CN101035564A - 人源化的抗5t4抗体和抗5t4抗体/加利车霉素缀合物 - Google Patents

人源化的抗5t4抗体和抗5t4抗体/加利车霉素缀合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了嵌合和人源化抗5T4抗体和抗体/药物缀合物和它们的制备和使用方法。

Description

人源化的抗5T4抗体和抗5T4抗体/加利车霉素缀合物
相关申请
本申请要求2004年9月10日提交的美国临时专利申请号60/608,494的优先权，将该临时申请完整引入本文作为参考。
发明领域
本发明一般涉及用于治疗恶性疾病的人源化抗体和抗体/药物缀合物(即免疫连接物)。更具体地，本发明涉及人源化的抗5T4抗体、用于制备所述抗体的分离的可变区核酸和多肽，和抗5T4/细胞毒素缀合物，尤其抗5T4/加利车霉素缀合物。
发明背景
为系统药物疗法开发的药物缀合物是靶标特异的治疗剂。该概念涉及将治疗剂偶联到对确定的靶细胞群体具有结合特异性的载体分子。高亲和性单克隆抗体的可用性已经培养了免疫治疗，即抗体定向药物的开发。已经缀合到单克隆抗体的治疗剂包括细胞毒素、生物反应调节物、酶(例如，核糖核酸酶)、细胞凋亡诱导蛋白和肽，和放射性同位素。抗体/细胞毒素缀合物通常称作免疫细胞毒素，而由抗体和低分子量药物如氨甲蝶呤和阿霉素组成的抗体/药物缀合物称作化学抗体/药物缀合物，免疫调节剂含有已知具有调节功能的生物反应调节物，如淋巴因子、生长因子和补体激活眼镜蛇蛇毒因子(CVF)。放射抗体/药物缀合物由放射性同位素组成，其可以通过它们的放射用作杀死细胞的治疗剂或者用于成像。抗体介导的药物向肿瘤细胞的递送通过使药物在正常组织中的摄入最小化而增强了药物的肿瘤杀死功效。见例如，Reff等人(2002)Cancer Control 9：152-66；Sievers(2000)Cancer Chemother.Pharmacol.46 Suppl：S18-22；Goldenberg(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39：195-201。MYLOTARG(吉姆单抗奥佐米星)是通过商业途径可获得的抗体/药物缀合物，其根据该原理工作并且经证明用于治疗老年患者中急性粒细胞白血病。见Sievers等人(1999)Blood 93：3678-84。在该情况中，靶定分子是缀合到加利车霉素的抗-CD33单克隆抗体。
人类中的免疫疗法已经受到限制，部分是由于对非人单克隆抗体的不利应答。使用啮齿动物抗体进行的早期临床试验揭示人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗大鼠抗体(HARA)应答，其导致抗体的快速清除。因此已经开发了较低免疫原性的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体、PRIMATIZED抗体，和使用转基因小鼠或者噬菌体展示文库制备的人抗体。见Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：6851-5；Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：10029-33；Newman等人(1992)Biotechnology(NY)10：1455-60；Green等人(1994)Nat.Genet.7：13-21；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-97。避免HAMA应答允许施用高剂量和重复剂量以实现治疗应答。
使用重组克隆技术制备的嵌合抗体以包括可变区，其含有来自非人物种抗体(即，用抗原免疫的物种)的抗原结合部位和来自人免疫球蛋白的恒定区。人源化的抗体是一类嵌合抗体，其中可变区的仅仅负责抗原结合的那些残基来自非人物种，而剩余的可变区残基以及恒定区是人的。人源化的抗体甚至比常规嵌合抗体具有更低的免疫原性并且在施用于人后显示出提高的稳定性。见Benincosa等人(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.292：810-6；Kalofonos等人(1994)Eur.J.Cancer 30A：1842-50；Subramanian等人(1998)Pediatr.Infect.Dis.J.17：110-5。
用于药物定向的候选抗体包括识别癌胚抗原(即胎儿细胞和肿瘤细胞上存在的抗原)并且在正常成人细胞中几乎不存在的抗体。见例如，Magdelenat(1992)J.Immunol.Methods 150：133-43。5T4癌胚抗原是72kDa高度糖基化的跨膜糖蛋白，其包含42kDa非糖基化核心(Hole等人(1988)Br.J.Cancer 57：239-46，Hole等人(1990)Int.J.Cancer 45：179-84；PCT国际公布号WO89/07947；美国专利号5,869,053)。5T4包括特征为富含亮氨酸的重复(LRRs)和间插的疏水区的细胞外结构域，其是定向疗法可以接近的抗原(Myers等人(1994)J.Biol.Chem.269：9319-24)。
人5T4在许多癌类型(包括膀胱、乳腺、宫颈、子宫内膜、肺、食管、卵巢、胰腺、胃和睾丸的癌)中表达并且除了胎盘的合胞体滋养层之外，几乎不存在于正常组织中(见，例如，Southall等人(1990)Br.J.Cancer 61：89-95(immunohistological distribution of 5T4 antigen in normal andmalignant tissues)；Mieke等人(1997)Clin.Cancer Res.3：1923-1930(lowintercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cellscorrelate with reduced disease-free survival in colorectal carcinomapatients)；Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer 69：899-902(prognosticsignificance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma)；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer 66：867-869(expression of 5T4antigen in colorectal and gastric carcinoma)；Jones等人(1990)Br.J.Cancer 61：96-100(expression of 5T4 antigen in cervical cancer)；Connor和Stern(199)Int.J.Cancer 46：1029-1034(loss of MHC class-1 expressionin cervical carcinomas)；Ali等人(2001)Oral Oncology 37：57-64(patternof expression of the 5T4 oncofoetal antigen on normal，dysplastic andmalignant oral mucosa)；PCT国际公布号WO89/07947；美国专利号5,869,053)。例如，已报导不表达5T4的组织包括肝脏、皮肤、脾脏、胸腺、中枢神经系统(CNS)、肾上腺、和卵巢。已报导具有5T4的局部或低表达的组织包括肝脏、皮肤、脾脏、淋巴结、扁桃体、甲状腺、前列腺和精囊。已经报导在肾脏、肺、胰腺、咽和胃肠道中5T4的弱-中等扩散表达。已报导具有5T4的高表达的唯一组织是合胞体滋养层；5T4也不存在于正常血清或者妊娠妇女的血清中(即，水平＜10ng/ml)。5T4在肿瘤中的过表达已经与疾病发展相关，并且已经提出5T4表达的评估作为鉴定具有短期预后的患者的有用方法(Mulder等人(1997)Clin.Cancer Res.3：1923-30，Naganuma等人(2002)Anticancer Res.22：1033-8，Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer 69：899-902，Starzynska等人(1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10：479-84，Wrigley等人(1995)Int.J.Gynecol.Cancer 5：269-274)。
已经描述了一些非人抗5T4-抗体，包括mAb5T4，也称作H8抗体，其识别5T4抗原的构象表位(Shaw等人(2002)Biochem.J.363：137-45，PCT国际公布号WO98/55607)；大鼠单克隆抗体(Woods等人(2002)Biochem.J.366：353-65)；和5T4小鼠单克隆抗体(美国专利号5,869,053)。已经描述了单链抗5T4抗体，以及包括融合到治疗分子的抗5T4抗体序列的融合蛋白。例如，融合到人IgG1恒定结构域或者鼠B7.1的细胞外结构域的抗5T4抗体序列诱导表达5T4的肿瘤细胞系的细胞溶解(Myers等人(2002)Cancer Gene Ther.9：884-96，Shaw等人(2000)Biochim.Biophys.Acta.1524：238-46；美国专利申请公布号2003/0018004)。类似地，与超级抗原融合的单链抗5T4抗体可以刺激体外非小细胞肺癌细胞的依赖于T细胞的细胞溶解(Forsberg等人(2001)Br.J.Cancer 85：129-36)。使用与突变的超级抗原葡萄球菌肠细胞毒素A(SEA)融合的单克隆抗体5T4的鼠Fab片段PNU-214936进行的I期临床试验显示出有限的细胞毒性和一定的抗肿瘤应答(Cheng等人(2004)J.Clin.Oncol.22(4)：602-609)。作为备选治疗方法，提出重组5T4疫苗用于治疗癌症(Mulryan等人(2002)Mol.CancerTher.1：1129-37；英国专利申请公布号2,370,571和2,378,704；欧洲专利申请公布号EP 1,160,323和1,152,060)。
尽管对5T4作为免疫疗法的潜在靶标存在巨大兴趣，但是还没有描述使用缀合到治疗剂的抗5T4抗体的疗法。本发明提供了人源化的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物，以及产生所公开的抗体和抗体/药物缀合物的方法和它们的治疗应用的方法。
发明概述
本发明提供了嵌合和人源化的抗5T4抗体和抗体片段，和它们的制备和使用方法。本发明的抗5T4抗体包含至少一条轻链或至少一条重链，或者其片段，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段(a)以至少约1×10-7M到约1×10-12M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(b)以大于1×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(c)以大于5×10-11M的结合亲和力的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(d)以大于鼠H8抗5T4抗体结合人5T4抗原的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(e)在体内特异靶定表达5T4的细胞；(f)与(a)-(e)任一项的抗体竞争结合人5T4抗原；(g)特异结合(a)-(e)任一项结合的表位；或者(h)包含(a)-(e)任一项的抗原结合结构域。本发明的嵌合和人源化的抗5T4抗体包含来自人恒定区的恒定区，如IgG1或者IgG4恒定区。例如，人IgG1重链恒定区可以包含SEQ ID NOs：25或85-89任一项的氨基酸序列。作为另一实例，人IgG4重链恒定区可以包含241位的脯氨酸。
本发明的代表性嵌合抗5T4抗体包括这样的抗体，其包含(a)包含SEQID NO：1的氨基酸1-107的轻链可变区序列，(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-120的重链可变区序列，或者(c)包含含有SEQ ID NO：1的残基1-107的氨基酸序列的可变区的轻链，并且重链包含含有SEQ ID NO：2的残基1-120的氨基酸序列的可变区。额外的代表性嵌合抗5T4抗体包括抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链；或者(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体包括抗体，其包含(a)包含人抗体构架区的残基的构架区；和(b)SEQ ID NO：17的轻链可变区的一个或多个CDR或者SEQ ID NO：18的重链可变区的一个或多个CDR。例如，人抗体构架区的残基可以包含(a)DPK24亚组IV种系克隆、VκIII亚组或者VκI亚组种系克隆的人抗体轻链构架区；(b)选自DP-75、DP-8(VH1-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和V1-8(VH1-08)、DP-14和V1-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VH1-e)、DP-3和DA-8(VH1-f)的人抗体重链构架区；(c)(b)的重链构架区的共有序列；或者(d)与(a)-(c)的构架区具有至少95％同一性的构架区。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体还包括SEQ ID NOs：17或18的两个或多个CDR，如SEQ ID NO：17的轻链可变区的两个或所有三个CDR，或者SEQ ID NO：18的重链可变区的两个或所有三个CDR，或者SEQ IDNO：17的轻链可变区的一个或多个CDR和SEQ ID NO：18的重链可变区的一个或多个CDR，或者SEQ ID NOs：17和18的所有CDR。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体还可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含(a)SEQ ID NO：17或23的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：17具有至少78％同一性的氨基酸序列；或者(c)与SEQ ID NO：23具有至少81％同一性的氨基酸序列。类似地，本发明的人源化抗5T4抗体可以包含核酸编码的轻链可变区序列，所述核酸包含：(a)SEQ ID NO：22或81的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO：22的核酸具有至少90％同一性的核苷酸序列；(c)与SEQ ID NO：81的核酸具有至少91％同一性的核苷酸序列；或者(d)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：22或者SEQ ID NO：81的互补序列特异杂交的核酸。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体还可以包含重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO：18、19和21的任一个给出的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：18具有至少83％同一性的氨基酸序列；(c)与SEQ ID NO：19具有至少81％同一性的氨基酸序列；或者(d)与SEQ ID NO：21具有至少86％同一性的氨基酸序列。类似地，本发明的人源化抗体可以包含核酸编码的重链可变区序列，所述核酸包含(a)SEQ ID NO：20、82或83的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO：20或者SEQ ID NO：83的核酸具有至少91％同一性的核苷酸序列；(c)与SEQ ID NO：82的核酸具有至少94％同一性的核苷酸序列；或者(d)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：20、82和83的任一个的互补序列特异杂交的核酸。
本发明的额外的代表性人源化抗5T4抗体包括这样的抗体，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：5的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：6的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(b)SEQ ID NO：5的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：6的重链氨基酸序列；(c)包含SEQ IDNO：7的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(d)SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列；(e)包含SEQ ID NO：9的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：10的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(f)SEQ ID NO：9的轻链氨基酸序列，和SEQ IDNO：10的重链氨基酸序列；(g)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：12的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(h)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：12的重链氨基酸序列；(i)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；(j)SEQ IDNO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：84的重链氨基酸序列；(k)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；和(l)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。
还提供了用于药物递送的抗体/药物缀合物，其包含(a)本发明的嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段；和(b)药物，其直接或间接结合抗体。代表性药物包括治疗剂，如细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促细胞凋亡剂、化学治疗剂、和治疗核酸。细胞毒素可以是例如，抗生素、微管蛋白聚合作用的抑制剂、烷化剂、蛋白质合成抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂，或者酶。抗生素细胞毒素，如加利车霉素、N-乙酰基-γ-加利车霉素、或者其衍生物，如N-乙酰基-γ-加利车霉素二甲基酰肼尤其可用于抗癌疗法。
所公开的抗5T4抗体/药物缀合物可以包括用于将抗体与药物结合的接头。代表性接头包括4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸式酸(3-acetylphenyl acidic acid)(AcPac)和4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)。抗体/药物缀合物还可以包括聚乙二醇或者其他试剂以加强药物掺入。
本发明还提供了制备抗体/药物缀合物的方法，该缀合物具有通式：
                    5T4Ab(-X-W)m
其中5T4Ab是嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段；X是包含可以与抗5T4抗体反应的任何反应基的产物的接头；W是药物；m是纯化的缀合产物的平均负荷；(-X-W)m是药物衍生物。根据本方法，将药物衍生物加到嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段，其中按照嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段的重量计，药物为3-10％。药物衍生物和嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段然后在pH为约7到9的非亲核、蛋白质相容的缓冲液中温育，以产生抗体/药物缀合物，其中该溶液还包含(i)合适的有机共溶剂，和(ii)包含至少一种胆汁酸或者其盐的一种或多种添加剂，并且其中温育在约30℃到约35℃的温度下进行约15分钟到约24小时。然后将所得缀合物进行层析分离过程以分离负荷按重量计为3-10％药物并且具有低缀合分数(LCF)的抗体/药物缀合物与未缀合的嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段、药物衍生物，和团聚的缀合物。还提供了通过该方法产生的抗体/药物缀合物。
为了将药物递送到表达5T4的细胞，本发明提供了借以将细胞与抗体/药物缀合物接触的方法，所述缀合物包含(i)嵌合或者人源化的抗5T4抗体，和(ii)直接或者间接结合人源化抗5T4抗体的药物。根据所公开的方法，药物在靶细胞内内化。本文还公开了治疗方法，其包括对患有5T4阳性癌的受试者施用治疗有效量的抗5T4抗体/药物缀合物，其包含(i)嵌合或者人源化的抗5T4抗体或抗体片段，和(ii)直接或者间接结合人源化抗5T4抗体或抗体片段的治疗剂。本发明的抗5T4疗法可以与其他已知的疗法组合以提高效果。另一种治疗剂可以与抗5T4抗体/药物缀合物组合同时或者以任何顺序连续施用。
附图简述
图1显示了用于评估致瘤细胞系中5T4表达的蛋白质印迹分析的结果。从培养细胞的裂解物以及从裸鼠中异种移植的肿瘤产生蛋白质印迹。CT26/neo：表达新霉素抗性基因的CT26小鼠结肠癌细胞；CT26/5T4：表达5T4抗原的CT26细胞。
图2显示了将细胞系暴露于生物素后，CT26/5T4和CT26/neo样品的蛋白质印迹分析的结果。样品A是已经生物素化并且能够结合抗生物素蛋白的5T4的级分。样品S是用抗生物素蛋白沉淀细胞提取物后上清液中存在的5T4的剩余量。这代表没有生物素化并且因此位于细胞原生质中的级分。5T4在膜(A)和细胞内(S)级分中都检测到。
图3A-3B显示了定量细胞内对比膜结合的5T4抗原的实验结果。图3A显示了使用如所指出的稀释的CT26/5T4细胞提取物制备的蛋白质印迹。生物素化的样品代表使用抗生物素蛋白耗尽生物素化的样品后样品中存在的5T4的量，即，非膜结合的5T4的量。总样品代表残留量和抗生物素蛋白耗竭的量的总和，即非膜结合的和膜结合的5T4抗原的量。图3B显示了通过样品稀释和H8反应带的光密度确定的线性回归曲线。膜结合的5T4抗原的量描绘为总样品的光密度和抗生物素蛋白耗竭后生物素化样品的光密度之间的差异。如实施例1中描述，细胞膜(5T4M)上5T4的量经计算为CT26/ST4细胞中总细胞5T4的24％。
图4显示了蛋白质印迹的结果，其阐明了CT26/5T4细胞、DLD-1细胞(人结肠癌细胞)、N87细胞(人胃癌细胞)、PC3-MM2细胞(人前列腺癌细胞)和PC3细胞(人前列腺癌细胞)的细胞表面上的5T4抗原。
图5A-5B显示了用于检测5T4抗原的膜定位的FACS分析结果。在MDAMB435/neo细胞中，H8的信号与对照IgG的吻合(图5A)。相比，在MDAMB435/5T4细胞中，从H8抗体得到的信号比对照抗体的信号强100倍，表明在细胞膜上存在5T4(图5B)。黑色：5T4抗原的检测；灰色：通过对照IgG检测。
图6显示了用于检测N87(人胃癌细胞)、PC14PE6(人肺癌细胞)、和NCI-H157细胞(人肺癌细胞)的膜上5T4抗原的FACS分析的结果。在每种情况中，从H8抗体得到的信号为对照抗体的约10倍，表明在细胞膜上存在5T4。灰色：5T4抗原的检测；黑色：通过对照IgG检测。
图7是线图，其描绘在CT26/5T4的细胞表面和细胞培养基中检测的荧光标记的H8抗体的测量。膜结合的抗体的平均荧光随着时间降低。抗体没有在培养基中释放。这些结果表明H8抗体/5T4复合体被CT26/5T4细胞内化。
图8是线图，其描绘了暴露于抗5T4缀合物的MDAMB435/5T4细胞的选择性细胞溶解，所述缀合物包含使用4-巯基-4-甲基-戊酸作为接头缀合到加利车霉素的H8抗体。
图9A-9B是线图，其描绘了暴露于抗5T4缀合物(H8PEG2K-AcBut-CalichDMH)的表达5T4的细胞的选择性细胞溶解，所述缀合物包含使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)作为接头缀合到加利车霉素的PEG化的H8抗体。见实施例2。图9A显示缺少5T4抗原的MDAMB435/neo细胞对于通过H8PEG2K-AcBut-CalichDMH以及通过游离加利车霉素引起的细胞溶解大约同样敏感。图9B显示了与游离加利车霉素相比，暴露于H8PEG2K-AcBut-CalichDMH的表达5T4的细胞的增强的细胞溶解。
图10是线图，其描绘了暴露于使用所指出的接头制备的H8-加利车霉素缀合物的MDAMB435/5T4肿瘤的生长抑制。PBS：磷酸缓冲盐水；H8-AcBut-CalichDMH：使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-AcPac-CalichDMH：使用3-乙酰基苯基酸式酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-Amide-CalichDMH：使用4-巯基-4-甲基-戊酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8PEG(mal2)-AcBut-CalichDMH：使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的PEG化的H8抗体。
图11A-11B是线图，其描绘了在对照物质(图11A)或者H8-加利车霉素缀合物(图11B)的存在下，MDAMB435/5T4肿瘤的生长抑制。CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体(阴性对照，即用于评估由于缺少定向抗原，细胞对缀合物的肿瘤摄入引起的细胞溶解)；PBS：磷酸缓冲盐水；H8+CalichDMH：H8抗体和加利车霉素(未缀合的)的混合物；CalichDMH：游离加利车霉素；H8-AcPac-CalichDMH：使用3-乙酰基苯基酸式酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-amide-CalichDMA：使用4-巯基-4-甲基-戊酸缀合到加利车霉素的H8抗体。
图12是线图，其描绘了暴露于所指出的H8加利车霉素缀合物或者对照物质的NCI-H157肿瘤的生长抑制。H8-AcPac-CalichDMH：使用3-乙酰基苯基酸式酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-amide-CalichDMA：使用4-巯基-4-甲基-戊酸缀合到加利车霉素的H8抗体；CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体(阴性对照)；PBS：磷酸缓冲盐水；H8：未缀合的H8抗体。
图13A-13B是线图，其描绘了在对照物质(图13A)或者H8-加利车霉素缀合物(图13B)存在下N87肿瘤的生长抑制。CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体(阳性对照)；PBS：磷酸缓冲盐水；H8+CalichDMH：H8抗体和加利车霉素(未缀合的)的混合物；CalichDMH：游离加利车霉素；H8-AcPac-CalichDMH：使用3-乙酰基苯基酸式酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-amide-CalichDMA：使用4-巯基-4-甲基-戊酸缀合到加利车霉素的H8抗体。
