ES2498517T3 - Anticuerpos anti-5T4 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-5T4 aislado, o fragmento del mismo que comprende un dominio de unión a antígeno de, o que se une con el mismo epítopo de 5T4 que, un anticuerpo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 4, (b) una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 12, (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; o (d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.

Description

Anticuerpos anti-5T4 y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco (es decir, inmunoconjugados) para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos neoplásicos o malignos. La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos de región variable aislados y polipéptidos para preparar anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco.
Antecedentes de la invención
La disponibilidad de anticuerpos monoclonales de alta afinidad ha permitido el desarrollo de inmunoterapias dirigidas. De acuerdo con este enfoque, un agente terapéutico se acopla con un anticuerpo con especificidad de unión para una población celular diana definida. Los agentes terapéuticos que se han conjugado con anticuerpos monoclonales incluyen citotoxinas, modificadores de la respuesta biológica, enzimas (por ejemplo, ribonucleasas), proteínas y péptidos inductores de apoptosis, y radioisótopos. Los conjugados de anticuerpo/citotoxina se denominan generalmente inmunocitotoxinas. Los anticuerpos acoplados con fármacos de bajo peso molecular tales como metotrexato se denominan típicamente conjugados de quimioanticuerpo/fármaco. Los conjugados descritos como inmunomoduladores contienen modificadores de la respuesta biológica tales como linfocinas, factores de crecimiento y factor de veneno de cobra activador del complemento (CVF). Los anticuerpos radiomarcados incluyen isótopos radiactivos que pueden usarse para radioterapia así como captura de imágenes.
La administración de fármacos mediado por anticuerpos a células tumorales aumenta la eficacia del fármaco minimizando su captación en tejidos normales. Véase, por ejemplo, Reff y col. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Supl: S18-22; Goldenberg (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201. MYLOTARG® (ozagamicina de gemtuzumab) es una inmunoterapia dirigida disponible en el mercado que actúa de acuerdo con este principio y que está aprobada para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en pacientes ancianos. Véase Sievers y col. (1999) Blood 93: 3678-84. En este caso, la molécula de dirección es un anticuerpo monoclonal anti-CD33 que está conjugado con caliqueamicina.
La inmunoterapia dirigida en seres humanos se ha limitado no obstante, en parte debido a respuestas adversas a anticuerpos monoclonales no humanos. Los ensayos clínicos tempranos usando anticuerpos de roedor revelaron respuestas de anticuerpo humano anti ratón (HAMA) y anticuerpo humano anti rata (HARA), que dan como resultado eliminación de anticuerpos rápida. Se han desarrollado desde entonces anticuerpos menos inmunogénicos, incluyendo anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos PRIMATIZED® y anticuerpos humanos preparados usando ratones transgénicos o bibliotecas de presentación de fagos. Véase Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman y col. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green y col. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222:581
97. La evitación de una respuesta HAMA permite la administración de dosis alta y dosis repetida para conseguir una respuesta terapéutica.
Los anticuerpos candidatos para dirección farmacológica incluyen anticuerpos que reconocen antígenos oncofetales, es decir, antígenos presentes en células fetales y células neoplásicas, y que están en gran medida ausentes de células adultas normales. Véase, por ejemplo, Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150: 133-43. El antígeno oncofetal 5T4 es una glucoproteína transmembrana altamente glucosilada de 72 kDa que comprende un núcleo no glucosilado de 42 kDa (Hole y col. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole y col. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-84; Publicación internacional de PCT Nº WO89/07947; Patente de E.E.U.U Nº 5.869.053). 5T4 incluye un dominio extracelular caracterizado por dos repeticiones ricas en leucina (LRR) y una región hidrófila intermedia, que es un sitio accesible para terapia dirigida (Myers y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9319-24).
El 5T4 humano se expresa en numerosos tipos de cáncer, incluyendo carcinomas de la vejiga, mama, cuello uterino, endometrio, pulmón, esófago, ovario, páncreas, estómago y testículo, y esta sustancialmente ausente de tejidos normales, excepto por el sincitiotrofoblasto en la placenta (véase, por ejemplo Southall y col. (1990) Br. J. Cancer 61: 89-95 (immunohistological distribution of 5T4 antigen in normal and malignant tissues); Mieke y col. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-1930 (low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorrectal carcinoma patients); Starzynska y col. (1994) Br. J. Cancer 69: 899902 (prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorrectal carcinoma); Starzynska y col. (1992) Br. J. Cancer 66: 867-869 (expression of 5T4 antigen in colorrectal and gastric carcinoma); Jones y col. (1990) Br. J. Cancer 61: 96-100 (expression of 5T4 antigen in cervical cancer); Connor y Stem (199) Int. J. Cancer 46: 1029-1034 (loss of MHC class-I expression in cervical carcinomas); Ali y col. (2001) Oral Oncology 37: 57-64 (pattern of expression of the 5T4 oncofetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa); Publicación internacional de PCT Nº WO89/07947; Patente de E.E.U.U. Nº 5.869.053). Por ejemplo, los tejidos que se ha indicado que no tienen expresión de 5T4 incluyen el hígado, piel, bazo, tímo, sistema nervioso central (SNC), glándula adrenal y ovario. Los tejidos que se han indicado que tienen expresión focal o baja de 5T4 incluyen el hígado, piel, bazo, ganglio linfático, amígdala, tiroides, próstata y vesículas seminales. Se ha indicado expresión difusa débil-moderada
de 5T4 en el riñón, pulmón, páncreas, faringe y tracto gastrointestinal. El único tejido que se ha indicado que tiene alta expresión de 5T4 es el sincitiotrofoblasto; 5T4 también estaba ausente de suero normal o el suero de mujeres embarazadas (es decir niveles < 10 ng/ml). La sobreexpresión de 5T4 en tumores se ha correlacionado con progresión de enfermedad, y se ha sugerido que la evaluación de la expresión de 5T4 es un enfoque útil para identificar pacientes con pronóstico a corto plazo (Mulder y col. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-30, Naganuma y col. (2002) Anticancer Res. 22: 1033-1038, Starzynska y col. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902, Starzynska y col. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 479-484, Wrigley y col. (1995) Int J. Gynecol. Cancer 5: 269-274).
Se han descrito varios anticuerpos anti 5T4, incluyendo mAb5T4, también denominado el anticuerpo H8 que reconoce un epítopo conformacional del antígeno 5T4 (Shaw y col. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, Publicación Internacional de PCT Nº WO98/55607), un anticuerpo monoclonal de rata (Woods y col. (2002) Biochem. J. 366: 353-65), y un anticuerpo monoclonal de ratón denominado 5T4 (Patente de E.E.U.U. Nº 5.869.053). También se han descrito anticuerpos anti 5T4 monocatenarios, así como proteínas de fusión que incluyen secuencias de anticuerpo anti 5T4 fusionadas con una molécula terapéutica. Por ejemplo, las secuencias de anticuerpo anti 5T4 fusionadas con el dominio constante de IgG1 humano u con el dominio extracelular B7.1 inducen la citolisis de líneas celulares de tumor que expresan 5T4 ((Myers y col. (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-896, Shaw y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-246; Publicación de solicitud de Patente de E.E.U.U. Nº 2003/0018004). De forma similar, un anticuerpo monocatenario anti 5T4 fusionado con un superantígeno no puede estimular la citolisis dependiente de linfocitos T de células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas in vitro (Forsberg y col. (2001) Br. J. Cancer
85: 129-136). Un ensayo clínico de fase 1 usando PNU-214936, un fragmento Fab murino del anticuerpo monoclonal 5T4 fusionado con una enterocitotoxina A estafilocócica de superantígeno mutada (SEA), mostró toxicidad limitada y algo de respuesta antitumoral (Cheng y col. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-9). Como un enfoque terapéutico alternativo, también se han sugerido vacunas de 5T4 recombinantes para el tratamiento de cánceres (Mulryan y col. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; Publicaciones de Solicitud de Patente del Reino Unido Nº 2.370.571 y 2.378.704; Publicaciones de Solicitud de Patente de EP Nº 1.160.323 y 1.152.060).
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti 5T4, conjugados de anti 5T4/fármaco, procedimientos para producir los anticuerpos desvelados y conjugados de anticuerpo/fármaco y procedimientos para su diagnóstico y uso terapéutico.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti 5T4, conjugados de los mismos y procedimientos para el uso de los mismos. También se proporcionan polipéptidos anti 5T4 aislados y ácidos nucleicos aislados que los codifican. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo anti 5T4 aislado, o fragmento del mismo, que comprende un dominio de unión a antígeno de, o que se une con un mismo epítopo de 5T4 que, un anticuerpo que comprende:
(a)
una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 4,
(b)
una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 12,
(c)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; o
(d)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.
Los anticuerpos anti 5T4 de la invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente con el antígeno 5T4 humano, en los que el anticuerpo (a) comprende un dominio de unión a antígeno de los anticuerpos A1 o A3 murinos; (b) compite por la unión con 5T4 con los anticuerpos A1 o A3 murinos; (c) se une con un epítopo de 5T4 unido con los anticuerpos A1 o A3, o (d) comprende un fragmento de unión a 5T4 de un anticuerpo de (a)-(c). Los anticuerpos anti 5T4 de la invención pueden ser quiméricos, humanizados, monocatenarios, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, tetramérico, tetravalente, multiespecífico, específico de dominio, un anticuerpo de un único dominio, una proteína de fusión o un monoclonal murino. Por ejemplo, los anticuerpos anti 5T4 humanizados de la invención incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada
o al menos una región variable de cadena ligera, en los que el anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo: (a) comprende un dominio de unión a antígeno de los anticuerpos A1 o A3 murinos; (b) compite por la unión con 5T4 con los anticuerpos A1 o A3 murinos; (c) se une con un epítopo de 5T4 unido con los anticuerpos A1 o A3; o (d) un fragmento de unión a 5T4 de un anticuerpo de (a)-(c).
Los anticuerpos anti 5T4 de la invención tienen una afinidad de unión por el antígeno 5T4 humano de al menos aproximadamente de 1 x 10-7 M a aproximadamente 1 x 10-12 M. Los anticuerpos anti 5T4 desvelados y conjugados de los mismos también pueden mostrar unión específica dirigiéndose a las células que expresan 5T4 in vivo.
Los anticuerpos anti 5T4 representativos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2; (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2; (e) una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; (f) una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; (g) una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 49, 51, 52, 54, 56, 81 u 82; (h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a SEC ID Nº: 51; (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 78 % idéntica a SEC ID Nº: 54; (l) una secuencia de aminoácidos que al menos 80 % idéntica a SEC ID Nº: 81; o (m) una secuencia de aminoácidos que al menos 78 % idéntica a SEC ID Nº: 82.
Los anticuerpos anti 5T4 representativos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de los restos 21-147 de SEC ID Nº: 4; (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; (e) una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12; (f) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % idéntica a los restos 21-127 y de SEC ID Nº: 12; (g) una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 83 u 84; (h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 83 % idéntica a SEC ID Nº: 60; (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 93 % idéntica a SEC ID Nº: 70; (j) una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a SEC ID Nº: 76; (k) una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a SEC ID Nº: 76; (n) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEC ID Nº: 83; o
(o) una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a SEC ID Nº: 84.
Por ejemplo, un anticuerpo anti 5T4 puede comprender (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; o (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.
Los anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados de la invención pueden comprender regiones constantes derivadas de regiones constantes humanas, tales como una región constante de cadena ligera humana derivada de la región constante de cadena ligera kappa humana y una región constante de cadena pesada humana derivada de una región constante de cadena pesada IgG1 humana o IgG4 humana.
Los anticuerpos anti 5T4 humanizados representativos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden (a) regiones marco conservadas que comprenden restos de una región marco conservada de anticuerpo humano; y (b) una o más CDR de la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 o 12; o una o más CDR de la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 2 o 10. Por ejemplo, los restos de una región marco de anticuerpo humano pueden comprender (a) una región marco conservada de cadena ligera de anticuerpo humano de un clon de línea germinal de subgrupo IV DPK 24, un subgrupo VIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), o un clon de línea germinal de subgrupo VI (DPK9, DPK1, 02, DPK7); (b) una región marco conservada de cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada del grupo que consiste en DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b y VI-3 (VH1-03), DP-15 y V1-8 (VH1-08), DP-14 y V118 (VH1-18), DP-5 y V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 y YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 y DA-8 (VH1-f); (c) una secuencia consenso de una región marco conservada de cadena pesada de (b); o (d) una región marco conservada que es al menos 63 % idéntica a una región marco conservada de (a)-(c).
Los anticuerpos anti 5T4 humanizados representativos de la invención también pueden incluir dos o más CDR de SEC ID Nº: 2, 4, 10 o 12, tales como dos o las tres CDR de la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 o 12,
o dos o las tres CDR de la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 2 o 10, o una o más CDR de la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 o 12 y una o más CDR de la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 2 o 12 o todas las CDR de SEC ID Nº: 2, 4, 10 o 12.
Los anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados representativos incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de los restos 20138 de SEC ID Nº: 2; (b) una secuencia de aminoácidos que al menos 85 % idéntica a los restos 20–138 de SEC ID Nº: 2; (e) una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; (f) una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; (g) una secuencia de aminoácidos de los restos 1-119 de SEC ID Nº: 49; (h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a los restos 1–119 de SEC ID Nº: 49; o (i) una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada humanizada variable representada en las Figuras 9A-9C.
Los anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados adicionales de la invención incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada codificada por un ácido nucleico que comprende (a) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1; (c) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9; (d) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1-358 y de SEC ID Nº: 48;
(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de A1 o A3 humanizada representada en las Figuras 9A-9C.
Los anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados representativos incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de los restos 21127 de SEC ID Nº: 4; (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; (d) una secuencia de aminoácidos que es al menos 96 % idéntica a los restos 23-130 de SEC ID Nº: 8; (e) una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12; (f) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % idéntica a los restos 21 -127 de SEC ID Nº: 12; o (g) una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de A1 o A3 humanizada representada en las Figuras 9A-9C.
También se proporcionan conjugados de anticuerpo/fármaco para suministro de fármacos que comprenden (a) un anticuerpo anti 5T4 quimérico o humanizado o fragmento de anticuerpo de la invención; y (b) un fármaco, que está directa o indirectamente unido con el anticuerpo. Los fármacos representativos incluyen agentes terapéuticos, tales como citotoxinas, radioisótopos, agentes inmunomoduladores, agentes anti angiogénicos, agentes antiproliferativos, agentes proapoptóticos, agentes quimioterapéuticos y ácidos nucleicos terapéuticos. Una citotoxina puede ser, por ejemplo, un antibiótico, un inhibidor de la polimerización de tubulina, un agente alquilante, un inhibidor de síntesis de proteínas, un inhibidor de proteína quinasa, un inhibidor de fosfatasa, un inhibidor de topoisomerasa o una enzima. Son particularmente útiles para terapias antineoplásicas citotoxinas antibióticas, tales como caliqueamicina, N-acetil-caliqueamicina, o derivados de las mismas tales como N-acetil--caliqueamicina dimetil hidracida.
Los conjugados de anticuerpos anti 5T4/fármaco desvelados pueden incluir un engarce para unir el anticuerpo con el fármaco. Los engarces representativos incluyen ácido 4-(4’acetilfenoxi) butanoico (AcBut), ácido 3-acetilfenil ácido (AcPac) y ácido 4-mercapto-4-metil-pentanoico (Amida). Los conjugados de anticuerpo/fármaco también pueden incluir polietilenglicol u otros agentes para potenciar la incorporación de fármacos.
Para la administración de un fármaco a células que expresan 5T4, la presente invención proporciona procedimientos por los que las células se ponen en contacto con un conjugado de anticuerpo/fármaco que comprende (i) un anticuerpo anti 5T4 quimérico o humanizado y (ii) un fármaco que está unido con el anticuerpo anti 5T4 humanizado directa o indirectamente. De acuerdo con los procedimientos desvelados, el fármaco se internaliza dentro de la célula diana. También se desvelan en el presente documento procedimientos terapéuticos, que comprenden administrar al sujeto que tiene un cáncer positivo para 5T4 una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de anticuerpo anti 5T4/fármaco que comprende (i) un anticuerpo anti 5T4 quimérico o humanizado o fragmento de anticuerpo, y (ii) un agente terapéutico que está unido con el anticuerpo anti 5T4 humanizado o fragmento de anticuerpo directa o indirectamente. Pueden combinarse terapias anti 5T4 de la invención con cualquier otra terapia conocida para un efecto mejorado. Puede administrarse un segundo agente terapéutico en combinación con un conjugado de anticuerpo anti 5T4/fármaco simultáneamente o de forma consecutiva en cualquier orden.
También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican regiones variables anti 5T4 humanizadas, que son útiles para la producción de los anticuerpos anti 5T4 humanizados desvelados. Los ácidos nucleicos representativos que codifican una región variable de cadena pesada anti 5T4 humanizada incluyen (a) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1; (c) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una cualquiera de SEC ID Nº: 48, 50, 53 o 55. Los ácidos nucleicos representativos que codifican una región variable de cadena ligera anti 5T4 humanizada incluyen (a) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3; (c) una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera A1 o A3 humanizada de una cualquiera de SEC ID Nº: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 o 75.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1C muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos anti-5T4 murinos A1, A2, A3. Las secuencias de aminoácidos se anotan para identificar regiones determinantes de complementariedad (CDR) con subrayado y la secuencia líder con doble subrayado. La Figura 2 es una transferencia de Western preparada usando lisados celulares CT26/5T4 y explorada con los anticuerpos indicados. Las Figuras 3A-3B son gráficos lineales que muestran curvas de respuesta y cinética de unión para dos preparaciones independientes de anticuerpos H8 y A1. Las preparaciones fueron sustancialmente equivalentes. Las Figuras 4A-4C son gráficos lineales que muestran la modulación de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3 por células MDAMB435/5T4. Los niveles de anticuerpo en la superficie celular se reducen a lo largo del tiempo (Figuras 4A, 4C (sólidas)), mientras que los niveles de anticuerpo en el sobrenadante permanecen constantes (Figuras 4B, 4C (abiertas)). FCM, fluorescencia celular media; sobt sobrenadante. La Figura 5 es un diagrama esquemático de la construcción de Fc de 5T4 de ectodominio humano, la construcción Fc de 5T4 de ectodominio de ratón, y las construcciones quiméricas de 5T4 de ratón/humano. Estas construcciones se usaron para el mapeo de epítopos como se describe en el Ejemplo 4. Las Figuras 6A-6B muestran resultados gráficos de unión competitiva de H8 humanizado y cada uno de los anticuerpos indicados con la proteína de fusión de Fc de ectodominio de 5T4 humano. HuH8, anticuerpo H8 humanizado; ChiA1, anticuerpo quimérico A1; ChiA1+C67F, anticuerpo quimérico A1 que porta la mutación C67F; ChiA2, anticuerpo quimérico A2; muA2, anticuerpo murino A2; ChiA3, anticuerpo quimérico A3; ChiA3+C91Y, anticuerpo quimérico A3 que porta la mutación C91Y, muA3, anticuerpo murino A3; sin Ab, sin anticuerpo (control).
La Figura 7 es un diagrama lineal que muestra los epítopos de 5T4 humano unidos con H8, A1, A2 y A3. Los restos indicados son restos del antígeno 5T4 descritos por Myers y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324, también disponibles con el número de referencia de GenBank Z29083 (SEC ID Nº: 87). LRR, repetición rica en leucina. La Figura 8 muestra los resultados de ensayos esferoides realizados como se describe en el Ejemplo 6. Los conjugados de anti 5T4/caliqueamicina preparados usando los anticuerpos A1 y A3 inhibieron significativamente el crecimiento de células que expresaban 5T4 (MDAMB435/5T4) en comparación con células de control (MDAMB435/neo). CMA-676, conjugado de anti-CD33/caliqueamicina; huH8-AcBut-CalichDMH, anticuerpo H8 humanizado conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut); CalichDMH, caliqueamicina no conjugada; A1-AcBut-CalichDMH, anticuerpo A1 conjugado con caliqueamicina usando ácido 4(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut); A3-AcBut-CalichDMH, anticuerpo A3 conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut). Las Figuras 9A-9H muestran secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada A1 humanizada versión 1 (SEC ID Nº: 48-49); secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada A1 humanizada (VH huA1) versiones 1.2 y 2.0; secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera A1 humanizada (VL huA1) versiones 1.0, 2.0 y 3.0; secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada A2 humanizada versiones 1.0 y 2.0 (VH huA2); secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera A2 humanizada versiones 1.0 y 2.0 (VL huA2); secuencias humanizadas de la región variable de cadena pesada A3 humanizada versiones 1.0 y 2.0 (VH huA3); y secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera A3 humanizada versiones 1.0 y 2.0 (VL huA32). Las CDR están subrayadas. Las Figuras 10A-10B muestran secuencias marco conservadas de región variable de cadena pesada humana representativas que pueden usarse para preparar anticuerpos anti 5T4 humanizados. La Figura 10A es un alineamiento de las secuencias de región variable de cadena pesada humana del subgrupo I (SEC ID Nº: 14-24) y las secuencias marco conservadas consenso derivadas de las mismas (SEC ID Nº: 25-27). La Figura 10B muestra las secuencias de genes de línea germinal humana de los subgrupos VH7 y VH3 (SEC ID Nº: 88-93). La Figura 11 es un alineamiento de las secuencias de región variable de cadena ligera humana del subgrupo VIII (SEC ID Nº: 29-34). Secuencias encuadradas, CDR. La Figura 12 es un alineamiento de las secuencias de región variable de cadena ligera humana del subgrupo VI (SEC ID Nº: 35-44). Secuencias encuadradas, CDR. La Figura 13 muestra secuencias de línea germinal humana adicionales de los subgrupos V 1 y VIV, que tienen regiones marco conservadas que pueden usarse para preparar anticuerpos anti 5T4 humanizados (SEC ID Nº: 9499). La Figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos de regiones constantes humanas representativas que pueden usarse para preparar anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados (SEC ID Nº: 45-47). La Figura 15 muestra las secuencias de aminoácidos de un antígeno 5T4 de mono cynomolgus de longitud completa y un antígeno 5T4 de tití de cola negra parcial. Secuencias subrayadas, secuencias líder. Para cada secuencia, el ectodominio de 5T4 incluye los aminoácidos 30-356.
Descripción detallada de la invención
I. Anticuerpos anti 5T4
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos murinos que se unen con el antígeno 5T4 humano y que son útiles para desarrollar inmunoterapias dirigidas. El antígeno 5T4 humano es una fosfoproteína no glucosilada de 72 kDa hallada en la superficie de células trofoblásticas y numerosos tipos de células cancerosas. Véase Hole y col. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole y col. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184; Publicación internacional de PCT Nº WO89/07947; Patente de E.E.U.U. Nº 5.869.053.
Los anticuerpos anti 5T4 murinos de la invención se designan A1 y A3, y se prepararon como se describe en el ejemplo 1. También se proporcionan anticuerpos anti 5T4 derivados de A1 y A3, y que se unen específicamente con el antígeno 5T4 humano. Por ejemplo, los anticuerpos anti 5T4 de la invención incluyen anticuerpos que comprenden restos de unión a antígeno de los anticuerpos A1 y A3; anticuerpos que compiten por la unión con el antígeno 5T4 con los anticuerpos A1 o A3; y anticuerpos que se unen con el mismo epítopo de 5T4 que los anticuerpos A1 o A3.
En particular, los anticuerpos A1, A2 y A3 desvelados comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno que reconoce un epítopo único en el antígeno 5T4 humano. Cada uno de estos anticuerpos se une también con un epítopo distinto del que se une con H8, y cada uno de A1, A2 y A3 es incapaz de competir con el anticuerpo H8 por la unión con 5T4 humano. Véase Ejemplos 4-5 y Figuras 6-7. En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente con los restos 30-163 de 5T4 humano (por ejemplo, A3), anticuerpos que se unen específicamente con los restos 224-276 de 5T4 humano (por ejemplo, A1). También se proporcionan antígenos 5T4 humanos que comprenden epítopos que se unen con un anticuerpo A1, A2 o A3. Por ejemplo, la invención proporciona fragmentos antigénicos de 5T4 que comprenden los restos 30-163, 224-276 y 224-355 de un antígeno 5T4 nativo o de longitud completa.
La unión específica de los anticuerpos anti 5T4 desvelados se refiere a una unión preferente de un anticuerpo con el antígeno 5T4 humano en una muestra heterogénea que comprende múltiples antígenos diferentes. Típicamente, se produce una unión específica si la afinidad de unión es de al menos aproximadamente 10-7 M o superior, tal como al
menos aproximadamente 10-8 M o superior, incluyendo al menos aproximadamente 10-9 M o superior, al menos aproximadamente 10-11 M o superior o al menos aproximadamente 10-12 M o superior. Por ejemplo, la unión específica de un anticuerpo de la invención con un antígeno 5T4 humano incluye unión en el intervalo de al menos aproximadamente 1 x 10-7 M a aproximadamente 1 x 10-12 M, tal como dentro del intervalo de aproximadamente 1 x 10-8 M a aproximadamente 1 x 10-12 M, o dentro de un intervalo de aproximadamente 1 x 10-8 M y aproximadamente 1 x 10-11 M, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 x 10-8 M a aproximadamente 1 x 10-10 M, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 x 10-9 M a aproximadamente 1 x 10-10 M. La unión específica también se refiere a dirección selectiva de un anticuerpo anti 5T4 a células que expresan 5T4 después de la administración del anticuerpo a un sujeto.
Los anticuerpos anti-5T4 de la invención pueden tener una estructura tetramérica (por ejemplo, similar a los anticuerpos de origen natural), o pueden comprender cualquier otra estructura que tiene al menos una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o al menos una región de cadena pesada de inmunoglobulina, o fragmentos de unión a 5T4 de las mismas (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab modificado, F(ab’)2 o Fv). También se incluyen anticuerpos de dominio sencillo, en los que una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), pero menos de las 6 CDR, constituyen una región de unión a antígeno. La invención también abarca anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos superhumanizados, diacuerpos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos tetravalentes y/o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos). Estos descriptores de anticuerpos no son mutuamente excluyentes.
