ES2683953T3

ES2683953T3 - Procedimientos y sistemas para tratar o prevenir trastornos hipertensivos gestacionales

Info

Publication number: ES2683953T3
Application number: ES12744935.3T
Authority: ES
Inventors: Paul Kussie; Woo S. JOO
Original assignee: Aggamin LLC
Current assignee: Aggamin LLC
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2032-02-07
Also published as: JP6169495B2; EP2672996A4; CA2826563A1; US20140065150A1; CA2826563C; WO2012109282A2; EP2672996A2; JP2014511375A; EP2672996B1; US9592331B2; WO2012109282A3

Abstract

Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28, o compite por la unión con un anticuerpo que comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28; donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y sistemas para tratar o prevenir trastornos hipertensivos gestacionales 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos, sistemas, dispositivos y aparatos para tratar trastornos hipertensivos gestacionales; tales como preeclampsia y eclampsia.

10 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de EE. UU. N:° 61/440.169, presentada el 7 de febrero de 2011.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

15

La preeclampsia es un síndrome de hipertensión, edema y proteinuria que afecta del 5 al 10 % de los embarazos y da como resultado una importante morbilidad y mortalidad maternas y fetales. La preeclampsia representa al menos 200.000 muertes maternas en todo el mundo por año. Los síntomas de la preeclampsia normalmente aparecen después de la semana 20 de embarazo y se detectan habitualmente mediante la monitorización rutinaria de la 20 presión arterial y la orina. Sin embargo, estos procedimientos de monitorización son ineficaces para el diagnóstico de preeclampsia en una fase temprana, lo que podría reducir el riesgo para el sujeto o el desarrollo del feto, si se dispusiera de un tratamiento eficaz.

Los síntomas de la preeclampsia generalmente incluyen cualquiera de los siguientes: (1) presión sanguínea sistólica 25 (PA) >140 mmHg y una PA diastólica >90 mmHg después de 20 semanas de gestación, (2) proteinuria de nueva aparición (1+ por tira reactiva en el análisis de orina) , >300 mg de proteína en una recogida de orina de 24 horas, o relación aleatoria de proteína/creatinina en orina >0,3), o (3) resolución de hipertensión y proteinuria a las 12 semanas postparto. Los síntomas de la preeclampsia también pueden incluir disfunción renal y endoteliosis o hipertrofia glomerular. Otros síntomas de la eclampsia pueden ser cualquiera de los siguientes síntomas debido al 30 embarazo o la influencia de un embarazo reciente: convulsiones, coma, trombocitopenia, edema hepático, edema pulmonar o edema cerebral.

La preeclampsia puede variar en gravedad de leve a potencialmente mortal. Una forma leve de preeclampsia se puede tratar con reposo en cama y monitorización frecuente. Para los casos moderados a graves, se recomienda la 35 hospitalización y se prescriben medicamentos para la presión arterial o medicamentos anticonvulsivos para prevenir las convulsiones. Si la afección pone en riesgo la vida de la madre o del feto, el embarazo se interrumpe y el feto nace prematuramente.

Se ha notificado que varios factores tienen relación con el desarrollo fetal y placentario y la preeclampsia. Estos 40 incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor Flt-1 soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PlGF). El VEGF es un mitógeno específico de las células endoteliales, un inductor angiogénico y un mediador de la permeabilidad vascular. El VEGF también se ha demostrado ser importante para la reparación capilar glomerular. El VEGF se divulga en lapatente de EE. UU. N.° 5.332.671;La;la patente de EE. UU. N.° 5.240.848; yla patente de EE. UU. N.° 5.194.596; así como enCharnock-Jones y col., 1993, Biol. Reproduction, 45 48: 1120-1128. El VEGF existe como un homodímero glucosilado e incluye al menos cuatro isoformas diferentes sometidas a splicing de forma alterna. La actividad biológica del VEGF nativo incluye la promoción del crecimiento selectivo de células endoteliales vasculares o células endoteliales de la vena umbilical y la inducción de la angiogénesis. El VEGF incluye varios miembros de la familia o isoformas (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165 o VEGF 121); véaseTischer y col., 1991, J. Biol. Chem. 266, 1194750 11954;Neufed y col., 1996, Cancer Metastasis 15: 153-158;patente de EE. UU. N.° 6.447.768;patente de EE. UU. N.° 5.219.739; ypatente de EE. UU. N.° 5.194.596. También se conocen formas mutantes de VEGF tales como el VEGF selectivo de KDR y el VEGF selectivo de Flt descritos enGille y col., 2001, J. Biol. Chem. 276: 3222-3230. Formas modificadas de VEGF se describen enLeCouter y col., 2003, Science 299: 890-893.

55 El VEGF se une como un homodímero a dos receptores de tirosina quinasa transmembranales homólogos, la tirosina cinasa similar a fms (Flt-1) y el receptor del dominio cinasa (KDR), que se expresan de forma diferencial en células endoteliales obtenidas de muchos tejidos diferentes. El número de acceso al GenBank AF063657 proporciona las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Flt-1 humana. Flt-1, pero no KDR, es altamente expresada por las células del trofoblasto que contribuyen a la formación de la placenta. El PIGF es un miembro de la 60 familia de VEGF que también está implicado en el desarrollo de la placenta. PIGF es expresado por citotrofoblastos

y sincitiotrofoblastos y es capaz de inducir proliferación, migración y activación de células endoteliales. El PIGF se une como un homodímero al receptor Flt-1, pero no al receptor KDR. Tanto PIGF como VEGF contribuyen a la actividad mitógena y la angiogénesis que son fundamentales para el desarrollo de la placenta.

5 Se identificó sFlt-1, que carece de los dominios transmembrana y citoplásmico del receptor Flt-1 de longitud completa, en el medio de cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana y se demostró posteriormente la expresión in vivo de sFlt-1 en tejido placentario. sFlt-1 se une a VEGF con alta afinidad pero no estimula la mitogénesis de las células endoteliales. Los niveles elevados de sFlt-1 descubiertos en las muestras de suero tomadas de mujeres embarazadas que padecen o corren el riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo 10 gestacional (por ejemplo, preeclampsia o eclampsia) indican que sFlt-1 actúa como un «sumidero fisiológico» para unirse a y agotar, en las células del trofoblasto y las células endoteliales de la madre, los factores de crecimiento funcionales necesarios para el desarrollo y la angiogénesis adecuados del feto y/o la placenta.

El documento WO2006/076467usa «aféresis dirigida» para tratar mujeres embarazadas que corren el riesgo de 15 desarrollar eclampsia, por lo que los receptores sFlt-1 se retiran selectivamente de la sangre haciendo pasar la sangre a través de un cartucho que contiene PIGF inmovilizado y/o a través de un cartucho que contiene anticuerpo anti-sFlt-1 inmovilizado. El receptor sFlt-1 se libera y la sangre limpia se devuelve al paciente.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

20

La presente invención proporciona un uso médico para tratar o prevenir un trastorno asociado con sFlt-1, tal como un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto, que comprende proporcionar ex vivo al sujeto anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o un ligando de sFlt-1, en una cantidad suficiente y durante un tiempo suficiente para disminuir los niveles en sangre de sFlt-1 del sujeto para tratar o prevenir el trastorno asociado 25 con sFlt-1 en el sujeto.

En ciertas realizaciones, el uso médico comprende retirar un volumen de la sangre del sujeto, poner la sangre o un componente de la misma (por ejemplo, plasma) en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1 , donde los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los 30 mismos, o ligandos de sFlt-1, están unidos a un soporte sólido, para unir sFlt-1 en la sangre del sujeto o componente de la misma a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, disminuyendo de este modo la cantidad de sFlt-1 en la sangre del sujeto o componente de la misma, y devolver la sangre o componente de la misma al sujeto.

35 La invención proporciona un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso en el

tratamiento o la prevención de un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1,

o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28, o compite por la unión con un anticuerpo que comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID 40 NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28;en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso para 45 agotar sFlt-1 del plasma humano, donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está fijado a un soporte sólido, y la relación anticuerpo:sFlt-1 es 50, 100 o 250; en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID nO:18, la SEQ ID

50 NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID

NO:28; y donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.

La invención proporciona además un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en el que la 55 cadena pesada comprende la SEQ ID NO:30 o una secuencia al menos el 85 % idéntica a la misma, y en el que la cadena ligera comprende la SEQ ID NO:32 o una secuencia al menos el 85 % idéntica a la misma, donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión al sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.

Como se describe en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los 60 mismos, comprenden una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la

SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos para sFlt-1 comprenden una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ 5 ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, comprenden al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:30 y 32, o una secuencia al menos el 85 % o al menos el 90 % idéntica a las mismas.

Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los 10 mismos, comprenden una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SEQ iD NO:12. Como también se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1 comprenden una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la sEq ID NO:8, 15 la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:12. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, pueden comprender al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:14 y 16, o una secuencia al menos el 85 % o al menos el 90 % idéntica a las mismas.

En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-sFlt-1 no bloquean la unión del ligando a sFlt-1. Los 20 ligandos de sFlt-1 incluyen PIGF, VEGF, incluyendo sus isoformas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a un epítopo en sFlt-1 que no está presente en Flt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a un epítopo que incluye aminoácidos del extremo carboxi de una isoforma de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a uno o más de los dominios 1-3 de sFlt-1 humano.

25

Se observa que la capacidad de un anticuerpo para agotar el sFlt-1 de la sangre o un componente de la misma no depende necesariamente de la afinidad de unión, y puede estar influida por la región de sFlt-1 a la que se une el anticuerpo. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que 30 tienen la SEQ ID nO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. Como también se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1 pueden competir por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID 35 NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, compiten por la unión con un anticuerpo que comprende al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:30 y 32, o una secuencia al menos el 85 % o al menos el 90 % idéntica a las mismas.

