 mM de NaCI, 0,25 mM de ditioeritritol. O enriquecimento foi obtido aquecendo-se a 95°C durante 3 minutos em um ba-nho de água (500 mL de volume) em seguida permitindo-se a reação resfriar lentamente em temperatura ambiente. O cassete de oligonucleotídeo recozido foi então diluído dez vezes em água antes da ligação no vetor apropriadamente cortado. O seqüenciamento de DNA foi usado para confirmar a sequência correta, plasmídeos de criação pCR2.1 (5/44-gH4-7) e pCR2.1 (5/44-gL2). As sequências enxertadas verificadas foram então subclonadas nos vetores de expressão pMRR14 (cadeia pesada) e pMR10.1 (cadeia leve).

IV. ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE CD22 DE SEQUÊNCIAS ENXERTADAS POR CDR

[00255] Os vetores codificando variantes enxertadas foram co- transfectadas em células CHO em uma variedade de combinações, juntamente com as cadeias de anticorpo quimérico original. A atividade de ligação foi comparada em um ensaio de competição, competindo a ligação do anticorpo 5/44 de camundongo original para ligar em células Ramos (obtidas de ATCC, uma linhagem de célula humana de lin- foblasto de linfoma de Burkitt expressando CD22 de superfície). Este ensaio foi considerado a melhor maneira de comparar os enxertos em sua capacidade de ligar em CD22 de superfície de célula. Os resultados são mostrados nas Figuras 14 e 15. Como pode ser visto, existe muito pouca diferença entre quaisquer dos enxertos, todos realizados mais eficazmente do que os quiméricos contra a origem de murino. A introdução dos 3 resíduos humanos adicionais na extremidade de CDR-H2 (gH6 e gH7) não mostraram ter ligação afetada.

[00256] A combinação de enxerto com o número menor de resíduos de murino gL1gH7 foi selecionada. O enxerto de cadeia leve gl_1 tem seis resíduos doadores. Os resíduos V2, V4, L37 e Q45 são resíduos de empacotamento potencialmente importantes. Os resíduos H38 estão na interface VH/VL. O resíduo D60 é um resíduo de superfície intimamente ligado a CDR-L2 e pode diretamente contribuir para ligação de antígeno. Destes resíduos, V2, L37, Q45 e D60 são encontrados em sequências de linha germinal de genes kapa humano de outros subgrupos. O enxerto de cadeia pesada gH7 tem 4 resíduos de estrutura doadores (Resíduo R28 é considerado ser parte de CDR-H1 sob a definição estrutural usada em enxerto de CDR (observe Adair e outro (1991), Publicação PCT No. WO 91/09967)). Os resíduos E1 e A71 são resíduos de superfície intimamente ligados às CDRs. O resíduo I48 é um resíduo de empacotamento potencial. O resíduo T93 está presente na interface VH/VL. Destes resíduos, E1 e A71 são encontrados em outros genes de linha germinal de subgrupo I humano. O resíduo I48 é encontrado no subgrupo 4 de linha germinal humano, e T73 é encontrado em subgrupo-3 de linha germinal humano.

[00257] O DNA completo e sequência de proteína de ambas, a cadeia leve e cadeia pesada, incluindo posição aproximada de introns dentro dos genes de região constante fornecidos pelos vetores, são mostrados na Figura 16 e são dados em SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 28, respectivamente, para a cadeia leve e SEQ ID N°: 31 e SEQ ID N°: 30, respectivamente, para a cadeia pesada.

[00258] DNA codificando estes genes de cadeia pesada e leve foi cortado destes vetores. DNA de cadeia pesada foi digerido no sítio 5’ Hindlll, em seguida foi tratado com o fragmento Klenow de DNA poli- merase de E. coli I para criar uma extremidade embotada 5’. A divagem no sítio 3’ EcoRI resultou no fragmento de cadeia pesada, que foi purificada, de géis de agarose. Da mesma maneira, um fragmento de cadeia leve foi produzido, embotado no sítio 5’ Sful e com um sítio 3’ EcoRI. Ambos os fragmentos foram clonados em vetores de expressão baseados em DHFR e usados para gerar linhagens de células estáveis em célula CHO.

EXEMPLO 3 CONJUGAÇÃO DE CALIQUEAMICINA DE NAc-GAMMA DMH ACBUT PARA ANTICORPO ANTI-CD22 HUMANIZADO (G5/44)

[00259] Em uma reação de conjugação típica, o anticorpo anti- CD22 (G5/44) foi conjugado à caliqueamicina de NAc-gamma DMH AcBut Osu (derivado de caliqueamicina) (observe Figura 17), onde a concentração de proteína alvo foi 7,5 mg/mL e o derivado de caliqueamicina foi 8,5 por cento em peso da proteína. O pH da reação alvo foi 8,5 + 0,2, e as concentrações alvo dos outros componentes de reação foram como segue: 50 mM de N-(2-Hidroxietil)piperazina-N’-(4-ácido butanossulfônico) (HEPBS), 37,5 mM de decanoato de sódio, e 9% v/v de etanol total. A reação foi conduzida em 33°+ 2°C durante uma hora. Os resultados da análise desta reação típica antes da purificação foram como segue: Proteína: 7,34 mg/mL; Carga de Caliqueamicina: 82,7 pg/mL; Agregado: 93,25%; e Proteína Não-conjugada (LCF): 1,07% (% da área de UV por HPLC).

[00260] O efeito de vários aditivos tensoativos e suas concentrações sobre o rendimento do produto e pureza foi testado para determinar seu efeito na produção de monômero conjugado (observe Tabela 2). As reações foram conduzidas onde tudo foi mantido constante exceto para o aditivo e sua concentração. Os conjugados produzidos destas reações foram analisados quanto à concentração da proteína, a carga de caliqueamicina, teor de agregado, e LCF. Embora todos os ácidos n-carboxílicos na faixa de Ce (hexanoato) a C12 (dodecanoato) produzam resultados aceitáveis, os melhores resultados totais (LCF baixo, agregado baixo, e recuperação alta de conjugada de monoméri- co) foram obtidos com decanoato em uma faixa de concentração de 30 mM a 50 mM. TABELA 2: EFEITO DE IDENTIDADE DE ADITIVO E CONCENTRAÇÃO EM RESULTADOS DE CONJUGAÇÃO

EXEMPLO4 PROCESSO DE PURIFICACAO CROMATOGRAFICO PROCESSOS DE SEPARACAO CROMATOGRAFICOS

[00261] Embora 0 Fluxo Rapido de Sefarose™ 4 de Butila fosse identificado como os melhores meios de HIC, os resultados aceitaveis podem ser obtidos com alteragoes leves nas condigoes cromatografi-cas usando outras resinas tal como Octil Sefarose™ Fluxo Rapido, PPG-600C (Tosoh Biosep), Fractogel® EMD Propila (EM Processing) e Fonte 15ISO (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

[00262] O material de partida para a purificagao foi uma mistura de reagao de conjugagao contendo 7,2 mg/mL de proteina em um derivado de caliqueamicina de 83 pg/mg, com um teor de agregado de 10,1% (percentual da area por HPLC), e um teor de LCF de 5,6% (percentual da area por HPLC).

[00263] Depois da reagao da conjugagao ter sido concluida, a mis-tura de reagao foi diluida quatro vezes pela adigao de solugao de fos-fato de potassio em uma concentragao de fosfato final de 0,7 M (pH 8,2). Depois de misturar, esta solugao foi filtrada atraves de filtros de 0,45 micron. A solugao diluida foi carregada em uma coluna Butil Sefarose™ 4 Fluxo Rapido. A quantidade total de proteina carregada em uma coluna foi 29 mg por ml de volume de leito. Depois de uma lava-gem com 0,7 M de fosfato de potassio, a coluna foi eluida usando um gradiente de etapa de 0,7 M a 4 mM de fosfato de potassio, pH 8,2. As fragoes eluidas no gradiente de etapa foram reunidas para outro pro-cessamento, com o lago consistindo em conjugado monomerico com menos do que 1 percentual de area de cada dentre o agregado e LCF. Este lago foi carregado em uma coluna de dessalinificagao Sefadex® G-25 (Amersham Biosciences) para permutagao em um tampao apro-priado para formulagao, consistindo em 20 mM de Tris-CI e 10 mM de cloreto de sodio em pH 8,0. A preparagao de CMC-544 permutado por tampao, purificado teve as seguintes propriedades: Carga de Caliqueamicina: 81 |jg/nnL; Agregado: 0,4%; (% da area por HPLC) LCF: 0,8% (percentual da area por HPLC).