Son anticuerpos de origen natural las glucoproteínas tetraméricas (H2L2) de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Las dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada se liga a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Cada una de las cadenas ligera y pesada se caracteriza además por una región variable amino terminal y una región constante. Las regiones variables incluyen secuencias que difieren extensivamente entre anticuerpos y determinan sustancialmente la afinidad de unión y especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Las regiones variables de cada una de las cadenas ligera y pesada se alinean para formar el dominio de unión a antígeno.
Los anticuerpos quiméricos comprenden secuencias de al menos dos especies diferentes. Como ejemplo, pueden usarse técnicas de clonación recombinante para incluir regiones variables, que contienen los sitios de unión a antígeno, de un anticuerpo no humano (es decir, un anticuerpo preparado en una especie no humana inmunizada con el antígeno) y regiones constantes derivadas de una inmunoglobulina humana.
Los anticuerpos anti-5T4 quiméricos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos A1 y A3, es decir, (a) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; y (c) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12. Los anticuerpos anti-5T4 humanizados representativos pueden incluir una región variable de cadena pesada expuesta como los aminoácidos 1-119 de SEC ID Nº: 49, o una cualquiera de las regiones variables de cadena pesada humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C, y una región variable de cadena ligera humanizada, también representada en las Figuras 9A-9C. La preparación de anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados representativas de la invención se describe en el ejemplo 7.
Los anticuerpos anti-5T4 de la invención también pueden comprender una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que deriva de o es sustancialmente similar a las regiones variables de A1 o A3, o sustancialmente similar a las regiones variables de A1 y A3 humanizadas. Con respecto a regiones variables de cadena pesada y cadena ligera sustancialmente idénticas, las secuencias sustancialmente idénticas son al menos aproximadamente 90 % idénticas a las secuencias de región variable de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1-12 o a las regiones variables de A1, A2 y A3 humanizadas en las Figuras 9A-9C, tales como al menos 91 % idénticas, al menos 92 % idénticas, al menos 93 % idénticas, al menos 94 % idénticas, al menos 95 % idénticas, al menos 96 % idénticas, al menos 97 % idénticas, al menos 98 % idénticas o al menos 99 % idénticas.
Los anticuerpos anti 5T4 quiméricos representativos de la invención, es decir, anticuerpos que se unen específicamente con el antígeno 5T4, también incluyen los anticuerpos que tienen (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta como los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10, o una cualquiera de las regiones variables de cadena pesada de A1, A2 o A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C; (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos 85 % idéntica a los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2; (c) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos 86 % idéntica a los restos 19-135 de SEC ID Nº: 6; (d) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos 91 % idéntica a los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10; (e) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos 90 % idéntica a los restos 1-119 de SEC ID Nº: 49; o (f) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada derivada de una cualquiera de las regiones variables de A1 o A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C.
También se desvela en el presente documento que una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-5T4 quimérico o humanizado, que se une específicamente con el antígeno 5T4, puede codificarse por (a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1, nucleótidos 55405 de SEC ID Nº: 5, nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9, nucleótidos 1-358 de SEC ID Nº: 48; o un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de A1, A2 o A3 humanizada representada en las Figuras 9A-9C;
(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1, nucleótidos 55405 de SEC ID Nº: 5, o nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9. Por ejemplo, una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-5T4 quimérico puede codificarse por un ácido nucleico que es al menos 98 % idéntico a los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % idéntica a los nucleótidos 55-405 de SEC ID Nº: 5, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 89 % idéntica a los nucleótidos 1-358 de SEC ID Nº: 48. Una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-5T4 quimérico también puede codificarse por un ácido nucleico que hibrida específicamente con el complemento de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1, nucleótidos 55-405 de SEC ID Nº: 5, nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9, o nucleótidos 1-358 de SEC ID Nº: 48, en condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo condiciones de lavado finales de SSC 0,1X a 65 °C.
Los anticuerpos anti-5T4 quiméricos representativos de la invención incluyen además los anticuerpos que tienen (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta como los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, restos 21-127 de SEC ID Nº: 12, o restos de una región variable de cadena ligera de A1 o A3 humanizada representada en las Figuras 9A-9C; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que es al menos 90 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, restos 23-130 de SEC ID Nº: 8, o restos 21-127 de SEC ID Nº: 12. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que es al menos 94 % idéntica a los restos 21127 de SEC ID Nº: 4; (c) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que es al menos 98 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12; (d) o una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera derivada de una cualquiera de las regiones variables de cadena ligera de A1 o A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C.
Como se desvela en el presente documento una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-5T4, quimérico que se une específicamente con el antígeno 5T4, puede codificarse por (a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3, nucleótidos 67-390 de SEC ID Nº: 7, nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11, o nucleótidos que codifican una cualquiera de las regiones variables de cadena ligera de A1, A2 o A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C; o (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3, nucleótidos 67-390 de SEC ID Nº: 7, o nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11. Por ejemplo, una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-5T4 quimérico puede codificarse por un ácido nucleico que comprende (a) una secuencia de nucleótidos que es al menos 97 % idéntica a los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3; (b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % idéntica a los nucleótidos 67-390 de SEC ID Nº: 7; o (c) una secuencia de nucleótidos que es al menos 99 % idéntica a los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11. Una región variable de cadena ligera de una anticuerpo anti-5T4 quimérico, que se une específicamente con el antígeno 5T4, también puede codificarse por un ácido nucleico que hibrida específicamente con el complemento de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3, nucleótidos 67390 de SEC ID Nº: 7, o nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11, en condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo condiciones de lavado final de SSC 0,1X a 65 °C.
Los anticuerpos humanizados son un tipo de anticuerpo quimérico en el que los restos de región variable responsables de la unión a antígeno (es decir, restos de una región determinante de complementariedad, región determinante de complementariedad abreviada, o cualquier otro resto que participe en la unión a antígeno) derivan de una especie no humana, mientras que los restos de región variable restantes (es decir, restos de las regiones marco conservadas) y regiones constantes derivan, al menos en parte, de secuencias de anticuerpo humano. Un subconjunto de restos de región marco conservada y restos de región constante de un anticuerpo humanizado pueden derivar de fuentes no humanas. Las regiones variables de un anticuerpo humanizado también se describen como humanizadas (es decir, una región variable de cadena ligera o pesada humanizada). La especie no humana es típicamente la usada para inmunización con antígeno, tal como ratón, rata, conejo, primate no humano u otra especie mamífera no humana. Los anticuerpos humanizados son típicamente menos inmunogénicos que los anticuerpos quiméricos tradicionales y muestran estabilidad mejorada después de su administración a seres humanos. Véase, por ejemplo, Benincosa y col. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos y col. (1994) Eur. J. Cancer 30A:1842-50; Subramanian y col. (1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5.
Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son restos de regiones variables de anticuerpo que participan en la unión a antígeno. Se usan de forma habitual varios sistemas de numeración para identificar CDR. La definición de Kabat se base en la variabilidad de secuencia y la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones de bucles estructurales. La definición de AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Chothia. Las CDR de la región variable de cadena ligera están delimitadas por los restos en las posiciones 24 y 34 (CDR1-L), 50 y 56 (CDR2-L), y 89 y 97 (CDR3-L) de acuerdo con el algoritmo de Kabat, Chothia, o AbM. De acuerdo con la
definición de Kabat, las CDR de la región variable de cadena pesada están delimitadas por los restos en las posiciones 31 y 35B (CDR1-H), 50 y 65 (CDR2-H), y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo con Kabat). De acuerdo con la definición de Chothia las CDR de la región variable de cadena pesada están delimitadas por los restos en las posiciones 26 y 32 (CDR1-H), 52 y 56 (CDR2-H) y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo con Chothia). De acuerdo con la definición de AbM, las CDR de la región variable de cadena pesada están delimitadas por los restos en las posiciones 26 y 35B (CDR1-H), 50 y 58 (CDR2-H) y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo con Kabat). Véase Martin y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272; Martin y col. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen y col. (1992) Immunomethods 1: 126; y Rees y col. (1996) en Sternberg
M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172.
Las regiones determinantes de especificidad (SDR) son restos dentro de las CDR que interaccionan directamente con el antígeno. Las SDR corresponden a restos hipervariables. Véase (Padlan y col. (1995) FASEB J. 9: 133-139).
Los restos marco conservados son los restos de regiones variables de anticuerpo distintos de los restos hipervariables o CDR. Los restos marco conservados pueden derivar de un anticuerpo humano de origen natural, tal como un marco conservado humano que es sustancialmente similar a una región marco conservada de los anticuerpos A1, A2 o A3. También pueden usarse secuencias marco conservadas artificiales que representan un consenso entre las secuencias individuales. Cuando se selecciona una región marco conservada para humanización, pueden repetirse secuencias que están ampliamente representadas en seres humanos frente a secuencias menos habituales. Pueden realizarse mutaciones adicionales de las secuencias aceptoras de marco conservado humano para restaurar restos murinos que se cree que están implicados en los contactos con el antígeno y/o restos implicados en la integridad estructural del sitio de unión a antígeno, o para mejorar la expresión de anticuerpos. Puede usarse una predicción de estructura peptídica para analizar las secuencias de región pesada y ligera variable humanizada para identificar y evitar sititos de modificación de proteínas postraduccionales introducidos por el diseño de humanización.
Pueden prepararse anticuerpos humanizados usando uno cualquiera de la diversidad de procedimientos incluyendo revestimiento, injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR), injerto de CDR abreviadas, injerto de regiones determinantes de especificidad (SDR), y ensamblaje de Frankenstein, como se describe posteriormente. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos superhumanizados en los que se han introducido uno o más cambios en las CDR. Por ejemplo, pueden sustituirse con restos humanos restos no humanos en las CDR. Estos enfoque generales pueden combinarse con mutagénesis convencional y técnicas de síntesis para producir un anticuerpo anti-5T4 de cualquier secuencia deseada.
El revestimiento se basa en el concepto de reducir las secuencias de aminoácidos potencialmente inmunogénicas en un anticuerpo de roedor u otro no humano remodelando la superficie del exterior accesible al disolvente del anticuerpo con secuencias de aminoácidos humanas. Por lo tanto, los anticuerpos revestidos parecen menos ajenos a células humanas que el anticuerpo no humano no modificado. Véase Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98. Un anticuerpo no humano se reviste identificando restos de la región marco conservada exterior expuesta en el anticuerpo no humano que son diferentes de los de las mismas posiciones en regiones marco conservadas de un anticuerpo humano, y por reemplazo de los restos identificados con aminoácidos que típicamente ocupan estas mismas posiciones en anticuerpos humanos.
El injerto de CDR se realiza reemplazando una o más CDR de una anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano u otro anticuerpo que comprende restos marco conservados deseados) con CDR de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo no humano). Los anticuerpos aceptores pueden seleccionarse basándose en la similitud de los restos marco conservados entre un anticuerpo aceptor candidato y un anticuerpo donante. Por ejemplo, de acuerdo con el enfoque de Frankenstein, se identifica que las regiones marco conservadas humanas tienen homología de secuencias sustancial con cada región marco conservada del anticuerpo no humano relevante, y se injertan CDR del anticuerpo no humano en el compuesto de las regiones marco conservadas humanas diferentes. Se describe un procedimiento relacionado que también es útil para la preparación de anticuerpos de la invención en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Nº: 2003/0040606.
El injerto de CDR abreviadas es un enfoque relacionado. Las CDR abreviadas incluyen los restos determinantes de especificidad y aminoácidos adyacentes, incluyendo los de las posiciones 27d-34, 50-55 y 89-96 en la cadena ligera, y en las posiciones 31-35b, 50-58, y 95-101 en la cadena pesada (convención de numeración de (Kabat y col. (1987)). Véase (Padlan y col. (1995) FASEB J. 9: 133-9). El injerto de restos determinantes de especificidad (SDR) se basa en el entendimiento de que la especificidad de unión y afinidad de un sitio de combinación de anticuerpo se determina por los restos más altamente variables dentro de cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). El análisis de las estructuras tridimensionales de los complejos de anticuerpo-antígeno, combinado con el análisis de los datos de secuencias de aminoácidos disponibles puede usarse para modelar la variabilidad de secuencia basándose en la diferencia estructural de restos de aminoácidos que aparecen en cada posición dentro de la CDR. Las SDR se identifican como secuencias polipeptídicas mínimamente inmunogénicas consistentes en restos de contacto. Véase Padlan y col. (1995) FASEB J. 9: 133-139.
En general, se seleccionan marcos conservados aceptores humanos basándose en que sean sustancialmente similares a las regiones marco conservadas de los anticuerpos donantes, o que son más similares a la secuencia
consenso de la subfamilia de la región variable. Después del injerto, pueden realizarse cambios adicionales en las secuencias donantes y/o aceptoras para optimizar la unión de anticuerpos, funcionalidad, uso codónico, niveles de expresión, etc., incluyendo la introducción de restos no humanos en las regiones marco conservadas. Véase, por ejemplo, Publicación internacional de PCT Nº: WO 91/09967.
Para el injerto de CDR en una región marco conservada variable de cadena pesada, las secuencias marco conservadas útiles pueden derivar de un DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b y VI-3 (VH1-03), DP-15 y V1-8 (VH1-08), DP-14 y V1-18 (VH1-18), DP-5 y V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 y YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 y DA-8 (VH1-f). Las regiones variables de cadena pesada representativas que contienen restos marco conservados para humanización se exponen como SEC ID Nº: 13-24 y 88-93. Los marcos conservados representativos que representan un consenso de los restos marco conservados de VH1 se exponen como SEC ID Nº:25-27. Véase también Figuras 10A-10B.
Para el injerto de CDR en una región marco conservada variable de cadena ligera, las secuencias marco conservadas útiles pueden derivar de un clon de línea germinal de subgrupo IV DPK24, un subgrupo Vlll (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), o un clon de línea germinal de subgrupo Vl (DPK9, DPK1, 02, DPK7). Las regiones variables de cadena ligera representativas que contienen restos marco conservados para humanización se exponen como SEC ID Nº: 28-34, 35-44, y 94-99. Véase Figuras 11-14.
Los anticuerpos anti-5T4 humanizados representativos de la invención incluyen anticuerpos que tienen una o más CDR de un anticuerpo anti-5T4 no humano seleccionado de CDR de una región variable de cadena pesada de una cualquiera de SEC ID Nº: 2 o 10, o una región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 o 12. Por ejemplo, los anticuerpos anti-5T4 humanizados pueden comprender dos o más CDR seleccionadas de CDR de una región variable de cadena pesada de una cualquiera de SEC ID Nº: 2 o 10, o una región variable de cadena ligera de una cualquiera de SEC ID Nº: 4 o 12. Los anticuerpos anti-5T4 humanizados también pueden comprender una cadena pesada que comprende una región variable que tiene dos o tres CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2 o 10, y una cadena ligera que comprende una región variable que tiene dos o tres CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 4 o 12.
Pueden construirse anticuerpos anti-5T4 humanizados de la invención en los que la región variable de una primera cadena (es decir, la región variable de cadena ligera o la región variable de cadena pesada) está humanizada, y en los que la región variable de la segunda cadena no está humanizada (es decir, una región variable de un anticuerpo producido en una especie no humana). Estos anticuerpos son de un tipo de anticuerpo humanizado denominados anticuerpos semi humanizados. Los anticuerpos anti-5T4 no humanos que pueden usarse para preparar anticuerpos semi humanizados incluyen los anticuerpos A1 y A3, como se desvela en el presente documento, así como el anticuerpo H8 descrito en la Publicación Internacional de PCT Nº: WO 98/55607 y en Forsberg y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 124430-12436, o el anticuerpo monoclonal de rata descrito en Woods y col. (2002) Biochem. J. 366: 353-65. Por ejemplo, un anticuerpo anti-5T4 semi humanizado puede comprender una región variable de cadena pesada expuesta como los aminoácidos 1-119 de SEC ID Nº: 49 o aminoácidos de una región variable de cadena pesada de A1 o A3 humanizada representada en las Figuras 9A-9C, y una región variable de cadena ligera de una cualquiera de SEC ID Nº: 4 o 12.
Las regiones constantes de anticuerpos anti-5T4 quiméricos y humanizados pueden derivar de regiones constantes de uno cualquiera de IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cualquier isotipo de los mismos (por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3
o IgG4 de IgG), así como versiones mutadas de los mismos. La elección de un isotipo humano y modificación de aminoácidos particulares en el isotipo puede potenciar o eliminar la activación de mecanismos de defensa del huésped y alterar la biodistribución de anticuerpos. Véase (Reff y col. (2002) Cancer Control 9: 152-66). Se exponen regiones constantes representativas útiles para preparar anticuerpos quiméricos y humanizados de la invención como SEC ID Nº: 45-47. También pueden usarse regiones constantes de cadena ligera lambda humanas, incluyendo versiones variantes o mutantes. Para clonar secuencias que codifican regiones constantes de inmunoglobulina, pueden suprimirse secuencias intrónicas.
Pueden construirse anticuerpos anti-5T4 quiméricos y humanizados usando técnicas convencionales conocidas en este campo. Por ejemplo, pueden prepararse regiones variables hibridando entre sí oligonucleótidos solapantes que codifican las regiones variables y ligándolas en un vector de expresión que contiene una región constante de anticuerpo humano. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y Patentes de E.E.U.U Nº: 4.196.265; 4.946.778; 5.091.513; 5.132.405; 5.260.203; 5.677.427; 5.892.019; 5.985.279; 6.054.561. Pueden prepararse anticuerpos tetravalentes (H4L4) que comprenden dos anticuerpos tetraméricos intactos, incluyendo homodímeros y heterodímeros, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional de PCT Nº: WO 02/096948. También pueden prepararse dímeros de anticuerpos mediante la introducción de un resto o restos de cisteína en la región constante del anticuerpo, que promueven la formación de enlaces disulfuro intercatenarios, mediante el uso de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales (Wolff y col. (1993) Cancer Res. 53: 2560-5), o mediante la producción recombinante para incluir una región constante doble (Stevenson y col. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30). Pueden prepararse fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos de la invención, por ejemplo, mediante la expresión de secuencias de anticuerpo truncadas o mediante la digestión postraduccional de anticuerpos de longitud completa.
Pueden prepararse fácilmente variantes de anticuerpos anti-5T4 de la invención, es decir, los anticuerpos A1 y A3 así como versiones quiméricas y humanizadas de los mismos, para incluir diversos cambios, sustituciones, inserciones y deleciones. Por ejemplo, pueden optimizarse secuencias de anticuerpo para uso codónico en el tipo celular usado para la expresión de anticuerpos. Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítopo de unión a receptor de recuperación, si no está presente ya, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo. Véase Patente de E.E.U.U Nº: 5.739.277. Las modificaciones adicionales para potenciar la estabilidad del anticuerpo incluyen modificación de IgG4 para reemplazar la serina en el resto 241 con prolina. Véase Angal y col. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108. Otros cambios útiles incluyen sustituciones según se requieran para optimizar la eficacia en la conjugación del anticuerpo con un fármaco. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse en su extremo carboxilo terminal para incluir aminoácidos para unión con fármacos, por ejemplo pueden añadirse uno o más restos de cisteína. Las regiones constantes pueden modificarse para introducir sitios para la unión de carbohidratos u otros restos.
Pueden producirse variantes de anticuerpos anti-5T4 de la invención usando técnicas recombinantes convencionales, incluyendo mutagénesis dirigida, o clonación de recombinación. Puede prepararse un repertorio diversificado de anticuerpos anti-5T4 mediante procedimientos de ordenamiento génico y conversión génica en animales no humanos transgénicos (Publicación de Patente de E.E.U.U Nº: 2003/0017534), que después se ensayan con respecto a actividades relevantes usando ensayos funcionales. En realizaciones particulares de la invención, se obtiene variantes anti-5T4 usando un protocolo de maduración de afinidad para mutación de CDR (Yang y col. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403), combinación de cadenas (Marks y col. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783), uso de cepas mutadas de E. coli (Low y col. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368), combinación de ADN (Patten y col. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733), presentación de fagos (Thompson y col. (1996) J. Mol. Biol.
256: 77-88), y PCR sexual (Crameri y col. (1998) Nature 391: 288-291). Para aplicaciones de inmunoterapia, los ensayos funcionales relevantes incluyen unión específica con antígeno 5T4 humano, internalización de anticuerpos y dirección a un sitio o sitios tumorales cuando se administra a un animal que porta tumores, como se describe posteriormente en el presente documento.
La presente invención proporciona además células y líneas celulares que expresan anticuerpos anti-5T4 de la invención. Las células huésped representativas incluyen células de mamífero y humanas, tales como células CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1 y células COS. Se conocen en la técnica procedimientos para generar una línea celular estable después de la transformación de una construcción heteróloga en una célula huésped. Las células huésped representativas no de mamífero incluyen células de insecto (Potter y col. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112). También pueden producirse anticuerpos en animales transgénicos (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) y plantas transgénicas (Schillberg y col. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45).
II. Ácidos nucleicos y polipéptidos Anti-5T4
La presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican regiones variables de cadena pesada y cadena ligera anti-5T4 y polipéptidos aislados codificados por los ácidos nucleicos desvelados. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de A1 y A3, regiones variables de A1 y A3 humanizadas, y variantes de las mismas. Los ácidos nucleicos y polipéptidos aislados pueden usarse para preparar anticuerpos anti-5T4 quiméricos y humanizados.
II.A. Ácidos nucleicos Anti-5T4
Los ácidos nucleicos son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria, bicatenaria o tricatenaria. A no ser que se limite específicamente, los ácidos nucleicos pueden contener análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares al ácido nucleico natural de referencia. Los ácidos nucleicos incluyen genes, ADNc, ARNm y ARNc. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse o pueden derivar de cualquier fuente biológica, incluyendo cualquier organismo. Se describen procedimientos representativos para clonar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-5T4 en los Ejemplos 1 y 7.
Los ácidos nucleicos representativos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 9, 11 y 48. En particular, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada de A1 y A3 comprenden los nucleótidos 58-41 de SEC ID Nº: 1, y los nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9, que codifican regiones variables de cadena pesada que tienen la secuencias de aminoácidos expuestas como los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, y los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10, respectivamente. Un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de A1 humanizada comprende los nucleótidos 1-358 de SEC ID Nº:
48. Los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena ligera de A1 y A3 comprenden los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3, y los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11, respectivamente, que codifican regiones variables de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas como los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, y los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12, respectivamente. Los ácidos nucleicos adicionales de la invención comprenden nucleótidos que codifican las regiones variables de A1 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C.
Los ácidos nucleicos de la divulgación también pueden comprender una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 48, incluyendo secuencias de nucleótidos
que son al menos 90 % idénticas a las secuencias codificantes de región variable de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9 y 11, tal como al menos aproximadamente 91 % idénticas o al menos 92 % idénticas, tal como al menos 93 % idénticas, al menos 94 % idénticas, al menos 95 % idénticas, al menos 96 % idénticas, al menos 97 % idénticas, al menos 98 % idénticas o al menos 99 % idénticas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender (a) una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 1; (b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 97 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 3; (c) una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 5; (d) una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 7; (e) una secuencia de nucleótidos que es al menos 99 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 11; o (f) una secuencia de nucleótidos que al menos 89 % idéntica a la secuencia codificante de región variable de SEC ID Nº: 48. Las secuencias se comparan con respecto a la correspondencia máxima usando un algoritmo de comparación de secuencias usando la secuencia codificante de región variable de longitud completa de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, o secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de región variable de A1, A2 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9H como la secuencia de consulta, como se describe posteriormente en el presente documento, o por inspección visual. Véase también Ejemplo 1 y Tabla 1, y Ejemplo 7 y Tabla 11.
De acuerdo con la presente divulgación, las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser tan pequeña como de un par de bases. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender secuencias mutadas, incluyendo secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios de restos, una deleción de uno o más restos, o una inserción de uno o más restos adicionales.
De acuerdo con la presente divulgación, los ácidos nucleicos sustancialmente idénticos se identifican adicionalmente como ácidos nucleicos que hibridan específicamente con o hibridan sustancialmente con la longitud completa de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 48; la longitud completa de una secuencia codificante de región variable de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 48; o las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de región variable de A1, A2 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9H, en condiciones rigurosas. En el contexto de la hibridación de ácido nucleico, dos secuencias de ácido nucleico que se comparan pueden designarse una sonda y una diana. Una sonda es una molécula de ácido nucleico de referencia, y una diana es una molécula de ácido nucleico de ensayo, hallada con frecuencia dentro de una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Una secuencia diana es sinónimo de una secuencia de ensayo.
De acuerdo con la presente divulgación, para estudios de hibridación, las sondas útiles son complementarias de o imitan al menos una secuencia de aproximadamente 14 a 40 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferentemente, las sondas comprenden de 14 a 20 nucleótidos, o incluso más cuando se desee, tal como 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300 o 500 nucleótidos o hasta la longitud completa de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 48; la longitud completa de una secuencia codificante de región variable de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 48; o secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de región variable de A1, A2 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C. Dichos fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, por síntesis química del fragmento, por aplicación de tecnología de amplificación de ácido nucleico o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante.
La hibridación específica se refiere a la unión, formación de doble cadena o hibridación de una molécula solamente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, (por ejemplo, ADN o ARN celular total). La hibridación específica puede acomodar desapareamientos entre la secuencia de sonda y la diana dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación.
Las condiciones de hibridación rigurosas y condiciones de lavado de hibridación rigurosas en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como análisis de transferencia de Southern y Northern son dependientes tanto de secuencia como de ambiente. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas mayores. Se encuentra una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capítulo 2, Elsevier, Nueva York, Nueva York. Generalmente, se seleccionan condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Típicamente, en condiciones rigurosas una sonda hibridará específicamente con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.
