KR20110050753A - 칼리치아미신 유도체-운반체 접합체 - Google Patents

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Abstract

본원에서는, 이미 보고된 방법에 비해 약물 부하량이 현저히 높고 응집 및 저접합체 분획(LCF)가 감소된 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체를 제조하는 방법이 기술된다. 세포독성 약물 유도체/항체 접합체, 이러한 접합체를 포함하는 조성물 및 이러한 접합체의 용도가 또한 기술된다. 또한, 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체, 이러한 접합체를 포함하는 조성물 및 이러한 접합체의 용도가 기술된다.

Description

칼리치아미신 유도체-운반체 접합체{Calicheamicin derivative-carrier conjugates}
본 발명은 약물 부하량이 높고 저접합 분획(LCF)이 실질적으로 감소된 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체("접합체")를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-CD22 항체-단량체성 칼리치아미신(calicheamicin) 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 접합체, 당해 접합체의 정제 방법, 당해 접합체를 포함하는 약제학적 조성물 및 접합체의 용도에 관한 것이다.
전신 약물치료를 위해 개발된 약물 접합체는 표적 특이적 세포독성제이다. 당해 기술적 개념은 한정된 표적 세포 집단에 특이성을 갖는 운반체 분자에 치료제를 커플링시킴을 포함한다. 항원과 고친화성인 항체가 표적화 잔기로서 선택되는 것이 적합하다. 고친화성 모노클로날 항체의 유용성과 함께 항체 표적화 치료제가 촉망되고 있다. 모노클로날 항체에 접합된 독성 물질은 독소, 저분자량의 세포독성 약물, 생물학적 반응 개질제 및 방사성핵종을 포함한다. 항체-독소 접합체는 흔히 면역독소로서 호칭되는 반면, 항체 및 저분자량의 약물(예를 들어, 메토트렉세이트 및 아드리아마이신)로 이루어진 면역접합체는 화학면역접합체로서 호칭된다. 면역조절제는 림포킨, 성장 인자 및 보체 활성화 코브라 독 인자(CVF)와 같은 조절 기능을 갖는 것으로 공지된 생물학적 반응 개질제를 포함한다. 방사선면역접합체는 방사선에 의해 세포를 사멸시키기 위한 치료제로서 사용되거나 영상화를 위해 사용될 수 있는 방사능 동위원소로 이루어진다. 세포독성 약물의 종양 세포로의 항체 매개 특이적 전달은 이의 항종양 효능을 증대시킬뿐만 아니라 정상 조직에 의한 비표적화된 흡수를 차단하여 이의 치료학적 지수를 증가시킬 것으로 기대된다.
본 발명은 표적화 비히클로서 항체를 포함하고 악성종양 세포의 표면상의 항원 결정인자에 대해 특이성을 갖는, 세포독성 약물과 접합된 면역접합체에 관한 것이다. 본 발명은 세포독성 약물 항체 접합체에 관한 것이고 여기서, 항체는 B-악성종양 세포, 림프구 증식성 질환 및 만성 염증 질환에 대한 항원 결정인자에 특이성을 갖고 있다. 본 발명은 또한 면역접합체의 제조 방법 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다.
암 및 류마티스 관절염을 포함하는 다양한 질환을 치료하기 위한 다수의 항체 기본 치료제는 임상적인 용도를 위해 승인되었거나 비-호지킨 림프종과 같은 B-세포 악성종양을 포함하는 다양한 악성종양에 대해 임상 시험중에 있다. 하나의 당해 항체 기본 치료제는 B-세포상에 발현되는 세포 표면 항원 CD20에 특이적인 비표지된 키메라 사람 γ1(+mγ1V-영역) 항체인 리툭시마브(rituximab)(리툭산(Rituxan)TM)이다. 이들 항체 기본 치료제는 보체 매개 세포독성(CDCC)에 의존하거나 B-세포에 대한 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 의존하거나 임상의 및 환자에 대한 관련되는 제조 및 사용 문제를 갖는 방사성핵종, 예를 들어, 131I 또는 90Y의 사용에 의존한다. 따라서, 현재의 항체 기본 치료제의 단점을 극복하여 비-호지킨 림프종(NHL)과 같은 조혈 악성 종양을 포함하는 다양한 악성종양을 치료할 수 있는, 용이하게 효율적으로 제조될 수 있고 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 사용될 수 있는 면역접합체를 제조할 필요가 있다.
총체적으로 칼리치아미신 또는 LL-E33288 복합체로서 공지된 강력한 항세균제 및 항종양제 계열의 구성원을 포함하는 면역접합체(문헌참조: 미국 특허 제4,970,198(1990))는 골수종 치료용으로 개발되었다. 가장 강력한 칼리치아미신은 본원에 단순히 감마로서 언급된 γ1으로 명명된다. 이들 화합물은 적당한 티올과 반응하여 디설피드를 형성할 수 있고 동시에 하이드라지드와 같은 작용성 그룹 또는 칼리치아미신 유도체를 운반체에 부착시키는데 유용한 기타 작용성 그룹을 도입하는 메틸트리설피드를 포함한다[문헌참조: 미국 특허 제5,053,394호]. 다양한 암에 대한 치료제를 개발하는데 있어서 단량체성 칼리치아미신 유도체/운반체 접합체의 사용은 특이적 표적화 제제(운반체)의 능력뿐만 아니라, 운반체에 접합된 칼리치아미신 유도체의 양(즉, 약물 부하량)이 증가하는 경우 단백질 응집물을 형성시키는 접합 방법 둘다에 의해 제한되었다. 보다 높은 약물 부하량은 접합체의 고유 효능을 증가시키기 때문에 운반체 단백질의 친화도가 일관되게 유지되는 정도로 많은 약물이 운반체상에 부하되는 것이 바람직할 수 있다. 응집된 단백질의 존재는 비특이적 독성 및 면역원성일 수 있고, 따라서 치료학적 적용을 위해 제거되어야만 하고 이들 접합체의 대량 생산을 보다 어렵게하여 생성물의 수율을 감소시킨다. 운반체 단백질상에 부하되는 칼리치아미신의 양(약물 부하량), 접합 반응에서 형성되는 응집물의 양 및 수득될 수 있는 최종 정제된 단량체성 접합체의 수율은 모두 관련되어 있다. 따라서, 접합 반응에 첨가되는 반응성 칼리치아미신 유도체의 양을 조정함에 의해 보다 높은 약물 부하량과 최종 단량체의 수율이 조율되어야만 한다.
세포독성 약물 접합체, 특히, 칼리치아미신 접합체가 응집하는 경향은 특히, 접합 반응이, 본원에 참조문헌으로서 인용되는 미국 특허 제5,877,296호 및 미국 특허 제5,773,001호에 기재된 링커와 함께 수행되는 경우 문제가 된다. 이 경우에, 제조되는 접합체의 상당 부분이 응집된 형태로 있고 치료용으로 이들 본래의 방법(CMA 방법)에 의해 제조된 접합체를 정제하기란 매우 어렵다. 몇몇 운반체 단백질에 대해, 심지어 적당한 부하량을 갖는 접합체도 실질적으로 소규모를 제외하고는 제조할 수 없다. 결론적으로, 응집양을 최소화함으로써 적당한 생성물 수율과 함께 가능한 한 높은 부하량을 허용하는 운반체에 칼리치아미신과 같은 세포독성 약물을 접합시키는 방법을 개선할 필요가 있다.
이미, 약물 부하량/수율이 높고 응집이 감소된 단량체성 칼리치아미신 유도체/운반체를 제조하는 접합 방법은 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,712,374호 및 미국 특허 제5,714,586호에 기재되어 있다. 이들 방법으로, 실질적으로 응집물 함량이 감소된 접합체가 제조되지만, 이후에 바람직하지 않게도 고수준의 저접합 분획(LCF)(45 내지 65% HPLC 면적 %)인 대부분 비접합된 항체로 이루어진 분획을 함유하는 접합체가 제조되는 것으로 밝혀졌다. 생성물중에 LCF의 존재는 세포독성 약물을 함유하지 않음으로써 항체의 사용이 비효율적이다. 또한 표적물에 대해 칼리치아미신-운반체 접합체와 경쟁할 수 있고 잠재적으로 후자의 표적화율을 감소시켜 세포독성 약물의 효능을 감소시킨다. 따라서, LCF를 상당히 저하시키고 접합체의 물성을 상당히 변화시키지 않으면서 허용가능한 응집 수준을 갖게하는 개선된 접합 방법이 요망되고 있다.
본 발명은 부하량이 높고 저접합 분획(LCF)이 상당히 저하된 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체("접합체")를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단량체성 칼리치아미신 유도체-운반체 접합체의 제조방법; 접합체; 조성물; 접합체의 정제 방법 및 접합체의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 단량체성 칼리치아미신 유도체-항-CD22 항체 접합체(CMC-544)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 물리적 또는 화학적 특성을 상당히 변화시키지 않으면서 LCF 수준이 상당히 감소된(10% 미만) 접합체의 제조를 위한 개선된 접합 방법을 기재하고 있다. 본 발명은 또한 LCF의 수준을 상당히 저하시킬 뿐만 아니라 선행 기재된 방법으로부터의 응집을 상당히 감소시켜 실질적으로 증가된 약물 부하량을 제공하는 추가로 개선된 접합 방법을 기재하고 있다. 본 발명의 접합체는 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Pr(-X-W)m
상기 화학식에서,
Pr은 단백질성 운반체이고,
X는 단백질성 운반체와 반응할 수 있는 반응성 그룹을 갖는 생성물을 포함하는 링커이고,
W는 세포독성 약물이고,
m은 세포독성 약물이 접합체의 7 내지 9중량%를 차지하도록 하는 정제된 접합 생성물에 대한 평균 부하량이고,
(X-W)m은 세포독성 약물 유도체이다.
한 양태에서, 본 발명의 접합체는 (1) 단백질성 운반체에 대해 4.5 내지 11중량%인 세포독성 약물 유도체를 단백질성 운반체에 첨가하는 단계, (2) 비친핵성 단백질 혼화성 완충 용액(pH 범위 7 내지 9)중에서 세포독성 약물 유도체와 단백질성 운반체를 항온처리하여 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체를 제조하는 단계(여기서, 당해 용액은 (a) 유기 조용매 및 (b) 하나 이상의 C6-C18 카복실산 또는 이의 염을 포함하는 첨가제를 추가로 포함하고 당해 항온처리는 약 15분 내지 24시간 동안 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수행한다) 및 (3) 단계 (2)에서 제조된 접합체를 크로마토그래피 분리 공정에 도입시켜, 세포독성 약물의 부하량 범위가 4 내지 10중량%이고 저접합 분획(LCF)이 10% 미만인 단량체성 세포독성 약물 유도체/단백질성 운반체 접합체를 비접합된 단백질성 운반체, 세포독성 약물 유도체 및 응집된 접합체로부터 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 한 측면에서, 접합체의 단백질성 운반체는 호르몬, 성장 인자, 항체, 항체 단편, 항체 모사체 및 이들의 유전학적으로 또는 효소학적으로 조작된 대응물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 단백질성 운반체는 항체이다. 바람직한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab)2 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 사람화 항체는 세포 표면 항원 CD22에 대해 지시된다.
바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 CDR-이식된 항체이고 경쇄 가변 영역 5/44-gL1(서열 19) 및 중쇄 가변 영역 5/44-gH7(서열 27)을 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 28의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 30의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 28의 서열을 갖는 경쇄 및 서열 30의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
또 다른 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 친화도 성숙 프로토콜(affinity maturation protocol)에 의해 수득된 변이체 항체이고 사람 CD22에 대한 특이성이 증가된 CDR-이식된 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체를 제조하는데 사용된 세포독성 약물은 튜불린 중합의 억제제, DNA에 결합하여 이를 파괴시키는 알킬화제, 단백질 합성 억제제 또는 티로신 키나제의 억제제이다.
한 양태에서, 세포독성 약물은 칼리치아미신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 에스페라미신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테린 및 메이탄시노이드로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 세포독성 약물은 칼리치아미신이다. 특히, 바람직한 양태에서, 칼리치아미신은 감마 칼리치아미신 또는 N-아세틸 감마 칼리치아미신 유도체이다.
여전히 또 다른 측면에서, 세포독성 약물은 3-머캅토-3-메틸 부타노일 하이드라지드로 작용화되고 표적 세포에 결합하여 표적 세포내로 진입한 후 접합체로부터 세포독성 약물을 방출시킬 수 있는 가수분해성 링커를 통해 단백질성 운반체에 접합된다.
본 측면의 바람직한 양태에서, 가수분해성 링커는 4-(4-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 옥탄산 또는 이의 염, 또는 데칸산 또는 이의 염이 응집을 감소시키고 약물 부하량을 증가시키기 위해 접합 공정 동안에 첨가제로서 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 접합체는 크로마토그래피 분리 공정에 의해 정제된다.
한 양태에서, 단량체성 약물 유도체-운반체 접합체를 분리하는데 사용되는 크로마토그래피 분리 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)이다.
또 다른 양태에서, 단량체성 약물 유도체-운반체 접합체를 분리하는데 사용되는 크로마토그래피 분리 방법은 HPLC, FPLC 또는 세파크릴-S-200 크로마토그래피이다.
바람직한 양태에서, 단량체성 약물 유도체-운반체 접합체를 분리하는데 사용되는 크로마토그래피 분리 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이다. 특히 바람직한 양태에서, HIC는 페닐 세파로스 6 고속류 크로마토그래피 매질, 부틸 세파로스 4 고속류 크로마토그래피 매질, 옥틸 세파로스 4 고속류 크로마토그래피 매질, 토요펄 에테르-650M 크로마토그래피 매질, 마크로-프렙 메틸 HIC 매질 또는 마크로-프렙 t-부틸 HIC 매질을 사용하여 수행된다. 보다 특히 바람직한 양태에서, HIC는 부틸 세파로스 4 고속류 크로마토그래피 매질을 사용하여 수행된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체에 관한 것이다. 당해 측면의 바람직한 양태에서, 사용되는 세포독성 약물은 칼리치아미신이고 사용되는 운반체는 항체이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab)2 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 특히 바람직한 측면에서, 세포 표면 항원 CD22에 대해 지시된 사람화 항체가 사용된다.
한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 CDR-이식된 항체이고 경쇄 가변 영역 5/44-gL1(서열 19) 및 중쇄 가변 영역 5/44-gH7(서열 27)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 28의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 30의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 서열 28의 서열을 갖는 경쇄 및 서열 30의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 CDR-이식된 항체이다.
여전히 다른 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 사람 CD22에 대한 특이성을 증가시키는 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득된 변이 항체인 CDR-이식된 항체이다.
바람직한 양태에서, 칼리치아미신은 감마 칼리치아미신 또는 N-아세틸 감마 칼리치아미신이다.
한 양태에서, 칼리치아미신 유도체는 3-머캅토-3-메틸 부타노일 하이드라지드로 작용화된다.
또 다른 양태에서, 약물을 운반체에 접합시키는데 사용되는 링커는 표적 세포에 결합하여 표적 세포내로 진입한 후 접합체로부터 세포독성 약물을 방출시킬 수 있는 가수분해성 링커다. 바람직한 양태에서, 가수분해성 링커는 4-(4-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 Pr(-X-S-S-W)m(여기서, Pr은 항-CD22 항체이고; X는 항체와 반응할 수 있는 모든 반응성 그룹을 갖는 생성물을 포함하는 가수분해성 링커이고; W는 칼리치아미신 라디칼이고; m은 칼리치아미신이 접합체의 4 내지 10중량%를 차지하도록 하는 정제된 접합 생성물에 대한 평균 부하량이고; (-X-S-S-W)m은 본 발명의 방법에 의해 제조된 칼리치아미신 유도체이다)의 구조를 갖는 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체에 관한 것이다.
당해 측면의 한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab)2 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 항체는 사람 CD22에 대해 특이성을 갖고 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 도 1에 H1(서열 1)로서 기재한 서열, CDR-H2에 대해 도 1에 H2(서열 2), H2'(서열 13), H2''(서열 15) 또는 H2'''(서열 16)로서 기재한 서열 또는 CDR-H3에 대해 도 1에 H3(서열 3)으로서 기재한 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 도 1에 L1(서열 4)로서 기재한 서열, CDR-L2에 대해 도 1에 L2(서열 5)로서 기재한 서열 또는 CDR-L3에 대해 도 1에 L3(서열 6)으로서 기재한 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CD22 항체이다 .
또 다른 바람직한 양태에서, 항-CD22 항체는, 가변 도메인이
CDR-H1에 대해 서열 1에 기재된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2, 서열 13, 서열 15 또는 서열 16에 기재된 서열, 또는 CDR-H3에 대해 서열 3에 기재된 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 및 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4에 기재된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 기재된 서열 또는 CDR-L3에 대해 서열 6에 기재된 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 항-CD22 항체는 CDR-H1에 대한 서열 1, CDR-H2에 대한 서열 2, 서열 13, 서열 15 또는 서열 16, CDR-H3에 대한 서열 3, CDR-L1에 대한 서열 4, CDR-L2에 대한 서열 5 및 CDR-L3에 대한 서열 6을 포함한다.
또 다른 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 CDR-이식된 항-CD22 항체이고 사람 수용체 주쇄 영역 및 비사람 공여체 CDR를 포함하는 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는, 항체의 중쇄의 가변 도메인 영역이 사람 서브그룹 I 컨센서스(consenesus) 서열을 기초로 하고 1, 28, 48, 71 및 93번 위치에 비사람 공여 잔기를 포함하는 사람 수용체 주쇄를 갖는다. 다른 양태에서, 사람화 항체는 67 및 69번 위치에 비사람 공여 잔기를 추가로포함한다.
하나의 바람직한 양태에서, CDR-이식된 사람화 항체는 사람 서브그룹 I 컨센서스 서열을 기초로 하는 사람 수용체 주쇄 영역을 포함하고 2, 4, 37, 38, 45 및 60번 위치에 비사람 공여 잔기를 추가로 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, CDR-이식된 항체는 3번 위치에서 비사람 공여 잔기를 추가로 포함한다.
여전히 또 다른 양태에서, CDR-이식된 항체는 경쇄 가변 영역 5/44-gL1(서열 19) 및 중쇄 가변 영역 5/44-gH(서열 27)을 포함한다.
또 다른 양태에서, CDR-이식된 항체는 서열 28에 제시된 서열을 갖는 경쇄 및 서열 30에 제시된 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
여전히 또 다른 양태에서, CDR-이식된 항체는 서열 28에 제시된 서열을 갖는 경쇄 및 서열 30에 제시된 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, 항-CD22 CDR-이식된 항체는 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득된 변이 항체이고 사람 CD22에 대한 특이성이 증가되었다.
또 다른 양태에서, 항-CD22 항체는 각각 서열 7 및 서열 8에 제시된 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
또 다른 양태에서, 항-CD22 항체는 공여 CDR의 결실 부분이 상이한 서열로 대체되어 작용성 CDR을 형성하는 절두된 공여 CDR 서열을 갖는 하이브리드 CDR을 포함한다.
특히, 바람직한 양태에서, 세포독성 약물 유도체는 감마 칼리치아미신 또는 N-아세틸 감마 칼리치아미신 유도체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체의 안정한 동결건조된 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체의 안정한 동결건조된 조성물은 (a) 1.5 내지 5중량% 농도의 동결방지제, 0.5 내지 1.5중량% 농도의 중합체성 벌크제, 0.01M 내지 0.1M 농도의 전해질, 0.005 내지 0.05중량% 농도의 용해 촉진제, 용액의 최종 pH가 7.8 내지 8.2가 되도록 하는 5 내지 50mM 농도의 완충제 및 물을 포함하는 용액중에 최종농도가 0.5 내지 2mg/ml이 되도록 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체를 용해시키는 단계; (b) 상기 용액을 +5℃ 내지 +10℃의 온도에서 바이알에 분배하는 단계; (c) 당해 용액을 -35℃ 내지 -50℃의 동결온도에서 동결시키는 단게; (d) 동결된 용액을 24 내지 78시간 동안 -10℃ 내지 -40℃의 저장 온도에서 초기 건조 압력이 20 내지 80마이크론인 제1 동결 건조 단계에 적용시키는 단계 및 (e) 단계 (d)의 동결 건조 생성물을 15 내지 30시간 동안 +10℃ 내지 +35℃의 저장 온도에서 20 내지 80 마이크론의 건조 압력에서 2차 건조 단계에 적용하는 단계에 의해 제조된다.
한 양태에서, 세포독성 약물/운반체 접합체의 동결건조에서 사용되는 동결방지제는 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜, 알돈산, 우론산, 알다르산, 알도스, 케토스, 아미노당, 알디톨, 이노시톨, 글리세르알데하이드, 아라비노스, 리속스, 펜토스, 리보스, 크실로스, 갈락토스, 글루코스, 헥소스, 요도스, 만노스, 탈로스, 헵토스, 글루코스, 프럭토스, 글루콘산, 소르비톨, 락토스, 만니톨, 메틸 α-글루코피라노시드, 말토스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 소르보스, 글루카르산, 에리트로스, 트레오스, 아라비노스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 요도스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 크실룰로스, 프시코스, 타가토스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 슈크로스, 트레할로스, 뉴라민산, 아라비난, 프럭탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 크실란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀루란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로이틴, 데르마탄, 히알루론산, 알긴산, 크산탄 고무, 전분, 슈크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 펜타에리트리톨로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 동결방지제는 슈크로스이고 1.5중량%의 농도로 존재한다.