EXEMPLO5 anAlise DE LIGACAO DE IMUNOCONJUGADO DE CALIQUEAMICINA DE NAc-GAMMA DMH ACBUT - G5/44 (CMC-544)

[00264] Imunoconjugado de anticorpo anti-CD22 humanizado (G5/44) com caliqueamicina (CMC-544) gerado pelo processo de conjugagao acima foi analisado em um estudo de ligagao para determinar se o conjugado gerado usando o processo melhorado teve qualquer efeito adverso sobre a ligagao de antigeno. A Tabela 3 mostra que o procedimento de conjugagao nao teve qualquer impacto sobre a afini-dade de ligagao de antigeno do anticorpo. Imunoconjugado CMC-544 feito por procedimento de conjugagao novo ou antigo ligou o antigeno alvo com afinidades similares, que nao diferiram daquele do anticorpo nao-conjugado G5/44. TABELA 3: AFINIDADES DE LIGAQAO DE CMC-544 FEITAS USANDO-SE PROCEDIMENTOS DE CONJUGAQAO DE CMA-676 E CMC-544

[00266] Análises de biossensores foram realizadas usando um Bia- core™ 2000 (Biacore™ AB, Uppsala, Suécia). CD22mFc foi covalen- temente imobilizado sobre o chip de biossensor revestido com dextra- na de carboximetila ativado com hidroxissuccinimida (CM5) usando uma química de acoplamento de amina padrão em uma densidade de proteína de aproximadamente 2000 unidades de ressonância. Amostras de CMC-544 ou G5/44 foram diluídas no tampão de HBS (10 mM de HEPES, pH 7,4, contendo 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA e 0,005% de polissorbato 20 (v/v)) e injetadas na faixa de concentração de 1 a 100 nM sobre a superfície de chip de biossensor revestida com CD22mFc em uma taxa de fluxo de 30 pL/minutos durante 3 minutos para permitir a ligação. Depois da fase de ligação, a dissociação do anticorpo ligado foi monitorada lavando-se o chip com o tampão de HBS durante um período de 15 minutos. A superfície antigênica foi regenerada lavando-se o chip Biossensor com 15 pL do tampão de re-generação (10 mM de NaOH e 200 mM de NaCI) durante 30 segundos, seguido por um tempo de estabilização de 2 minutos antes do próximo ciclo. As constantes cinéticas foram calculadas por análise de regressão de quadrado menor não-linear usando um modelo apropriado de curva de ligação Langmuir 1:1 e programa BIAevaluation (versão 3,0, BIAcore). A ligação de antígeno de CMC-544 foi avaliada por análise de ressonância de plasmônio de superfície empregando-se CD22mFc covalentemente imobilizado em um chip de biossensor. Os resultados de análise cinética da ligação de CMC-544 e G5/44 para CD22mFc mostra que, depois que os dados foram ajustados globalmente em um modelo de ligação Langmuir 1:1 com compensação para transferência de massa, ambos CMC-544 e G544 não-conjugados ligaram-se ao CD22 com uma afinidade similar (CMC-544:CD22 KD = 200 pM; G5/44:CD22 KD = 235 pM). A conjugação à caliqueamicina não impactou a capacidade de G5/44 para eficazmente ligar-se à CD22mFc.

[00267] A ligação de CMC-544 e G5/44 em CD22 expressa na superfície de células de linfoma B foi também examinada por citometria de fluxo. Gentuzumab Anti-CD33 mAb (hP67.6) e seu conjugado de caliqueamicina CMA-676 (ozogamicina de gentuzumab) foram usados como os controles comparados com isótipo nesta avaliação. Rituximab (Rituxan®), um mAb de CD20 anti-humano de lgG1 humano quimérico, foi usado como um controle positivo. lgG1 e lgG4 policlonais humanos purificados foram também usados como controles negativos. A ligação de CMC-544 e G5/44 em CD22 em Ramos ou RL BCL foi similar e distinguível daquele de lgG4 policlonal humano. RL BCL mostrou a expressão de superfície mais baixa de CD22 do que Ramos BCL. Ao contrário, a ligação de CMA-676 ou gL1gH7 em cada BCL foi similar aquela de lgG4 policlonal humano consistente com sua necessidade de expressão de CD33 (dados não-mostrados). As mesmas células demonstraram ligação forte de rituximab anti-CD20 (Rituxan®). Ao contrário de hP67.6 e CMA-676, nem CMC-544 nem G5/44 demonstraram qualquer ligação em células de leucemia CD22’ CD33+ HL-60 (dados não-mostrados). Estes resultados sugerem que a conjugação de G5/44 em caliqueamicina não afetou sua especificidade de antígeno. CMC-544 especificamente não reconhece CD22 em células B humanas, porém não em células B de murino, rato, canino, suíno ou primata (cynomolgus e rhesus) (dados não-mostrados).

EXEMPLO 6 ANÁLISE DE EFEITOS IN VITRO E IN VIVO DE CMC-544 CITOXICI- DADE IN VITRO

[00268] O efeito de CMC-544 feito usaπdo-se processos de CMA- 676 e CMC-544 no crescimento in vitro de linhagens de célula de linfoma de Célula B de CD22+, RL, Daudi, Raji e Ramos, foi ∞mparado. O conjugado de caliqueamicina comparado ao isótipo alvejado em CD33 humana (CMA-676 foi usado para refletir efeitos não-específicos de antígeno do conjugado. O uso de DMH de caliqueamicina de N-Ac gamma não-conjugada (a droga liberada do conjugado na hidrólise de ácido) nesta avaliação indicou que cada destas linhagens de célula foi sensível aos efeitos letais de caliqueamicina. Tabela 4 mostra os resultados destas avaliações baseadas na equivalência de caliqueamicina e Tabela 5 mostra estes resultados expressos como as concentrações de proteína de anticorpo conjugado. A liberação mediada por CD22 de caliqueamicina para as células CD22+ foi pelo menos 10 vezes mais eficiente exterminando-se as células alvo do que a droga de não- conjugado sozinha. O conjugado de controle comparado ao isótipo (CMA-676) mostrou a citoxicidade que foi menor do que ou similar ao derivado de caliqueamicina não-conjugada. É evidente a partir da Tabela 4 que o conjugado feito pelo processo de conjugação de CMC- 544 pode gerar efeito de citoxicidade equivalente em concentrações de anticorpo mais baixas do que o conjugado feito pelo processo de conjugação de CMA-676. TABELA 4: INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO POR CALIQUEAMICINA CONJUGADA. (leso Pm de Caliqueamicina)

*ND, não-determinado TABELA 5: INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO POR ANTICORPO CONJUGADO. (leso Mg/ML DE ANTICORPO)

*ND, não determinado

[00270] Citoxicidade In Vivo. CMC-544 feito pelo processo de CMC- 544 foi também avaliado em xenoenxertos de linfoma de célula B. Nestes estudos, dois tumores de linfoma de célula B, RAMOS e RL, foram usados. Linfoma de RL é uma linhagem de célula derivada de NHL de não-Burkitt enquanto RAMOS foi originalmente derivado de um linfoma de Burkitt. Em uma experiência representativa mostrada na Figura 18, CMC-544 e sua contra-parte de anticorpo de murino foram mostradas ser eficazes na inibição, de uma maneira dependente de dose, do crescimento de linfoma de célula B de RAMOS.

[00271] O conjugado do anticorpo humanizado foi mostrado ser mais potente do que sua contraparte de murino. Neste estudo, a dose mais baixa de conjugado de caliqueamicina capaz de causar inibição de crescimento significante de linfoma foi de 10 pg/kg de DMH de caliqueamicina de NAc-gama conjugada. Ao contrário, o anticorpo não- conjugado, G5/44, em 10 mg/Kg de intraperitoneal administrada em um horário similar como conjugados não teve efeito sobre o crescimento de tumor.