图14是线图，其描绘了暴露于H8/加利车霉素缀合物或者对照物质的PC14PE6肿瘤的生长抑制。H8-AcPac-CalichDMH：使用3-乙酰基苯基酸式酸缀合到加利车霉素的H8抗体；H8-amide-CalichDMA：使用4-巯基-4-甲基-戊酸缀合到加利车霉素的H8抗体；CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体(阴性对照)；PBS：磷酸缓冲盐水；H8：未缀合的H8抗体。
图15A-15G是肺癌的同位模型的正常和肿瘤侵染的肺的图像。图15A是切除的正常小鼠肺的图像；心脏呈黑色。图15B是静脉内注射PC14PE6肿瘤细胞后肿瘤结节侵染的切除的小鼠肺的图像(见实施例4)；H，心脏。图15C是显示肺的萎陷后胸廓的宏观图像(4X放大率)。肺结节(LN)与正常肺组织(L)可区别。胸腔充满出血液(胸膜渗漏，PE)。图15D-15G是石蜡包埋的肺和心组织的苏木精和伊红染色切片的显微照片，其显示了肿瘤浸润和正常组织破坏的程度。图15D-15E显示了胸膜腔(15D)和心包(15E)中肿瘤细胞的浸润。图15F-15G显示了通过增殖肺泡周空间中肿瘤组织减少功能性肺组织。
图16是线图，显示了接受所指出的治疗的具有同位肺肿瘤的小鼠的存活分数(％)。所有处理在注射PC14PE6细胞后6天腹膜内施用。见实施例4。H8(粗黑实线)：未缀合的鼠H8抗体；PBS(白色实线)：磷酸缓冲盐水；CMA2(细黑实线)：以2μg加利车霉素的剂量施用的缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；CMA4(具有小短划线的线)：以4μg加利车霉素的剂量施用的缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；H8-AcPac-CalichDMH 2(具有大短划线的线)：以2μg加利车霉素的剂量施用的H8-加利车霉素缀合物。H8-AcPac-CalichDMH 4(具有大短划线的线)：以4μg加利车霉素的剂量施用的H8-加利车霉素缀合物。以2μg或者4μg的剂量施用的H8-加利车霉素缀合物的结果在120天的时间内不可区分。每个治疗组包括10只动物。每个治疗方案由腹膜内施用的3剂组成，每个剂量之间相隔4天。
图17是条形图，其显示了在所指出的对照治疗后由于肺部肿瘤死亡的小鼠中胸膜体积。PBS：磷酸缓冲盐水；H8：未缀合的H8抗体；CMA 2：以每剂2μg施用的缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；CDA4：以每剂4μg施用的缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；n：动物数。施用未缀合的H8抗体或者对照缀合物CMS后未减少的胸膜渗漏体积。
图18是鼠H8轻链可变区(SEQ ID NO：16的氨基酸21-127)和DPK24种系克隆(SEQ ID NO：63)的比对。加框的序列：CDR；星号：鼠H8的氨基酸保持在人源化的H8轻链可变区形式1中的位置，和人DPK24的氨基酸保持在人源化的轻链可变区形式2中的位置；加下划线的残基：增加抗体表达的突变。
图19是亚组VκIII的人轻链可变区序列(SEQ ID NO：65-70)和鼠H8轻链可变区(SEQ ID NO：16的氨基酸21-127)的比对。当与H8构架序列比较时，在人构架序列中不同的残基加下划线。对于H8的人源化，在H8的对应位置上的一个或多个残基用人构架序列的残基替代。加框的序列：CDR。
图20是亚组VκI的人轻链可变区序列(SEQ ID NO：71-80)和鼠H8轻链可变区(SEQ ID NO：16的氨基酸21-127)的比对。为了人源化H8，在H8的对应位置上的一个或多个残基用人构架序列的残基替代。加框的序列：CDR。
图12是鼠H8重链可变区(SEQ ID NO：14的氨基酸20-139)和DP75种系克隆(SEQ ID NO：64)的比对。加框的序列：CDR；星号：鼠H8的氨基酸保持在人源化的H8重链可变区形式1中的位置(即K38、S40和I48)，和人DP75的氨基酸保持在人源化的重链可变区形式2中的位置。
图22是亚组I的人重链可变区序列(SEQ ID NOs：52-60)和从其得到的共有构架序列(SEQ ID NO：49-51)的比对。
图23是鼠H8重链可变区(SEQ ID NO：14的氨基酸20-139)和从亚组I的重链可变区(即人源化的重链可变区形式3(SEQ ID NO：19))的共有序列得到的人源化H8重链可变区的比对。加框的序列：CDR。
图24A-24C显示了人源化抗5T4抗体的代表性轻链可变区序列(图24A)和重链可变区序列(图24B-24C)。
图25A-25O显示了使用人源化的可变区作为查询序列进行的BLAST分析的结果。也见表6和7。
图26A-26B显示了用于制备人源化抗5T4抗体的代表性人恒定区的序列。
图27A-27G显示了代表性抗5T4抗体的轻链和重链氨基酸序列。图27A显示了嵌合抗5T4抗体，其具有(a)包含鼠H8轻链可变区和人κ恒定区(SEQ ID NO：1)的轻链，和(b)包含鼠H8重链可变区和人IgG1恒定区(SEQ ID NO：2)的重链。图27B显示了嵌合的抗5T4抗体，其具有(a)包含鼠H8轻链可变区和人κ恒定区(SEQ ID NO：3)的轻链，和(b)包含鼠H8重链可变区和突变的人IgG4恒定区(SEQ ID NO：4)的重链。图27C显示了半人抗5T4抗体，其具有(a)包含人源化H8轻链可变区形式1和人κ恒定区(SEQ ID NO：5)的轻链，和(b)包含鼠H8重链可变区和突变的人IgG4恒定区(SEQ ID NO：6)的重链。图27D显示了人源化的抗5T4抗体，其具有(a)包含人源化H8轻链可变区形式1和人κ恒定区(SEQ ID NO：7)的轻链，和(b)包含人源化的H8重链可变区形式1和突变的人IgG4恒定区(SEQ ID NO：8)的重链。图27E显示了人源化的抗5T4抗体，其具有(a)包含人源化H8轻链可变区形式1和人κ恒定区(SEQ ID NO：9)的轻链，和(b)包含人源化的H8重链可变区形式2和人IgG1恒定区(SEQ IDNO：10)的重链。图27F显示了人源化的抗5T4抗体，其具有(a)包含人源化H8轻链可变区形式2和人κ恒定区(SEQ ID NO：11)的轻链，和(b)包含人源化的H8重链可变区形式2和突变的人IgG4恒定区(SEQ ID NO：12)的重链。图27G显示了人源化的抗5T4抗体，其具有(a)包含人源化H8轻链可变区形式2和人κ恒定区(SEQ ID NO：11)的轻链，和(b)包含人源化的H8重链可变区形式3和突变的人IgG4恒定区(SEQ ID NO：84)的重链。单下划线：可变区；加框的序列：CDR；星号：脯氨酸突变。
图28A-28B显示了使用所指示浓度下的鼠H8、H8的嵌合形式，和H8的人源化形式检测MDAMB435/neo细胞(图28A)或MDAMB435/5T4细胞(图28B)上5T4抗原的FACS分析的结果。所有抗体都显示出对MDAMB435/5T4细胞的选择性结合。
图29是线图，其显示了嵌合H8抗体和人源化H8形式1-3的结合性质，其用竞争性结合测定法测定。嵌合H8抗体和人源化H8形式1-3的IC50分别为1.0×10-9M、1.0×10-9M、1.4×10-9M和1.5×10-9M。见实施例5。
图30是线图，其显示了在25小时时间内，在MDAMB435/5T4细胞的细胞表面上嵌合的H8抗体和人源化H8抗体的检测。在观察期间内检测的降低的水平表明两种抗体的内化。在实验过程期间，在条件培养基中不存在可检测的抗体。
图31是条形图，其描绘了COS-1细胞中嵌合的H8抗体和人源化H8形式1-3的瞬时表达水平。三种人源化H8抗体以相似水平表达(形式1，4.4mg/L/48小时；形式2：2.7mg/L/48小时；形式3：3.9mg/L/48小时)，其大于对嵌合的H8抗体所观察到的水平(0.6mg/L/48小时)。见实施例6。
图32A-32B是线图，其显示了在体外暴露于所指出浓度的H8-AcBut-CalichDMH(使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体)144小时后，MDAMB435/neo和MDAMB435/5T4细胞的球形生长的抑制。
图33A-33C是线图，其描绘了在对照物质(图33A)或者人源化H8-加利车霉素缀合物(图33B)的存在下N87肿瘤的生长抑制和应答计算(图33C)。PBS：磷酸缓冲盐水；huH8+CalichDMH：H8抗体和加利车霉素(未缀合的)的混合物；CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；CMC：缀合到加利车霉素的抗-CD22抗体；huH8-AcBut-CalichDMH：使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体；(4)，以4μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(2)，以2μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(1)，以1μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；箭头：在第1、5和9天的给药方案；CR：完全应答；PR：部分应答；TR，无应答；NR：无应答。见实施例9。
图34A-34C是线图，其描绘了在对照物质(图34A)或者人源化H8-加利车霉素缀合物(图34B)的存在下MDAMB435/5T4肿瘤的生长抑制和应答计算(图34C)。PBS：磷酸缓冲盐水；huH8+CalichDMH：H8抗体和加利车霉素(未缀合的)的混合物；CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；CMC：缀合到加利车霉素的抗-CD22抗体；huH8-AcBut-CalichDMH：使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体；(4)，以4μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(2)，以2μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(1)，以1μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；箭头：在第1、5和9天的给药方案；CR：完全应答；PR：部分应答；TR，无应答；NR：无应答。见实施例9。
图35A-35E是线图，其描绘了在对照物质(图35A)或者人源化H8-加利车霉素缀合物(图35B、35D、35E)的存在下PC14PE6肿瘤的生长抑制和应答计算(图35C)。图35A-35C给出涉及新肿瘤生长的数据，图35D给出涉及复发肿瘤的治疗的数据。PBS：磷酸缓冲盐水；huH8+CalichDMH：H8抗体和加利车霉素(未缀合的)的混合物；CMA：缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体；huH8-AcBut-CalichDMH：使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体；(4)，以4μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(2)，以2μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(1)，以1μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；(4*)，在用缀合物治疗前允许肿瘤生长到约1.08cm3后以4μg加利车霉素剂量施用的抗体-加利车霉素缀合物；箭头：在第1、5和9天(图35A、35B和35D)或者第19、23和27天(图35C)的给药方案；CR：完全应答；PR：部分应答；TR，无应答；NR：无应答。见实施例9。
图36-36B显示了用载体(磷酸缓冲盐水)(图36A)或者用huH8-AcBut-CalichDMH(使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体)(图36B)治疗后21天，含有PC14PE6肿瘤的小鼠的照片。PC14PE6肿瘤在施用载体或者人源化的H8-加利车霉素缀合物时为约80mm3。通过腹膜内注射共三次剂量施用活性剂，每剂4μg加利车霉素，每剂相隔三天。图36A中的箭头标识可见的肿瘤。图36B中虚线围绕的区域标识PC14PE6肿瘤已经消退的区域。见实施例9。
发明详述
I.嵌合和人源化的抗5T4抗体
H8是杂交瘤产生的单克隆小鼠IgG1抗体，其在PCT申请公布号WO98/55607和Forsberg等人(1997)J.Biol.Chem.272(19)：124430-12436中描述。本发明的嵌合的抗5T4抗体包括鼠抗5T4抗体的可变区序列和来自人抗体序列的额外的残基。本发明的人源化抗5T4抗体包括来自抗5T4抗体H8的抗原结合残基和来自人抗体序列的额外残基。因此所公开的嵌合和人源化的抗5T4抗体也称作嵌合H8抗体和人源化的H8抗体。在图27A-27F中给出了代表性嵌合和人源化H8抗体。
术语抗体指包含抗原结合部位的免疫球蛋白蛋白质或者抗体片段(例如，Fab、经修饰的Fab、Fab’、F(ab’)2或者Fv片段，或者具有至少一个免疫球蛋白轻链可变区或者至少一个免疫球蛋白重链区的蛋白质)。本发明的人源化抗体包括双抗体、四聚物抗体(tetrameric antibody)、单链抗体、四价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、识别特定表位的结构域特异性抗体(例如，识别H8抗体结合的表位的抗体)。
术语抗5T4抗体指特异结合5T4抗原，尤其人5T4抗原的抗体。5T4抗原是在滋养层细胞和多种癌细胞类型的表面上发现的72kDa非糖基化的磷酸蛋白质。见Hole等人(1988)Br.J.Cancer 57：239-46，Hole等人(1990)Int.J.Cancer 45：179-184；PCT国家公布号WO89/07947；美国专利号5,869,053。
术语结合指两种分子(例如，抗原和抗体)之间的亲和性。本文使用的特异结合指抗体优先结合包含多种不同抗原的异质样品中的一种抗原。抗体与抗原的结合如果其结合亲和力为至少约10-7M或者更高，如至少约10-8M或者更高，包括至少约10-9M或者更高，至少约10-11M或者更高，或至少约10-12M或者更高，那么所述结合是特异的。例如，本发明的抗体与人5T4抗原的特异结合包括在至少约1×10-7到约1×10-12M范围内的结合。本发明的抗体与人5T4抗原的特异结合还包括至少约3×10-10M到约12×10-10M的范围内，如约4×10-10M到约9×10-10M的范围内，如约7×10-10M到约12×10-10M的范围内，或如约7×10-10M到约9×10-10M的范围内，或如约9×10-10M到约12×10-10M的范围内，或如约11×10-10M到约12×10-10M的范围内的结合，或者更大的结合亲和力，如约1.0×10-11M到约10×10-11M，或约1.0×10-11M到约5×10-11M，或约5.0×10-11M到约10×10-11M。短语特异结合还指当施用于受试者时选择性靶定表达5T4的细胞。
术语嵌合抗体在本文中用于描述包含来自至少两个不同物种的序列的抗体。人源化的抗体是一种类型的嵌合抗体。嵌合的抗5T4抗体可以包含(a)具有SEQ ID NO：1的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：2的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(b)SEQ ID NO：1的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列；或者(c)SEQ ID NO：3的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：4的重链氨基酸序列。
术语人源化在本文用于描述抗体，其中负责抗原结合的可变区残基(即，互补决定区的残基和参与抗原结合的任何其他残基)来自非人物种，而剩余的可变区残基(即构架区的残基)和恒定区至少部分来自人抗体序列。人源化抗体的可变区和可变区和恒定区的残基还可以来自非人来源。人源化抗体的可变区也描述为人源化的(即，人源化的轻或者重链可变区)。非人物种通常是用抗原免疫的物种，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类，或者其他非人哺乳动物物种。
本发明的代表性嵌合和人源化的抗5T4抗体包含至少一个轻链或至少一个重链，或者其片段，其中嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段(a)以至少约1×10-7M到约1×10-12M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(b)以大于1×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(c)以大于5×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(d)以大于鼠H8抗5T4抗体结合人5T4抗原的结合亲和力的结合亲和力特异结合人5T4抗原；(e)在体内特异靶定表达5T4的细胞；(f)与(a)-(e)任一项的抗体竞争结合人5T4抗原；(g)特异结合(a)-(e)任一项结合的表位；或者(h)包含(a)-(e)任一项的抗原结合结构域。
已经表明鼠H8抗5T4抗体识别与5T4的跨膜结构域接近的构象表位。抗体的结合需要糖基化(其对于结构和免疫原性是重要的)和分子内二硫键。还已经表明H8抗5T4抗体不结合小鼠5T4，尽管在小鼠和人5T4之间有84％的同一性并且7个N-连接的糖基化位点中的6个在这两者之间是保守的。N-末端和C-末端半胱氨酸在小鼠和人5T4之间也完全保守。已经表明鼠H8抗体当除去氨基酸192处的N-连接的糖基化位点时结合人5T4(Shaw等人(2002)Biochem J.365：137-145)。有证据表明H8抗5T4抗体不结合具有小鼠LRR2的人/小鼠5T4嵌合体(残基173-361替换人残基173-355)，然而该抗体结合正反交嵌合体(reciprocal chimera)。还有证据表明嵌合H8抗体和人源化H8抗体结合含有小鼠残基282-361的5T4嵌合体。该证据导致得出H8表位位于氨基酸173和252之间的结论。额外的证据提示嵌合的H8不结合含有小鼠残基173-258的人/小鼠抗5T4嵌合体，而人源化的H8抗体在较高浓度具有轻微结合。
天然存在的抗体是约150,000道尔顿的四聚体(H2L2)糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。两条重链通过二硫键彼此连接并且每条重链通过二硫键连接到轻链。每条轻链和重链的其他特征是氨基末端可变区和恒定区。术语可变指可变结构域的某些部分在抗体的序列中非常不同并且实质上决定了每种具体抗体对其特定抗原的结合亲和力和特异性。每条轻链和重链的可变区对准形成抗原结合结构域。代表性人源化H8可变区在图24A-22C中给出(SEQ ID NOs：17、18、19、21和23)。
可以使用标准技术重组制备类似于天然发生的抗体的具有四聚体结构域的抗体。重组产生的抗体还包括单链抗体，其中单个轻链和重链对的可变区包括抗原结合区；和融合蛋白，其中人源化抗5T4抗体的可变区与效应子序列(如Fc结构域、细胞因子、免疫促进剂、细胞毒素或者任何其他治疗蛋白质)融合。见例如，Harlow & Lane(1988) Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York和美国专利号4,196,265；4,946,778；5,091,513；5,132,405；5,260,203；5,677,427；5,892,019；5,985,279；6,054,561。
可以如PCT国际公布号WO 02/096948中描述的制备包含两个完整四聚体抗体的四价抗体(H4L4)，其包括同型二聚体和异二聚体。通过使用异双官能交联剂(Wolff等人(1993)Cancer Res.53：2560-5)在抗体恒定区中引入半胱氨酸残基(其促进链间二硫键形成)或者通过重组产生以包括两个恒定区(Stevenson等人(1989)Anticancer Drug Des.3：219-30)也可以制备抗体二聚体。
术语互补性决定区或者CDR指参与抗原结合的抗体可变区的残基。CDR的许多定义是惯用的。Kabat定义是基于序列变异性，Chothia定义是基于结构环区域的位置。AbM定义是Kabat和Chothia方法的折中。根据Kabat、Chothia或者AbM算法，轻链可变区的CDR被24和34位(CDR1-L)、50和56位(CDR2-L)和89和97位(CDR3-L)的残基结合。根据Kabat定义，重链可变区的CDR被31和35B位(CDR1-H)、50和65位(CDR2-H)和95和102位(CDR3-H)(根据Kabat的编号)的残基结合。根据Chothia定义，重链可变区的CDR被26和32位(CDR1-H)、52和56位(CDR2-H)、和95和102位(CDR3-H)(根据Chothia编号)的残基结合。根据AbM定义，重链可变区的CDR被26和35B位(CDR1-H)、50和58位(CDR2-H)、和95和102位(CDR3-H)(根据Kabat编号)的残基结合。见Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：9268-9272；Martin等人(1991)Methods Enzymol.203：121-153；Pedersen等人(1992)Immunomethods 1：126；和Rees等人(1996)In Sternberg M.J.E.(ed.)，Protein Structure Prediction，Oxford University Press，Oxford，pp.141-172。
术语特异性决定区或者SDR指CDR内直接与抗原相互作用的那些残基，其对应于高变残基。见(Padlan等人(1995)FASEB J.9：133-9)。
构架残基是可变区的不同于高变残基的那些残基。可以用于制备人源化抗5T4抗体的重链可变区的代表性人构架包括DP-75和DP-8(VH1-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和V1-8(VH1-08)、DP-14和V1-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VH1-e)、DP-3、和DA-8(VH1-f)的构架区。还可以使用基于前面的个体序列的共有构架序列。见图21-23。轻链可变区的代表性人构架包括人种系克隆DPK24和种系克隆亚组VκIII和VκI的人构架区，它们的每一种当与H8轻链可变区比较时显示出大于60％的氨基酸同一性。见图18-20。
所公开的人源化抗5T4抗体的恒定区来自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和其任何同种型(例如，IgG的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的任一种的恒定区。人同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的选择和人同种型中特定氨基酸的修饰可以增强或者消除宿主防御机制的激活和改变本发明的人源化抗体的生物分布。见(Reff等人(2002)Cancer Control 9：152-66)。
可以使用多种方法之一制备人源化的抗体，所述方法包括贴面、互补决定区(CDR)的移植、缩短CDR(abbreviated CDR)的移植、特异性决定区(SDR)的移植、和Frankenstein装配，如下述。这些一般方法可以与标准诱变和合成技术组合来产生任何希望的序列的抗5T4抗体。
贴面是基于通过用人氨基酸序列对抗体的溶解可及的外部进行表面重建来减少啮齿动物或者其他非人抗体中潜在免疫原性氨基酸序列的概念。从而，贴面的抗体对于人细胞的外来性看起来较低。见Padlan(1991)Mol.Immunol.28：489-98。非人抗体如下贴面：(1)鉴定非人抗体中暴露的外部构架区残基，其与人抗体的构架区中相同位置的残基不同，和(2)用通常占据人抗体中相同位置的氨基酸替换所鉴定的残基。
通过用供体抗体(例如，非人抗体)的CDR置换受体抗体(例如，人抗体)的一个或多个CDR进行CDR的移植。受体抗体可以基于候选受体抗体和供体抗体之间构架残基的相似性来选择并且可以进一步修饰以引入相似的残基。例如，人受体构架可以包含人亚组I共有序列的重链可变区，其任选在1、28、48、67、69、71和93位的一个或多个位置具有非人供体残基。作为另一实例，人受体构架可以包含人亚组I共有序列的轻链可变区，任选在2、3、4、37、38、45和60位的一个或多个位置具有非人供体残基。CDR移植后，可以在供体和/或受体序列中进行额外的改变以优化抗体结合和功能性。见例如PCT国际公布号WO 91/09967。
缩短的CDR的移植是相关方法。缩短的CDR包括特异性决定残基和相邻的氨基酸，包括轻链中27d-34、50-55和89-96位的氨基酸，和重链中31-35b、50-58和95-101位的氨基酸((Kabat等人(1987)的编号惯例)。见(Padlan等人(1995)FASEB J.9：133-9)。特异性决定残基(SDR)的移植的前提是理解抗体组合部位的结合特异性和亲和性由每个互补决定区(CDR)内的最高度可变的残基决定。对抗体-抗原复合体的三维结构的分析结合对可利用的氨基酸序列数据的分析用于基于在CDR的每个位置发生的氨基酸残基的结构的不同来对序列变异性建模。见Padlan等人(1995)FASEB J.9：133-139。由接触残基组成的最小免疫原性的多肽序列也称作特异性决定残基(SDR)，被鉴定并且移植到人构架区。
根据Frankenstein方法，将人构架区鉴定为与相关的非人抗体的每个构架区具有实质的序列同源性，并且将非人抗体的CDR移植到不同人构架区的复合物上。也可用于制备本发明的抗体的相关方法在美国专利申请公布号2003/0040606中描述。
本文描述的人源化的抗5T4抗体通常包含至少一个人源化的轻链可变区或者重链可变区。从而，本发明的人源化抗5T4抗体可以包含通过如上述贴面、缩短CDR或者SDR的移植或者Frankenstein装配制备的轻链可变区，和非人抗体(例如，H8抗体或者其他非人抗5T4抗体)的重链可变区。备选地，非人抗体的轻链可变区可以与人源化的重链可变区组合。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体包括(a)具有非人抗5T4抗体的选自SEQ ID NO：17的轻链可变区或者SEQ ID NO：18的重链可变区的CDR的一个或多个CDR，如选自SEQ ID NO：17的轻链可变区或者SEQ ID NO：18的重链可变区的CDR的两个或多个CDR的抗体；(b)具有轻链的抗体，该轻链包含具有SEQ ID NO：17的两个或三个CDR的可变区；和(c)具有重链的抗体，该重链包含具有SEQ ID NO：18的两个或三个CDR的可变区。本发明的代表性人源化抗5T4抗体还包括这样的抗体，其具有(a)SEQ IDNO：17或23所给出的轻链可变区氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：17具有至少78％同一性的轻链可变区氨基酸序列；或者(c)与SEQ ID NO：23具有至少81％同一性的轻链可变区氨基酸序列。功能的人源化抗5T4抗体(即特异结合5T4抗原的抗5T4抗体)的轻链可变区可以由如下核酸编码：(a)SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：81的核酸；(b)与SEQ ID NO：22的核酸具有至少90％同一性的核酸；(c)与SEQ ID NO：81的核酸具有至少91％同一性的核酸；或(d)在严格杂交条件(例如，0.1×SSC、65℃的最终洗涤条件)下与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：81的互补序列特异杂交的核酸。