40 También se describen en el presente documento anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, que compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SeQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID No:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SeQ ID NO:12. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1 compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que 45 tienen sustancialmente la misma secuencia que la sEq ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la sEq ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:12. Como también se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, compiten por la unión con un anticuerpo que comprende al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:14 y 16, o una secuencia al menos el 85 % o al 50 menos el 90 % idéntica a las mismas.

En ciertas realizaciones, el trastorno hipertensivo gestacional es eclampsia o preeclampsia. En ciertas realizaciones, el trastorno hipertensivo gestacional es preeclampsia. Como se divulga en el presente documento, el trastorno relacionado con sFlt-1 puede ser una nefropatía.

55

En ciertas realizaciones, la sangre o un componente de la misma es plasma y el uso médico comprende retirar un volumen de la sangre del sujeto y separar la sangre en plasma y componentes celulares antes de poner en contacto el plasma con anticuerpos anti-sFlt-1 o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación, un ser humano postparto, o un no ser humano (por ejemplo, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro o un gato). En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación o un ser humano postparto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación.

5

La presente invención proporciona un sistema que comprende sFlt (a) anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, que comprenden CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28, o compiten por la unión con un anticuerpo que comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la 10 SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28;

en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1; donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 15 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 de plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo está unido a un soporte sólido, y la relación molar anticuerpo:sFlt-1 es 50; (b) un primer medio para transportar sangre o un componente de la misma de un sujeto a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido para poner en contacto la sangre o un componente de la misma con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, y de ese modo retirar sFlt-1 de 20 la sangre o un componente de la misma; y (c) un segundo medio para transportar la sangre o un componente de la misma al sujeto después del contacto de la sangre o un componente de la misma con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos.

En ciertas realizaciones de la presente invención, se pone en contacto plasma, en lugar de sangre, con anticuerpos 25 anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, unidos a un soporte sólido, con el fin de tratar o prevenir un trastorno hipertensivo gestacional. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el primer medio incluye un dispositivo para separar la sangre del sujeto en plasma y componentes celulares.

En ciertas realizaciones, el primer medio comprende un dispositivo de acceso, tal como un catéter, aguja, cánula o 30 similar, insertado en un vaso sanguíneo del sujeto, para acceder al aparato circulatorio del sujeto, un sistema de conductos, tales como tubos, tuberías, fibras huecas o similares, que conecta de forma fluida el dispositivo de acceso a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, permitiendo de este modo que la sangre del sujeto fluya hasta y entre en contacto con los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, y, opcionalmente, una bomba (por ejemplo, una 35 bomba peristáltica) o similar, para mover sangre desde el sujeto a través del dispositivo de acceso y el sistema de conductos a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos.

En ciertas realizaciones, el segundo medio comprende un sistema de conductos, tales como tubos, tuberías, fibras huecas o similares, y un dispositivo de retorno, tal como un catéter, aguja, cánula o similar, donde el dispositivo de 40 retorno se inserta en un vaso sanguíneo (por ejemplo, una vena) del sujeto, donde el sistema de conductos conecta de forma fluida la sangre o el plasma en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, al dispositivo de retorno para permitir el retorno de la sangre o plasma al sujeto. Opcionalmente, el segundo medio también comprende una bomba (por ejemplo, una bomba peristáltica) o similar, para mover la sangre o el plasma desde los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 45 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, a través del sistema de conductos al dispositivo de retorno. Esta bomba o similar puede ser la misma bomba o similar que es parte del primero medio o, como alternativa, la fuerza motriz para el segundo medio para transportar la sangre o el plasma al sujeto puede ser una bomba independiente o similar, específica del segundo medio.

50 En ciertas realizaciones, el dispositivo para separar la sangre de un sujeto en plasma y componentes celulares es una centrífuga o un dispositivo de aféresis, por ejemplo, un dispositivo de plasmaféresis.

El primer y/o el segundo medio también pueden comprender uno o más sensores para determinar la presión y/o el caudal de la sangre en el sistema de conductos.

55

La presente invención también proporciona una columna que contiene los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, unidos a un soporte sólido, en la que los anticuerpos anti-sFlt-1, o los fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, agotan al menos el 70 %, o al menos el 80%, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo está 60 fijado a un soporte sólido, y la relación molar anticuerpo:sFlt-1 es 50.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una representación esquemática de una realización de la presente invención donde la sangre 5 de un sujeto se separa en el plasma y los componentes celulares, los componentes celulares son devueltos al sujeto, el plasma se transporta a una columna llena de perlas de SEPHAROSE® a las que se han fijado anticuerpos anti-sFlt-1, de modo que el contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1 agota el sFlt-1 en el plasma, y el plasma agotado en sFlt-1 es devuelto al sujeto.

10 La figura 2 ilustra el agotamiento de sFlt-1 de una solución que comprende sFlt-1 mediante el uso de compuestos de unión a sFlt-1, incluyendo anticuerpos anti-sFlt-1 y VEGF121 unidos a un soporte sólido (panel A) y mediciones de Kd aparente de anticuerpos monoclonales purificados y Flt-1 mediante la plataforma Octet de ForteBio (panel B).

La figura 3 muestra una realización de una columna que comprende anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión 15 al antígeno anti-sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido. La columna comprende una carcasa cilíndrica 1 y dos tapas de conexión 2 y 3, cuando la tapa 2 está conectada a un medio para suministrar sangre o plasma a partir de un sujeto a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, y la tapa 3 está conectada a un medio para el retorno de la sangre o el plasma agotado en sFlt-1 al sujeto tras el contacto de la sangre o el plasma con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de 20 los mismos, unidos al soporte sólido. El disco superior 4 es una barrera insertada en la tapa 2 que mantiene al soporte sólido 5 alejado de la abertura de entrada. Un disco similar está presente en la tapa inferior 3 pero no se muestra. El soporte sólido 5 se representa en este contexto en forma de perlas, pero puede ser de cualquier forma conveniente. Los anticuerpos anti-sFlt-1 no se muestran, pero están unidos al soporte sólido 5. 1, 2, 3 y 4 están hechos de materiales sintéticos compatibles con la sangre y están interconectados mediante técnicas 25 convencionales.

La figura 4 muestra el efecto del caudal sobre el agotamiento de sFlt-1 por anticuerpo AG10B.

La figura 5 muestra el efecto del caudal lineal sobre el agotamiento de sFlt-1 por anticuerpo AG10B.

30

La figura 6 muestra el efecto del tiempo de residencia sobre el agotamiento de sFlt-1 por anticuerpo AG10B.

La figura 7 muestra el efecto de la densidad de AG10B sobre el agotamiento de sFlt-1.

35 La figura 8 muestra el agotamiento de sFlt-1 del plasma en un intervalo de relaciones de AG10B:sFlt-1. Un anticuerpo inespecífico, Erbitux, no agota sFlt-1, lo que indica que el efecto de AG10B es específico.

La figura 9 muestra el agotamiento de sFlt-1 del suero en un intervalo de relaciones de AG10B:sFlt-1.

40 La figura 10 muestra que el agotamiento de sFlt-1 no resulta afectado por el volumen de lecho de la columna.

La figura 11 muestra el agotamiento de sFlt-1 por en anticuerpo AG10B en presencia de heparina.

La figura 12 muestra que la unión del anticuerpo AG10B a sFlt-1 no bloquea la unión a VEGF.

45

La figura 13 muestra que AG10B inmovilizado sobre perlas de Sepharose no activa el sistema del complemento. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

50 La presente invención proporciona un uso médico de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con sFlt-1 que comprende proporcionar ex vivo al sujeto sustancias de unión anti-sFlt-1, incluyendo pero sin limitarse a ligandos de y proteínas de unión a sFlt-1, anticuerpos anti-sFlt-1, y fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, en una cantidad suficiente y durante un tiempo suficiente para disminuir los niveles en sangre de sFlt-1 del sujeto. En una realización, la invención proporciona un uso médico de tratamiento o prevención de un trastorno 55 hipertensivo gestacional en un sujeto que tiene o corre el riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo gestacional y, por lo tanto, que necesita tratamiento o prevención para un trastorno hipertensivo gestacional que comprende proporcionar ex vivo al sujeto sustancias de unión anti-sFlt-1, incluyendo aunque sin limitarse a ligandos de y proteínas de unión a sFlt-1, anticuerpos anti-sFlt-1, y fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, en una cantidad suficiente y durante un tiempo suficiente para disminuir los niveles en sangre de sFlt-1 del sujeto, tratando o 60 previniendo, de este modo, el trastorno hipertensivo gestacional en el sujeto. También se describe en el presente

documento un uso médico de tratamiento del parto prematuro. Los niveles de sFlt-1 son normalmente elevados durante las últimas semanas de un embarazo normal, y pueden no estar acompañados por un trastorno hipertensivo. Por consiguiente, la invención se usa para tratar trastornos relacionados con sFlt-1 no hipertensivos del embarazo en fase tardía y el parto o profilácticamente para evitar dichos trastornos. También se describe en el 5 presente documento un uso médico de tratamiento o prevención de nefropatía crónica.