[00272] Estudos similares foram realizados usando o modelo de linfoma RL. Tabela 6 mostra a análise combinada de três experiências independentes em que os efeitos antitumor de CMC-544 foram avaliados em tumores de NHL RL representados em 300 - 400 mg no tamanho em camundongos nus. CMC-544 em uma maneira dependente de dose fez com que os tumores regredissem em uma estrutura de tempo de 3 semanas. A dose minimamente eficaz de CMC-544 no modelo de linfoma RL foi estabelecida a partir das análises estatísticas destes estudos a ser 20 pg/kg baseada no teor de caliqueamicina. Não existiram mortes em quaisquer destes três estudos. Dose mais altas (60 - 320 pg/kg) de CMC-544 causou quase a regressão completa de linfoma de RL. Tomados juntos, os resultados obtidos com os dois modelos de linfoma de célula B demonstraram claramente a capacidade de CMC-544 causar a regressão do tumor. TABELA 6: EFEITO ANTITUMOR DE CMC-544 CONTRA XENOEN- XERTOS DE NHL DE RL EM CAMUNDONGOS NÚS

[00274] A capacidade de CMC-feita pelo novo procedimento para inibir o crescimento de xenoenxertos de linfoma de célula B estabele cido grandes usando ambos os modelos de linfoma RL e RAMOS foi também testada. Os tumores foram permitidos crescerem e representados em 1,5 ou 2 g de massa de tumor depois que CMC-544 ou um conjugado (CMA-676) de controle negativo comparado ao isótipo foi administrado intraperitonealmente na dose de 160 pg/Kg de caliqueamicina conjugada mantendo o horário original de dosagens nos 1°, 5o e 9o dia. O mesmo horário de dosagem foi mostrado mais cedo para causar regressão duradoura longa de tumores representados pequenos (observe Tabela 6). Como mostrado na Figura 19, a administração de CMC-544 em camundongos carregando linfoma RAMOS grandes causou regressão gradual da massa de linfoma pré-existente e pelo 20° dia, 3 dos 4 camundongos carregando tumor estiveram livres de tumor. O monitoramento destes camundongos livres de tumor até o 50° dia não indicou qualquer recrescimento de linfoma RAMOS regredido. Ao contrário, um controle comparado ao isótipo, CMA-676, não teve efeito sobre o crescimento de tumor. Quatro dos cinco camundongos carregando tumor grande tratado com CMA-676 tiveram de ser sacrificados antes do 15° dia por causa de sua carga de tumor alcançada próximo a 15% de seu peso corporal.

[00275] Uma experiência similar usando CMC-544 foi realizada no modelo de linfoma RL. A administração intraperitoneal de CMC-544 em uma dose de 160 pg/kg em um horário similar como descrito antes causou >90% de regressão da massa pré-existente de linfomas RL dentro de 30 dias. Entretanto, pelo 45° dia, 2 camundongos neste grupo com linfomas shrunkenmostraram recrescimento dos tumores. Estes resultados indicaram que CMC-544 é capaz de causar a regressão de pequenos, bem como grandes, linfomas estabelecidos. Em um pequeno número de estudos não-mostrados aqui, linfomas RL que recresceram esporadicamente depois da regressão induzida por CMC- 544 inicial foram retratados com CMC-544 outra vez. Estes estudos mostraram que os tumores RL foram ainda responsáveis pelo segundo curso do tratamento com CMC-544 e regredidos outra vez. Desse modo, o tratamento com CMC-544 pode ser eficaz contra ambas as massas, pequenas e grandes de linfomas de célula B com o potencial para terapia de repetição.

II. COMPARAÇÃO IN VIVO DE CONJUGADO FEITO COM PROCESSOS DE CONJUGAÇÃO DE CMA-676 E CMC-544

[00276] A Figura 20 mostra os resultados de uma experiência representativa em que os camundongos carregando linfoma RL representados receberam duas doses diferentes (80 e 320 pg/kg de caliqueamicina conjugada) de CMC-544 feita usando o processo de con-jugação de CMA-676 e o processo de conjugação de CMC-544 usando o horário de dosagem padrão. A eficácia antitumor observada foi dependente de dose como esperado e não existiu diferença nas eficácias de cada dentre as duas preparações de CMC-544. Ao contrário, DMH de caliqueamicina de N Acetil-gama não-conjugada administrada intraperitonealmente em 160 pg/kg foi inativa. Entretanto, deve ser enfatizado que para cada dose de caliqueamicina conjugada, a quantidade de proteína de anticorpo administrada na forma de um conjugado foi quatro vezes mais alta para CMC-544 feita pelo processo de CMA- 676 versus aquela feita pelo processo de CMC-544. Uma vez que o teor de caliqueamicina do conjugado alvejado é primariamente responsável por causar o efeito antitumor, é possível liberar a quantidade requerida de caliqueamicina por meio do conjugado feito pelo novo procedimento usando quantidades muito menores do anticorpo alvejado. A carga aumentada do conjugado feita pelo processo de CMC-544 é, na verdade, devido à falta de quantidades significantes da fração conjugada baixa (LCF).

III. TRATAMENTO DE TUMORES RESISTENTES AO RITUXIMAB (RITUXAN®).

[00277] A seguinte questão a ser explorada foi se os linfomas de célula B desenvolvidos após a descontinuação do tratamento com o rituximab (Rituxan®), comercialmente disponível seriam todavia res- ponsivos ao tratamento com CMC-544. Para esta finalidade, linfomas RL em desenvolvimento (não-representado) foram tratados com rituximab (Rituxan®) durante três semanas. Enquanto a terapia de rituximab (Rituxan® foi continuada, o crescimento de linfoma RL foi inibido. Na cessação de terapia de rituximab (Rituxan®), linfomas RL cresceram rapidamente até o tamanho de ~ 1 g de massa, tempo durante o qual eles foram tratados com CMC-544 na dose intraperitoneal de 160 pg/Kg. Como mostrado nas Figuras 21 e 22, estes linfomas RL foram também responsíveis a CMC-544 com 80% de camundongos tornando-se livres de tumor por volta do dia 60. Desse modo, o CMC-544 é capaz de causar regressão de linfomas de célula B com três doses que poderiam ser inibidas apenas pela dosagem contínua de rituximab (Rituxan®).

EXEMPLO 7 EFEITO IN VITRO E IN VIVO DE CMC-544. ESTUDOS DE LIGAÇÃO E TOXICIDADE

[00278] CMC-544 foi avaliado quanto a sua ligação a CD22 e tam bém quanto a sua atividade em modelos in vitro e in vivo. O CMC-544 foi também comparado a CMA-676, um conjugado de controle comparado ao isótopo de hP67.6 (lgG4) com caliqueamicina ligada a AcBut, e ao rituximab (Rituxan®), um mAb anti-CD 20 de IgG quimérico, (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA.), que é comercialmente disponível e foi adquirido de Medworld Pharmacy (Chestnut ridge, NY). Os seguintes anticorpos foram empregados nos estudos de domínio de ligação G5/44: BU12 (Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 e To 15 ((Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13 e M5/44 (Celltech, Slough, UK). Anticorpos adicionais empregados nos estudos de bloqueio foram SJ10 (Immunotech, Fullerton, CA) e M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1 (Celltech, Slough, UK). As linhagens celulares para os estudos incluindo linhagem Ramos de célula de linfoma de Burkitt (CRL-1923) e a linhagem RL de célula de linfoma de não-Hodgkin (NHL) foram todas obtidas da Coleção de Cultura do Tipo Americano. As linhagens celulares foram determinadas serem livres de micoplasma por um ensaio de de-tecção de micoplasma de reação de cadeia de polimerase (ATCC, Manassas, VA). As linhagens celulares foram mantidas como culturas de suspensão em carreador RPMI mais 10% de FBS, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 0,2% de glicose, sódio de Penicilina G 100 U/ml, e sulfato de estreptomicina 100 ug/ml.