本发明的代表性人源化抗5T4抗体还包括这样的抗体，其具有(a)如SEQ ID NOs：18、19和21的任一个给出的重链可变区氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：18具有至少83％同一性的重链可变区氨基酸序列；(c)与SEQID NO：19具有至少81％同一性的重链可变区氨基酸序列；或(d)与SEQ IDNO：21具有至少86％同一性的重链可变区氨基酸序列。功能性人源化抗5T4抗体(即特异结合5T4抗原的抗5T4抗体)的重链可变区可以由如下核酸编码：(a)SEQ ID NO：20、82和83任一项的核酸；(b)与SEQ ID NO：20的核酸具有至少91％同一性的核酸；(c)与SEQ ID NO：82的核酸具有至少94％同一性的核酸；(d)与SEQ ID NO：83的核酸具有至少91％同一性的核酸；或者(e)在严格杂交条件(例如，0.1×SSC、65℃的最终洗涤条件)下与SEQ ID NO：20、82和83任一项的互补序列特异杂交的核酸。
人源化的抗5T4抗体可以包含(a)具有SEQ ID NO：5的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：6的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(b)SEQ ID NO：5的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的重链氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO：7的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(d)SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列；(e)具有SEQ ID NO：9的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：10的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；(f)SEQ ID NO：9的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：10的重链氨基酸序列；(g)具有SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：12的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者(h)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：12的重链氨基酸序列。
可以构建本发明的人源化抗5T4抗体，其中第一链(即，轻链可变区或者重链可变区)的可变区被人源化，并且其中第二链的可变区未被人源化(即，在非人物种中产生抗体的可变区)。这些抗体在本文中称作半人源化的抗体。例如，抗5T4抗体可以包含SEQ ID NO：17或23的人源化的轻链可变区，和非人抗5T4抗体的重链可变区，如SEQ ID NO：14的鼠H8重链可变区。备选地，抗5T4抗体可以包含非人抗5T4抗体的人源化轻链可变区，如SEQ ID NO：16的鼠H8轻链可变区和SEQ ID NO：18、19、或21任一项的人源化重链可变区。不同于鼠H8的抗5T4非人抗体可以用于制备半人源化的抗体，例如，Woods等人(2002)Biochem.J.366：353-65描述的大鼠单克隆抗体。
可以容易地制备所公开的人源化抗5T4抗体的变体以包括多种改变、替代、插入和缺失，其中此类改变在使用中提供优点。例如，为增加抗体的血清半寿期，可以将补救受体结合表位(如果不存在)掺入抗体重链序列。见美国专利号5,739,277。用于增加抗体稳定性的额外修饰包括修饰IgG4以用脯氨酸置换残基241处的丝氨酸。见Angal等人(1993)Mol.Immunol.30：105-108。其他有用的改变包括如优化抗体与药物的缀合效率所需的替代。例如，抗体可以在其羧基末端修饰以包括用于药物附着的氨基酸，如可以加入一个或多个半胱氨酸残基。可以修饰恒定区以引入用于糖类或者其他部分结合的位点。
使用标准重组技术，包括位点定向诱变或者重组方法，可以产生本发明的人源化抗5T4抗体的变体。人源化抗5T4抗体的多样化所有组成成分可以通过转基因非人动物中的基因重排和基因转化方法制备(美国专利公布号2003/0017534)，然后使用功能测定法测试相关活性。在本发明的具体实施方案中，使用亲和性成熟方案，如突变CDR(Yang等人(1995)J.Mol.Biol.254：392-403)、链改组(Marks等人(1992)Biotechnology(NY)10：779-783)、使用大肠杆菌的增变株(Low等人(1996)J.Mol.Biol.260：359-368)、DNA改组(Patten等人(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8：724-733)、噬菌体展示(Thompson等人(1996)J.Mol.Biol.256：77-88)和性PCR(Crameri等人(1998)Nature 391：288-291)，可以得到抗5T4变体。对于免疫治疗应用，相关的功能测定法包括特异结合到人5T4抗原，当缀合到细胞毒素时内化抗体，并当施用于具有肿瘤的动物时靶向肿瘤部位，如实施例所述。见实施例1-11。
本发明还提供了表达本发明的人源化抗5T4抗体的细胞和细胞系。代表性宿主细胞包括哺乳动物和人细胞，如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞、和COS细胞。将异源构建体转化到宿主细胞后产生稳定细胞系的方法是本领域已知的。代表性非哺乳动物宿主细胞包括昆虫细胞(Potter等人(1993)Int.Rev.Immunol.10(2-3)：103-112)。还可以在转基因动物(Houdebine(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13(6)：625-629)和转基因植物(Schillberg等人(2003)Cell Mol.Life Sci 60(3)：433-45)中产生抗体。
I.A.嵌合和人源化抗5T4核酸
本发明还提供了编码人源化抗5T4轻链和重链可变区的分离的核酸。该分离的核酸可以用以制备如本文公开的人源化抗5T4抗体。
术语核酸分子和核酸每个指单链、双链或者三链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸和其多聚体。除非特别限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考天然核酸相似的性质。术语核酸分子或者核酸还可以代替基因、cDNA、mRNA、或者cRNA使用。核酸可以合成，或者可以来自任何生物来源，包括任何生物。克隆编码人源化抗5T4抗体的核酸的代表性方法在实施例5中描述。
本发明的代表性核酸包含SEQ ID NO：20、22、81、82或83任一种的核苷酸序列。本发明的核酸还可以包含与SEQ ID NO：20、22、81、82或83任一种基本上同一的核苷酸序列，例如，与SEQ ID NO：20、81或83任一种具有至少91％同一性或者与SEQ ID NO：22具有至少90％同一性、或者与SEQ ID NO：82具有至少94％同一性的核苷酸序列。使用序列比较算法，用SEQ ID NO：20、22、81、82或83任一种的全长序列作为查询序列(如下文描述)或者通过目视检测来比较序列得到最大对应。见实施例5和表6。
关于与所公开的人源化H8可变区核酸具有所指出的最小百分数同一性的基本上同一的核酸，基本上同一的序列还可以与SEQ ID NO：20、81或83任一种具有至少约92％同一性，如至少93％同一性，或者至少94％同一性，或者至少95％同一性，或者至少96％同一性，或者至少97％同一性，或者至少98％同一性，或者至少99％同一性。类似地，基本上同一的序列还包括与SEQ ID NO：22具有至少约91％同一性的序列，例如，至少约92％同一性，或至少93％同一性，或者至少94％同一性，或者至少95％同一性，或者至少96％同一性，或者至少97％同一性，或者至少98％同一性，或者至少99％同一性的序列；和与SEQ ID NO：82具有至少约95％同一性的序列，如至少96％同一性，或者至少97％同一性，或者至少98％同一性，或者至少99％同一性的序列。
基本上同一的序列可以是多态性序列。术语多态性指在群体中存在两种或多种遗传决定的备选序列或者等位基因。等位基因差异可以小至一个碱基对。
基本上同一的序列还可以包含诱变的序列，包括包含沉默突变的序列。突变可以包含一个或多个残基改变、一个或多个残基缺失，或者一个或多个额外残基的插入。
基本上同一的核酸还鉴定为在严格条件下与SEQ ID NO：20、22、81、82或83任一种的全长特异杂交或者实质杂交的核酸。在核酸杂交上下文中，被比较的两种核酸序列可以称作探针和靶标。探针是参考核酸分子，靶标是测试核酸分子，通常在核酸分子的异源群体中发现。靶序列与测试序列同义。
用于杂交研究或者测定的优选的核苷酸序列包括与本发明的核酸分子的至少约14到40个核苷酸的序列互补或者相似的探针序列。优选地，探针包含SEQ ID NO：20、22、81、82和83任一种的14到20个核苷酸，或者希望时甚至更长，如30、40、50、60、100、200、300或500个核苷酸或者长达全长。可以容易制备此类片段，例如，通过化学合成片段，通过应用核酸扩增技术，或者通过将所选的序列导入重组构建体用于重组生产。
短语杂交特别指当特定序列存在于复杂核酸混合物(例如，总细胞DNA或者RNA)中时，在严格条件下分子仅结合所述序列、与其形成双链体或者杂交。
短语杂交基本上指探针核酸分子和靶核酸分子之间的互补性杂交，并且包括通过减小杂交介质的严格性以实现所希望的杂交来容纳的小的错配。
在核酸杂交实验如DNA和RNA印迹分析的背景中，严格杂交条件和严格杂交洗涤条件是依赖于序列和环境的。较长的序列在较高温度下特异杂交。对核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，Elsevier，New York，New York。通常，选择高严格杂交和洗涤条件比确定的离子强度和pH下特定序列的热溶解温度(Tm)低约5℃。通常，在严格条件下，探针将与其靶标子序列但不与其他序列特异杂交。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件以等于特定探针的Tm。具有约100个以上互补残基的互补核酸的DNA或者RNA印迹分析的严格杂交条件的实例是在50％甲酰胺与1mg肝素在42℃下过夜杂交。高严格洗涤条件的一个实例是在0.1×SSC中65℃下15分钟。严格洗涤条件的实例是在0.2×SSC缓冲液中65℃下15分钟。见Sambrook等人，编者(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York对于SSC缓冲液的描述。通常，在低严格性洗涤之前为高严格性洗涤以便除去背景探针信号。多于约100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤条件的实例是1×SSC中45℃下15分钟。多于约100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是4×到6×SSC中40℃下15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH7.0-8.3下、小于约1M Na+离子的盐浓度，通常约0.01到1M Na+离子浓度(或者其他盐)并且温度通常为至少约30℃。可以加入去稳定剂，如甲酰胺实现严格条件。通常，比为特定杂交测定中不相关探针观察到的信噪比高两倍(或者更高)的信噪比指示特定杂交的检测。
下面是可以用于鉴定与本发明的参考核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的杂交和洗涤条件的实例：探针核苷酸序列优选与靶核苷酸序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS在50℃洗涤；更优选地，探针和靶序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃下杂交，接着用1×SSC、0.1％SDS在50℃洗涤；更优选地，探针和靶序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃下杂交，接着用0.5×SSC、0.1％SDS在50℃洗涤；更优选地，探针和靶序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃下杂交，接着用0.1×SSC、0.1％SDS在50℃洗涤；更优选地，探针和靶序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃下杂交，接着用0.1×SSC、0.1％SDS在65℃洗涤。
两种核苷酸序列基本上同一的另一指征是这两种核酸编码的蛋白质基本上相同，共有总体的三维结构，或者是生物功能等同物。这些术语在下文进一步定义。如果对应的蛋白质基本上同一，那么在低严格条件下不相互杂交的核酸分子将基本上同一。这可以例如在两种核酸序列包含如遗传密码允许的保守替代的变体时发生。
术语保守替代的变体指具有简并密码子替代的核酸序列，其中一个或多个所选的(或者全部)密码子的第三个位置用混合的碱基和/或脱氧肌苷残基替代。见Batzer等人(1991)Nucleic Acids Res.19：5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；和Rossolini等人(1994)Mol.CellProbes 8：91-98。
本发明的核酸还包含与SEQ ID NOs：20、22、81、82和83任一种互补的核酸，和SEQ ID NOs：20、22、81、82和83任一种的核酸和互补核酸的子序列和延长的序列。
本文使用的术语互补序列指出包含反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列当碱基对之间形成氢键时能够相互配对。本文使用的术语互补序列指基本上互补的核苷酸序列，如可以通过下文给出的相同核苷酸比较方法评估，或者定义为能够在如本文描述的相对严格条件下与所述的核酸区段杂交。互补核酸区段的特定实例是反义寡核苷酸。
术语子序列指包含更长的核酸序列的部分的核酸序列。示例性子序列是上文描述的探针，或者引物。本文使用的术语引物指连续序列，其包含约8个或者更多脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸，优选10-20个核苷酸，更优选所选核酸分子的20-30个核苷酸。本发明的引物包含具有足够长度和合适的序列以便在本发明的核酸分子上提供聚合起始的寡核苷酸。
术语延长序列指加入掺入核酸中的核苷酸(或者其他类似分子)。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在核酸分子的3’末端加入序列。此外，核苷酸序列可以与其他DNA序列组合，所述其他DNA序列为诸如启动子、启动子区、增强子、多腺苷酸化信号、内含子序列、额外的限制酶位点、多个克隆位点，和其他编码区段。从而，本发明还提供了包含所公开的核酸的载体，包括用于重组表达的载体，其中本发明的核酸有效连接功能启动子。
本文使用的术语“有效连接”指启动子区和核苷酸序列之间的功能组合，从而该核苷酸序列的转录受到启动子区的控制和调节。将启动子区有效连接到核苷酸序列的技术是本领域已知的。
本文使用的术语载体指核酸分子，其具有使其能够在宿主细胞中复制的核苷酸序列。载体还可以包括允许核苷酸序列在载体内连接的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列也在宿主细胞中复制。代表性载体包括质粒、粘粒和病毒载体。
本发明的核酸可以被克隆、合成、改变、诱变，或者其组合。用于分离核酸的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域已知的。用于产生碱基对改变、缺失或者小插入的位点定向诱变也是本领域已知的。见例如Sambrook等人(eds.)(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Silhavy等人(1984) Experiments with Gene Fusions.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover & Hames(1995)DNA Cloning：A Practical Approach.第二版，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford/New York；Ausubel(ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Biology.第三版，Wiley，New York。
I.B.嵌合和人源化的抗5T4多肽
本发明还提供了分离的人源化抗5T4多肽。本发明的代表性轻链和重链多肽如SEQ ID NOs：1-12给出。代表性轻链可变区多肽和重链可变区多肽分别如SEQ ID NOs：17和23和SEQ ID NOs：18、19和21给出。
术语多肽和蛋白质每种指由通过肽键连接的氨基酸单链组成的化合物。本发明的抗体备选地称作多肽或者蛋白质。本发明的多肽可以包含天然发生的氨基酸、合成氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸，和其组合。多肽可以包括L形式和D-形式氨基酸。
代表性非遗传编码的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸，和鸟氨酸。
代表性衍生的氨基酸包括例如，其中已经衍生游离氨基以形成胺盐酸盐、对-甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧基羰基、氯代乙酰基或者甲酰基的那些分子。可以衍生游离的羧基以形成盐、甲酯或者乙酯或者其他类型的酯或者酰肼。可以衍生游离的羟基以形成O-酰基或者O-烷基衍生物。可以衍生组氨酸的咪唑氮形成N-im-苄基组氨酸。
本发明还提供了人源化抗5T4多肽的功能片段，例如，可变区多肽。还提供了长于所公开的序列的功能多肽序列。例如，可以将一个或多个氨基酸加入抗体多肽的N-末端或者C-末端。此类额外的氨基酸可以用于多种应用，包括但不限于纯化应用。制备延长的蛋白质的方法是本领域已知的。
本发明的多肽包括(a)具有SEQ ID NO：17或23的氨基酸序列的轻链可变区多肽；(b)具有与SEQ ID NO：17有至少78％同一性的氨基酸序列的轻链可变区多肽；和(c)具有与SEQ ID NO：23有至少81％同一性的氨基酸序列的轻链可变区多肽。本发明的额外多肽包括(a)具有如SEQ IDNOs：18、19和21的任一个给出的氨基酸序列的重链可变区多肽；(b)具有与SEQ ID NO：18有至少83％同一性的氨基酸序列的重链可变区多肽；(c)具有与SEQ ID NO：19有至少81％同一性的氨基酸序列的重链可变区多肽；和(d)具有与SEQ ID NO：21有至少86％同一性的氨基酸序列的重链可变区多肽。使用序列比较算法，用SEQ ID NO：17、18、19、21或23任一种的全长序列作为查询序列(如下文描述)或者通过目视检测来比较序列得到最大对应。也见实施例5。
关于与所公开的人源化H8可变区多肽具有所指定的最小百分比同一性的基本上相同的多肽，基本上相同的多肽可以与SEQ ID NO：17、18、19、21或23的任一种的氨基酸具有至少约87％同一性，如至少88％同一性，或者至少89％同一性，或者至少90％同一性，或者至少91％同一性，或者至少92％同一性，或者至少93％同一性，或者至少94％同一性，或者至少95％同一性，或者至少96％同一性，或者至少97％同一性，或者至少98％同一性，或者至少99％同一性。本发明还包含本文公开的任一种核酸编码的多肽。
基本上相同的蛋白质还包括包含为所公开的人源化可变区多肽和可变区抗体的任一种的保守替代的变体的氨基酸的蛋白质。术语保守替代的变体指包含氨基酸的多肽，其中一个或多个残基已经用功能上相似的残基保守替代并且该多肽以与所公开的嵌合和人源化H8抗体的任一种相似的亲和力结合人抗5T4。短语保守替代的变体还包括肽，其中将残基用化学衍生的残基替代。
保守替代的实例包括将一个非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸用另一非极性残基替代；将一个极性(亲水)残基用另一极性残基替代，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的替代；将一个碱性残基如赖氨酸、精氨酸或者组氨酸用另一碱性残基替代；或者将一个酸性残基如天冬氨酸或者谷氨酸用另一酸性残基替代。
可以使用技术人员已知的多种标准技术纯化和表征本发明的分离的多肽。见例如，Schrder & Lübke(1965) The Peptides.Academic Press，NewYork；Bodanszky(1993) Principles of Peptide Synthesis.2nd rev.ed.Springer-Verlag，Berlin/New York；Ausubel(ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Biology.3rd ed.Wiley，New York。
I.C.核苷酸和氨基酸序列比较
两个或多个核苷酸或者多肽序列的上下文中，术语同一的或者百分比同一性指当为了最大对应性进行比较和比对时，如使用本文公开的序列比较算法之一或者通过目视检测测量的，相同或者具有所指定的百分数的相同氨基酸残基或者核苷酸的两个或多个序列或者子序列。
关于核苷酸或者多肽序列，术语基本上同一的指特定序列与天然存在的序列通过一个或多个缺失、替代或者添加而改变，其净效应是保留人源化的抗5T4核酸或者多肽的生物功能。
为了比较两个或多个序列，通常一个序列作为一个或多个测试序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时，测试和参考序列进入计算机程序，如果必要，指定子序列坐标，并选择序列算法程序参数。序列比较算法然后基于所选的程序参数，计算所指定的测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。
用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2：482-489的局部同源性算法、通过Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的同源性比对算法、通过Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：2444-2448的相似性方法检索、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，Madison，Wisconsin中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过目视检测来进行。一般见Ausubel(ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Biology.第三版，Wiley，New York。
确定百分比序列同一性和序列相似性的优选算法是BLAST算法，其在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中描述。进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))公开得到。BLAST算法参数决定比对的灵敏性和速度。对于两个核苷酸序列的比较，BLASTn默认参数设置为W＝11(字长)和E＝10(期望值)，并且还包括使用低复杂性滤器来掩蔽具有低组成复杂性的查询序列的残基。为了比较两个氨基酸序列，BLASTp程序默认参数设置为W＝3(字长)，E＝10(期望值)，使用BLOSUM62得分矩阵，存在缺口罚分＝11和缺口延伸罚分＝1，并使用低复杂性滤器掩蔽具有低组成复杂性的查询序列的残基。见实施例5。
I.D.功能测定法
本发明还公开了表征人源化抗5T4抗体的活性的体外和体内测定法，所述活性包括5T4结合活性、结合到细胞表面上呈递的5T4抗原后的细胞内化，和靶定受试者中表达5T4的细胞。当缀合到细胞毒素时，本发明的公开的抗体可以引起抗癌活性，包括抑制表达5T4的癌细胞的生长和/或诱导表达5T4的细胞中细胞死亡。本发明的人源化抗5T4抗体可以包含一种或多种前面的活性。
用于检测人源化抗5T4抗体与5T4抗原结合的技术是本领域已知的，包括例如，实施例5中描述的BIACORE测定法。额外的代表性技术包括离心、亲和层析和其他免疫化学方法。见例如，Manson(1992)Immunochemical Protocols.Humana Press，Totowa，New Jersey，UnitedStates of America；Ishikawa(1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay.Elsevier，Amsterdam/New York。使用分离的5T4抗原或者表达5T4的细胞可以进行抗原结合测定法。见实施例1和5。
术语抗癌活性用于一般性描述破坏现有癌细胞或者延迟或者防止癌细胞生长的能力。术语癌指受试者中原发和转移的肿瘤和癌，包括癌和造血恶性，如白血病和淋巴瘤。用于测定抗癌活性的体外测定法在实施例2和8中描述，代表性动物模型在实施例3、4和9中描述。
术语生长抑制在本文中用于描述抗5T4抗体清除表达5T4的细胞或者防止或者减少表达5T4的细胞增殖的能力。如实施例2-4和8-9中描述的，本发明的人源化抗5T4抗体可以抑制癌细胞生长。用于快速体外评估细胞生长抑制的额外代表性方法在Jones等人(2001)J.Immunol.Methods254：85-98中描述。
诱导细胞死亡的能力包括诱导程序性细胞死亡，其特征是核DNA降解、核退化和浓缩、失去膜完整性，和吞噬作用。用于评估细胞的代表性测定法在Hoves等人(2003)Methods 31：127-34；Peng等人(2002)Chin.Med.Sci J.17：17-21；Yasuhara等人(2003)J.Histochem.Cytochem.51：873-85中描述。
II.抗5T4抗体/药物缀合物
本发明还提供了包含本发明的嵌合或者人源化抗5T4抗体的抗体/药物缀合物。还提供了制备抗体/药物缀合物的方法，从而药物直接或者间接结合到抗体。本发明的抗体/药物缀合物具有通式5T4Ab(-X-W)m，
其中：
5T4Ab是本文描述的嵌合或者人源化的抗5T4抗体或者抗体片段；
X是包含可以与抗5T4抗体或者抗体片段反应的任何反应基的产物的接头；
W是药物；
m是纯化的缀合产物的平均负荷(例如，m使得药物构成缀合物重量的约3-10％)；
(-X-W)m是药物衍生物。
还提供了制备本发明的抗体/药物缀合物的方法。作为一个实例，可以如下制备式5T4Ab(-X-W)m的抗体/药物缀合物：(a)将药物衍生物加入嵌合或者人源化的抗5T4抗体，其中药物按重量计为嵌合或者人源化的抗5T4抗体的3-10％；(b)将药物衍生物和嵌合或者人源化的抗5T4抗体在具有约7到9的pH的非亲核的蛋白质相容的缓冲溶液中温育以产生抗体/药物缀合物，其中该溶液还包含(i)合适的有机共溶剂，和(ii)包含至少一种胆汁酸或者其盐的一种或多种添加剂，并且其中温育在约30℃到约35℃的温度下进行约15分钟到约24小时；和(c)将步骤(b)中产生的缀合物进行层析分离过程以分离负荷按重量计为3-10％药物并且具有低缀合分数(LCF)的抗体/药物缀合物与未缀合的嵌合或人源化的抗5T4抗体、药物衍生物，和团聚的缀合物。
II.A.药物
本文使用的术语药物指具有生物或者可检测的活性的任何物质，例如治疗剂、可检测的标记、结合剂，等等，和前体药物，其在体内代谢成活性剂。术语药物还包括药物衍生物，其中药物已经官能化使得能够与本发明的抗体缀合。通常，这些类型的缀合物称作免疫连接物。
术语治疗剂指可以用于治疗或者预防需要其的受试者中的状况的任何组合物。具体地，用于本发明的药物将包括抗癌药物。表达5T4的细胞包括来自鳞状细胞/腺瘤肺癌(非小细胞肺癌)、侵入性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、侵入性子宫内膜腺癌、侵入性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌的癌细胞。