한 양태에서, 동결건조 공정 동안에 사용되는 중합체성 벌크제는 덱스트란 40 또는 하이드록시에틸 전분 40으로부터 선택되고 0.9중량%의 농도로 존재한다.
또 다른 양태에서, 동결건조 용액에 사용되는 전해질은 염화나트륨이고 0.05M의 농도로 존재한다.
바람직한 양태에서, 용해 촉진제는 동결건조 공정 동안에 사용된다. 바람직하게, 용해 촉진제는 계면활성제이다. 특히 바람직한 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고 0.01중량%의 농도로 존재한다.
한 양태에서, 사용되는 완충제는 0.02M의 농도로 존재하는 트로메타민이다. 용액의 pH는 동결건조 공정의 출발시에 8.0인 것이 바람직할 수 있다. 세포독성 약물/운반체 접합체를 함유하는 용액은 과정을 개시하기 전에 +5℃의 온도에서 바이알에 분배된다.
바람직한 양태에서, 바이알중의 용액은 -45℃의 온도에서 동결되고 동결된 용액은 60시간 동안 1차 건조 압력 60마이크론 및 -30℃에서 제1 동결 건조 단계에 적용되며 동결 건조된 생성물은 24시간 동안 +25℃의 저장 온도 및 60마이크론의 건조 압력에서 2차 건조 단계에 적용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 치료학적 유효량의 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체내의 운반체는 호르몬, 성장 인자, 항체 및 항체 모사체로부터 선택되는 단백질성 운반체이다.
바람직한 양태에서, 단백질성 운반체는 사람 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사함 항체 또는 사람화 항체이다.
바람직한 양태에서, 사람화 항체는 세포 표면 항원 CD22에 대해 지시된다.
특히 바람직한 본 발명의 이러한 측면의 양태에서, 항-CD22 항체는 사람 CD22에 대해 특이성을 갖고 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 도 1에 H1(서열 1)로서 기재한 서열, CDR-H2에 대해 도 1에 H2(서열 2), H2'(서열 13), H2''(서열 15) 또는 H2'''(서열 16)로서 기재한 서열 또는 CDR-H3에 대해 도 1에 H3(서열 3)으로서 기재한 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 도 1에 L1(서열 4)로서 기재한 서열, CDR-L2에 대해 도 1에 L2(서열 5)로서 기재한 서열 또는 CDR-L3에 대해 도 1에 L3(서열 6)으로서 기재한 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CD22 항체이다 .
또 다른 바람직한 양태에서, 항-CD22 항체는 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 기재된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2, 서열 13, 서열 15 또는 서열 16에 기재된 서열, 또는 CDR-H3에 대해 서열 3에 기재된 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 및 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4에 기재된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 기재된 서열 또는 CDR-L3에 대해 서열 6에 기재된 서열 중 하나 이상을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 항-CD22 항체는 CDR-H1에 대한 서열 1, CDR-H2에 대한 서열 2, 서열 13, 서열 15 또는 서열 16, CDR-H3에 대한 서열 3, CDR-L1에 대한 서열 4, CDR-L2에 대한 서열 5 및 CDR-L3에 대한 서열 6을 포함한다.
특히 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 CDR-이식된 사람화 항-CD22 항체이고 경쇄 가변성 영역 5/44-gL1(서열 19) 및 중쇄 가변성 영역 5/44-gH7(서열 27)을 포함한다.
또 다른 특히 바람직한 양태에서, 사람화 항-CD22 항체는 사람 CD22에 대해 특이성을 갖는 CDR-이식된 항체이고 서열 28의 서열을 갖는 경쇄 및 서열 30의 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, CDR-이식된 항체는 사람 CD22에 대한 특이성이 증가된 변이 항체이고 당해 항체는 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득된다.
한 양태에서, 단량체성 세포독성 약물은 칼리치아미신이고 바람직하게 감마 칼리치아미신 또는 N-아세틸 칼리치아미신으로부터 선택된다.
한 양태에서, 당해 조성물은 임의로 추가의 생활성 제제를 함유할 수 있다. 당해 생활성 제제는 세포독성 약물, 성장인자 또는 호르몬일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 치료학적 유효량의 조성물을 피험자에게 투여함에 의해 증식성 질환을 앓는 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 조성물은 피하내, 복막내, 정맥내, 동맥내, 골수내, 경막내, 경진피(transdermal), 경피(transcutaneous), 비강내, 국소, 장내, 질내, 설하내 또는 직장 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 정맥내로 투여된다.
한 양태에서, 당해 조성물은 암과 같은 증식성 질환을 앓고 있는 사람 피험자에게 투여된다. B-세포 악성종양은 세포 표면 항원 CD22를 발현하는 백혈병 또는 림프종일 수 있다.
여전히 또 다른 양태에서, 암은 암종 또는 육종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성종양을 갖는 환자에게 본 발명의 세포독성 약물-항-CD22-항체 접합체를 포함하는 치료학적으로 유효량의 조성물을 투여함에 의해 B-세포 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, B-세포 악성종양은 림프종, 특히, 비-호지킨 림프종이다.
한 양태에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용되는 세포독성 약물은 칼리치아미신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 메이탄시노이드 및 에스페라미신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 세포독성 약물은 감마 칼리치아미신 또는 N-아세틸 칼리치아미신이다.
또 다른 양태에서, 당해 치료는 항체, 성장 인자, 호르몬, 사이토킨, 항호르몬, 크산틴, 인터류킨, 인터페론 및 세포독성 약물로부터 선택되는 하나 이상의 생물활성 제제와 함께 본 발명의 세포독성 약물 접합체를 투여함을 포함한다.
바람직한 양태에서, 생활성 제제는 항체이고 B-세포 악성종양에서 발현되는 세포 표면 항원에 대해 지시되어 있다. 추가의 바람직한 양태에서, B-세포 악성종양 상에 발현된 세포 표면 항원에 대해 지시된 항체는 항-CD19, 항-CD20 및 항-CD33 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 당해 항체는 항-CD20 항체인 리툭시마브(RituxanTM)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 생활성 제제는 사이토킨 또는 성장 인자이고 인터류킨 2(IL-2), TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 생활성 제제는 호르몬이고, 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스틴 및 코르티코스테로이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 생활성 제제는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피타루비신, 발루비신, 시타라빈, 겜시타빈, 트리플루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 고우게로틴, 푸로마이신, 테가푸르, 티조푸린, 아드리아마이신, 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로레타민, 프레드니손, 프로카바진, 메토트렉세이트, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔, 탁솔 유사체 및 미토마이신으로부터 선택되는 세포독성 약물이다.
바람직한 양태에서, 세포독성 약물-항-CD22 항체 접합체의 치료학적으로 유효한 조성물은 치료 처방의 일부로서 CHOPP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); COP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손); CAP-BOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손); m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린); ProMACE-MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 시타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴); MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린); MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 데카르바진); ABV(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진);ChIVPP(클로르암부실, 빈블라스틴, 프로카바진 및 프레드니손); IMVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); DHAP(덱사메타손, 고용량 시타리빈 및 시스플라틴); ESHAP(에토포시드, 메틸프레드니손, 고용량 시타라빈 및 시스플라틴); CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신); CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손) 및 CVP-1(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손)로부터 선택되는 세포독성 제제의 병용제제 하나 이상과 함께 투여한다.
바람직한 양태에서, 세포독성 약물-항-CD22-항체 접합체의 치료학적으로 유효한 조성물은 세포독성 약물의 상기 병용제제 하나 이상을 투여하기 전에 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 치료학적 유효량의 세포독성 약물 항-CD22-항체 접합체의 조성물은 치료 처방의 일부로서 세포독성 약물의 상기 병용제제 하나 이상을 투여한 다음 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 림프종의 치료를 필요로 하는 환자에게 단량체성 칼리치아미신 유도체 항-CD22-항체 접합체의 치료학적으로 유효한 조성물을 하나 이상의 생활성 제제와 함께 투여함을 포함하는, 악성 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 암과 같은 증식성 질환을 앓는 피험자의 치료시에 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 특히, 암은 세포 표면상에 CD22 항원을 발현하는 B-세포 악성종양이다. 특히, B-세포 악성종양은 백혈병 또는 림프종이다. 한 양태에서, 암은 암종 또는 육종이다.
한 양태에서, 치료학적 유효량의 조성물은 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 골수내, 경막내, 경진피, 경피, 비내, 국소, 장내, 질내, 설하 또는 직장 투여된다.
바람직한 양태에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 비-호지킨 림프종과 같은 B-세포 악성종양을 앓는 피험자의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체의 용도에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체는 하나 이상의 생활성 제제와 함께 투여된다.
한 양태에서, 생활성 제제는 항체, 성장 인자, 호르몬, 사이토킨, 항호르몬, 크산틴, 인터류킨, 인터페론 및 세포독성 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 생활성 제제는 항-CD19, 항-CD20 및 항-CD33 항체와 같은 B-세포 악성종양 상에서 발현되는 세포 표면 항원에 대해 지시된 항체이다. 바람직한 양태에서, 항-CD20 항체는 리툭시마브(RituxanTM)이다.
또 다른 양태에서, 생활성 제제는 인터류킨 2(IL-2), TNF, CSF, GM-CSF 및 G-GSF와 같은 사이토킨 또는 성장 인자 또는 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스틴 및 코르티코스테로이드를 포함하는 호르몬을 포함한다.
또 다른 양태에서, 생활성 제제는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피타루비신, 발루비신, 시타라빈, 겜시타빈, 트리플루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 고우게로틴, 푸로마이신, 테가푸르, 티아조푸린, 아드리아마이신, 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로레타민, 프레드니손, 프로카바진, 메토트렉세이트, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔, 탁솔 유사체 및 미토마이신으로부터 선택된 세포독성 약물이다.
바람직한 양태에서, 치료학적 유효량의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체는 치료 처방의 일부로서 세포독성제의 병용제제 하나 이상과 함께 투여되고, 이때 세포독성제의 병용제제는 CHOPP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); COP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손); CAP-BOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손); m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린); ProMACE-MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 시타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴); MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린); MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 데카르바진); ABV(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ChIVPP(클로르암부실, 빈블라스틴, 프로카바진 및 프레드니손); IMVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); DHAP(덱사메타손, 고용량 시타리빈 및 시스플라틴); ESHAP(에토포시드, 메틸프레드니손, 고용량 시타라빈 및 시스플라틴); CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신); CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손) 및 CVP-1(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), ESHOP(에토포시드, 메틸프레드니손, 고용량 시타라빈, 빈크리스틴 및 시스플라틴); EPOCH(일시 투여량의 사이클로포스파미드 및 경구 프레드니손과 함께 96시간 동안 에토포시드, 빈크리스틴 및 독소루비신), ICE(이포스파미드, 사이클로포스파미드 및 에토포시드), CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신), CHOP-B(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 블레오마이신), CEPP-B(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진 및 블레오마이신) 및 P/DOCE(에피루비신 또는 독소루비신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드 및 프레드니손)로부터 선택된다.
하나의 바람직한 양태에서, 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체는 치료 처방의 일부로서 세포독성제의 병용제제 하나 이상을 투여하기 전에 투여된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 치료학적 유효량의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체는 치료 처방의 일부로서 세포독성제의 병용제제 하나 이상을 투여한 후에 투여된다.
여전히 또 다른 바람직한 양태에서, 치료학적 유효량의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체는 치료 처방의 일부로서 세포독성제의 병용제제 하나 이상을 임의로 포함하고 B-세포 악성종양상의 세포 표면 항원에 대해 지시된 항체와 함께 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 증식성 질환을 치료하기 위한 약물의 제조시 본 발명의 단량체성 칼리치아미신 유도체/항-CD22 항체 접합체의 용도에 관한 것이다. 당해 의약은 단독으로 또는 기타 생활성 제제와 배합하여 B-세포 증식성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
도 1은 마우스 모노클로날 항체 5/44의 CDR의 아미노산 서열(서열 1 내지 6)을 나타낸다.
도 2는 마우스 모노클로날 항체 5/44의 경쇄 가변성(VL) 도메인의 DNA 및 단백질 서열을 나타낸다.
도 3은 마우스 모노클로날 항체 5/44의 중쇄 가변성 도메인(VH)의 완전한 서열을 나타낸다.
도 4는 CDR-H2에서 글리코실화 부위 및 반응성 라이신의 제거를 위한 전략을 도시하고 있다.
도 5는 5/44 경쇄 서열의 이식 디자인을 도시한다. DPK-9는 사람 생식선 수용체 주쇄 서열이다. 수직선은 마우스와 사람 잔기간의 차이를 지적한다. 밑줄친 서열은 이식체내에 유지되는 공여 잔기를 지적한다. CDR은 굵은 이탤릭체로 표시한다(DPK-9에 대해서는 나타내지 않음). 이식체 gL1은 6개의 공여 주쇄 잔기를 갖고 gL2는 7개의 공여 주쇄 잔기를 갖는다.
도 6은 5/44 중쇄 서열에 대한 이식 디자인을 나타낸다. DP7은 사람 생식선 수용체 주쇄 서열이다. 수직선은 마우스와 사람 잔기간의 차이를 나타낸다. 밑줄친 서열은 이식체내에 유지되는 공여 잔기를 나타낸다. CDR은 굵은 이탤릭체로 나타낸다(DP7에 대해 나타내지 않음). 이식체 gH4 및 gH6은 6개의 공여 주쇄 잔기를 나타낸다. 이식체 gH5 및 gH7은 4개의 공여 주쇄 잔기를 갖는다.
도 7은 벡터 pMRR14의 지도를 도시한다.
도 8은 벡터 pMRR10.1의 지도를 도시한다.
도 9는 키메라 5/44 돌연변이체의 바이아코어 분석 결과를 도시한다.
도 10은 5/44 gH1 및 gL1 유전자 어셈블리에 대한 올리고뉴클레오타이드를 도시한다.
도 11은 중간체 벡터 pCR2.1(544gH1)의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 12는 중간체 벡터 pCR2.1(544gL1)의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 13은 추가의 이식체를 제조하는데 사용되는 올리고뉴클레오타이드 카셋트를 도시한다.
도 14는 혈광 표지된 마우스 5/44 항체 및 이식된 변이체 간의 경쟁 분석을 나타내는 그래프이다.
도 15는 형광 표지된 마우스 5/44 항체 및 이식된 변이체 간의 경쟁 분석을 나타내는 그래프이다.
도 16은 이식된 중쇄 및 경쇄의 완전한 DNA 및 단백질 서열을 도시한다.
도 17은 항체-NAc-감마 칼리치아미신 DMH 접합체의 도식적 설명이다.
도 18은 RAMOS B-세포 림프종의 성장에 대한 CMC-544의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 누드 마우스에서 생체내 이종이식편 모델에서 거대 B-세포 림프종에 대한 CMC-544의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 RL 림프종의 성장에 대한 CMA-676 접합 방법 및 CMC-544 접합 방법으로 제조된 CMC-544의 효과를 비교하는 그래프이다.
도 21은 리툭시마브(RituxanTM)-처리된 거대 RL 림프종이 CMC-544 처리에 민감함을 보여주는 그래프이다.
도 22는 CMC-544의 세포독성 효과에 대한 리툭시마브(RituxanTM)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 23은 범발성 조기 RAMOS B 림프종을 갖는 SCID 마우의 생존에 대한 CMC-544, 리툭시마브(RituxnTM) 및 CMA-676의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 24는 범발성 후기 RAMOS B 림프종을 갖는 SCID 마우스의 생존에 대한 CMC-544, 리툭시마브(RituxanTM) 및 CMA-676의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 25는 범발성 후기 RAMOS B 림프종을 갖는 SCID 마우스 생존에 대한 CMC-544, 리툭시마브(RituxanTM) 및 CMA-676의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 범발성 후기 RAMOS B 림프종을 갖는 SCID 마우스 생존에 대한 CMC-544, 리툭시마브(RituxanTM) 및 CMA-676의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 범발성 후기 RAMOS B 림프종을 갖는 SCID 마우스 생존에 대한 CMC-544, 리툭시마브(RituxanTM) 및 CMA-676의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 28은 리툭시마브(RituxanTM)의 존재 및 부재하에 RL 비-호지킨 림프종에 대한 CMC-544의 항종양 활성을 나타내는 그래프이다.
도 29는 RL 비-호지킨 림프종에 대한 CMC-544 및 CHOP의 항종양 활성을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 접합체는 약물 유도체-단백질성 운반체 접합체를 형성하기 위해 단백질성 운반체와 반응하는 임의의 반응 그룹을 포함하는 링커로 유도체화된 세포독성 약물을 포함한다. 특히, 본 발명의 접합체는 세포독성 약물 유도체-항체 접합체를 형성하기 위해 단백질성 운반체로서 사용되는 항체와 반응하는 임의의 반응 그룹을 포함하는 링커로 유도체화된 세포독성 약물을 포함한다. 특히, 항체는 B-세포 악성종양상의 세포 표면 항원에 대해 반응한다. 당해 접합체를 제조하고 정제하기 위한 개선된 방법이 하기에 기재된다. 특정 조용매, 첨가제 및 특수한 반응 조건과 함께 분리 공정의 사용은 LCF가 상당히 감소된 단량체성 세포독성 약물 유도체/항체 접합체를 형성시킨다. 응집된 형태와는 반대로 단량체 형태는 상당한 치료학적 가치를 갖고, LCF의 최소화 및 응집의상당한 감소는 LCF가 보다 고도로 접합된 분획(HCF)과 경쟁하는 것을 차단함으로써 치료학적으로 의미있는 방식으로 항체 출발 물질을 사용할 수 있도록 한다.
1. 운반체
본 발명의 운반체/표적화 제제는 바람직하게는 단백질성 운반체/표적화 제제이다. 운반체/표적화 제제로서는, 호르몬, 성장 인자, 항체, 항체 단편, 항체 모사체 및 이들의 유전학적으로 또는 효소학적으로 조작된 대응물이 포함되고 이들은 이후부터 단수 또는 그룹으로서 "운반체"로 언급된다. 운반체의 필수 성질은 목적하지 않은 세포와 연합되는 항원 또는 수용체를 인지하고 결합한 후 세포내 도입되는 능력이다. 본 발명에 적용될 수 있는 운반체의 예는 전반적으로 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,053,394호에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기 위해 바람직한 운반체는 항체 및 항체 모사체이다.
다수의 비면역글로불린 단백질 스캐폴드(scaffold)는 항체 특이성을 갖는, 항원 에피토프와 결합하는 항체 모사체를 제조하기 위해 사용되어 왔다[문헌참조: PCT 공개 번호 제WO 00/34784호]. 예를 들어, 면역글로불린 폴딩과 관련된 "소형체(minibody)" 스캐폴드는 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인으로부터 3개의 베타 쇄를 결실시킴에 의해 디자인되었다[문헌참조: Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994]. 당해 단백질은 61개의 잔기를 포함하고 2개의 초가변 루프를 제시하는데 사용될 수 있다. 이들 2개의 루프는 무작위화되었으며 항원 결합에 대해 선택된 생성물이지만, 지금까지 당해 주쇄는 용해도 문제로 인해 그 유용성이 어느 정도 제한된 것으로 간주된다. 루프를 나타내는데 사용되는 또 다른 주쇄는 포유동물 알파-아밀라제를 특이적으로 억제하고, 2개의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 74개의 잔기의 6개의 쇄 베타 쉬트 샌드위치인 단백질인 텐다미스태트(tendamistat)이다[문헌참조: McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995]. 당해 스캐폴드는 3개의 루프를 포함하지만 지금까지 이들 루프중에 2개만이 무작위화 잠재성에 대해 조사되었다.
기타 단백질은 주쇄로서 시험되었고 알파 나선 표면[참조 문헌: Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995], 알파 나선 번들내 알파 나선들 간의 루프[참조 문헌: Ku and Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552] 및 소형 프로테아제 억제제의 루프와 같은 디설피드 브릿지에 의해 억압된 루프[문헌참조: Markland et al., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland et al., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen and Collins, Gene 164;243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995]상의 무작위 잔기를 나타내는데 사용되었다.