[00279] Se ou não G5/44 pode inibir a ligação de mAbs de murino de especificidade conhecida ao CD22 foi avaliado pela análise BIAcore empregando-se Fc-CD22 imobilizado em uma lasca CM5 BIAcore. As unidades de ressonância de plasmônio de superfície (RU) obtidas com e sem saturação anterior do Fc-CD22 imobilizado com G5/44 foram comparadas. A análise de interação biomolecular foi realizada empre- gando-se um BIACORE 2000. Os anticorpos foram passados sobre uma superfície de controle vazia ("flowcell1", serve como um controle, nenhuma proteína foi acoplada) e a superfície de teste de Fc-CD22 (flowcell2) imobilizada sobre uma lasca sensora de CM5 por meio de química de acoplamento de amina em um nível de 9,042 RU. O sen- sorgrama resultante foi a resposta (RU) sobre a flowcell2 menos a resposta (RU) sobre a flowcell1. Um segundo sensorgrama foi obtido primeiro saturando-se as flowcells com G5/44 (100 ug/ml) antes da introdução de mAbs de murino contra CD22 que foi previamente caracterizado quanto a sua ligação. Imediatamente após avaliado a resposta de G5/44, os mAbs anti-CD22 de murino foram individualmente perfundidos sem remover G544. A segunda resposta combinada gerada devido à ligação de mAb anti-CD22 de murino a CD22 revestido por G5/44 foi também registrada. Se o anticorpo de murino ligado a CD22 em sítios não-relacionados àqueles ocupados por G5/44, então as respostas combinadas seriam aditivas. Se a ligação de G5/44 a CD22 interferiu com ou preveniu a ligação do segundo anticorpo, então as respostas combinadas não seriam aditivas. Cada das segundas avaliações combinadas foi corrigida para a "taxa imprópria" da interação de G5/44: CD22.

[00280] G5/44 bloqueou a ligação apenas daqueles anticorpos que ligam-se ao epitopo A/domínio 1 de CD22 tipo lg (SHCL1 Leu 14 e HD239), indicando que G5/44 também liga-se neste domínio de CD22. Os anticorpos que ligam-se ao epitopo B/domínio 3 de CD22 tipo lg (RFB-4), epitopo C/domínio 4 de CD22 (To 15) tipo lg e domínio 2 de CD22 (4KB128) tipo lg, não foram bloqueados por G5/44. Estes resul tados indicam que o sítio de ligação de G5/44 sobre CD22 é localizado sobre o primeiro domínio tipo lg porque ele previne a ligação daqueles mAbs anti-CD22 que reconhece o primeiro domínio de CD22 (epitopo A) tipo lg. Outro anticorpo anti-CD22, M6/13 (Celltech, Slough, UK), de sub-especificidade desconhecida foi também bloqueado por G5/44 (Celltech, Slough, UK), desse modo mapeando o sítio de ligação de M6/13 ao epitopo A/domínio 1 de CD22 tipo lg. O anticorpo M5/44, a origem murina de G5/44 que tem a mesma especificidade do G5/44, inibe a ligação de G5/44, e serve como um controle positivo. O anticorpo BU12 anti-CD19 serve como um controle negativo nestas avaliações. Os resultados são sumarizados na Tabela 7. TABELA 7: LIGAÇÃO DE M/AB ANTI-CD22 DE MU RI NO COM ESPECIFICIDADES DEFINIDAS PARA O FC-CD22 PRÉ-TRATADO COM O G5/44. RESPOSTA DE LIGAÇÃO EXPRESSA COMO UNIDADES DE RESSONÂNCIA DE PLASMÔNIO DE SUPERFÍCIE (RU).

[00282] Empregando-se mAbs de murino de especificidades de ligação conhecidas para domínios individuais a CD22, a capacidade de G5/44 bloquear a ligação destes anticorpos às células B foi investigada. Adicionalmente, a capacidade do mAbs bloquear a ligação de G5/44 às células B foi também investigada. Nestes estudos, 1 x 105 células Ramos foram primeiro expostas à anticorpo anti-CD22 de murino (10 ug/ml de G5/44 humanizado ou anti-CD22 monoclonal de camundongo) durante uma hora a 4°C antes da exposição das células ao G5/44 (10 ug/ml). As células foram incubadas durante um adicional de 1 hora a 4°C antes da exposição das células a G5/44 (10 ug/ml). As células foram incubadas durante um adicional de 1 hora a 4°C. Após os tratamentos de anticorpo, as células B foram peletizadas e lavadas com PBS-1% de BSA e o anticorpo secundário apropriado foi adicionado (ou FITC-anti-humano de cabra (cadeia pesada e leve) ou FITC- anticamundongo de cabra (cadeia pesada e leve) a 100 gl de uma diluição de 1:100 em PBS - 1//de BSA durante 30 minutos a 4°C. As cé lulas foram novamente peletizadas, lavadas, e ressuspensas em PBS - 1% de BSA e adicionadas a um tubo contendo 250 pl de PBS -1% de formaldeído. A intensidade de fluorescência associada com as células foi avaliada por citometria de fluxo empregando-se citômetro de fluxo BD FACSort®.

[00283] Os resultados mostraram que exposição anterior de G5/44 a células CDD22+ B resultou em significante inibição da subsequente ligação de M5/44 e M6/13 de mAbs anti-CD22. Ao contrário, a ligação de RFB4 de mAbs anti-CD22, To15, HD239 e 4KB às células B não foi inibida por G5/44. A falta de inibição significante de ligação de HD239 às células B por G5/44 como detectado por citometria de fluxo foi inesperada, especialmente uma vez que a análise BIAcore™ indicou que G5/44 pode bloquear a ligação de HD239 a CD22. A falta de forte inibição de ligação de HD239 por G5/44 pode ser explanada com base nas diferenças em suas afinidades relativas para CD22. Quando os mAbs anti-CD22 de murino acima foram examinados quanto a sua capacidade de inibir a ligação de G5/44 às células CD22+ B, SHCL1 e M6/13, porém não os outros mAbs anti-CD22, inibiram a ligação de G5/44. Os epitopos de ligação de HD239 e SHCL1 foram mapeados para o primeiro domínio de CD22 tipo lg. Entretanto, os epitopos reconhecidos por M6/13 ou M5/44 não foram mapeados. Os estudos de bloqueio detalhados acima indicam que os anticorpos acima reconhecem epitopos localizados sobre o primeiro domínio de CD22 tipo lg, coletivamente conhecidos como epitopo A.

[00284] Vinte mil células Ramos foram incubadas com várias doses de CMC-544 com e sem rituximab (Rituxan®) durante 96 horas. Após 96 horas, a viabilidade celular foi avaliada por exclusão de iodeto de propídio analisada por citometria de fluxo. A viabilidade média de 3 a 6 cavidades foi calculada e a inibição de resposta de dose de viabilidade celular foi calculada para os vários tratamentos. A inibição de resposta de base de viabilidade celular foi calculada de uma concentração zero de CMC-544. A regressão logística foi empregada para testar se CMC- 544 causou uma inibição dependente da dose estatisticamente signifi- cante de crescimento de célula Ramos sobre a faixa de dose de 0,01 a 3 ng de caliqueamicina DMH/ml. A regressão logística foi também empregada para determinar se a interação de CMC-544 com rituximab (Rituxan®) foi estatisticamente significante. As concentrações inibitórias médias (IC50) foram também computadas e a eficácia de cada tratamento com relação ao tratamento com CMC-544 sozinho foi registrada. A análise estatística foi conduzida empregando-se o procedimento PROBIT em SAS versão 8.2.

