ES2693370T3

ES2693370T3 - Politerapia de un anticuerpo CD20 afucosilado con un conjugado de anticuerpo CD22-fármaco

Info

Publication number: ES2693370T3
Application number: ES14721825.9T
Authority: ES
Inventors: Christian Klein; Sabine Lang; Andrew Polson; Pablo Umana
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: MX2015014501A; MY192404A; JP2016519125A; KR20150139883A; AU2014261456B2; HK1211962A1; BR112015027474A2; US20170306040A1; EP2992015B1; RU2015151455A; IL242161B; BR112015027474A8; CA2904040A1; JP6207721B2; AR096184A1; MX370829B; EP2992015A1; NZ711867A; KR101817409B1; ZA201506512B

Abstract

Obinutuzumab, para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con el conjugado de anticuerpo CD22-fármaco anti-CD22-MC-vc-PAB-MMAE, en el que el anticuerpo anti-CD22 en dicho conjugado de anticuerpo CD22-fármaco comprende el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 50 y el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 51.

Description

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1) el ensayo usa células diana que se sabe que expresan el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo;

2) el ensayo usa como células efectoras las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas 5 aisladas de la sangre de un donante sano elegido aleatoriamente;

3) el ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo siguiente:

ii) las PBMC se aíslan usando procedimientos estándar de centrifugación por densidad y se suspenden a 5 × 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI;

iii) las células diana se cultivan por procedimientos estándar de cultivo de tejidos, se obtienen de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a un 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microcurios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de

15 cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml;

iv) se transfieren 100 microlitros de la anterior suspensión final de células diana a cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos;

v) el anticuerpo se diluye en serie de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microvaloración de 96 pocillos, sometiendo a prueba por triplicado diversas concentraciones de anticuerpo que abarcan el intervalo de concentraciones completo anterior;

25 vi) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales de la placa que contienen las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2 % (VN) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);

vii) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales de la placa que contienen las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);

viii) a continuación, se centrifuga la placa de microvaloración de 96 pocillos a 50 x g durante 1 minuto y 35 se incuba a 4 ºC durante 1 hora;

ix) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) a cada pocillo para generar una proporción de células efectoras:diana de 25:1 y se colocan las placas en un incubador en una atmósfera con un 5 % de CO2 a 37 ºC durante 4 horas;

x) se obtiene el sobrenadante libre de células de cada pocillo y se cuantifica la radiactividad liberada experimentalmente (ER) usando un contador gamma;

xi) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo de acuerdo con

45 la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, donde ER es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpo, MR es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles MR (véase el punto v anterior) y SR es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles SR (véase el punto vi anterior);

4) "ADCC aumentada" se define como un aumento en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior y/o bien una reducción en la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior. El aumento

55 de ADCC se refiere a la ADCC, medida con el ensayo anterior, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que se conocen por los expertos en la técnica, pero que no se han producido en células huésped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.

Dicha "ADCC aumentada" se puede obtener por glucomanipulación de dichos anticuerpos, lo que significa potenciar dichas funciones efectoras naturales mediadas por células de los anticuerpos monoclonales manipulando su componente oligosacárido, como se describe en Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 y US 6.602.684.

65 El término "citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células tumorales humanas diana por el anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia del complemento. La CDC se mide

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EU: Ser 400; número secuencial 403 manipulada para que sea Cys en esa posición). En otros aspectos, la cisteína manipulada de la cadena pesada (incluyendo la región Fc) se encuentra en una cualquiera de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración EU): 41, 88, 116, 118, 120, 171, 282, 375 o 400. Por tanto, los cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo original anti-CD22 de la invención son: A41C, A88C, S116C, A118C, T120C, A171C, V282C, S375C o S400C. En otros aspectos, la cisteína manipulada de la cadena ligera se encuentra en una cualquiera de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat): 15, 43, 110, 144, 168, 205. Por tanto, los cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo original anti-CD22 de la invención son: V15C, A43C, V110C, A144C, S168C o V205C.

Un anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre, en el que el anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína se une a un polipéptido CD22 y se prepara mediante un procedimiento que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácido de un anticuerpo original anti-CD22 por cisteína, en el que el anticuerpo original comprende al menos una secuencia de HVR seleccionada de:

(SEQ ID NO: 9) o la secuencia

(b): una secuencia de HVR-L2

imagen17SEQ ID NO: 12 (figura 3B);

(c): una secuencia de HVR-L3

imagen17(SEQ ID NO: 14) (figura 3B);

(d): una secuencia de HVR-H1

imagen17(SEQ ID NO: 2) (figura 3A);

(e): una secuencia de HVR-H2

imagen18(SEQ ID NO: 4 (figura 3A); y

(f) una secuencia de HVR-H3

imagen17(SEQ ID NO: 6) (figura 3A).

En un determinado aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con un anticuerpo manipulado con cisteína que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se divulga en el presente documento, o una secuencia de aminoácidos de anticuerpo manipulado con cisteína que carece del péptido señal como se divulga en el presente documento.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína aislado en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención que comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida con el complemento de una molécula de ADN que codifica (a) un anticuerpo manipulado con cisteína que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se divulga en el presente documento, (b) una secuencia de aminoácidos de anticuerpo manipulado con cisteína que carece del péptido señal como se divulga en el presente documento,

(c) un dominio extracelular de una proteína de anticuerpo manipulado con cisteína transmembranaria, con o sin el péptido señal, como se divulga en el presente documento, (d) una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento o (e) cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo manipulado con cisteína de longitud completa como se divulga en el presente documento.