代表性治疗药物包括细胞毒素、放射性同位素、化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促细胞凋亡剂、和细胞抑制和细胞溶解酶(例如，RNA酶)。药物还可以包括治疗性核酸，如编码免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、或促细胞凋亡剂的基因。这些药物描述符不是相互排斥的，并且从而可以使用上述术语的一个或多个描述治疗剂。例如，所选的放射性同位素也是细胞毒素。治疗剂可以制备为上面任一种的药学上可接受的盐、酸或者衍生物。通常，作为药物的具有放射性同位素的缀合物也称作放射性免疫连接物并且作为药物的具有化学治疗剂的那些缀合物也称作化学免疫连接物。
用于免疫连接物的合适的药物的实例包括紫杉烷类、美登素、CC-1065和duocarmycins、加利车霉素和其他enediynes，和auristatins。其他实例包括抗叶酸剂、长春花生物碱、和蒽环类。植物毒素、其他生物活性蛋白质、酶(例如，ADEPT)、放射性同位素、光敏剂(例如，用于光动力疗法)也可以用于免疫连接物。此外，使用二级载体，如细胞毒性剂，如脂质体或者聚合物也可以制备缀合物。
术语细胞毒素通常指抑制或者防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。代表性细胞毒素包括抗生素、微管蛋白聚合作用抑制剂、结合并破坏DNA的烷化剂，和破坏蛋白质合成或者基本细胞蛋白质如蛋白质激酶、磷酸酶、拓扑异构酶、酶和细胞周期蛋白的物质。代表性细胞毒素包括，但不限于，阿霉素、柔红霉素、伊达比星、阿克拉霉素、佐柔比星、米托蒽醌、表阿霉素、洋红霉素、诺加拉霉素、美洛格瑞、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、三氟尿苷、环胞苷、山萮阿糖啶、氮杂胞苷、脱氧氟尿苷、喷司他丁、溴苷、卡培他滨、克拉屈滨、脱氧氮杂胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌呤霉素、喃氟啶、噻唑呋林、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、氮芥、泼尼松、甲基苄肼、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉酚、紫杉酚类似物、铂化合物，如顺铂和卡铂、丝裂霉素、噻替哌、紫杉烷、长春新碱、柔红霉素、表阿霉素、放线菌素、authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、他莫昔芬、伊达比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、esperamicins和美登木素生物碱。
在本发明的具体实施方案中，细胞毒素是抗生素，如加利车霉素，也称作LL-E33288复合物，例如，γ-加利车霉素(γ1)。见美国专利号4,970,198。用γ加利车霉素酰肼衍生物的抗体缀合物进行的早期研究表明体外基于抗原的细胞毒素和在异种移植物实验中的活性。通过使用效力较低的衍生物N-乙酰基γ最初提高了这些缀合物的治疗指数。通过加入二甲基取代基稳定所有加利车霉素缀合物中存在的二硫键得到了额外的改进。适于用于制备本发明的抗体/药物缀合物的加利车霉素的额外实例在美国专利号4,671,958、5,053,394、5,037,651、5,079,233和5,108,912中公开，将它们完整引入本文作为参考。这些化合物含有甲基三硫，其可以与合适的硫醇反应形成二硫化物，同时引入官能团如酰肼或者用于将加利车霉素缀合到抗5T4抗体的其他官能团。通过加入二甲基取代基稳定所有加利车霉素缀合物中存在的二硫键得到进一步改进。这导致选择N-乙酰基γ加利车霉素二甲基酰肼或者NAc-γDMH(CL-184,538)作为用于缀合的优化衍生物之一。还可以使用加利车霉素的二硫化物类似物，例如，美国专利号5,606,040和5,770,710(将它们完整引入本文作为参考)中描述的类似物。
对于放射性治疗应用，本发明的嵌合或者人源化抗5T4抗体可以包含高能量放射性同位素。同位素可以直接结合抗体，例如，结合在抗体中的半胱氨酸残基，或者可以用螯合剂介导抗体和放射性同位素的结合。适于放射疗法的放射性同位素包括但不限于α-放射体、β-放射体、和俄歇电子。对于诊断应用，有用的放射性同位素包括正电子放射体和γ放射体。本发明的人源化抗5T4抗体可以进一步例如在抗体的酪氨酸残基上碘化，以促进抗体的检测和治疗效果。
可以缀合到抗5T4抗体的代表性放射性同位素包括18氟、64铜、65铜、67镓、68镓、77溴、80m溴、95钌、97钌、103钌、105钌、99m锝、107汞、203汞、123碘、124碘、125碘、126碘、131碘、133碘、111铟、113铟、99m铼、105铼、101铼、186铼、188铼、121m碲、99锝、122m碲、125m碲、165铥、167铥、168铥、90钇、和从其衍生的氮化物或者氧化物形式。其他合适的同位素包括α发射体，如213铋、213铅，和225锕。
血管生成和受抑制的免疫应答在恶性疾病和肿瘤生长、侵入和转移的病理发生中起关键作用。从而，用于本发明方法的药物还包括能够诱导免疫应答和/或体内抗血管生成应答的那些药物。
术语免疫应答意在指脊椎动物受试者的免疫系统对抗原或者抗原决定簇的任何应答，包括体液免疫应答(例如，产生抗原特异性抗体)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。代表性免疫调节剂包括细胞因子、黄嘌呤、白介素、干扰素和生长因子(例如，TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF)，和激素，如雌激素(己烯雌酚、雌二醇)、雄激素(睾酮、HALOTESTIN(氟氢甲睾酮))、黄体酮(MEGACE(醋酸甲地孕酮)、PROVERA(醋酸甲羟孕酮))，和皮质甾类(泼尼松、地塞米松、皮质醇)。
用于本发明的免疫调节剂还包括阻断激素对肿瘤的作用的抗激素和抑制细胞因子产生、下调自身抗原表达或者掩蔽MHC抗原的免疫抑制剂。代表性抗激素包括抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018、onapnstone、和托瑞米芬；和抗雄激素，如氟利坦、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林、和性瑞林；和抗肾上腺剂。代表性免疫抑制剂包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、溴隐亭、达那唑、氨苯砜、戊二醛、MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体、环孢霉素A、类固醇，如糖皮质类固醇、细胞因子或者细胞因子受体拮抗剂(例如，抗干扰素抗体、抗IL-10抗体、抗TNFα抗体、抗IL-2抗体)、链激酶、TGFβ、雷帕霉素、T细胞受体、T细胞受体片段，和T细胞受体抗体。
代表性抗血管生成剂包括血管形成抑制剂，如法呢基转移霉抑制剂、COX-2抑制剂、VEGF抑制剂、bFGF抑制剂、甾类硫酸酯酶抑制剂(例如，2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE))、白介素-24、血小板反应蛋白、metallospondin蛋白、I类干扰素、白介素12、鱼精蛋白、制管张素、层粘连蛋白、内皮抑制素和催乳素片段。
抗增殖剂和促细胞凋亡剂包括PPAR-γ的活化剂(例如，环戊酮前列腺素(cyPGs))、类视黄醇、三萜类化合物(triterpinoids)(例如，环木菠萝烷、羽扇豆烷、乌斯烷、齐墩果烷、木栓烷、达玛烷、葫芦素和柠檬苦素类化合物三萜类化合物)、EGF受体的抑制剂(例如，HER4)、雷帕霉素、CALCITRIOL(1，25-二羟胆钙化醇(维生素D))、芳香酶抑制剂(FEMARA(letrozone))、端粒酶抑制剂、离子螯合剂(例如，3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine))、凋亡蛋白(来自鸡aneamia病毒的病毒蛋白质3-VP3)、BcI-2和BcI-X(L)的抑制剂、TNF-α、FAS配体、TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)、TNF-α/FAS配体/TNF-相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)信号传递活化剂、和PI3K-Akt存活途径信号传递抑制剂(例如，UCN-01和格尔德霉素)。
代表性化学治疗剂包括烷化剂，如噻替哌和环磷酰胺；磺酸烷基酯，如白消安、二丙胺磺酯和哌泊舒凡；aziidines，如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；氮丙啶和methylamelamines，包括六甲密胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和trimethylolomelamine；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，如亚硝脲氮芥、氯脲菌素、福替目丁、罗氮芥、尼莫司汀、雷诺氮芥；抗生素，如aclacinomysins、放线菌素、authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-二偶氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、山萮阿糖啶、氟尿苷、5-EU；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、曼托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic acid；乙酰葡醛酸内酯；aldophospharnide glycoside；氨基-γ-酮戊酸；胺苯吖啶；bestrabucil；必桑郡；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elfornithine；醋酸羟哔咔唑；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；丙米腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸乙肼；甲基苄肼；丙亚胺；西作非兰；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2’-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(Ara-C)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如，紫杉醇(TAXOL，Oncology of Princeton，New Jersey)和多西他赛(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer of Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春烯碱；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基乌氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins和卡培他滨。
可以缀合到本文公开的嵌合和人源化抗5T4抗体和根据本发明的治疗方法使用的额外的治疗剂包括但不限于用于光动力治疗的光敏化剂(美国专利公布号2002/0197262和美国专利号5,952,329)；用于化学治疗的磁性颗粒(美国专利公布号2003/0032995)；结合剂，如肽、配体、细胞粘着配体，等等，和前体药物，如含有磷酸酯的前体药物、含有硫代磷酸酯的前体药物、含有硫酸酯的前体药物、含有肽的前体药物、含有β-内酰胺的前体药物、含有取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或者含有取代的苯乙酰胺前体药物、5-氟胞嘧啶和可以转化成更有活性的细胞毒性游离药物的其他5-氟尿嘧啶前体药物。
对于使用嵌合或者人源化抗5T4抗体的诊断方法，药物可以包含可以用于检测体外或者体内表达5T4的细胞的存在的可检测标记。用于临床诊断应用的放射性同位素包括可以在体内检测的标记，如使用闪烁照像法、磁共振成像、或者超声可以检测的那些标记。有用的闪烁照像法标记包括正电子发射体和γ发射体。用于磁源成像的代表性造影剂是顺磁或者超顺磁性离子(例如，铁、铜、锰、铬、铒、铕、镝、钬和钆)、氧化铁颗粒，和水溶性造影剂。对于超声检测，气体或者液体可以被捕获在多孔无机颗粒中，其作为微泡造影剂释放。对于体外检测，有用的可检测标记包括荧光团、和表位或者放射性标记。
II.B.接头分子
药物直接或者通过接头分子间接缀合到本发明的嵌合或者人源化的抗5T4抗体。接头分子可以是稳定或者可水解的，从而其在细胞进入后释放。药物从抗体释放的主要机制包括在溶酶体的酸性pH中水解(腙、缩醛和顺乌头酸样酰胺)、通过溶酶体酶进行肽切割(组织蛋白酶和其他溶酶体酶)，和二硫化物还原。由于切割的这些不同机制，将药物连接到抗体的机制也有很大不同并且可以使用任何合适的接头。优选地，缀合方法产生具有最低低缀合分数(即小于约10％)(LCF，多数未缀合的抗体的分数)的样品。
合适的缀合步骤的一个实例依赖于肼类和其他亲核试剂缀合到通过在抗体上天然存在的糖类的氧化产生的醛。用引入的羰基可以制备含有腙的缀合物，所述羰基提供所希望的药物释放性质。可以用接头制备缀合物，所述接头在一端具有二硫化物，在中间具有烷基链，在另一端具有肼衍生物。蒽环类是可以使用该技术缀合到抗体的细胞毒素的一个实例。
含有不同于腙的官能团的接头具有在溶酶体的酸性环境中被切割的可能。例如，从硫醇反应性接头可以制备缀合物，所述接头含有可以在细胞内切割的不同于腙的位点，如酯、酰胺和缩醛/缩酮。喜树碱是用这些接头可以缀合的一种细胞毒性剂。也可以使用从5到7元环酮制备并且一个氧连接到细胞毒性剂并且另一个氧连接到用于抗体附着的接头的缩酮。蒽环类也是使用这些接头的合适的细胞毒素。
一类pH敏感接头的另一实例是顺乌头酸，其具有与酰胺键并列的羧酸。羧酸加速酸性溶酶体中的酰胺水解。还可以使用具有一些其他类型的结构的实现相似类型的水解速率加速的接头。美登木素生物碱是可以用在C-9附着的接头缀合的细胞毒素的一个实例。
药物缀合物的另一潜在释放方法是溶酶体酶对肽的酶促水解。在一个实例中，肽通过酰胺键连接到对氨基苯甲醇，然后在苯甲醇和细胞毒性剂之间产生氨基甲酸酯或者碳酸酯。肽的切割导致氨基甲酸氨基苯甲酯或者碳酸氨基苯甲酯的断裂，或者自我牺牲。该策略示例的细胞毒性剂包括蒽环类、紫杉烷类、丝裂霉素C和auristatins。在一个实例中，通过接头而不是氨基甲酸酯的断裂也可以释放酚。在另一变型中，用二硫化物还原来起始氨基甲酸对巯基苯甲酯或者碳酸对巯基苯甲酯的断裂。
缀合到抗体的许多细胞毒性剂在水中具有很小(如果有)的溶解度并且可以由于缀合物的团聚而限制缀合物上药物负荷。克服该缺点的一种方法是向接头加入增溶基团。可以使用具有由PEG和二肽组成的接头的缀合物，包括具有附着到抗体的PEG-二酸、硫醇酸或者马来酰亚胺酸的那些缀合物、二肽接头，和结合到蒽环类的胺或者duocarmycin类似物的酰胺。另一实例是用含有结合到细胞毒性剂的接头二硫化物的PEG和结合到抗体的酰胺制备的缀合物。掺入PEG基团的方法在克服团聚和限制药物负荷中有益。
优选用于制备本发明的抗体/药物缀合物的代表性接头包括下式的接头：
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)
其中
Alk1和Alk2独立地为键或者分枝或未分枝的(C1-C10)亚烷基链；
Sp1是键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR’-、-N(CH2CH2)2N-、或者-X-Ar’-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z独立地为键、-NR’-、-S-、或者-O-，条件是当n＝0时，Y和Z的至少一个是键，并且Ar’是1，2-、1，3-或者1，4-亚苯基，其任选用(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种或者三种基团取代，条件是当Alk1是键时，Sp1是键；
n是0到5的整数；
R’是分枝或未分枝的(C1-C5)链，其任选用-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基或者(C1-C3)三烷基铵-A-的一种或两种基团取代，其中A-是药学上可接受的形成盐的阴离子；
Ar是1，2-、1，3-或者1，4-亚苯基，其任选用(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种或者三种基团取代，其中n和R’如前面定义；或者1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2，3-、2，6-或者2，7-亚萘基或者
Figure A20058003353100501
每个亚萘基或者吩噻嗪任选用(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种、三种或者四种基团取代，其中n和R’如前面定义，条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp1是仅连接到氮的键；
Sp2是键、-S-或者-O-，条件是当Alk2是键时，Sp2是键；
Z1是H、(C1-C5)烷基、或者苯基，其任选用(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-ONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种或者三种基团取代，其中n和R’如上文定义；
Sp是直链或者支链二价或者三价(C1-C18)基团、二价或者三价芳基或者杂芳基、二价或三价(C3-C18)环烷基或者杂环烷基基团、二价或者三价芳基-或者杂芳基-芳基(C1-C18)基团、二价或者三价环烷基-或者杂环烷基-烷基(C1-C18)基团或者二价或三价(C2-C18)不饱和的烷基，其中杂芳基优选是呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、唑基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、N-甲基咔唑基、氨基courmarinyl、或者吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，那么Sp可以被低级(C1-C5)二烷基氨基、低级(C1-C5)烷氧基、羟基或者低级(C1-C5)烷硫基额外取代；和
Q是＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
优选地，Alk1是分枝或未分枝的(C1-C10)亚烷基链；Sp1是键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR1，其中R1如前文定义，条件是当Alk1是键时，Sp1是键。
Ar是1，2-、1，3-或者1，4-亚苯基，其任选用(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种或者三种基团取代，其中n和R’如前面定义；或者Ar是1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2，3-、2，6-、或者2，7-亚萘基，其任选用(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种、三种或者四种基团取代。
Z1是(C1-C5)烷基或者苯基，其任选用(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’、或者-S(CH2)nCONHR’的一种、两种或者三种基团取代；Alk2和Sp2一起为键；Sp和Q如上文定义。
美国专利号5,773,001(完整引入本文作为参考)公开了与从加利车霉素制备的亲核药物，尤其肼类和相关亲核试剂一起使用的接头。这些接头可尤其用于当药物和接头之间形成的键是可水解时得到更好的活性的情况。这些接头含有两种官能团，包括(1)用于与抗体反应的基团(例如，羧酸)，和(2)用于与药物反应的羰基(例如，醛或者酮)。羰基可以与药物上的酰肼基团反应形成腙键。该键是可水解的，允许结合到靶细胞后从缀合物释放治疗剂。
作为一个实例，可以如下将嵌合或者人源化的H8抗体缀合到细胞毒性药物(1)将细胞毒性药物衍生物加到抗5T4抗体，其中细胞毒性药物按重量计为蛋白质性载体的4.5-11％；(2)将细胞毒性药物衍生物与抗5T4抗体在pH为约7到9的非亲核的、蛋白质相容的缓冲溶液中温育以产生单体细胞毒性药物/抗体缀合物，其中溶液还包含(a)合适的有机共溶剂，和(b)包含至少一种C6-C18羧酸或者其盐的添加剂，并且其中温育在约30℃到约35℃的温度下进行约15分钟到24小时；和(3)将步骤(2)中产生的缀合物进行层析分离过程以分离单体缀合物与未缀合的抗体、细胞毒性药物衍生物和团聚的缀合物，所述单体缀合物的负荷按重量计为细胞毒性药物的3％到10％并且具有低于10％的低缀合分数(LCF)。
步骤(3)的层析分离可以包括诸如大小排阻层析(SEC)、超滤/渗滤、HPLC、FPLC或者Sephacryl S-200层析的过程。使用Phenyl Sepharose 6Fast Flow层析介质、Butyl Sepharose 4 Fast Flow层析介质、OctylSepharose 4 Fast Flow层析介质、Toyopearl Ether-650M层析介质、Macro-Prep甲基HIC介质或者Macro-Prep叔丁基HIC介质，通过疏水相互作用层析(HIC)也可以完成层析分离。
制备抗-H8抗体/药物缀合物的代表性方法包括在共同待决的美国专利申请公布号2004-082764A1和美国专利申请号10/699,874(将它们完整引入本文作为参考)中关于制备CMC-544所描述的方法。使用下面的条件可以进行缀合：10mg/ml抗体、8.5％(w/w)加利车霉素衍生物、37.5mM癸酸钠、9％(v/v)乙醇、50mM HEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸))，pH8.5，32℃，1小时。使用丁基sepharose FF树脂、0.65M磷酸钾上样缓冲液、0.49M磷酸钾洗涤缓冲液，和4mM磷酸钾洗脱缓冲液可以进行疏水相互作用层析(HIC)。通过大小排阻层析、超滤/渗滤或者其他合适的方法可以完成缓冲液交换。可以在1.5％Dextran-40、0.9％蔗糖、0.01％TWEEN-80、20mM Tris/50mM NaCl，pH8.0中配制抗体/药物缀合物。还可以使用含有5％蔗糖、0.01％TWEEN-80、20mM Tris/10mM NaCl，pH8.0的备选制剂。基于该制剂调节冻干循环。所配制的主体的浓度可以为0.5mg缀合物/ml。每个主体可以含有1mg缀合物，即2ml满量。可以如希望的制备其他满量体积，例如，5ml满量。
其他制备方法包括关于CMD-193描述的方法，也在共同待决的美国专利申请号11/080,587中描述。使用下面的条件可以进行缀合：10mg/ml抗体、7％(w/w)加利车霉素衍生物、10mM脱氧胆酸、50mMHEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸))、9％(v/v)乙醇、pH8.2，32℃，1小时。可以将反应液用0.66M磷酸钾pH8.56稀释10倍，并且使用丁基sepharose FF树脂、0.60M磷酸钾上样缓冲液和洗涤缓冲液，和20mMTris/25mM NaCl洗脱缓冲液进行HIC。用再生纤维素膜通过超滤/渗滤可以完成缓冲液交换。缀合物可以对20mM Tris/10mM NaCl pH8.0(10diavolumes)渗滤。抗体/药物缀合物可以用5％蔗糖，0.01％TWEEN-80，20mM Tris/10mM NaCl，pH8.0配制。配制后主体缀合物的浓度可以为1mg/ml，并且瓶子满量可以为5mg/瓶，即5ml满量，或者如希望可以制备其他满量体积。
在本发明的特定实施方案中，使用的接头是4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。通过将β-加利车霉素、γ-加利车霉素或者N-乙酰基γ-加利车霉素或者其衍生物与3-巯基-3-甲基丁酰基酰肼、AcBut接头和本发明的抗5T4抗体反应制备抗体/药物缀合物。见，例如，美国专利号5,773,001。该接头产生在循环中基本上稳定的缀合物，每天释放估计2％的NAc-γDMH，并且其在酸性溶酶体中容易释放NAc-γDMH。在本发明的其他实施方案中，使用3-乙酰基苯基酸式酸(AcPac)或者4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)作为接头分子制备抗体/药物缀合物。见实施例2。
用于缀合放射性同位素的代表性接头包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)-异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺基6-肼烟酸盐氯化物(succinimidyl 6-hydraziniumnicotinate hydrochloride)(SHNH)，和六甲基丙二基胺肟(HMPAO)(Bakker等人(1990)J.Nucl.Med.31：1501-9，Chattopadhyay等人(2001)Nucl.Med.Biol.28：741-4，Dewanjee等人(1994)J.Nucl.Med.35：1054-63，Krenning等人(1989)Lancet 1：242-4，Sagiuchi等人(2001)Ann.Nucl.Med.15：267-70)；美国专利号6,024,938)。备选地，可以衍生靶定分子使得放射性同位素可以直接结合到它(Yoo等人(1997)J.Nucl.Med.38：294-300)。碘化方法也是本领域已知的，并且代表性方案可以见例如Krenning等人(1989)Lancet 1：242-4和Bakker等人(1990)J.Nucl.Med.31：1501-9。
为了进一步增加每个抗体/药物缀合物的药物分子数，可以将药物缀合到聚乙二醇(PEG)，包括直链或者支链聚乙二醇聚合物和单体。PEG单体为式-(CH2CH2O)-。药物和/或肽类似物可以直接或者间接，即通过合适的间隔臂基团如糖结合到PEG。PEG/抗体/药物组合物还可以包括额外的亲脂和/或亲水部分以促进药物稳定性和体内递送到靶标部位。制备含有PEG的组合物的代表性方法可以见美国专利号6,461,603、6,309,633和5,648,095等等。
许多药物(包括加利车霉素)的疏水性质可以导致抗体/药物缀合物的团聚。为了产生具有更高药物负荷/产率和减少的团聚的单体抗体/药物缀合物，可以在非亲核的蛋白质相容的缓冲溶液中进行缀合反应，所述溶液含有(i)作为共溶剂的丙二醇和(ii)包含至少一种C6-C18羧酸的添加剂。有用的酸包括C7到C12酸，如辛酸或者其盐。也可以使用不同于丙二醇的其他蛋白质相容的有机共溶剂，如乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等等。一些或者所有有机共溶剂用于将药物转移到缀合混合物。使用N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)酯或者其他同等活化的酯制备抗体/药物缀合物的有用的缓冲液包括磷酸缓冲盐水(PBS)和N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES缓冲液)。用于缀合反应的缓冲液将基本上无胺和亲核试剂。作为另一方法，可以在含有叔丁醇、没有额外添加剂的非亲核、蛋白质相容的缓冲溶液中进行缀合反应。见例如，美国专利号5,712,374和5,714,586。在美国专利号5,739,116和5,877,296中描述了用于缀合和含有加利车霉素的缀合物的额外方法。
通过反应变量的变化可以根据经验确定形成单体缀合物的最佳反应条件，所述反应变量为如温度、pH、加利车霉素衍生物输入，和添加剂浓度。丙二醇的代表量按体积计为总溶液的10％到60％，例如10％到40％，或者约30％。包含至少一种C6-C18羧酸或者其盐的添加剂的代表量为20mM到100mM，如40mM到90mM，或者约60mM到90mM。C6-C18羧酸或者其盐的浓度可以增加到150-300mM并且共溶剂下降到1％到10％。在本发明的代表性实施方案中，羧酸是辛酸、癸酸或者对应的盐。例如，200mM辛酸可以与5％丙二醇或者乙醇一起使用。缀合反应可以在稍微升高的温度(30-35℃)和pH(8.2-8.7)下进行。抗体的浓度为1到15mg/ml并且加利车霉素衍生物，如N-乙酰基γ-加利车霉素DMH AcBut OSu酯的浓度按重量计可以为抗体的约4.5％到11％。适于缀合其他药物的条件可以由本领域技术人员不用过度实验来确定。