«Flt-1 soluble (sFlt-1)» (también conocido como sVEGF-R1) se refiere a una forma soluble del receptor Flt-1 que es idéntica u homóloga a la proteína definida por el número de acceso al GenBank AF063657, y tiene actividad biológica de sFlt-1. La actividad biológica de sFlt-1 se puede ensayar usando cualquier procedimiento estándar, por 10 ejemplo, ensayando la unión de sFlt-1 a VEGF. El sFlt-1 carece del dominio transmembrana y el dominio de tirosina cinasa citoplásmica del receptor Flt-1. El sFlt-1 puede unirse a VEGF y PlGF con alta afinidad, pero no puede inducir proliferación o angiogénesis y, por lo tanto, es funcionalmente diferente de los receptores Flt-1 y KDR. El sFlt-1 se purificó inicialmente a partir de células endoteliales umbilicales humanas y posteriormente se demostró que era producido por células de trofoblasto in vivo. Como se usa en el presente documento, el sFlt-1 incluye cualquier 15 miembro o isoforma de la familia de sFlt-1. Los ejemplos no limitantes incluyen isoformas de sFlt-1 que se reconocen como variantes de splicing. Las variantes de splicing tienen un sitio de inicio de la transcripción común, pero no contienen los 30 exones sometidos a splicing que codifican Flt-1. Una isoforma está codificada por un ARNm que tiene los primeros 13 exones seguidos por una parte del intrón 13 y una secuencia señal poli(A) y contiene los primeros seis dominios similares a Ig, pero no el séptimo dominio similar a Ig, dominio transmembrana o 20 dominio intracelular. A(Número de acceso al GenBank AF063657; Kendall y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:10705-9). Otra isoforma está codificada por un ARNm que tiene los primeros 14 exones seguido de un nuevo exón 15 terminal sometido a splicing de forma alternativa y una secuencia señal de poli(A). La isoforma se trunca en el séptimo dominio similar a Ig extracelular (número de acceso al GenBank AI188382; Thomas y col., 2007, FASEB J. 21: 3885-3895). También se han notificado o predicho varios otros ARNm sometidos a splicing de forma 25 alternativa y sus productos de traducción. Cada una de estas proteínas contiene secuencias C-terminales exclusivas que incluyen aminoácidos codificados por el extremo 3' del ARNm sometido a splicing de forma alternativa hasta el primer codón de terminación de la traducción. El sFlt-1 también puede significar productos de degradación o fragmentos que resultan de la escisión enzimática del receptor Flt-1 cuando dichos productos de degradación o fragmentos conservan la actividad biológica de sFlt-1. En un ejemplo, las metaloproteinasas específicas liberadas a 30 partir de la placenta pueden escindir el dominio extracelular del receptor Flt-1 para liberar la parte N-terminal de Flt-1 a la circulación.

«Ex vivo» se refiere a practicar los procedimientos de tratamiento o prevención divulgados en el presente documento fuera del cuerpo de un sujeto, es decir, extracorporalmente, por lo que la sangre o el componente 35 sanguíneo del sujeto (por ejemplo, plasma) se pone en contacto con anticuerpos anti-sFlt-1 o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos fuera del cuerpo del sujeto.

«Anticuerpo anti-sFlt-1» se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a sFlt-1. «Fragmento de unión a sFlt-1» de un anticuerpo anti-sFlt-1 se refiere a una parte de un anticuerpo anti-sFlt-1 que conserva la capacidad de unirse a 40 sFlt-1.

«Ligando de sFlt-1» se refiere a un factor de crecimiento o derivado del mismo que se une a sFlt-1. Los ligandos de sFlt-1 de origen natural incluyen, sin limitación, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario (PlGF). El VEGF es preferentemente VEGF-A o VEGF-B. El VEGF incluye sus isoformas, 45 incluyendo, sin limitación, VEGF121, VEGF165 y VEGF189. El PlGF incluye sus isoformas, incluyendo, sin limitación, PlGF-1, PlGF-2, PlGF-3 y PlGF-4. Los derivados incluyen, sin limitación, proteínas de fusión a VEGF y PlGF y variantes de secuencia de VEGF y PIGF que se unen a sFlt-1.

«Sustancias de unión a sFlt-1» incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos y cualquier otra molécula 50 de unión (por ejemplo, proteínas naturales o sintéticas, polipéptidos y polímeros) que se unen selectivamente a sFlt- 1.

Los anticuerpos de la invención son eficaces para agotar eficazmente sFlt-1 en sangre o plasma de un sujeto. El sFlt-1 puede ser soluble o estar en micropartículas que circulan en el torrente sanguíneo. La heparina se puede 55 administrar al sujeto para liberar sFlt-1 unido a tejido, potenciando el agotamiento ex vivo de sFlt-1 y minimizando el conjunto de sFlt-1 no circulante que queda en el sujeto.

Se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de anticuerpos. En el presente documento se describe un anticuerpo para sFlt-1 aislado (incluyendo fragmentos de unión a sFlt-1 del mismo) que comprende una, dos o tres 60 CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una , dos, o tres CDR

de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. También se describe en el presente documento un anticuerpo para sFlt-1 que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que son sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CdR de cadena ligera que son sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. En 5 ciertas de las realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1 o fragmentos de unión de los mismos comprenden al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID nO:30 y 32, o una secuencia al menos el 85 % al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, idéntica a las mismas.

10 En el presente documento se describe un anticuerpo para sFlt-1 aislado que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:2, la SeQ iD NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SeQ ID NO:12, así como un anticuerpo para sFlt-1 que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que son sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que son sustancialmente idénticas a la SEQ ID 15 NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:12. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, comprenden al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:14 y 16, o una secuencia al menos el 85 % al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, idéntica a las mismas.

20 «Identidad» se refiere al número o porcentaje de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico, teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. «Sustancialmente idéntica» significa una secuencia de aminoácidos que difiere solo en sustituciones conservativas de aminoácidos, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina, arginina por lisina, etc.) o en 25 una o más sustituciones, deleciones o inserciones no conservativas situadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos es al menos el 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 85 %, y de la forma más preferente al menos aproximadamente el 90 % similar a otra secuencia de aminoácidos. Los procedimientos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencia están disponibles públicamente, incluyendo, pero sin limitarse a, el 30 paquete de programa GCG (Devereux y col., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), BlAsTP, BLASTN, FASTA (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403 (1990), y el programa ALIGN (versión 2.0). El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la similitud. El programa BLAST está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, y col., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894; BLAST 2.0 en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Al comparar secuencias, estos procedimientos consideran diversas 35 sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen normalmente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, serina, treonina, lisina, arginina y fenilalanina, tirosina.

Se observa en el presente documento que la capacidad de un anticuerpo para agotar sFlt-1 de la sangre o un 40 componente de la misma no depende necesariamente de la afinidad de unión, sino que también puede depender de otras características, tales como los dominios o epítopos de sFlt-1 a los que el anticuerpo se une. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1, compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SeQ 45 ID NO:28. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1 compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SeQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28. En algunas de dichas realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los mismos, compiten por la unión con un 50 anticuerpo que comprende al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:30 y 32, o una secuencia al menos el 85 % o al menos el 90 % idéntica a las mismas.

Se describen en el presente documento, anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, que compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ 55 ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID nO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SEQ iD NO:12. Como también se describe en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1 compiten por la unión con un anticuerpo que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SeQ ID No:2, la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:6 y una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen sustancialmente la misma secuencia que la SEQ ID NO:8, la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID 60 NO:12. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión de los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

mismos, compiten por la unión con un anticuerpo que comprende al menos una región variable con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO:14 y 16, o una secuencia al menos el 85 % o al menos el 90 % idéntica a las mismas.

La siguiente tabla 1 enumera las SEQ ID NO: correspondientes a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los dominios variables y las CDR de los anticuerpos anti-sFlt-1 «101» y «102» divulgados en el presente documento.

Tabla 1 - SEQ ID NO de anticuerpos

Designación del anticuerpo: 101 102

: secuencia de nucleótidos secuencia de aminoácidos secuencia de nucleótidos secuencia de aminoácidos

CDR1H: 1 2 17 18

CDR2H: 3 4 19 20

CDR3H: 5 6 21 22

CDR1L: 7 8 23 24

CDR2L: 9 10 25 26

CDR3L: 11 12 27 28

VH: 13 14 29 30

VL: 15 16 31 32

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a un epítopo en sFlt-1 humano al que están unidos uno o más de los anticuerpos denominados en el presente documento 101, 102 o AG10A-D. Dos anticuerpos compiten (es decir, se unen al mismo epítopo o uno solapante) si cada uno inhibe (bloquea) de manera competitiva la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1x, 5x, 10x, 20x o 100x de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos en un 50 %, preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 % según lo medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo,Junghans y col., Cancer Res. 50:1495, 1990). Procedimientos adicionales para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo o uno solapante, que otro anticuerpo, son bien conocidos en la técnica.

Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, se une a sFlt-1 humano pero no se une a Flt-1 humano. Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, que se une a sFlt-1 reconoce el dominio extracelular de Fit-1. Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, reconoce un epítopo en sFlt-1 que no está presente en Fit-1. Dicho epítopo no presente en Flt-1 incluye aminoácidos del extremo carboxi de sFlt-1. Dicho epítopo no presente en Flt-1 es un epítopo discontinuo o un epítopo conformacional de sFlt- 1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen al sitio de unión al ligando de Flt-1.