본 발명에 사용될 수 있는 항체 운반체의 예는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화 항체, 사람 항체 및 이의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 바람직하게, 당해 항체는 암과 같은 증식성 질환 상태인 표적 세포 및/또는 조직상에 발현된 세포 표면 항원에 대해 지시된다. 표적 세포상에서 세포 표면 항원에 대해 지시된 특이적 항체의 예는 대부분의 B-세포 림프종에서 과발현되는 CD22 항원에 대한 항체; 쥐 항-CD22 모노클로날 항체의 사람화된 형태인 G5/44; 특정 사람 골수 종양, 특히 급성 골수 백혈병에 만연되어 있는 세포 표면 항원 CD33에 대한 항체; 항-CD33 쥐 항체의 사람화된 형태인 hP67.6[참조: 미국 특허 제5,773,001호]; mP67.6으로 지정된 상피 기원의 많은 종양에서 발견되는 PEM 항원에 대한 항체[참조 문헌: I.D. Bernstein et al., J. Clin. Invest. 79:1153(1987) and I.D. Bernstein et al., J. Immunol. 128:867-881(1992)]; 및 hu3S193으로 지정된 많은 고형 종양에서 과발현되는 루이스 Y 탄수화물 항원에 대한 사람화 항체[참조 문헌: 미국 특허 제6,310,185 B1]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 운반체/표적화 제제로서 또한 사용될 수 있는 리툭시마브(RituxanTM) 및 트라스투주마브(Trastuzumab)(HerceptinTM)와 같은 여러 시판되는 항체가 있다. 리툭시마브(RituxanTM)는 다양한 B-세포 림프종을 치료하는데 사용되는 키메라 항-CD20 항체이고 트라스투주마브(HerceptinTM)는 유방암을 치료하기 위해 사용되는 사람화 항-Her2 항체이다.
세포 표면 항원 CD22에 대해 유도된 CDR-이식된 사람화 항체 분자(G5/44로 명명)가 본 발명에서 운반체로서 사용하기 위한 것으로 본원에서 예시된다. 이 항체는, 특정 사람 림프종에서 일반적인, 세포 표면 항원 CD22에 대해 유도된 쥐 항-CD22 모노클로날 항체의 사람화 형태이다. 본원에서 사용된 "CDR-이식된 항체 분자"란 용어는, 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체 항체(예: 사람 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 주쇄로 이식된, 공여체 항체(예: 쥐 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)(경우에 따라 변형된 CDR(이후 CDR) 포함)을 함유하는 항체 분자를 말한다. 바람직하게는, 이러한 CDR-이식된 항체는 사람 수용체 주쇄 영역 뿐만 아니라 하나 이상의 위에서 언급된 공여체 CDR을 포함하는 가변 도메인을 가진다.
CDR이 이식되는 경우, CDR이 유래되는 공여체 항체의 계열/유형을 고려하여 모든 적당한 수용체 가변 영역 주쇄 서열, 예를 들면 마우스, 영장류 및 사람 주쇄 영역이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 사람 주쇄의 예로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM[참조 문헌: Kabat et al. Seq. of Proteins of Immunol. Interest, 1: 310-334 (1994)]. 예를 들면, KOL 및 NEWM을 중쇄로 사용될 수 있고, REI은 경쇄로 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄로 사용될 수 있다.
본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 공여체 항체의 쇄와 동종성인 쇄를 갖는 것을 수용체 항체로서 사용하는 것이 바람직하다. 수용체 중쇄 및 경쇄가 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 경우에 따라 상이한 쇄로부터 유래된 주쇄 영역을 갖는 혼성 쇄를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 주쇄 영역은 수용체 항체의 서열과 정확하게 동일한 서열을 가질 필요가 없다. 예를 들면, 통상적이지 않은 잔기가 수용체 쇄 계열 또는 유형에서 보다 흔히 존재하는 잔기로 변화될 수 있다. 달리, 수용체 주쇄 영역에서 선택된 잔기는, 이들이 공여체 항체내의 동일한 위치에서 발견되는 잔기 또는 공여체 항체내의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 대한 보존적 치환인 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다. 이러한 변화는 공여체 항체의 친화도를 회복하는데 필요한 최소한도로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있는 수용체 주쇄 영역중에서 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 본원에서 이의 전문이 참조로 인용된 PCT 공보 제WO 91/09967호에 기술되어 있다.
공여체 잔기는 공여체 항체, 즉 CDR이 본래 유래된 항체로부터의 잔기이다.
본 발명의 항체는, 가변 도메인이 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위하여 잠재적인 글리코실화 부위 서열이 제거되어진 H2'를 CDR-H2 (Kabat 등의 상기 참조 문헌으로부터 정의된 바와 같음)로서 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.
달리 또는 추가로, 본 발명의 항체는, 가변 도메인이 리신 잔기가 60번 위치에 존재하는 H2"를 CDR-H2(Kabat 등의 상기 참조 문헌으로부터 정의된 바와 같음)로서 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. CD-H2내의 노출된 부위에 위치하고 항원 결합 친화도의 감소를 유발하는 접합제와의 반응 잠재력을 갖는 것으로 여겨지는 상기 리신 잔기가 또 다른 아미노산으로 치환된다.
또한, 본 발명의 항체는, 가변 도메인이 잠재적 글리코실화 부위 서열 및 60번 위치의 리신 잔기가 모두 또 다른 아미노산으로 치환된 H'"를 CDR-H2 (Kabat 등의 상기 참조 문헌으로부터 정의된 바와 같음)로서 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 다음을 포함할 수 있다: 전체 길이의 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체; Fab, 변형된 Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편과 같은 이의 생물학적 활성 단편; 경쇄 또는 중쇄 단량체 또는 이량체; 또는 단일쇄 항체, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv. 유사하게, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 경우에 따라 다른 항체 도메인과 조합될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 효과인자 또는 리포터 분자가 중쇄의 C-말단에 부착할 수 있도록 하는 하나 이상의 아미노산이 첨가되는 변형을 갖는 변형된 Fab 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 아미노산은 변형된 힌지(hinge) 영역을 형성하는데, 이러한 힌지 영역은 효과인자 또는 수용체 분자가 부착될 수 있는 1 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유한다.
본 발명의 항체의 불변 영역 도메인이 존재하는 경우, 이는 항체의 제안된 작용, 특히 요구되거나 되지 않을 수 있는 효과인자 작용(effector function)을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 사람 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인 일 수 있다. 특히, 항체가 치료적 용도로 의도되고 항체 효과인자 작용이 요구되는 경우에, 사람 IgG 불변 영역 도메인, 특별히 IgG1 및 IgG3 이소형(isotype)의 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 달리, 항체가 치료적 용도로 의도되고 항체 효과인자 작용이 요구되지 않거나 요망되지 않는 경우에, IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있거나, IgG1 Fc 영역을 돌연변이시켜 항체 효과인자 작용을 제거할 수 있다.
본 발명의 항체는 5x10-8 M 이상, 바람직하게는 1x10-9 M 이상, 보다 바람직하게는 0.75x10-1 M 이상, 가장 바람직하게는 0.5x10-10 M 이상의 결합 친화도를 갖는다.
하나의 양태로, 본 발명은 면역독소 접합체 및 항체 변이체 또는 항체 모사체를 사용하여 이들 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 변이체는 CD22에 대해 지시되고, CD22에 대해 향상된 친화도를 나타낸다. 이러한 변이체는 수많은 친화도 성숙 프로토콜, 예를 들면 CDR 돌연변이화[참조 문헌: Yang et al., J. Mol.Biol., 254, 392-403, 1995], 쇄 셔플링(shuffling)[참조 문헌: Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992], 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이원 균주의 사용[참조 문헌: Low et al., J. Mol.Biol., 260, 359-368, 1996], DNA 셔플링[참조 문헌: Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997] 파아지 디스플레이[참조 문헌: Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996], 및 유성(sexual) PCR[참조 문헌: Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998]에 의해 수득될 수 있다.
모든 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은, 본 발명의 항체를 포함하는 운반체를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 세균, 예를 들면 이. 콜라이 및 기타 미생물 시스템이 항체 단편, 예를 들면 Fab 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편 및 단일쇄 항체 단편, 예를 들면 단일쇄 Fv의 발현에 부분적으로 사용될 수 있다. 진핵생물(예를 들면 포유동물)의 숙주 세포 발현 시스템이 완전한 항체 분자를 포함한 거대 항체의 생산에 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, 골수종, 효모 세포, 곤충 세포, 하이브리도마 세포, NSO, VERO, 또는 PEP C6 세포 등이 있다. 적합한 발현 시스템은 또한 유전자전이된(transgenic) 동물 및 식물을 포함한다.
II. 치료제
본 발명에서 사용하기에 적합한 치료제로는, 튜불린 중합을 억제하거나 파괴하는 세포독성 약물, DNA에 결합하여 파괴하는 알킬화제, 단백질 합성을 억제하거나 필수 세포 단백질, 예를 들면 단백질 키나제, 효소 및 사이클린을 억제하는 제제가 있다. 이러한 세포독성 약물의 예로는 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이라루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 칼리치아미신, 에스페라미신 및 마이탄시노이드가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 세포독성 약물은 칼리치아미신이며, 이는 메틸 트리설피드 항종양 항생제의 예이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 칼리치아미신의 예는 예를 들면 미국 특허 제4,671,958호, 미국 특허 제4,970,198호, 미국특허 제5,053,394호, 미국 특허 제5,037,651호; 및 미국 특허 제5,079,233호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 전문이 본원에 참조로 인용된다. 바람직한 칼리치아미신은 감마-칼리치아미신 유도체 또는 N-아세틸 감마-칼리치아미신 유도체이다.
III. 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체
본 발명의 접합체는 하기 화학식의 접합체이다.
Pr(-X-W)m
상기 화학식에서,
Pr은 단백질성 운반체이며,
X는 단백질성 운반체와 반응할 수 있는 임의의 반응성 그룹의 생성물을 포함하는 링커이고;
W는 세포독성 약물이고,
m은 칼리치아미신이 접합체의 4 내지 10중량%를 차지하도록 하는 정제된 접합 생성물에 대한 평균 부하량이며;
(-X-Wm)은 세포독성 약물이다.
바람직하게는, X는 화학식 (CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)=Q-Sp)을 가지며, 이때
Alk1 및 Alk2는 독립적으로 결합 또는 분지되거나 분지되지 않은 (C1-C10) 알킬렌 쇄이고;
Sp1은 결합, -S-,- O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N-, 또는 -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z [여기서, X, Y, 및 Z는 독립적으로 결합, -NR'-, -S- 또는-O- 이며, 단 n이 0인 경우 Y 및 Z 중 하나 이상은 결합이어야 하고, Ar'은 (C1-C5) 알킬, (C1-C4) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR'의 1, 2 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-페닐렌이다]이며, 단 Alk1이 결합인 경우에 Sp1은 결합이며;
n은 0 내지 5의 정수이고;
R'는 -OH, (C1-C4) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, (Cl-C3) 디알킬아미노 또는 (Cl-C3) 트리알킬암노뮴-A-[여기서, A-는 염을 완성시키는 약제학적으로 허용되는 음이온이다]의 1 또는 2개의 그룹으로 임의로 치환된, 분지되거나 분지되지 않은 (C1-C5) 쇄이며;
Ar은 (C1-C6) 알킬, (C1-C5) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' [여기서, n 및 R'는 앞서 정의된 바와 같다]의 1, 2, 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-페닐렌이거나, 또는 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- 또는 2,7-나프틸리덴 또는
Figure pat00001
이며, 이때 각각의 니프릴리덴 또는 페노티아진은 (C1-C6) 알킬, (C1-C5) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR' 또는 -S(CH2)nCONHR'[여기서, n 및 R'는 위에서 정의한 바와 같다]의 1, 2, 3 또는 4개의 그룹으로 임의로 치환되며, 단 Ar이 페노티아진인 경우에 Sp1은 질소에 연결된 결합이고;
Sp2는 결합, -S- 또는 -O- 이고, 단 Alk2가 결합인 경우에 Sp2는 결합이며;
Z1은 H, (C1-C5) 알킬, 또는 (C1-C5) 알킬, (C1-C5) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCONHR'- 또는 -S(CH2)nCONHR' [여기서, n 및 R'는 위에서 정의한 바와 같다]의 1, 2 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 페닐이며;
Sp는 직쇄 또는 분지쇄의 이가 또는 삼가 (C1-C18) 라디칼, 이가 또는 삼가 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼, 이가 또는 삼가 (C3-C18) 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이가 또는 삼가 아릴- 또는 헤테로아릴-아릴 (C1-C18) 라디칼, 이가 또는 삼가 사이클로알킬- 또는 헤테로알킬-알킬 (C1-C18) 라디칼 또는 이가 또는 삼가 (C2-C18) 불포화 알킬 라디칼이며, 이때 헤테로아릴은 바람직하게는 푸릴, 티에닐, N-메틸피롤릴, 피리디닐, N-메틸이미다졸릴, 옥사졸릴, 피리미디닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, N-메틸카바조일, 아미노쿠마리닐 또는 펜아지닐이고, Sp가 삼가 라디칼인 경우에 Sp는 추가로 저급 (Cl-C5) 디알킬아미노, 저급 (C1-C5) 알콕시, 하이드록시, 또는 저급 (C1-C5) 알킬티오 그룹으로 치환될 수 있고;
Q는 =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- 또는 =NHO-이다.
바람직하게는, Alk1은 분지되거나 분지되지 않은 (C1-C1O) 알킬렌 쇄이고;
Sp'은 결합, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, 또는 -NR' [여기서, R'는 위에서 정의한 바와 같다]이고, 단 Alk1이 결합인 경우에 Sp1은 결합이고;
Ar은 (C1-C6) 알킬, (C1-C5) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' [여기서, n 및 R'는 위에서 정의된 바와 같다]의 1, 2 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌이거나, Ar은 각각 (C1-C6) 알킬, (C1-C5) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR'의 1, 2 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- 또는 2,7- 나프틸리덴이고;
Z1는 (C1-C5) 알킬, 또는 (C1-C5) 알킬, (C1-C4) 알콕시, (C1-C4) 티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)NCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR'의 1, 2 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 페닐이며;
Alk2 및 Sp2는 함께 결합을 형성하고;
Sp 및 Q는 바로 위에서 정의된 바와 같다.
본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 제5,773,001호에는 칼리치아미신으로부터 제조된 친핵성 유도체, 특히 하이드라지드 및 관련 친핵체와 함께 사용될 수 있는 링커가 기재되어 있다. 이들 링커는, 약물과 링커 사이에 형성된 결합이 가수분해될 수 있을 때 보다 우수한 활성이 수득되는 경우에 특히 유용하다. 이들 링커는 2개의 작용 그룹을 함유한다. 통상적으로, 한 그룹은 운반체와 반응시키는데 활용될 수 있는 카복실산이다. 산 작용 그룹은, 적절히 활성화되는 경우에, 운반체의 유리 아민 그룹, 예를 들면 항체 또는 기타 단백질성 운반체의 리신 측쇄 중의 아민과 아미드 결합을 형성할 수 있다. 통상적으로, 나머지 작용 그룹은 적당히 변형된 치료제와 반응하는 카보닐 그룹, 즉 알데히드 또는 케톤이다. 카보닐 그룹은 약물 상의 하이드라지드 그룹과 반응하여 하이드라존 결합을 형성할 수 있다. 이러한 결합은 가수분해될 수 있어, 표적 세포에 결합된 후 접합체로부터 치료제가 방출될 수 있도록 한다.
본 발명에서 사용하기에 가장 바람직한 이작용성 링커는 4-(4-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)이며, 이로부터 접합체가 3-머캅토-3-메틸 부타노일 하이드라지드와의 반응에 의해 작용화되는 β-칼리치아미신, γ-칼리치아미신 또는 N-아세틸 γ-칼리치아미신, AcBut 링커 및 사람 또는 사람화 IgG 항체 표적화 운반체로 이루어진 바람직한 생성물이 수득된다.
IV. 단량체성 접합
칼리치아미신을 포함한 다수의 세포독성 약물의 천연 소수성 특성으로 인해, 치료학적 적용에 필수적인 합당한 수율 및 우수한 약물 부하량을 갖는 단량체성 약제 접합체를 제조하는데 어려움이 있다. 링커, 예를 들면 미국 특허 제5,773,001호에 기술된 AcBut 링커와 같은 링커에 의해 제공된 결합의 소수성 증가 뿐 아니라, 운반체 (항체)로부터 치료제를 분리하는 공유결합 거리의 증가는 상기 문제를 더욱 어렵게 만든다.
약물 부하량이 보다 높은 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체의 응집은 당해 약물의 소수성으로 인해 발생한다. 약물 부하량은 종종 적당한 양의 단량체성 생성물을 수득하기 위하여 제한되어야 한다. 어떤 경우, 예를 들면 미국 특허 제5,877,296호의 접합체를 사용하는 경우에, 과도한 응집으로 인하여, 미국 특허 제5,053,394호에 기술된 반응 조건을 사용하여 치료학적 적용에 유용한 부하량을 갖는 접합체를 유용한 수율로 제조하는 것이 곤란하다. 이들 반응 조건은 DMF를 접합 반응의 조용매로서 이용하였다. 따라서, 응집 및 재료의 고유 손실이 없이 고수준의 약물 부하량/수율을 가능케하는 방법이 요구된다.
응집을 감소시키는 개량법은, 본원에 이의 전문이 참조로 인용되는 미국 특허 제5,712,374호 및 제5,714,586호에 기재되어있다. 상기 특허들에는, 세포독성 치료제를 표적화하는데 사용되는 사람 또는 사람화 항체, 예를 들어, hP67.6 및 본원에 기술된 기타 사람화 항체와 같은 단백질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단백질성 운반체가 기재되어 있다. 이들 특허에서, (i) 프로필렌 글리콜을 조용매로서 함유하고 (ii) 하나 이상의 C6-C18 카복실산을 포함하는 첨가제를 함유하는 비-친핵성, 단백질-혼화성의 완충 용액을 사용하면, 일반적으로 약물 부하량/수율이 보다 높고 응집이 감소된 탁월한 활성의 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체가 생성된다는 것이 밝혀졌다. 상기 문헌에 기재된 바람직한 산은 C7 내지 C12 산이며, 가장 바람직한 산은 옥탄산(예를 들면, 카프릴산) 또는 이의 염이였다. N-하이드록시석신이미드 (Osu) 에스테르 또는 기타 필적하게 활성화된 에스테르로부터 제조된 접합체에 바람직한 완충 용액은 바람직하게는 포스페이트-완충 염수(PBS) 또는 N-2-하이드록시에틸 피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES 완충제)이였다. 이들 접합 반응에서 사용된 완충 용액은 유리 아민 또는 친핵체를 함유할 수 없다. 다른 유형의 접합체에 대하여, 허용되는 완충제가 쉽게 결정될 수 있다. 달리, 추가적 첨가제 없이 t-부탄올을 함유하는 비-친핵성, 단백질-혼화성의 완충 용액을 사용하면, 약물 부하량/수율이 보다 높고 응집이 감소된 단량체성 칼리치아미신 유도체/운반체 접합체가 생성된다는 것이 밝혀졌다.
단량체성 접합체를 형성하는데 필요한 조용매의 양은 단백질에 따라 다소 달라지며, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 단량체성 접합체를 효과적으로 형성하는데 필요한 첨가제의 양은 또한 항체에 따라 달라진다. 이러한 양은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 미국 특허 제5,712,374호 및 제5,714,586호에서, 프로필렌 글리콜은 총 용액의 10용적% 내지 60용적%, 바람직하게는 10용적% 내지 40용적%, 가장 바람직하게는 약 30용적% 범위의 양으로 첨가되고, 하나 이상의 C6-C18 카복실산 또는 이의 염, 바람직하게는 카프릴산 또는 이의 염을 포함하는 첨가제는 20mM 내지 100mM, 바람직하게는 40mM 내지 90mM, 가장 바람직하게는 약 60mM 내지 90mM 범위의 양으로 접합 반응물에 첨가되어, 약물 부하량/수율이 높고 응집이 감소된 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체를 생성하였다. 프로필렌 글리콜 이외에 다른 단백질-적합성 유기 조용매, 예를 들면 에틸렌 글리콜, 에탄올, DMF, DMSO 등이 사용될 수 있었다. 유기 조용매의 일부 또는 전부를 사용하여 약물을 접합 혼합물로 전이시켰다.
달리, 상기 특허들에서, C6-C18 카복실산 또는 이의 염의 농도는 150 내지 300nm까지 증가될 수 있으며, 조용매는 1 내지 10%로 감소되었다. 하나의 양태에서, 카복실산은 옥탄산 또는 이의 염이였다. 바람직한 양태에서, 카복실산은 데칸산 또는 이의 염이였다. 또 다른 바람직한 양태에서, 카복실산은 카프릴산 또는 이의 염이였고, 이는 5% 프로필렌 글리콜 또는 에탄올과 함께 200mM 카프릴산의 농도로 존재하였다.
또 다른 양태로서, 이들 특허에서, 총 용액의 10용적% 내지 25용적%, 바람직하게는 15용적% 범위의 농도에서 t-부탄올이 접합 반응물에 첨가되어, 약물 부하량/수율이 높고 응집이 감소된 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체가 생성될 수 있었다.
이러한 정립된 접합 조건은, 현재 MylotargTM으로서 시판되고 있는 CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin)의 형성에 적용되었다. 급성 골수 백혈병(AML)에 대한 이러한 치료제의 도입 이래로, 칼리치아미신이 항체에 균일하게 분포되지 않는다는 것은 이온-교환 크로마토그래피의 사용을 통해 알게되었다. 대부분의 칼리치아미신은 항체의 대략 절반에 존재하고, 나머지 반은 단지 소량의 칼리치아미신을 함유하는 LCF중에 존재한다. 따라서, 칼리치아미신과 같은 세포독성 약물을 운반체에 접합시키는 방법을 개선하여, 응집량을 최소화하고, 접합체 생성물의 수율을 현저히 향상시키면서 고수준의 균일한 약물 부하량을 가능케할 필요가 있다.