La Tm es la temperatura (con fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy rigurosas que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para análisis de transferencia de Southern o Northern de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de aproximadamente 100 restos complementarios es hibridación durante una noche en formamida al 50 % con 1 mg de heparina a 42 °C. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es 15 minutos en SSC 0,1X a 65 °C. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es 15 minutos en tampón SSC 0,2X a 65 °C. Véase Sambrook y col., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, para una descripción de tampón de SSC. Con frecuencia, un lavado de alta rigurosidad se precede de un lavado de baja rigurosidad para retirar la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de condiciones de lavado de rigurosidad media para una doble cadena de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 15 minutos en SSC 1X a 45 °C. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para una doble cadena de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es de 15 minutos en SSC 4X a 6X a 40 °C. Para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas típicamente implican concentraciones salinas de menos de aproximadamente 1 M de ion Na+, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1 M de concentración de ion Na+ (u otras sales) a pH 7,0-8,3, y la temperatura es típicamente al menos aproximadamente 30 °C. Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relación de señal y ruido de 2 veces (o mayor) la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.
Los siguientes son ejemplos de condiciones de hibridación y lavado que pueden usarse para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a secuencias de nucleótidos de referencia de la presente divulgación: una secuencia de nucleótidos de sonda preferentemente hibrida con una secuencia de nucleótidos diana en dodecil sulfato sódico (SDS) 7 %, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C seguido de lavado en SSC 2X, SDS 0,1 % a 50 °C; más preferentemente, una secuencia de sonda y diana hibridan en dodecil sulfato sódico (SDS) 7 %, NaPO4 0,5 M EDTA 1 mM a 50 °C seguido de lavado en SSC 1X, SDS 0,1 % a 50 °C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana hibridan en dodecil sulfato sódico (SDS) 7 %, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C seguido de lavado en SSC 0,5X, SDS, 0,1 % a 50 °C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana hibridan en dodecil sulfato sódico (SDS) 7 %, NaPO4 0,5 M, EDTA 1mM a 50 °C seguido de lavado en SSC 0,1X, SDS 0,1 % a 50 °C; más preferentemente, una secuencia sonda y diana hibrida en dodecil sulfato sódico (SDS) 7 %, NaPO4 0,5 M, EDTA 1mM a 50 °C seguido de lavado en SSC 0,1X, SDS 0,1 % a 65 °C.
Un indicio adicional de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, comparten una estructura tridimensional general
o son equivalentes biológicamente funcionales. Estos términos se definen adicionalmente posteriormente en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas aún son sustancialmente idénticas si las proteínas correspondientes son sustancialmente idénticas. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleótidos comprenden variantes sustituidas de forma conservativa como se permite por el código genético.
Las variantes sustituidas de forma conservativa son secuencias de ácido nucleico que tienen sustituciones de codones degradados en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituyen con restos de base mixta y/o desoxiinosina. Véase Batzer y col. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka y col. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; y Rossolini y col. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98.
Los ácidos nucleicos de la divulgación también comprenden ácido nucleicos complementarios de una cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, o secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de región variable de A1, A2 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C, y subsecuencias y secuencias elongadas de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, o secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de región variable de A1, A2 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C, y secuencias complementarias de las mismas. Son secuencias complementarias dos secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos antiparalelas capaces de emparejarse entre sí tras la formación de enlaces de hidrógeno entre los pares de bases. Como se usa en el presente documento, la expresión secuencias complementarias significa secuencias de nucleótidos que son sustancialmente complementarias, como se puede evaluar por los mismos procedimientos de comparación de nucleótidos expuestos posteriormente, o se define que son capaces de hibridar con el segmento de ácido nucleico en cuestión en condiciones relativamente rigurosas tales como las descritas en el presente documento. Un ejemplo particular de un segmento de ácido nucleico complementario es un oligonucleótido antisentido.
Una subsecuencia es una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia de ácido nucleico más larga. Una subsecuencia ejemplar es una sonda, descrita anteriormente en el presente documento, o un cebador. El término cebador como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia contigua que comprende aproximadamente 8 o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos preferentemente 10-20 nucleótidos, y más preferentemente 20-30 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico seleccionada. Los cebadores de la invención abarcan oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia apropiada para proporcionar el inicio de polimerización en una molécula de ácido nucleico en la presente divulgación.
Una secuencia elongada comprende nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) incorporadas en el ácido nucleico. Por ejemplo, una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) puede añadir secuencias en el extremo 3’ terminal de la molécula de ácido nucleico. Además, la secuencia de nucleótidos puede combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, regiones promotoras, potenciadores, señales de poliadenilación, secuencias intrónicas, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, y otros segmentos codificantes. Por lo tanto, la invención también proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos desvelados, incluyendo vectores para expresión recombinante, en los que un ácido nucleico de la invención está unido operativamente con un promotor funcional. Cuando está unido operativamente con un ácido nucleico, un
promotor está en combinación funcional con el ácido nucleico de modo que la transcripción del ácido nucleico se controla y regula por la región promotora. Los vectores se refieren a ácidos nucleicos capaces de replicación en una célula huésped, tal como plásmidos, cósmidos y vectores virales.
Los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden clonarse, sintetizarse, alterarse, mutarse o combinaciones de los mismos. Se conocen en este campo técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante convencionales usadas para aislar ácidos nucleicos. También se conoce en este campo mutagénesis específica para crear cambios, deleciones o inserciones pequeñas de pares de bases. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Silhavy y col. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover y Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, 2ª ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/Nueva York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed. Wiley, Nueva York.
II.B. Polipéptidos Anti-5T4
La presente invención también proporciona polipéptidos anti-5T4’ aislados. Los polipéptidos y proteínas se refieren cada uno a un compuesto constituido por una única cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Los polipéptidos de región variable de cadena pesada representativos se exponen como los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, restos 20-141 de SEC ID Nº: 10, y restos 1-119 de SEC ID Nº: 49. Los polipéptidos de región variable de cadena ligera representativos se exponen como los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, y los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12. Los polipéptidos adicionales de la invención comprenden aminoácidos de las regiones variables de A1 y A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C.
Los polipéptidos adicionales de la invención incluyen polipéptidos de región variable de cadena pesada y cadena ligera que son sustancialmente similares a los polipéptidos anti-5T4 desvelados, tal como al menos aproximadamente 90 % idénticos a las regiones variables de SEC ID N: 2, 4, 10, 12 y 49, por ejemplo, al menos aproximadamente 91 % idénticos, al menos 92 % idénticos, al menos 93 % idénticos, al menos 94 % idénticos, al menos 95 % idénticos, al menos 96 % idénticos, al menos 97 % idénticos, al menos 98 % idénticos o al menos 99 % idénticos. Las secuencias se comparan con respecto a máxima correspondencia usando un algoritmo de comparación de secuencias usando la secuencia de longitud completa de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 10, 12, 49, o una cualquiera de las regiones variables de A1, A2 o A3 humanizadas representadas en las Figuras 9A-9C como la secuencia de consulta, o la secuencia de región variable de la misma, o por inspección visual. La invención abarca además polipéptidos codificados por uno cualquiera de los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento.
Por ejemplo, los polipéptidos representativos de la invención incluyen (a) polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % similar a los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2; (b) polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % similar a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; (e) polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % similar a los restos 20-141 de SEC ID N: 10; (f) polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % similar a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12; y (g) polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % similar a los restos 1-119 de SEC ID Nº: 49. Véase ejemplo 1 y Tabla 2, y ejemplo 7 y Tabla 11.
Los polipéptidos de la invención pueden comprender aminoácidos de origen natural, aminoácidos sintéticos, aminoácidos codificados genéticamente, aminoácidos no codificados genéticamente y combinaciones de los mismos. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos tanto de forma L como de forma D.
Los aminoácidos no codificados genéticamente representativos incluyen pero sin limitación ácido 2-aminoadípico; ácido 3-aminoadípico; ácido β-aminopropiónico; ácido 2-aminobutírico; ácido 4-aminobutírico (ácido piperidínico); ácido 6-aminocaproico; ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico; ácido 3-aminoisobutírico; ácido 2aminopimélico; ácido 2,4-diaminobutírico; desmosina; ácido 2,2’-diaminopimélico; ácido 2,3-diaminopropiónico; Netilglicina; N-etilasparagina; hidroxilisina; alo-hidroxilisina; 3-hidroxiprolina; 4-hidroxiprolina; isodesmosina; aloisoleucina; N-metilglicina (sarcosina); N-metilisoleucina; N-metilvalina; norvalina; norleucina; y ornitina.
Los aminoácidos derivatizados representativos incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que se han derivatizado grupos amino libres para formar clorhidratos de amina, grupos de p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos tbutiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, metil y etil ésteres u otros tipos de ésteres o hidracidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de histidina puede derivatizarse para formar N-imbenzilhistidina.
La presente invención también proporciona fragmentos de un polipéptido anti-5T4 de la invención, por ejemplo, fragmentos que constituyen un sitio de unión a antígeno 5T4. También se proporcionan secuencias polipeptídicas que son más largas que las secuencias desveladas. Por ejemplo, pueden añadirse uno o más aminoácidos al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de anticuerpo. Dichos aminoácidos adicionales pueden emplearse en una diversidad de aplicaciones, incluyendo pero sin limitación aplicaciones de purificación. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar proteínas elongadas.
Los polipéptidos anti-5T4 de la invención incluyen proteínas que comprenden aminoácidos que son variantes sustituidas de forma conservativa de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 10, 12 o 49. Una variante sustituida de forma conservativa se refiere a un polipéptido que comprende un aminoácido en el que uno o más restos se han sustituido de forma conservativa con un resto funcionalmente similar.
Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución con un resto no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina de otro; la sustitución con un resto polar (hidrófilo) de otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina; la sustitución con un resto básico tal como lisina, arginina o histidina de otro; o la sustitución con un resto ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, de otro.
Los polipéptidos aislados de la invención pueden purificarse y caracterizarse usando una diversidad de técnicas convencionales que se conocen por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Schröder y Lübke (1965) The Peptides. Academic Press, Nueva York; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis, 2ª rev. ed. Springer-Verlag, Berlín/Nueva York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed. Wiley, Nueva York.
II.C. Comparaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos
Las expresiones idéntico o porcentaje de identidad en el contexto de dos o más secuencias de nucleótidos o proteínas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencia desvelados en el presente documento o por inspección visual.
La expresión sustancialmente idéntico con respecto a una secuencia de nucleótidos o proteica significa que una secuencia particular varía de la secuencia de una secuencia de origen natural en una o más deleciones, sustituciones o adiciones, cuyo efecto neto es conservar la función biológica de un ácido nucleico o polipéptido anti5T4.
Para comparación de dos o más secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan una o más secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación se secuencias, se introducen secuencias de ensayo y de referencia en un programa informático, se designan coordenadas de subsecuencias si es necesario y se seleccionan parámetros de programas de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o las secuencias de ensayo designadas en relación con la secuencia de referencia basándose en los parámetros de programas seleccionados.
Puede realizarse alineamiento óptimo de secuencias para comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, por el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de Software de Wisconsin Genetics, Computer Group, Madison, Wisconsin), o por inspección visual. Véase, en general, Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed. Wiley, Nueva York.
Un algoritmo preferido para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Está disponible públicamente Software para realizar análisis de BLAST a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http:/lwww.ncbi.nlm.nih.gov/). Los parámetros del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. Para la comparación de dos secuencias de nucleótidos, los parámetros por defecto de BLASTn se ajustan a W=11 (longitud de palabra) y E=10 (expectativa), y también incluyen el uso de un filtro de baja complejidad para enmascarar restos de la secuencia de consulta que tienen baja complejidad composicional. Para la comparación de dos secuencias de aminoácidos, los parámetros por defecto del programa BLASTp se ajustan a W=3 (longitud de palabra), E=10 (expectativa), uso de la matriz de puntuación BLOSUM62, costes de existencia de huecos=11 y extensión=1, y el uso de un filtro de baja complejidad para enmascarar restos de la secuencia de consulta que tiene baja complejidad composicional. Véase Ejemplo 1.
III. Conjugados de anticuerpo anti-5T4/fármaco
La presente invención proporciona además conjugados de anticuerpo/fármaco que comprenden un anticuerpo anti5T4 de la invención. También se proporcionan procedimientos para preparar los conjugados de anticuerpo/fármaco, de modo que el fármaco se une con el anticuerpo directa o indirectamente. Los conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención tienen la fórmula general
5T4Ab(-X-W)m
en la que:
5T4Ab es un anticuerpo anti-5T4 o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento; X es un engarce que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que puede reaccionar con un anticuerpo anti-5T4 o fragmento de anticuerpo; W es un fármaco; m es la carga media para un producto de conjugación purificado (por ejemplo, m de modo que el fármaco constituya aproximadamente 3 -10 % del conjugado en peso); y (-X-W)m es un derivado farmacológico.
También se proporcionan procedimientos para preparar conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención. Como un ejemplo, puede prepararse un conjugado de anticuerpo/fármaco de la formula 5T4Ab(-X-W)m (a) añadiendo el derivado farmacológico al anticuerpo anti-5T4 siendo el fármaco 3-10 % en peso del anticuerpo anti-5T4; (b) incubando el derivado farmacológico y el anticuerpo anti-5T4 en una solución no nucleófila, compatible con proteínas, tamponada que tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a 9 para producir un conjugado de anticuerpo/fármaco, en el que la solución comprende además (i) un codisolvente orgánico adecuado y (ii) y uno o más aditivos que comprenden al menos un ácido biliar o su sal, y en el que la incubación se realiza a una temperatura que varía de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas; y (c) sometiendo el conjugado producido en la etapa (b) a un procedimiento de separación cromatográfica para separar los conjugados de anticuerpo/fármaco con una carga en el intervalo de 3-10 % en peso del fármaco y con fracción conjugada baja (LCF) del anticuerpo anti-5T4 no conjugado, derivado farmacológico y conjugados agregados.
III.A. Fármacos
Un fármaco es cualquier sustancia que tenga actividad biológica detectable, por ejemplo, agente terapéuticos, marcadores detectables, agentes de unión, etc. y profármacos, que se metabolizan en un agente activo in vivo. Un fármaco también puede ser un derivado farmacológico, en el que un fármaco se ha funcionalizado para permitir la conjugación con un anticuerpo de la invención. En general, estos tipos de conjugados se denominan inmunoconjugados.
Los agentes terapéuticos son composiciones que pueden usarse para tratar o prevenir una afección en un sujeto que lo necesite. Los agentes terapéuticos útiles en la invención incluyen agentes antineoplásicos, es decir, agentes que tienen actividad antineoplásica en células que expresan 5T4 tales como células cancerosas de carcinoma de pulmón adenomatoso/escamoso (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma de cuello uterino escamoso, adenocarcinoma endometrial invasivo, carcinoma de páncreas invasivo, carcinoma ovárico, carcinoma vesical escamoso y coriocarcinoma.
Los fármacos terapéuticos representativos incluyen citotoxinas, radioisótopos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunomoduladores, agentes antiangiogénicos, agentes antiproliferativos, agentes proapoptóticos y enzimas citostáticas y citolíticas (por ejemplo, RNasas). Un fármaco también puede incluir un ácido nucleico terapéutico, tal como un gen que codifica un agente inmunomodulador, un agente antiangiogénico, un agente antiproliferativo o un agente proapoptótico. Estos descriptores farmacológicos no son mutuamente excluyentes, y por tanto puede describirse un agente terapéutico usando uno o más de los términos anteriormente indicados. Por ejemplo, los radioisótopos seleccionados también son citotoxinas. Pueden prepararse agentes terapéuticos como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Generalmente, los conjugados que tienen un radioisótopo como el fármaco se denominan radioinmunoconjugados, y los que tienen un agente quimioterapéutico como el fármaco se denominan quimioinmunoconjugados.
Los ejemplos de fármacos adecuados para su uso en inmunoconjugados incluyen los taxanos, maitansinas, CC1065 y las duocarmicinas, las caliqueamicinas y otros enodiinos, y las auristatinas. Otros ejemplos incluyen los antifolatos, alcaloides de la vinca y las antraciclinas. También pueden usarse toxinas vegetales, otras proteínas bioactivas, enzimas (es decir, ADEPT), radioisótopos, fotosensibilizadores (es decir, para terapia fotodinámica) en inmunoconjugados. Además, pueden realizarse conjugados usando vehículos secundarios como el agente citotóxico, tales como liposomas o polímeros, por ejemplo.
El término cito toxina generalmente se refiere a un agente que inhibe o previene la función de las células y/o da como resultado la destrucción de células. Las citotoxinas representativas incluyen antibióticos inhibidores de la polimerización de tubulina, agentes alquilantes que se unen con y alteran el ADN, y agentes que alteran la síntesis proteica o la función de proteínas celulares esenciales tales como proteína quinasas, fosfatasas, topoisomerasas, enzimas y ciclinas. Las citotoxinas representativas incluyen, pero sin limitación, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carubicina, nogalamicina, menogarilo, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, adriamicina, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato, flurouracilos, etopósido, taxol, análogos del taxol, platinos tales como cis-platino y carbo-platino, mitomicina, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorubicina, epirubicina, actinomicina, autramicina, azaserinas, bleomicinas, tamoxifeno, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, esperamicinas y maitansinoides.
En realizaciones particulares de la invención, una citotoxina es un antibiótico tal como una caliqueamicina, también denominado el complejo LL-E33288, por ejemplo, gamma-caliqueamicina (1) o N-acetil gamma-caliqueamicina. Véase Patente de E.E.U.U Nº: 4.970.198. Se desvelan ejemplos adicionales de caliqueamicinas adecuadas para su uso en la preparación de conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención en las Patentes de E.E.U.U Nº: 4.671.958; 5.053.394; 5.037.651; 5.079.233; y 5.108.912 que se incorporan en el presente documento en su totalidad. Estos compuestos contienen un metiltrisulfuro que puede hacerse reaccionar con tioles apropiados para formar disulfuros, introduciendo al mismo tiempo un grupo funcional tal como una hidracida u otro grupo funcional que es útil para conjugar caliqueamicina con un anticuerpo anti-5T4. También pueden usarse análogos de disulfuro de caliqueamicina, por ejemplo, análogos descritos en las patentes de E.E.U.U Nº: 5.606.040 y 5.770.710, que se incorporan en el presente documentos en su totalidad.
Para aplicaciones de radioterapia, un anticuerpo anti-5T4 de la invención puede comprender un radioisótopo de alta energía. El isótopo puede estar unido directamente con el anticuerpo, por ejemplo, en un resto de cisteína presente en el anticuerpo, o puede usarse un quelante para mediar en la unión del anticuerpo y el radioisótopo. Los radioisótopos adecuados para radioterapia incluyen pero sin limitación emisores , emisores  y electrones auger. Para aplicaciones de diagnóstico, los radioisótopos útiles incluyen emisores de positrones y emisores . Un anticuerpo anti-5T4 de la invención puede estar además yodado, por ejemplo, en un resto de tirosina del anticuerpo, para facilitar la detección o efecto terapéutico del anticuerpo.
Los radioisótopos representativos que pueden conjugarse con un anticuerpo anti-5T4 incluyen 18fluor, 64cobre,65cobre, 67galio, 68galio, 77bromo, 80mbromo, 95rutenio, 97rutenio, 103rutenio, 105rutenio, 99mtecnecio, 107mercurio, 203mercurio, 123yodo, 124yodo, 125yodo, 126 yodo, 131yodo, 133yodo, 111indio, 113indio, 99mrenio, 105renio, 101renio, 186renio,188renio, 121mtelurio, 99tecnecio, 122mtelurio, 125mtelurio, 165tulio, 167tulio, 168tulio, 90itrio, y formas de nitruro u óxido derivadas de los mismos. Otros radioisótopos adecuados incluyen emisores alfa, tales como 213bismuto, 213plomo y 225actinio.
Los conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención pueden incluir immunomoduladores, es decir, agentes que inducen una respuesta inmunitaria, incluyendo respuestas inmunitarias tumorales (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de antígeno) y respuestas inmunitarias medidas por células (por ejemplo, proliferación de linfocitos). Los agentes immunomoduladores representativos incluyen citocinas, xantinas, interleucinas, interferones, y factores de crecimiento (por ejemplo, TNF, CSF, GM-CSF y G-CSF), y hormonas tales como estrógenos (dietilestilbestrol, estradiol), andrógenos (testosterona, HALOTESTIN® (fluoximesterona)), progestinas (MEGACE® (acetato de megestrol), PROVERA® (acetato de medroxiprogesterona)), y corticosteroides (prednisona, dexametasona, hidrocortisona).
Los agentes immunomoduladores útiles en la invención también incluyen antihormonas que bloquean la acción hormonal en tumores y agentes inmunosupresores que suprimen la producción de citocinas, regulan negativamente la expresión de autoantígenos o enmascaran los antígenos del MHC. Las antihormonas representativas incluyen antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben aromatasa, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno; y antiandrógeno tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide y goserelina; y agentes antiadrenales. Los agentes inmunosupresores representativos incluyen 2-amino-6-aril-5-sustituidas, azatioprina, ciclofosfamida, bromocriptina, danazol, dapsona, glutaraldehído, anticuerpos antiidiotípicos para antígenos del MHC y fragmentos del MHC, ciclosporina A, esteroides tales como glucocorticosteroides, citocina o antagonistas del receptor de citocina (por ejemplo, anticuerpos antiinterferón, anticuerpos anti-IL10, anticuerpos anti-TNFα, anticuerpos anti-IL2), estreptoquinasa, TGFβ, rapamicina, receptor de linfocitos T, fragmentos del receptor de linfocitos T y anticuerpos del receptor de linfocitos T.
Los fármacos adicionales útiles en la invención incluyen agentes antiangiogénicos que inhiben la formación de vasos sanguíneos, por ejemplo, inhibidores de farnesiltransferasa, inhidores de COX-2, inhibidores de VEGF, inhibidores de bFGF, inhibidores de sulfatasa de esteroides (por ejemplo, 2-metoxiestradiol bis-sulfamato (2-MeOE2bisMATE)), interleucina-24, trombospondina, proteínas de metalospondina, interferones de clase I, interleucina 12, protamina, angiostatina, laminina, endostatina y fragmentos de prolactina.
Los agentes antiproliferativos y agentes proapoptóticos incluyen activadores de PPAR-gamma (por ejemplo, prostaglandinas de ciclopentenona (cyPG)), retinoides, triterpenoides (por ejemplo, cicloartano, lupano, ursano, oleanano, friedelano, dammarano, cucurbitacina y triterpenoides limonoides), inhibidores de receptor de EGF (por ejemplo, HER4), rampamicina, CALCITRIOL® (1,25-dihidroxycolcalciferol (vitamina D)), inhibidores de aromatasa (FEMARA® (letrozona)), inhibidores de telomerasa, quelantes de hierro (por ejemplo, 3-aminopiridina-2carboxaldehído tiosemicarbazona (Triapina)), apoptina (proteína viral 3 -VP3 de virus de anemia de pollo), inhibidores de Bcl-2 y Bcl-X(L), TNF-alfa, ligando FAS, ligando que induce la apoptosis relacionada con TNF (TRAIL/Apo2L), activadores de la señalización de TNF-alfa/ ligando FAS/ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL/Apo2L) e inhibidores de la ruta de supervivencia de PI3K-Akt (por ejemplo, UCN-01 y geldanamicina).
Los agentes quimioterapéuticos representativos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; azidinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, tietilenfosfo
ramida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas del nitrógeno tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-EU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenal tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diacicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2etilhidrazida; procarbazina; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2’, 2’ triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton, Nueva Jersey) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer of Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; y capecitabina.
Los agentes terapéuticos adicionales que pueden conjugarse con anticuerpos anti-5T4 y usarse de acuerdo con los procedimientos terapéuticos de la presente invención incluyen agentes fotosensibilizadores (Publicación de Patente de E.E.U.U. Nº: 2002/0197262 y Patente de E.E.U.U. Nº: 5.952.329) para terapia foto dinámica; partículas magnéticas para termoterapia (Publicación de patente de E.E.U.U. Nº: 2003/0032995); agentes de unión tales como péptidos, ligandos, ligandos de adhesión celular, etc., y profármacos tales como profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen β-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo.
Para procedimientos de diagnóstico usando anticuerpos anti-5T4, un fármaco puede comprender un marcador detectable usado para detectar la presencia de células que expresan 5T4 in vitro o in vivo. Los radioisótopos que son detectables in vivo, tales como los marcadores que son detectables usando escintigrafía, captura de imágenes por resonancia magnética o ultrasonidos, pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico clínico. Los marcadores escintigráficos útiles incluyen emisores de positrones y emisores . Son agentes de contraste representativos para la captura de imágenes de fuente magnética los iones paramagnéticos o superparamagnéticos (por ejemplo, hierro, cobre, manganeso, cromo, erbio, europio, disprosio, holmio y gadolinio), partículas de óxido de hierro y agentes de contraste solubles en agua. Para la detección ultrasónica, pueden inmovilizarse gases o líquidos en partículas inorgánicas porosas que se liberan como agentes de contraste de microburbujas. Para la detección in vitro, los marcadores detectables útiles incluyen fluoróforos, epítopos detectables o agentes de unión y marcadores radiactivos.
III.B. Moléculas de engarce
Los fármacos se conjugan con anticuerpos anti-5T4 quiméricos y humanizados de la invención directa o indirectamente mediante una molécula de engarce. La molécula de engarce puede ser estable o hidrolizable, por lo que se libera después de la entrada celular. Los mecanismos principales por los que el fármaco se escinde del anticuerpo incluyen hidrólisis en el pH ácido de los lisosomas (hidrazonas, acetales, y amidas de tipo cis-aconitato), escisión peptídica por enzimas lisosómicas (las catepsinas y otras enzimas lisosómicas) y reducción de disulfuros. Como resultado de estos diversos mecanismos de escisión, los mecanismos de enlace del fármaco con el anticuerpo también variarán ampliamente y puede usarse cualquier engarce adecuado. Preferentemente, el procedimiento de conjugación produce una muestra con fracción conjugada baja mínima (LCF, la fracción de anticuerpo principalmente no conjugado), es decir, menos de aproximadamente el 10 %.