[00285] Os resultados do estudo mostraram que o CMC-544 causou uma inibição dependente da dose de crescimento de célula Ramos sobre a faixa de dose de 0,01 a 3 ng de caliqueamicina DMH/ml. A concentração inibitória média (IC50 ) de CMC-544 sozinho foi de 0,029 ng/ml. As concentrações de 2, 20 e 200 pg/ml de rituximab (Rituxan®) foram adicionadas às células tratadas com CMC-544 para determinar se a interação de rituximab (Rituxan®) com a atividade de ci- totoxidade de CMC-544 é estatisticamente significante. Rituximab (Rituxan®), adicionado a 20 e 200 jig/ml sem CMC-544, não teve nenhum efeito significante sobre 0 crescimento celular sozinho (111,7% e 94,0% de crescimento de carreador, respectivamente). Em combinação com CMC-544, todas as três concentrações de (Rituxan®) produziram deslocamentos estatisticamente significantes (p < 0,05) para a esquerda na inclinação e interceptam a curva de resposta à dose de CMC-544. A combinação com 2 e 200 jig/ml de rituximab produziu os maiores deslocamentos nas curvas de resposta à dose. Estas 2 curvas não foram estatisticamente diferentes uma da outra, porém foram sig- nificantemente diferentes (p < 0,05) da combinação de dose de 20 jig/ml. Um segundo estudo (resultados não-relatados) confirmou os resultados observados no primeiro estudo. As concentrações inibitórias médias para as combinações de 2, 20 e 200 pg/ml de rituximab (Rituxan®) mais CMC-544 são 0,0072, 0,0081 e 0,0072 ng/ml, respectivamente. As concentrações inibitórias médias de CMC-544 mais rituximab (Rituxan®) são aproximadamente quatro vezes mais potentes do que o IC50 de CMC-544 sozinho.

II XENQENXERTQS SUBCUTÂNEOS DE ATIVIDADE ANTITUMOR IN VIVO E LINFOMAS DE CÉLULA B DISSEMINADAS SISTEMATICAMENTE EM CAMUNDONGOS SCID.

[00286] Camundongos nus atímicos fêmea, 18-22 g, foram administrados irradiação corporal total (400 rads). A irradiação também suprimiu o sistema imune dos camundongos para realçar a aquisição de tumor. Três dias após a irradiação, os camundongos foram injetados subcutaneamente com 107 células RL em Matrigel™ (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA, diluídas 1:1 em meio RPMI) no flanco direito dorsal. Quando os tumores atingiram o tamanho apropriado (0,3 g, tipicamente 21 dias após), terapia com CMC-544, rituximab (Rituxan®) ou CHOP (veja abaixo) foi administrada em solução salina estéril, 0,2 ml/camundongo ip. O dia inicial de administração de droga foi considerado 0 dia 1. Duas doses adicionais foram administradas nos dias 5 e 9 (tratamento = q4Dx3). A terapia CHOP consistiu em ciclofosfamida (C), (Cytoxan®, Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ) 40 mg/kg ip.; doxorrubicina HCL (H), (Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO), 3,3 mg/kg ip.; vincristina (O), (GensiaSicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) 0,5 mg/kg ip.; e prednisona (P), (Roxane Labs., Columbia, OH) 0,2 mg/kg po. CHO foi administrado de acordo com a mesma escala de dosagem como ambos CMC-544 e rituximab (Rituxan®) (q4Dx3) enquanto a prednisona foi administrada oralmente dia sim dia não durante 5 doses (q2Dx5). Os tumores foram medidos pelo menos uma vez por semana e calculados como massa de tumor (g) = 0,5 (amplitude do tumor/2) (comprimento do tumor). As médias de grupo SEM foram calculadas e comparadas ao grupo tratado por carreador quanto à sig- nificância estatística empregando-se os testes T múltiplos. As médias de grupo foram registradas até 50 dias ou até um camundongo morrer (o que rompeu a média de grupo) ou o tumor crescer demasiadamente grande (> 3,5 g) e o camundongo teve de ser eutanizado. Após este tempo, a massa de tumor foi reportada apenas para cada camundongo individual em todos os grupos de tratamento. O número de camundongos sem tumor ao final de cada estudo para cada grupo de tratamento foi também registrado.

[00287] Para determinar o efeito de CMC-544 sozinho ou em combinação com outros agentes bioativos sobre linfomas disseminados, o modelo de camundongo SCID foi empregado. Os camundongos SCID, machos (CB17 SCID), 20-25 g, foram injetados com 106 células Ramos através da veia do rabo (0,2 ml). Ou 3 ou 9 dias após a injeção de célula, os camundongos foram administrados com carreador, conjugados (CMC-544 ou CMC-676), ou rituximab (Rituxan®), ip., durante um total de 3 doses. Durante a escala de tratamento de 3 dias, os camundongos foram dosados nos dias 3, 7 e 11. Para a escala de tratamento de 9 dias, os camundongos foram dosados nos dias 9, 13 e 17. Na escala de tratamento de 9 dias, as combinações de CMC-544 e rituximab (Rituxan®) foram também administradas como descrito abaixo. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à presença de paralisia de membro traseiro, período no qual eles são ligados. Sete a dez camundongos por grupo de tratamento foram empregados. O tempo de sobrevivência médio do grupo (± SD), tempos de sobrevivência médio, mínimo e máximo foram todos calculados. A diferença em distribuição de sobrevivência entre os grupos foi determinada em- pregando-se um teste de grau Log não-paramétrico com significância reportada no nível 0,05. As curvas de sobrevivência foram construídas empregando-se o método Kaplan-Meier.

[00288] O estudo inicial examinou o efeito de duas escalas de dosagem sobre os tempos de sobrevivência dos camundongos SCID com o linfoma disseminado. O primeiro estudo indicou o início da dosagem de droga 3 dias após as células de tumor serem injetadas in-travenosamente (modelo de desenvolvimento), enquanto que o segundo estudo a dosagem de droga prologada até 9 dias após a injeção de célula de tumor (modelo estabelecido). Em cada estudo, CMC-544 (160 pg/kg), CMA-676 (160 pg/kg), ou rituximab (Rituxan®) (20 mg/kg) foram administrados 3 doses ip, 4 dias de intervalo (Q4Dx3). No modelo de desenvolvimento, os camundongos tratados por carreador tiveram um tempo de sobrevivência médio de 27 dias (Figura 23, Tabela 8). CMA-676, o controle comparado ao isótipo para CMC-544, não aumentou o tempo de sobrevivência significantemente (p > 0,05). CMC-544 significantemente aumentou o tempo de sobrevivência para 41 dias, enquanto o rituximab teve um efeito profundo, aumentando o tempo de sobrevivência para > 125 dias (significantemente maior do que CMC-544, p < 0,05). A dosagem prolongada até as células de tumor terem uma oportunidade de circular (residente) e depositar-se nos tecidos alvo (modelo estabelecido) alterou os resultados para CMC- 544 e rituximab (Rituxan®). CMA-676 novamente não teve nenhum efeito significante sobre os tempos de sobrevivência (Figura 24, Tabela 8). O rituximab (Rituxan®) aumentou o tempo de sobrevivência médio para 62,6 dias enquanto que o CMC-544 aumentou o tempo de sobrevivência médio para 83,5 dias. Não houve nenhuma diferença significante entre os efeitos de CMC-544 e rituximab (Rituxan®) no modelo estabelecido.

[00289] Um estudo preliminar foi conduzido para determinar se o rituximab (Rituxan®) teve qualquer efeito, ou positivo ou negativo, sobre a resposta de sobrevivência de CMC-544. O CMC-544 (160 pg/kg) foi administrado com e sem rituximab (Rituxan®) (20 mg/kg, classificada a combinação de droga de dose elevada (HD)). Além disso, doses menores de CMC-544 (80 pg/kg) foram co-administradas com doses menores de rituximab (Rituxan®) (10 pg/kg). Os compostos não foram dados separadamente nas respectivas doses de 80 pg/kg ou 10 pg/kg devido ao número limitado de camundongos no estudo. Esta combina-ção, CMC-544 (80 pg/kg) com rituximab (Rituxan®) (10 pg/kg), foi classificada a combinação de dose média (MD) e foi conduzida para de terminar a praticabilidade de combinações de dose menor de drogas sobre a sobrevivência de camundongo SCID. O CMC-544 (160 gg/kg) e rituximab (Rituxan®) (20 jig/kg), administrados sozinhos, funcionaram como relatado no modelo acima estabelecido. Cada média do tempo de sobrevivência prolongado para 58,5 e 50,5 dias, respectivamente (Figura 25, Tabela 9). Em combinação, a média do tempo de sobrevivência foi ligeiramente (embora não-estatisticamente significante, p > 0,05) melhorou para 64,4 dias para a combinação de dose elevada. A combinação de dose média de 80 jig/kg de CMC-544 e 10 ug/kg de rituximab (Rituxan®) significantemente melhorou (p<0,05 versus tratado por carreador) o tempo de sobrevivência para uma média de 92,4 dias. Estes resultados sugeriram que combinações de dose menor de CMC-544 e rituximab (Rituxan®) foram garantidas.