Según la invención, en ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, son particularmente adecuados para la administración a un sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos pueden modificarse para minimizar la inmunogenicidad y/o la hipersensibilidad en un sujeto. Dichas modificaciones pueden proporcionar un factor de seguridad adicional en el caso de que los anticuerpos se lixivien de una columna u otro soporte sólido usado para el tratamiento ex vivo de un sujeto. Además, en ciertas realizaciones, los anticuerpos para sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, pueden administrarse in vivo para tratar eclampsia o preeclampsia. Por lo tanto, para el tratamiento tanto ex vivo como in vivo, los anticuerpos usados según la invención incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados, así como fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos anti- sFlt-1. El anticuerpo quimérico 10A (Vh: SEQ ID NO:35; Vl: SEQ ID NO:36) comprende la región variable del anticuerpo 102 y una región constante de IgG1 humana. Los anticuerpos también pueden modificarse para minimizar o eliminar otros efectos. Por ejemplo, la región constante del anticuerpo quimérico 10B (Vh: SEQ ID NO:37; VL: SEQ ID NO:36), proporcionada en el presente documento, incluye la mutación N298Q, que impide la glucosilación. Los anticuerpos que contienen esta mutación son deficientes en las funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la unión a Fc. El anticuerpo quimérico AG10C (Vh: SEQ ID NO:38; Vl: SEQ ID NO:36) incluye la mutación I254A, que altera la unión del anticuerpo al receptor Fc neonatal (FcRn). El receptor FcRn facilita el transporte de IgG materna a través de la placenta hacia el feto. Por consiguiente, AG10C se uniría a sFlt-1 en el sujeto de tratamiento, pero no sería transportado al feto en crecimiento. Los antioxidantes de administración ex vivo o in vivo incluyen ambas mutaciones (por ejemplo, anticuerpo quimérico AG10D, Vh: SEQ ID NO:39; Vl: SEQ ID NO:36).

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se usan para

neutralizar la actividad de sFlt-1 y un mecanismo posible es a través del bloqueo directo de los sitios de unión en sFlt-1 para factores de crecimiento tales como VEGF o PlGF. Sin embargo, otros mecanismos también son posibles. Por ejemplo, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se pueden unir a un sitio en sFlt-1 de modo que la unión de VEGF o PIGF a sFlt-1 no esté bloqueada. En cualquier caso, el sFlt-1 se retira de la 5 sangre o el plasma en virtud de ser capturado por los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido y ya no está disponible para unirse a, y reducir de este modo la concentración de, factores de crecimiento libres tales como VEGF o PIGF en la sangre o el plasma. Además, cuando se captura mediante anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos unidos al soporte sólido, el sFlt-1 ya no está disponible para formar heterodímeros con Flt-1 o KDR unidos a la membrana.

10

Los anticuerpos anti-sFlt-1 se unen a uno o más dominios extracelulares similares a Ig de Flt-1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, se une a uno o más de los dominios 1-3 de sFlt-1 y bloquea la unión del ligando. La estructura de dominio de Flt-1 se ha descrito. (Véase, por ejemplo,Davis-Smyth y col., 1996, EMBO Journal, 15(18):4919-27). Por ejemplo, el primer dominio similar a Ig se 15 extiende desde aproximadamente Pro32 hasta aproximadamente Ile128. El segundo dominio similar a Ig se extiende desde aproximadamente Pro134 hasta aproximadamente Thr226. El tercer dominio similar a Ig se extiende desde aproximadamente Va1232 hasta aproximadamente Lys331. El cuarto dominio similar a Ig, que se cree que es crítico para la formación del dímero del receptor, se extiende desde aproximadamente Phe333 a aproximadamente Pro428. El quinto dominio similar a Ig se extiende desde aproximadamente Tyr431 a aproximadamente Thr553. El sexto 20 dominio similar a Ig se extiende desde aproximadamente Gly558 hasta aproximadamente Arg656. El séptimo dominio similar a Ig se extiende desde aproximadamente Tyr662 a aproximadamente Thr751.

Cuando dicho anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, o ligando de sFlt-1, se emplea en el uso médico ex vivo divulgado en el presente documento, se une a las moléculas sFlt-1 a las que no está unido el 25 ligando sFlt-1 y retira esas moléculas de sFlt-1 de la sangre o el plasma. En otras realizaciones, el anticuerpo anti- sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, se une a uno o más de los dominios 1-3 de sFlt-1 y no bloquea la unión del ligando. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, se une a sFlt-1 y el ligando unido es desplazado. Por lo tanto, la cantidad de sFlt-1 en un sujeto se reduce sin una reducción sustancial del ligando de sFlt-1.

30

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen a sFlt-1 para impedir la dimerización. Se entiende que la unión del ligando de Flt-1 a Flt-1 es cooperativa, de manera que un complejo receptor-ligando estable incluye un dímero de ligando unido a un dímero de receptor. Por consiguiente, bloquear la dimerización del receptor desestabiliza las interacciones receptor-ligando. Cuando anticuerpos anti-sFlt- 35 1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, que bloquean la dimerización se emplean en el uso médico ex vivo divulgado en el presente documento, dichos anticuerpos o fragmentos de unión se unen a sFlt-1 y reducen la cantidad de sFlt-1 circulante. Por lo tanto, la cantidad de sFlt-1 en un sujeto se reduce sin una reducción sustancial del ligando de sFlt-1. Debido a que la dimerización del sFlt-1 unido está bloqueada, se reduce la estabilidad de cualquier monómero de sFlt-1 con ligando. Por lo tanto, cualquier reducción del ligando de sFlt-1 en 40 el sujeto puede ser insustancial.

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a sFlt-1 pero no bloquean o inhiben sustancialmente la unión del ligando o la dimerización de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se unen a un epítopo que está presente en todas las isoformas de sFlt-1.

45

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen al dominio 1 similar a Ig de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen al dominio 2 similar a Ig de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen al dominio 3 similar a Ig de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos 50 de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen a los dominios 1-2 similares a Ig de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen a los dominios 2-3 similares a Ig de sFlt-1. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, se unen a los dominios 1 y 3 similares a Ig de sFlt-1.

55 En el presente documento se divulgan anticuerpos anti-sFlt-1 adecuados para uso en los presentes uso médico y sistemas (por ejemplo, 101, 102, AG10A-D). Basándose en estos anticuerpos anti-sFlt-1, sería una cuestión de rutina para los expertos en la materia diseñar y producir anticuerpos anti-sFlt-1 adicionales para uso en los presentes uso médico y sistemas, por ejemplo, diseñando y produciendo anticuerpos anti-sFlt-1 adicionales que comprenden las secuencias de región variable y/o CDR de los anticuerpos anti-sFlt-1 divulgados en el presente 60 documento. Además, sería una cuestión de rutina diseñar anticuerpos anti-sFlt-1 adicionales que comprendan

secuencias de región variable o CDR que tengan ciertos niveles especificados de identidad en la secuencia de aminoácidos con las secuencias de región variable o CDR de los anticuerpos anti-sFlt-1 divulgados en el presente documento.

5 En el diseño y la producción de anticuerpos anti-sFlt-1 adicionales, los expertos en la materia pueden guiarse por ciertas características bien conocidas de anticuerpos. La estructura de los anticuerpos típicos de origen natural es bien conocida e incluye dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, con cada cadena ligera enlazada covalentemente a una cadena pesada mediante un puente disulfuro intercatenario. Las dos cadenas pesadas están enlazadas entre sí mediante puentes disulfuro adicionales. Las cadenas pesadas y ligeras 10 individuales pueden plegarse en dominios que tienen tamaños (110-125 aminoácidos) y estructuras similares, pero con diferentes funciones. Las cadenas ligeras pueden comprender un dominio variable (VL) y/o un dominio constante (CL). Las cadenas pesadas también pueden comprender un dominio variable (VH) y/o tres o cuatro dominios constantes (Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4), dependiendo de la clase o isotipo de anticuerpo. En seres humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y IgA e IgG se subdividen además en subclases o subtipos (IgA1-2 e IgG1-4).

15

Como se podría esperar a partir de su nombre, los dominios variables muestran una considerable variabilidad en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo al siguiente. Esta variabilidad generalmente es mayor en la ubicación de los sitios de unión al antígeno. Tres regiones, denominadas regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR), se encuentran en cada uno de VL y VH, que son compatibles con regiones menos 20 variables llamadas regiones variables marco.

Se ha descubierto que es conveniente considerar ciertas partes de moléculas de anticuerpo individualmente. La parte de un anticuerpo que consiste en los dominios VL y VH se denomina Fv (fragmento variable) y constituye el sitio de unión al antígeno. Un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio Vl y un dominio Vh en una cadena 25 polipeptídica se denomina Fv monocatenario (scFv) y generalmente contiene el extremo N de un dominio y el extremo C del otro dominio unidos por un enlazador flexible (véase, por ejemplo,la patente de los Estados Unidos N.° 4.946.778y la publicación de patente internacionalWO 88/09344.

Para ciertas realizaciones divulgadas en el presente documento, puede ser ventajoso emplear fragmentos scFv 30 porque los fragmentos scFv carecen de algunos o de todos los dominios constantes de anticuerpos completos. Por lo tanto, pueden superar algunos de los efectos secundarios asociados con el uso de anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos scFv tienden a estar libres de ciertas interacciones indeseadas entre regiones constantes de cadena pesada y otras moléculas biológicas.

35 El soporte sólido puede tener fijados anticuerpos monocatenarios multivalentes, donde múltiples anticuerpos monocatenarios, cada cadena individual teniendo un un dominio Vh y uno Vl enlazados covalentemente por un primer enlazador peptídico, están enlazados covalentemente por al menos uno o más segundos enlazadores peptídicos para formar un anticuerpo monocatenario multivalente. Cada cadena de un anticuerpo monocatenario multivalente incluye un fragmento de cadena ligera variable y un fragmento de cadena pesada variable, y se enlaza 40 mediante el segundo enlazador peptídico a al menos otra cadena. El segundo enlazador peptídico está compuesto preferentemente por al menos quince y menos de cien residuos de aminoácidos.