Un ejemplo de un procedimiento de conjugación adecuado se basa en la conjugación de hidracidas y otros nucleófilos con los aldehídos generados por oxidación de los carbohidratos que aparecen de forma natural en los anticuerpos. Pueden prepararse conjugados que contienen hidrazona con grupos carbonilo introducidos que proporcionan las propiedades de liberación de fármacos deseadas. También pueden prepararse conjugados con un engarce que tiene un disulfuro en un extremo, una cadena de alquilo en el medio y un derivado de hidracina en el otro extremo. Las antraciclinas son un ejemplo de citotoxinas que pueden conjugarse con anticuerpos usando esta tecnología.
Los engarces que contienen grupos funcionales distintos de hidrazonas tienen el potencial de escindirse en el medio ácido de los lisosomas. Por ejemplo, pueden prepararse conjugados a partir de engarces reactivos con tiol que contienen un sitio distinto de una hidrazona que es escindible de forma intracelular, tales como ésteres, amidas y acetales/cetales. La camptotecina es una agente citotóxico que puede conjugarse usando estos engarces. También pueden usarse cetales compuestos de un anillo de cetona de 5 a 7 miembros y que tiene uno de los oxígenos unido con el agente citotóxico y el otro con un engarce para la unión con el anticuerpo. Las antraciclinas también son un ejemplo de una citotoxina adecuada para su uso con estos engarces.
Otro ejemplo de una clase de engarces sensibles al pH son los cis-aconitatos, que tienen un ácido carboxílico yuxtapuesto con un enlace amida. El ácido carboxílico acelera la hidrólisis de amida en los lisosomas ácidos. También pueden usarse engarces que consiguen un tipo similar de aceleración de la velocidad de hidrólisis con varios otros tipos de estructuras. Los maitansinoides son un ejemplo de una citotoxina que puede conjugarse con engarces unidos en C-9.
Otro procedimiento de liberación potencial para conjugados farmacológicos es la hidrólisis enzimática de péptidos por las enzimas lisosómicas. En un ejemplo, un péptido se une mediante un enlace amida con alcohol paraaminobencílico y después se prepara un carbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el agente citotóxico. La escisión del péptido conduce al colapso, o autoinmolación del carbamato o carbonato de aminobencilo. En un ejemplo, también puede liberarse un fenol por colapso del engarce en lugar del carbamato. En otra variación, se usa reducción de disulfuro para iniciar el colapso de un carbamato o carbonato de paramercaptobencilo.
Muchos de los agentes citotóxicos conjugados con los anticuerpos tiene poca solubilidad, si la tienen, en agua y eso puede limitar la carga farmacológica en el conjugado debido a la agregación del conjugado. Un enfoque para superar esto es añadir grupos solubilizantes al engarce. Pueden usarse conjugados realizados con un engarce consistente en PEG y un dipéptido, incluyendo los que tienen un diácido, tiol-ácido o maleimida-ácido de PEG unido con el anticuerpo, un espaciador dipeptídico, y un enlace amida con la amina de una antraciclina o un análogo de duocarmicina. Otro ejemplo es un conjugado preparado con un engarce que contiene PEG unido por enlace disulfuro con un agente citotóxico y unido por enlace amida con un anticuerpo. Los enfoques que incorporan grupos de PEG pueden ser beneficios para superar la agregación y los límites en la carga farmacológica.
Los engarces representativos preferidos para la preparación de conjugado de anticuerpo/fármaco de la invención incluyen engarces de la fórmula:
(CO -Alko1-Sp1-Ar -Sp2-Alk2-C(Z1) = Q -Sp)
en la que
Alk1 y Alk2 son de forma independiente un enlace o cadena de alquileno (C1-C10) ramificada o no ramificada; Sp1 es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR’-, -N(CH2CH2)2N-, o -X-Ar’-Y-(CH2)n-Z en el que X, Y y Z son de forma independiente un enlace, -NR’-, -S-, u -O-, a condición de que cuando n = 0, entonces al menos uno de Y y Z debe ser un enlace y Ar’ es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos de alquilo (C1-C5), alkoxi (C1-C4), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’, a condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace; n es un número entero de 0 a 5; R’ es una cadena ramificada o no ramificada (C1-C5) opcionalmente sustituida por uno o dos grupos de -OH, alkoxi (C1-C4), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, dialquilamino (C1-C3), o trialquilamonio (C1-C3) -A-en la que A-es un anión farmacéuticamente aceptable que completa una sal; Ar es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos de alquilo (C1-C6), alkoxi (C1-C5), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’ en el que n y R’ son como se ha definido anteriormente en el presente documento o un 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno o
con cada naftilideno o fenotiazina opcionalmente sustituido con uno, dos, tres o cuatro grupos de alquilo (C1-C6), alkoxi (C1-C5), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, o - S(CH2)nCONHR’ en el que n y R’ son como se ha definido anteriormente a condición de que cuando Ar es fenotiazina, Sp1 es un enlace conectado solamente con nitrógeno; Sp2 es un enlace, -S-, u -O-, a condición de que cuando Alk2 es un enlace, Sp2 es un enlace; Z1 es H, alquilo (C1-C5) o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos de alquilo (C1-C5), alkoxi, (C1-C5), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -ONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’ en el que n y R’ son como se ha definido anteriormente; Sp es un radical divalente o trivalente (C1-C18) de cadena sencilla o ramificada, radical de arilo o heteroarilo
divalente o trivalente, radical de cicloalquilo o heterocicloalquilo (C3-C18) divalente o trivalente, radical de aril-o heteroaril-arilo (C1-C18) divalente o trivalente, radical de cicloalquil o heterocicloalquil-alquilo (C1-C18) divalente o trivalente o radical de alquilo insaturado (C2-C18) divalente o trivalente, en el que el heteroarilo es preferentemente furilo, tienilo, N-metilpirrolilo, piridinilo, N-metilimidazolilo, oxazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, N-metilcarbazoilo, aminocourmarinilo, o fenazinilo y en el que si Sp es un radical trivalente, Sp puede sustituirse adicionalmente por dialquilamino (C1-C5) inferior, alkoxi (C1-C5) inferior, hidroxi o grupos alquiltio (C1-C5) inferiores; y Q es =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, o =NHO-.
Preferentemente, Alk1 es una cadena de alquileno (C1-C10) ramificada o no ramificada; Sp’ es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, o -NR’ en el que R’ es como ha se ha definido anteriormente en el presente documento a condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace;
Ar es 1,2-, 1,3-, o 1,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos de alquilo (C1-C6), alkoxi (C1-C5), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’ en el que n y R’ son como se ha definido anteriormente en el presente documento, o Ar es un 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno cada uno opcionalmente sustituido con uno, dos, tres o cuatro grupos de alquilo (C1-C6), alkoxi, (C1-C5), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’.
Z1 es alquilo (C1-C5), o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos de alquilo (C1-C5), alkoxi (C1-C4), tioalkoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR’, -CONHR’, -O(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’, -O(CH2)nCONHR’, o -S(CH2)nCONHR’; Alk2 y Sp2 son juntos un enlace; y Sp y Q son como se ha definido inmediatamente antes.
La Patente de E.E.U.U Nº: 5.773.001, incorporada en el presente documento en su totalidad, desvela engarces que pueden usarse con fármacos nucleófilos, particularmente hidracidas y nucleófilos relacionados, preparados a partir de las caliqueamicinas. Estos engarces son especialmente útiles en casos en los que se obtiene mejor actividad cuando el enlace formado entre el fármaco y el engarce es hidrolizable. Estos engarces contienen dos grupos funcionales, incluyendo (1) un grupo para reacción con un anticuerpo (por ejemplo, ácido carboxílico), y (2) un grupo carbonilo (por ejemplo, un aldehído o una cetona) para reacción con un fármaco. Los grupos carbonilo pueden reaccionar con un grupo hidracida en el fármaco para formar un enlace de hidrazona. Este enlace es hidrolizable, permitiendo la liberación del agente terapéutico del conjugado después de la unión con las células diana.
Como un ejemplo, puede conjugarse un anticuerpo anti-5T4 con un fármaco citotóxico (1) añadiendo el derivado de fármaco citotóxico al anticuerpo anti-5T4 en el que el fármaco citotóxico es 4,5 %-11 % en peso del vehículo proteico; (2) incubando el derivado de fármaco citotóxico y anticuerpo anti-5T4 en una solución no nucleófila, compatible con proteínas, tamponada que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a 9 para producir un conjugado de fármaco citotóxico monomérico/anticuerpo, en el que la solución comprende además (a) un codisolvente orgánico adecuado y (b) un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico C6-C18 o su sal, y en el que la incubación se realiza a una temperatura que varía de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente 15 minutos a 24 horas; y (3) sometiendo el conjugado producido en la etapa (2) a un procedimiento de separación cromatográfica para separar conjugados monoméricos con una carga en el intervalo de 3 % a 10 % en peso de fármaco citotóxico y con fracción conjugada baja (LCF) por debajo del 10 % de anticuerpo no conjugado, derivado de fármaco citotóxico y conjugados agregados.
La separación cromatográfica de la etapa (3) puede incluir procedimientos tales como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), ultrafiltración/diafiltración, HPLC, FPLC, o cromatografía de Sephacryl S-200. La separación cromatográfica también puede conseguirse por cromatografía de integración hidrófoba (HIC) usando medio cromatográfico Fast Flow de fenil Sepharose, medio cromatográfico Fast Flow de butil Sepharose 4, medio cromatográfico Fast Flow de Octil Sepharose 4, medio cromatográfico Toyopearl Ether-650M, medio de Macro-Prep metil HIC o medio de Macro-Prep t-Butil HIC.
Los procedimientos representativos para preparar conjugados de anticuerpo anti-5T4/fármaco incluyen los descritos para la preparación de CMC-544 en la Publicación de Solicitud de Patente de E.E.U.U publicada en trámite junto con la presente Nº: 2004-082764A1 y la solicitud de patente de E.E.U.U Nº: 10/699.874, que se incorporan en el presente documento en su totalidad. Puede realizarse conjugación usando las siguientes condiciones: anticuerpo 10 mg/ml, derivado de caliqueamicina 8,5 % (p/p), decanoato sódico 37,5 mM, etanol 9 % (v/v), HEPES (N-(2Hidroxietil)piperazina-N’-(ácido 4-butanosulfonico)), 50mM, pH 8,5, 32 °C, 1 hora. Puede realizarse cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) usando una resina de butil sepharose FF, tampón de carga de fosfato potásico 0,65 M, tampón de lavado de fosfato potásico 0,49 M y tampón de elusión de fosfato potásico 4 mM. Puede conseguirse intercambio de tampón por cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración/diafiltración u otro medio adecuado. El conjugado de anticuerpo/fármaco puede formularse en Dextrano-40 1,5 %, sacarosa 0,9 %, TWEEN®-80, 0,01 %, Tris 20 mM/NaCl 50 mM, pH 8,0. También puede usarse una solución de formulación alternativa que contiene sacarosa al 5 %, TWEEN®-80 0,01 %, Tris 20 mM/NaCl 10 mM, pH 8,0. Los ciclos de liofilización se ajustan basándose en la formulación. La concentración del volumen formulado puede ser de 0,5 mg de conjugado/ml. Cada frasco puede contener 1 mg de conjugado, es decir, 2 ml de carga. Pueden prepararse otros volúmenes de carga según se desee, por ejemplo, 5 ml de carga.
Otros procedimientos representativos incluyen los descritos para CMD-193, también descritos en la Publicación de solicitud de Patente de E.E.U.U. Nº: 20060002942. Puede realizarse conjugación usando las siguientes condiciones: anticuerpo 10 mg/ml, derivado de caliqueamicina 7 % (p/p), desoxicolato 10 mM, HEPBS (N-(2-Hidroxietil)piperazina-N’-(4-ácido butanosulfónico)) 50 mM, etanol 9 % (v/v), pH 8,2, 32 °C, 1 hora. La reacción puede diluirse 10 veces con fosfato potásico 0,66 M pH 8,56, y puede realizarse HIC usando una resina de butil sepharose FF, tampón de carga de fosfato potásico 0,60 M y tampón de lavado, y tampón de elución de Tris 20 mM/NaCl 25 mM. Puede conseguirse intercambio de tampón usando ultrafiltración/diafiltración con una membrana de celulosa regenerada. El conjugado puede diafiltrarse contra Tris 20 mM/NaCl 10 mM pH 8,0 (10 diavolúmenes). El conjugado de anticuerpo/fármaco puede formularse en sacarosa 5 %, TWEEN®-80 0,01 %, Tris 20 mM/NaCl 10 mM, pH 8,0. La concentración del conjugado a granel después de la formulación puede ser de 1 mg/ml, y la carga del frasco puede ser de 5 mg/frasco, es decir, 5 ml de carga, o pueden prepararse otros volúmenes de carga según se desee.
En una realización particular de la invención, el engarce empleado es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). Se preparan conjugados de anticuerpo/fármaco haciendo reaccionar -caliqueamicina, -caliqueamicina o N-acetil caliqueamicina, o derivados de los mismos, con 3-mercapto-3-metil butanoil hidracida, el engarce AcBut y un anticuerpo anti-5T4 de la invención. Véase por ejemplo, Patente de E.E.U.U. Nº: 5.773.001. Este engarce produce conjugados que son sustancialmente estables en circulación, liberando una estimación del 2 % del NAc-gamma DMH por día, y que liberan el NAc-gamma DMH fácilmente en los lisosomas ácidos. En otras realizaciones de la invención, se preparan conjugados de anticuerpo/fármaco usando ácido 3-acetilfenilo ácido (AcPac) o ácido 4mercapto-4-metil-pentanoico (Amida) como la molécula de engarce.
Los engarces representativos útiles para la conjugación de radioisótopos incluyen isotiocianato de dietilentriamina pentaacetato (DT-PA), clorhidrato de succinimidil 6-hidracinio nicotinato (SHNH), y hexametilpropilen amina oxima (HMPAO) (Bakker y col. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay y col. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741744, Dewanjee y col. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning y col. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi y col. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270); Patente de E.E.U.U. Nº: 6.024.938). Como alternativa, una molécula de dirección puede derivatizarse de modo que un radioisótopo pueda unirse directamente con ella (Yoo y col. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300). También se conocen en la técnica procedimientos de yodación, y pueden encontrarse protocolos representativos, por ejemplo, en Krenning y col. (1989) Lancet 1:242-4 y en Bakker y col. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9.
Para aumentar adicionalmente el número de moléculas farmacológicas por conjugado de anticuerpo/fármaco, el fármaco puede conjugarse con polietilenglicol (PEG), incluyendo polímeros y monómeros de polietilenglicol sencillos
o ramificados. Un monómero de PEG tiene la fórmula: -(CH2CH2O)-. Pueden unirse fármacos y/o análogos peptídicos con PEG directa o indirectamente, es decir mediante grupos espaciadores apropiados tales como azucares. Una composición de PEG/anticuerpo/fármaco también puede incluir restos lipófilos y/o hidrófilos adicionales para facilitar la estabilidad farmacológica y la administración a un sitio diana in vivo. Pueden encontrarse procedimientos representativos para preparar composiciones que contienen PEG en las Patentes de E.E.U.U Nº: 6.461.603; 6.309.633; y 5.648.095, entre otros sitios.
Por ejemplo, para aumentar la cantidad de caliqueamicina en conjugados de anticuerpo-caliqueamicina, el anticuerpo se conjuga con PEG antes de la conjugación con caliqueamicina, por ejemplo, usando PEG-SPA, PEG-SBA, o PEG-bis-maleimida. Los conjugados de anticuerpo/fármaco preparados usando PEG pueden mostrar afinidad de unión reducida por el antígeno diana, pero aún ser eficaces como resultado de la carga farmacológica aumentada. Pueden usarse aditivos tales como desoxicolato y decanoato para producir un conjugado de anticuerpo/caliqueamicina con niveles bajos de anticuerpo no conjugado y niveles bajos de agregado.
La naturaleza hidrófoba de muchos fármacos, incluyendo caliqueamicinas, puede dar como resultado la agregación de conjugados de anticuerpo/fármaco. Para producir conjugados de anticuerpo/fármaco monoméricos con mayor carga/rendimiento de fármacos y agregación reducida, la reacción de conjugación puede realizarse en una solución no nucleófila, compatible con proteínas, tamponada que contiene (i) propilenglicol común codisolvente y (ii) un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico C6-C18. Los ácidos útiles incluyen ácidos C7 a C12, tales como ácido octanoico o ácido caprílico, o sus sales. También pueden usarse otros codisolventes orgánicos compatibles con proteína distintos de propilenglicol, tales como etilenglilcol, etanol, DMF, DMSO, etc. Se usan algunos de o todos los codisolventes orgánicos para transferir el fármaco a la mezcla de conjugación. Los tampones útiles para la preparación de conjugados de anticuerpo/fármaco usando ésteres de N-hidroxisuccinimida (OSu) u otros ésteres comparablemente activados incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) y ácido N-2-hidroxietil piperazinaN’-2-etanosulfónico (tampón HEPES). La solución tamponada usada en reacciones de conjugación debería carecer sustancialmente de aminas libres y nucleófilos. Como otro enfoque, las reacciones de conjugación pueden realizarse en una solución no nucleófila, compatible con proteínas, tamponada que contiene t-butanol sin los aditivos adicionales. Véase por ejemplo, Patentes de E.E.U.U Nº: 5.712.374 y 5.714.586. Se describen procedimientos adicionales para la conjugación y conjugados que contienen caliqueamicina en las Patentes de E.E.U.U Nº:
5.739.116 y 5.877.296.
Las condiciones de reacción óptimas para la formación de un conjugado monomérico pueden determinarse de forma empírica por la variación de variables de reacción tales como la temperatura, pH, aporte de derivado de
caliqueamicina y concentración de aditivos. Las cantidades representativas de propilenglicol varían del 10 % al 60 %, por ejemplo, del 10 % al 40 %, o aproximadamente el 30 % en volumen de la solución total. Las cantidades representativas de un aditivo que comprende al menos un ácido carboxílico C6-C18 o su sal varían de 20 mM a 100 mM, tal como de 40 mM a 90 mM, o de aproximadamente 60 mM a 90 mM. La concentración del ácido carboxílico C6-C18 o su sal puede aumentarse hasta 150-300 mM y el codisolvente reducirse del 1 % al 10 %. En realizaciones representativas de la invención, el ácido carboxílico es ácido octanoico, ácido decanoico o las sales correspondientes. Por ejemplo, puede usarse ácido caprílico 200 mM con propilenglicol o etanol 5 %. La reacción de conjugación puede realizarse a temperatura (30-35 °C) y pH (8,2-8,7) ligeramente elevados. La concentración de anticuerpo puede variar de 1 a 15 mg/ml y la concentración de un derivado de caliqueamicina, por ejemplo, N-Acetil gamma-caliqueamicina DMH AcBut OSu éster puede variar de aproximadamente el 4,5 % al 11 % en peso del anticuerpo. Pueden determinarse condiciones adecuadas para la conjugación de otros fármacos por los expertos en la materia sin experimentación indebida.
III.C. Purificación de conjugados de anticuerpo/fármaco
Después de la conjugación, los conjugados monoméricos pueden separarse de reactivos no conjugados y/o formas agregadas de los conjugados por procedimientos convencionales, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), o cromatoenfoque (CF). Los conjugados purificados son monoméricos y habitualmente contienen del 3 % al 10 % de fármaco en peso. También pueden purificarse conjugados de anticuerpo/fármaco usando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), que ofrece algunas ventajas sobre SEC incluyendo (1) una capacidad para reducir eficazmente el contenido de LCF así como agregado; (2) alojamiento de volúmenes de reacción grandes; y (3) dilución mínima del producto. Los medios de HIC de alta capacidad adecuados para su uso en escala de producción incluyen medio cromatográfico de Fenil Sepharose 6 Fast Flow, medio cromatográfico de Butil Sepharose 4 Fast Flow, medio cromatográfico de Octil Sepharose 4 Fast Flow, medio cromatográfico de Eter-650M Toyopearl, medio de HIC macro-Prep metilo o medio de HIC macro-prep-t butilo. También puede usarse ultrafiltración/diafiltración para intercambio de tampones.
En un procedimiento de purificación representativo, se realizan múltiples etapas, incluyendo una etapa de retirada de células de centrífuga, una etapa de captura de afinidad de proteína A seguida de una o dos etapas de pulido cromatográfico ortogonal, una etapa de filtración de virus y una etapa de filtración de flujo tangencial para concentración y formulación. El procedimiento de purificación produce preferentemente producto con menos del 5 % de agregado, menos de 20 ppm de proteína A, menos de 50 ppm de proteína de la célula huésped y una recuperación general de más del 50 %.
Una preparación de anti-5T4/caliqueamicina típica contiene predominantemente (aproximadamente 95 %) anticuerpo conjugado que contiene 5-7 moles de caliqueamicina por mol de anticuerpo. El conjugado se ha preparado de forma reproducible a la escala de laboratorio (10-200 mg). La carga farmacológica, que se expresa como g de caliqueamicina/mg de anticuerpo monoclonal, se determina dividiendo la concentración de caliqueamicina (mg/ml) por la concentración de anticuerpo (mg/ml). Estos valores se determinan midiendo la absorbancia de UV de la solución de conjugado a 280 nm y 310 nm. Es importante observar que esta es una carga media y que la carga real es una distribución casi gaussiana centrada en el valor de carga medio, es decir, algo del anticuerpo se carga a más que la media y algo del anticuerpo se carga a menos que la media. El anticuerpo no conjugado (fracción conjugada baja), que puede medirse usando HIC-HPLC (cromatografía liquida de alto rendimiento de interacción hidrófoba) analítica, es la población de anticuerpo que tiene poca o ninguna caliqueamicina conjugada. Este valor es una medida de la distribución de caliqueamicina en el anticuerpo y no afecta en general a la cantidad de caliqueamicina dosificada. La caliqueamicina no conjugada, que puede medirse usando ELISA, se refiere a la cantidad de caliqueamicina que no se conjuga con el anticuerpo y se expresa con respecto al porcentaje de caliqueamicina total. Los ensayos de carga farmacológica no diferencian entre caliqueamicina no conjugada y conjugada. La cantidad de caliqueamicina no conjugada es indetectable o despreciable cuando se usan ensayos de carga farmacológica, y por lo tanto estos ensayos miden eficazmente la cantidad de caliqueamicina conjugada.
Puede usarse procedimientos analíticos para ensayar con respecto a la liberación y estabilidad de conjugados de caliqueamicina y anti-5T4 humanizado. Los conjugados pueden evaluarse con respecto a identidad (IEF), fuerza (carga de proteína total y caliqueamicina total), pureza (caliqueamicina no conjugada, anticuerpo conjugado bajo, contenido agregado y SDS-PAGE reducido), e inmunoafinidad (ELISA reunión al antígeno). Pueden usarse ensayos adicionales conocidos por los expertos en la materia. Usando estos ensayos, puede conseguirse uniformidad entre lotes en la fabricación comercial.
III.D. Farmacocinética de los conjugados de anticuerpo/fármaco
Puede evaluarse la farmacocinética de inmunoconjugados dirigidos a 5T4 y compararse con la farmacocinética de caliqueamicina no conjugada en diversos animales. Por ejemplo, esto puede realizarse después de una única administración de embolada intravenosa en ratones desnudos hembra, ratas Sprague-Dawley macho y monos cynomolgus hembra. La farmacocinética de un anticuerpo anti-5T4 se caracteriza en general por baja eliminación, bajo volumen de distribución y larga semivida terminal aparente en diversas especies. Se espera que las concentraciones en suero de derivados de caliqueamicina no conjugados estén por debajo del límite de
cuantificación. Se espera que el perfil de toxicidad para estos conjugados en estudios de variación de toxicidad de una única dosis sea similar al obtenido para otros conjugados de anticuerpo/caliqueamicina a dosis comparables.
IV. Ensayos funcionales para caracterización de anticuerpos Anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco
La presente invención desvela además ensayos in vitro e in vivo para caracterizar actividades de un anticuerpo anti5T4, incluyendo la actividad de unión de 5T4, la internalización celular después de la unión con el antígeno 5T4 presentado en una superficie celular, y la dirección a células que expresan 5T4 en un sujeto. Cuando se conjugan con una citotoxina, los anticuerpos desvelados de la invención pueden inducir actividad antineoplásica incluyendo inhibición del crecimiento de células cancerosas que expresan 5T4 y/o inducción de la muerte celular en células que expresan 5T4. Los anticuerpos anti-5T4 de la invención pueden comprender una o más de las actividades anteriores.
Se conocen en este campo técnicas para detector la unión de anticuerpos anti-5T4 con antígeno 5T4, incluyendo por ejemplo, ensayos BIACORE® como se describe en el Ejemplo 2. Las técnicas representativas adicionales incluyen centrifugación, cromatografía de afinidad y otros procedimientos inmunoquímicos. Véase por ejemplo, Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, Estados Unidos de América; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, Ámsterdam/Nueva York. Pueden realizarse ensayos de unión a antígeno usando antígeno 5T4 aislado o células que expresan 5T4. Véase Ejemplo 2.
La especificidad de unión de los anticuerpos anti-5T4 puede describirse adicionalmente por la definición de un epítopo de unión, es decir, identificación de restos, incluyendo restos no adyacentes que participan en la unión a antígeno y/o definición de restos que influyen en la unión a antígeno. Véase los Ejemplos 4-5.
Puede ensayarse la internalización de los anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco por células que expresan 5T4 observando la cantidad de anticuerpos o conjugados unidos con la superficie de las células que expresan 5T4 a lo largo del tiempo. Se describen técnicas representativas para evaluar la localización en membrana de anticuerpos y conjugados de anticuerpo/fármaco en el Ejemplo 3.