[00290] CMC MD = dose média de CMC544, 80 pig/kg

[00291] CMC HD = dose elevada de CMC-544, 160 pg/kg

[00292] Ritux MD = dose média de Rituximab, 10 mg/kg

[00293] Ritux HD = dose elevada de Rituximab, 20 pg/kg.

[00294] Um outro estudo de combinação com CMC-544 e rituximab (Rituxan®) foi conduzido. Os seguintes grupos de tratamento foram conduzidos: CMC-544 a 40, 80 e 160 pg/kg; rituximab (Rituxan®) a 5, 10, e 20 mg/kg; e CMC-544 a 40 pg/kg mais rituximab (Rituxan®) 5 mg/kg, CMC-544 a 80 pg/kg mais rituximab (Rituxan®) 10 mg/kg, e CMC-544 a 160 pig/kg mais rituximab (Rituxan®) 20 mg/kg. Todas as doses de rituximab (Rituxan®) melhoraram ligeiramente a média do tempo de sobrevivência para a faixa de 33 - 40 dias, (todas as doses p < 0,05 comparadas com a média do tempo de sobrevivência dos tratados com carreador de 25,8, Figura 26, Tabela 10). A dose elevada de CMC-544, 160 pg/kg, média do tempo de sobrevivência melhorada para 85 dias, consistente com os resultados reportados nos dois estudos anteriores. A combinação do CMC-544 com o rituximab (Rituxan®) não constituiu nenhuma melhora significante nos tempos de sobrevi- ência (Figura 27, Tabela 10). As duas doses menores de CMC-544 (80 e 40 pg/kg) cada qual melhorou significantemente (p < 0,05) a média dos tempos de sobrevivência acima daquela do CMC-544 de dose elevada. Para as doses de 40 e 80 pg/kg de CMC-544, 90% e 80% dos camundongos, respectivamente, estavam ainda sobrevivendo em 125 dias. Ambos os grupos de combinação de droga tiveram 100% dos camundongos vivos até o dia 125. Doses menores de CMC-544 são mais eficazes do que a dose elevada de 160 pg/kg.

[00295] O Rituximab (Rituxan®), em combinação com CMC-544, não teve nenhum efeito óbvio sobre a atividade de CMC-544 no modelo de célula B disseminada em camundongos SCID nas doses testadas (veja acima). Se o CMC-544, co-administrado com rituximab (Rituxan®), resultou em ou realce ou inibição de atividade antitumor foi também avaliado empregando-se o modelo de xenoenxerto de linfoma B de RL subcutâneo em camundongos nus Balb/c. No modelo de linfoma B subcutâneo, tumores foram representados para uma massa de tumor média de 300 mg após o que dois terapêuticos sob estudo foram administrados IP. O CMC-544 foi empregado a 20 ou 80 pg/kg de Q4Dx3 com ou sem rituximab (Rituxan®) (20 mg/kg e Q4Dx3). A co- administração de rituximab (Rituxan®) nem realçou nem inibiu signifi- cantemente (p > 0,05) a eficácia terapêutica de CMC-544 (Figura 28). O Rituximab (Rituxan®), administrado sozinho, inibiu o crescimento de linfoma B de RL (57% de inibição de crescimento de tumor no dia 20, p < 0,05 versus tratado por carreador) neste estudo, similar àquele observado com a dosagem menor de CMC-544.

[00296] O regime quimioterapêutico de combinação CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona) é a modalidade de tratamento mais comumente empregada para pacientes de linfoma de não Hodgkin. O efeito antitumor de CHOP foi comparado com aquele de CMC-544 em xenoenxertos de linfoma B de RL estabelecidos. Os componentes individuais do regime de CHOP foram empregados em suas doses máximas toleradas respectivas avaliadas em camundongos nus (dados não reportados) e foram como segue: Ciclofosfamida (C) 40 mg/kg IP, doxorrubicina (H) 3,3 mg/kg IP, vincristina (O) 0,5 mg/kg IP, e prednisona (P) 0,2 mg/kg PO. CHO foi administrado Q4Dx3 e P foi administrado PO, Q2Dx5. CMC-544 foi administrado IP, Q4Dx3 em uma dosagem de 160 pg/kg de equivalentes de caliqueamicina. O tratamento de CHOP inicialmente causou uma inibição significante do crescimento de linfoma B de RL (Figura 29). Entretanto, 3 semanas depois, tumores cresceram novamente com taxas de crescimento similares como o grupo tratado por carreador. Ao contrário, o efeito antitumor de CMC- 544 foi completo e manteve-se durante todo o período experimental. Estes resultados sugerem que o CMC-544, em uma dose significan- temente menor do que a dose não letal máxima em camundongos nus, foi mais eficaz do que a terapia de combinação de CHOP.

[00297] Estes estudos mostraram que o rituximab (Rituxan®), adicionado ao CMC-544 causou um aumento significante em atividade citotóxica de CMC-544 observado com as células de linfoma B Ramos. Uma interação sinérgica em células Ramos para rituximab (Rituxan®) e glicocorticóides foi também recentemente relatada. Adicionalmente, um inibição de crescimento sinérgico em 4 das 8 linhagens celulares adicionais foi observada com o rituximab (Rituxan®) quando administrado em combinação com 10 pM de dexametasona.

[00298] O rituximab (Rituxan®) sozinho, 0,4 a 10 pg/ml, foi reportado causar uma significante, embora pequena (18% no máximo) inibição de crescimento de célula Ramos. Adicionalmente, ele foi ativo em 6 das 8 linhagens de célula de linfoma não-Hodgkin de célula B quando incubado a 10 pg/ml (48 horas de incubação). Ghetie e outros, mostrou que o rituximab (Rituxan®), 10 pg/ml, causou um aumento de 6,2% em apoptose (versus 3,5% em células tratadas com carreador) após 24 horas de incubação com células Ramos. Nos estudos correntes, o rituximab (Rituxan®), em doses de 20 e 200 pg/ml não teve ne-nhum efeito sobre o crescimento de célula Ramos quando administrado sozinho. Em camundongos, não houve nenhuma evidência de qualquer interação entre CMC-544 e o rituximab (Rituxan™) ou no modelo disseminado ou no modelo de xenoenxerto subcutâneo. As combinações de droga testadas não interferiram com cada dos efeitos do outro nem os realçaram. Se a redução das doses de cada droga no modelo disseminado alterará esta observação precisa ser determinado.

[00299] O modelo de linfoma de célula B disseminada com células Ramos foi descrito por Flavell e outros. Os tempos de sobrevivência médios para camundongos tratados pelo carreador foram reportados serem de 34 a 36 dias. Os camundongos desenvolveram paralisia do membro traseiro e progrediram para tornarem-se moribundos, morrendo logo após. Análise histológica dos órgãos revelou que os órgãos mais comumente envolvidos foram a glândula adrenal, baço e espaço sub-aracnóide. O infiltrado de espaço sub-aracnóide freqüentemente estendeu-se dentro do cérebro. O rituximab (Rituxan®) funcionou bem quando administrado na fase precoce do processo da doença para os camundongos SCID disseminados (Figura 23), porém foi menos impressionante quando administrado no dia 9 na fase estabelecida do modelo (Figura 24). O rituximab (Rituxan®) sendo do isótipo lgG1, mais provavelmente trabalha por meio dos mecanismos efetores do hospedeiro camundongo. Estes mecanismos incluem citotoxidade mediada por complemento e/ou citotoxidade celular dependente do anticorpo por meio do recrutamento de células exterminadoras naturais que estão presente em camundongos SCID. As células de tumor Ramos injetadas são provavelmente mais suscetíveis precocemente sobre os mecanismos imunes do hospedeiro que são ativados por rituximab (Rituxan®), antes das células terem uma oportunidade de infiltrar- se nos órgãos afetados. O anticorpo G5/44 não-conjugado (a molécula alvo em CMC-544) não foi entretanto testado no modelo de tumor disseminado em camundongos SCID, porém ele não teve nenhum efeito quando administrado em xenoenxertos subcutâneos. G5/44, sendo do isótipo lgG4, não seria esperado ativar os mecanismos efetores do hospedeiro e, portanto, não produziriam atividade antitumor.