II.C.抗体/药物缀合物的纯化
缀合后，通过常规方法可以分离单体缀合物、未缀合的反应物和/或缀合物的团聚形式，所述常规方法为例如大小排阻层析(SEC)、疏水相互作用层析(HIC)、离子交换层析(IEC)，或者层析聚焦(CF)。纯化的缀合物为单体，并且通常含有按重量计3％到10％的药物。抗体/药物缀合物还可以用疏水相互作用层析(HIC)纯化，该层析相对于SEC提供了一些优点，包括(1)能够有效降低LCF含量以及团聚体；(2)容纳大反应体积；和(3)产物的最小稀释。适于生产使用的高容量HIC介质包括Phenyl Sepharose 6Fast Flow层析介质、Butyl Sepharose 4 Fast Flow层析介质、OctylSepharose 4 Fast Flow层析介质、Toyopearl Ether-650M层析介质、Macro-Prep甲基HIC层析介质或者Macro-Prep叔丁基HIC介质。超滤/渗滤也可以用于缓冲液交换。
在代表性纯化方法中，进行多个步骤，包括离心细胞除去步骤、蛋白A亲核捕获步骤，接着是一个或两个正交层析完善步骤、病毒过滤步骤，和切向流过滤步骤以浓缩和配制。纯化方法优选产生小于5％团聚体、小于20ppm蛋白A、小于50ppm宿主细胞蛋白质，和大于50％总体回收的产物。
典型的人源化抗5T4/加利车霉素制剂主要含有(～95％)缀合的抗体，每摩尔抗体含有5-7摩尔加利车霉素。已经在实验规模(10-200mg)可重现地制备了缀合物。通过将加利车霉素浓度(μg/mL)除以抗体浓度(mg/mL)确定表达为μg加利车霉素/mg mAb的药物负荷。通过测量280nm和310nm下缀合物溶液的UV吸光度确定这些值。重要的是注意到这是平均负荷并且实际负荷是以平均负荷值为中心的半-高斯分布，即一些抗体负荷高于平均值，一些抗体负荷低于平均值。使用分析HIC-HPLC(疏水相互作用高效液相层析)可以测量的未缀合的抗体(低缀合分数)是有很小或者没有缀合的加利车霉素的抗体群体。该值是抗体上加利车霉素分布的量度并且通常不影响所施用的加利车霉素的量。使用ELISA可以测量的未缀合的加利车霉素指未缀合到抗体并且以总加利车霉素百分数表达的加利车霉素的量。药物负荷测定不区分未缀合的和缀合的加利车霉素。当使用药物负荷测定时，未缀合的加利车霉素的量是不可检测的或者可忽略的，并且因此这些测定法有效测量缀合的加利车霉素的量。
分析方法可以用于测定人源化抗5T4加利车霉素缀合物的释放和稳定性测试。可以评估缀合物的身份(IEF)、强度(总蛋白质和总加利车霉素负荷)、纯度(未缀合的加利车霉素、低缀合的抗体、团聚体含量和还原性SDS-PAGE)，和免疫亲和(抗原结合ELISA)。可以使用本领域技术人员已知的额外测定法。使用这些测定法，可以在商业生产中保持批与批的一致性。
II.D.抗体/药物缀合物的药物代谢动力学
可以评估5T4靶定的免疫连接物的药物代谢动力学并与未缀合的加利车霉素在多种动物中的药物代谢动力学相比较。例如，这可以在雌性裸鼠、雄性Sprague-Dawley大鼠和雌性猕猴中单次静脉内快速浓注施用后进行。一般通过在多种物种中低清除、低分布体积和长的明显的终末半寿期来表征抗5T4抗体的药物代谢动力学。预期未缀合的加利车霉素衍生物的血清浓度低于定量极限。预期在单次剂量毒性范围研究中这些缀合物的毒性谱与在相当的剂量下为其他抗体/加利车霉素缀合物得到的相似。
III.嵌合和人源化抗5T4抗体和抗体/药物缀合物的用途
本发明的人源化抗5T4抗体和抗体/药物缀合物都可以在体外和体内用于与表达5T4的细胞有关的应用。如实施例1描述，表达5T4的癌细胞包括鳞状细胞/腺瘤肺癌(非小细胞肺癌)、侵入性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、侵入性子宫内膜腺癌、侵入性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌。在支气管、乳腺、结肠、直肠、胃、宫颈、子宫内膜、胰腺、卵巢、革域(chorium)和精囊的癌中检测到高水平的5T4。
对于体内应用，所公开的人源化抗体作为药物载体的应用依赖于它们作为靶定分子的能力。术语靶定指与对照组织相比，在靶组织中肽或者肽类似物的优先运动和/或积累。本文使用的术语靶组织指包含表达5T4的细胞的组织，即施用于受试者后积累本发明的抗体/药物缀合物的预期部位。本文使用的术语对照组织指怀疑基本上缺少所施用的抗体/药物缀合物的结合和/或积累的部位，即基本上缺少表达5T4的细胞的组织。术语选择性靶定在本文中用来指抗体/药物缀合物的优先定位，从而靶组织中抗体/药物缀合物的量比对照组织中肽类似物的量大2倍，如约5倍或者更大、或者约10倍或者更大的量。
III.A.体外应用
本发明提供了使用人源化抗5T4抗体的体外方法。例如，可以单独或者与细胞毒性剂或者其他药物组合使用所公开的抗体以特异结合5T4阳性癌细胞，从而从细胞样品耗竭此类细胞。
提供了通过将表达5T4的细胞与包含缀合到细胞毒素的抗5T4抗体缀合物的抗体/药物缀合物接触提供靶定的细胞溶解的方法。见实施例3和8。还提供了通过将细胞与包含细胞毒性药物的抗体/药物缀合物接触来抑制表达5T4的细胞和诱导表达5T4的细胞的细胞凋亡的方法。可以在体外或者体内实现表达5T4的细胞与抗体/药物缀合物的接触。
III.B诊断和检测方法
本发明的人源化抗5T4抗体还可以用于基于它们特异结合5T4抗原在体外和体内检测5T4+细胞。检测表达5T4的细胞的方法可以包括：(a)制备包含细胞的生物样品；(b)将人源化的抗5T4抗体与生物样品在体外接触，其中该抗体包含可检测的标记；和(c)检测可检测的标记，从而检测表达5T4的细胞。
所公开的检测方法还可以在体内进行，例如，用于诊断，以提供手术内的辅助，或者用于剂量确定。对受试者施用经标记的人源化抗5T4抗体后，并且足够结合的时间后，可以显现被抗体结合的表达5T4的细胞的生物分布。所公开的诊断方法可以与治疗方法组合使用。此外，为了检测和治疗的双重目的，可以施用本发明的人源化抗5T4抗体。
代表性非侵入检测方法包括闪烁照像法(例如，SPECT(单光子发射计算机化断层显像)、PET(正电子成像术)、γ照相机成像，和直线性扫描)、磁共振成像(例如，常规磁共振成像、磁化传递成像(MTI)、质子磁共振波谱(MRS)、弥散加权成像(DWI)和函数MR成像(fMRI))，和超声。
III.C.治疗应用
本发明还涉及用于在受试者中诱导表达5T4的癌细胞的细胞溶解的方法和组合物。从而，所公开的方法用于抑制癌生长，包括延迟的肿瘤生长和抑制转移。不希望被任何单个操作模式所限制，人源化H8加利车霉素缀合物的抗原引导的靶定(见，例如，实施例3、4和9)以及被动靶定(见例如，实施例10)可以促进抗肿瘤效应。
使用公开的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物可以治疗的代表性癌包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食管、胃、胰腺、肝脏、胆囊、胆管、小肠、泌尿道，包括肾、膀胱、和膀胱上皮、雌性生殖道、子宫颈、子宫、卵巢、雄性生殖道、前列腺、精囊、睾丸、内分泌腺、甲状腺、肾上腺、垂体腺、皮肤、骨、软组织、血管、脑、神经、眼、脑膜中表达5T4的原发性和转移肿瘤。具体地，本发明的公开的抗5T4抗体/药物缀合物可以用于治疗非小细胞肺癌、转移乳腺癌、和胰腺癌，作为二线免疫疗法以及一线组合疗法的部分。靶标癌还可以表达Lewis Y糖抗原，包括乳腺、结肠、胃、食管、胰腺、十二指肠、肺、膀胱和肾癌，和胃和胰岛细胞神经内分泌肿瘤。见美国专利号6,310,185。
所公开的方法还涉及表达5T4的白血病和淋巴瘤细胞，包括霍奇金淋巴瘤细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞。淋巴瘤细胞可以是无痛的、侵入性、低等级、中间等级或者高等级淋巴瘤细胞。
从而，可以基于生物标记表达选择用本发明的人源化抗5T4抗体/加利车霉素缀合物治疗的患者，所述生物标记表达包括但不限于5T4抗原的升高的表达，得到根据富集的靶标表达而不是肿瘤来源或者组织学选择的患者群体。可以测量靶标表达作为与细胞染色强度组合的许多细胞染色的函数。例如，5T4的高表达的分类包括通过5T4的阳性免疫组织化学染色测试的大于30％(即，40％、50％或者60％)的细胞在3+水平上(在1到4的范围内)的那些患者，而5T4的中等表达包括大于20％的细胞的细胞染色为1+到2+的那些患者。
除了5T4抗原表达之外的生物标记也可以用于患者选择，包括例如基于多种药物抗性(MDR)表征肿瘤。几乎50％的人类癌症完全抗化学治疗或者仅暂时应答，之后它们不再受到常用的抗癌药物的影响。该现象称作MDR并且内在地由一些肿瘤类型表达，而其他在暴露于化学疗法治疗后获得MDR。药物流出泵P-糖蛋白介导与细胞毒性化学疗法有关的多数MDR。可以进行癌症患者肿瘤样品中存在的MDR机制的表型和功能分析以便将特定MDR机制与特定肿瘤类型中对化学疗法的抗性联系起来。
本文使用的术语癌症也包括非瘤性增殖病症。从而，本发明的方法预期用于治疗或者预防增生、组织转化、或者最尤其发育异常(此类异常生长状况的综述见DeVita，Jr.等人(2001)， Cancer：Principles and Practice.第六版，Lippincott Williams & Wilkins)。
术语癌生长一般涉及提示癌内向更发展的形式改变的多种指数的任一种。从而，用于测量癌生长的抑制的指数包括但不限于癌细胞存活的降低、肿瘤体积或者形态的减小(例如，使用计算层析X射线照相术(CT)、声像图检查或者其他成像方法可以测定的)、延迟的肿瘤生长、肿瘤脉管系统的破坏、迟发型超敏反应皮肤试验的提高的性能、细胞溶解T淋巴细胞活性的升高、肿瘤特异性抗原水平的下降。术语延迟的肿瘤生长指肿瘤生长到特定量所需的持续时间的减少。例如，治疗可以延迟相对于最初测量日(第0天)肿瘤体积增长三倍所需的时间或者生长到1cm3所需的时间。
III.D.制剂
可以容易地制备和配制本发明的嵌合和人源化的抗5T4抗体用于安全和有效的临床使用。用于施用于受试者的合适的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞)、使得制剂与预期的受者的体液等渗的溶质(例如，糖、盐和多元醇)、悬浮剂和增稠剂。合适的溶质包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)，和它们的混合物。制剂可以存在于单位剂量或者多剂量容器，例如密封的安瓿或者小瓶，并且可以保存在冷冻或者冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需要在临使用前加入无菌液态载体以施用于受试者或者随后用适于预期的应用的同位素进行放射标记。本发明的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物优选配制为如下文描述的有效剂量。
作为一个实例，代表性抗5T4抗体制剂包含40mg/ml抗体或者抗体/药物缀合物、25mM乙酸、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨醇酯20(pH5.0)的多剂量制剂并且具有2-8℃下保存两年的最小架存期。作为一个实例，抗5T4抗体制剂可以在9.0mg/ml氯化钠、7.35mg/ml二水合柠檬酸钠、0.7mg/ml聚山梨醇酯80、和无菌水，pH6.5中含有10mg/ml抗体或者抗体/药物缀合物。用于施用于实验小鼠模型的抗5T4/加利车霉素缀合物的代表性制剂包括2μg或者4μg加利车霉素(见实施例3、4和7)，其可以相应地按比例施用于人。
抗5T4抗体或者抗体/药物缀合物的稳定的冻干制剂可以如下制备：(a)将抗体/药物缀合物在溶液中溶解到0.5到2mg/ml的终浓度，所述溶液包含按重量计1.5％-5％浓度的冷冻保护剂、按重量计0.5-1.5％浓度的聚合的膨胀剂、0.01M到0.1M浓度的电解质、按重量计0.005％到0.05％浓度的溶解性促进剂、5-50mM浓度的缓冲剂，使得溶质的最终pH为7.8-8.2，和水；(b)将上面的溶液在+5℃到+10℃的温度下分配到瓶中；(c)将溶液在-35℃到-50℃的冷冻温度下冷冻；(d)将冷冻的溶液在20到80微米的初次干燥压力下在-10℃到-40℃的架子温度(shelf temperature)下进行最初的冷冻干燥步骤24到78小时；和(e)将步骤(d)的冷冻干燥的产物在20到80微米的干燥压力和+10℃到+35℃的架子温度下进行二次干燥步骤15到30小时。
用于冻干冷冻保护剂的代表性冷冻保护剂包括糖醇、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡萄糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡萄糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻多糖、角叉菜胶、半乳卡罗聚糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、石耳素、甲壳质、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油和季戊四醇。
例如，冷冻保护剂蔗糖可以以按重量计1.5％的浓度使用，聚合的膨胀剂Dextran 40或者羟乙基淀粉40可以以按重量计0.9％的浓度使用，冻干溶液中使用的电解质为氯化钠，其以0.05M的浓度存在，缓冲剂氨基丁三醇可以以0.02M的浓度使用。溶解度促进剂(例如，表面活性剂，如聚山梨醇酯80)也可以在冻干过程中使用。通常，该溶解度促进剂是表面活性剂。制备冻干的制剂的代表性步骤包括在-45℃的温度下冷冻小瓶；在60微米的初次干燥压力下和-30℃的架子温度下将冷冻的溶液进行最初的冷冻干燥步骤60小时；和在60微米的干燥压力下和+25℃的架子温度下将冷冻的产物进行二次干燥步骤24小时。
用药学上可接受的载体配制抗5T4抗体和抗体/药物缀合物，所述载体为例如大的缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。还可以使用药学上可接受的盐，如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或者有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。制剂还可以额外含有液体，如水、盐水、甘油，和乙醇，和/或辅助物质，如增湿剂或者乳化剂或者pH缓冲物质可以存在于此类组合物中。此类载体使得组合物可以配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和混悬剂，用于由患者摄入。
III.E.剂量和施用
人源化抗5T4抗体可以肠胃外施用，例如，通过静脉内、皮下、腹膜内或者肌内施用。为了将组合物递送到肺部途径，组合物可以作为气溶胶或者粗喷雾(coarse spray)施用，即经鼻施用。鞘内或者髓内施用可以用于治疗中枢神经系统(CNS)和CNS相关的癌。本发明的抗5T4抗体还可以经皮、经皮肤、局部、经肠、阴道内、舌下或者经直肠施用。基于诸如所治疗的疾病和部位、抗体制剂类型和组合物的治疗功效选择递送方法。静脉内施用可以常规地用于临床。
本发明提供了将有效量的人源化抗5T4抗体施用于受试者。术语有效量在本文中用于描述足以引起所希望的生物反应的人源化抗5T4抗体的量。例如，当施用于患有癌症的受试者时，有效量包含引起抗癌活性的量，所述抗癌活性包括癌细胞细胞溶解、癌细胞增殖的抑制、癌细胞凋亡的诱导、癌细胞抗原的减少、延迟的肿瘤生长，和转移的抑制。公认肿瘤缩小是功效的临床替代标记。另一种公认的功效标记是无恶化的存活。抗5T4/加利车霉素缀合物通常在关键功效参数中显示出至少25％的改善，如生存中值、肿瘤进展的时间，和总体反应率的改善。
通常，有效剂量为约0.01mg/m2到约50mg/m2，如约0.1mg/m2到约20mg/m2，或者约15mg/m2，其剂量基于抗5T4抗体的量计算或者基于抗体/加利车霉素制剂中加利车霉素的量计算。用于施用于实验小鼠模型的抗5T4/加利车霉素缀合物的代表性剂量包括2μg或者4μg加利车霉素(见实施例3-4和9)，其可以为施用于人相应地成比例调整。例如，可以将本发明的抗5T4/加利车霉素缀合物施用于人类患者，每3周一次，长达6个循环。对于放射性标记的抗5T4抗体，取决于同位素和抗体的结合亲和力，有效剂量通常为约1mCi到约300mCi，通常约5mCi到100mCi。
为了使用公开的嵌合和人源化抗5T4抗体检测5T4阳性细胞，将本发明的组合物的可检测量施用于受试者。如本文所用的可检测量指诊断组合物，指嵌合或者人源化H8抗体的剂量，从而可以在体外或者体内确定抗体的存在。对于使用放射性同位素的闪烁照相成像，通常放射性同位素的剂量可以包括约10μCi到50mCi，或者约100μCi到25mCi，或者约500μCi到20mCi，或者约1mCi到10mCi，或者约10mCi的活性。
本发明的组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便施用一定量的组合物，其有效实现所希望的诊断或者治疗结果。施用方案也可以改变。可以使用单次注射或者多次注射。所选的剂量水平和方案将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性和稳定性(即半寿期)、剂型、施用途径、与其他药物或者治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或者病症，和所治疗的受试者的生理状况和以前的医疗史。
对于本发明的任何抗5T4或者抗体/药物缀合物，可以在细胞培养测定或者在动物模型，通常在啮齿动物、兔、狗、猪、和/或灵长类动物中初步估计治疗有效剂量。动物模型也可以用于确定合适的浓度范围和施用途径。此类信息然后可以用于确定人体中的有用剂量和施用途径。通常，施用最小剂量，并在不存在剂量限制性细胞毒性下升高剂量。医学领域中技术人员已知有效量或者剂量的确定和调节，以及评估何时和怎样进行此类调整。
对于关于制剂、剂量和施用方案和可测量的治疗结果的额外指导，见Berkow等人(2000) The Merck Manual of Medical Information.Merck &Co.，Inc.，Whitehouse Station，New Jersey；Ebadi(1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology.CRC Press，Boca Raton，Florida；Gen naro(2000) Remington：The Science and Practice of Pharmacy.Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania；Katzung(2001) Basic & Clinical Pharmacology.Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Div.，New York；Hardman等人(2001)Goodman & Gilman′s  the Pharmacological Basis of Therapeutics.TheMcGraw-Hill Companies，Columbus，Ohio；Speight & Holford(1997)Avery′s Drug Treatment：A Guide to the Properties，Choices， Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management，Lippincott，Williams，& Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania。
III.E组合疗法
所公开的抗5T4抗体可以作为最初治疗施用，或者用于治疗对常规疗法不应答的疾病。此外，所公开的抗5T4抗体可以与其他疗法(例如，手术切除、放射、额外的靶定的抗癌药物或者系统抗癌药物，等等)组合使用以引起累加或者加强的治疗效果和/或减小一些抗癌剂的肝细胞毒性。本发明的嵌合和人源化的抗5T4抗体可以与额外的活性剂共同施用或者共同配制，或者配制用于以任何顺序连续施用。
用于组合疗法的代表性活性剂包括上文描述的如用于制备抗5T4/药物缀合物的任一种药物。本发明的嵌合和人源化抗5T4抗体还可以与其他治疗性抗体和抗体/药物缀合物组合使用，所述治疗性抗体和抗体/药物缀合物包括不同于所公开的人源化抗5T4抗体的抗5T4抗体，以及抗CD19、抗CD20(例如，RITUXAN、ZEVALIN、BEXXAR)、抗CD22抗体、抗CD33抗体(例如，MYLOTARG)、抗CD33抗体/药物缀合物、抗LewisY抗体(例如，Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193)、抗-HER-2抗体(例如，HERCEPTIN(曲妥单抗)、MDX-210、OMNITARG(pertuzumab、rhuMAb 2C4))、抗-CD52抗体(例如CAMPATH)、抗-EGFR抗体(例如ERBITUX(西妥昔单抗)、ABX-EGF(panitumumab))、抗-VEGF抗体(例如AVASTIN(贝伐单抗))、抗-DNA/组蛋白复合体抗体(例如ch-TNT-1/b)、抗-CEA抗体(例如CEA-Cide、YMB-1003)hLM609、抗-CD47抗体(例如6H9)、抗-VEGFR2(或含有激酶插入结构域的受体，KDR)抗体(例如IMC-1C11)、抗-Ep-CAM抗体(例如ING-1)、抗-FAP抗体(例如西罗珠单抗)、抗-DR4抗体(例如TRAIL-R)、抗-黄体酮受体抗体(例如2C5)、抗-CA19.9抗体(例如GIVAREX)和抗纤维蛋白抗体(例如MH-1)。
抗5T4抗体/药物缀合物还可以与细胞毒性剂的一种或多种组合一起施用作为治疗方案的部分。用于该目的的有用的细胞毒性制剂包括CHOPP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)；CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、和泼尼松)；COP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)；CAP-BOP(环磷酰胺、阿霉素、甲基苄肼、博来霉素、长春新碱和泼尼松)；m-BACOD(氨甲喋呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松、和亚叶酸；ProMACE-MOPP(泼尼松、氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、mechloethamine、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)；ProMACE-CytaBOM(泼尼松、氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱)；MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)；MOPP(mechloethamine、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)；ABVD(阿霉素/阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)；MOPP(mechloethamine、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)，备选与ABV(阿霉素/阿霉素、博来霉素、长春碱)；MOPP(mechloethamine、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)，备选与ABVD(阿霉素/阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)；ChIVPP(苯丁酸氮芥、长春碱、甲基苄肼、泼尼松)；IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲喋呤、依托泊苷)；MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲喋呤、依托泊苷)；DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)；ESHAP(依托泊苷、甲基泼尼松龙、HD阿糖胞苷、和顺铂)；CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、泼尼松和博来霉素)；CAMP(罗氮芥、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松)；和CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)；DHAP(顺铂、高剂量阿糖胞苷和地塞米松)；CAP(环磷酰胺、阿霉素、顺铂)；PV(顺铂、长春碱或长春地辛)；CE(卡铂、依托泊苷)；EP(依托泊苷、顺铂)；MVP(丝裂霉素C、长春碱或长春地辛、顺铂)；PFL(顺铂、5-氟尿嘧啶、亚叶酸)；IM(异环磷酰胺、丝裂霉素C)；IE(异环磷酰胺、依托泊苷)；IP(异环磷酰胺、顺铂)；MIP(丝裂霉素C、异环磷酰胺、顺铂)；ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)；PIE(顺铂、异环磷酰胺、依托泊苷)；Viorelbine和顺铂；卡铂和紫杉醇；CAV(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱)；CAE(环磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)；CAVE(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、依托泊苷)；EP(依托泊苷、顺铂)；和CMCcV(环磷酰胺、氨甲喋呤、罗氮芥、长春新碱)一起使用。
抗5T4/加利车霉素缀合物与系统抗癌药物如(BMS-247550、Epo-906)、紫杉烷类的重制(reformulations)(Abraxane、Xyotax)、微管蛋白抑制剂(MST-997、TTI-237)，或者与定向的细胞毒素如CMD-193和SGN-15组合使用。额外有用的抗癌剂包括TAXOTERE、TARCEVA、GEMZAR(吉西他滨)、5-FU、AVASTIN、ERBITUX、TROVAX、anatumomabmafenatox、来曲唑(letrazole)、多西他赛和蒽环类。
对于组合疗法，在适于进行预期的疗法或者诊断的时帧内施用人源化抗5T4抗体和额外的治疗或者诊断剂。从而，可以基本上同时(例如，作为单一制剂或者在数分钟或者小时内)或者以任何顺序连续施用单一活性剂。例如，单一活性剂治疗可以在相互约1年内施用，如约10、8、6、4或者2个月内，或者4、3、2或者1周内，或者约5、4、3、2或者1天内施用。抗5T4/加利车霉素缀合物和第二种治疗剂的施用优选引起比施用任一种更好的效果。
实施例
包括下面的实施例用来阐明本发明的方式。下面实施例的一些方面按照本发明共同发明人发现或者预期在本发明实践中适用的技术和步骤描述。这些实施例阐明了共同发明人的标准实验室实践。按照本公开和本领域技术人员的一般水平，技术人员将明白下面的实施例仅仅意在示例并且可以利用多种改变、修饰和更改而不背离本发明的范围。
实施例1
正常和恶性组织中的5T4表达
为了考虑5T4抗原作为癌症治疗的靶标，确定5T4在正常和恶性组织上的分布。在多种肿瘤细胞的表面上观察到高水平的5T4，在一些情况中与疾病的发展相关，并且基本上在多数正常细胞中不存在。该表达谱提示5T4作为癌症免疫治疗的似乎可能的靶标。
使用鼠H8抗5T4抗体，根据标准技术如蛋白质印迹测定正常和癌性组织中5T4的表达。通过等离子体共振或者FACS分析验证5T4的多种抗体和缀合物的亲和力。H8是杂交瘤产生的单克隆小鼠IgG1抗体，其在PCT国际公布号WO 98/55607和Forsberg等人(1997)J.Biol.Chem.272(19)：124430-12436中描述。为了用作体外和体内测定中的阳性对照，通过将表达5T4的载体转染到CT26小鼠结肠癌和MDAMB435人乳腺癌细胞中建立可再现地表达高水平5T4的肿瘤细胞。见图1和表1。