Los ensayos funcionales también incluyen procedimientos para evaluar la actividad antineoplásica de conjugados de anticuerpo/fármaco, por ejemplo, una capacidad para destruir células cancerosas existentes, o para retardar o prevenir el crecimiento de células cancerosas. Los cánceres a los que se dirigen conjugados de anticuerpo/fármaco incluyen tumores tanto primarios como metastatizados y carcinomas de cualquier tejido en un sujeto, incluyendo carcinomas y tumores malignos hematopoyéticos tales como leucemias y linfomas.
Los anticuerpos anti-5T4 que tienen actividad inhibidora del crecimiento pueden eliminar células que expresan 5T4 o prevenir o reducir la proliferación de células que expresan 5T4. Se describen procedimientos representativos para evaluación in vitro rápida de la inhibición del crecimiento celular en Jones y col. (2001) J. Immunol. Methods 254:85
98.
Los anticuerpos anti-5T4 también pueden comprender una capacidad para inducir la muerte celular, por ejemplo, muerte celular programada caracterizada por la degradación de ADN nuclear, degeneración y condensación nuclear, perdida de integridad de membrana y fagocitosis. Se describen ensayos representativos para evaluar las células en Hoves y col. (2003) Methods 31:127-34; Peng y col. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara y col. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885.
Por ejemplo, para evaluar la citotoxicidad de conjugados de anticuerpo anti-5T4/caliqueamicina in vitro, se cultivan células MDAMB435/5T4 (células de carcinoma de mama humano que sobreexpresan el antígeno 5T4) y células MDAMB435/neo (células de control) en presencia de conjugados de anticuerpo-caliqueamicina o caliqueamicina libre, esencialmente como se describe en Boghaert y col. (2004), Clin. Cancer Res., 10: 4538-4549. La citotoxicidad de cada agente se presenta como DE50 (ng/ml), que es la cantidad de caliqueamicina proporcionada como conjugado o como fármaco libre que provoca la reducción del 50 % de un cultivo celular en relación con un control no tratado. El número de células en cultivo se determina usando un colorante vital (MTS) después de exposición al fármaco. Véase también Ejemplo 6.
La citotoxicidad de conjugados de anticuerpo/caliqueamicina también puede evaluarse usando células MDAMB435/5T4 y MDAMB435/neo cultivadas de una manera adecuada para el crecimiento esferoide. Las células se cultivan en presencia de conjugados de anticuerpo/caliqueamicina o caliqueamicina libre, y después de exposición al fármaco, se determinaron las dimensiones de cada esferoide. La eficacia de cada uno de los agentes en la inhibición del crecimiento esferoide se presenta como DE50 (ng/ml), es decir, la cantidad de caliqueamicina proporcionada como conjugado o como fármaco libre que provoca el 50 % de inhibición del crecimiento esferoide en relación con un control no tratado. Véase Ejemplo 6.
Para evaluar la citotoxicidad de conjugados de anticuerpo anti-5T4/caliqueamicina in vivo, se preparan tumores en ratones desnudos por inyección subcutánea de células MDAMB435/5T4 (células de carcinoma de mama humano que sobreexpresan el antígeno 5T4), células NCI-H157 (células de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano), células PC14PE6 (células de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano), o células N87 (células de carcinoma gástrico). Se administran conjugados de anticuerpo/caliqueamicina y compuestos de control a ratones
portadores de tumores, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal en un total de tres dosis proporcionadas a intervalos de 4 días, por ejemplo, los días 1, 5 y 9. Los resultados terapéuticos medibles incluyen la inhibición del crecimiento de células tumorales.
Para evaluar adicionalmente la capacidad de dirección de conjugados de anticuerpo anti-5T4/caliqueamicina, se puede usar un modelo ortotópico para cáncer de células no pequeñas y células pequeñas, esencialmente como se describe en Onn y col. (2003) Clin. Cancer Res. 9(15):5532-5539. Brevemente, se inyectan células de adenocarcinoma de pulmón humano (PC14PE6) en venas de la cola de ratones desnudos, que después migran para formar tumores en el pulmón. Los tumores pueden aparecer como nódulos sólidos en el parénquima del pulmón y provocan efusiones pleurales hemorrágicas que contienen células tumorales suspendidas. Se administran compuestos de control y conjugados de anticuerpo/caliqueamicina a ratones portadores de tumores, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal comenzando a los 6 días después de la inyección de células tumorales durante un total de 3 dosis proporcionadas a intervalos de 4 días, por ejemplo, los días 6, 10 y 14. Los resultados terapéuticos medibles incluyen efusiones pleurales reducidas y aumento de la supervivencia.
V. Usos de anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco
Los anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención son útiles tanto in vitro como in vivo para aplicaciones relacionadas con células que expresan 5T4. Los cánceres que expresan 5T4 incluyen carcinoma de pulmón escamoso/adenomatoso (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma del cuello uterino escamoso, adenocarcinoma endometrial invasivo, carcinoma de páncreas invasivo, carcinoma ovárico, carcinoma vesical escamoso y coriocarcinoma. Se detecta 5T4 en carcinomas de bronquios, mama, colon, recto, estómago, cuello uterino, endometrio, páncreas, ovarios, corion y vesículas seminales.
V.A. Aplicaciones In Vitro
La presente divulgación proporciona procedimientos in vitro usando anticuerpos anti-5T4. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados pueden usarse solos o en combinación con agentes citotóxicos u otros fármacos para unirse específicamente con células cancerosas positivas para 5T4 para agotar dichas células de una muestra celular. También se proporcionan procedimientos para inducir apoptosis y/o inhibición de la proliferación celular mediante el contacto de células que expresan 5T4 con un conjugado de anticuerpo/fármaco que comprende un anticuerpo anti5T4 conjugado con una citotoxina. Se han descrito en el presente documento procedimientos in vitro representativos anteriormente bajo el encabezamiento de "Ensayos funcionales para Caracterización de anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco."
Los anticuerpos Anti-5T4 de la invención también tienen utilidad en la detección de células positivas para 5T4 in vitro basándose en su capacidad para unirse específicamente con el antígeno 5T4. Un procedimiento para detectar células que expresan 5T4 puede comprender: (a) preparar una muestra biológica que comprende células; (b) poner en contacto un anticuerpo anti-5T4 con la muestra biológica in vitro; y (c) detectar la unión del anticuerpo anti-5T4. Para facilitar la detección, el anticuerpo puede conjugarse con un marcador.
V.B. Detección y Diagnóstico In Vivo
También pueden usarse anticuerpos anti-5T4 de la invención para procedimientos de detección in vivo, por ejemplo, según sea útil para el diagnóstico, para proporcionar asistencia intraoperatoria, o para la determinación de la dosis. Después de la administración de un anticuerpo anti-5T4 marcado a un sujeto, y después de un tiempo suficiente para la unión, puede visualizarse la biodistribución de células que expresan 5T4 unidas por el anticuerpo. Los procedimientos de diagnóstico desvelados pueden usarse en combinación con procedimientos de tratamiento. Además, los anticuerpos anti-5T4 de la invención pueden administrarse para el fin doble de detección y terapia.
Los procedimientos de detección no invasivos representativos incluyen escintigrafía (por ejemplo, SPECT (Tomografía computarizada de emisión de un único fotón), PET (Tomografía de emisión de positrones), captura de imágenes con cámara gamma y exploración rectilínea), captura de imágenes por resonancia magnética (por ejemplo, captura de imágenes por resonancia magnética convencional, captura de imágenes por transferencia de magnetización (MTI), espectroscopia de resonancia magnética de protones (MRS), captura de imágenes ponderada de difusión (DWI) y captura de imágenes por MR funcional (fMRI)), y ultrasonidos.
V.C. Aplicaciones terapéuticas
La presente invención se refiere además a procedimientos y composiciones útiles para inducir la citolisis de células cancerosas que expresan 5T4 en un sujeto. Los conjugados de anticuerpo anti-5T4/fármaco de la invención son útiles para inhibir el crecimiento de células cancerosas y células de un trastorno proliferativo no neoplásico, tales como hiperplasia, metaplasia, o más particularmente displasia (para una revisión de dichas condiciones de crecimiento anómalas, véase DeVita, Jr. y col. (2001), Cancer: Principles and Practice, 6º edición, Lippincott Williams & Wilkins.
Los cánceres adecuados para dirección usando conjugados de anticuerpo anti-5T4/fármaco incluyen tumores
primarios y metastásicos que expresan 5T4 en mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar, conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario incluyendo riñón, vejiga y urotelio, tracto genital femenino, cuello uterino, útero, ovarios, tracto genital masculino, próstata, vesículas seminales, testículos, una glándula endocrina, glándula tiroidea, glándula adrenal, glándula hipófisis, piel, hueso, tejidos blandos, vasos sanguíneos, cerebro, nervios, ojos, meninges. Otros cánceres relevantes son leucemias y linfomas que expresan 5T4 (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin), incluyendo leucemia o linfoma indolente, agresivo, de grado bajo, de grado intermedio, o de grado alto.
En particular, se sabe que 5T4 se expresa en células de carcinoma de pulmón adenomatoso/escamoso (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma de cuello uterino escamoso, adenocarcinoma endometrial invasivo, carcinoma de páncreas invasivo, carcinoma ovárico, carcinoma vesical escamoso y coriocarcinoma. Se detecta 5T4 a niveles altos en carcinomas de bronquios, mama, colon, recto, estómago, cuello uterino, endometrio, páncreas, ovarios, corion y vesículas seminales. La distribución de la superficie celular del antígeno 5T4 puede ser homogénea o heterogénea. En carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico y carcinoma ovárico, la expresión de 5T4 está directamente relacionada con la progresión de la enfermedad. En el carcinoma de mama, se observa aumento de la intensidad de la tinción de 5T4 en nódulos metastásicos, sin embargo, la expresión de 5T4 no se correlaciona con el estadio de enfermedad. Los cánceres también pueden expresar el antígeno de carbohidrato de Lewis Y incluyendo carcinomas de mama, colon, gástrico, esofágico, pancreático, duodenal, de pulmón, de vejiga y renal y tumores neuroendocrinos gástricos y de células de islotes. Véase Patente de E.E.U.U. Nº: 6.310.185.
Por lo tanto, los pacientes para tratar con los conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención pueden seleccionarse basándose en la expresión de biomarcadores, incluyendo pero sin limitación expresión elevada de antígeno 5T4, que da como resultado una población de pacientes seleccionados para expresión de diana enriquecida en lugar de origen tumoral o histología. La expresión de diana puede medirse en función del número de células que se tiñen en combinación con la intensidad de la tinción celular. Por ejemplo, la clasificación de alta expresión de 5T4 incluye los pacientes con más del 30 % (es decir, 40 %, 50 % o 60 %) de las células ensayadas por tinción inmunohistoquímica positivas para 5T4 a un nivel de 3+ (en una escala de 1 a 4), mientras que la expresión moderada del 5T4 puede incluir los pacientes con más del 20 % de las células con tinción de 1+ a 2+.
Pueden usarse también biomarcadores distintos de la expresión del antígeno 5T4 para selección de pacientes, incluyendo caracterización del tumor basándose en la resistencia multifarmacológica (MDR), por ejemplo. Casi el 50 % de los cánceres humanos son completamente resistentes a quimioterapia o responden de forma solo transitoria, después de lo cual ya no se ven afectados por fármacos antineoplásicos usados habitualmente. Este fenómeno se denomina MDR y se expresa inherentemente por algunos tipos tumorales, mientras que otros adquieren MDR después de exposición a tratamiento de quimioterapia. La bomba de flujo de salida de fármaco P-glucoproteína media en una mayoría de las MDR asociadas con productos quimioterapéuticos citotóxicos. El análisis fenotípico y funcional de los mecanismos de MDR presentes en muestras de ensayo de tumores de pacientes con cáncer puede realizarse para relacionar un mecanismo o mecanismos de MDR específicos con la resistencia a quimioterapia en tipos tumorales específicos.
El crecimiento canceroso o proliferación anómala se refieren a uno cualquiera de varios índices que sugieren un cambio dentro de las células a una forma de cáncer más desarrollada o patología. La inhibición del crecimiento de células cancerosas o células de un trastorno proliferativo no neoplásico puede ensayarse por procedimientos conocidos en la técnica, tales como crecimiento de tumor retardado e inhibición de la metástasis. Otros índices para medir la inhibición del crecimiento de cáncer incluyen una reducción de la supervivencia de células cancerosas, una reducción del volumen o la morfología del tumor (por ejemplo, como se determina usando tomografía computarizada (CT), sonografía u otro procedimiento de captura de imágenes), destrucción de vasculatura tumoral, rendimiento mejorado en el ensayo cutáneo de hipersensibilidad retardada, un aumento de la actividad de linfocitos T citolíticos, y una reducción de los niveles de antígenos específicos de tumor.
Sin pretender quedar ligado a culaquier modo de actuación individual, tanto la dirección guiada por antígeno como la dirección pasiva de conjugados de anticuerpo anti 5T4/fármaco pueden contribuir a la eficacia antitumoral. La dirección guiada por antígeno se refiere al movimiento preferente y/o acumulación de un péptido o análogo peptídico en un tejido diana (es decir, un tejido que comprende células que expresan 5T4 y el sitio pretendido para acumulación de un conjugado de anti 5T4/fármaco) en comparación con un tejido de control (es decir, un tejido que se sospecha que carece sustancialmente de células que expresan 5T4 y unión y/o acumulación de un conjugado de anti 5T4/fármaco administrado). La localización preferente de un conjugado de anticuerpo/fármaco es generalmente tal que una cantidad de conjugado de anticuerpo/fármaco en un tejido diana es aproximadamente 2 veces mayor que una cantidad de conjugado de anticuerpo/fármaco en un tejido de control, tal como una cantidad que es aproximadamente 5 veces o más, o aproximadamente 10 veces o más.
La dirección pasiva se refiere en general a secuestrar anticuerpos o conjugados de fármaco/anticuerpo en un sitio tumoral debido a cambios locales en la vasculatura. Por ejemplo, los conjugados de anti 5T4/fármaco pueden dejar la vasculatura en el sitio del tumor, que está fenestrado debido al aumento de la producción de VEGF, unirse con células que expresan 5T4 y desencadenar la internalización del conjugado de anti 5T4/fármaco. El mal drenaje venoso y linfático del tumor también puede dar como resultado el secuestro de conjugados de anti 5T4/fármaco no
unidos. Los anticuerpos conjugados con fármacos con engarces lábiles por ácido pueden liberar el fármaco, que después se difunde en células tumorales. Los efectos antitumorales de la dirección pasiva no son permanentes o tan potentes como los inducidos por dirección guiada por antígeno, pero pueden contribuir a la eficacia total.
V.D. Formulaciones
Se preparan fácilmente anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención y se formulan para su uso clínico seguro y eficaz. Las formulaciones adecuadas para administración a un sujeto incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal), solutos que hacen a la formulación isotónica con los fluidos corporales del receptor pretendido (por ejemplo, azúcares, sales y polialcoholes), agentes de suspensión y agentes espesantes. Los disolventes adecuados incluyen agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas de los mismos. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y frascos, y pueden almacenarse en una condición congelada o criodesecada (liofilizada) que requiere solamente la adición de vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso para la administración a un sujeto o para posterior radiomarcaje con un isótopo apropiado para la aplicación pretendida. Los anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco de la invención se formulan preferentemente como una dosis eficaz, descrita posteriormente.
Como un ejemplo, una formulación de anticuerpo anti 5T4 o conjugado de anti 5T4/fármaco representativa comprende una formulación multidosis de anticuerpo o conjugado de anticuerpo/fármaco 40 mg/ml, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bencílico 0,9 %, polisorbato 20 0,al 02 % a pH 5,0, y que tiene un periodo de validez mínimo de dos años en almacenamiento a 2-8 ºC. Como otro ejemplo, una formulación de anticuerpo anti 5T4 o conjugado de anti 5T4/fármaco puede comprender anticuerpo 10 mg/ml o conjugado de anticuerpo/fármaco en cloruro sódico 9,0 mg/ml, citrato sódico dihidrato 7,35 mg/ml, polisorbato 80 al 0,7 mg/ml y agua estéril, pH 6,5. Las formulaciones representativas de un conjugado de anti 5T4/caliqueamicina para administración a modelos de ratón experimentales incluyen 2 g o 4 g de caliqueamicina (véase Ejemplos 3, 4 y 7), que pueden cambiarse de escala de forma correspondiente para su administración a seres humanos.
Una formulación liofilizada estable de un anticuerpo anti 5T4 o conjugado de anticuerpo/fármaco pueden prepararse
(a) disolvier un conjugado de anticuerpo/fármaco hasta una concentración final de 0,5 a 2 mg/ml en una solución que comprende un crioprotector a una concentración de 1,5 %-5 % en peso, un agente de masificación polimérico a una concentración de 0,5-1,5 % en peso, electrolitos a una concentración de 0,01 M a 0,1 M, un agente facilitador de la solubilidad a una concentración de 0,005 % a 0,05 % en peso, agente tamponante a una concentración de 5-50 mM de modo que el pH final de la solución sea 7,8-8,2, y agua; (b) dispensar la solución anterior en frascos a una temperatura de +5 ºC a +10 ºC; (c) congelar la solución a una temperatura de congelación de -35 ºC a -50 ºC; (d) someter la solución congelada a una etapa de liofilización inicial a una presión de secado primaria de 20 a 80 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de -10 ºC a -40 ºC durante 24 a 78 horas; y (e) someter el producto liofilizado de la etapa (d) a una etapa de secado secundaria a una presión de secado de 20 a 80 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de +10 ºC a +35 ºC durante 15 a 30 horas.
Los crioprotectores representativos útiles para liofilización del crioprotector incluyen alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietilenglicol, ácido aldónico, ácido urónico, ácido aldárico, aldosas, cetosas, azúcares de amino, alditoles, inositoles, gliceraldehídos, arabinosa, lixosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, glucosa, hexosa, idosa, manosa, talosa, heptosa, glucosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, lactosa, manitol, metil -glucopiranósido, maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbosa, ácido glucárico, eritrosa, treosa, arabinosa, alosa, altrosa, gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina, sacarosa, trehalosa, ácido neuramínico, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos, levano, fucoidano, carragenina, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pululano, glucógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, pustulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma de xantano, almidón, sacarosa, glucosa, lactosa, trehalosa, etilenglicol, polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol y pentaeritritol.
Por ejemplo, el crioprotector sacarosa puede usarse a una concentración de 1,5 % en peso, el agente de masificación polimérico Dextrano 40 o hidroxietil almidón 40 puede usarse a una concentración de 0,9 % en peso, el electrolito usado en la solución de liofilización es cloruro sódico, que está presente a una concentración de 0,05 M, y el agente tamponante trometamina puede usarse a una concentración de 0,02 M. Puede usarse también un agente facilitador de la solubilidad (por ejemplo, un tensioactivo tal como Polisorbato 80) durante el procedimiento de liofilización. Habitualmente este agente facilitador de la solubilidad es un tensioactivo. Las etapas representativas para la preparación de una formulación liofilizada incluyen congelar los frascos a una temperatura de -45 ºC, la solución congelada se somete a una etapa de liofilización inicial a una presión de secado primaria de 60 micrómetros y a una temperatura de almacenamiento de -30 ºC durante 60 horas; y someter el producto liofilizado a una etapa de secado secundaria a una presión de secado de 60 micrómetros a una temperatura de almacenamiento de +25 ºC durante 24 horas.
Se formulan anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anticuerpo/fármaco en un vehículo farmacéuticamente aceptable,
por ejemplo, macromoléculas metabolizadas lentamente grandes tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. También pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos. Las formulaciones pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol y/o pueden estar presentes en dichas composiciones sustancias adyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones, para ingesta por el paciente.
V.E. Dosis y administración
Los anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo, mediante administración intravascular, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Para la administración de composiciones a rutas pulmonares, las composiciones pueden administrarse como un aerosol o pulverización gruesa, es decir administración transnasal. Puede usarse la administración intratecal, intramedular o intraventricular para el tratamiento de cánceres del sistema nervioso central (SNC) y cánceres relacionados con el SNC. También pueden administrarse anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco por vía transdérmica, vía transcutánea, vía tópica, vía entérica, vía intravaginal, vía sublingual o vía rectal. Puede usarse rutinariamente administración intravenosa en la clínica. Un procedimiento de suministro se selecciona basándose en consideraciones tales como la afección y el sitio para tratar, el tipo de formulación de anticuerpo y la eficacia terapéutica de la composición.
La presente invención permite que se administre una cantidad eficaz de un anticuerpo anti 5T4 y conjugado de anti 5T4/fármaco a un sujeto, es decir, una cantidad de un anticuerpo anti 5T4 o conjugado de anti 5T4/fármaco suficiente para inducir una respuesta biológica deseada. Por ejemplo, cuando se administra a un sujeto que porta cáncer, una cantidad eficaz comprende una cantidad suficiente para inducir actividad antineoplásica, incluyendo citolisis de células cancerosas, inhibición de la proliferación de células cancerosas, inducción de la apoptosis de células cancerosas, reducción de los antígenos de células cancerosas, retardo del crecimiento tumoral y/o inhibición de la metástasis. La reducción del tumor está bien aceptada como un marcador sustituto clínico de eficacia. Otro marcador bien aceptado para la eficacia es la supervivencia sin progresión. Los conjugados de anti 5T4/caliqueamicina demuestran generalmente al menos una mejora del 25 % en parámetros de eficacia claves, tales como mejora de la mediana de la supervivencia, tiempo hasta la progresión tumoral y velocidad de respuesta general.
En general, una dosis eficaz estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 50 mg/m2, tal como de aproximadamente 0,1 mg/m2 a aproximadamente 20 mg/m2, o aproximadamente 15 mg/m2, dosis que se calcula basándose en la cantidad de anticuerpo anti 5T4. También puede calcularse una dosis eficaz de un conjugado de anti 5T4/fármaco basándose en una cantidad del fármaco conjugado. Por ejemplo, las dosis representativas de un conjugado de anti 5T4/caliqueamicina para administración a modelos de ratón experimentales incluyen 2 g o 4 g de caliqueamicina, que pueden cambiarse de escala de forma correspondiente para administración a seres humanos. Por ejemplo, pueden administrarse conjugados de anti 5T4/caliqueamicina de la invención a pacientes humanos una vez cada 3 semanas durante hasta 6 ciclos. Para un anticuerpo anti 5T4 radiomarcado, una dosis eficaz está típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 mCi a aproximadamente 300 mCi, normalmente de aproximadamente 5 mCi a 100 mCi, dependiendo del radioisótopo y la afinidad de unión del anticuerpo.
Para la detección de células positivas para 5T4 usando los anticuerpos anti 5T4 desvelados, se administra una cantidad detectable de una composición de la invención a un sujeto, es decir, una dosis de un anticuerpo anti 5T4 de modo que la presencia del anticuerpo pueda determinarse in vitro o in vivo. Para captura de imágenes escintigráficas usando radioisótopos, las dosis típicas de un radioisótopo pueden incluir una actividad de aproximadamente 10 Ci a 50 mCi, de aproximadamente 100 Ci a 25 mCi, de aproximadamente 500 Ci a 20 mCi, de aproximadamente 1 mCi a aproximadamente 10 mCi, o aproximadamente 10 mCi.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en una composición de la invención pueden variarse para administrar una cantidad de la composición que sea eficaz para conseguir el resultado de diagnóstico o terapéutico deseado. Los regímenes de administración también pueden variarse. Puede usarse una única inyección o múltiples inyecciones. El nivel de dosificación y régimen seleccionado dependerán de una diversidad de factores incluyendo la actividad y estabilidad (es decir, semivida) de la composición terapéutica, formulación, la vía de administración, combinación con otros fármacos o tratamientos, la enfermedad o trastorno para detectar y/o tratar, y la condición física e historial médico previo del sujeto que se trate.
Para anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, tales como roedores, conejos, perros, cerdos y/o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentraciones y la vía de administración apropiados. Dicha información puede usarse después para determinar las dosis útiles y vías de administración en seres humanos. Típicamente, se administra una dosis mínima, y la dosis se aumenta de escala en
ausencia de citotoxicidad limitante de dosis. La determinación y ajuste de una cantidad o dosis eficaz, así como la evaluación de cuándo y cómo realizar dichos ajustes, se conocen por los expertos en la técnica médica.
Para terapias de combinación, se administran anticuerpos anti 5T4, conjugados de anti 5T4/fármaco y/o agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales en cualquier periodo de tiempo adecuado para la realización de la terapia o el diagnóstico pretendido. Por lo tanto, los agentes individuales pueden administrarse de forma sustancialmente simultánea (es decir, como una única formulación o en un intervalo de minutos u horas) o de forma consecutiva en cualquier orden. Por ejemplo, pueden administrarse tratamientos de agente individual en un intervalo de aproximadamente 1 año entre sí, tal como en un intervalo de aproximadamente 10, 8, 6, 4 o 2 meses, o en un intervalo de 4, 3, 2 o 1 semanas o en un intervalo de aproximadamente 5, 4, 3, 2 o 1 días.
Para directrices adicionales con respecto a la formulación, dosis, régimen de administración y resultados terapéuticos medibles, véase Berkow y col. (2000) The Merck Manual of Medical Information, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, Nueva Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology, CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania; Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Div., Nueva York; Hardman y col. (2001) Goodman & Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, The McGraw-Hill Companies, Columbus, Ohio; Speight & Holford (1997) Avery’s Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choices, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, Lippincott, Williams, & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania.
V.F. Terapias de combinación
Los anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco desvelados pueden administrarse como un tratamiento inicial, o para el tratamiento de afecciones que no son sensibles a las terapias convencionales. Además, los anticuerpos anti 5T4 y conjugados anti 5T4/fármaco pueden usarse en combinación con otras terapias (por ejemplo, escisión quirúrgica, radiación, fármacos antineoplásicos adicionales, etc.) para inducir de este modo efectos terapéuticos aditivos o potenciados y/o reducir la hepatocitotoxicidad de algunos agentes antineoplásicos. Los anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención pueden coadministrarse o coformularse con agentes adicionales, o formularse para su administración consecutiva con agentes adicionales en cualquier orden.