El soporte sólido puede tener diacuerpos fijados, donde dos anticuerpos monocatenarios se combinan para formar un diacuerpo. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de unión, cada uno específico para sFlt-1. Cada 45 cadena del diacuerpo incluye un dominio Vh conectado a un dominio Vl. Los dominios están conectados con enlazadores que son lo suficientemente cortos como para impedir el emparejamiento entre dominios en la misma cadena, impulsando de este modo el emparejamiento entre dominios complementarios en diferentes cadenas para recrear los dos sitios de unión al antígeno.

50 El soporte sólido puede tener triacuerpos fijados, donde tres anticuerpos monocatenarios se combinan para formar un triacuerpo. En triacuerpos, el extremo aminoacídico de un dominio Vl o VHse fusiona directamente con el extremo carboxilo de un dominio Vl o Vh, es decir, sin ninguna secuencia enlazadora. El triacuerpo tiene tres cabezas de Fv con los polipéptidos dispuestos de forma cíclica, de la cabeza a la cola.

55 El soporte sólido puede tener fragmentos Fab fijados. Los fragmentos Fab son fragmentos de un anticuerpo que consisten en dominios VlClVh y Ch1. Aquellos generados después de la digestión con papaína simplemente se denominan Fab y carecen de la región bisagra de cadena pesada. Después de la digestión con pepsina, se generan diversos Fab que conservan la bisagra de cadena pesada. Esos fragmentos divalentes con los puentes disulfuro intercatenarios intactos se denominan F(ab')2, mientras que un Fab' monovalente se produce cuando los puentes 60 disulfuro no se conservan.

De este modo, los anticuerpos anti-sFlt-1 y fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, para uso en el uso médico y sistemas divulgados en el presente documento, pero sin limitarse a, anticuerpos de origen natural, fragmentos bivalentes tales como (Fab')2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos monocatenarios, Fv 5 monocatenarios (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos monocatenarios multivalentes, diacuerpos, triacuerpos y similares que se unen a sFlt-1.

La especificidad de los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se puede determinar basándose en la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un 10 anticuerpo (Kd), mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al anticuerpo. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo y su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo con su sitio de unión al antígeno en el anticuerpo, como con la valencia del anticuerpo, que se refiere al número de sitios de unión al antígeno de un epítopo particular. Los anticuerpos se unen normalmente con una constante de disociación (Kd) de 10-5 a 10-11 litros/mol. Cualquier Kd mayor que 10-4 litros/mol generalmente 15 se considera que indica unión inespecífica. Cuanto menor sea el valor de la Kd, mayor será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o los fragmentos de unión a sFlt-1, se unen a sFlt-1 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 10'5 a 10'11 litros/mol, aproximadamente 10'6 a 10'10 litros/mol, o aproximadamente 10'7 a 20 10'9 litros/mol. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1, se unen a sFlt-1 con una constante de disociación (Kd) de al menos aproximadamente 10-5 litros/mol, al menos 10-6 litros/mol , al menos 10-7 litros/mol, al menos 10'8 litros/mol, al menos 10'9 litros/mol, al menos 10'10 litros/mol, o al menos 10'11 litros/mol. La Kd es de 10'9 litros/mol a 10'10 litros/mol. La Kd es de 10'10 litros/mol a 10'11 litros/mol.

25 Los anticuerpos anti-sFlt-1 adecuados para uso en el uso médico y los sistemas divulgados en el presente documento incluyen además aquellos para los que las características de unión se han mejorado mediante mutación directa, procedimientos de maduración de la afinidad, presentación en fagos o transposición de cadenas. La afinidad y la especificidad pueden modificarse o mejorarse mediante la mutación de las CDR y el cribado de los sitios de unión al antígeno que tienen las características deseadas (véase, por ejemplo, Yang y col., J. Mol. Biol., 254: 39230 403 (1995)). Las CDR se pueden mutar de varias formas. Una forma es aleatorizar residuos individuales o combinaciones de residuos de modo que, en una población de sitios de unión al antígenos de lo contrario idénticos, los veinte aminoácidos se encuentren en posiciones particulares. Como alternativa, las mutaciones pueden inducirse en un intervalo de residuos de CDR mediante procedimientos de PCR propensos a error (véase, por ejemplo,Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación en fagos que 35 contienen genes de región variable de cadena pesada y ligera se pueden propagar en cepas mutantes de E. coli (véase, por ejemplo,Low y col., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estos procedimientos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

Los anticuerpos anti-sFlt-1 pueden obtenerse mediante tecnología de hibridoma estándar (por ejemplo,Harlow & 40 Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), que se incorpora como referencia en el presente documento) o usando ratones transgénicos (por ejemplo, ratones KM, originalmente de Medarex, San Jose, Calif.) que producen cadenas pesadas gamma y ligeras kappa de inmunoglobulina humana. En ciertos ratones conocidos en la técnica, se inserta una parte sustancial del genoma productor de anticuerpos humano en el genoma de los ratones, y los ratones se hacen deficientes en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Dichos 45 ratones pueden inmunizarse con parte o la totalidad de sFlt-1 (por ejemplo, sFlt-1 humano), opcionalmente en un adyuvante adecuado, por ejemplo, adyuvante de Freund completo o incompleto.

Procedimientos para la preparación de anticuerpos adecuados para uso en el uso médico y los sistemas divulgados en el presente documento son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, enla patente de EE. UU. N.° 50 6.054.297;la patente de EE. UU. N.° 5.821.337;la patente de EE. UU. N.° 6.365.157; yla patente de EE. UU. N.° 6.165.464; la;la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2006/0067937; la publicación de patente internacionalWO 06/034507; que se incorporan en el presente documento como referencia.

Los anticuerpos anti-sFlt-1 adecuados para uso en el uso médico y los sistemas divulgados en el presente 55 documento pueden incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios, fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2. En ciertas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales de ratón. Los anticuerpos anti-sFlt-1 pueden incluir una variedad de isotipos de anticuerpos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, y IgA, IgD e IgE secretoras.

«Anticuerpo quimérico» se refiere a un polipéptido que comprende al menos la parte de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo enlazada a al menos parte de otra proteína (normalmente un dominio constante de inmunoglobulina).

5 «Anticuerpo humanizado» se refiere a un anticuerpo con una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana (las secuencias de «importación»). Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. El anticuerpo humanizado habitualmente comprenderá 10 sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una inmunoglobulina humana o una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Por «región 15 determinante de la complementariedad (CDR)» se entiende las tres secuencias hipervariables en las regiones variables dentro de cada una de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Por «región marco (FR)» se entiende las secuencias de aminoácidos ubicadas a cada lado de las tres secuencias hipervariables (CDR) de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Las regiones FR y CDR del anticuerpo humanizado no necesitan corresponderse de forma precisa a las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR importada o la FR humana o 20 humana consenso pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de modo que el residuo de CDR o de FR en ese sitio no corresponda ni a la secuencia consenso ni a la importada. Dichas mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Habitualmente, al menos el 75 %, preferentemente el 90 %, y de la forma más preferente al menos el 95 % de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias parentales de FR y CDR.

25

Los anticuerpos anti-sFlt-1 pueden obtenerse directamente de hibridomas que expresan los anticuerpos anti-sFlt-1 o pueden clonarse y expresarse de forma recombinante en células huésped adecuadas (por ejemplo, células CHO, células NS/0, células HEK293). Las células huésped adecuadas incluyen células vegetales, células de mamíferos y microorganismos tales como E. coli y levadura. Como alternativa, los anticuerpos anti-sFlt-1 se pueden producir de 30 forma recombinante en un animal o planta transgénica no humana, por ejemplo, un ratón transgénico.

Los anticuerpos anti-sFlt-1 pueden modificarse antes o después de la fijación a un soporte sólido. Las posibles modificaciones incluyen glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores o bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un ligando celular u otra proteína. Los anticuerpos anti- 35 sFlt-1 pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, son adecuados para el tratamientoex vivode un trastorno relacionado con sFlt-1. Adecuados significa que los anticuerpos reducen efectivamente la concentración de sFlt-1 en la sangre o el plasma de un sujeto cuando se usan en una cantidad efectiva durante un 40 tiempo efectivo. Por ejemplo, usando un caudal de 50 ml/minuto, se procesarían 5 litros de plasma (aproximadamente 2,5 volúmenes de sangre humana) en 100 minutos. Como se ejemplifica en el presente documento, en un ensayo, el anticuerpo AG10B agotó el 94 % de sFlt-1 de una solución de ensayo usando un caudal de 1 ml/min aplicado a una columna de 1 ml. Esto es comparable a un caudal de 50 ml/min usando una columna de 50 ml (y comparable a un tiempo de residencia de 1 minuto). Otro ensayo muestra que el agotamiento 45 de sFlt-1 en una muestra de ensayo se redujo solo ligeramente cuando la concentración de AG10B en el soporte sólido se redujo de 0,8 mg/ml de perlas a 0,4 mg/ml de perlas.