[00300] O conjugado de caliqueamicina G5/44 (CMC-544) comportou-se de maneira oposta ao rituximab (Rituxan®), produzindo melhores resultados quando administrado na fase estabelecida da doença. A razão para o CMC-544 funcionar melhor na fase estabelecida não está clara, porém a fase estabelecida mais intimamente representa a situação clínica. O CMA-676, o conjugado de controle de não ligação, comparado ao isótipo, não teve nenhum efeito significante sobre as médias dos tempos de sobrevivência. Os resultados no modelo de SCID disseminados claramente sugerem que as doses de CMC-544 precisam ser reduzidas para determinar a dose de eficácia máxima (MED). A dose de 160 p.g/kg foi menos ativa do que as doses menores de 80 e 40 pg/kg. Não está claro por que isto é desse modo, porém a dose de 160 pg/kg pode ser bem acima da MED. Outros estudos são planejados para controlar este resultado.

[00301] Mohammad e outros, empregaram a terapia CHOP (Cyclos- phosphamida (C) 40 mg/kg IV, doxorrubicina (H) 3,3 mg/kg IV, vincristina (O) 0,5 mg/kg IV, e prednisona (P) 0,2 mg/kg PO) em um modelo de xe- noenxertos subcutâneos com uma linhagem de célula de linfoma de célula grande difusa, DLCL. As doses empregadas para a terapia CHOP foram determinadas serem sua dose máxima tolerada. A terapia, CHO administrada uma vez IV e P, administrada diariamente durante 5 dias, foi classificada "ativa", produzindo um T/C de 25,8%. Nenhuma cura de tumor foi registrada. Os resultados no modelo descrito por Mohammad e outros, pareceram similares àqueles observados com a terapia CHOP (administrada IP, Q4Dx3) no modelo RL aqui descrito. Em nenhum estudo a CHOP produziu curas a longo prazo, ao contrário do CMC-544. TABELA 10: AVALIAÇÕES DESCRITIVAS DE TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA PARA OS ESTUDOS DE COMBINAÇÃO.

[00302] CMC LD = dose baixa de CMC-544, 40 gg/kg

[00303] CMC MD = dose média de CMC544, 80 pg/kg

[00304] CMC HD = dose elevada de CMC-544, 160 pg/kg

[00305] Ritux LD = dose baixa de Rituximab, 5 mg/kg

[00306] Ritux MD = dose média de Rituximab, 10 mg/kg

[00307] Ritux HD = dose elevada de Rituximab, 20 pg/kg.

EXEMPLO 8 FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE CMC-544

[00308] Formulações estáveis de CMC-544 para administração in vivo foram preparadas adicionando-se diluentes, excipientes, carrea- dors e estabilizadores. Seguindo cromatografia HIC as frações croma- tográficas são ensaiadas por SEC-HPLC e análise de UV de múltiplos comprimentos de onda. As frações apropriadas foram selecionadas para reunião com base na análise acima, que forneceu informação sobre o conteúdo de agregado, concentração de proteína, e carga de caliqueamicina. Excipientes, estabilizadores, agentes de volume e agentes de tamponamento foram adicionados para estabilizar a solução. Uma vez que o CMC-544 pode sofrer degradação por meio de diversas trilhas de degradação, instabilidades físicas precisam ser consideradas no desenvolvimento de formulações. Uma das principais considerações no desenvolvimento de formulações é que a taxa de hidrólise de caliqueamicina do anticorpo deve ser minimizada enquanto que a integridade física e química do anticorpo anti-CD-22 deve ser mantida. Além disso, a precipitação do conjugado de anticorpo- caliqueamicina, que pode ocorrer sob certas condições de pH e con-centração, precisa ser minimizada.

[00309] No desenvolvimento de uma formulação de um conjugado de anticorpo - derivado de caliqueamicina monomérica, o pH da formulação é crítico, quando isto minimiza a degradação e instabilidade física. Um pH de 8,0 foi selecionado para minimizar a hidrólise de caliqueamicina e manter solubilidade adequada do conjugado. Os dados adicionais obtidos empregando-se SDS-PASGE e ELISA de ligação de antígeno, indicaram que a integridade estrutural significante e especificidade do anticorpo são mantidas em um pH de 8,0. Consequentemente, a trometamina foi escolhida como um agente de tamponamen- to para manter um pH de 8,0. Um tampão alternativo poderia incluir fosfato de potássio ou sódio dibásico. A faixa de concentração de tampão pode ser de 5 a 50 mM. Uma faixa de pH preferida de 7,5 a 8,5 é sugerida para estabilidade/solubilidade ideal. A especificação de pH corrente para o produto acabado é de 7,0 - 9,0.

[00310] Embora a estabilidade das soluções de conjugado tampo- nadas seja adequada durante a estabilidade a curto prazo, a longo prazo é inferior. A liofilização é empregada para melhorar a vida de prateleira dos conjugados. Os problemas associados com a liofilização de uma solução de proteína são bem documentados, e a perda de estrutura secundária, terciária e quaternária pode ocorrer durante os processos de congelamento e secagem. A sacarose é incluída na formulação para atuar como um estabilizador amorfo do conjugado e manter a integridade estrutural do anticorpo durante o congelamento e secagem. As concentrações de 1,5 a 5,0% de peso/volume de sacarose foram empregadas. Além disso, um agente de volume polimérico, tal como o Dextrano 40 ou amido de hidroxietila pode ser incorporado para realçar a aparência e rigidez física das tortas liofilizadas em uma concentração de 0,5 - 1,5% em peso. Estes materiais formam massas liofilizadas em concentrações relativamente baixas e podem ser empregados par minimizar o conteúdo total de sólidos da fórmula liofilizada, desse modo permitindo secagem por congelamento mais rápida. Estudos de formulação têm empregado uma concentração de Dextran 40 de 0,9% em peso.

[00311] O Polissorbato 80 é incluído na formulação para realçar a solubilidade do conjugado. Uma concentração preferida de 0,01% é empregada com uma faixa potencial de 0,005 a 0,05%. O Tween® é também adicionado à formulação em uma concentração de 0,91 a 0,05% em volume.

[00312] Um eletrólito pode também estar presente na fórmula e pode ser empregado para melhorar a eficiência do processo de purificação final. O cloreto de sódio é tipicamente empregado em uma concentração de 0,01 M a 0,1 M. Os eletrólitos adicionais tais como sulfato de sódio podem também ser empregados como uma substituição para o cloreto de sódio, uma vez que ele pode ser mais facilmente liofilizado. Idealmente, a solução de CMC-544 final compreende 1,5% de sacarose (em peso), 0,9% de Dextrano 40 (em peso), 0,01% de Tween® 80, 50 mM de cloreto de sódio, 0,01% de polissorbato 80 (em peso) e 20 mM de trometamina.