Los agentes representativos útiles para terapia de combinación incluyen cualquiera de los fármacos descritos anteriormente en el presente documento como útiles para la preparación de conjugados de anti 5T4/fármaco. Los anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/fármaco de la invención también pueden usarse en combinación con otros anticuerpos terapéuticos y conjugados de anticuerpo/fármaco, incluyendo anticuerpos anti 5T4 distintos de los anticuerpos anti 5T4 desvelados, así como anticuerpos y conjugados que se dirigen a un antígeno diferente. Los anticuerpos representativos que pueden usarse solos o como un conjugado de anticuerpo/fármaco, incluyen anticuerpos anti CD19, anticuerpos anti CD20 (por ejemplo, RITUXAN®, ZEVALIN®, BEXXAR®), anticuerpos anti CD22, anticuerpos anti CD33 (por ejemplo MYLOTARG®), conjugados de anticuerpo anti CD33/fármaco, anticuerpos anti Lewis Y (por ejemplo, Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), anticuerpos anti HER-2 (por ejemplo, HERCEPTIN® (trastuzumab), MDX-210, OMNITARG® (pertuzumab, rhu-MAb 2C4)), anticuerpos anti CD52 (por ejemplo, CAMPATH®), anticuerpos anti EGFR (por ejemplo, ERBITUX® (cetuximab), ABX-EGF (panitumumab)), anticuerpos anti VEGF (por ejemplo, AVASTIN® (bevacizumab)), anticuerpos anti complejo de ADN/histona (por ejemplo, ch-TNT-1/b), anticuerpos anti CEA (por ejemplo, CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, anticuerpos anti CD47 (por ejemplo, 6H9), anticuerpos anti VEGFR2 (o receptor que contiene dominio de inserto de quinasa, KDR) (por ejemplo, IMC-1C11), anticuerpos anti Ep-CAM (por ejemplo, ING-1), anticuerpos anti FAP (por ejemplo, sibrotuzumab), anticuerpos anti DR4 (por ejemplo, TRAIL-R), anticuerpos anti receptor de progesterona (por ejemplo, 2C5), anticuerpos anti CA19.9 (por ejemplo, GIVAREX®) y anticuerpos anti fibrina (por ejemplo, MH-1).
También pueden administrarse conjugados de anticuerpo anti 5T4/fármaco junto con una o más combinaciones de gentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento. Las preparaciones citotóxicas útiles para este fin incluyen CHOPP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona y procarbacina); CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorubicina, procarbacina, bleomicina, vincristina y prednisona); m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina; ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbacina); ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, citarabina, bleomicina y vincristina); MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina); MOPP (mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbacina); ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina y dacarbacina); MOPP (mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbacina) alternando con ABV (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina); MOPP (mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbacina) alternando con ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina y dacarbacina); CHIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbacina, prednisona); IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, etopósido); MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, etopósido); DHAP (dexametasona, citarabina de dosis alta y cisplatino); ESHAP (etopósido, metilprednisolona, citarabina HD y cisplatino); CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbacina, prednisona y bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona); y CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina y prednisona); DHAP (cisplatino, citarabina de dosis alta y dexametasona); CAP (ciclofosfamida, doxorubicina,
cisplatino); PV (cisplatino, vinblastina o vindesina); CE (carboplatino, etopósido); EP (etopósido, cisplatino); MVP (mitomicina, vinblastina o vindesina, cisplatino); PFL (cisplatino, 5-flurouracilo, leucovorina); IM (ifosfamida, mitomicina); IE (ifosfamida, etopósido); IP (ifosfamida, cisplatino); MIP (mitomicina, ifosfamida, cisplatino); ICE (ifosfamida, carboplatino, etopósido); PIE (cisplatino, ifosfamida, etopósido); Vinorelbina y cisplatino; Carboplatino y paclitaxel; CAV (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina); CAE (ciclofosfamida, doxorubicina, etopósido); CAVE (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, etopósido); EP (etopósido, cisplatino); y CMCcV (ciclofosfamida, metotrexato, lomustina, vincristina).
Pueden usarse anticuerpos anti 5T4 y conjugados de anti 5T4/caliqueamicina en combinación con fármacos antineoplásicos sistémicos, tales como epitilonas (BMS-247550, Epo-906), reformulaciones de taxanos (Abraxano, Xyotax), inhibidores de microtubulina (MST-997, TTI-237) o con citotoxinas dirigidas tales como CMD-193 y SGN-15. Los agentes antineoplásicos útiles adicionales incluyen TAXOTERE®, TARCEVA®, GEMZAR® (gemcitabina), 5-FU, AVASTIN®, ERBITUX®, TROVAX®, anatumomab mafenatox, letrazol, docetaxel y antraciclinas.
Para terapias de combinación, se administran un anticuerpo anti 5T4, conjugado de anti 5T4/fármaco y/o uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales dentro de cualquier periodo de tiempo adecuado para la realización de la terapia o el diagnóstico pretendidos. Por lo tanto, los agentes individuales pueden administrarse de forma sustancialmente simultánea (es decir, como una única formulación o en un intervalo de minutos u horas) o de forma consecutiva en cualquier orden. Por ejemplo, pueden administrarse tratamientos de un único agente en un intervalo de aproximadamente 1 año entre sí, tal como en un intervalo de aproximadamente 10, 8, 6, 4 o 2 meses, o en un intervalo de 4, 3, 2 o 1 semanas, o en un intervalo de aproximadamente 5, 4, 3, 2 o 1 días. La administración de un anticuerpo anti 5T4 o conjugado de anti 5T4/caliqueamicina en combinación con un segundo agente terapéutico induce preferentemente un mayor efecto que la administración de uno de ellos solo.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se han incluido para ilustrar modos de la invención. Ciertos aspectos de los siguientes ejemplos se describen con respecto a técnicas y procedimientos que los presentes coinventores han descubierto o contemplado que actúan bien en la práctica de la invención. Estos ejemplos ilustran prácticas de laboratorio convencionales de los coinventores. A la luz de la presente divulgación y el nivel general de experiencia en la técnica, los expertos en la materia apreciarán que se pretende que los siguientes ejemplos sean solamente ejemplares.
Ejemplo 1
Anticuerpos murinos anti 5T4
Se prepararon anticuerpos anti 5T4 en ratones usando antígeno 5T4 humano y procedimientos convencionales para inmunización. Se produjeron líneas celulares de hibridoma que producían los anticuerpos A1, A2 y A3 por fusión de linfocitos B individuales con células de mieloma.
Las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos anti 5T4 A1, A2 y A3 se clonaron usando el sistema de síntesis de ADNc SMART® (Clontech Laboratories Inc. of Mountain View, California) seguido de amplificación por PCR. El ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN total aislado de células de hibridoma A1, A2 o A3, usando oligo(dT) y el oligo SMART® IIA (Clontech Laboratories Inc.) con transcriptasa inversa POWERSCRIPT™ (Clontech Laboratories Inc.). El ADNc se amplificó después por PCR usando un cebador que hibrida con la secuencia de oligo SMART® IIA y el cebador específico de región constante de ratón (Kappa de ratón para la cadena ligera, IgG2a de ratón para la cadena pesada de A1, IgG2b de ratón para la cadena pesada de A2 e IgG1 de ratón para la cadena pesada de A3) con polimerasa VENT® (New England Biolabs Inc. de Ipswich, Massachusetts). Se subclonaron productos de PCR de región variable de cadena pesada y cadena ligera en el vector de expresión pED6 y se determinó la secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es ventajoso porque no se requiere ningún conocimiento previo de la secuencia de ADN. Además, la secuencia de ADN resultante no se altera por el uso de cebadores de PCR degradados.
Las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de cadena pesada de A1, A2 y A3 se exponen como los nucleótidos 58-414 de SEC ID Nº: 1, nucleótidos 55-405 de SEC ID Nº: 5 y nucleótidos 58-423 de SEC ID Nº: 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de A1, A2 y A3 se exponen como los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, los restos 19-135 de SEC ID Nº: 6 y los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de cadena ligera de A1, A2 y A3 se exponen como los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 3, los nucleótidos 67-390 de SEC ID Nº: 7 y los nucleótidos 61-381 de SEC ID Nº: 11, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera de A1, A2 y A3 se exponen como los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, restos 23-130 de SEC ID Nº: 8, y restos 21-127 de SEC ID Nº: 12, respectivamente. Véase también las Figuras 1A-1C.
Para evaluar la novedad de las secuencias de región variable de anti 5T4 A1, A2 y A3, se realizaron búsquedas de BLASTp (para secuencias de consulta de proteínas) usando parámetros por defecto de Expectativa=10, Tamaño de Palabra=3, un filtro de complejidad baja y la matriz BLOSUM62, permitiendo costes de existencia de hueco=11 y extensión=1. Se realizaron búsquedas de BLASTn (para secuencias de consulta de nucleótidos) usando parámetros
por defecto de Expectativa=10, Tamaño de Palabra=11 y un filtro de complejidad baja. Los resultados de búsqueda de BLAST se presentan como una lista de secuencias relacionadas con la secuencia de consulta, clasificadas en orden de valor E, que es un indicador de la significación estadística de coincidencias identificadas en la base de datos. Las secuencias más estrechamente relacionadas con las secuencias de región variable usadas para el análisis de BLAST se identifican en la Tabla 1 (BLASTn) y Tabla 2 (BLASTp).
Tabla 1
Análisis de BLASTn
Secuencia de consulta
Identidad (%) de la Secuencia Objeto más Cercana Descripción de la Secuencia Objeto más Cercana
VH A1 (SEC ID Nº: 1)
97 % gi|31322165|gb|AY169686.1| Precursor de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de Mus musculus clon VGBC1.13, gen, cds parcial
VL A1 (SEC ID Nº: 3)
96 % gi|804922|dbj|D50385.1|MUSIKCVRJ ARNm de Mus musculus para la región variable de cadena kappa de inmunoglobulina, secuencia parcial, línea celular:K3F10
VH A2 (SEC ID Nº: 5)
97 % gi|11612012|gb|AF303853.1|AF303853 ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de Mus musculus clon J558.22, cds parcial
VL A2 (SEC ID Nº: 7)
97 % gi|1556423|emb|X79906.1|MMMABMST2 ARNm de M. musculus para la cadena ligera del anticuerpo monoclonal MST2
VH A3 (SEC ID Nº: 9)
99 % gi|3420272|gb|AF064445.1|AF064445 Gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de Mus musculus (Vh10.2), alelo Vh10.2a, cds parcial
VL A3 (SEC ID Nº:
98 % gi|2906107|gb|AF045512.1|AF045512
11)
Región variable de cadena ligera kappa de anticuerpo monoclonal 9E10 de Mus musculus, ARNm (IgK), cds parcial
Tabla 2
Análisis de BLASTp
Secuencia de consulta
Identidad (%) de la Secuencia Objeto más Cercana Descripción de la Secuencia Objeto más Cercana
VH A1 (SEC ID Nº: 2)
84 % gi|15865327|emb|CAC82228.1| cadena pesada de inmunoglobulina [Mus musculus]
VL A1 (SEC ID Nº: 4)
93 % gi|644862|gb|AAA62143.1| región V de cadena kappa de inmunoglobulina anti integrina alfa 4
VH A2 (SEC ID Nº: 6)
85 % gi|15149453|gb|AAK85298.1| anticuerpo monocatenario HFN7.1 [construcción sintética]
(continuación)
Análisis de BLASTp
Secuencia de consulta
Identidad (%) de la Secuencia Objeto más Cercana Descripción de la Secuencia Objeto más Cercana
VL A2 (SEC ID Nº: 8)
95 % gi|297678|emb|CAA80086.1| región variable de inmunoglobulina [Mus musculus domesticus]
VH A3 (SEC ID Nº: 10)
90 % gi|2906050|gb|AAC04511.1| cadena pesada de anticuerpo monoclonal anti poli(dC) [Mus musculus]
VL A3 (SEC ID Nº: 12)
97 % gi|2906108|gb|AAC04540.1| cadena ligera kappa de anticuerpo monoclonal [Mus musculus]
Ejemplo 2
Especificidad de unión y afinidad de los anticuerpos anti 5T4 murinos
5 Para evaluar la especificidad de unión y afinidad de los anticuerpos A1, A2 y A3, se realizó análisis de BIACORE® usando el antígeno 5T4 humano inmovilizado en una microplaca CM5. La tecnología BIACORE® utiliza cambios en el índice refractario en la capa de superficie tras la unión del anticuerpo con el antígeno 5T4 inmovilizado en la capa. La unión se detecta por resonancia de plasmón superficial (SPR) de luz de láser que refracta de la superficie. El análisis de la velocidad de asociación y velocidad de disociación de la cinética de la señal permite la diferenciación
10 entre interacciones no específicas y específicas. El anticuerpo anti 5T4 H8 se usó como un control. H8 es un anticuerpo IgG1 de ratón monoclonal generado por hibridoma descrito en la Publicación Internacional de PCT Nº WO 98/55607 y en Forsberg y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 124430-12436.
Tabla 3
Resultados del Ensayo BIACORE®
Anticuerpo
KD (M) KA (1/M) kd (1/s) ka (1/Ms)
H8
4,1 X 10-10 2,5 X 109 5,1 X 10-5 1,3 X 105
A1
6,4 X 10-10 1,6 X 109 1,3 X 104 2,0 X 105
A2
1,5 X 10-8 6,5 X 107 8,7 X 10-4 5,6 X 104
A3
2,2 X 10-9 4,6 X 108 5,2 X 10-5 2,4 X 104
15 Los resultados de BIACORE® muestran que los anticuerpos H8 y A1 tienen mayor afinidad por 5T4 en comparación con los anticuerpos A2 y A3. A2 es un anticuerpo de afinidad relativamente baja. Están presentes cisteínas poco habituales en el resto 67 de la región variable de cadena pesada de A1 y el resto 91 de la región variable de cadena pesada de A3. El reemplazo de estos restos con fenilalanina (A1) o tirosina (A3) no alteró las propiedades de unión al anticuerpo o los niveles de expresión.
20 La afinidad de unión de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3 también se ensayó por transferencia de Western usando lisados celulares CT26/5T4, que identificaron unión fuerte con H8, A1 y A3. Véase Figura 2.
La capacidad de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3 para unirse con células que expresan el antígeno 5T4 se ensayó usando separación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células PC14PE6. Todos los anticuerpos mostraron unión específica con células PC14PE6 que expresaban 5T4, sin embargo, el nivel de la unión con A2 fue
25 significativamente inferior al observado para H8, A1 y A3. Véase Tabla 4.
Tabla 4
Resultados del Análisis de FACS
Anticuerpo
Fluorescencia Celular Media
Control (Ab secundario)
4
Control (IgG murino)
4
H8
24
A1
18
A2
7
A3
27
Para evaluar la variabilidad potencial en la producción de anticuerpo, se ensayaron dos preparaciones independientes de A1 y H8. Las propiedades de unión y cinéticas de cada anticuerpo, cuando se compararon a partir de cada preparación, no fueron significativamente diferentes. Véase Figuras 3A-3B.
Ejemplo 3
Internalización de anticuerpos anti 5T4 murinos por células que expresan 5T4
Para evaluar la internalización de los anticuerpos tras su unión con el antígeno 5T4, se determinó la cantidad de anticuerpos H8 y A1 detectados en la superficie celular frente a en el sobrenadante en función del tiempo. Se expusieron células MDAMB435/5T4 no disociadas enzimáticamente (células de cáncer de mama humano) a anticuerpos anti 5T4 durante 1 hora a 4 ºC. Las células se lavaron e incubaron en medio a 37 ºC durante 4 horas o 24 horas. La cantidad de anticuerpo unido a las membranas celulares frente a anticuerpo no unido (es decir, presencia en el sobrenadante) se determinó usando FACS. La desaparición de anticuerpos de 5T4 de la superficie de células MDAMB435/5T4 demuestra la modulación del complejo de antígeno 5T4/anticuerpo en la superficie celular, lo que puede indicar internalización y/o disociación. Véase Figuras 4A-4C.
Ejemplo 4
Mapeo de epítopos usando quimeras de 5T4
Para identificar los epítopos con los que se unen cada uno de los anticuerpos A1, A2, A3 y H8, se realizaron ensayos ELISA usando (1) construcciones de Fc de ectodominio de 5T4 con secuencias suprimidas o mutadas y (2) construcciones quiméricas de 5T4 expresadas de forma transitoria en células COS-1. El ectodominio incluye la región amino terminal, dos repeticiones ricas en leucina y la región hidrófila intermedia. Se prepararon proteínas de fusión que contenían un ectodominio 5T4 y una región constante de Fc de IgG1 humano usando 5T4 de ratón (aminoácidos 1-361), 5T4 de rata (aminoácidos 1-361), 5T4 de mono cynomolgus (aminoácidos 1-355), 5T4 de chimpancé (aminoácidos 1-355) y tití de cola negra (aminoácidos 1-355). Las construcciones quiméricas de 5T4 se representan en la Figura 5. Los resultados de unión se resumen en la Tabla 5, que indica unión específica, unión parcial o falta de unión, por cada uno de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3. Los anticuerpos H8 humanizado y A1, A2 y A3 quiméricos mostraron propiedades de unión similares al H8, A1, A2 y A3 murinos respectivamente.
Basándose en estos resultados, se determinó que el anticuerpo H8 humanizado se une con 5T4 humano entre los restos 173 y 252. H8 humanizado se une con 5T4 con o sin glucosilación ligada a N en el resto 344, lo que confirma que la unión del H8 humanizado con 5T4 humano no es próxima a la membrana. El anticuerpo A1 tiene un primer contacto con 5T4 humano entre los restos 173 y 252 y un segundo contacto con 5T4 humano entre los restos 282 y
361. El anticuerpo A2 se une con 5T4 humano entre los restos 282 y 361. El anticuerpo A3 se une con la primera región de repeticiones ricas en leucina de 5T4 humano entre los restos 83 a 163. Los epítopos unidos con cada anticuerpo se representan en la Figura 7.
Tabla 5
Resultados del Mapeo de Epítopos Usando Fusiones de Fc del Ectodominio de 5T4 y Quimeras de 5T4 de Ratón/Humano
construcción de antígeno 5T4
Anticuerpo
H8
A1 A2 A3
Fc de ectodominio de 5T4 humano
+ + + +
Fc de ectodominio de 5T4 de ratón
- - - -
Fc de ectodominio de 5T4 de rata
- +/ - -
Fc de ectodominio de 5T4 de mono cynomolgus
- + + +
Fc de ectodominio de 5T4 de chimpancé
+ + + +
Fc de ectodominio de 5T4 de tití de cola negra
+/ + + -
83-163 de ser humano/ratón
+ + + -
173-361 de ser humano/ratón
- - - +
173-258 de ser humano/ratón
- +/ + +
282-361 de ser humano/ratón (con o sin enlace a N en la posición 344)
+ +/ - +
(+) unión; (-) sin unión; (+/-) unión parcial
Basándose en la unión diferente observada con ectodominios de 5T4 de ser humano y mono cynomolgus, se realizaron mutaciones dirigidas para distinguir restos que participan en la unión a anticuerpo. La unión del anticuerpo
5 H8 humanizado se ensayó con cada uno de los ectodominios de 5T4 mutados observados en la Tabla 6 a continuación, es decir, ectodominios de 5T4 humanos que incluyen un resto de mono cynomolgus en la posición indicada. Estos resultados mostraron que los restos 213 y 214 del antígeno 5T4 humano son necesarios para el epítopo con el que se une el H8 humanizado.
Tabla 6
Resultados del Mapeo de Epítopos Usando Fusión de Fc/Ectodominio de 5T4 Humano con Mutaciones Dirigidas
mutación
unión de H8 humanizado
E189K
+
V200K
+
L204V
+
R213H
+/-
R213H y R214L
-
() unión; (-) sin unión; (+/-) unión parcial
Además de los ensayos de unión directa, se realizaron ensayos de unión competitiva usando anticuerpo H8 humanizado biotinilado y cada uno de los anticuerpos A1, A2 o A3. No se observó inhibición de la unión con 5T4 humano, lo que apoya que cada uno de A1, A2 y A3 se une con un epítopo de 5T4 que es distinto de con el que se une el anticuerpo H8. Véase Figuras 6A-6.
Ejemplo 5
Mapeo de epítopos usando BIACORE®
También se realizó mapeo de epítopos de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3 usando BIACORE® usando una microplaca CM5 con antígeno 5T4 humano unido. La microplaca se saturó con anticuerpo H8, A1, A2 o A3 y se 5 midió una primera respuesta. Después se saturó la microplaca con un segundo anticuerpo de entre los anticuerpos H8, A1, A2 y A3, y se midió una segunda respuesta. Para múltiples experimentos, la microplaca se regeneró por disociación de los anticuerpos unidos en glicina 10 mM, pH 1,5, seguido de un lavado en tampón. Los resultados se resumen en la Tabla 7 a continuación. Los porcentajes mostrados son las unidades de respuesta medidas tras la unión con un segundo anticuerpo directamente con la microplaca CM5 divididas por las unidades de respuesta 10 medidas tras la unión del segundo anticuerpo con una microplaca CM5 saturada con un primer anticuerpo. Estos resultados muestran que H8, A1, A2 y A3 se unen cada uno con un epítopo distinto en 5T4 humano. Los epítopos unidos con los anticuerpos H8 y A3 están estéricamente cerca entre sí de modo que la velocidad de asociación con el antígeno se reduce cuando se ensaya la unión de H8 en presencia de A3, y viceversa. Se obtuvieron resultados similares usando los anticuerpos quiméricos y humanizados H8, A1, A2 y A3, que se prepararon como se describe
15 en el Ejemplo 7 posteriormente en el presente documento. Véase Tabla 8.
Tabla 7
Resultados de Ensayos de Competición Usando BIACORE® -Porcentaje de Respuesta del Segundo Anticuerpo Después de Saturación con el Primer Anticuerpo
2º anticuerpo
1er anticuerpo
H8
A1 A2 A3
H8
-- 114 % 102 % 85 %
A1
109 % -- 109 % 98 %
A2
99 % 98 % -- 94 %
A3
73 % 104 % 106 % ---
Tabla 8
Resultados de Ensayos de Competición Usando BIACORE® -Porcentaje de Segundo Anticuerpo Unido Después de Saturación con el Primer Anticuerpo
segundo anticuerpo/primer anticuerpo unido
tiempo después de la inyección del segundo anticuerpo (segundos)
19
37,5 75 150 300 600
H8 humanizado/A3 quimérico
44,9 % 57,0 % 69,1 % 79,4 % 86,6 % 91,3 %
A3 quimérico/H8 humanizado
46,2 % 51,2 % 58,4 % 67,5 % 76,2 % 83,6 %
A2 quimérico/A1 quimérico
102,9 % 93,5 % 90,1 % 89,0 % 88,9 % 89,1 %
A1 quimérico/A2 quimérico
92,5 % 90,6 % 91,4 % 92,7 % 93,9 % 95,5 %
A3 quimérico/A1 quimérico
82,1 % 82,0 % 84,5 % 87,8 % 90,8 % 92,8 %
A1 quimérico/A3 quimérico
98,8 % 96,5 % 97,0 % 98,0 % 98,8 % 99,6 %
A3 quimérico/A2 quimérico
92,2 % 88,6 % 89,5 % 91,5 % 93,4 % 94,6 %
A2 quimérico/A3 quimérico
89,2 % 88,4 % 89,8 % 91,5 % 92,9 % 94,3 %
H8 humanizado/A1 quimérico
93,2 % 92,7 % 94,2 % 95,9 % 96,9 % 97,3 %
A1 quimérico/H8 humanizado
92,7 % 92,4 % 93,8 % 95,8 % 97,3 % 98,7 %
H8 humanizado/A2 quimérico
93,8 % 94,0 % 96,0 % 98,1 % 99,8 % 101,3 %
A2 quimérico/H8 humanizado
86,9 % 84,7 % 86,9 % 90,5 % 93,7 % 96,7 %
Los resultados combinados de los estudios de mapeo de epítopos como se determina usando construcciones quiméricas (véase Ejemplo 4) y BIACORE® se presentan en la Figura 7.
Ejemplo 6
Eficacia de los conjugados de anti 5T4/caliqueamicina
5 Se usó una tinción de colorante vital (MTS) para determinar el número de células supervivientes después de la exposición a diversos tratamientos. Se obtuvo MTS (kit de ensayo de proliferación celular no radiactivo) de Promega (Madison, Wisconsin) y se usó de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para cada línea celular se estableció una curva de calibración (número de células frente a densidad óptica después de 2 horas) para estimar una densidad de siembra inicial apropiada. Las células se sembraron después en placas de 96 multipocillos a una
10 densidad de 750 a 5.000 células por pocillo. Inmediatamente después de sembrar, las células se expusieron a diversas concentraciones (0, 0,01, 0,05, 0,1, 1, 10, 100 y 500 ng de equivalentes de caliqueamicina/ml) de caliqueamicina, CMA-676 y conjugados de caliqueamicina de anticuerpos anti 5T4. Después de la determinación del número de células supervivientes 96 horas después de la exposición al fármaco, se calculó la DE50 basándose en los parámetros de regresión logísticos derivados de las curvas de respuesta a dosis. La DE50 se definió como la
15 concentración de fármaco (CalichDMH) que provocó una reducción del 50 % del número de células después de 96 horas de exposición al fármaco. Un equivalente de caliqueamicina (cal. eq.) es la concentración de caliqueamicina proporcionada como una sustancia pura o como un conjugado. Dependiendo de la cantidad de caliqueamicina unida con el anticuerpo (carga farmacológica del anticuerpo), los equivalentes de caliqueamicina que son diferentes pueden indicar diferentes concentraciones de proteínas.
20 Los resultados de los ensayos de MTS se muestran en la Tabla 9. Los conjugados de anticuerpo/caliqueamicina preparados usando los ensayos de anti 5T4 A1 y A3 redujeron sustancialmente la viabilidad de células MDAMB435/5T4. Se calcularon los valores de selectividad comparando la actividad específica del conjugado con la actividad no específica. Es decir, el factor de CalichDMH con respecto a las células que expresaban 5T4 se dividió por el factor de los valores de CalichDMN para células que no expresaban 5T4. Cuando se usa un anticuerpo no
25 específico, por ejemplo hp67.6 (CMA-676), el factor de los valores de CalichDMH son aproximadamente iguales de modo que la selectividad sea 1.