구체적인 예로는 G5/44-NAc-감마-칼리치아미신 DMH AcBut 접합체가 있으며, 이는 CMC-544로 지칭되며 도 17에 대략적으로 도시되어 있다. LCF의 양을 전체 항체의 10% 미만으로 감소시키는 것이 CMC-544의 개발을 위해 요구되며, LCF 수준의 감소를 위한 각종 선택사항이 고려되었다. 면역접합체의 기타 속성, 예를 들면 항원 결합 및 세포독성은 최종 용액에 의해 영향을 받지 않아야 한다. 고려된 선택사항에는 항체의 유전적 또는 물리적 변형, 크로마토그래피 분리 기법, 또는 반응 조건의 변형이 포함된다.
구식 반응 조건 (CMA-676 공정 조건)을 사용하여 G5/44 항체를 NAc-감마-칼리치아미신 DMH AcBut Osu와 반응시키면, CMA-676과 유사한 물리적 특성(약물 부하량, LCF 및 응집)을 갖는 생성물이 생성되었다. 그러나, 접합 후 존재하는 LCF의 고수준(50 내지 60%)은 바람직하지 않은 것으로 여겨졌다. 최적 반응 조건은, 주요 반응 변수, 예를 들면 온도, pH, 칼리치아미신 유도체 투입량, 및 첨가제 농도가 평가되어진 통계학적 실험 설계 방법을 통하여 결정되었다. 이들 실험의 분석을 통해, 칼리치아미신 투입량 및 첨가제 농도가 저접합 분획(LCF) 및 응집물 형성에 가장 현저하게 영향을 미치는 반면에, 온도 및 pH는 작은 영향을 미친다는 것이 입증되었다. 추가적 실험에서, 단백질성 운반체 (항체) 및 조용매(에탄올)의 농도가 LCF 및 응집물 수준을 제어하는데 있어서 마찬가지로 덜 중요하다는 것이 밝혀졌다. LCF를 10% 미만으로 감소시키기 위하여, 칼리치아미신 유도체 투입량을 반응물중의 항체의 양에 비례하여 3%로부터 8.5%로 증가시켰다. 첨가제를 200mM 농도의 옥탄산 또는 이의 염(CMA-676 공정)으로부터 37.5mM 농도의 데칸산 또는 이의 염으로 변화시켰다. 접합 반응은 다소 상승된 온도(30 내지 35℃) 및 pH(8.2 내지 8.7)에서 우수하게 진행하였다. 이러한 변화를 포함하는 반응 조건은 LCF를 10% 미만으로 저하시키면서, 칼리치아미신 부하량을 증가시켰고, 이후 이는 CMC-544 공정 조건 또는 "새로운" 공정 조건으로 지칭된다. CMA-676 및 CMC-544 공정 조건을 사용하여 수득된 결과의 비교가 표 1에 제시된다.
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칼리치아미신 투입량의 증가는 약물 부하량을 2.5 내지 3.0중량%로부터 7.0 내지 9.0(가장 통상적으로 7.5 내지 8.5)중량%로 증가시켰으며, 반응중에 단백질 응집의 증가를 초래하지 않았다. 응집물 및 LCF의 감소로 인하여, CMC-544 공정 조건에서 보다 균질한 생성물이 생성되었다. CMC-544는 다중-그램 항체 스케일(muti-gram antibody scale)에서 이러한 새로운 접합 방법에 의해 재현성있게 제조되었다.
전술한 반응에서, 항체의 농도는 1 내지 15mg/ml일 수 있으며 칼리치아미신 유도체, 예를 들면 N-아세틸 감마-칼리치아미신 DMH AcBut OSu 에스테르 (도 17에 도시된 접합체를 제조하기 위하여 사용됨)의 농도는 항체 중량의 약 4.5중량% 내지 11중량% 범위이다. 조용매는 에탄올이였으며, 이에 대한 우수한 결과가 6 내지 11.4%(용적 기준) 범위의 농도에서 입증되었다. 상기 반응을 PBS, HEPES, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)(HEPBS), 또는 기타 적합한 완충제 중에서, pH 8 내지 9 및 30℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도하에 15분 내지 24 시간 동안 수행하였다. 당업자는 다른 유형의 접합체에 대한 허용가능한 pH 범위를 쉽게 결정할 수 있다. 다양한 항체의 경우에, 전술한 첨가제의 병용제제를 다소 변화시켜 사용하면, 약물 부하량 및 단량체성 접합체 수율을 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 최적 결과를 수득하기 위하여 임의의 특정 단백질성 운반체가 엄격한 조건 또는 첨가제의 선택에 있어서 어떤 부수적인 변화를 요구할 수도 있다는 것을 이해하여야 한다.
V. 접합체 정제 및 분리
접합 후, 단량체성 접합체는 접합되지 않은 반응물 (예를 들면, 단백질성 운반체 및 유리 세포독성 약물/칼리치아미신) 및/또는 응집된 형태의 접합체로부터 통상의 방법, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 또는 크로마토집속(chromatofocusing)(CF)에 의해 분리될 수 있다. 정제된 접합체는 단량체성이고, 통상적으로 4 내지 10중량%의 세포독성 약물/칼리치아미신을 함유한다. 바람직항 양태에서, 접합체는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 정제한다. 이미 세포독성 약물/칼리치아미신-항체 접합체의 생산-규모의 제조용으로 사용된 공정(CMA-676 공정)에서, 유일하게 사용된 접합후 분리 단계는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)이였다. 이 단계는 응집된 접합체를 제거하고 제형화를 위한 완충제 교환을 수행하는데 있어서 상당히 효과적이였으나, LCF 함량을 감소시키는데는 비효과적이였다. 따라서, SEC-기반 공정은 최종 생성물의 LCF 함량을 조절하기 위하여 전적으로 접합 반응의 화학반응에 의존한다. SEC의 또 다른 단점은 칼럼에 적용되는 접합체 반응 혼합물의 용적이 제한된다는 것이다 (통상적으로 공정 칼럼 충전 용적의 5%를 초과하지 않음). 이는 주어진 제조 공간에서 허용될 수 있는 배치 크기 (및 이에 따른 제조 능력)을 심하게 제한한다. 최종적으로, SEC 정제 공정은 또한 접합체 용액의 현저한 희석을 초래하며, 이로 인해 제형화 중에 신뢰할 수 있을 정도로 수득될 수 있는 단백질 농도에 제약이 가해진다.
세포독성 약물이 칼리치아미신 유도체와 같이 고도의 소수성을 갖으며 접합체에 사용되는 경우, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 접합된 항체와 접합되지 않은 항체를 효과적으로 분리하기 위한 바람직한 크로마토그래피이다. HIC는 SEC에 비해 유리한 세가지의 주요 이점을 제공한다: (1) 이는 LCF 함량 및 응집물을 효과적으로 감소시킬 수 있는 능력을 가지며; (2) HIC의 칼럼 충전능이 훨씬 크며; (3) HIC는 생성물의 과도한 희석을 방지한다.
생산-규모용으로 적합한 수많은 고성능 HIC 매질, 예를 들면 부틸, 페닐 및 옥틸 세파로스 4 고속류 매질(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)이 접합 과정 후 단량체성 접합 성분으로부터 접합되지 않은 성분 및 접합체의 응집물을 효과적으로 분리할 수 있다.
VI. 조성물 및 제형
본 발명은 또한, 본 발명의 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체를 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 혼합함을 포함하는 치료학적 또는 진단학적 조성물/제형의 제조 방법을 제공한다.
상기 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체는 치료학적 또는 진단학적 조성물/제형 중의 유일한 활성 성분일 수 있거나, 또는 다른 항체 성분, 예를 들면 항-CD19, 항-CD20, 항-CD33, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체 또는 비-항체 성분, 예를 들면 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 항-호르몬, 세포독성 약물 및 크산틴을 포함한 다른 활성 성분이 수반될 수 있다.
암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 사용될 수 있으며 본 발명의 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체와 함께 사용될 수 있는 사이토킨 및 성장 인자로는 인터페론, 인터류킨, 예를 들면 인터루킨 2(IL-2), TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF가 포함된다.
암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되며, 본 발명의 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체와 함께 사용될 수 있는 호르몬으로는 에스토로겐(예: 디에틸스틸베스트롤 및 에스트라디올), 안드로겐(예: 테스토스테론 및 할로테스틴(Halotestin)), 프로제스틴(예: 마가스(Megace) 및 프로베라(Provera)), 및 코르티코스테로이드(예: 프레드니손, 덱사메타손 및 하이드로코르티손)이 포함된다.
항호르몬, 예를 들면 항에스트로겐, 즉 타목시펜, 항안드로겐, 즉 프루타미드 및 항부신호르몬제(antiadrenal agent)가 암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되며, 본 발명의 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체와 함께 사용될 수 있다.
암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되며 본 발명의 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체와 함께 사용될 수 있는 화학요법제/항신생물제로는 아드리아마이신, 시스플라틴, 카보플라틴, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔 및 이의 각종 유도체, 및 미토마이신이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당해 조성물은 바람직하게는 치료학적 유효량의 본 발명의 접합체를 포함하여야 한다. 본원에서 사용된 "치료학적 유효량"이란 용어는 표적 질환 또는 병리상태를 치료, 경감 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료학적 또는 예방학적 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 말한다. 모든 접합체에 대해, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 통상적으로 쥐, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류 모델에서 초기에 추정될 수 있다. 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데도 사용할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여, 사람 투여를 위한 유용한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.
사람 피험자를 위한 정확한 유효량은 질환 상태의 중증도, 피험자의 일반적인 건강상태, 피험자의 연령, 체중 및 성별, 음식, 투여 시간 및 빈도, 약물 배합, 반응 민감도 및 치료에 대한 관용성/반응도에 따라 달라질 것이다. 이러한 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며 임상의의 판단에 맡겨진다. 일반적으로, 유효량은, 단백질성 운반체를 기준으로 하여 계산 하는 경우에, 0.1mg/m2 내지 50mg/m2, 바람직하게는 0.4mg/m2 내지 30mg/m2, 보다 바람직하게는 2mg/m2 내지 9mg/m2 일 것이다.
조성물은 환자에게 단독으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 배합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 단량체성 세포독성 약물 유도체/운반체 접합체가 투여되는 용량은, 치료하고자 하는 병리상태의 특성, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 당해 접합체가 예방적으로 사용되는지 또는 기존 상태를 치료하기 위하여 사용되는지의 여부에 따라 결정된다.
투여 빈도는 접합체의 반감기 및 이의 효과 지속기간에 따라 결정될 것이다. 접합체의 반감기가 짧은(예를 들어, 2 내지 10 시간)를 갖는 경우, 이는 1일 1회 이상 투여할 필요가 있다. 달리, 접합체 분자의 반감기가 긴 경우(예를 들어, 2 내지 15 일), 단지 1일 1회, 1주 1회, 또는 심지어 1 또는 2개월마다 1회로 투여할 필요가 있다.
조성물은 또한 항체 접합체의 투여용으로 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 당해 담체는 그 자체가 당해 조성물을 투여받는 개인에게 유해한 항체의 생성을 유도해서는 아니되며, 독성이어서는 아니된다. 적합한 담체는 크고, 서서히 대사되는 고분자, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 폴리삭카리드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같은 무기산염, 또는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염이 사용될 수 있다.
이들 조성물 중의 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들면 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충 물질이 당해 조성물 중에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 당해 조성물을 환자의 섭취를 위하여 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 겔제, 시럽제, 슬러리 또는 현탁제로 제형화되도록 할 수 있다.
바람직한 투여 형태는 예를 들면, 주사 또는 주입, 예컨대 거환 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형을 포함한다. 생성물이 주사용 또는 주입용인 경우에, 이는 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유액의 형태를 취할 수 있으며, 이는 제형화제, 예를 들면 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
완충된 접합체 용액의 안정성이 단기간의 안정성에 적당하더라도, 장기간의 안정성은 불랑하다. 접합체의 안정성을 증가시키고 이의 저장수명을 증가시키기 위하여, 항체-약제 접합체를 무수 형태로 동결건조하여, 사용 전에 적당한 멸균액으로 재구성할 수 있다. 단백질 용액의 동결건조와 관련된 문제는 익히 입증되었다. 2차, 3차 및 4차 구조의 손상이 동결 및 건조 과정 동안 일어날 수 있다. 따라서, 접합체의 무정형의 안정화제로서 작용하고 동결건조 과정 동안 단백질의 구조적 일체성을 유지시키는 동결방지제를 포함시킨다. 하나의 양태에서, 본 발명에 유용한 동결방지제는 당 알콜, 예를 들면 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 병용제제가다. 또 다른 양태에서, 동결방지제는 당 산, 예를 들면 알돈산, 우론산, 알다르산, 및 이의 병용제제가다.
본 발명의 동결방지제는 또한 탄수화물일 수 있다. 적합한 탄수화물은 2 이상의 하이드록실 그룹을 함유하는 알데히드 또는 케톤 화합물이다. 당해 탄수화물은 환형 또는 선형일 수 있으며, 예를 들어 알도스, 케토스, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 알돈산, 우론산 또는 알다르산, 또는 이의 병용제제를 포함한다. 당해 탄수화물은 일-, 이- 또는 다-탄수화물, 예를 들면 이당류 또는 다당류일 수 있다. 적합한 탄수화물은 예를 들면 글리세르알데히드, 아라비노스, 릭소스, 펜토스, 리보스, 크실로스, 칼락토스, 글루코스, 헥소스, 요도스, 만노스, 탈로스, 헵토스, 글루코스, 프럭토스, 글루콘산, 소르비톨, 락토스, 만니톨, 메틸 α-글리코피라노시드, 말토스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 소르보스, 글루카르산, 에리트로스, 트레오스, 아라비노스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 요도스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 크실룰로스, 프시코스, 타가토스, 글루코론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 슈크로스, 트레할로스 또는 네우라민산, 또는 이의 유도체를 포함한다. 적합한 다-탄수화물은 예를 들어 아라비난, 프럭탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 크실란(예: 이눌린), 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀룰란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로이틴, 데르마탄, 히알루론산, 알긴산, 크산틴 검 또는 전분을 포함한다. 이중에서 특히 유용한 탄수화물은 슈크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스 및 이의 병용제제가다. 슈크로스는 특히 유용한 동결방지제이다.
바람직하게는, 본 발명의 동결방지제는 탄수화물 또는 "당" 알콜(이는 다가 알콜 일 수 있다)이다. 다가 화합물은 하나 이상의 하이드록실 그룹을 함유하는 화합물이다. 바람직하게는, 다가 화합물은 선형이다. 적합한 다가 화합물은 예를 들어 글리콜(예를 들면, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜), 글리세롤 또는 펜타에리트리톨 또는 이들의 병용제제를 포함한다.
일부 바람직 양태에서, 동결방지제는 슈크로스, 트레할로스, 만니톨 또는 소르비톨이다.
일단 제형화된, 본 발명의 조성물은 피험자에게 직접 투여될 수 있다. 치료될 피험자는 동물일 수 있다. 그러나, 당해 조성물은 사람 피험자에게 투여하기 위하여 변형되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경진피(transdermal), 경피(transcutaneous)(PCT 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 비내, 장관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 수 많은 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 피하분사기(hypospray)를 사용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 통상적으로, 당해 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
당해 조성물의 직접적 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질 공간에 전달될 수 있다. 당해 조성물은 또한 병소에 투여될 수 있다. 투여 처리법은 단일 투여 스케줄 또는 다중 투여 스케줄일 수 있다.
당해 조성물중의 활성 성분은 세포독성 약물/단백질성 운반체 접합체일 것이라고 생각될 것이다. 이는 그 자체로는 위장관에서 분해되기 쉬울 것이다. 따라서, 당해 조성물을 위장관을 이용하는 경로로 투여하여야 하는 경우, 당해 조성물은 분해로부터 접합체를 보호하지만, 일단 위장관으로부터 흡수되어졌을 때에는 접합체를 방출하는 제제를 함유할 필요가 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 상세한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명은 특히, 세포가 그 표면상에 CD22 항원을 발현함을 특징으로 하는 증식성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 단량체성 칼리치아미신 유도체/사람화 항-CD22 항체(G5/44), CMC-544를 제공한다.
추가로, 본 발명은 CD22를 발현하는 세포를 특징으로 하는 증식성 질환의 치료용 조성물 또는 의약의 제조시 CMC-544의 용도를 제공한다.
CMC-544는 또한, 본원에 기술된 조성물 또는 약제로 치료될 피험자에 존재하는 CD22-발현 세포의 수준을 감소시키는 것이 요망되는 모든 치료에서 활용될 수 있다. 구체적으로, 당해 조성물 또는 의약은, 세포 표면상에 CD22를 발현하는 증식성 질환, 즉 림프종 및 백혈병을 앓는 사람 또는 동물을 치료하는데 사용된다. 이들 CD22-발현 세포는 체내에서 순환되거나, 또는 체내의 특정 부위에 바람지하지 않게 다수가 집중하여 존재할 수 있다.
CMC-544는 또한 B-림프구 계열의 악성종양, 예를 들면 림프종 및 백혈병, 가장 바람직하게는 비-호지킨 림프종(NHI), 급성 림프구 백혈병(ALL), 다발성 골수종, 급성 림프구 백혈병(ALL) 및 만성 림프구 백혈병(CLL)의 치료에 바람직하게 사용될 수 있다. CMC-544는 단독으로 또는 B-세포 악성종양을 가진 피험자를 치료하기 위한 다른 생활성제와 함께 사용될 수 있다.
통상적으로 사용되는 생활성 제제는 성장 인자. 사이토킨 및 세포독성 약물을 포함한다. 암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되며, CMC-544와 함께 사용될 수 있는 세포독성 약물은 3일 이하 동안을 위한 안트라사이클린, 예를 들면 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피타루비신 및 발루비신; 및 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드, 예를 들면 시타라빈, 겜시타빈, 트리풀루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 고우게로틴, 푸로마이신, 테가푸르 및 티아조푸린을 포함한다. CMC-544와 함께 투여될 수 있는 기타 화학요법제/신생물제는 아드리아마이신, 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로레타민, 프레드니손, 프로카바진, 메토트렉세이트, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔 및 이의 각종 유사체, 및 미토마이신을 포함한다. CMC-544는 이들 치료제 중 하나 이상과 함께 동시에 투여될 수 있다. 달리, CMC-544는 이들 치료제 중 하나 이상과 함께 순차적으로 투여될 수 있다.
CMC-544는 또한 단독으로, 또는 치료 처방의 일부로서 다른 생활성 제제, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 스테로이드, 항체, 예를 들어, 항-CD20 항체인 리툭시마브(RituxanTM), 및 화학요법제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 악성 림프증식성 질환의 치료를 위한 정립된 치료 처방은 CHOPP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), COP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CAP-BOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손), M-BACOD (메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 시타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴), MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 고정 용량의 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린), MOPP (메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), ABVD (아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ABV(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴)와 교대되는 MOPP, 및 ABVD (아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진)과 교대되는 MOPP (메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), 및 ChIVPP (클로르암부실, 빈블라스틴, 프로카바진 및 프레드니손)을 포함한다. 요법은 유도 요법 단계, 강화 요법 단계 및 유지 요법 단계를 포함한다. CMC-544는 또한 단독으로, 또는 유도 요법 단계, 강화 요법 단계 및 유지 요법 단계의 일환으로 위에서 확인된 임의의 요법 처방과 함께 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 접합체는 또한 재발된 공격성 림프종의 치료를 위한 병용 화학요법 처방의 일부로서 기타 생활성 제제 및 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 치료 처방은 IMVP-16 (이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드), MIME (메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드), DHAP (덱사메타손, 고-용량 사이타리빈 및 시스플라틴), ESHAP (에토포시드, 메틸프레디솔론, 고용량 시타라빈 및 시스플라틴, EPOCH (일시 투여량의 사이클로포스파미드 및 경구용 프레드니손과 함께 96시간 동안, 에토포시드, 빈크리스틴 및 독소루비신), CEPP(B) (사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신), CAMP (로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손), CVP-1 (사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP-B (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 블레오마이신), CEPP-B (사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진 및 블레오마이신), 및 P/DOCE (에피루비신 또는 독소루비신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드 및 프레드니손)을 포함한다. 공격성 림프종의 추가의 치료 처방은 단계 1에서 CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)-리툭시마브(RituxanTM)- CMC-544을 이용한 제1 라인의 치료를 포함할 수 있고, 이 후 단계 2 및 단계 3에서 CHOP-리툭시마브(RituxanTM), CHOP-CMC-544 또는 CHOP-리툭시마브(RituxanTM)-CMC-544를 이용한 치료를 포함할 수 있다. 달리, 단계 1은 COP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손)-리툭시마브(RituxanTM)-CMC-544를 이용한 제1 라인의 치료를 포함할 수 있고, 이후 단계 2 및 단계 3에서 COP-리툭시마브(RituxanTM), COP-CMC-544 또는 COP-리툭시마브(RituxanTM)-CMC-544를 이용한 치료를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 공격성 림프종의 치료는 단계 1에서 항체 약제 접합체 CMC-544를 이용한 제1 또는 제2 라인의 치료를 포함할 있고, 이후 단계 2 및 단계 3에서 CMC-544 및 CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), CMC-544 및 COP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), 리툭시마브(RituxanTM)와의 CMC-544, 또는 리툭시마브(RituxanTM) 단독을 이용한 치료를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 공격성 림프종의 치료는 항체 약물 접합체 CMC-544를 이용한 제1 라인의 치료를 포함할 수 있고, 이후 단계 2 및 3에서 CMC-544 단독 또는 다른 치료 처방, 예를 들면 ESHOP (에토포시드, 메틸프레디솔론, 고-용량의 시타라빈, 빈크리스틴 및 시스플라틴), EPOCH (일시 투여량의 사이클로포스파미드 및 경구용 프레드니손과 함께 96 시간 동안 에토포시드, 빈크리스틴 및 독소루비신), IMV-16 (이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드), ASHAP(아드리아마이신, 솔루메드롤, Ara-C 및 시스플라틴), MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드) 및 ICE(이포스파미드, 사이클로포스파미드 및 에토포시드)와 배합된 CMC-544를 이용하는 치료를 포함할 수 있다. 본 출원에서 제공되는 병용 화학요법 처방, 투여량 등을 포함하여 악성종양의 화학요법에 사용되는 각종 세포독성 약물에 관한 상세한 설명은 문헌[Cancer Principles and Practice of Oncology, Eds. Vincent T. DeVita, Samuelo Hellman, Steven A. Rosenberg, 6th Edition, Publishers: Lippincott, Williams and Wilkins (2001) and Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, Eds. Edward Chu and Vincent T. DeVita, Publishers : Jones and Bartlett, (2002)]에서 찾아 볼 수 있다.