Para fines de investigación, se analizan columnas de diversas dimensiones que contienen 0,1 - 50 ml de perlas de Sepharose acopladas con anticuerpos anti-sFlt-1 para determinar su capacidad para agotar el sFlt-1 recombinante 50 introducido en soluciones tamponadas o suero animal o plasma humano, o sFlt-1 nativo en líquido amniótico o plasma sanguíneo de pacientes con preeclampsia. Los experimentos de agotamiento de sFlt-1 se realizan con columnas que contienen perlas de Sepharose acopladas a anticuerpos anti-sFlt-1 a 0,025 - 20 mg de anticuerpos por 1 ml de perlas (0,065 - 52 mil millones de moléculas de anticuerpo por perla individual), a caudales de 0,05 - 50 ml/min, a caudales lineales de 10 - 300 cm/h, y tiempos de residencia de 0,25 - 5 minutos. Para estos experimentos 55 de agotamiento de sFlt-1, se aplican de 1 a 400 veces los volúmenes de lecho de columna de soluciones tamponadas, suero o plasma que contiene sFlt-1 a las columnas con relaciones de anticuerpo anti-sFlt-1:sFlt-1 de 5:1 a 5.000:1 (p/p), o relaciones molares de 1.25:1 a 1.250:1. En estos intervalos de condiciones, las columnas que contienen perlas de Sepharose acopladas con anticuerpos anti-sFlt-1 agotan del 50 al 100 % de sFlt-1 en soluciones tamponadas, suero o plasma.

Para tratamientos clínicos, se usan columnas de diversas dimensiones que contienen de 25 a 750 ml de perlas de Sepharose acopladas con anticuerpos anti-sFlt-1, para agotar el sFlt-1 nativo de diversas isoformas, solos o en complejos con ligandos tales como isoformas de VEGF o PIGF del plasma sanguíneo de pacientes que padecen enfermedades asociadas con altos niveles de sFlt-1 en sangre, incluyendo preeclampsia. Las columnas usadas en 5 tratamientos clínicos contienen perlas de Sepharose acopladas a anticuerpo anti-sFlt-1 a 0,1 - 5 mg de anticuerpos por 1 ml de perlas (5 - 100 mg por 50 ml de perlas, 0,26 - 5,2 mil millones de moléculas de anticuerpo por perla individual), a caudales de 10 a 100 ml/min, a caudales lineales de 30 - 180 cm/h y tiempos de residencia de 0,5 - 3 minutos. Los pacientes con peso promedio tendrán aproximadamente 8 litros de sangre circulando en su cuerpo (aproximadamente 4 litros de plasma). Aproximadamente 0,5 - 3 veces el volumen plasmático corporal total (2 - 12 10 litros de plasma), que corresponde a de 40 a 240 veces los volúmenes del lecho de la columna de plasma sanguíneo (para una columna de 50 ml), que contenía 0,08 - 0,48 mg de sFlt nativo 1 (para un paciente con un nivel de 40 ng/ml de sFlt-1 en plasma) de diversas formas, se aplicará a las columnas que contienen perlas acopladas con anticuerpos anti-sFlt-1 a relaciones de anticuerpo anti-sFlt-1:sFlt-1 de 50:1 a 2.000:1 (p/p), o relaciones molares de 12,5:1 a 500:1. En estos intervalos de condiciones, las columnas que contienen perlas de Sepharose acopladas 15 con anticuerpos anti-sFlt-1 pueden agotar del 50 al 100 % de sFlt-1 del plasma de pacientes con altos niveles de sFlt-1 en su sangre.

Por lo tanto, la invención proporciona un uso médico que trata o previene un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto, que comprende proporcionar ex vivo al sujeto un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del 20 mismo, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95%, o al menos el 99%, o del 70 % al 80 %, o del 80 % al 90 %, o del 90 % al 95 %, o del 95 % al 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está fijado a un soporte sólido, y la relación molar de anticuerpo:sFlt-1 es 500. En otra realización, la invención proporciona un uso médico que trata o previene un 25 trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto que comprende proporcionar ex vivo al sujeto un anticuerpo anti-sFlt- 1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 %, o del 70 % al 80 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está fijado a un soporte sólido, y la relación anticuerpo:sFlt-1 es 250. En otra 30 realización, la invención proporciona un uso médico que trata o previene un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto que comprende proporcionar ex vivo al sujeto un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está fijado a un soporte 35 sólido, y la relación molar de anticuerpo:sFlt-1 es 100. En aún otras realizaciones, al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 se agota del plasma humano en el análisis in vitro cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está unido a un soporte sólido, y la relación molar de anticuerpo:sFlt-1 es 50. Los anticuerpos anti-sFlt-1 y fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, incluyen aquellos que se unen a dominios 1-3 similares a Ig de Flt-1 en diversas combinaciones, así 40 como a anticuerpos que se unen a dominios 4, 5, 6 o 7 similares a Ig, solos o en combinación , o en combinación con dominios 2 y/o 3 similares a Ig.

De acuerdo con el procedimiento de análisis, el suero humano se adiciona con sFlt-1. Como se ejemplifica en el presente documento, se usó una proteína sFlt-1 que consiste en los dominios 1-3. Cuando se ensayan anticuerpos 45 para sFlt-1 contra otros dominios o combinaciones de dominios, se usa una molécula de sFlt-1 que contiene los dominios pertinentes. Los ejemplos no limitantes de moléculas de sFlt-1 contienen dominios 1-3, dominios 1-4, dominios 1-5, dominios 1-6, dominios 1-7, dominios 2-3, dominios 2-4, dominios 2-5, dominios 2-6, o dominios 2-7 de sFlt-1. (Véase, por ejemplo,Barleon y col., 1997, J Biol. Chem. 272:10382-88para mostrar la expresión de diversos dominios de sFlt-1). El análisis se realiza usando anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de 50 los mismos, unidos a perlas de Sepharose mezclados en plasma adicionado con sFlt-1. El análisis se realiza durante un período de tiempo que replica un tiempo de residencia en una columna clínica de 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 o 5 minutos. Dicho análisis se puede realizar usando una solución de anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión sFlt-1, unidos a perlas en una columna y plasma adicionado con sFlt-1 aplicado a un caudal para obtener un tiempo de residencia deseado. Como alternativa, el análisis podría realizarse usando sFlt-1 introducido en líquido amniótico, 55 suero (por ejemplo, suero de caballo) o una solución tampón (por ejemplo, PBS), pero se prefiere plasma, particularmente plasma humano. El análisis puede realizarse usando anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte de columna (por ejemplo, perlas de Sepharose) a diversas densidades y sFlt-1 introducido en plasma a diversas concentraciones. Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, se pueden unir a perlas de Sepharose en cantidades de 0,025, 0,050, 0,1, 0,25, 0,5, 1 o 2 mg perla. 60 El caudal puede ser de 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 o 100 ml/min, y los caudales lineales pueden ser 10,

20, 30, 50, 100, 150, 180, 240 o 300 cm/h.

Los anticuerpos de la invención son eficaces para agotar eficazmente sFlt-1 en sangre o plasma de un sujeto. El sFlt-1 puede ser soluble y/o estar en micropartículas que circulan en el torrente sanguíneo. En ciertas realizaciones, 5 cuando un anticuerpo de la invención se fija a un soporte sólido (por ejemplo, perlas de Sepharose) y se pone en contacto con una solución que contiene sFlt-1 de modo que la relación anticuerpo:sFlt-1 sea 50, el anticuerpo para sFlt-1 agota (se une a) al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 % de sFlt-1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo para sFlt-1 agota del 70 % al 80 %, del 80 % al 90 %, o del 90 % al 95 %, del 95 % al 99 % de sFlt-1. La solución puede ser sangre, plasma, suero o una solución tampón. En ciertas realizaciones, 10 cuando un anticuerpo de la invención se fija a un soporte sólido (por ejemplo, perlas de Sepharose) y se pone en contacto con una solución que contiene sFlt-1 de modo que la relación anticuerpo:sFlt-1 sea 100, el anticuerpo para sFlt-1 agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 % de sFlt-1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo para sFlt-1 agota del 70 % al 80 %, del 80 % al 90 %, o del 90 % al 95 %, del 95 % al 99 % de sFlt-1. En ciertas realizaciones, cuando un anticuerpo de la invención se fija a un soporte sólido (por ejemplo, 15 perlas de Sepharose) y se pone en contacto con una solución que contiene sFlt-1 de modo que la relación anticuerpo:sFlt-1 sea 250, el anticuerpo para sFlt-1 agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %,

0 al menos el 95 % de sFlt-1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo para sFlt-1 agota del 70 % al 80 %, del 80 % al 90 %, o del 90 % al 95 %, del 95 % al 99 % de sFlt-1.

20 El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1, es capaz, en condiciones adecuadas, de reducir la concentración de sFlt-1 en la sangre o el plasma del sujeto que contiene sFlt-1 a menos de aproximadamente 50 ng/ml, menos de aproximadamente 40 ng/ml, menos de aproximadamente 25 ng/ml, menos de aproximadamente 10 ng/ml, menos de aproximadamente 5 ng/ml, menos de aproximadamente 4 ng/ml, menos de aproximadamente 3 ng/ml, menos de aproximadamente 2 ng/ml, menos de aproximadamente 1 ng/ml, menos de aproximadamente 0,75 25 ng/ml o menos de aproximadamente 0,5 ng/ml.

Una molécula de sFlt-1 se retira del plasma sanguíneo mediante inmovilización en un soporte sólido, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo. Cuando sFlt-1 se inmoviliza en un soporte sólido, la unión del ligando resulta menos favorecida en comparación con el caso en el que sFlt-1 está libre 30 en solución. Por consiguiente, los niveles de sFlt-1 se reducen en el sujeto, y cualquier reducción del ligando de sFlt-

1 circulante puede ser insustancial.