Tabla 9 5
Resultados de Ensayos de MTS
Tratamiento
línea celular
DE50 de MDAMB435/neo (ng/ml)
DE50 de MDAMB435/5T4 (ng/ml)
CalichDMH
3,3 -5,0 5,0 -8,0
huHB-ActBut-CalichDMH
0,4 -0,8 0,08 -0,1
CMA-676
34 -60 50 -100
A1-ActBut-CalichDMH
22 -34 0,4 -0,6
A2-ActBut-CalichDMH
60 40
A3-ActBut-CalichDMH
20 -20 0,3 -20
tratamiento
línea celular
Factor de CalichDMH de MDAMB435/neo
Factor de CalichDMH de MDAMB435/5T4
CalichDMH
1,0 -1,0 1,0 -1,0
huHB-ActBut-CalichDMH
4,0 -12,5 50 -100
CMA-676
0,08 -0,1 0,08 -0,1
A1-ActBut-CalichDMH
0,14 -0,15 13 -13
A2-ActBut-CalichDMH
0,06 0,13
(continuación)
tratamiento
línea celular
Factor de CalichDMH de MDAMB435/neo
Factor de CalichDMH de MDAMB435/5T4
A3-ActBut-CalichDMH
0,17 -0,25 0,4 -17
Selectividad: H8=8; hP67.6=1; A1=93; A3=1,6 CalichDMH, caliqueamicina no conjugada huH8-AcBut-CalichDMH, anticuerpo H8 humanizado conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut) CMA-676, conjugado de anti CD33/caliqueamicina A1-AcBut-CalichDMH, anticuerpo A1 conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut) A2-AcBut-CalichDMH, anticuerpo A2 conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut) A3-AcBut-CalichDMH, anticuerpo A3 conjugado con caliqueamicina usando ácido 4-(4’-acetilfenoxi)butanoico (AcBut)
La citotoxicidad de los conjugados de anti 5T4/caliqueamicina también se ensayó usando un cultivo de células esferoides tridimensional que se asemejaba más estrechamente a un ambiente celular in vivo. Los esferoides se realizaron esencialmente de acuerdo con Yuhas y col. (1977) Cancer Res. 37: 3639-3643. Brevemente, se sembraron 105 células en 5 ml de medio de cultivo en placas de cultivo celular de poliestireno de 60 mm previamente revestidas con 5 ml de agar de uso en cultivo tisular 0,65 % en medio de cultivo (Sigma de St. Louis, Misuri). Las placas se incubaron durante 5-6 días a 37 ºC y en CO2 al 5 % en aire. Se seleccionaron esferoides con un diámetro de 0,2 mm y se colocaron en una placa multipocillo de 24 pocillos. Cada pocillo contenía 0,5 ml de capa inferior de agar, 1 esferoide y 1 ml de capa superior de medio de cultivo. Los esferoides se expusieron después a diversas concentraciones (0, 0,091, 0,365, 1,46, 5,86, 23,44, 93,75 y 375 ng de equivalentes de caliqueamicina/ml) de caliqueamicina, CMA-676 y conjugados de anti 5T4/caliqueamicina preparados usando los anticuerpos anti 5T4 A1 y A3 y un engarce AcBut. Ambos conjugados de anti 5T4/caliqueamicina inhibieron significativamente el crecimiento de células MDAMB435/5T4. Véase Figura 8.
Ejemplo 7
Preparación y propiedades de unión de anticuerpos anti 5T4 quiméricos y humanizados
Se construyeron anticuerpos quiméricos H8, A1, A2 y A3 que tenían secuencias de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de H8 murinas y regiones constantes de cadena pesada de IgG4 humanas y regiones constantes de cadena ligera kappa humanas. La cisteína presente en la posición 67 de la región variable de cadena pesada de A1 se cambió opcionalmente a fenilalanina, y la cisteína presente en la posición 91 de la región variable de cadena pesada de A3 se cambió opcionalmente a tirosina. Estas variantes se exponen en SEC ID Nº: 2 (VH A1) y SEC ID Nº: 10 (VH A3). La presencia o ausencia de secuencias intrónicas y el reemplazo de restos de cisteína no afectó a la expresión del anticuerpo. Para clonar secuencias que codificaban regiones constantes de IgG, se suprimieron opcionalmente secuencias intrónicas.
Se preparó H8 humanizado como se ha descrito en la Publicación Internacional de PCT Nº: WO 2006/031653. Se prepararon anticuerpos A1 humanizados por injertos de CDR como se describe adicionalmente posteriormente en el presente documento. Las CDR de los anticuerpos A1, A2 y A3 murinos se identificaron usando la definición de AbM, que se basa en la variabilidad de secuencia así como la localización de las regiones de bucle estructurales. En general, se seleccionaron marcos conservados aceptores humanos basándose en que fueran sustancialmente similares a las regiones marco conservadas de los anticuerpos murinos, o que fueran más similares a la secuencia consenso de la subfamilia de región variable. También se tuvo en consideración la representación de los loci de marco conservado en seres humanos, de modo que se prefirieron en general secuencias ampliamente representadas frente a secuencias menos habituales. Se realizaron mutaciones adicionales de las secuencias aceptoras de marco conservado humano para restaurar restos murinos que se cree que están implicados en contactos de antígeno y/o restos implicados en la integridad estructural del sitio de unión a antígeno. La secuencia de aminoácidos también puede optimizarse para preferencia codónica de las células CHO y para retirar sitios de enzimas de restricción. Puede usarse un programa de predicción de estructura peptídica para analizar las secuencias de región variable pesada y ligera humanizadas para identificar y evitar sitios de modificación de proteínas post traduccionales introducidos por el diseño de humanización.
Se construyó una región variable de cadena pesada de A1 humanizada (VH A1 versión 1.0) para incluir las CDR de A1 murino injertado en una región marco conservada DP-21 humana (subgrupo VH7, Nº de Referencia CAA43346, SEC ID Nº: 88), que contiene una mutación de marco conservado (S82A) y una retromutación (E46K). Se
prepararon variantes retirando la retromutación (VH A1 versiones 1.1 y 1.2). Se preparó una segunda región variable de cadena pesada de A1 humanizada injertando dos CDR de A1 en una región marco conservada de línea germinal DP-54 humana (VH A1 versión 2.0). Se realizaron seis (6) retromutaciones para producir VH A1 versión 2.1. Como se describe adicionalmente posteriormente, ambas regiones variables de cadena pesada de A1 conservaron las propiedades de unión a 5T4. Las regiones marco conservadas de DP-21 y DP-54 muestran 63 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de su longitud, lo que indica que pueden realizarse numerosos cambios de aminoácidos conservando a la vez la especificidad de unión del anticuerpo, incluyendo la capacidad para unirse con un epítopo particular. Se muestra la similitud de las regiones variables de cadena pesada de A1 humanizadas en la Tabla 10. Se exponen secuencias de nucleótidos representativas que codifican regiones variables de cadena pesada de A1 humanizadas como SEC ID Nº: 48, 50, 53, y 55. Se exponen secuencias de aminoácidos representativas de regiones variables de cadena pesada de A1 humanizadas como SEC ID Nº: 49, 51, 52, 54 y 56. Véase también Figuras 9A-9B.
Se construyó una región variable de cadena ligera de A1 humanizada para incluir las CDR de A1 murino injertadas en regiones marco conservadas de línea germinal humanas DPK24 (subgrupo VKIV), DPK9 (subgrupo VKI), y DPK23 (subgrupo VKIII). Después de la incorporación de una retromutación S67Y en la región variable de cadena ligera de A1 humanizada los marcos conservados preparados con cada uno de estos marcos conservados demostraron unión con 5T4. Véase posteriormente, incluyendo Tabla 13. La región marco conservada de DPK24 muestra 74 % y 73 % de identidad de secuencia de aminoácidos sobre su longitud con DPK9 y DPK23, respectivamente. La región marco conservada DPK9 muestra 74 % de identidad de secuencias de aminoácidos sobre su longitud con DPK23. La similitud de las regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas se muestra en la Tabla 10. La múltiples versiones de regiones marco conservadas variables de cadena ligera humanizadas demuestran que pueden realizarse numerosos cambios de aminoácidos conservando a la vez la especificidad de unión del anticuerpo, incluyendo la capacidad para unirse con un epítopo particular. Se exponen secuencias de nucleótidos representativas que codifican regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas como SEC ID Nº: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 y 75. Se exponen secuencias de aminoácidos representativas de regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas como SEC ID Nº: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 y 76. Véase también Figuras 9C-9F.
Tabla 10
Relación de anticuerpos A1 humanizados
1ª Región variable / 2ª Región variable
Porcentaje de identidad
VL HuA1 v1.1 (SEC ID Nº: 60) / Proteína VL HuA1 v2.4 (SEC ID Nº: 70)
86 %
VL HuA1 v1.1 (SEC ID Nº: 60) / Proteína VL HuA1 v3.1 (SEC ID Nº: 75)
86 %
proteína VL HuA1 v2.4 (SEC ID Nº: 70) / proteína VL HuA1 v3.1 (SEC ID Nº: 75)
85 %
proteína VH HuA1 v1.1 (SEC ID Nº: 52) / proteína VH HuA1 v2.0 (SEC ID Nº: 54)
78 %
Se diseñaron anticuerpos A2 y A3 humanizados usando una estrategia similar. Se exponen secuencias de aminoácidos representativas de regiones variables de cadena pesada de A2 humanizadas y regiones variables de cadena ligera de A2 humanizadas como SEC ID Nº: 77-78 y SEC ID Nº: 79-80, respectivamente. Véase también Figura 9G. Se exponen secuencias de aminoácidos representativas de regiones variables de cadena pesada de A3 humanizadas y regiones variables de cadena ligera de A3 humanizadas como SEC ID Nº: 81-82 y SEC ID Nº: 83-84, respectivamente. Véase también Figura 9H.
Para evaluar la novedad de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de A1, A2 y A3 humanizadas, se realizaron análisis de BLASTn y BLASTp como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 11.
Tabla 11
Análisis de BLASTn y BLASTp
Secuencia de consulta
Identidad (%) de Secuencia objeto más cercana Descripción de la secuencia objeto más cercana
ADN de VL A1 humanizada versión 1.1 (SEO ID Nº: 59)
83 %* DEFINICIÓN ARNm parcial de Homo sapiens para región variable de cadena kappa de inmunoglobulina (gene IGKV2) REFERENCIA AM040532
Proteína VL A1 humanizada versión 1.1 (SEC ID Nº: 60)
82 % DEFINICIÓN precursor B17 de región V-IV de cadena kappa de Ig REFERENCIA P06314
ADN de VL A1 humanizada versión 2.4 (SEC ID Nº: 69)
85 %* DEFINICIÓN ARNm de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina anti virus de la rabia clon SC4064 de Homo sapiens, Cds completo. REFERENCIA AY942044
Proteína VL A1 humanizada versión 2.4 (SEC ID Nº: 70)
92 % DEFINICIÓN región V de cadena kappa de inmunoglobulina humanizada anti integrina alfa 4. REFERENCIA AAA62146
ADN de VL A1 humanizada versión 3.1 (SEC ID Nº: 75)
84 %* DEFINICIÓN ARNm de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina anti toxoide del tétanos clon 136e06 de Homo sapiens (IGL@), cds parcial. REFERENCIA AY867377
Proteína VL A1 humanizada versión 3.1 (SEC ID Nº: 76)
84 % DEFINICIÓN anticuerpo scFv anti-Burkholderia mallei [Construcción sintética]. REFERENCIA ABI97018
ADN de VH A1 humanizada versión 1.1 (SEC ID Nº: 50)
88 %* DEFINICIÓN ARNm de región variable de cadena pesada de IgA ID:CLL097 de Homo sapiens, Cds parcial. REFERENCIA AF021940
Proteína VH A1 humanizada versión 1.1 (SEC ID Nº: 51)
90 % DEFINICIÓN región variable de cadena pesada de IgA [Homo sapiens]. REFERENCIA AAC09074
ADN de VH A1 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 53)
81 %* DEFINICIÓN ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina clon 23u-45 de Homo sapiens (IGH) cds parcial. REFERENCIA AF062241
(continuación)
Análisis de BLASTn y BLASTp
Secuencia de consulta
Identidad (%) de Secuencia objeto más cercana Descripción de la secuencia objeto más cercana
Proteína VH A1 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 54)
77 % DEFINICIÓN cadena D, Información sobre la señalización Erbb de la estructura del complejo Erbb2-Pertuzumab. REFERENCIA 1S78_D
Proteína VL A2 humanizada versión 1.0 (SEC ID Nº: 79)
87 % DEFINICIÓN cadena A, estructura cristalina del fragmento Fab de una aglutinina fría Igm monoclonal humana. REFERENCIA 1QLR_A
Proteína VL A2 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 80)
83 % DEFINICIÓN cadena ligera de inmunoglobulina kappa 1 [Homo sapiens]. REFERENCIA AAD29608
Proteína VH A2 humanizada versión 1.0 (SEC ID Nº: 77)
88 % DEFINICIÓN cadena A, la estructura cristalina de un anticuerpo humanizado Fv 528. REFERENCIA 1WT5_A
Proteína VH A2 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 78)
78 % DEFINICIÓN cadena D, información sobre la señalización de Erbb de la estructura del complejo Erbb2-Pertuzumab. REFERENCIA 1S78_D
Proteína VL A3 humanizada versión 1.0 (SEC ID Nº: 83)
85 % DEFINICIÓN región VLJ de cadena ligera kappa de inmunoglobulina [Homo sapiens]. REFERENCIA BAC01708
Proteína VL A3 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 84)
90 % DEFINICIÓN HerMel [construcción sintética]. REFERENCIA CAL47329
Proteína VH A3 humanizada versión 1.0 (SEC ID Nº: 81)
79 % DEFINICIÓN proteína Igh-1a [Mus musculus]. REFERENCIA AAH80671
Proteína VH A3 humanizada versión 2.0 (SEC ID Nº: 82)
77 % DEFINICIÓN proteína Igh-1a [Mus musculus]. REFERENCIA AAH80671
* Cuando la cobertura de consulta = 100 %
Las Figuras 10A-10B muestran secuencias de región variable de cadena pesada adicionales que pueden usarse como marcos conservados para la preparación de anticuerpos anti-5T4 A1, A2 y A3. Las Figuras 11-13 muestran
5 secuencias de región variable de cadena ligera adicionales que pueden usarse como un marco conservado para la preparación de anticuerpos anti-5T4 A1, A2 y A3 humanizados. La Figura 14 muestra regiones constantes representativas que pueden usarse para la preparación de anticuerpos anti-5T4 A1, A2 y A3 humanizados y quiméricos.
Para evaluar la especificidad y afinidad de unión de los anticuerpos H8, A1, A2 y A3 quiméricos y humanizados, se 10 realizó análisis de BIACORE® usando antígeno 5T4 humano inmovilizado en una microplaca CM5. Véase Ejemplo
2. Los resultados para anticuerpos A1, A2 y A3 quiméricos se muestran en la Tabla 12 dad a continuación.
Tabla 12
Resultados de ensayo de BIACORE®
Anticuerpo
KD (M) KA (1/M) kd (1/s) ka (1/Ms)
H8 humanizado
1,5 X 10-10 6,5 X 109 4,0 X 10-5 2,6 X 105
A1 Quimérico
4,4 X 10-10 2,3 X 109 6,7 X 10-5 1,5 X 105
A2 Quimérico
1,8 X 10-9 5,7 X 108 2,5 X 10-4 1,4 X 105
A3 Quimérico
1,8 X 10-10 5,4 X 109 1,0 X 10-5 5,4 X 104
A1 Quimérico + C67F
3,8 X 10-10 2,6 X 109 6,3 X 10-5 1,7 X 105
A3 Quimérico + C91Y
5,9 X 10-9 1,7 X 109 1,6 X 10-5 2,7 X 104
En general, la quimerización/humanización aumentó la afinidad de H8, A1, A2 y A3 por 5T4 humano. Compárese Tabla 3. El aumento de las afinidades de unión parece resultar principalmente de una disociación más lenta del 5 anticuerpo y el antígeno en lugar de una asociación más rápida. Los anticuerpos A2 y A3 quiméricos mostraron las propiedades de unión más mejoradas después de la quimerización.
Todas las regiones variables de cadena pesada de A1 humanizadas conservaron las propiedades de unión con 5T4 además, la retirada de la retromutación K46 de la región variable de cadena pesada de A1 humanizada no afectó a las propiedades de unión con 5T4. Las regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas mostraron 10 propiedades de unión con 5T4 deterioradas. Las regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas construidas usando marcos conservados de DPK9 y DPK23 se unieron con 5T4 con mayor afinidad que las regiones variables de cadena ligera de A1 humanizadas construidas usando marcos conservados de DPK24. Se incorporaron retromutaciones para restaurar y/u optimizar la unión con 5T4. El reemplazo del resto de serina en la posición 67 con un resto de tirosina, como se ve en la región marco conservada de A1 murina, restauró completamente las
15 propiedades de unión a antígeno 5T4. Véase Tabla 13.
Tabla 13
Inhibición de la unión del anticuerpo A1 quimérico biotinilado con 5T4 humano por ELISA
Anticuerpo Versión A1
CI50
A1 Quimérico
16-20 nM
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v1.1
>1 M
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v1.1
28 nM
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v2.0
>1 M
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v2.4
16 nM
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v3.0
>1 M
VH huA1 v2.0 + VL huA1 v3.1
27 nM
huA1, A1 humanizado v, versión
Ejemplo 8
Reactividad cruzada entre especies de anticuerpos Anti-5T4
20 La reactividad entre especies de anticuerpos anti-5T4 desvelados en el presente documento se ensayó para determinar especies relevantes para estudios de eficacia in vivo y análisis de toxicología. La correlación de la
actividad de unión y la relación de los diferentes ectodominios de 5T4 también se usaron para describir adicionalmente el epítopo con el que se une cada anticuerpo. Se realizaron ensayos de unión usando ectodominios de 5T4 de diversas especies fusionados con Fc IgG1 humano. El porcentaje de identidad de cada región de ectodominio con 5T4 humano se muestra en la Tabla 14.
Tabla 14
Relación de 5T4 de diferentes especies
Especie
Porcentaje de identidad con 5T4 humano Aminoácidos del Ectodominio
Ser humano
100 1-355
Ratón
84,0 1-361a
Rata
83,1 1-361a
Chimpancé (secuencia parcial-396/420 aminoácidos)
99,5 1-355
Mono Cynomolgus
96,7 1-355
Tití de cola negra (secuencia parcial-367/420 aminoácidos)
94,6 1-355
Perro
87,9 1-355
Vaca
86,9 1-355
a Contiene repetición directa de 6 aminoácidos dentro del dominio hidrófilo
Las secuencias de longitud completa o parciales de 5T4 de ser humano, ratón, rata, perro y vaca se han desvelado previamente como los Nº de referencia de GenBank Z29083 (ser humano, SEC ID Nº: 87), AJ012160 (ratón), BC087011 (rata), XM539020 (perro) y XM593502 (vaca). Se generó una secuencia parcial virtual de 5T4 de
10 chimpancé usando un alineamiento de ARNm y secuencias genómicas. Se aislaron ácidos nucleicos que codificaban proteínas de 5T4 de mono cynomolgus y tití de cola negra. Se muestran las secuencias de aminoácidos de estos antígenos 5T4 adicionales en la Figura 15 y también se exponen como SEC ID Nº: 86 (mono cynomolgus) y SEC ID Nº: 85 (tití de cola negra).
Para evaluar la novedad de las secuencias de mono cynomolgus y tití de cola negra se realizaron análisis de BLAST
15 como se ha descrito en el Ejemplo 2. Cuando se usó la secuencia de aminoácidos de 5T4 de tití de cola negra de longitud completa como una secuencia de consulta, la secuencia objeto más cercana se identificó como 5T4 humano (Nº de referencia de GenBank NP_006661.1), con 94 % de identidad (302/320 aminoácidos). Las secuencias también difirieron en el extremo carboxilo terminal, no alineándose los aminoácidos 1-19 de SEC ID Nº: 85 con la secuencia objeto más cercana. Cuando se usó la secuencia de aminoácidos de 5T4 de mono cynomolgus de
20 longitud completa como una secuencia de consulta, se identificó la secuencia objeto no virtual más cercana como un precursor de glucoproteína de trofoblastos también de mono cynomolgus (Nº de Referencia de GenBank BAE00432.1), con 99 % identidad (364/366 aminoácidos). Las secuencias también difirieron en el extremo carboxilo terminal, no alineándose los aminoácidos 1-25 de SEC ID Nº: 86 con la secuencia objeto no virtual más cercana.
Para ensayar la unión de anticuerpos anti-5T4, se transfectaron transitoriamente con proteínas de fusión
25 Fc/ectodominio de 5T4 células COS-1, y se realizaron ensayos ELISA. Se usaron anticuerpos IgG4 e IgG1 humanos no relevantes, como controles. La reactividad entre especies de los anticuerpos anti-5T4 se resume en la Tabla 15.
Tabla 15
Reactividad cruzada de anticuerpos Anti-5T4 (DE50 en nM)
huH8 4
huH8 1 ChiA1 4 ChiA2 4 ChiA3 4
Ser humano
0,19 0,20 0,28 0,21 0,20
Chimpancé
0,19 0,22 0,27 0,22 0,20
Tití de cola negra
+/ +/ 0,24 0,22 -
(continuación)
Reactividad cruzada de anticuerpos Anti-5T4 (DE50 en nM)
huH8 4
huH8 1 ChiA1 4 ChiA2 4 ChiA3 4
mono cynomolgus
- - 0,18 0,18 0,23
rata
- - +/ - -
ratón
- - - - -
huH8 4, anticuerpo H8 humanizado que tiene regiones constantes de lgG4 huH8 1, anticuerpo H8 humanizado que tiene regiones constantes IgG1 ChiA1 4, anticuerpo A1 quimérico que tiene regiones constantes IgG4 ChiA2 4, anticuerpo A2 quimérico que tiene regiones constantes IgG4 ChiA3 4, anticuerpo A3 quimérico que tiene regiones constantes IgG4 (+/-), unión parcial (-), sin unión
LISTADO DE SECUENCIAS
5 <110> WYETH Boghaert, Erwin Damle, Nitin Hamann, Philip Khandke, Kiran
10 Kunz, Arthur Marquette, Kimberly Tchistiakova, Lioudmila Gill, Davinder Sreekumar, Kodangattil
<120> ANTICUERPOS ANTI-5T4 Y USOS DE LOS MISMOS
<130> 040000-0359813
20 <140>
<141>
<150> 60/891.248
<151> 25
<150> 60/781.346
<151>
<160> 99 30
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1 35 <211> 414
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
40 <221> misc_feature
<222> (1) .. (57)
<223> secuencia líder
<220>
45 <221> misc_feature
<222> (58) .. (414)
<223> región variable de cadena pesada
<220>
<221> misc_difference
<222> (260) .. (260)
<223> n es g o t
<400> 1
<210> 2
<211> 138 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (1) .. (19)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (20) .. (138)
<223> región variable de cadena pesada
<220>
<221>
MISC_FEATURE 30 <222> (45) .. (54)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 35 <222> (69) .. (85)
<223> CDR2
<220>
<221>
MUTÁGENO 40 <222> (87)..(87)
<223> Xaa es cisteína (C) o fenilalanina (F); esta es la posición 67 con la numeración de acuerdo con Kabat
<220>
<221>
MISC_FEATURE 45 <222> (118)..(127)
<223> CDR3
<400> 2
<210> 3
<211> 381 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (1) .. (60)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (61) .. (381)
<223> región variable de cadena ligera
<400> 3
<210> 4
<211> 127 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (1)..(20)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (21)..(127)
<223> región variable de cadena ligera
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (44) .. (54)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (70) .. (76)
<223> CDR2
<220>
<221>
MISC_FEATURE 30 <222> (109)..(117)
<223> CDR3
<400> 4
<210> 5
<211> 405 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (1) .. (54)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (55) .. (405)
<223> región variable de cadena pesada
<400> 5
<210> 6
<211> 135
<212> PRT 5 <213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(1) .. (18) 10 <223> secuencia líder
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(19) .. (135) 15 <223> región variable de cadena pesada
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(44) .. (53) 20 <223> CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(68) .. (84) 25 <223> CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(117) .. (124) 30 <223> CDR3
<400> 6
<210> 7
<211> 390 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (1) .. (66)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (67)..(390)
<223> región variable de cadena ligera
<400> 7
<210> 8
<211> 130 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (1) .. (22)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (23) .. (130)
<223> región variable de cadena ligera
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (46) .. (56)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (73) .. (79)
<223> CDR2
<220>
<221>
MISC_FEATURE 30 <222> (112)..(120)
<223> CDR3
<400> 8
<210> 9
<211> 423 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (1) .. (57)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (58) .. (423)
<223> región variable de cadena pesada
<220>
<221>
misc_difference 20 <222> (347)..(347)
<223> n es g o a
<400> 9
<210> 10
<211> 141 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (1) .. (19)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (20) .. (141)
<223> región variable de cadena pesada
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (45) .. (54)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (69) .. (87)
<223> CDR2
<220>
<221>
MUTÁGENO 30 <222> (116)..(116)
<223> Xaa es cisteína (C) o tirosina (Y); esta es la posición 91 con la numeración de acuerdo con Kabat
<220>
<221>
MISC_FEATURE 35 <222> (120)..(130)
<223> CDR3
<400> 10
<210> 11
<211> 381 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (1) .. (60)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (61) .. (381)
<223> región variable de cadena ligera
<400> 11
<210> 12
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1) .. (20)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
MISC_FEATURE 5 <222> (21) .. (127)
<223> región variable de cadena ligera
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (44) .. (54)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (70) .. (76)
<223> CDR2
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (109)..(117)
<223> CDR3
<400> 12
<210> 13
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19 10 <211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19 15
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24 10 <211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24 15
<210> 25
<211> 30 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> secuencia consenso de marco conservado 1 de región variable de cadena pesada VH1 humana 10
<400> 25
15 <210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> marco conservado 2 de región de variable de cadena pesada VH1 humana
<400> 26
<210> 27
<211> 32
<212> PRT 30 <213> Artificial
<220>
<223> marco conservado 3 de región de variable de cadena pesada VH1 humana
35 <400> 27
<210> 28
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
10 <210> 29
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 29
<210> 30
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32 10
<210> 33
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 357 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 48
15 <210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (23) .. (35)
<223> CDR1
<220>
<221>
MISC_FEATURE 30 <222> (50) .. (66)
<223> CDR2
<220>
<221>
MISC_FEATURE 35 <222> (99)..(108)
<223> CDR3
<400> 49 <210> 50
<211> 357 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 50
15 <210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 51
<210> 52
<211> 119
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
15 <400> 52 <210> 53
<211> 357 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 53
15 <210> 54
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 54
<210> 55
<211> 357 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 55
15 <210> 56
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 56
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 10 <223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 57
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial 20
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 58
5 <210> 59
<211> 321
<212> PRT
<213> Artificial
10 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 59
<210> 60
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 60
15 <210> 61
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 61
<210> 62
<211> 107
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
20 <400> 62
<210> 63
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 63
<210> 64 10 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 15 <223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 64
<210> 65
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial 25
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 65
5 <210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
10 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 66
<210> 67
<211> 321
<212> ADN 20 <213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
25 <400> 67 <210> 68
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 68
15 <210> 69
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 69
<210> 70
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 70
15 <210> 71
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 71
<210> 72
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 72
15 <210> 73
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 73
<210> 74
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 74
15 <210> 75
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 75
<210> 76
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 76
15 <210> 77
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 77
<210> 78
<211> 117 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 78 <210> 79
<211> 108 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 79 <210> 80
<211> 108 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 80 <210> 81
<211> 122 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 81
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial 5
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón
<400> 82 10
<210> 83
<211> 107 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 20
<400> 83 <210> 84
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de secuencias humanas y de ratón 10
<400> 84 <210> 85
<211> 367 5 <212> PRT
<213> títi
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (1)..(29)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
mat_peptide 15 <222> (30)..(367)
<223> péptido maduro -secuencia parcial
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (30)..(356)
<223> ectodominio
<400> 85
<210> 86
<211> 420 5 <212> PRT
<213> mono Cynomologous
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (1) .. (29)
<223> secuencia líder
<220>
<221>
mat_peptide 15
<222> (30)..(420)
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (30)..(356)
<223> ectodominio
<400> 86
<210> 87
<211> 420
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
<210> 88
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
<210> 89
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
<210> 90
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
<210> 91
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
<210> 93
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
<210> 94
<211> 95 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
<210> 95
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
<210> 97
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
<210> 98
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99 10

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo anti-5T4 aislado, o fragmento del mismo que comprende un dominio de unión a antígeno de, o que se une con el mismo epítopo de 5T4 que, un anticuerpo que comprende:
    (a)
    una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 4,
    (b)
    una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 12,
    (c)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4; o
    (d)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.