또한, 본 발명은, 유효량의 본 발명의 CMC-544를 피험자에게 투여함을 포함하여, CD22를 발현하는 세포를 특징으로 하는 증식성 질환을 앓고 있거나 이의 위험이 있는 사람 또는 동물 피험자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아래의 구체적 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 본 발명을 추가로 설명하는 것이다.
[실시예]
실시예 1
후보 항체의 생성
CD22에 대한 항체의 패널을 아래의 선별 기준을 사용하여 하이브리도마로부터 선별하였다: 다우디(Daudi) 세포에 대한 결합, 다우디 세포에 대한 내재화, 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 결합, PBMC에 대한 내재화, 친화도(10-9M 초과), 마우스 γ1 및 생성 속도. 5/44를 바람직한 항체로서 선별하였다.
1. 키메라 5/44 항체 분자의 유전자 클로닝 및 발현
a) 5/44 하이브리도마 세포의 제조 및 이로부터의 RNA 제조
하이브리도마 5/44를, 사람 CD22 단백질을 사용하여 마우스를 면역화한 후, 통상적 하이브리도마 기법에 의해 생성시켰다. RNA를 RNEasy 키트 (Qiagen, Crawle, UK; Catalogue No. 74106)를 사용하여 5/44 하이브리도마 세포로부터 제조하였다. 수득된 RNA를 후술되는 바와 같이 cDNA로 역전사시켰다.
b) NHL 종양상의 CD22의 분포
5/44 항-CD22 모노클로날 항체를 이용하여 염색의 발생 및 분포를 조사하기 위하여, 면역조직화학 연구를 착수하였다. 대조군 항-CD20 및 항-CD79a 항체를 본 연구에 포함시켜, 종양의 B-세포 부위를 확인하였다.
총 50개의 종양을 연구하였으며, 이들을 작용 제형 및 REAL 분류 체계를 이용하여 아래와 같이 분류하였다:
·7 B 림프모구 백혈병/림프종(고(high)/l)
·4 B-세포/작은 림프구 림프종(저(low)/A)
·3 림프형질형(lymphoplasmacytoid)/면역종 (저/A)
·1 외투 세포(mantle cell) (Int/F)
·14 소포 중심 림프종(follicle center lymphoma) (저 내지 중(int)/D)
·13 미만성 거대 세포 림프종 (중 내지 고/G, H)
·6 비분류 (K)
·2 T 세포 림프종
40개의 B-세포 림프종은 0.1㎍/ml에서 5/44 항체와의 CD22 항원에 대해 양성이였으며, 농도가 0.5㎍/ml로 증가되는 경우 추가로 6개가 양성이 되었다. 0.1㎍/ml에서 음성인 나머지 2개의 B-세포 종양에 대해서, 보다 높은 농도에서 시험하기에는 남은 조직이 불충분하였다. 그러나, 5/44 보다도 강한 염색을 주는 또 다른 항-CD22 (6/33으로 명명, Celltech, Slough, UK)을 사용한 비교 시험한 결과, 48개 B-세포 림프종 모두가 CD22에 대하여 양성 염색을 나타냈다.
따라서, CD22 항원이 B-세포 림프종에서 광범위하게 발현되므로, NHL의 면역요법을 위한 적합한 표적을 제공한다는 결론을 내릴 수 있다.
c) 5/44 VH 및 VL의 PCR 클로닝
5/44 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 암호화하는 cDNA 서열을 역전사효소를 사용하여 합성하여, 전체 RNA 중에 존재하는 mRNA의 일본쇄 cDNA 복사체를 제조하였다. 이어서, 이를 쥐의 V-영역 서열의 증폭을 위한 주형으로 하여, 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다.
i) cDNA 합성
cDNA를 다음 시약을 함유하는 20㎕ 반응 용적에서 합성하였다: 50mM Tris-HCI pH 8.3, 75mM KCl, 10mM 디티오트레이톨, 3mM MgCl2, 0.5mM의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP, 20 단위 RNAsin, 75ng 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이머, 2㎍ 5/44 RNA 및 200단위 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소. 60분 동안 45℃에서 항온처리한 후, 5분 동안 95℃에서 가열하여 반응을 종결시켰다.
ii) PCR
cDNA의 분취액을, 중쇄 및 경쇄에 대해 특이적인 프라이머의 조합을 이용하여 PCR에 적용하였다. 시그날 펩티드의 보존된 서열과 어닐링시키기 위하여 설계된 축퇴성 프라이머 풀을 정방향 프라이머로서 사용하였다. 이들 서열은 이의 5'말단으로부터 7개의 뉴클레오티드에서 시작되는 제한 부위(VL Sful; VH HindIII), 생성된 mRNA의 최적 해독을 가능케하는 서열 GCCGCCACC(서열 50), 개시 코돈, 및 공지된 마우스 항체의 리더 펩티드 서열을 기초로 하는 20 내지 30개의 뉴클레오티드를 순차적으로 모두 함유한다[참조 문헌: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health].
3' 프라이머는 항체의 주쇄 4 J-C 연결부에 걸치도록 설계되며, VL PCR 단편의 클로닝을 용이하게 하기 위하여 효소 BsiWl에 대한 제한 부위를 함유하도록 설계된다. 중쇄 3' 프라이머는 항체의 J-C 연결부에 걸치도록 설계된 혼합물이다. 3' 프라이머 클로닝을 용이하게 하는 Apal 제한 부위를 포함한다. 프라이머의 3' 영역은 공지된 마우스 항체에서 발견된 것들을 기초로 하여 혼합 서열 함유한다[참조 문헌: Kabat et al., 1991, supra).
상기된 프라이머의 조합을 통하여, VH 및 VL에 대한 PCR 생성물이 직접적으로 적당한 발현 벡터(하기 참조)내로 클로닝되도록 하여 키메라 (마우스-사람) 중쇄 및 경쇄가 생성될 수 있도록 하고, 또한 이들 유전자가 포유동물 세포에서 발현되도록 하여 목적하는 이소형의 키메라 항체가 생성될 수 있도록 한다.
PCR을 위한 항온처리(100㎕)를 다음과 같이 설정하였다. 각 반응물은 10 mM Tris-HCI pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.01% w/v 젤라틴, 0.25mM의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP, 10pmole의 5' 프라이머 혼합물, 10 pmole의 3' 프라이머, 1㎕ cDNA 및 1단위 Taq 폴리머라제를 함유하였다. 반응물을 5분 동안 95℃에서 항온처리한 다음, 1분간 94℃, 1분간 55℃ 및 1분간 72℃의 사이클을 반복하였다. 30회의 사이클 후, 각 반응물의 분취량을 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다.
중쇄 V-영역의 경우에, 증폭된 DNA 생성물은, 주쇄 I의 개시부 내에서 어닐링하는 프라이머 풀이 시그날 펩티드 프라이머 집단을 대체한 경우에만 수득되었다. 당해 단편을 DNA 서열분석용 벡터 내에 클로닝시켰다. 당해 DNA 서열을 결정하고 해독하여 추론된 아미노산 서열을 수득하였다. 이러한 추론된 아미노산 서열은, 실험상 결정된 N-말단 단백질 서열를 참조로 하여 확인되었다. 도 1은 마우스 모노클로날 항체 5/44의 CDR의 아미노산 서열을 도시한다. 도 2 및 3은 마우스 모노클로날 항체 5/44의 성숙한 경쇄 및 중쇄의 DNA/단백질 서열을 각각 도시한다.
iii) PCR 단편의 분자 클로닝
이어서, 쥐 V-영역 서열을 발현 벡터 pMRR10.1 및 pMRR14 (도 7 및 8) 내로 클로닝하였다. 이들은, 사람 카파 경쇄 및 사람 감마-4 중쇄의 불변 영역을 암호화하는 DNA를 함유하는 경쇄 및 중쇄의 발현을 위한 벡터이다. VL 영역을, Sful 및 BsiWl 제한 부위를 이용하여 서열분석용 벡터로부터 제한 분해시키고 연결시키는 방법으로 발현 벡터 내로 서브클로닝시켜, 플라스미드 pMRR10 (544cL) (도 8)를 제조하였다. 중쇄 DNA를 5' 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켜 시그날 펩티드를 도입하였는데, 그 이유는 이것이 상이한 동일계(in-house) 하이브리도마 (162로 명명됨)로부터의 마우스 중쇄 항체 리더가 사용되는 클로닝 전략에서는 수득되지 않았기 때문이다. 5' 프라이머는 다음 서열 가졌다: 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGG CACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' (서열 51).
역방향 프라이머는 본래의 VH 유전자 클로닝에 사용된 것과 동일하였다. 생성된 PCR 생성물을 효소 HindIII 및 ApaI으로 분해하고, 서브클로닝하고 이의 DNA 서열을 확인하여, 플라스미드 pMRR14(544cH)(도 7)을 제조하였다. 두 발현 벡터 모두를 CHO 세포내로 일시적으로 공동-형질감염시켜 키메라 c5/44 항체를 제조하였다. 이는 리포펙타민(Lipofectamine) 시약을 제조업자의 프로토콜 (InVitrogen: Life Technology, Groningen, The Netherlands. Catalogue no. 11668-027)에 따라 사용하여 달성되었다.
II. 글리코실화 부위 및 반응성 라이신의 제거
잠재적 N-연결된 글리코실화 부위 서열은 아미노산 서열 N-Y-T(도 3)을 갖는 CDR-H2에서 관찰되었다. 5/44 및 이의 단편(Fab를 포함)의 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯팅 및 탄수화물 염색은 이러한 부위가 실제로 글리코실화되었음을 나타냈다(제시하지 않음). 또한, 라이신 잔기는 항체가 접합될 수 있는 제제와의 접합을 위한 추가의 부위를 제공함으로써 항체의 결합 친화도를 감소시킬 가능성을 갖는 CDR-H2내의 노출된 부위에서 관찰되었다.
도 4에 제시한 바와 같이, 글리코실화 부위 및/또는 반응성 라이신을 제거하고자 하는 시도로서 CDR-H2 서열내로 아미노산 치환을 도입시키기 위해 PCR 전략을 사용하였다. 돌연변이 N55Q, T57A 또는 T57V를 암호화하는 전방향 프라이머를 글리코실화 부위를 제거하는데 사용하였고(도 4), 치환 K60R을 함유하는 제4 전방향 프라이머를 반응성 라이신 잔기를 제거하기 위해 생성시켰다(도 4). 상기 각각의 PCR 증폭시에 주쇄 4 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물을 효소 XbaI 및 Apal로 분해시키고 pMRR14(544cH)(Xbal 및 Apal로 또한 분해됨) 내로 삽입하여 이들 돌연변이체를 암호화하는 발현 플라스미드를 생성시켰다. N55Q, T57A 및 T57V 돌연변이는 컨센서스 N-X-T/S로부터 멀리 떨어진 아미노산을 변화시킴으로써 글리코실화 부위를 제거하며, K60R 돌연변이는 잠재적 반응성 라이신을 유사하게 양하전된 잔기 아르기닌으로 대체시켰다. 수득된 cH 변이체 플라스미드를 cL 플라스미드와 함께 공동-형질감염시켜, 발현된 키메라 항체 변이체를 생성시켰다.
III. 키메라 유전자의 활성의 평가
키메라 유전자의 활성은 CHO 세포내로 일시적으로 형질감염시키고 비아코어(BiaCore) 분석으로 친화도 상수를 측정한 후에 평가하였다.
글리코실화 부위 또는 반응성 라이신이 제거된 키메라 5/44 또는 이의 변이체의 친화도는 CD22-mFc 작제물에 결합시키기 위한 BIA 기술을 사용하여 조사하였다. 결과는 도 9에 제시한다. 모든 결합 측정은 비아코어(BIAcore)TM 2000 장치(제조원: Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)에서 수행하였다. 검정은 고정화된 항-마우스 Fc를 통해 CD22mFc를 포획함으로써 수행하였다. 항체는 가용성 상 중에 존재하였다. 샘플, 표준물 및 대조군(50㎕)을 고정화된 항-마우스 Fc 위에 주사한 다음, 가용성 상 중의 항체를 주사하였다. 각 사이클 후, 표면을 30㎕/분에서 40mM HCl 50㎕으로 재생시켰다. 반응속도론 분석을 BIAevaluation 3.1 소프트웨어(제조원: Pharmacia)를 사용하여 수행하였다.
작제물 T57A 내의 글리코실화 부위의 제거로, 키메라 5/44와 비교하여 결합 속도가 다소 빨라지고 해리 속도가 현저하게 느려짐으로써 친화도가 약 5배 개선되었다. N55Q 돌연변이는 친화도에 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 탄수화물의 제거 자체가 외관상으로는 (N55Q 변화의 경우와 마찬가지로) 결합에 영향을 주지 않음을 제시하기 때문에 예상치 못한 것이다. 한가지 가능한 설명은, 탄수화물의 존재와 관계없이, 트레오닌에서 알라닌으로의 전환시 제거되는 57번 위치의 트레오닌이 결합에 대한 음성적 효과를 발휘한다는 것이다. 알라닌의 작은 크기가 중요하고 트레오닌의 음성적 효과가 이의 크기와 관련된다는 가설은 T57V 돌연변이를 사용하여 수득된 결과로부터 뒷받침되고, 57번 위치에서 발린으로의 대체는 유리하지 않다(결과는 제시하지 않음).
K60R 돌연변이에 의한 라이신 잔기의 제거는 친화도에 중성 효과를 미치는데, 즉 아르기닌 잔기의 도입은 친화도를 감소시키지 않으며 잠재적 반응성 부위를 제거한다.
따라서, 글리코실화 부위의 제거를 위한 돌연변이 및 반응성 라이신의 제거를 위한 돌연변이 둘다가 사람화 디자인에 포함되었다.
실시예 2
5/44의 CDR-이식
5/44 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위에 대한 유전자의 분자 클로닝 및 키메라(마우스/사람) 5/44 항체를 제조하기 위한 이들의 용도는 상기한 바 있다. 마우스 5/44 VL 및 VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 2 및 3(서열 7 및 8)에 나타내져 있다. 본 실시예는 Adair 등의 방법(PCT 출원 번호 제WO91/09967호)에 따라, 사람에서 잠재적 면역원성을 감소시키기 위한 사람 주쇄로의 5/44 항체의 CDR-이식을 기술한다.
I. 5/44 경쇄의 CDR-이식
사람 서브그룹 I 카파 경쇄 V 부위로부터의 컨센서스 서열과의 단백질 서열 정렬은 64% 서열 동일성을 나타내었다. 따라서, CDR-이식된 경쇄를 작제하기 위해, 선택한 수용체 주쇄 영역은 사람 VK 서브그룹 I 생식선 O12, DPK9 서열의 주쇄 영역과 상응하였다. 주쇄 4 수용체 서열은 사람 J-부위 생식선 서열 JK1으로부터 유도하였다.
쥐 5/44의 주쇄 영역의 아미노산 서열 및 수용체 서열의 비교는 도 5에 나타내었으며 공여체 및 수용체 쇄 사이에 27개가 상이함을 나타냈다. 각각의 위치에서, 쥐 잔기가 직접 또는 간접적으로, 팩킹에 대한 효과를 통해 또는 VH/VL 경계면에서 항원 결합에 기여할 수 있는 잠재성을 분석하였다. 쥐 잔기가 중요하다고 고려되고 크기, 극성 또는 전하의 측면에서 사람 잔기와 충분히 상이한 경우, 쥐 잔기가 보유되었다. 이러한 분석을 기준으로 하여, 서열 19 및 서열 20(도 5)에 나타낸 서열을 갖는 CDR-이식된 경쇄의 2가지 유형을 작제하였다.
II. 5/44 중쇄의 CDR-이식
5/44 중쇄의 CDR-이식은 경쇄에 대해 기술한 바와 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. 5/44 중쇄의 V-도메인은 서브그룹 I에 속하는 사람 중쇄에 대해 상동(70% 서열 동일성)인 것으로 밝혀졌으므로, 사람 서브그룹 I 생식선 주쇄 VH1-3,DP7의 서열을 수용체 주쇄로 사용하였다. 주쇄 4 수용체 서열은 사람 J-부위 생식선 서열 JH4로부터 유도하였다.
5/44 중쇄와 주쇄 영역의 비교는 도 6에 나타내져 있으며, 여기서 5/44 중쇄가 22번 위치에서 수용체 서열과 상이함을 알 수 있다. 이들 중 어떠한 것이 항원 결합에 기여하는지의 분석은 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26 및 서열 27(도 6)에 나타낸 서열을 갖는, 5개 유형의 CDR-이식된 중쇄를 유도하였다.
III. 이식된 서열에 대한 유전자의 작제
이식된 서열 gH1 및 gL1을 암호화하도록 유전자를 설계하고, 일련의 중복 올리고뉴클레오티드를 설계 및 작제하였다(도 10). CDR-이식된 V-부위 유전자를 작제하기 위해 PCR 구축 기법을 사용하였다. Tris-HCl pH8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.001% 젤라틴, 0.25mM의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP, '내부' 프라이머(T1, T2, T3, B1, B2, B3) 각각 1pmol, '외부' 프라이머(F1, R1) 각각 10pmol 및 Taq 폴리머라제(AmpliTaq, Applied BioSystems, 카탈로그 번호 N808-0171) 1단위를 함유하는 100㎕ 용적의 반응물을 설정하였다 PCR 사이클 매개변수는 30회의 사이클 동안, 1분 동안 94℃, 1분 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃였다. 이어서 반응 생성물을 1.5% 아가로스 겔에서 전개시키고, 절단하고 QIAGEN 회전 칼럼(QIAquick 겔 추출 킷트, 카탈로그 번호 28706)을 사용하여 회수하였다. DNA를 30㎕의 용적으로 용출시켰다. 이어서 gH1 및 gL1 DNA의 분취액(1㎕)를 제조업자의 지침에 따라 InVitrogen TOPO TA 클로닝 벡터 pCR2.1 TOPO(카탈로그 번호 K4500-01)내로 클로닝시켰다. 당해 비발현 벡터는 다수의 클론의 서열분석을 용이하게 하기 위한 클로닝 중간체로서 제공되었다. 플라스미드 pCR2.1(544gH1) 및 pCR2.1(544gL1)(도 11 및 12)를 생성시키는, gH1 및 gL1을 함유하는 정확한 클론을 동정하기 위해 벡터-특이적 프라이머를 사용한 DNA 서열분석을 사용하였다.
사람화된 이식체 gH4, 5, 6 및 7, 및 gL2를 생성시키기 위해 올리고뉴클레오티드 카셋트 교체 방법을 사용하였다. 도 13은 올리고뉴클레오티드 카셋트의 설계를 나타낸다. 각각의 변이체를 작제하기 위해, 벡터 pCR2.1(544gH1) 또는 pCR2.1(544gL1)을 제시한 제한효소로 절단하였다(중쇄는 XmaI/SacII으로, 경쇄는 XmaI/BstEII). 대형 벡터 단편을 아가로스로부터 겔 정제하고 올리고뉴클레오티드 카셋트와 함께 연결반응에 사용하였다. 이들 카셋트는 12.5mM 트리스-HCl pH7.5, 2.5mM MgCl2, 25mM NaCl, 0.25mM 디티오에리트리톨 200㎕의 용적 중 0.5pmol/㎕의 농도로 혼합된 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드(도 13에 나타내져 있음)로 구성되어 있다. 수욕(용적 500㎖)에서 3분 동안 95℃로 가열시킨 후 반응물을 실온으로 서서히 냉각시켜 어닐링(annealing)을 수행하였다. 이어서, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 카셋트를 적합하게 절단된 벡터내로 연결시키기 전에 물속에 10배 희석시켰다. 플라스미드 pCR2.1(5/44-gH4-7) 및 pCR2.1(5/44-gL2)를 생성시키는, 정확한 서열을 확인하기 위해 DNA 서열분석을 사용하였다. 이어서, 확증된 이식된 서열을 발현 벡터 pMRR14(중쇄) 및 pMR10.1(경쇄)내로 서브클로닝시켰다.