测试的肿瘤样品包括鳞状细胞/腺瘤肺癌(非小细胞肺癌)、侵入性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、侵入性子宫内膜腺癌、侵入性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌。在支气管、乳腺、结肠、直肠、胃、子宫颈、子宫内膜、胰腺、卵巢、革域和精囊的癌上检测到高水平5T4。5T4抗原(例如，同质和异质性)的细胞表面分布根据肿瘤类型而变。
为了测定5T4抗原的细胞定位，将表达5T4的细胞作为单层培养然后暴露于生物素化的鼠H8抗体。细胞溶解后，通过抗生物素蛋白结合分离膜结合的5T4抗原，并在非抗生物素蛋白结合级分中检测细胞内5T4。见图2。
为了定量细胞表面上存在的5T4抗原的百分数，将生物素化的提取物和CT26/5T4的对照培养物与抗生物素蛋白包被的小珠混合。对上清液中蛋白质进行蛋白质印迹分析，并通过光密度测定法估计5T4的量。见图3A-3B。基于通过样品稀释和H8反应带的光密度确定的线性回归线的方程，使用下式计算细胞膜(5T4M)上5T4的量：100*(1-内部光密度/总光密度)。对三种细胞类型计算5T4M：CT26/5T4，24％；PC3-MM2，15％，N87，41％。
生物素化细胞培养物的抗生物素蛋白耗竭后，通过蛋白质印迹分析确定DLD-1细胞(人结肠癌细胞)、N87细胞(人胃癌细胞)、PC3-MM2细胞(人前列腺癌细胞)和PC3细胞(人前列腺癌细胞)上的膜定位。见图4。通过FACS分析确定MDAMB435/5T4细胞(人乳腺癌细胞)上5T4的膜定位。见图5A-5B。通过FACS分析确定N87、PC14PE6和NCI-H57细胞上5T4的膜定位。见图6。还通过组织样品中组织化学检测确定PC3-MM2细胞上5T4抗原的膜定位。
为了评估5T4抗原结合后H8抗体是否被内化，在数小时期限内测定细胞表面上抗体的量。H8从CT26/5T4细胞表面的消失表明5T4/H8复合体的内化。见图7。
表1概述了肿瘤细胞中的5T4表达。在结肠直肠癌、胃癌和卵巢癌中，5T4的表达直接涉及疾病的发展。在乳腺癌中，观察到转移的结节上5T4染色的增强的强度。然而，在原发肿瘤中5T4表达和该疾病的阶段之间没有发现相关性。见表2。
                                    表1
                            肿瘤细胞中5T4表达
  细胞系   癌   5T4表达   细胞膜上5T4的存在
  蛋白质印迹   蛋白质印迹+生物素化   FACS
  DLD-1   结肠   2/2(a)   1/1   10(b)
  GEO   结肠   0/2   n.d.   4.0
  HCT116   结肠   1/1   n.d.   2.2
  HT29   结肠   2/2   0/1   2.7
  LOVO   结肠   0/2   0/1   3.3
  HCA7   结肠   1/1   n.d.   8.0
  MDAMB361   乳腺   3/3   2/2   38.0，38.0，34.0
  MDAMB435   乳腺(黑素瘤？)   0/2   n.d.   2.4
  PC3   前列腺   4/4   1/1   3.0
  PC3MM2   前列腺   6/6   2/2   11.0，14.0
  H157   肺(NSCLC)   n.d.   1/1   36.3，41.8
  PC14   肺(NSCLC)   1/1   n.d.   3.5
  PC14/PE6   肺(NSCLC)   1/1   n.d.   3.6
  N87   胃   4/4   3/3   7.6
  JAR   绒毛膜   2/2   1/1   9.0
  JEG   绒毛膜   2/2   1/1   2.3
  LOX   黑素瘤   2/2   0/1   0.2，0.9
  A431   子宫颈   3/3   1/2   2.3，2.3
  BXPC3   胰腺   1/1   n.d.   3.9
(a)＝5T4阳性培养物的分数
(b)＝相对平均通道荧光＝用H8染色后的MCF/用mlgG染色后的MCF
表2
乳腺癌中5T4表达
Figure A20058003353100701
*＝4/19＝1-2+
实施例2
制备和表征抗5T4-加利车霉素(CM)缀合物
鼠H8抗体用于制备抗体/药物缀合物。然后在体外测试缀合物结合人5T4抗原和诱导癌细胞的细胞溶解的能力。用三种接头将加利车霉素连接到H8：4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸式酸(AcPac)和4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)。为了增加H8-加利车霉素缀合物中加利车霉素的量，在用加利车霉素缀合前将抗体缀合到PEG，例如，使用PEG-SPA、PEG-SBA和PEG-二-马来酰亚胺。在表4中，每种H8-加利车霉素缀合物的效率报道为ED50，其是以缀合物或者以游离药物给出的加利车霉素量，所述量导致相对于未处理的对照，细胞培养物的减少50％。使用活体染料(MTS)确定细胞数。
通过AcBut(4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸)酸可水解的接头将加利车霉素直接连接到H8证明是困难的并且产生多数团聚的团聚体和每个抗体具有低量的CM的缀合物(约1摩尔/摩尔)。所得复合体的低水平缀合和团聚性质使得这些复合体不适于使用。
通过稳定的酰胺键(4-巯基-4-甲基-戊酸)将加利车霉素连接到H8导致当与其5T4-阴性对应物比较时，对表达5T4的癌的细胞毒性强增强200倍。见图8和表4。尽管存在该选择性，但是缀合物的毒性低于游离加利车霉素并且在每毫升培养基500ng加利车霉素的浓度下不能完全破坏细胞培养物。
使用聚乙二醇(PEG)、H8、加利车霉素和AcBut接头制备的缀合物不形成团聚体并且具有每摩尔H8约6摩尔加利车霉素的负荷。所测试的多种类型的PEG将H8与5T4的结合减小50％到90％。见表3。
                    表3
            H8抗体/PEG的结合活性
  名称   MW(kDa)   H8PEG的结合*
 BIACORE   FACS
  PEG-SPA(PEG2K)   2   69％   64％
  PEG-SBA(PEG5K)   5.3   79％   79％
  PEG-二-马来酰亚胺(PEGmal2)   3.4   43％   未确定
*抗体修饰后结合5T4的分数
尽管结合减小，但是两种H8PEG-AcBut-CalichDMH缀合物、H8PEG2K-AcBut-CalichDMH和H8PEGmal2-AcBut-CalichDMH证明了在体外诱导表达5T4细胞的细胞溶解的选择性功效。为仅仅保留约30％结合活性的H8-加利车霉素缀合物观察到选择性细胞毒性。H8PEG2K-AcBut-CalichDMH比游离加利车霉素更具毒性并且在每毫升培养基500ng加利车霉素的浓度下完全破坏细胞培养物。见图9A-9B和表4。
                                                                表4
                                        H8-加利车霉素缀合物对表达5T4细胞的选择性细胞溶解
  处理   细胞系
  MDAMB435   MDAMB435/neo   MDAMB435/5T4
  名称   抗体   PEG   接头   ED50(ng/ml)   泛围(ng/ml)   ED50(ng/ml)   泛围(ng-ml)   ED50(ng/ml)   泛围(ng-ml)
  CM   无   无   无   3.80(4)a   0.70-7.00   11.90(7)   2.00-30.00   10.50(6)   5.00-20.00
  CMA   p67.6   无   AcBut   41.00(3)   23.00-70.00   50.00(5)   20.00-90.00   55.00(4)   20.00-80.00
  H8-CM   H8   无   AcBut   3.00(1)   3.00-3.00   2.30(1)   2.30-2.30   0.04(1)   0.04-0.04
  H8～CM   H8   无   AcPac   未确定   未确定   1.00(1)   1.00-1.00   0.02(1)   0.02-0.02
  H8^CM   H8   无   Amide   未确定   未确定   40.00(1)   40.00-40.00   0.18(1)   0.18-0.18
  H8PEG2K-CM   H8   PEG2K   AcBut   31.00(2)   12.00-50.00   41.50(2)   23.00-60.00   2.60(2)   2.00-3.20
  H8PEG5K-CM   H8   PEG5K   AcBut   36.00(2)   22.00-50.00   45.00(2)   40.00-50.00   31.50(2)   30.00-33.00
  H8PEGmal2-CM   H8   PEGmal2   AcBut   未确定   未确定   7.00(1)   7.00-7.00   0.90(1)   0.90-0.90
括号中的数字指出实验数目
实施例3
使用皮下异种移植物对H8-加利车霉素缀合物的抗肿瘤功效
为了评估H8-加利车霉素缀合物的体内细胞毒性，通过皮下注射MDAMB435/5T4细胞(过表达人5T4抗原的人乳腺癌细胞)、NCI-H157细胞(人非小细胞肺癌细胞)、PC14PE6细胞(人非小细胞肺癌细胞)，或者N87细胞(人胃癌细胞)，用裸鼠制备肿瘤。以4天间隔给予，即在第1、5和9天给予总共3剂，通过腹膜内注射到带有肿瘤的小鼠来施用H8-加利车霉素缀合物和对照化合物。H8-加利车霉素缀合物抑制所有肿瘤类型的生长。见图10、11A-11B、12、13A-13B和14。
实施例4
使用人肺癌的同位模型研究H8-加利车霉素缀合物的抗肿瘤功效
为了进一步评估具有H8-加利车霉素缀合物的抗体的靶定能力，基本上如Onn等人(2003)Clin.Cancer Res.9(15)：5532-5539所述的使用非小细胞和小细胞癌的同位模型。简言之，将人肺腺癌(PC14PE6)注射到裸鼠的尾部静脉，其然后迁移而在肺中形成肿瘤。肿瘤在肺实质中表现为实体结节并且导致含有悬浮的肿瘤细胞的出血性胸膜渗漏。见图15A-15G。通过在肿瘤细胞注射后第6天开始腹膜内注射到带有肿瘤的小鼠进行对照化合物和H8-加利车霉素缀合物的注射，总共三剂，以4天的间隔，即在第6、10和14天时施用。H8-加利车霉素缀合物的施用导致带有肿瘤的动物的存活率增加。见图16。施用未缀合的H8抗体或者对照缀合物CMA没有减小胸膜渗漏。然而，CMS轻微地增加了带有肿瘤的小鼠的平均存活率。见图17。
实施例5
人源化抗5T4抗体的制备和表征
使用来自鼠H8抗体的序列和人抗体序列制备嵌合和人源化的抗5T4抗体。在图27A-27F中显示了本发明的代表性抗体的序列。
构建了具有鼠H8重链和轻链可变区序列和人恒定区序列的嵌合H8抗体(图27A-27B)。用于制备嵌合和人源化H8抗体的代表性人恒定区包括人IgG1、人κ和人IgG4的恒定区。任选引入突变以改变恒定区效应功能，如依赖细胞的细胞毒性(CDC)、补体裂解、和依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。见图26A-26B。为了克隆编码IgG恒定区的序列，任选缺失内含子序列。见实施例6。还制备抗体，其中一条抗体链包含鼠H8可变区(如嵌合抗体中)，另一条抗体链包含人源化的H8可变区，即，半人源化的抗体(图27C)。
构建人源化的H8可变区以包括移植到人或者基本上人构架区上的鼠H8的CDR。使用AbM定义鉴定鼠H8抗体的CDR，所述定义基于序列变异性以及结构环区的位置。人受体构建是基于它们与鼠H8抗体的构架区实质上相似或者与可变区亚家族的共有序列最相似来选择的。见图18-23。还考虑人中构架基因座的表示，从而广泛表示的序列比不广泛的序列优选。例如，进行人构架受体序列的额外突变以便恢复认为参与抗原接触的鼠残基和/或参与抗原结合部位的结构完整性的残基。还根据CHO细胞的密码子偏爱优化氨基酸序列和除去限制酶位点。使用肽结构域预测程序分析人源化的可变重和轻区域序列以鉴定和避免人源化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。使用该策略，构建了三种形式的人源化H8可变区。形式1保留了构架序列内认为对于抗体完整性和抗原结合重要的位置处的鼠H8残基。形式2保留了仅CDR中的鼠残基。形式3与形式2类似，只是将共有可变区序列用作重链受体构架。形式3抗体的轻链可变区与形式2抗体的相同。见图24A-24C。
使用SMARTcDNA合成(Clontech)，接着通过PCR扩增克隆H8抗5T4抗体可变重链和轻链区。使用寡聚(dT)和SMARTHA oligo与POWERSCRIPTTM逆转录酶(Clontech)，从H8杂交瘤细胞分离的1μg总RNA合成cDNA。使用与SMARTIIA oligo序列退火的引物和人恒定区特异引物(小鼠κ用于轻链，小鼠IgG1用于重链)与VENT聚合酶，通过PCR扩增cDNA。将重链和轻链PCR产物亚克隆到pED6表达载体并测定核酸序列。该方法是有利的，因为不需要DNA序列的现有知识。此外，使用简并PCR引物不改变所得DNA序列。
当与公布的核苷酸序列(PCR国际公布号WO 98/55607和Forsberg等人(1997)J.Biol.Chem.272(19)：124430-12436中)比较时，注意到鼠H8的核苷酸序列之间的一些差异。所提到的差异不改变蛋白质序列。重链可变区的氨基酸133密码子中存在的T(公布的)到C的差异分别与密码子ACT和ACC相关。ACT和ACC都编码氨基酸苏氨酸(T)。重链可变区的氨基酸138的密码子中存在的T(公布的)到C的差异分别与密码子TCT和TCC相关。TCT和TCC都编码氨基酸丝氨酸(S)。轻链可变区的氨基酸126的密码子中存在的A(公布的)到C的差异分别与密码子ATA和ATC相关。ATA和ATC都编码氨基酸异亮氨酸(I)。
为了构建人源化的H8轻链可变区，DPK24种系序列VL-IV/基因座B3用作受体构架。DPK24序列与鼠H8轻链可变区具有68％同一性并且当与鼠H8轻链构架序列比较时含有18个氨基酸替代。人源化的H8轻链可变区形式1保持鼠H8残基S43、S49和F87。确定增加表达的突变包括F10S、T45K、I63S、Y67S、F73L和T77S。见图18。
还使用种系克隆亚组VκIII和VκI的轻链可变区的构架区构建人源化抗体。见图19-20。具体地，包括轻链VκIII亚组构架区和所公开的人源化H8抗体形式1的抗体高度表达并且是稳定的。基于VκIII种系构架L16、L2、A27、L6、L10和L25用于人源化H8轻链可变区的9个突变(T7S、D17E、V19A、S50Y、I63S、Y67S、F73L、T77S和F87Y)已经引入人源化H8抗体形式2并且不损害结合亲和力。类似地，基于亚组VκI的种系构架的用于人源化H8轻链可变区的10个突变(T7S、F10S、V19A、T46K、S50Y、I63S、T67S、F73L、T77S和F87Y)已经引入人源化H8抗体而不影响结合亲和力。此外，在H8轻链可变区的1、9、10、12、15、22、43、45和83位的氨基酸替代不影响抗原结合。
为了构建人源化的H8重链可变区，DP75种系序列VH-I/基因座1-02用作受体序列。DP75序列与鼠H8重链可变区具有65％同一性并且当鼠与H8重链构架序列比较时并且含有28个氨基酸替代。人源化的H8重链可变区形式1保留了鼠H8残基K38和S40，其对于与重链和轻链可变区的抗原接触是重要的，还保留了I48，其对于与可变区和CDR2的抗原接触是重要的。见图21。备选地，使用重链可变区亚组共有序列制备人源化H8重链形式3。共有序列当与鼠H8重链构架序列比较时含有25个氨基酸替代。见图22-23。
通过将重叠的寡核苷酸一起退火并将它们连接到含有人抗体恒定区的pED6表达载体来构建人源化的H8重链和轻链可变区。使用PCR诱变或者位点定向诱变也可以构建人源化的重链和轻链可变区。寡核苷酸的设计包括CHO细胞表达的密码子选择的优化和除去限制酶位点。从H8可变重链区除去BgIII限制性位点。用于合成人源化H8轻链可变区形式1的寡核苷酸在SEQ ID NOs：27-32中给出。用于合成人源化H8轻链可变区形式2的寡核苷酸在SEQ ID NOs：33-36中给出。用于合成人源化H8重链可变区形式1的寡核苷酸在SEQ ID NOs：37-44中给出。用于合成人源化H8重链可变区形式2的寡核苷酸在SEQ ID NOs：37、39-42和44-46中给出。用于合成人源化H8重链可变区形式3的寡核苷酸在SEQ ID NOs：37、40、41和44-48中给出。
为了评估人源化H8可变区序列的新颖性，进行BLASTp检索(用于蛋白质查询序列)，使用默认参数：期望值＝10；字长＝3，低复杂度滤器，和BLOSUM62矩阵，允许缺口罚分＝11，和延伸＝1。进行BLASTn检索(用于核苷酸查询序列)，使用默认参数：期望值＝10；字长＝11，和低复杂度滤器。BLAST检索结果报导为与查询序列有关的序列列表，以E值顺序排列，E值是数据库中鉴定的匹配的统计学显著性的指示。在表5(BLASTp)和表6(BLASTn)中鉴定了与用于BLAST分析的人源化可变区序列最密切相关的序列。在图25A-25O中显示了BLAST结果和每个查询序列与最密切相关的受试序列(subject sequence)的比对。
表5
BLASTp分析
 查询序列   最密切的受试序列的同一性(％)   最密切的受试序列的描述   图
 VL形式1(SEQ ID NO：17)   77％   gi|229528|prf|751423A蛋白质Len，Bence-Jones   25A
 VL形式2(SEQ ID NO：23)   80％   gi|229528|prf|751423A蛋白质Len，Bence-Jones   25C
 VH形式1(SEQ ID NO：18)   82％   gi|161791|gb|AAB16857.1人免疫球蛋白IgM重链VH1区   25B
 VH形式2(SEQ ID NO：21)   85％   gi|161791|gb|AAB16857.1人免疫球蛋白IgM重链VH1区   25D
 VH形式3(SEQ ID NO：19)   80％   gi|17939658|gb|AAH19337.1|人IGHG1蛋白   25E
表6
BLASTn分析
 查询序列   最密切的受试序列的同一性(％)   最密切的受试序列的描述   图
 VL形式1(SEQ ID NO：81)   90％   gi|7769338|gb|AF206032.1小鼠杂交瘤16B2-A1抗肌球蛋白免疫球蛋白轻链可变区mRNA，部分cds   25J-25K
 VL形式2(SEQ ID NO：22)   89％   gi|7769338|gb|AF206032.1小鼠杂交瘤16B2-A1抗肌球蛋白免疫球蛋白轻链可变区mRNA，部分cds   25F-25G
 VH形式1(SEQ ID NO：82)   93％   gi|34539549|gb|AY369876.1小鼠克隆BaPFO-17免疫球蛋白mu重链可变区mRNA，部分cds   25L-25M
 VH形式2(SEQ ID NO：20)   90％   gi|47109385|emb|AJ7045366.1抗-PLAP ScFv抗体的合成构建体，克隆GLC4   25H-25I
 VH形式3(SEQ ID NO：83)   90％   gi|47109385|emb|AJ7045366.1|抗-PLAP ScFv抗体的合成构建体，克隆GLC4   25N-25O
为了证明可以表达嵌合和人源化的抗体，将COS-1细胞用编码本发明的代表性抗5T4的抗体的质粒瞬时转染。48小时后，使用ELISA测定细胞培养基以确定人IgG抗体的水平。如表7中所示，所有抗5T4抗体都表达。
表7
嵌合和人源化抗5T4抗体的表达
  抗体   细胞培养基中的人IgG(μg/ml)   相对于嵌合H8，表达增加的倍数
  嵌合H8(mVH/mVL)   0.5   --
  半人源化H8(mVH/hVL1)   8.4   17
  人源化H8形式1(hVH1/hVL1)   3.6   7
  人源化H8形式2/1(hVH2/hVL1)   2.0   4
  人源化H8形式1/2(hVH1/hVL2)   4.3   9
  人源化H8形式2(hVH2/hVL2)   2.1   4
mVH，鼠H8重链可变区
mVL，鼠H8轻链可变区
hVH1，人源化H8重链可变区形式1
hVL1，人源化H8轻链可变区形式1
hVH2，人源化H8重链可变区形式2
hVL2，人源化H8轻链可变区形式2
为了评估嵌合和人源化H8抗体的结合特异性和亲和力，使用在CM5芯片上固定的人5T4抗原进行BIACORE分析。BIACORE技术利用抗体结合到表面层上固定的5T4抗原时表面层处折射率的改变。通过从表面折射的激光的表面等离子体共振(SPR)检测结合。结合(on)率和解离(off)率的信号动力学分析允许区分非特异和特异相互作用。使用的抗体的浓度在12.5nM到200nM范围内。见表8。类似于鼠H8抗体，用BIACORE测定法进行嵌合、半人源化和人源化H8抗体的测定。
表8
BIACORE测定的结果
  抗体   KD(M)   kd(1/s)   ka(1/Ms)
  鼠H8   5.8×10-10   5.9×10-5   1.0×105
  嵌合H8(mVH/mVL)   3.0×10-10   4.2×10-5   1.4×105
  人源化H8形式1(hVH1/hVL1)   8.4×10-10   7.8×10-5   0.9×105
  人源化H8形式2(hVH2/hVL2)   1.2×10-10   1.3×10-5   1.1×105
  人源化H8形式3(hVH3/hVL2)   1.2×10-10   1.9×10-5   1.5×105
mVH，鼠H8重链可变区
mVL，鼠H8轻链可变区
hVH1，人源化H8重链可变区形式1
hVL1，人源化H8轻链可变区形式1
hVH2，人源化H8重链可变区形式2
hVL2，人源化H8轻链可变区形式2
hVH3，人源化H8重链可变区形式3
为了评估结合的选择性，进行FACS分析来检测MDAMB435/neo细胞或者MDAMB435/5T4细胞上的5T4抗原，该检测使用所指示浓度的鼠H8、H8的嵌合形式和H8的人源化形式。所有抗体都显示出对表达5T4的细胞的选择性结合。见图28A-28B。
使用竞争结合测定法如下测定嵌合H8抗体和人源化H8形式1-3的结合性质。将ELISA板用人5T4抗原包被。向每孔加入100μl PBS-CMF(pH7.2)中的1μg/ml 5T4抗原。将板在4℃过夜温育。用抗原包被后，将板用PBS-CMF，pH7.2中的0.02％酪蛋白的封闭溶液在温室洗涤2-4小时。制备测定缓冲液(PBS中0.5％BSA+0.02％TWEEN-20)中的250ng/ml嵌合H8抗体的连续稀释液，将其转移到包被并封闭的ELISA板，在室温温育1-2小时。将板用200μl PBS中的0.03％TWEEN-20洗涤4次。每孔加入100μl BIOFXTMB(Biofx Laboratories，Inc.of Randallstown，Maryland)后在室温显影信号10-15分钟。通过每孔加入100μl 0.18NH2SO4停止反应。温和搅拌下进行所有温育和洗涤步骤。在450nm读数ELISA板。通过将OD450(平均的一式两份数据点)作为生物素化的抗体浓度的函数作图来确定结合抗原的生物素化抗体的ED50。通过如上制备经包被和封闭的ELISA板，向这些板转移测试抗体的连续稀释液与所计算的ED50浓度下的生物素化的嵌合H8抗体来进行竞争ELISA。使用用测定缓冲液1∶10,000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP扩增生物素标记，然后如上进行信号显影和定量。见图29。
为了评估结合到5T4抗原后，人源化抗5T4抗体是否被内化，使用如实施例1中描述的FACS分析测定在MDAMB435/5T4细胞的细胞表面上检测的抗体的量。如对嵌合H8抗体和H8抗体/加利车霉素缀合物观察到的，人源化H8抗体被表达5T4的细胞内化。见图30。
实施例6
人源化H8抗体的瞬时和稳定表达
为了大规模产生人源化H8抗体，制备表达人源化H8形式1-3的稳定CHO细胞系。作为最初步骤，在COS-1细胞中瞬时表达编码载体后评估抗体产生的水平。将编码人源化H8重链和轻链的DNA分别亚克隆到双顺反子表达载体pSMED2(氨甲喋呤抗性)和pSMEN2(新霉素抗性)中。三种人源化的H8抗体以相似水平表达，其大于对嵌合H8抗体观察到的水平。见图31。
为了在CHO细胞中表达，通过除去三个内含子进一步优化人IgG4突变的恒定区，其导致人源化H8抗体的更高的表达和稳定性。通过将pSMED2_huH8重链和pSMEN2_huH8轻链共转染到预先适应的CHODukx细胞系153.8，制备表达人源化H8抗体的CHO细胞系。在50nM氨甲喋呤中选择的前导克隆的表达水平具有17mg/升/24小时的平均效价和10μg/106个细胞/24小时的平均细胞生产力。在50nM氨甲喋呤和G418(1mg/ml)中选择的前导库具有8mg/升/24小时的平均效价并且其平均细胞生产力为6μg/106个细胞/24小时。
实施例7
人源化H8-加利车霉素缀合物的制备和表征
基本如实施例2描述的将人源化的H8抗体缀合到加利车霉素。添加剂脱氧胆酸盐和癸酸钠每种都产生具有低水平的未缀合的蛋白质和团聚体的缀合物。见表9。
表9在5mg生产规模下人源化H8和加利车霉素的缀合
  最终反应数据
  添加剂/浓度   蛋白质(mg/mL)   负荷(mcg/mg)   团聚体   LCF
  脱氧胆酸盐/10mM   5.27   78.9   7.1   1.88
  癸酸盐/37.5mM   4.95   84.8   7.07   0
基本上如实施例2中描述的通过等离子体共振比较鼠H8、人源化H8和人源化H8加利车霉素缀合物的结合动力学。缀合物样品含有61μgCalichDMH/mg蛋白质，1％游离抗体和1.4％团聚体。人源化H8形式2-加利车霉素缀合物的结合性质与鼠H8-加利车霉素缀合物的性质相当(表10)，表明抗体的人源化和加利车霉素的缀合都不影响对5T4的结合。通过使用流式细胞术确定表达5T4的肿瘤细胞上抗体和缀合物的结合独立地证实了这些结果。
表10
使用抗体/加利车霉素(CM)缀合物进行BIACORE测定的结果
  缀合物   KD(M)   Kd(1/s)   ka(1/Ms)
  鼠H8/CM   5.8×10-10   5.9×10-5   1.0×105
  人源化H8形式2/CM   1.7×10-10   2.0×10-5   1.2×105
  人源化H8形式2/AcBut/CalichDMH   2.6×10-10   3.4×10-5   1.3×105
实施例8
人源化H8-加利车霉素缀合物体外的抗肿瘤功效
为了评估人源化H8-加利车霉素缀合物的体外细胞毒性，基本上如Boghaert等人(2004)，Clin.Cancer Res.，10：4538-4549所述的在抗体-加利车霉素缀合物或游离加利车霉素的存在下培养MDAMB435/5T4细胞(过表达人5T4抗原的人乳腺癌细胞)和MDAMB435/neo细胞(对照细胞)。在表11中，每种试剂的细胞毒性以ED50(ng/ml)报导，其是导致相对于未处理的对照细胞培养物的50％减少的作为缀合物或者游离药物给出的加利车霉素的量。药物暴露后96小时使用活体染料(MTS)测定培养物中细胞数目。当加入到MDAMB435/5T4细胞时，ED50或者缀合物总是比加入到MDAMB435/neo细胞的更低(3倍到6倍)。
还使用以适于球状体生长的方式培养的MDAMB435/5T4和MDAMB435/neo细胞评估人源化H8-加利车霉素缀合物的细胞毒性。该模型近似产生肿瘤的条件并且对细胞毒性药物具有内在更大的抗性。该模型的另一优点是它允许更长的培养期。在抗体-加利车霉素缀合物或者游离加利车霉素存在下培养144小时后，测定每个球状体的大小。如表12所示，当加入到MDAMB435/5T4细胞时，huH8-AcBut-CalichDMH的ED50比加入到MDAMB435/neo的低6倍。
使用任一测定法，人源化H8-加利车霉素缀合物在诱导细胞毒性和抑制球状体生长方面比游离的加利车霉素或者CMA-676(一种抗-CD33-加利车霉素缀合物)实质上更有效。可以在集落形成测定和球状体测定但是不能在活体染料测定中阐明PC14PE6细胞的选择性毒性。结果表明缀合物的细胞毒性直接涉及细胞表达的5T4的量。此外，缀合物比游离药物(CalichDMH)或者对照缀合物(CMA-676)更有效。