  2. 2.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, siendo el anticuerpo aislado un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo especifico de dominio, un anticuerpo de un único dominio o una proteína de fusión.
  3. 3.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo monoclonal murino.
  4. 4.
    El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, teniendo el anticuerpo aislado una afinidad de unión por el antígeno 5T4 humano de al menos 1 x 10-7 M a 1 x 10-12 M como puede determinarse por análisis de resonancia de plasmón superficial.
  5. 5.
    El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, dirigiéndose el anticuerpo aislado específicamente a células que expresan 5T4 in vivo.
  6. 6.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, comprendiendo el anticuerpo monoclonal murino una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2 o restos 20141 de SEC ID Nº: 10.
  7. 7.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, comprendiendo el anticuerpo monoclonal murino una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4, o los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.
  8. 8.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, comprendiendo el anticuerpo monoclonal murino una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº:
  9. 4.
  10. 9.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, comprendiendo el anticuerpo monoclonal murino una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12.
  11. 10.
    El anticuerpo aislado de la reivindicación 2, que es un anticuerpo anti-5T4 quimérico o humanizado.
  12. 11.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 10, que comprende regiones constantes derivadas de regiones constantes humanas.
  13. 12.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 11, en el que la región constante de cadena ligera humana deriva de la región constante de cadena ligera kappa humana.
  14. 13.
    El anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 11, en el que la región constante de cadena pesada humana deriva de una región constante de cadena pesada IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana.
  15. 14.
    El anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13, en el que la región constante de cadena pesada IgG4 humana comprende prolina en la posición 241.
  16. 15.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que tiene al menos una región variable de cadena ligera o al menos una región variable de cadena pesada que comprende
    (a)
    regiones marco conservadas que comprenden restos de una región marco conservada de anticuerpo humano; y
    (b)
    una o más CDR de la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 o 12, o una o más CDR de la región
    variable de cadena pesada SEC ID Nº: 2 o 10.
  17. 16. El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 15, en el que los restos humanos son restos marco conservados humanos seleccionados del grupo que consiste en:
    (a)
    una región marco conservada de cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada del grupo que consiste en DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b y VI-3 (VH1-03), DP-15 y V1-8 (VH1-08), DP-14 y V1-18 (VH1-18), DP-5 y V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 y YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH 1-e), DP-3 y DA-8 (VH 1f);
    (b)
    una región marco conservada de cadena ligera de anticuerpo humano de un clon de línea germinal de subgrupo IV DPK24, un subgrupo VIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK 21), o un clon de línea germinal de subgrupo VI (DPK9, DPK1, 02, DPK-7);
    (c)
    una secuencia consenso de una región marco conservada de cadena pesada de (a); y
    (d)
    una región marco conservada que es al menos 63 % idéntica a una región marco conservada de (a)-(c).
  18. 17.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 15 o 16 que comprende al menos dos CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 10 o 12.
  19. 18.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 17, en el que la cadena ligera del anticuerpo quimérico o humanizado comprende una región variable que comprende al menos dos de las tres CDR de una cualquiera de SEC IDNº: 4 o 12.
  20. 19.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 18, en el que la cadena ligera del anticuerpo quimérico o humanizado comprende una región variable que comprende tres CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 4 o 12.
  21. 20.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 15, en el que la cadena pesada del anticuerpo quimérico o humanizado comprenden una región variable que comprende al menos dos de tres CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2 o 10.
  22. 21.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 20, en el que la cadena pesada del anticuerpo quimérico o humanizado comprende una región variable que comprende tres CDR de una cualquiera de SEC ID Nº: 2 o 10.
  23. 22.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 15, que comprende las CDR de SEC ID Nº: 2 y 4, o las CDR de SEC ID Nº:10 y 12.
  24. 23.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22, en el que la secuencia de región variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico o humanizado comprende:
    (a)
    una secuencia de aminoácidos de los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2;
    (b)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2;
    (c)
    una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10;
    (d)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10;
    (e)
    una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 49, 51, 52, 54, 56, 81 u 82;
    (f)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a SEC ID Nº: 51;
    (g)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 78 % idéntica a SEC ID Nº: 54;
    (h)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a SEC ID Nº: 81; o
    (i)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 78 % idéntica a SEC ID Nº: 82.
  25. 24.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 10, en el que la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico o humanizado comprende:
    (a)
    una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4;
    (b)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4;
    (c)
    una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12;
    (d)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % idéntica a los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12;
    (e)
    una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 83 u 84;
    (f)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 83 % idéntica a SEC ID Nº: 60;
    (g)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 93 % idéntica a SEC ID Nº: 70;
    (h)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a SEC ID Nº: 76;
    (i)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEC ID Nº: 83; o
    (j)
    una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a SEC ID Nº: 84.
  26. 25.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 10, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
    (i)
    una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 4 y los restos 20-138 de SEC ID Nº: 2,
    (ii)
    SEC ID Nº: 58 y una cualquiera de SEC ID Nº: 49, 51, 52, 54, 56,
    (iii) SEC ID Nº: 60 y una cualquiera de SEC ID Nº: 49, 51, 52, 54, 56, y
    (iv) SEC ID Nº: 54 y una cualquiera de SEC ID Nº: 60, 62, 70, 74, 76.
  27. 26.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 25, que comprende una región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 54 y una región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 70.
  28. 27.
    El anticuerpo quimérico o humanizado de la reivindicación 10, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 12 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de los restos 20-141 de SEC ID Nº: 10.
  29. 28.
    Un anticuerpo aislado que se une específicamente con un epítopo de 5T4 humano que comprende los restos 173-252 y 276-355 de SEC ID Nº: 87.
  30. 29.
    Un anticuerpo aislado que se une específicamente con un epítopo de 5T4 humano que comprende los aminoácidos 83-163 de SEC ID Nº: 87.
  31. 30.
    Un conjugado de anticuerpo/fármaco para suministro farmacológico que comprende:
    (a)
    el anticuerpo aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29; y
    (b)
    un fármaco, que está unido directa o indirectamente con el anticuerpo aislado.
  32. 31.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 30, en el que el fármaco es un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en una citotoxina, un radioisótopo, un agente inmunomodulador, un agente anti angiogénico, un agente anti proliferativo, un agente proapoptótico, un agente quimioterapéutico y un ácido nucleico terapéutico.
  33. 32.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 31, en el que el agente terapéutico es una citotoxina y en el que la citotoxina es un antibiótico, un inhibidor de polimerización de tubulina, un agente alquilante, un inhibidor de síntesis de proteínas, un inhibidor de proteína quinasa, un inhibidor de fosfatasa, un inhibidor de topoisomerasa o una enzima.
  34. 33.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 31, en el que la citotoxina es un antibiótico y en el que el antibiótico es caliqueamicina.
  35. 34.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 33, en el que la caliqueamicina es un derivado de Nacetilo o análogo de disulfuro de caliqueamicina.
  36. 35.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 34, en el que la caliqueamicina es N-acetil-y caliqueamicina.
  37. 36.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, en el que el fármaco está unido al anticuerpo mediante un engarce.
  38. 37.
    El conjugado de anticuerpo/fármaco de la reivindicación 36, en el que el engarce se selecciona del grupo que consiste en ácido 4-(4’acetilfenoxi)butanoico (AcBut), ácido 3-acetilfenil ácido (AcPac), ácido 4-mercapto-4-metilpentanoico (Amida), y derivados de los mismos.
  39. 38.
    Uso de un conjugado de anticuerpo anti-5T4/fármaco que comprende (i) el anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, y (ii) un agente terapéutico que está unido con el anticuerpo aislado directa o indirectamente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer positivo para 5T4.
  40. 39.
    El uso de la reivindicación 38, en el que el conjugado de anticuerpo anti-5T4/fármaco es un conjugado de anticuerpo anti-5T4/caliqueamicina, y que comprende además administrar un segundo agente terapéutico, en el que el conjugado de anti-5T4/caliqueamicina y el segundo agente terapéutico se administran de forma concurrente o consecutiva en cualquier orden.
  41. 40.
    Una célula que expresa un anticuerpo anti-5T4 o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
  42. 41.
    Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-5T4 o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
    FIG. 1A
    VL A1 murina
    FIG. 1B
    VL A2 murina
    FIG. 1C
    VL A3 murina
    FIG. 9A
    ADN de VH A1 humanizada-versión 1.0
    Proteína VH A1 humanizada -versión 1.0
    ADN de VH A1 humanizada -versión 1.1
    Proteína VH A1 humanizada -versión 1.1
    VH A1 humanizada -versión 1.2 (con injertos de CDR en la línea germinal DP-21, subgrupo VH7)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas K46, C67, S82a y N82a.
    FIG. 9B
    ADN de VH A1 humanizada -versión 2.0
    Proteína VH A1 humanizada -versión 2.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DP-54, subgrupo VH3)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas K46, M48, G49, C67, L71, T73, T74, A75, S76 y A78.
    ADN de VH A1 humanizada -versión 2.1
    Proteína VH A1 humanizada -versión 2.1
    FIG. 9C
    ADN de VL A1 humanizada -versión 1.0
    Proteína VL A1 humanizada -versión 1.0 (con injertos de CDR en la línea germinal DPK24, subgrupo VKIV)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas S43, N49, N60, T63, Y67, F73, L85 y F87.
    ADN de VL A1 humanizada -versión 1.1
    Proteína VL A1 humanizada -versión 1.1
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.0
    FIG. 9D
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.0 (con injertos de CDR en la línea germinal de DPK9, subgrupo VKI)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas V3, Q42, S43, N49, N60, Y67, F73, L85 y F87.
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.1
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.1
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.2
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.2
    FIG. 9E
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.3
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.3
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.4
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.4
    ADN de VL A1 humanizada -versión 2.5
    Proteína VL A1 humanizada -versión 2.5
    FIG. 9F
    ADN de VL A1 humanizada -versión 3.0
    Proteína VL A1 humanizada -versión 3.0 (con injertos de CDR en la línea germinal DPK23, subgrupo VKIII)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas F10, S43, N49, V58, N60, Y67, F73, L85 y F87.
    ADN de VL A1 humanizada -versión 3.1
    Proteína VL A1 humanizada -versión 3.1
    FIG. 9G
    VH huA2 versión 1.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DP-75, subgrupo VH1)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas K38, R40, T41 I48, I69, T75, Q81, S82b; E85 y M94.
    VH huA2 versión 2.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DP-54, subgrupo VH3)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas K38, R40, T41, I48, G49, A67, A71, K73, S74, S76, A78 y M94.
    VL huA2 versión 1.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DPK20, subgrupo VKIII)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas S43, W47, A60, S70, S77, M78 y A80
    VL huA2 versión 2.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DPK9, subgrupo VKI)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas V3, L4, S43, W47, S70 y M78.
    FIG. 9H
    VH huA3 versión 1.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DP-29, subgrupo VH3)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas A49, Q75, S76, M89, C91 y V93.
    VH huA3 Versión 2.0 (con injertos de CDR en la linea germinal DP-54, subgrupo VH3)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas D73, Q75, S76, M89, C91 y V93.
    VL huA3 versión 1.0 (con injertos de CDR en la línea germinal DPK24, subgrupo VKIV)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas S43, D85 y F87
    VL huA3 versión 2.0 (con injertos de CDR en la línea germinal DPK9, subgrupo VKI)
    Cualquiera de los siguientes aminoácidos podría sustituirse en estas posiciones designadas 3V, Q42, S43, D60, D85 y F87.
    FIG. 10B
    Secuencias de aminoácidos de genes de línea germinal humana del subgrupo VH 7
    DP-21 (VH 7) Nº de referencia de GenBank CAA43346 (SEC ID Nº: 88)
    Secuencia de aminoácidos de genes de línea germinal humana del subgrupo VH 3
    DP-54 (VH 3-07) Nº de referencia de GenBank AB019440 (SEC ID Nº: 89)
    DP-47 (VH3-23) Nº de referencia de GenBank AB019439 (SEC ID Nº: 90)
    DP-49 (VH3-30) Nº de referencia de GenBank. AB019439 (SEC ID Nº: 91)
    DP-53 (VH3-74) Nº de referencia de GenBank AB019437 (SEC ID Nº: 92)
    DP-48 (VH3-13) Nº de referencia de GenBank AB019440 (SEC ID Nº: 93)
    FIG. 13
    Secuencias de aminoácidos de genes de línea germinal humana del subgrupo Vk I
    DPK9 (O12, Vk 1) Nº de referencia de GenBank. X59315 (SEC ID Nº: 94)
    O2 (O2, Vk 1) Nº de referencia de GenBank X59312 (SEC ID Nº: 95)
    DPK1 (Vk I,)18) Nº de referencia de GenBank M64856 (SEC ID Nº: 96)
    DPK 7 (Vk I, L15) Nº de referencia de GenBank K01323 (SEC ID Nº: 97)
    Secuencia de aminoácidos de genes de línea germinal humana del subgrupo Vk IV
    DPK24 (B3, VklV) Nº de referencia de GenBank Z00023 (SEC ID Nº: 98)
    Secuencias de aminoácidos de genes de linea germinal humana del subgrupo Vk III
    DPK23 (Vk-III, L25) Nº de referencia de GenBank X72820 (SEC ID Nº: 99)
    FIG. 14
    IgG4 humano_mutado (mutación de bisagra S241P) (SEC ID Nº: 45)
    IgG1 humano (SEC ID Nº: 46)
    Kappa humano (SEC ID Nº: 47)
    FIG. 15
    5T4 de tití de cola negra
    5T4 de mono Cynomolgous
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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006350220A1 (en) * 2005-12-23 2008-05-08 Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-hyperproliferative therapies targeting HDGF
AR059809A1 (es) 2006-03-10 2008-04-30 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 y sus usos
CN101506235B (zh) 2006-09-01 2012-07-25 人类多细胞株治疗学公司 人或人源化免疫球蛋白在非人转基因动物中增强的表达
ES2405605T3 (es) 2009-03-27 2013-05-31 Wyeth Llc Células iniciadoras de tumores y procedimientos de uso de las mismas
GB0918383D0 (en) * 2009-10-20 2009-12-02 Cancer Rec Tech Ltd Prognostic,screening and treatment methods and agents for treatment of metastasis and inflammation
SG184473A1 (en) 2010-04-07 2012-11-29 Abbvie Inc Tnf-alpha binding proteins
ES2683953T3 (es) 2011-02-07 2018-09-28 Aggamin Llc Procedimientos y sistemas para tratar o prevenir trastornos hipertensivos gestacionales
SG10201605401WA (en) * 2011-04-01 2016-08-30 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
BR112014004162A2 (pt) * 2011-08-22 2018-04-24 Cangene Corp anticorpos contra clostridium difficile
JP2014533929A (ja) 2011-09-23 2014-12-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ５ｔ４およびｃｄ３に対する二重特異的結合性分子
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
CN104094116B (zh) 2012-01-24 2017-05-31 辉瑞公司 在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
ES2786083T3 (es) 2012-12-12 2020-10-08 Arch Oncology Inc Anticuerpos terapéuticos CD47
WO2014137931A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to 5t4
EP2968536B1 (en) 2013-03-13 2023-06-28 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for modulating chemotherapeutic cytotoxicity
EP3010939A2 (en) * 2013-06-17 2016-04-27 Asana BioSciences, LLC 5t4-targeted immunofusion molecule and methods
CN105813655B (zh) 2013-10-11 2022-03-15 阿萨纳生物科技有限责任公司 蛋白-聚合物-药物缀合物
ES2726850T3 (es) 2013-10-11 2019-10-09 Mersana Therapeutics Inc Conjugados de proteína-polímero-fármaco
BR112016010051A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Pfizer ?conjugados de anticorpo-fármaco anti-efna4?
WO2015155345A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune Limited Antibodies and antibody-drug conjugates
WO2015177360A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Site-specific conjugation of linker drugs to antibodies and resulting adcs
US10647768B2 (en) * 2014-05-29 2020-05-12 Macrogenics, Inc. Multi-chain polypeptide-containing tri-specific binding molecules
EP3453406B1 (en) 2014-07-29 2021-04-14 Cellectis Ror1 (ntrkr1) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
US10544201B2 (en) 2014-07-31 2020-01-28 Cellectis ROR1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
ES2777305T3 (es) 2014-09-04 2020-08-04 Cellectis Receptores de antígeno quiméricos específicos de la glicoproteína trofoblástica (5T4, TPBG) para inmunoterapia contra el cáncer
EP3247392A1 (en) * 2015-01-22 2017-11-29 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing medin
TW201706300A (zh) 2015-05-20 2017-02-16 瑟勒提斯公司 用於癌症免疫療法之抗－ｇｄ３專一性嵌合抗原受體
CN116425875A (zh) 2015-09-18 2023-07-14 安驰肿瘤公司 治疗性cd47抗体
EP3184547A1 (en) * 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
HUE055482T2 (hu) * 2015-11-24 2021-11-29 Byondis Bv 5T4 elleni ellenanyagok és ellenanyag-drog konjugátumok
CN106916227B (zh) * 2015-12-24 2019-12-13 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
MX2019000727A (es) * 2016-07-20 2019-05-02 Aerpio Therapeutics Inc Anticuerpos monoclonales humanizados que tienen como blanco ve-ptp (hptp-b).
WO2018075960A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Tioma Therapeutics, Inc. Therapeutic cd47 antibodies
US11135307B2 (en) 2016-11-23 2021-10-05 Mersana Therapeutics, Inc. Peptide-containing linkers for antibody-drug conjugates
CN108084265B (zh) * 2016-11-23 2021-07-02 复旦大学 特异性结合人的5t4抗原的全人源单域抗体及其应用
CN108285487B (zh) * 2017-01-08 2021-02-19 浙江昭华生物医药有限公司 抗5t4抗体-药物偶联物及其应用
CN110325209A (zh) 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途
EP3595705A1 (en) * 2017-03-15 2020-01-22 Oxford BioMedica (UK) Limited Method
WO2018184558A1 (zh) * 2017-04-05 2018-10-11 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种人源化抗tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CA3058477A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
WO2018226795A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 The Regents Of The University Of California Humanized anti-n-cadherin antibodies and uses thereof
AU2018304585B2 (en) 2017-07-20 2023-07-06 Alligator Bioscience Ab Antigen binding proteins binding to 5T4 and 4-1BB and related compositions and methods
WO2019104289A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
WO2019126691A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
CN108187065B (zh) * 2017-12-29 2023-04-28 广东众生药业股份有限公司 抗5t4抗体与美登素衍生物dm4偶联复合物及制备方法和用途
MX2020007024A (es) 2018-01-03 2020-10-28 Palleon Pharmaceuticals Inc Sialidasas humanas recombinantes, proteinas de fusion de sialidasa y metodos para usar las mismas.
BR112020018490A2 (pt) 2018-03-12 2020-12-29 Genmab A/S Anticorpo, imunoconjugado ou conjugado de anticorpo-fármaco, construção de ácido nucléico, vetor de expressão, célula, composição, composição farmacêutica, anticorpo, método, método para produzir um anticorpo, kit de partes, e, anticorpo anti-idiotípico
BR112020020604A2 (pt) 2018-04-11 2021-01-12 Inhibrx, Inc. Construções de polipeptídeo multiespecífico tendo ligação restrita de cd3 e métodos e usos relacionados
CN112789294A (zh) 2018-07-24 2021-05-11 印希比股份有限公司 含有受限cd3结合结构域和受体结合区的多特异性多肽构建体及其使用方法
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
KR20210084546A (ko) 2018-10-29 2021-07-07 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 펩티드 함유 링커를 갖는 시스테인 조작된 항체-약물 접합체
EP4028424A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
IL294879A (en) 2020-01-29 2022-09-01 Inhibrx Inc Monodomain antibodies of cd28 and their multivalent and multispecific constructs
CA3196402A1 (en) * 2020-10-22 2022-04-28 Dale L. Ludwig Combination radioimmunotherapy and cd47 blockade in the treatment of cancer
JP2024501771A (ja) * 2021-01-06 2024-01-15 パレオン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその融合タンパク質
WO2023155925A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Anti-5t4 antibodies and uses thereof
EP4353220A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-17 Pierre Fabre Medicament Use of a liquid aqueous composition for solubilization and stabilization of an antibody-drug conjugate

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5108912A (en) 1987-01-30 1992-04-28 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5869053A (en) 1988-03-04 1999-02-09 Cancer Research Campaign Technology, Ltd. 5T4 antigen from human trophoblasts
AU3353989A (en) 1988-03-04 1989-09-22 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
KR0162259B1 (ko) 1989-12-05 1998-12-01 아미 펙터 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
GB9116610D0 (en) 1991-08-01 1991-09-18 Danbiosyst Uk Preparation of microparticles
US6310185B1 (en) 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
ZA955642B (en) 1994-07-07 1997-05-06 Ortho Pharma Corp Lyophilized imaging agent formulation
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
WO1997026885A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The General Hospital Corporation Doing Business As Massachusetts General Hospital Benzophenothiazine and benzoporphyrin dye combination photodynamic therapy of tumors
WO1998055607A2 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Tumor targeted vector
GB2370573A (en) 1998-11-18 2002-07-03 Oxford Biomedica Ltd Poxviral vectors
GB2378704B (en) 1998-11-18 2003-05-07 Oxford Biomedica Ltd Uses of 5t4 antigen
EP2042598A1 (en) 1998-11-18 2009-04-01 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
EP1396543A3 (en) * 1999-07-08 2004-03-31 Research Association for Biotechnology Primers for synthesizing full length cDNA clones and their use
AU2001257577A1 (en) 2000-02-28 2001-09-03 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
EP2044839A3 (en) 2000-08-03 2009-07-01 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
AU2002214150A1 (en) * 2000-11-13 2002-05-21 Oxford Biomedica (Uk) Limited Canine and feline tumour-associated antigen 5t4
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
AU2002348477A1 (en) 2001-05-01 2002-12-23 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
GB0203419D0 (en) * 2002-02-13 2002-04-03 Oxford Biomedica Ltd Peptide
US8420353B2 (en) 2002-03-22 2013-04-16 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
SI1507556T1 (sl) 2002-05-02 2016-10-28 Wyeth Holdings Llc Konjugati kaliheamicinski derivat-nosilec
TW200539855A (en) 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
WO2006004950A2 (en) 2004-06-30 2006-01-12 International Bioimmune Systems, Inc. Humanized monoclonal antibody 31.1 as an anticancer agent
AR050642A1 (es) 2004-09-10 2006-11-08 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/ calicheamicina
US7807804B2 (en) * 2004-10-05 2010-10-05 Wyeth Llc Methods and compositions for improving recombinant protein production
AR059809A1 (es) * 2006-03-10 2008-04-30 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 y sus usos
ES2815678T3 (es) 2010-04-21 2021-03-30 Syntarga Bv Conjugados de análogos de CC-1065 y conectores bifuncionales
SG10201605401WA (en) * 2011-04-01 2016-08-30 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates

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