IV. CDR-이식된 서열의 CD22 결합 활성
이식된 변형체를 암호화하는 벡터를 본래의 키메라 항체 쇄와 함께 각종 조합으로 CHO 세포내로 공동-형질전환시켰다. 라모스(Ramos) 세포(ATCC로부터 입수함, 표면 CD22를 발현시키는 버킷(Burkitt's) 림프종 림프아구 사람 세포주에의 결합에 대해 본래의 마우스 5/44 항체의 결합을 경쟁시키는 경쟁 검정에서 결합 활성을 비교하였다. 당해 검정은 세포 표면 CD22에 결합하는 능력에 있어 이식체들을 비교하기 위한 최상의 방법으로 사료되었다. 결과는 도 14 및 15에 나타내었다. 알 수 있는 바와 같이, 임의의 이식체 사이에는 차이가 거의 없었으며, 모두 쥐 부모에 대한 경쟁에서 키메라보다 효과적으로 수행되었다. CDR-H2(gH6 및 gH7)의 말단에 3개의 추가적 사람 잔기의 도입은 결합에 영향을 주는 것으로 나타나지 않았다.
최소한의 쥐 잔기 gL1gH7와의 이식체 조합을 선택하였다. 경쇄 이식체 gL1은 6개의 공여체 잔기를 가진다. 잔기 V2, V4, L37 및 Q45는 잠재적으로 중요한 팩킹 잔기이다. 잔기 H38은 VH/VL 경계면에 있다. 잔기 D60은 CDR-L2에 근접한 표면 잔기이고 항원 결합에 직접적으로 기여할 수 있다. 이들 잔기 중, V2, L37, Q45 및 D60은 다른 서브그룹으로부터 사람 카파 유전자의 생식선 서열에서 발견된다. 경쇄 이식체 gH7은 4개의 공여체 주쇄 잔기(CDR-이식에 사용된 구조 정의 하에 잔기 R28은 CDR-H1의 일부인 것으로 사료된다)를 갖는다[참조: Adair et al.(1991), PCT 출원 번호 제WO91/09967호]. 잔기 E1 및 A71은 CDR에 근접한 표면 잔기이다. 잔기 148은 잠재적 팩킹 잔기이다. 잔기 T93은 VH/VL 경계면에 존재한다. 이들 잔기 중, E1 및 A71은 다른 사람 서브그룹 I의 생식선에서 발견된다. 잔기 148은 사람 생식선 서브그룹 4에서 발견되며, T73은 사람 생식선 서브그룹 3에서 발견된다.
벡터에 의해 제공된 불변 영역 유전자 내의 인트론의 대략적인 위치를 포함하는, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 총 DNA 및 단백질 서열은 도 16에 나타내었고 경쇄에 대해서는 각각 서열 29 및 서열 28로서 나타내고, 중쇄에 대해서는 각각, 서열 31 및 서열 30으로 나타내었다.
이들 경쇄 및 중쇄 유전자를 암호화하는 DNA를 이들 벡터로부터 절단하였다. 중쇄 DNA를 5' HindIII 위치에서 절단한 후, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편으로 처리하여 5' 평활 말단을 제조하였다. 3' EcoRI 위치에서 절단하고, 아가로스 겔로부터 정제하여 중쇄 단편을 제조하였다. 동일한 방법으로, 5' Sful 위치 및 3' EcoR1 위치에서 평활 말단화된 경쇄 단편을 제조하였다. 단편 둘 다를 발현 벡터를 기초로 한 DHFR로 클로닝시키고 CHO 세포내에 안정한 세포주를 발생시키기 위해 사용하였다.
실시예 3
사람화 항-CD22 항체(G5/44)에 대한 NAc-감마 칼리치아미신 DMH AcBut의 접합
통상의 접합 반응에서, 사람화 항-CD22 항체(G5/44)를 NAc-감마 칼리치아미신 DMH AcBut OSu(칼리치아미신 유도체)에 접합시켰고(도 17 참조), 이때 표적 단백질 농도는 7.5mg/㎖이었으며 표적 칼리치아미신 유도체 하중은 단백질의 8.5중량%였다. 표적 반응 pH는 8.5 ±0.2였고, 다른 반응 성분의 표적 농도는 다음과 같았다: 50mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)(HEPBS), 37.5mM 나트륨 데카노에이트 및 9% v/v 총 에탄올. 반응을 33℃ ±2℃에서 1시간 동안 수행하였다. 정제하기 전 이러한 통상의 반응의 분석 결과는 다음과 같았다: 단백질: 7.34mg/㎖; 칼리치아미신 부하량: 82.7㎍/mg; 응집: 93.25%; 및 비접합된 단백질(LCF): 1.07%(HPLC을 기준으로 한 UV 면적%).
생성물 수율 및 순도에 대한 각종 계면활성제 첨가제 및 이들의 농도의 효과를 시험하여 접합된 단량체의 생산에 대한 이들의 효과를 측정하였다(표 2 참조). 첨가제 및 이의 농도를 제외한 모든 것을 평형으로 유지시켜 반응을 진행시켰다. 이들 반응으로부터 생산된 접합체를 단백질 농도, 칼리치아미신 부하량, 응집물 함량 및 LCF에 대해 분석하였다. C6(헥사노에이트) 내지 C12(도데카노에이트)의 범위에서 모든 n-카복실산이 허용가능한 결과를 제공하였지만, 최상의 전반적 결과(낮은 LCF, 낮은 응집물 및 단량체성 접합체의 높은 회수율)는 30mM 내지 50mM의 농도 범위에서 데카노에이트를 사용하여 수득되었다.
Figure pat00003
실시예 4
크로마토그래피 정제 공정
I. 크로마토그래피 분리 공정
부틸 세파로스 4 급속류가 최상의 HIC 매질로서 동정되었지만, 허용되는 결과는 옥틸 세라포스 고속류, PPG-600C(Tosoh Biosep), 프락토겔 EMD 프로필(EM Processing) 및 Source 151SO(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)와 같은 다른 수지를 사용하여 크로마토그래픽 조건에서 약간 변형시킨 경우에도 수득할 수 있다.
정제의 출발 물질은 응집물 함량이 10.1%(HPLC를 기준으로 한 면적%) 및 LCF 함량이 5.6%(HPLC를 기준으로 한 면적%)인, 칼리치아미신 유도체 부하량 83㎍/mg에서 단백질 7.2mg/㎖을 함유하는 접합 반응 혼합물이었다.
접합 반응이 완결된 후, 0.7M(pH 8.2)의 최종 포스페이트 농도까지 인산칼륨 용액을 첨가하여 반응 혼합물을 4배 희석켰다. 혼합 후, 당해 용액을 0.45마이크론 필터를 통해 여과하였다. 희석된 용액을 부틸 세파로스 4 고속류 칼럼상에 부하하였다. 칼럼에 부하된 단백질의 총량은 베드 용적 ㎖당 29mg이었다. 0.7M 인산칼륨으로 세척한 후, 칼럼을 pH 8.2의 0.7M 내지 4mM 인산칼륨의 단계 구배를 사용하여 용출시켰다. 단계 구배에서 용출된 분획을 추가로 처리하기 위해, 응집물 및 LCF가 각각 1면적% 미만인 단량체성 접합체로 이루어진 풀로 수집하였다. 상기풀을 pH8.0의 20mM Tris-Cl 및 100mM 염화나트륨으로 이루어진, 제형에 적합한 완충액으로 교환하기 위해 세파덱스 G-25(Amersham Biosciences) 탈염 칼럼에 부하하였다. 정제되고, 완충액-교환된 CMC-544 제제는 다음의 특성을 지녔다: 칼리치아미신 하중: 81㎍/mg; 응집물: 0.4%(HPLC를 기준으로 한 면적%) LCF: 0.8%(HPLC를 기준으로 한 면적%).
실시예 5
NAc-감마 칼리치아미신 DMH AcBut-G5/44 면역접합체(CMC-544)의 결합 분석
개선된 방법을 사용하여 생산된 접합체가 항원 결합에 대해 임의의 역효과를 갖는지의 여부를 측정하기 위해 상기한 접합 방법에 의해 생산된 사람화 항-CD22 항체(G5/44)와 칼리치아미신의 면역접합체(CMC-544)를 결합 연구에서 분석하였다. 표 3은 접합 과정이 항체의 항원 결합 친화도에 어떠한 영향도 주지 못함을 나타낸다. 구식 또는 신식 접합 방법에 의해 제조된 CMC-544 면역접합체는 비접합 항체 G5/44의 친화도와 상이하지 않은 유사한 친화도로 표적 항원에 결합하였다.
Figure pat00004
비아코어 2000(BIAcore AB, Uppsala, 스웨덴)을 사용하여 바이오센서 분석을 수행하였다. 대략 2000 공명 단위의 단백질 밀도에서 표준 아민-커플링 화학을 사용하여 CD22mFc를 N-하이드록시석신이미드-활성화된 카복시메틸 덱스트란-피복된 바이오센서 칩(CM5)상에 공유적으로 고정시켰다. CMC-544 또는 G5/44의 샘플을 HBS 완충액(150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.005% 폴리소르베이트20(v/v)를 함유하는 pH 7.4의 10mM HEPES)으로 희석시키고 30㎕/분의 유속에서 3분 동안 CD22mFc-피복된 바이오센서 칩 표면상에서 1 내지 100nM의 농도 범위로 주입하여 결합시켰다. 결합 단계 후, 결합된 항체의 분리를 HBS 완충액을 사용하여 15분 동안 칩을 세척하여 관찰하였다. 재생 완충액(10mM NaOH 및 200mM NaCl) 15㎕를 사용하여 30초 동안 바이오센서 칩을 세척하여 항원 표면을 재생성시킨 후, 다음 사이클 전에 2분 동안 안정화시켰다. 1:1 랑뮈어(Langmuir) 결합 곡선 맞춤 모델 및 BIAevaluation 프로그램(버전 3.0, BIAcore)를 사용하여 비선형 최소제곱법 회귀 분석에 의해 반응속도 상수를 계산하였다. CMC-544의 항원 결합은 바이오센서 칩에 공유적으로 고정된 CD22mFc를 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 평가하였다. 데이타를 질량 전이에 대해 보정한 1:1 랑뮈어 결합 모델에 대역적으로 적용한 후, CD22mFc에 대한 CMC-544 및 G5/44의 결합의 반응속도론 분석 결과는 CMC-544 및 비접합된 G544 둘 다가 유사한 친화도로 CD22에 결합되었음을 나타내었다(CMC-544:CD22 KD = 200pM; G5/44:CD22 KD=235pM). 칼리치아미신에 대한 접합은 CD22mFc에 효과적으로 결합하는 G5/44의 능력에 영향을 주지 않았다.
B 림프종 세포의 표면에 발현된 CD22에 대한 CMC-544 및 G5/44의 결합을 또한 유동 세포측정에 의해 측정하였다. 당해 평가에서 항-CD33 mAb 겜투주마브(gemtuzumab)(hP67.6) 및 이의 칼리치아미신 접합체 CMA-676(겜투주마브오조가마이신)을 이소형-매치된 대조군으로 사용하였다. 키메라 사람 IgG1 항-사람 CD20 mAb인 리툭시마브(RituxanTM)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 정제된 사람 폴리클로날 IgG1 및 IgG4를 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 라모스 또는 RL BCL상의 CD22에 대한 CMC-544 및 G5/44의 결합은 유사하였으며 사람 폴리클로날 IgG4의 결합과 구별가능하였다. RL BCL은 라모스 BCL보다 낮은 CD22의 표면 발현을 나타냈다. 대조적으로, BCL에 대한 CMA-676 또는 gL1gH7의 결합은 이들의 CD33의 발현이 결핍됨과 일치하여, 사람 폴리클로날 IgG4의 결합과 유사하였다(데이타는 나타내지 않음). 동일한 세포가 항-CD20 리툭시마브(RituxanTM)의 강한 결합을 나타내지 않았다. hP67.6 및 CMA-676과 달리, CMC-544 및 G5/44는 둘 다 CD22- CD33+ HL-60 백혈병 세포에 대한 어떠한 결합도 입증되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 이들 결과는 칼리치아미신에 대한 G5/44의 접합이 이의 항원 특이성에 영향을 주지 않음을 제안한다. CMC-544는 특이적으로 사람 B-세포상의 CD22를 인식하지만, 쥐, 랫트, 개, 돼지 또는 영장류{사이노몰구스(cynomolgus) 및 레수스(rhesus)} B-세포상의 CD22는 인식하지 않는다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 6
CMC-544의 시험관내 및 생체내 효과 분석
I. 시험관내 세포독성
CMA-676 및 CMC-544 방법을 사용하여 제조된 CMC-544의 CD22+ B-세포 림프종 세포주인 RL, 다우디, 라지(Raji) 및 라모스의 시험관내 성장에 대한 효과를 비교하였다. 사람 CD33(CMA-676)에서 표적화된 이소형-매치된 칼리치아미신 접합체를 접합체의 항원-비특이적 효과를 반영하기 위해 사용하였다. 당해 평가에서 비접합 N-Ac 감마 칼리치아미신 DMH(산 가수분해시에 접합체로부터 방출된 약물)의 사용은 사용된 이들 세포주 각각이 칼리치아미신의 치사 효과에 민감성임을 나타내었다. 표 4는 칼리치아미신 등가성을 기준으로 한 이들 측정의 결과를 나타내고 표 5는 접합된 항체 단백질의 농도로서 표현된 이들 결과를 나타낸다. CD22+ 세포로의 칼리치아미신의 CD22-매개된 운반은 표적 세포를 치사시키는데 있어 비접합된 약물 자체보다 10배 효과적이었다. 이소형-매치된 대조 접합체(CMA-676)은 비접합 칼리치아미신 유도체보다 덜하거나 이와 유사한 세포독성을 나타내었다. 표 4로부터 CMC-544 접합 방법에 의해 제조된 접합체가 CMA-676 접합 방법에 의해 제조된 접합체보다 낮은 항체 농도에서 등가의 세포독성 효과를 산출할 수 있음이 명백해진다.
Figure pat00005
Figure pat00006
생체내 세포독성. CMC-544 방법에 의해 제조된 CMC-544를 추가로 B-세포 림프종 이종이식체에서 평가하였다. 이들 연구에서, 2개의 B-세포 림프종양, 라모스 및 RL이 사용되었다. 라모스가 원래 버킷 림프종으로부터 유래된 반면 RL 림프종은 비-버킷 NHL-유래된 세포주이다. 도 18에 나타낸 대표적 실험에서, CMC-544 및 이의 쥐 항체 대응물은 라모스 B-세포 림프종의 성장을 용량-의존성 방식으로 억제하는 데 유효한 것으로 나타났다.
사람화 항체의 접합체는 이의 쥐 대응물보다 더 효능적인 것으로 나타났다. 당해 연구에서, 림프종의 현저한 성장 억제를 유도할 수 있는 칼리치아미신 접합체의 최저 용량은 10㎍/접합된 NAc-감마 칼리치아미신 DMH kg이었다. 대조적으로, 접합체와 유사한 계획으로 10mg/kg을 복강내로 투여한 비접합된 항체, G5/44는 종양 성장에 효과를 갖지 않았다.
유사한 연구를 RL 림프종 모델을 사용하여 수행하였다. 표 6은 CMC-544의 항종양 효과를 누드 마우스에서 300 내지 400mg 크기로 단계화된 RL NHL 종양에 대해 평가한 3개의 독립적 실험의 조합된 분석을 나타낸다. CMC-544는 용량-의존성 방식으로 종양이 3주의 단위를 거쳐 퇴행되도록 유도했다. 이들 연구의 통계 분석으로부터, RL 림프종 모델에서 CMC-544의 최소한의 유효량은 칼리치아미신 함량을 기준으로 하여 20㎍/kg이 됨이 입증되었다. 이들 3개의 연구 중 어느 하나에서도 사망은 없었다. 고용량(60-320㎍/kg)의 CMC-544는 RL 림프종의 거의 완전한 퇴행을 유발하였다. 종합하면, 2개의 B-세포 림프종 모델을 사용하여 수득한 결과는 CMC-544의 종양 퇴행 유도 능력을 명백히 입증한다.
Figure pat00007
신규한 과정에 의해 제조된 CMC-544가 확립된 거대 B-세포 림프종 이종이식체의 성장을 억제시키는 능력을 라모스 및 RL 림프종 모델을 사용하여 또한 조사하였다. 1, 5 및 9일째에 본래의 투여 계획을 유지하면서 접합된 칼리치아미신 160㎍/kg의 용량으로 CMC-544 또는 이소형-매치된 음성 대조군 접합체(CMA-676)를 복강내로 투여한 후, 종양이 1.5 또는 2g의 종양 질량으로 성장 및 단계화되었다. 동일한 투여 계획은 일찍이 단계적 소형 종양의 장기 지속 퇴행을 유발하는 것으로 조기에 나타났다(표 6을 참조). 도 19에 나타낸 바와 같이, 거대 라모스 림프종-보유 마우스에게 CMC-544를 투여하면, 기존의 림프종 질량의 점진적인 퇴행을 유발하였으며 20일째에, 4마리의 종양-보유 마우스 중 3마리가 종양을 함유하지 않았다. 이들 종양-비함유 마우스를 최대 50일까지 관찰한 결과, 어떠한 퇴행된 라모스 림프종에서도 재성장이 나타나지 않았다. 대조적으로, 이소형-매치된 대조군인 CMA-676은 종양 성장에 대한 효과를 갖지 않았다. 5마리의 CMA-676-처리된 거대 종양-보유 마우스 중 4마리는 이들의 종양 부하가 이들의 체중의 15%에 근접하게 도달하였기 때문에, 15일 전에 치사시켜야 했다.
CMC-544를 사용한 유사한 실험을 RL 림프종 모델에서 수행하였다. 상기한 바와 유사한 계획대로 CMC-544를 160㎍/kg의 용량으로 복강내 투여하면, 30일 내에 RL 림프종의 기존 질량의 90%를 초과하는 퇴행이 유발되었다. 그러나, 45일째까지, 수축된 림프종을 갖는 상기 그룹의 2마리의 마우스에서 종양의 재성장이 나타났다. 이러한 결과는 CMC-544가 확립된 소형 및 거대 림프종의 퇴행을 유발할 수 있음을 나타낸다. 본원에 나타내지 않은 소수의 연구에서, 산발적으로 재성장한 RL 림프종을 초기 CMC-544-유도된 퇴행 후 다시 CMC-544로 재처리하였다. 이들 연구는 RL 종양이 여전히 CMC-544를 사용한 처리의 제2 과정에 반응적이며 다시 퇴행됨을 나타내었다. 따라서, CMC-544를 사용한 처리는 반복 요법에 잠재력이 있는 소형 및 거대 중량의 B-세포 림프종 둘 다에 효과적일 수 있다.
II. CMA-676 및 CMC-544 접합 방법으로 제조한 접합체의 생체내 비교
도 20은 단계적 RL 림프종-보유 마우스에 표준 투여 계획을 사용한 CMA-676 접합 방법 및 CMC-544 접합 방법을 사용하여 제조된, 2가지 상이한 용량(접합된 칼리치아미신 80 및 320㎍/kg)의 CMC-544를 투여한 대표적 실험의 결과를 나타낸다. 관찰된 항-종양 효능은 예측한 바와 같이 용량-의존성이며 2개의 CMC-544 제제 중 어느 것의 효능에도 차이가 없었다. 대조적으로, 160㎍/kg으로 복강내로 투여된 비접합된 N 아세틸-감마 칼리치아미신 DMH는 불활성이었다. 그러나, 접합된 칼리마이신의 각각의 용량에 대해, 접합체의 형태로 투여된 항체 단백질의 양은 CMC-544 방법에 의해 제조된 것보다 CMA-676 방법에 의해 제조된 CMC-544 경우에 4배 더 높았다는 것이 강조되어야 한다. 표적 접합체의 칼리치아미신 함량이 주로 항종양 효과의 유발을 초래하였기 때문에, 매우 소량의 표적 항체를 사용하는 신규한 방법에 의해 제조된 접합체를 통해 칼리치아미신의 필요량을 운반할 수 있다. CMC-544 방법에 의해 제조된 접합체의 증가된 부하량은 저접합 분획(LCF)의 양을 현저히 결핍시키기 때문에 효과적이다.