表11
MTS测定的结果
  细胞   MDAMB435/5T4   MDAMB435/neo
  实验   A  B   A   B
  ED50(ng/ml)CalichDMH   10  4   2.3   2.2
  ED50(ng/ml)huH8-AcBut-CalichDMH   0.15  0.13   0.43   0.8
  ED50(ng/ml)CMA-676   40  ＞400   30   70
  huH8-AcBut-CalichDMH与CalichDMH相比的X倍效力   100  31   5.3   2.8
  huH8-AcBut-CalichDMH与CMA-676相比的X倍效力   267  ＞3,077   70   80
CalichDMH，游离的加利车霉素
huH8-AcBut-CalichDMH，使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体
CMA-676，缀合到加利车霉素的抗CD33抗体
实验A和B，在不同的日子进行的实验。
表12
球状体生长测定结果
  细胞   MDAMB435/5T4   MDAMB435/neo
  ED50(ng/ml)CalichDMH   1.6   2
  ED50(ng/ml)huH8-AcBut-CalichDMH   0.5   0.08
  ED50(ng/ml)CMA-676   11   3.2
  huH8-AcBut-CalichDMH与CalichDMH相比的X倍效力   3.2   25
  huH8-AcBut-CalichDMH与CMA-676相比的X倍效力   22   40
CalichDMH，游离的加利车霉素
huH8-AcBut-CalichDMH，使用4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)缀合到加利车霉素的人源化H8抗体
CMA-676，缀合到加利车霉素的抗CD33抗体。
实施例9
使用皮下异种移植物研究人源化H8-加利车霉素缀合物的抗肿瘤功效
为了评估在体内人源化H8-加利车霉素缀合物的细胞毒性，通过皮下注射N87细胞(人胃癌细胞)、MDAMB435/5T4细胞(过表达人5T4抗原的人乳腺癌细胞)或者PC14PE6细胞(人非小细胞肺癌细胞)在裸鼠中制备肿瘤。通过向具有肿瘤的小鼠腹膜内注射共三次剂量来施用人源化H8-加利车霉素缀合物和对照试剂，所述剂量以4天间隔施用，即在第1、5和9天，然后选择具有约0.08cm3大小的肿瘤(图33A-33C、34A-34C、35A-35C、和35E)，或者在第19、23和27天施用，然后选择实现了1.08cm3大小的肿瘤(图35D)。在一个研究中，治疗具有复发肿瘤的动物(图35E)。将总共11只动物用人源化H8-加利车霉素缀合物治疗，13只动物用所指出的对照物质治疗。
在第一剂后99天确定对疗法的应答率。完全应答率(CR)是具有小于或者等于该组的平均最初肿瘤体积的肿瘤大小的幸存小鼠的百分数。部分应答率(PR)是具有小于或者等于该组的平均最初肿瘤体积两倍的肿瘤大小的幸存小鼠的百分数。总应答(TR)是CR和PR之和。无应答(NR)计算为(100-TR)。见图33C、34C和35C。人源化H8-加利车霉素缀合物抑制所有肿瘤类型的生长。见33A-33B、34A-34B、35A-35D和36A-36B。抑制PC14PE6细胞所需的huH8-AcBut-CalichDMH的量(即最小有效剂量)比最大非致死剂量低至少16倍。
序列表
<110>惠氏公司
<120>人源化的抗-5T4抗体和抗-5T4/加利车霉素缀合物
<130>040000-0317753
<160>89
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<400>1
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>2
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<400>2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>3
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<400>3
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>4
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<400>4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
             420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>5
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<400>5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>6
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<400>6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>7
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<400>7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>8
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<400>8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>9
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<400>9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>10
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<400>10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>11
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(107)
<223>轻链可变区
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(34)
<223>CDR1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(56)
<223>CDR2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(97)
<223>CDR3
<400>11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>12
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>重链可变区
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(35)
<223>CDR1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2
<220>
<221>MISC_FEATURE
 <222>(99)..(109)
<223>CDR3
<400>12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>13
<211>417
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>13
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag     60
gtccagctgc agcagtctgg acctgacctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc    120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tactacatgc actgggtgaa gcagagccat    180
ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt aatcctaaca atggtgttac tctctacaac    240
cagaaattca aggacaaggc catattaact gtagacaagt catccaccac agcctacatg    300
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atctactatg    360
attacgaact atgttatgga ctactggggt caagtaacct cagtcaccgt ctcctca       417
<210>14
<211>139
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(19)
<223>前导序列
<220>
<221>MATURE_PEPTIDE
<222>(20)..(139)
<400>14
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
    130                 135
<210>15
<211>38l
<212>DNA
<213>小鼠
<400>15
atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgcgcatggg     60
agtattgtga tgacccagac tcccacattc ctgcttgttt cagcaggaga cagggttacc    120
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca    180
gggcagtctc ctacactgct catatcctat acatccagtc gctacgctgg agtccctgat    240
cgcttcattg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tttgcaggct    300
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcaa gattataatt ctcctccgac gttcggtgga    360
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                              381
<210>16
<211>127
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(20)
<223>前导序列
<220>
<221>MATURE_PEPTIDE
<222>(21)..(127)
<400>16
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu
            20                  25                  30
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
    50                  55                  60
Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr
            100                 105                 110
Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>17
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>18
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>19
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>20
<211>360
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>20
caggtccagc tggtgcagtc tggagccgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg     60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gcgccaggcc    120
cccggacagg gccttgagtg gatgggacgt attaatccta acaatggtgt tactctctac    180
aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatg actcgcgaca cctccatctc cacagcctac    240
atggagctct cccgcctgcg ctctgacgac accgccgtct attactgtgc acgctccact    300
atgattacca actatgttat ggactactgg ggtcaaggca ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>21
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>22
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>22
gatattgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgttt cactgggaga gagggccacc     60
ataaactgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtacca acagaagcca    120
gggcagcccc ctaagctgct catatactat acatccagtc gctacgctgg agtccctgat    180
cgcttctccg gcagtggatc cgggaccgat ttcactctga ccatcagctc cttgcaggct    240
gaagacgtgg cagtttatta ctgtcagcaa gattataatt ctcctcccac cttcggtgga    300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                              321
<210>23
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>24
<211>327
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>25
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>26
<211>106
<212>PRT
<213>人
<400>26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
            20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
        35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>27
<211>114
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>27
cgcgcactcc gatattgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgttt cactgggaga     60
gagggccacc ataaactgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttg          114
<210>28
<211>117
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>28
gtaccaacag aagccagggc agtcccctaa gctgctcata tcctatacat ccagtcgcta     60
cgctggagtc cctgatcgct tctccggcag tggatccggg accgatttca ctctgac       117
<210>29
<211>120
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>29
catcagctcc ttgcaggctg aagacgtggc agtttatttc tgtcagcaag attataattc     60
tcctcccacc ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgtgagtaga ataacttaat    120
<210>30
<211>105
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>30
taagttattc tactcacgtt tgatttccag cttggtgcct ccaccgaagg tgggaggaga     60
attataatct tgctgacaga aataaactgc cacgtcttca gcctg                    105
<210>31
<211>116
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>31
caaggagctg atggtcagag tgaaatcggt cccggatcca ctgccggaga agcgatcagg     60
gactccagcg tagcgactgg atgtatagga tatgagcagc ttaggggact gccctg        116
<210>32
<211>124
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>32
gcttctgttg gtaccaagcc acatcattac tcacactctg actggccttg cagtttatgg     60
tggccctctc tcccagtgaa acggccaggg agtcggggga ctgggtcatc acaatatcgg    120
agtg                                                                 124
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>33
cagcccccta agctgctcat atactat                                        27
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>34
atagtatatg agcagcttag ggggctg                                        27
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>35
gtggcagttt attactgtca gcaag                                          25
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>36
cttgctgaca gtaataaact gccac                                          25
<210>37
<211>86
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>37
cgcgcactcc caggtccagc tggtgcagtc tggagccgag gtgaagaagc ctggggcttc     60
agtgaaggtg tcctgcaagg cttctg                                          86
<210>38
<211>90
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>38
gttactcatt cactggctac tacatgcact gggtgaagca gagccccgga cagggccttg     60
agtggattgg acgtattaat cctaacaatg                                      90
<210>39
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>39
gtgttactct ctacaaccag aaattcaagg accgcgtgac catgactcgc gacacctcca     60
tctccacagc ctacatggag ctctcccgcc tgcgctctga c                        101
<210>40
<211>104
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>40
gacaccgccg tctattactg tgcacgctcc actatgatta ccaactatgt tatggactac     60
tggggtcaag gcaccctggt caccgtctcc tcaggtgagt cctg                     104
<210>41
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>41
tcgacaggac tcacctgagg agacggtgac cagggtgcct tgaccccagt agtccataac     60
atagttggta atcatagtgg agcgtgcaca gtaatagac                            99
<210>42
<211>93
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>42
ggcggtgtcg tcagagcgca ggcgggagag ctccatgtag gctgtggaga tggaggtgtc     60
gcgagtcatg gtcacgcggt ccttgaattt ctg                                  93
<210>43
<211>92
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>43
gttgtagaga gtaacaccat tgttaggatt aatacgtcca atccactcaa ggccctgtcc     60
ggggctctgc ttcacccagt gcatgtagta gc                                   92
<210>44
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>44
cagtgaatga gtaaccagaa gccttgcagg acaccttcac tgaagcccca ggcttcttca     60
cctcggctcc agactgcacc agctggacct gggagtg                              97
<210>45
<211>90
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>45
gttactcatt cactggctac tacatgcact gggtgcgcca ggcccccgga cagggccttg     60
agtggatggg acgtattaat cctaacaatg                                      90
<210>46
<211>92
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>46
gttgtagaga gtaacaccat tgttaggatt aatacgtccc atccactcaa ggccctgtcc     60
gggggcctgg cgcacccagt gcatgtagta gc                                   92
<210>47
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>47
gtgttactct ctacaaccag aaattcaagg accgcgtgac catcactcgc gacacctcca     60
cctccacagc ctacatggag ctctcctccc tgcgctctga g                        101
<210>48
<211>93
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>48
ggcggtgtcc tcagagcgca gggaggagag ctccatgtag gctgtggagg tggaggtgtc     60
gcgagtgatg gtcacgcggt ccttgaattt ctg                                  93
<210>49
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>基于人抗体序列的共有抗体重链构架1序列
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
<210>50
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>基于人抗体序列的共有抗体重链构架2序列
<400>50
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>51
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>基于人抗体序列的共有抗体重链构架3序列
<400>51
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>52
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>53
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>54
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
    1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>55
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>56
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr
<210>57
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>57