Los anticuerpos anti-sFlt-1 están unidos a un soporte sólido donde el soporte sólido no tiene anticuerpos anti- endoglina, o fragmentos de unión a endoglina de los mismos, unidos a él. En ciertas realizaciones del uso médico 35 divulgado en el presente documento, los procedimientos no disminuyen sustancialmente la cantidad de endoglina en la sangre del sujeto. Los sistemas no son capaces de retirar significativamente la endoglina de la sangre del sujeto.

En ciertas realizaciones, el uso médico de la presente invención comprende:

(a) retirar sangre del sujeto,

40 (b) hacer pasar la sangre o un componente de la misma sobre un soporte sólido al cual están fijados anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1, para disminuir el nivel de sFlt-1 en la sangre o el componente de la misma, y

(c) devolver la sangre o el componente de la misma al cuerpo del sujeto.

45 La sangre se separa en plasma y componentes celulares y solo el plasma se pone en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, mientras que los componentes celulares se devuelven al sujeto sin dicho contacto o, en ciertas realizaciones, se desechan en lugar de ser devueltos al sujeto.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el uso médico comprende retirar un volumen de la sangre del sujeto, 50 separar la sangre en plasma y componentes celulares, poner el plasma en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, para unir sFlt-1 en el plasma a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, disminuyendo de este modo la cantidad de sFlt-1 en el plasma del sujeto, devolver el plasma al sujeto y, opcionalmente, devolver los componentes celulares al sujeto.

55 Cuando se pone en práctica la realización anterior, los componentes celulares pueden ser devueltos al sujeto en cualquier momento. Es decir, los componentes celulares pueden ser devueltos al sujeto antes de que el plasma se ponga en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o los componentes celulares pueden ser devueltos al sujeto después de que el plasma se ponga en contacto con los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos. En ciertas realizaciones, los componentes celulares se pueden 60 combinar con el plasma después de que el plasma se haya puesto en contacto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o

fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, y los componentes celulares y el plasma combinados son devueltos al sujeto al mismo tiempo, a través del mismo sistema de conductos y/o el mismo dispositivo de retorno.

En ciertas realizaciones, el trastorno hipertensivo gestacional es eclampsia o preeclampsia. En ciertas realizaciones, 5 el trastorno hipertensivo gestacional es eclampsia. Como se divulga en el presente documento, el trastorno puede ser nefropatía crónica.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación, un ser humano postparto, o un no ser humano en periodo de gestación o postparto (por ejemplo, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un 10 perro o un gato). En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación o un ser humano postparto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano en periodo de gestación.

Opcionalmente, el uso médico divulgado en el presente documento se puede poner en práctica en un sujeto que está siendo tratado con terapias para preeclampsia o eclampsia estándar. Dichas terapias estándar son conocidas 15 por el experto en la materia e incluyen los procedimientos descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.°US 2004/0126828; la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.°US 2005/0025762; la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.°US 2005/0170444; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.°US 2006/0067937así como en la publicación de patente internacionalWO 2004/008946; la publicación de patente internacionalWO 2005/077007; y la publicación de patente internacionalWO 06/034507.

20

El uso médico divulgado en el presente documento se puede poner en práctica usando una combinación de sustancias de unión a sFlt-1. Por ejemplo, se pueden usar dos o más de anticuerpos anti-sFlt-1, fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos y ligandos de sFlt-1.

25 El uso médico divulgado en el presente documento se puede poner en práctica en un sujeto que está siendo tratado con medicamentos para la hipertensión crónica. Los medicamentos usados para el tratamiento de la hipertensión durante el embarazo incluyen metildopa, clorhidrato de hidralazina o labetalol.

El uso médico divulgado en el presente documento puede incluir además la etapa de administrar un compuesto 30 antihipertensivo al sujeto. Dicha administración puede ser mediante medios convencionales, por ejemplo, administrando una forma de dosificación oral que comprende un compuesto antihipertensivo.

El uso médico divulgado en el presente documento puede incluir además administrar un factor de crecimiento o citocina, tal como, sin limitación, un ligando de VEGFR, al sujeto. Como se describe en el presente documento, el 35 factor de crecimiento es VEGF. Como también se describe en el presente documento, el factor de crecimiento es PlGF.

El uso médico divulgado en el presente documento se puede poner en práctica durante el embarazo para el tratamiento o la prevención de preeclampsia o eclampsia o después del embarazo para tratar preeclampsia o 40 eclampsia postparto.

«Tratamiento» se refiere a la puesta en práctica de los procedimientos ex vivo divulgados en el presente documento con fines terapéuticos. «Tratar» o usar para «terapia» se refiere a administrar tratamiento a un sujeto ya diagnosticado con o que padece un trastorno hipertensivo gestacional para mejorar la afección del sujeto. Por 45 ejemplo, puede diagnosticarse que el sujeto tiene o padece preeclampsia o eclampsia, basándose en la identificación de cualquiera de los síntomas característicos descritos en el presente documento o basándose en la medición de la concentración de sFlt-1 en la sangre del sujeto, como se describe en el presente documento.

«Prevenir» se refiere al tratamiento profiláctico de un sujeto que aún no está enfermo, pero que es susceptible o 50 corre el riesgo riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo gestacional, por ejemplo, un sujeto que se determina que corre el riesgo de desarrollar preeclampsia o eclampsia.

«Trastorno hipertensivo gestacional» se refiere a cualquier afección o enfermedad durante el embarazo que está asociada con o se caracteriza por un aumento de la presión arterial. Entre estas afecciones y enfermedades se 55 incluyen preeclampsia (incluida preeclampsia prematura, preeclampsia grave), eclampsia, hipertensión gestacional, síndrome HELLP (hemólisis, enzimas hepáticas elevadas, bajo nivel de plaquetas), desprendimiento placentario, hipertensión crónica durante el embarazo, embarazo con restricción de crecimiento intrauterino y embarazo con un bebé pequeño para la edad gestacional (SGA).

60 «Preeclampsia» se refiere a un trastorno multisistémico que se caracteriza por hipertensión con proteinuria o edema,

0 ambas, disfunción glomerular, edema cerebral, edema hepático o anomalías de la coagulación debidas al embarazo o a la influencia de un embarazo reciente. En esta definición se incluyen todas las formas de preeclampsia, tales como preeclampsia prematura, leve, moderada y grave. La preeclampsia generalmente se produce después de la 20a semana de gestación. La preeclampsia generalmente se define como una combinación

5 de los siguientes síntomas: (1) una presión arterial sistólica (PA) >140 mm Hg y una PA diastólica>90 mm Hg después de las 20 semanas de gestación (generalmente medida en dos ocasiones, con 4-168 horas de diferencia), (2) nueva proteinuria de inicio (1+ mediante tira reactiva en el análisis de orina, >300 mg de proteína en una recogida de orina de 24 horas, o una sola muestra de orina aleatoria que tiene una relación de proteína/creatinina >0,3), y (3) resolución de hipertensión y proteinuria a las 12 semanas postparto. La preeclampsia grave 10 generalmente se define como (1) una PA diastólica>110 mm Hg (generalmente medida en dos ocasiones, con 4-168 horas de diferencia) o (2) proteinuria caracterizada por una medición de 3,5 gramos o más de proteína en una recogida de orina en 24 horas o dos muestras de orina al azar con al menos 3+ de proteína mediante tira reactiva. En la preeclampsia, la hipertensión y la proteinuria generalmente se producen dentro de siete días de diferencia. En la preeclampsia grave, la hipertensión grave, la proteinuria grave y el síndrome HELLP (hemólisis, enzimas 15 hepáticas elevadas, plaquetas bajas) o la eclampsia pueden producirse simultáneamente o solo un síntoma cada vez. El síndrome hEllP se caracteriza por indicios de trombocitopenia (<100.000 células/pl), aumento de LDH (>600 Ul/l) y aumento de AST (>70 Ul/l). Ocasionalmente, la preeclampsia grave puede causar el desarrollo de convulsiones. Esta forma grave del síndrome se conoce como «eclampsia». La eclampsia también puede incluir disfunción o daño a varios órganos o tejidos tales como el hígado (por ejemplo, daño hepatocelular, necrosis 20 periportal) y el sistema nervioso central (por ejemplo, edema cerebral y hemorragia cerebral). Se cree que la etiología de las convulsiones es secundaria al desarrollo de edema cerebral y espasmo focal de pequeños vasos sanguíneos en el riñón.

«Sujeto» se refiere a un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano tal como una 25 vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro o un gato.

«Que corre el riesgo de desarrollar» un trastorno hipertensivo gestacional, tal como la preeclampsia o la eclampsia, se refiere a un sujeto que actualmente no tiene, pero tiene una probabilidad mayor que la media de desarrollar, un trastorno hipertensivo gestacional. Dichos sujetos de riesgo incluyen mujeres embarazadas con una concentración 30 de sFlt-1 en sangre mayor de aproximadamente 3 ng/ml, mayor de aproximadamente 4 ng/ml, mayor de aproximadamente 5 ng/ml, mayor de aproximadamente 6 ng/ml, mayor de aproximadamente 7 ng/ml, mayor de aproximadamente 8 ng/ml, mayor de aproximadamente 9 ng/ml, mayor de aproximadamente 10 ng/ml, mayor de aproximadamente 15 ng/ml, mayor de aproximadamente 20 ng/ml, mayor de aproximadamente 25 ng/ml, mayor de aproximadamente 30 ng/ml, mayor de aproximadamente 40 ng/ml, o mayor de aproximadamente 45 ng/ml, pero que 35 no muestran otros signos de un trastorno hipertensivo gestacional tal como preeclampsia.