[00313] Uma fórmula representativa para a solução anterior à liofili- zação é apresentada abaixo: CMC-544 0,5 mg/ml, sacarose 1,5% em peso, Dextrano 40 0,9% em peso, cloreto de sódio 0,05 M, Tween® 0,01 - 0,05% em volume, polissorbato 80 0,01% em peso, trometamina 0,02 M, pH 8,0, e água. A solução é dispensada em frasconetes âmbar em uma temperatura de +5°C a 10°C, (opcionalmente a +5°C); a solução é congelada em uma temperatura de congelamento de -35°C a - 50°C, (opcionalmente a -45°C); a solução congelada é submetida a uma etapa de secagem por congelamento inicial em uma pressão de secagem primária de 20 a 80 microns (opcionalmente a 60 microns); o produto seco por congelamento é mantido em uma temperatura de prateleira a -10°C a -40°C, (idealmente a -30°C), durante 24 a 72 horas, (idealmente durante 60 horas); e finalmente o produto secado por congelamento é submetido a uma etapa de secagem secundária em uma pressão de secagem de 20-80 microns, (idealmente a 60 microns) em uma temperatura de prateleira de +10°C a +35°C, (idealmente +25°C), durante 15 a 30 horas (idealmente durante 24 horas). Um teste de elevação de pressão é empregado para determinar o término da secagem primária. Na conclusão do ciclo de liofilização, os frasconetes são novamente carregados com nitrogênio e tamponados.

[00314] A Tabela 11 demonstra as diferenças na formulação empregada para CMC-544 e a formulação empregada para CMC-676. Signifi- cantes diferenças entre a formulação de CMA-676 e a formulação empregada para o CMC-544 incluem concentração reduzida de proteína na nova formulação (0,5 mg/mL), o uso de trometamina como um tampão e a presença de 0,01% de Tween® 80. Estes resultados no CMC-544 reconstituído na nova formulação sendo claro quando oposto à turbi- dez observada na formulação de CMA-676 reconstituída (veja as Tabelas 12 e 13). TABELA 11: COMPARAÇÃO DA FORMULAÇÃO CMA-676 E FORMULAÇÃO CMC-544 PARA CMC-544. Formulação CMA-676 Formulação CMC-544

TABELA 12: OBSERVAÇÕES DE ESTABILIDADE E FÍSICO- QUÍMICA DAS FORMULAÇÕES DE CMA-676 E CMC-544 PARA CMC-544 A 5°C.

TABELA 13: OBSERVAÇÕES DE ESTABILIDADE E FÍSICO-QUÍMICAS DA FORMULAÇÃO DE CMA- 676 E CMC-544 LIOFILIZADA E ESTOCADA A 25°C.

[00316] Todas as referências e patentes acima citadas são aqui incorporadas por referência. Numerosas modificações e variações da presente invenção são incluídas na especificação acida identificada e são supostas serem óbvias para alguém versado na técnica. Tais modificações e alterações ao processo de conjugação, os conjugados feitos pelo processo, e às composições/formulações compreendendo os conjugados acredita-se que sejam abrangidas pelo escopo das reivindicações. BIBLIOGRAFIA: 1. G. Kohler e Milstein, C., Nature, 256:495 (1975). 2. T. G. Hose e Blair, A. H. CRC Critical Rev. Drug Carrier Systems 3:263(1987). 3. Patente U. S. n° 5.877.296. 4. Patente U. S. n° 5.773.001. 5. Patente U. S. n° 5.714.586. 6. Patente U. S. n° 5.712.374. 7. Patente U. S. n° 5.053.394. 8. J. Tramontane; e outros, J. Mol. Recognit. 7:9 (1994). 9. H. McConnell e Hoess, J„ J. Mol. Biol. 250:460 (1995). 10. Nord e outros, Nat Biotechnol. 15:772 (1997). 11. Nord e outros, Proteína Eng. 8:601 (1995). 12. 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Claims (23)

1. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula Pr(-X-S-S-W)m, em que Pr é um anticorpo anti-CD22 em que a molécula de anticorpo compreende SEQ ID No:1 para CDR-H1, SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:13 ou SEQ ID No:15 ou SEQ ID No:16 ou resíduos 50-66 de SEQ ID No:23 ou resíduos 50-66 de SEQ ID No: 27 para CDR-H2, SEQ ID No:3 para CDRH3, SEQ ID No:4 para CDR-L1, SEQ ID No:5 para CDR-L2, e SEQ ID No:6 para CDR-L3; X é um ligante hidrolisável que compreende um produto de qualquer grupo reativo que pode reagir com um anticorpo; Wé um radical caliqueamicina; m é a carga média para um produto de conjugação purificado para que o caliqueamicina constitua de 4 a 10% do conjugado em peso; e (-X-S-S-W)m é um derivado de caliqueamicina.

2. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo compreende SEQ ID No:1 para CDR-H1, resíduos 50-66 de SEQ ID No: 27 para CDR-H2, e SEQ ID No:3 para CDR-H3, SEQ ID No:4 para CDR-L1, SEQ ID No:5 para CDR-L2, e SEQ ID No:6 para CDR-L3.

3. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável compreendendo regiões de estrutura de aceptor humano e CDRs de doador não-humano.

4. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um domínio variável de cadeia pesada compreende uma região de estrutura de cadeia pesada compreendendo resíduos de doador nas posições 1, 28, 48, 72, e 97 de SEQ ID NO: 8 ocupadas por Glu, Arg, lie, Ala, e Thr, respectivamente, em que o restante da região de estrutura de cadeia pesada é ocupada pelos correspondentes resíduos de estrutura de aceptor humano de SEQ ID No: 21 ou 22.

5. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende ainda resíduos de doador nas posições 68 e 70 de SEQ ID NO: 8 ocupadas por alanina e leucina, respectivamente.

6. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compreende uma região de estrutura de cadeia leve compreendendo resíduos de doador nas posições 2, 4, 42, 43, 50, e 65 de SEQ ID NO: 7 ocupadas por valina, valina, leucina, histidina, glutamina e aspartato, respectivamente, em que o restante da região de estrutura de cadeia leve é ocupada pelos correspondentes resíduos de estrutura de aceptor humano de SEQ ID Nos: 17 ou 18.

7. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compreende ainda um resíduo de doador na posição 3 de SEQ ID NO: 7 ocupadas por valina.

8. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de acordo a SEQ ID No: 19 e uma região variável de cadeia pesada de acordo a SEQ ID No: 27.

9. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD22 compreende uma cadeia leve de acordo a SEQ ID No: 28 e uma cadeia pesada de acordo a SEQ ID No: 30.

10. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD22 compreende uma cadeia leve consistindo em resíduos 21-239 de SEQ ID No: 28 e uma cadeia pesada consistindo em resíduos 20-466 de SEQ ID No: 30 e em que o anticorpo é expresso em uma célula de mamífero.

11. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD22 resulta da expressão de SEQ ID No:29 e de SEQ ID No:31 em uma célula de mamífero.

12. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo variante obtido através de um protocolo de uma maturação de afinidade e apresenta afinidade aumentada para CD22 humano.

13. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o caliqueamicina é gama caliqueamicina ou gama caliqueamicina de N-acetila.

14. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o derivado de caliqueamicina é funcionalizado com hidrazida de butanoíla de 3-mercapto-3-metila.

15. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que de que o ligador hidrolizável é um ligador bifundional que é capaz de liberar o derivado de caliqueamicina do conjugado após aglutinar-se e entrar nas células alvo.

16. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que de que o ligante bifuncional é ácido 4-(4- acetilfenóxi)butanóico (AcBut).

17. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:

em que o anticorpo compreende SEQ ID No: 1 para CDR-H1, resíduos 50-66 de SEQ ID No:27 para CDR-H2, SEQ ID No: 3 para CDR-H3, SEQ ID No: 4 para CDR-L1, SEQ ID No: 5 para CDR-L2, e SEQ ID No: 6 para CDR-L3; e n é 3 a 9.

18. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve como definida na SEQ ID No: 19 e uma região variável de cadeia pesada como definida na SEQ ID No:27.

19. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve consistindo em resíduos 21-239 de SEQ ID No: 28 e uma cadeia pesada consistindo em resíduos 20-466 de SEQ ID No:30, e em que o anticorpo é expresso em uma célula de mamífero.

20. Conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácidos resultando da expressão de SEQ ID No:29 em uma célula de mamífero e uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácidos resultando da expressão de SEQ ID No:31 em uma célula de mamífero.

21. Uso de um conjugado monomérico de derivado de caliqueamicina / anticorpo anti-CD22, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferative.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo é uma malignidade de célula B.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a malignidade de célula B é selecionada do grupo consistindo em leucemia, linfoma, linfoma não-Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC) e mieloma múltiplo.

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