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>58
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>59
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>59
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala
<210>60
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95
Ala Arg
<210>61
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>62
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr
<210>63
<211>101
<212>PRT
<213>人
<400>63
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
            100
<210>64
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>65
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>65
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Val
<210>66
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>66
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro
                85                  90                  95
<210>67
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
<210>68
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>68
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
                85                  90                  95
<210>69
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>69
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1                5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Ser Ile Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp His Asn Leu Pro
                85                  90                  95
<210>70
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>70
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro
                85                  90                  95
<210>71
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
                85                  90                  95
<210>72
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
                85                  90                  95
<210>73
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
                85                  90                  95
<210>74
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
                85                  90                  95
<210>75
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>75
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro
                85                  90                  95
<210>76
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>77
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>78
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>78
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>79
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser
                85                  90                  95
<210>80
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>80
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser
                85                  90                  95
<210>81
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>81
gatattgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgttt cactgggaga gagggccacc     60
ataaactgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtacca acagaagcca    120
gggcagtccc ctaagctgct catatcctat acatccagtc gctacgctgg agtccctgat    180
cgcttctccg gcagtggatc cgggaccgat ttcactctga ccatcagctc cttgcaggct    240
gaagacgtgg cagtttattt ctgtcagcaa gattataatt ctcctcccac cttcggtgga    300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                              321
<210>82
<211>360
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>82
caggtccagc tggtgcagtc tggagccgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg     60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcagagc    120
cccggacagg gccttgagtg gattggacgt attaatccta acaatggtgt tactctctac    180
aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatg actcgcgaca cctccatctc cacagcctac    240
atggagctct cccgcctgcg ctctgacgac accgccgtct attactgtgc acgctccact    300
atgattacca actatgttat ggactactgg ggtcaaggca ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>83
<211>360
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自小鼠和人抗体序列的人工序列
<400>83
caggtccagc tggtgcagtc tggagccgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg     60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gcgccaggcc    120
cccggacagg gccttgagtg gatgggacgt attaatccta acaatggtgt tactctctac    180
aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatc actcgcgaca cctccacctc cacagcctac    240
atggagctct cctccctgcg ctctgaggac accgccgtct attactgtgc acgctccact    300
atgattacca actatgttat ggactactgg ggtcaaggca ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>84
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>具有来自人和小鼠的可变区和人IgG4恒定区的人源化重链
<400>84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>85
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>86
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>86
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>87
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>87
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>88
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>88
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>89
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>89
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330

Claims (49)

1.嵌合或者人源化抗5T4抗体或者其嵌合或者人源化片段，所述抗体包含至少一条轻链或至少一条重链，其中所述抗体或者抗体片段
(a)以至少约1×10-7M到约1×10-12M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(b)以大于1×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(c)以大于5×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(d)以大于鼠H8抗5T4抗体结合人5T4抗原的结合亲和力的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(e)在体内特异靶定表达5T4的细胞；
(f)与(a)-(e)任一项的抗体竞争结合人5T4抗原；
(g)特异结合(a)-(e)任一项结合的表位；或者
(h)包含(a)-(e)任一项的抗原结合结构域。
2.权利要求1的嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段，其包含来自人恒定区的恒定区。
3.权利要求2的嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中人轻链恒定区来自人κ轻链恒定区。
4.权利要求2的嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中人重链恒定区来自人IgG1或者人IgG4重链恒定区。
5.权利要求4的嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中人IgG1重链恒定区包含SEQ ID NOs：25或85-89任一项的氨基酸序列。
6.权利要求4的嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中人IgG4重链恒定区包含241位的脯氨酸。
7.权利要求1的嵌合抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链可变区序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-107。
8.权利要求1的嵌合抗5T4抗体或抗体片段，其中重链可变区序列包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-120。
9.权利要求1的嵌合抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链包含含有SEQID NO：1的残基1-107的氨基酸序列，并且其中重链包含含有SEQ ID NO：2的残基1-120的氨基酸序列的可变区。
10.权利要求1的嵌合抗5T4抗体或抗体片段，其中
(a)轻链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且重链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或者
(b)轻链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且重链包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列。
11.权利要求1的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中至少一条轻链或者至少一条重链的可变区包含：
(a)包含人抗体构架区的残基的构架区；和
(b)SEQ ID NO：17的轻链可变区的一个或多个CDR或者SEQ IDNO：18的重链可变区的一个或多个CDR。
12.权利要求11的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中构架区包含：
(a)DPK24亚组IV种系克隆、VκIII亚组或者VκI亚组种系克隆的人抗体轻链构架区；
(b)选自DP-75、DP-8(VH1-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和V1-8(VH1-08)、DP-14和V1-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VH1-e)、DP-3和DA-8(VH1-f)的人抗体重链构架区；
(c)(b)的重链构架区的共有序列；或者
(d)与(a)-(c)的构架区具有至少95％同一性的构架区。
13.权利要求11的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其包含SEQ IDNOs：17或18的至少两个CDR。
14.权利要求13的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链包含可变区，该可变区包含SEQ ID NO：17的三个CDR的至少两个。
15.权利要求14的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链包含可变区，该可变区包含SEQ ID NO：17的三个CDR。
16.权利要求11的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中重链包含可变区，该可变区包含SEQ ID NO：18的三个CDR的至少两个。
17.权利要求16的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中重链包含可变区，该可变区包含SEQ ID NO：18的三个CDR。
18.权利要求11的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链包含SEQID NOs：17-18的CDR。
19.权利要求1的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链可变区序列包含：
(a)SEQ ID NO：17或23的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：17具有至少78％同一性的氨基酸序列；或者
(c)与SEQ ID NO：23具有至少81％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求1的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中轻链可变区序列由核酸编码，该核酸包含：
(a)SEQ ID NO：22或81的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：22的核酸具有至少90％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：81的核酸具有至少91％同一性的核苷酸序列；或者
(d)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：22或者SEQ ID NO：81的互补序列特异杂交的核酸。
21.权利要求1的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中重链可变区序列包含：
(a)SEQ ID NO：18、19和21的任一个给出的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：18具有至少83％同一性的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：19具有至少81％同一性的氨基酸序列；或者
(d)与SEQ ID NO：21具有至少86％同一性的氨基酸序列。
22.权利要求1的人源化抗5T4抗体或抗体片段，其中重链可变区序列由核酸编码，该核酸包含：
(a)SEQ ID NO：20、82或83的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：20或者SEQ ID NO：83的核酸具有至少91％同一性的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：82的核酸具有至少94％同一性的核苷酸序列；或者
(d)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：20、82和83的任一个的互补序列特异杂交的核酸。
23.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：5的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：6的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：5的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：6的重链氨基酸序列。
24.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：7的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或
(b)SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。
25.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：9的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：10的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或
(b)SEQ ID NO：9的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：10的重链氨基酸序列。
26.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：12的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：12的重链氨基酸序列。
27.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；或
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：84的重链氨基酸序列。
28.人源化抗5T4抗体或者抗体片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。
29.用于药物递送的抗体/药物缀合物，其包含
(a)嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段；和
(b)药物，其直接或间接结合所述抗体或抗体片段。
30.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段：
(a)以至少约1×10-7M到约1×10-12M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(b)以大于1×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(c)以大于5×10-11M的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(d)以大于鼠H8抗5T4抗体结合人5T4抗原的结合亲和力的结合亲和力特异结合人5T4抗原；
(e)在体内特异靶定表达5T4的细胞；
(f)与(a)-(e)任一项的抗体竞争结合人5T4抗原；
(g)特异结合(a)-(e)任一项结合的表位；或者
(h)包含(a)-(e)任一项的抗原结合结构域。
31.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：5的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：6的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：5的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：6的重链氨基酸序列。
32.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：7的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。
33.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：9的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：10的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：9的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：10的重链氨基酸序列。
34.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：12的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：12的重链氨基酸序列。
35.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：84的重链氨基酸序列。
36.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中嵌合或人源化的抗5T4抗体或者抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO：11的残基1-107的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：8的残基1-120的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)SEQ ID NO：11的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。
37.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中所述药物是选自细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促细胞凋亡剂、化学治疗剂、和治疗性核酸的治疗剂。
38.权利要求37的抗体/药物缀合物，其中治疗剂是细胞毒素。
39.权利要求38的抗体/药物缀合物，其中细胞毒素是抗生素、微管蛋白聚合作用的抑制剂、烷化剂、蛋白质合成抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂，或者酶。
40.权利要求39的抗体/药物缀合物，其中细胞毒素是抗生素。
41.权利要求40的抗体/药物缀合物，其中抗生素是加利车霉素。
42.权利要求41的抗体/药物缀合物，其中加利车霉素是加利车霉素的N-乙酰基衍生物或者二硫化物类似物。
43.权利要求42的抗体/药物缀合物，其中加利车霉素是N-乙酰基-γ-加利车霉素。
44.权利要求29的抗体/药物缀合物，其中药物通过接头结合抗体。
45.权利要求44的抗体/药物缀合物，其中接头选自4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸式酸(3-acetylphenyl acidic acid)(AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)和其衍生物。
46.用于将药物递送到表达5T4的细胞的方法，其包括将细胞与抗体/药物缀合物接触，该缀合物包含(i)嵌合或者人源化的抗5T4抗体或抗体片段，和(ii)直接或者间接结合人源化抗5T4抗体或抗体片段的药物。
47.权利要求46的方法，其中药物在靶细胞中内化。
48.治疗患有5T4阳性癌症的个体的方法，所述方法包括对该个体施用治疗有效量的抗5T4抗体/药物缀合物，其包含(i)嵌合或者人源化的抗5T4抗体或抗体片段，和(ii)直接或者间接结合嵌合或者人源化抗5T4抗体或抗体片段的治疗剂。
49.权利要求48的方法，其中抗5T4抗体/药物缀合物是抗5T4抗体/加利车霉素缀合物，并且还包括施用另一种治疗剂，其中抗5T4/加利车霉素缀合物和所述另一种治疗剂同时施用或者以任何顺序连续施用。
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