III. 리툭시마브(RituxanTM)-내성 종양의 처리
탐구되어야 할 다음 문제는 시판되는 항-CD20 리툭시마브(RituxanTM)의 처리를 중단한 후 성장한 B-세포 림프종이 여전히 CMC-544 처리에 반응적일 것인지의 여부이다. 이를 위하여, 발병중인(비단계적) RL 림프종을 3주 동안 리툭시마브(RituxanTM)으로 처리하였다. 리툭시마브(RituxanTM) 요법이 지속되는 한, RL 림프종의 성장은 억제되었다. 리툭시마브(RituxanTM) 요법을 중단한 직후, RL 림프종은 160㎍/Kg의 복강내 용량의 CMC-544로 처리하였을 때, 약 1g 질량의 크기로 빠르게 성장하였다. 도 21 및 22에 나타낸 바와 같이, 이들 RL 림프종은 60일째에 종양을 함유하지 않은 마우스의 80%에서 여전히 CMC-544에 반응적이었다. 따라서, CMC-544는 오직 리툭시마브(RituxanTM)의 연속적 투여에 의해서만 억제될 수 있는 3개의 용량으로 B-세포 림프종의 퇴행을 유도할 수 있다.
실시예 8
CMC-544의 시험관내 및 생체내 효과
I. 결합 및 세포독성 연구
CMC-544는 CD22에 대한 결합을 평가하였으며 또한 시험관내 및 생체내 모델에서 이의 활성을 평가하였다. CMC-544는 또한 AcBut 연결된 칼리치아미신을 갖는 hP67.6(IgG4)의 이소형-매치된 대조군 접합체인 CMA-676 및 시판중이며 Medworld Pharmacy(Chestnut Ridge, NY)로부터 구입가능한 키메라 IgG1 항-CD 20 mAb(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA.)인 리툭시마브(RituxanTM)와 비교하였다, 다음의 항체를 G5/44 결합 도메인 연구에 사용하였다: BU12(Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239(Santa Cruz Biotech, Santa Curz, CA); RFB-4(Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 및 To 15(Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13 및 M5/44(Celltech, Slough, UK). 차단 연구에 사용된 부가적 항체는 SJ10(Immunotech, Fullerton, CA) 및 M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1(Celltech, Slough, UK)였다. 버킷 림프종 세포주 라모스(CRL-1923) 및 비-호지킨 림프종(NHL) 세포주 RL(CRL-2261)을 포함하는 연구용 세포주는 모두 아메리칸 타입 컬처 콜렉션으로부터 입수하였다. 세포주들은 폴리머라제 연쇄반응 미코플라스마 검출 검정에 의해 미코플라스마를 함유하지 않는 것으로 측정되었다(ATCC, Manassas, VA). 당해 세포주를 10% FBS, 10mM HEPES, 1mM 나트륨 피루베이트, 0.2% 글루코스, 페니실린 G 나트륨 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 설페이트 100㎍/㎖을 첨가한 RPMI 배지에서 현탁액 배양물로서 유지시켰다.
G5/44가 CD22에 대한 공지된 특이성의 쥐 mAbs의 결합을 억제할 수 있는지의 여부는 비아코어 CM5 칩에 고정된 Fc-CD22를 사용한 BIAcore 분석에 의해 평가하였다. 고정된 Fc-CD22를 G5/44로 우선 포화시키거나 포화시키지 않음으로써 수득된 표면 플라스몬 공명 단위(RU)를 비교하였다. 생분자 상호작용 분석은 BIACORE 2000을 사용하여 수행하였다. 항체를 공 대조군 표면(대조군으로서 제공된 유동세포 1, 단백질이 커플링되지 않음) 및 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 9,042RU의 수준으로 고정된 Fc-CD22의 시험 표면(유동세포 2) 위로 통과시켰다. 수득된 센소그램은 유동세포 2상의 반응(RU)에서 유동세포 1상의 반응(RU)를 감한 것이었다. 제2 센소그램은 이미 이들의 결합에 대해 특성화된 CD22에 대한 쥐 mAbs를 도입하기 전, 먼저 유동세포를 G5/44(100㎍/㎖)로 포화시킴으로써 수득하였다. G5/44 반응을 측정한 직후, G544를 제거하지 않고 쥐 항-CD22 mAbs를 개별적으로 관류시켰다. G5/44-피복된 CD22에 쥐 항-CD22 mAb가 결합됨으로 인해 생성된 제2의 조합 반응을 또한 기록하였다. 쥐 항체가 G5/44에 의해 점유된 부위와 관련없는 부위에서 CD22에 결합된 경우, 조합 반응은 첨가적일 수 없을 것이다. CD22에 대한 G5/44의 결합이 제2 항체의 결합을 간섭하거나 방해하는 경우, 조합 반응을 첨가할 수 없을 것이다. 각각의 제2 조합 측정을 G5/44:CD22 상호작용의 "해리 속도(off-rate)"에 대해 교정하였다.
G5/44는 오직 에피토프 A/CD22의 Ig-유사 도메인 1(SHCL1 Leu 14 및 HD239)에 결합되는 이들 항체의 결합만을 차단하였으며, 이는 G5/44가 또한 CD22의 이들 도메인에 결합됨을 나타낸다. 에피토프 B/CD22의 Ig-유사 도메인 3(RFB-4), 에피토프 C/CD22의 Ig-유사 도메인 4(To 15) 및 CD22의 Ig-유사 도메인 2(4KB128)에 결합하는 항체는 G5/44에 의해 차단되지 않았다. 이들 결과는 CD22상의 G5/44-결합 부위가 제1 Ig-유사 도메인상에 위치함을 나타내는데, 이는 이것이 CD22의 제1 Ig-유사 도메인(에피토프 A)를 인식하는 이들 항-CD22 mAb의 결합을 억제하기 때문이다. 다른 항-CD22 항체인 비공지된 아특이성의 M6/13(Celltech, Slough, UK)를 또한 G5/44(Celltech, Slough, UK)로 차단시켜 CD22의 제1 에피토프 A/Ig-유사 도메인 1에 대한 M6/13의 결합 부위를 지도화하였다. G5/44와 동일한 특이성을 갖는 G5/44의 쥐 부모인 항체 M5/44는 G5/44의 결합을 억제하며, 양성 대조군으로서 작용한다. 항-CD19 항체 BU12는 이들 평가에서 음성 대조군으로서 작용한다. 당해 결과는 표 7에 요약되어 있다.
Figure pat00008
CD22에 개별 도메인에 대한 공지된 결합 특이성의 쥐 mAbs를 사용하여, G5/44의 B-세포에 대한 이들 항체의 결합을 방해하는 능력을 조사하였다. 추가로, mAbs의 B-세포에 대한 G5/44의 결합을 방해하는 능력을 또한 조사하였다. 이들 연구에서, 1 ×105 라모스 세포를 G5/44(10㎍/㎖)에 노출시키기 전에, 먼저 쥐 항-CD22 항체(사람화된 G5/44 또는 마우스 모노클로날 항-CD22 10㎍/㎖)에 4℃에서 1시간 동안 노출시켰다. 세포를 4℃에서 부가적으로 1시간 동안 항온처리하였다. 항체 처리 후, B-세포를 펠렛화시켰고 PBS-1% BSA로 세척하였으며 PBS-1% BSA 중 1:100 희석액 100㎕의 적합한 제2 항체를 4℃에서 30분 동안 첨가하였다(FITC-염소 항-사람(중쇄 및 경쇄) 또는 FITC-염소 항-마우스(중쇄 및 경쇄)). 다시 세포를 펠렛화시키고, 세척하고, PBS-1% BSA에 재현탁시키고 PBS-1% 포름알데히드 250㎕를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 세포와 관련된 형광 강도를 BD FACSort 유세포측정기를 사용하는 유세포측정법으로 측정하였다.
결과는 CD22+ B-세포에 대한 G5/44의 사전 노출이 항-CD22 mAbs M5/44 및 M6/13의 연속적인 결합을 현저히 억제시켰음을 나타내었다. 대조적으로, B-세포에 대한 항-CD22 mAbs RFB4, To15, HD239 및 4KB의 결합은 G5/44에 의해 억제되지 않았다. 특히, BIAcore 분석이 G5/44가 CD22에 대한 HD239의 결합을 억제할 수 있음을 나타냈기 때문에, 유세포측정법에 의해 검출된 바와 같이 G5/44에 의한 B-세포에 대한 HD239의 현저한 억제의 결핍은 기대되지 않았다. G5/44에 의한 HD239의 강한 억제의 결핍은 CD22에 대한 이들의 상대적 친화도에서의 상이함을 기준으로 하여 설명될 수 있다. 상기한 쥐 항-CD22 mAbs를 CD22+ B-세포에 대한 G5/44의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대해 측정하는 경우, SHCL1 및 M6/13은 G5/44의 결합을 억제하였지만, 다른 항-CD22 mAbs는 억제하지 않았다. HD239 및 SHCL1의 결합 에피토프를 CD22의 제1 Ig-유사 도메인에 대해 맵핑하여 왔다. 그러나, M6/13 또는 M5/44에 의해 인식되는 에피토프는 맵핑되어 있지 않다. 위에 상세히 설명한 방해 연구는 상기한 항체가 에피토프 A로서 전체적으로 공지된 CD22의 제1 Ig-유사 도메인상에 위치한 에피토프를 인식함을 나타낸다.
2만개의 라모스 세포를 리툭시마브(RituxanTM)의 유무하에 다양한 용량의 CMC-544와 함께 96시간 동안 항온처리하였다. 96시간 후, 유세포측정에 의해 분석한 프로피윰 요오다이드 배제에 의해 세포 생존능을 측정하였다. 3개 내지 6개 웰의 평균 생존능을 계산하였고, 각종 처리에 대해 세포 생존능의 용량 반응 억제를 계산하였다. 세포 생존능의 배경 반응 억제는 CMC-544의 0 농도로부터 계산하였다. CMC-544가 ㎖당 칼리치아미신 DMH 0.01 내지 3ng의 용량 범위에 걸쳐 통계학적으로 유의적인 용량-의존성 라모스 세포 성장 억제를 유발하는지의 여부를 시험하기 위해 병참 회귀를 사용하였다. 또한 CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM)의 상호작용이 통계적으로 유의적인의 여부를 측정하기 위해서도 병참 회귀를 사용하였다. 또한 중간 억제 농도(IC50)를 계산하였고 CMC-544만을 사용한 처리에 비교한 각각의 처리의 효과를 기록하였다. SAS 버전 8.2의 PROBIT 방법을 사용하여 통학적계 분석을 수행하였다.
연구 결과는 CMC-544가 ㎖당 칼리치아미신 DMH 0.01 내지 3ng의 용량 범위에 걸쳐 용량-의존적으로 라모스 세포 성장 억제를 유도함을 나타내었다. CMC-544 단독의 중간 억제 농도(IC50)는 0.029ng/㎖이었다. 2, 20 및 200㎍/㎖ 농도의 리툭시마브(RituxanTM)을 CMC-544 처리된 세포에 첨가하여 CMC-544의 세포독성 활성과 리툭시마브(RituxanTM)의 상호작용이 통계학적으로 유의적인지의 여부를 측정하였다. CMC-544 없이 20 및 200㎍/㎖으로 첨가된 리툭시마브(RituxanTM)은 그 자체로는 세포 성장에 현저한 효과를 갖지 않았다(각각, 비히클 성장의 111.7% 및 94.0%). CMC-544와 함께, RituxanTM의 3개 농도 모두가 CMC-544 용량-반응 곡선의 기울기 및 절편에서 통계학적으로 유의적인 (p<0.05) 왼쪽으로의 이동을 산출하였다. 리툭시마브 2 및 200㎍/㎖의 병용제제는 용량-반응 곡선에서 가장 큰 이동을 산출하였다. 이들 2개의 곡선은 각각 서로 통계적으로 상이하지는 않았지만 20㎍/㎖ 용량 병용제제과는 현저하게 상이했다(p<0.05). 제2의 연구(결과는 나타내지 않음)는 제1 연구에서 관측된 결과를 확증하였다. 리툭시마브(RituxanTM) 2, 20 및 200㎍/㎖에 CMC-544를 합한 병용제제에 대한 중간 억제 농도는 각각, 0.0072, 0.0081 및 0.0072ng/㎖이다. CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM)의 합의 중간 억제 농도는 CMC-544 단독의 IC50보다 대략 4배 더 효능적이었다.
II. SCID 마우스에서의 생체내 항-종양 활성 피하 이종이식 및 체계적으로 범발성 B-세포 림프종
18 내지 22g의 암컷, 흉선 누드 마우스에 전신 방사선 조사(400rads)를 수행하였다. 방사선 조사는 추가로 마우스의 면역계를 억제하여 종양 침투를 증가시켰다. 방사선 조사 3일 후, 마우스의 등쪽, 오른쪽 옆구리에 마트리겔{Matrigel(Collavorative Biomedical Products, Belford, MA), RPMI 배지 중 1:1로 희석된} 중 107 RL 세포를 피하내로 주입하였다. 종양이 적합한 크기(0.3g, 통상 21일 후)에 도달하였을 때, 마우스당 0.2㎖의 멸균 염수 중 CMC-544, 리툭시마브(RituxanTM) 또는 CHOP 요법(아래를 참조)을 복강내로 투여하였다. 약물 투여 개시일을 1일로 간주하였다. 2개의 부가 용량을 5일 및 9일에 투여하였다(처리 = q4Dx3). CHOP 요법은 사이클로포스파미드(C), (CytoxanTM, Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ) 40mg/kg의 복강내 투여; 독소루비신 HCl(H), (Sigma-Aldrich, Co., St Louis, MO) 3.3mg/kg 복강내 투여; 빈크리스틴 (O), (GensiaSicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) 0.5mg/kg 복강내 투여; 및 프레드니손(P), (Roxane Labs., Columbia, OH) 0.2mg/kg 경구투여로 이루어져 있다. 프레드니손을 5용량(q2Dx5)으로 매일 경구투여한 반면, CHO는 CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM)(q4Dx3) 둘 다와 동일한 투여 계획에 따라 투여하였다. 주당 1회 이상 종양을 측정하고 종양 질량(g)=0.5(종양 너비/2)(종양 길이)로서 계산하였다. 그룹 평균 SEM을 계산하고 다수의 t-검정을 사용하여 통계학적 유의성에 대해 대해 비히클-처리된 그룹과 비교하였다. 그룹 평균은 최대 50일까지 또는 마우스의 치사시까지(그룹 평균을 분열시키는) 또는 종양이 너무 크게 성장하여(>3.5g) 마우스를 안락사시켜야만 할 때까지 기록하였다. 이러한 시기 후, 모든 처리 그룹에서 오직 각각의 개별 마우스에 대해서만 종양 질량을 기록하였다. 각각의 처리 그룹에 대한 각각의 연구 종반부에 다수의 종양이 제거된 마우스를 또한 기록하였다.
범발성 림프종에 대한 단독의 또는 다른 생활성 제제와 배합된 CMC-544의 효과를 측정하기 위해, SCID 마우스 모델을 사용하였다. 20 내지 25g의 수컷, SCID 마우스(CB17 SCID)에 꼬리 정맥을 통하여 106 라모스 세포를 주입하였다(0.2㎖). 세포 주입 후 3일 또는 9일에, 마우스에 비히클, 접합체(CMC-544 또는 CMC-676) 또는 리툭시마브(RituxanTM)을 복강내로 총 3용량으로 투여하였다. 3일의 처리 계획에 따라, 3, 7 및 11일에 마우스에 투여하였다. 9일의 처리 계획에 따라, 9, 13 및 17일에 마우스에 투여하였다. 9일의 처리 계획에서, CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM)의 병용제제를 또한 하기한 바와 같이 제공하였다. 뒷다리 마비의 존재에 대해 매일 관찰하였고, 이 시기에 마우스를 치사시켰다. 처리 그룹 당 7 내지 10마리의 마우스를 사용하였다. 그룹 평균 생존 시간(±SD), 중간, 최소 및 최대 생존 시간을 모두 계산하였다. 그룹 사이의 생존 분포의 상이함은 0.05 수준에서 보고된 유의성을 갖는 비지표 로그-횡렬 시험을 사용하여 측정하였다. 생존 곡선은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 구축하였다.
초기 연구는 범발성 림프종을 갖는 SCID 마우스의 생존 시간에 대한 2개의 상이한 용량 계획의 효과를 시험하였다. 제1 연구는 종양 세포를 정맥내로 주입한지 3일 후 개시 약물 용량을 조사하는 반면(발병중인 모델), 제2 연구는 종양 세포 주입후 9일까지 약물 투여를 지연시켰다(정착된 모델). 각각의 연구에서, CMC-544(160㎍/kg), CMA-676(160㎍/kg) 또는 리툭시마브(RituxanTM)(20mg/kg)을 4일 간격으로, 3용량으로 복강내로 투여하였다(Q4Dx3). 발병중인 모델에서, 비히클-처리된 마우스는 평균 27일의 생존 시간을 가졌다(도 23, 표 8). CMA-676, CMC-544에 대한 이소형-매치된 대조군은 생존 시간이 현저하게 증가하지 않았다(p>0.05). 리툭시마브가 생존 시간을 125일 이상(CMC-544보다 현저히 증대됨, p<0.05)으로 증가시키는, 완전한 효과를 가지는 반면, CMC-544는 41일까지 생존 시간이 현저하게 증가되었다. 종양 세포가 순환(회귀)되고 표적 조직(정착된 모델)내에 침전되는 기회를 가질때까지 지연된 투여는 CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM)에 대한 결과를 변화시켰다. 다시 CMA-676은 생존 시간에 현저한 효과를 갖지 않았다(도 24, 표 8). CMC-544는 평균 생존 시간을 83.5일까지 개선시킨 반면, 리툭시마브(RituxanTM)은 평균 생존 시간을 62.6일까지 증가시켰다. 정착된 모델에서 CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM) 사이의 현저한 상이함은 없었다.
Figure pat00009
리툭시마브(RituxanTM)이 CMC-544의 생존 반응에 대한 임의의 효과(긍정적 또는 부정적)를 갖는지의 여부를 측정하기 위해, 예비 연구를 수행하였다. 리툭시마브(RituxanTM)(20mg/kg, 표지된 고용량 약물 병용제제(HD))의 유무하에 CMC-544(160㎍/kg)을 투여하였다. 추가로, 저용량(80㎍/kg)의 CMC-544을 저용량(10mg/kg)의 리툭시마브(RituxanTM)과 함께 동시 투여하였다. 당해 연구에서 마우스의 수가 제한되어 있었기 때문에, 당해 화합물을 각각 80㎍/kg 또는 10mg/kg 용량으로 개별적으로 제공하지는 않았다. CMC-544(80㎍/kg)과 리툭시마브(RituxanTM)의 이러한 병용제제를 배지 용량 배합물(MD)로 라벨링하여 SCID 마우스 생존에 대한 약물의 저용량 병용제제의 가능성 측정을 위해 사용하였다. 단독으로 투여된 CMC-544(160㎍/kg) 및 리툭시마브(RituxanTM)(20mg/kg)은 상기한 정착된 모델에서 보고된 바와 같이 수행되었다. 각각은 평균 생존 시간을 각각, 58.5 및 50.5일까지 연장시켰다(도 25, 표 9). 이와 함께, 고용량 병용제제에 대해서는 평균 생존 시간이 64.4일로 약간(통계학적으로 유의적이지는 않지만, p>0.05) 개선되었다. CMC-544 80㎍/kg 및 리툭시마브(RituxanTM) 10mg/kg의 중간 용량 병용제제는 평균 92.4일까지 생존 시간을 현저히 개선시켰다(비히클-처리된 것에 대비하여 p<0.05). 이들 결과는 CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM)의 저용량 병용제제가 보증됨을 제안하였다.
Figure pat00010
CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM)의 추가의 배합 연구를 수행하였다. 다음의 처리 그룹이 사용되었다: 40, 80 및 160㎍/kg의 CMC-544; 5, 10 및 20mg/kg의 리툭시마브(RituxanTM); 40㎍/kg의 CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM) 5mg/kg의 합, 80㎍/kg의 CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM) 10mg/kg의 합 및 160㎍/kg의 CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM) 20mg/kg의 합. 모든 용량의 리툭시마브(RituxanTM)은 33 내지 40일의 범위로 평균 생존 시간을 약간 개선시켰다(모든 용량은 비히클-처리된 평균 생존 시간 25.8일에 비교하여 p<0.05, 도 26, 표 10). CMC-544 고용량, 160㎍/kg은 이전의 2개의 연구에서 보고된 결과와 일치하여, 평균 생존 시간을 85일까지 개선시켰다. CMC-544와 리툭시마브(RituxanTM)의 배합은 생존 시간에 현저한 개선을 주지는 않았다(도 27, 표 10). CMC-544의 2개의 저용량(80 및 40㎍/kg) 각각은 고용량 CMC-544 이상으로 평균 생존 시간을 현저히 개선시켰다(p<0.05). CMC-544 40 및 80㎍/kg 용량에 대해 각각, 마우스 90% 및 80%가 125일까지 계속 생존하였다. 약물 배합 그룹 둘 다 마우스 100%를 125일까지 생존시켰다. CMC-544의 저용량은 160㎍/kg의 고용량보다 유효하다.