En un aspecto específico, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína aislado en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención sin la secuencia señal N-terminal y/o sin la metionina iniciadora y está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos como se describe en el presente documento. Los procedimientos para producir los mismos también se describen en el presente documento, en los que dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificadora apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo manipulado con cisteína y la recuperación del anticuerpo manipulado con cisteína del cultivo celular.

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-CD22 manipulado con cisteína aislado en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención que presenta supresión en el dominio transmembranario o bien inactivación en el dominio transmembranario. Los procedimientos para producir el mismo también se describen en el presente documento, en el que esos procedimientos comprenden cultivar una

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acuerdo con la invención que comprende un dominio variable de la cadena pesada como se representa a continuación.

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(SEQ ID NO: 16) (los residuos de HVR están subrayados).

En algunos aspectos, las secuencias FR y de HVR de cadena pesada comprenden las siguientes:

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25 En algunos modos de realización, la invención proporciona una combinación de un anticuerpo anti-CD20 como se define en el presente documento con un anticuerpo anti-CD22 en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable de la cadena ligera como se representa a continuación.

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5 En algunos aspectos, las secuencias de HVR de cadena ligera comprenden las siguientes:

En algunos aspectos, las secuencias FR de cadena ligera comprenden las siguientes:

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En un aspecto, la invención proporciona una combinación de un anticuerpo anti-CD20 como se define en el presente documento con un anticuerpo anti-CD22 en dicho conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene almenos un 90%,un 91%, un 92%, un 93%,un 94%, un 95%, un 96%,un 97%, un 98% o un 45 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 17 o 18. En algunos aspectos, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprenda esa

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eliminación de la cadena no humana correspondiente en el clon de presentación en fagos primario, es decir, el epítopo regula (sella) la elección del ligando de cadena humana. Cuando se repite el procedimiento a fin de reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase el documento de PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. En determinados aspectos, una de las especificidades de unión es para CD22 y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de CD22. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos con respecto a las células que expresan CD22. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a CD22 y un brazo que se une al agente citotóxico, tal como, por ejemplo, saporina, antiinterferón α, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno con isótopo radioactivo. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab’)2).

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la combinación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla posible de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos del producto son bajos. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En determinados aspectos, la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en los aspectos cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión donde la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o donde las proporciones no son de particular importancia.

En un aspecto de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de la cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones indeseadas de las cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para obtener más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque, se puede manipular la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácido de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células indeseadas (patente de EE. UU. n.º 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089).

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Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.º 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteolíticamente anticuerpos inalterados para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente que forma complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab’ generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los recientes progresos han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado se pudo unir a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y linfocitos T humanos normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas de tumor de mama humanas.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucinas de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza que los dominios VH y VL de un fragmento se emparejen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes

Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. En determinados aspectos, el dominio de dimerización comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno aminoterminales a la región Fc. En determinados aspectos, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho sitios de unión a antígeno. En uno de dichos aspectos, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) cuatro sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (por ejemplo, dos cadenas polipeptídicas), en el que la(s) cadena(s) polipeptídica(s) comprende(n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptídica(s) puede(n) comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en las que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptídica(s) puede(n) comprender: VH-CH1-conector flexible-VH-CH1-cadena de la región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de la región Fc. El anticuerpo multivalente del presente documento puede comprender además al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente del presente documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera contemplados en este caso comprenden un dominio variable de la cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

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documento WO 1999/22764 (Raju, S.) con respecto a anticuerpos con hidrato de carbono alterado fijado a la región Fc de los mismos. Véase también el documento US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de unión a antígeno con glucosilación modificada.

En determinados aspectos, la variante de glucosilación comprende una región Fc, en la que una estructura glucídica fijada a la región Fc carece de fucosa. Dichas variantes tienen una función ADCC mejorada. Opcionalmente, la región Fc comprende además una o más sustituciones aminoacídicas en la misma que mejoran más la ADCC, por ejemplo, las sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de residuos). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos "desfucosilados" o "deficitarios en fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lee 13 deficitarias en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EU. UU. n.º US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes inactivados (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004)).

En un aspecto, el anticuerpo se altera para mejorar su semivida en suero. Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión a receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en el documento US 5739277, por ejemplo. Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de unión a receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG (documentos US 2003/0190311, US6821505; US 6165745; US 5624821; US 5648260; US 6165745; US 5834 597).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio deseable en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1, o como se describe además a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y cribar los productos.

TABLA 2

Residuo original: Sustituciones ejemplares Sustituciones preferentes

Ala (A): Val; Leu; Ile Val

Arg (R): Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N): Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (D): Glu; Asn Glu

Cys (C): Ser; Ala Ser

Gln (Q): Asn; Glu Asn

Glu (E): Asp; Gln Asp

Gly (G): Ala Ala

His (H): Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I): Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucina Leu

Leu (L): Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K): Arg; Gln; Asn Arg

Met (M): Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F): Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P): Ala Ala

Ser (S): Thr Thr

Thr (T): Val; Ser Ser

Trp (W): Tyr; Phe Tyr

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Claims

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