CMC-544와 배합시킨 리툭시마브(RituxanTM)은 용량 시험(상기 참조)에서 SCID 마우스에서 범발성 B-세포 모델내의 CMC-544의 활성에 뚜렷한 효과를 갖지 않았다. 리툭시마브(RituxanTM)과 동시 투여된 CMC-544가 항-종양 활성의 증강 또는 억제를 유도하는지의 여부는 또한 Balb/c 누드 마우스내의 피하 RL B 림프종 이종 이식 모델을 사용하여 평가하였다. 피하 B 림프종 모델에서, 연구하에 2개의 요법제를 복강내로 투여한 후, 종양은 평균 종양 질량 300mg으로 단계화 되었다. CMC-544를 리툭시마브(RituxanTM)(20mg/kg Q4Dx3)의 유무하에 20 또는 80㎍/kg Q4Dx3으로 사용하였다. 리툭시마브(RituxanTM)의 동시 투여는 CMC-544의 치료 효능을 현저히(p>0.05) 증강시키지도 억제하지도 않았다(도 28). 단독으로 투여한 리툭시마브(RituxanTM)은 CMC-544의 저 투여량을 사용하여 관찰한 바와 유사하게, 당해 연구에서 RL B 림프종 성장을 억제하였다(20일에 종양 성장의 57% 억제, 비히클-처리된 것에 대비하여 p<0.05).
병용 화학요법 처방 CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)은 비-호지킨 림프종 환자를 위해 가장 통상적으로 사용되는 치료 양식이다. CHOP의 항-종양 효과를 정착된 RL B 림프종 이종이식체에서 CMC-544의 항-종양 효과와 비교하였다. CHOP 처방의 개별 성분은 누드 마우스에서 평가된 이들 각각의 최대 허용량으로 사용되었으며(데이타는 나타내지 않았다) 다음과 같았다: 사이클로포스파미드 (C) 40mg/kg 복강내 투여, 독소루비신 (H) 3.3mg/kg 복강내 투여, 빈크리스틴 (O) 0.5mg/kg 복강내 투여 및 프레드니손 (P) 0.2mg/kg 경구투여. CHO는 Q4Dx3으로 투여하였으며 P는 경구, Q2Dx5로 투여하였다. CMC-544는 160㎍/kg 칼리치아미신 등가의 투여량으로, 복강내, Q4Dx3으로 투여하였다. CHOP 처리는 초기에 RL B 림프종 성장의 현저한 억제를 유도하였다(도 29). 그러나, 3주 후, 종양이 비히클-처리된 그룹과 유사한 성장 속도로 재성장하였다. 대조적으로, CMC-544의 항종양 효과는 완전하였으며 실험 기간 동안 지속되었다. 이들 결과는 누드 마우스에서 최대 비치사량보다 현저히 낮은 용량의 CMC-544가 CHOP 배합 치료보다 더 유효하였음을 제안한다.
이들 연구는 CMC-544에 첨가된 리툭시마브(RituxanTM)이 라모스 B 림프종 세포를 사용하여 관측된 CMC-544의 세포독성 활성에 현저한 증가를 유도하였음을 나타내었다. 라모스 세포내에서의 리툭시마브(RituxanTM) 및 글루코코르티코이드에 대한 상승효과적 상호작용이 또한 최근에 보고되었다. 추가로, 리툭시마브(RituxanTM)이 10μM 덱사메타손과 함께 투여되는 경우, 8개의 부가적 세포주 중 4개에서 상승효과적 성장 억제가 관측되었다.
0.4 내지 10㎍/㎖의 리툭시마브(RituxanTM) 그 자체가 비록 작지만(최대 18%) 현저한 라모스 세포 성장의 억제를 유도함이 보고되었다. 추가로, 이는 10㎍/㎖에서 항온처리할 경우(48시간 항온처리), B-세포 비-호지킨 림프종 세포주에서 활성을 가졌다. 문헌[참조: Ghetie et al]은 리툭시마브(RituxanTM), 10㎍/㎖이 라모스 세포와 24시간 항온처리된 후, 아폽토시스를 6.2% 증가시켰음(비히클-처리된 세포에서 3.5%와 비교)을 나타내었다. 최근 연구에서, 용량 20 및 200㎍/㎖의 리툭시마브(RituxanTM)은 단독으로 투여될 경우, 라모스 세포 성장에 효과를 갖지 않았다. 마우스에서는, 범발성 모델 또는 피하 이종이식체 모델에서 CMC-544 및 리툭시마브(RituxanTM) 사이에 어떠한 상호작용의 증거도 없었다. 시험된 약물 병용제제는 각각 서로의 효과를 간섭하지도 증강시키지지도 않았다. 범발성 모델에서 각각의 약물의 용량 감소가 이러한 관측을 변화시킬 것인지의 여부를 측정할 필요가 있다.
라모스 세포를 갖는 범발성 B-세포 림프종 모델이 문헌[참조: Flavell et al.]에 기술되어 있다. 비히클-처리된 마우스에 대한 중간 생존 시간은 34 내지 36일인 것으로 보고되었다. 마우스는 뒷다리 마비가 발병되어 빈사상태가 되기까지 진행된 후, 곧 치사되었다. 기관의 조직학적 분석은 가장 통상적으로 포함되는 기관이 부신, 비장 및 지주막하 공간이었음을 나타내었다. 지주막하 공간 침윤물은 빈번하게 뇌로 확장되었다. 리툭시마브(RituxanTM)은 범발성 SCID 마우스에 대한 질병 진행의 초기 단계에 투여될 경우 잘 수행하였지만(도 23), 정착 단계의 모델에서 9일에 투여했을 경우는 수행정도가 덜하였다(도 24). IgG1 이소형인 리툭시마브(RituxanTM)은 아마 마우스 숙주 효과기 메카니즘을 통해 작동할 것이다. 이들 메카니즘은 보체-매개 세포독성 및/또는 SCID 마우스내에 존재하는 자연세포독성세포의 동원을 통한 항체 의존성 세포성 세포독성를 포함한다. 주입된 라모스 종양 세포는 아마도 세포가 감염된 기관내로 침윤될 기회를 갖기 전에, 리툭시마브(RituxanTM)에 의해 활성화된 숙주 면역 메카니즘에 대해 초기에 보다 감작화될 것이다. 비접합된 G5/44 항체(CMC-544내의 표적 분자)는 SCID 마우스내의 범발성 종양 모델에서는 아직 시험되지 않았지만, 피하 이종이식체로 투여될 경우, 효과를 갖지 않았다. IgG4 이소형인 G5/44는 숙주 효과기 메카니즘을 활성시킬 것으로 기대되지 않을 것이며, 따라서 항-종양 활성을 생산하지 않을 것이다.
칼리치아미신 접합된 G5/44(CMC-544)는 질병의 정착 단계에 투여되었을 경우 보다 나은 결과를 내는 리툭시마브(RituxanTM)과 정반대의 방식으로 행동하였다. 정착된 단계에서 CMC-544가 더 잘 수행되는 이유는 명확하지 않지만, 정착된 단계는 치료학적 상황을 보다 근접하게 나타낸다. 이소형-매치된 비결합 대조군 접합체인 CMA-676은 평균 생존 시간에 대한 어떠한 현저한 효과도 갖지 않았다. 범발성 SCID 모델에서의 결과는 최대 유효 용량(MED)를 측정하기 위해 CMC-544의 용량을 감소시킬 필요가 있음을 분명히 제안한다. 160㎍/kg 용량은 80 및 40㎍/kg의 저용량보다 덜 활성적이었다. 이러한 이유는 분명하지 않지만, 160㎍/kg 용량은 MED 이상으로 유효할 수 있다. 추가의 연구는 이러한 조직에 초점을 맞추도록 계획된다.
문헌[참조: Mohammad et al.]은 확산된 대세포 림프종 세포주, DLCL를 갖는 피하 이종이식체 모델에 CHOP 요법(사이클로포스파미드 (C) 40mg/kg 정맥내 투여, 독소루비신(H) 3.3mg/kg 정맥내 투여, 빈크리스틴(O) 0.5mg/kg 정맥내 투여 및 프레드니손 (P) 0.2mg/kg 경구 투여)을 사용하였다. CHOP 요법을 위해 사용된 용량은 이들의 최대 허용량이 되도록 결정하였다. CHO는 1회 정맥내 투여하고, P는 5일 동안 매일 투여한 요법은 '활성'으로 평가되었으며, 25.8%의 T/C를 생산하였다. 어떠한 종양 치료도 기록하지 않았다. 문헌[참조: Mohammad et al.]에 기록된 모델에서의 결과는 본원에 기술한 RL 모델에서 CHOP 요법(복강내, Q4Dx3로 투여됨)을 사용하여 관측된 바와 유사하게 나타난다. 어떠한 연구에서도 CHOP는 CMC-544와 달리, 장기 치료를 야기하지 않았다.
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실시예 9
CMC-544의 안정한 제형
생체내 투여용의 CMC-544의 안정한 제형을, 희석제, 부형제, 담체 및 안정화를 첨가하여 제조하였다. HIC 크로마토그래피 후, 크로마토그래피 분획을 SEC-HPLC 및 다중파장 UV 분석으로 검정하였다. 적절한 분획을 상기 분석에 기초하여 혼주물로부터 선택하였는데, 이는 응집물 함량, 단백질 농도 및 칼리치아미신 부하량에 대한 정보를 제공하였다. 부형제, 안정화제, 벌크제 및 완충제를 첨가하여 당해 용액을 안정화시켰다. CMC-544가 다수의 분해 경로를 통해 분해될 수 있기 때문에, 제형의 개발시에 물리적 불안정성을 고려해야할 필요가 있었다. 제형의 개발시에 주요 고려사항 중 하나는 항체로부터 칼치아마이신의 가수분해 속도가 최소화되어야 하는 한편, 항-CD22 항체의 물리적 및 화학적 일체성이 유지되어야 한되는 점이다. 또한, 특정 pH 및 농도 조건하에 일어날 수 있는 칼리치아미신-항체 접합체의 침전이 최소화되어야 할 필요가 있었다.
단량체 칼리치아미신 유도체-항체 접합체의 제형을 개발하는데 있어, 제형의 pH가 결정적인데, 그 이유는 이것이 분해 및 물리적 불안정성을 최소화시키기 때문이다. 칼리치아미신 및 접합체의 적절한 용해도를 유지하기 위해 8.0의 pH를 선택하였다. SDS-PAGE 및 항원 결합 ELISA를 사용하여 수득한 추가 데이터는 당해 항체의 중요한 구조적 일체성 및 특이성이 8.0의 pH에서 유지됨을 나타냈다. 따라서, 트로메타민을 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제로서 선택하였다. 대안적 완충제는 이염기성 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함할 수 있다. 완충 농도의 범위는 5 내지 50mM일 수 있다. 최적의 안정성/용해도에 대해 7.5 내지 8.5의 pH 범위가 바람직한 것으로 제안된다. 제조된 생성물에 대한 통상적 pH 사항은 7.0 내지 9.0이다.
완충된 접합체 용액의 안정성이 단시간 동안은 적절하다 해도, 장기간의 안정성은 불량하다. 접합체의 저장기간을 개선시키는데 동결건조를 사용한다. 단백질 용액의 동결건조와 관련된 문제는 익히 문서화되어 있으며, 2차, 3차 및 4차 구조의 손실이 동결 및 건조 과정 동안 일어날 수 있다. 당해 접합체의 무정형 안정화제로서 작용하며 동결 및 건조 동안 항체의 구조적 일체성을 유지하는 슈크로스를 당해 제형이 포함시킨다. 또한, 덱스트란 40 또는 하이드록시에틸 전분과 같은 중합체성 완충제를 혼입시켜, 0.5 내지 1.5중량%의 농도에서 동결건조된 케이크의 외관 및 물리적 강성을 향상시킬 수 있다. 이러한 물질은 비교적 낮은 농도에서 동결건조된 케이크를 형성시키고, 동결건조된 제형의 전체 고체 함량을 최소화시키는데 사용할 수 있어 보다 신속한 동결건조를 가능하게 한다. 제형 연구는 0.9중량%의 덱스트란 40 농도를 사용하였다.
접합체의 용해도를 향상시키기 위해 폴리소르베이트 80을 제형에 포함시킨다. 0.01%의 바람직한 농도와 함께 0.005 내지 0.05%의 잠재적 범위를 사용한다. 또한, 트윈을 0.91 내지 0.05용적%의 농도에서 당해 제형에 첨가한다.
전해질이 당해 제형중에 존재할 수도 있으며 최종 정제 공정의 효율을 개선시키기 위해 사용할 수 있다. 염화나트륨은 통상적으로 0.01 내지 0.1M의 농도에서 사용한다. 황산나트륨과 같은 추가의 전해질은 보다 용이하게 동결건조될 수 있기 때문에 이를 염화나트륨의 대체물로서 사용할 수도 있다. 임의로, 최종 CMC-544 용액은 1.5중량% 슈크로스, 0.9중량% 덱스트란 40, 0.01중량% 트윈 80, 50mM 염화나트륨, 0.01중량% 폴리소르베이트 80 및 20mM 트로메타민을 포함한다.
동결건조 전에 용액에 대한 대표적 제형은 다음과 같이 제시된다: CMC-544 0.5mg/mL, 슈크로스 1.5중량%, 덱스트란 40 0.9중량%, 염화나트륨 0.05M, 트윈 0.01 내지 0.05용적%, 폴리소르베이트 80 0.01중량%, 트로메타민 0.02M, pH 8.0 및 물. 당해 용액을 +5℃ 내지 10℃의 온도(임의로, +5℃)에서 호박색 바이알에 첨가하고, 용액을 -35℃ 내지 -50℃의 동결 온도(임의로, -45℃)에서 동결시키고, 동결된 용액을 20 내지 80마이크론의 1차 건조 압력(임의로 60마이크론)에서 초기 동결 건조 단계에 도입시키고, 동결-건조된 생성물을 24시간 내지 72시간 동안(임의로 60시간 동안) -10℃ 내지 -40℃의 저장 온도(임의로 -30℃)에서 유지시키고, 마지막으로 동결-건조된 생성물을 20 내지 80마이크론(임의로 60마이크론)의 건조 압력에서 +10℃ 내지 +35℃(임의로 +25℃)의 저장 온도에서 15시간 내지 30시간(임의로 24시간) 동안 2차 건조 단계에 도입시킨다. 압력 상승 시험을 사용하여 1차 건조의 종결을 결정한다. 동결건조 사이클의 종결시에, 바이알을 질소로 역충전시키고 마개로 덮는다.
표 11은 CMC-544용으로 사용된 제형 및 CMC-676용으로 사용된 제형 사이의 차이를 제시한다. CMA-676 제형과 CMC-544용으로 사용된 제형 사이의 유의차는 새로운 제형 중의 감소된 단백질 농도(0.5/mL), 완충제로서의 트로메타민의 사용 및 0.01% 트윈 80의 존재를 포함한다. 이로써, 재구성된 CMA-676 제형에서 나타난 혼탁도와 대조적으로 청정한 신규한 제형 중의 재구성된 재구성된 CMC-544가 수득된다(도 12 및 13 참조).
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Figure pat00013
Figure pat00014
상기 인용된 모든 참조문헌 및 특허는 본원에서 참조로 인용된다. 본 발명의 수많은 변형 및 변화가 상기 확인된 명세서에 포함되며 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것으로 예상된다. 접합 공정, 상기 접합 공정에 의해 제조된 접합체 및 접합체를 포함하는 조성물/제형에 대한 이러한 변형 및 변경은 하기 청구의 범위내에 포함될 것으로 사료된다.
참조문헌
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<110> WYETH HOLDINGS CORPORATION <120> Calicheamicin derivative-carrier conjugates <130> 10-2004-7017670 <150> US 60/377,440 <151> 2002-05-02 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <220> <223> 5/44g CDR-H1 <220> <221> <400> 1 Asn Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <220> <223> mouse monoclonal 5/44 CDR-H2gL1 T3 <220> <221> <400> 2 Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> mouse <220> <223> mouse monoclonal 5/44 CDR-H3 <220> <221> <400> 3 Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <220> <223> mouse monoclonal 5/44 CDR-L1 <220> <221> <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <220> <223> mouse monoclonal 5/44 CDR-L2 <220> <221> <400> 5 Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <220> <223> mouse monoclonal 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Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gH6 <220> <221> <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gH7 <220> <221> <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full sequence of grafted light chain <220> <221> <400> 28 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Val Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys 50 55 60 Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 781 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full sequence of grafted light chain <220> <221> <400> 29 ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt 60 cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta 120 ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180 acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga 240 atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag tggtactgat 300 ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa 360 ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta 420 gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720 aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt 780 c 781 <210> 30 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full sequence of grafted heavy chain <220> <221> <400> 30 Met Asp Phe Gly Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Gly Lys 465 <210> 31 <211> 2160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full DNA sequence of grafted heavy chain <220> <221> <400> 31 aagcttgccg ccaccatgga cttcggattc tctctcgtgt tcctggcact cattctcaag 60 ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa gcctggtgct 120 tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gattcattgg 180 gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc cgggaataac 240 tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga cacctccaca 300 agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt gtactattgt 360 actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gggtacccta 420 gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480 aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720 aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780 ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840 catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900 ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc ccaggccctg 960 cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1020 cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc 1080 tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc 1140 catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 1200 ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1260 tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 1320 aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620 gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680 tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 1740 atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800 ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860 cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 1920 caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980 caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc 2040 aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtcta 2100 catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaattc 2160 <210> 32 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 T1 <220> <221> <400> 32 agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt gcttccgtca 60 aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac 94 <210> 33 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 T2 <220> <221> <400> 33 gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaag ggcagagcaa 60 cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 96 <210> 34 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 T3 <220> <221> <400> 34 agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc 60 acagtctcct cagcttctac aaagggccca agaaa 95 <210> 35 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544 gH1 B1 <220> <221> <400> 35 ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga 60 atccgaagtc catggtggcg gcaagctttt attc 94 <210> 36 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 B2 <220> <221> <400> 36 gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc 60 aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 97 <210> 37 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1B3 <220> <221> <400> 37 cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag 60 atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 93 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 F1 <220> <221> <400> 38 gaataaaagc ttgccgccac c 21 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gH1 R1 <220> <221> <400> 39 tttcttgggc cctttgtaga ag 22 <210> 40 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 T1 <220> <221> <400> 40 gcttcccggg gtgacgttca agtgacccag agcccatcca gcctgagcgc atctgtagga 60 gaccgggtca ccatcacttg tagatcc 87 <210> 41 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 T2 <220> <221> <400> 41 tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt 60 agtggtgtac cagacaggtt cagcggttcc 90 <210> 42 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 T3 <220> <221> <400> 42 agatttcgcc acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat tcggtcaggg 60 tactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c 91 <210> 43 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 B1 <220> <221> <400> 43 gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc ctaacaggca 60 acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc 88 <210> 44 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 B2 <220> <221> <400> 44 ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac 60 tctgactgga tctacaagtg atggtgac 88 <210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1B3 <220> <221> <400> 45 aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag 60 taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg 90 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 544gL1 F1 <220> <221> <400> 46 ggatgattcg aagccgccac 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 544gL1 R1 <220> <221> <400> 47 gcacgccgta cgtttgattt c 21 <210> 48 <211> 339 <212> DNA <213> mouse <220> <223> DNA sequence of mouse monoclonal 5/44 VL <220> <221> <400> 48 gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60 atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120 tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180 tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 339 <210> 49 <211> 363 <212> DNA <213> mouse <220> <223> DNA sequence of mouse monoclonal 5/44 VH <220> <221> <400> 49 gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120 cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat 180 aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240 atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc 300 tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 50 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence within oligonucleotide primer <400> 50 gccgccacc 9 <210> 51 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' oligonucleotide primer <400> 51 gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60 ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g 101

Claims (1)

  1. (1) 단백질성 운반체에 대해 4.5 내지 11중량%인 세포독성 약물 유도체를 단백질성 운반체에 첨가하는 단계;
    (2) (a) 유기 조용매 및 (b) 하나 이상의 C6-C18 카복실산 또는 이의 염을 포함하는 첨가제를 추가로 포함하는, pH가 약 7 내지 9의 범위인 비친핵성, 단백질-혼화성 완충 용액 중에서 세포독성 약물 유도체 및 단백질성 운반체를 약 30℃ 내지 약 35℃에서 약 15분 내지 24시간 범위의 시간 동안 항온처리하여 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체를 제조하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 제조된 접합체를 크로마토그래피 분리 공정에 도입시켜, 세포독성 약물의 부하량 범위가 4 내지 10중량%이고 저접합 분획(low conjugated fraction; LCF)이 10% 미만인 단량체성 세포독성 약물 유도체/단백질성 운반체 접합체를 비접합된 단백질성 운반체, 세포독성 약물 유도체 및 응집된 접합체로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 저접합 분획(LCF)이 감소된 하기 화학식의 단량체성 세포독성 약물/운반체 접합체의 제조방법.
    Pr(-X-W)m
    상기 화학식에서,
    Pr은 단백질성 운반체가고,
    X는 단백질성 운반체와 반응할 수 있는 임의의 반응성 그룹의 생성물을 포함하는 링커이고,
    W는 세포독성 약물이며,
    m은 세포독성 약물이 당해 접합체의 7 내지 9중량%를 차지하도록 하는 정제된 접합 생성물에 대한 평균 부하량이며,
    (-X-W)m은 세포독성 약물 유도체이다.
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