La fase del embarazo en la que se puede poner en práctica el uso médico descrito en el presente documento depende de diversos factores clínicos, incluyendo la salud general del sujeto y la gravedad de los síntomas de la preeclampsia. En general, una vez que se detecta preeclampsia o una predisposición a la preeclampsia, se pueden 40 emplear los procedimientos. El tratamiento puede continuar durante un período de tiempo que varía entre 1 y 100 días, más preferentemente entre 1 y 60 días, entre 1 y 10 días, o entre 1 y 5 días, y de la forma más preferente entre

1 y 20 días.

Como se divulga en el presente documento, el uso médico se lleva a cabo en un sujeto a partir de la 14a semana de 45 embarazo, la 16a semana de embarazo, la 18a semana de embarazo, la 20a semana de embarazo, la 22a semana de

embarazo, la 24a semana de embarazo, la 26a semana de embarazo, la 28a semana de embarazo, la 30a semana de

embarazo, la 32a semana de embarazo, la 34a semana de embarazo o la 36a semana de embarazo. En ciertas realizaciones, el procedimiento se lleva a cabo en un sujeto entre las semanas 14 y 16 de embarazo, las semanas 16 y 18 de embarazo, las semanas 18 y 20 de embarazo, las semanas 20 y 22 de embarazo, las semanas 22 y 24 50 de embarazo, las semanas 24 y 26 de embarazo, las semanas 26 y 28 de embarazo, las semanas 28 y 30 de

embarazo, las semanas 30 y 32 de embarazo, las semanas 32 y 34 de embarazo, o las semanas 34 y 36 de

embarazo.

En ciertas realizaciones, la sangre o plasma del sujeto se pone en contacto con anticuerpos o ligandos anti-sFlt-1 55 solo en la medida necesaria para reducir sFlt-1 a un nivel deseado. Un nivel deseado puede ser, por ejemplo, un nivel de sFlt-1 característico de un embarazo normal. Se ha observado que en el embarazo normal, la concentración sérica de sFlt-1 disminuye de las 8-12 semanas a las 16-20 semanas, aumenta gradualmente a las 26-30 semanas, se eleva rápidamente a las 35-39 semanas y vuelve al nivel normal después del parto. El nivel deseado es el nivel normal para la fase de embarazo de la persona. El nivel puede ser más alto o más bajo que el nivel normal para la 60 fase de embarazo del sujeto. Un experto en la materia podría determinar un nivel deseado, dependiendo, por

ejemplo, del paciente y la frecuencia con la que se realizará el procedimiento ex vivo.

El nivel de sFlt-1 deseado puede conseguirse controlando, por ejemplo, el período de tiempo que se trata un sujeto (es decir, el volumen de sangre o plasma tratado para un caudal particular), el caudal sobre el anticuerpo o ligando 5 inmovilizado, y/o la capacidad de unión del soporte sólido que porta el anticuerpo o ligando que se une a sFlt-1. Se usa un diagnóstico para medir los niveles de sFlt-1 en el momento del tratamiento. El diagnóstico proporciona una medida en tiempo real del nivel sFlt-1 y el tratamiento se interrumpe cuando se alcanza el nivel deseado de sFlt-1. El tiempo, el caudal y/o la capacidad están predeterminados en función del nivel de sFlt-1 diagnosticado en el sujeto al comienzo del procedimiento y del nivel de sFlt-1 que se desea alcanzar.

10

El uso médico reduce los niveles sanguíneos de sFlt-1 en el sujeto en un 10 %-90 %, 20 %-80 % o 30 %-50 %, en comparación con los niveles sanguíneos de sFlt-1 en el sujeto antes de que el procedimiento se ponga en práctica en el sujeto. El uso médico reduce los niveles sanguíneos de sFlt-1 en el sujeto en un 10 %-20 %, 20 %-30 %, 30 %- 40 %, 40 %-50 %, 50 %-60 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 %, o 90 %-100 % en comparación con los niveles 15 sanguíneos de sFlt-1 en el sujeto antes de que el procedimiento se ponga en práctica en el sujeto.

Los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, fijados a un soporte sólido, pueden usarse para retirar sFlt-1 de los fluidos corporales de sujetos que padecen o corren riesgo de desarrollar preeclampsia o eclampsia. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los 20 mismos, fijados a un soporte sólido, se usan para retirar sFlt-1 de sangre o plasma sanguíneo. Los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, fijados a un soporte sólido se usan en dispositivos inmunoadsorbentes extracorpóreos, que son conocidos en la técnica. La sangre o el plasma se expone a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, fijados al soporte, dando como resultado la retirada parcial o completa de sFlt-1 circulante (libre o en complejos con otras proteínas sanguíneas), después de lo 25 cual la sangre o el plasma se devuelve al cuerpo del sujeto. El uso médico divulgado en el presente documento puede implementarse en una disposición de flujo continuo, con o sin interponer una etapa de retirada de células, por ejemplo, una etapa de centrifugación, antes del contacto de la sangre o el plasma con los anticuerpos anti-sFlt-1.

Los soportes sólidos para uso en el uso médico descrito en el presente documento preferentemente deben ser no 30 tóxicos y estables cuando se exponen a sangre o componentes sanguíneos. Los soportes sólidos se pueden elegir de entre aquellos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar cualquier material poroso adecuado como soporte sólido. Los ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, materiales a base de carbohidratos tales como los diversos tipos de SEPHAROSE® (una forma reticulada de agarosa en forma de perlas), por ejemplo, SEPHAROSE 4B®, 4FF®, CL-4B® y CL-6B.

35

El soporte sólido puede estar compuesto por moléculas orgánicas o inorgánicas, o una combinación de moléculas orgánicas e inorgánicas, y puede estar compuesto por uno o más grupos funcionales, por ejemplo, grupos hidroxilo, adecuados para formar enlaces covalentes con agentes activadores. El soporte sólido puede estar compuesto por un compuesto hidrófilo, un compuesto hidrófobo o cualquier combinación de los mismos. El soporte sólido puede 40 estar compuesto por un polímero o un copolímero.

Los ejemplos de materiales adecuados para usar en soportes sólidos incluyen, aunque sin limitarse a, agarosa, celulosa, poliéter sulfonas, poliamidas, polisacáridos, politetrafluoroetileno, poliésteres, poliuretanos, fluoruro de polivinilideno, polipropileno, fluorocarburos, por ejemplo, poli(tetrafluoroetileno-co-perfluoro)(alquil vinil éter)), 45 polietileno, vidrio, policarbonatos, poliacrilato, poliacrilamida, poli(azolactona), poliestireno, cerámica y nailon.

El soporte sólido no necesita estar en ninguna forma particular. Por ejemplo, el soporte sólido puede estar en forma de perlas, membranas, geles, columnas, astillas, placas, tubos, láminas, fibras o fibras huecas. El soporte sólido también puede tener la forma de un revestimiento en el interior de una o más longitudes de tubos, tuberías o fibras 50 huecas a través de las cuales fluye la sangre o el plasma. En dichas realizaciones, los tubos, tuberías o fibras huecas preferentemente se bobinan o se retuercen o se doblan de otro modo, para maximizar la cantidad de soporte sólido en contacto con la sangre o plasma que fluye a través de los tubos, tuberías o fibras huecas.

Los procedimientos de fijación de anticuerpos y ligandos a un soporte sólido son bien conocidos en la técnica y se 55 pueden usar para fijar los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, usados en el uso médico descrito en el presente documento en un soporte sólido. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, el uso de bromuro de cianógeno, 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) o trietilamina.

En general, los soportes sólidos se pueden activar para la fijación de anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión 60 a sFlt-1 de los mismos, poniendo en contacto los soportes sólidos con un agente activador tal como un aldehído, un

epóxido, un cianógeno o un ácido carboxílico activado.

Los procedimientos de fijación de anticuerpos a soportes sólidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo,Hermanson y col. 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press;patente de EE. UU. N.° 5 5.874.165;patente de EE. UU. N.° 3.932.557;patente de EE. UU. N.° 4.772.635;patente de EE. UU. N.° 4.210.723;patente de EE. UU. N.° 5.250.6123; solicitud de patente europeaEP 1 352 957 A1 y publicación de patente internacionalWO 2004/074471. Normalmente, el soporte sólido se activa con un grupo funcional reactivo tal como un epóxido (por ejemplo, mediante el uso de epiclorhidrina), cianógenos (por ejemplo, bromuro de cianógeno (CNBr)), N,N-disuccinimidilcarbonato (DSC), aldehídos o ácido carboxílico activado (por ejemplo, ésteres de N- 10 hidroxisuccinimida (NHS) o ésteres activados de carbonildiimidazol (CDI)). Los grupos activados se pueden fijar directamente al soporte sólido, como es generalmente el caso de CNBr, o los grupos activados pueden ser parte de una molécula enlazadora o espaciadora, que normalmente es una cadena lineal de carbono, opcionalmente sustituida con átomos de oxígeno y/o nitrógeno. Un ejemplo típico de dicho enlazador es la cadena de diez miembros de carbono y oxígeno que se encuentra en el enlazador butanodiol digididil éter (un agente de 15 acoplamiento de epóxido común). El soporte sólido activado se pone a continuación en contacto con el anticuerpo en condiciones de acoplamiento.

Otros enlazadores pueden incluir una cadena de carbono ramificada, no ramificada o cíclica que comprende de 1 a 30 átomos de carbono. El enlazador puede estar compuesto por más de 30 átomos de carbono. El enlazador puede 20 comprender al menos un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre.

El producto comercial AFFI-GEL 15® (BioRad, Hercules, Calif.) se puede usar para el acoplamiento asistido por enlazador. AFFI-GEL 15® es un soporte de agarosa derivatizado con un ácido carboxílico activado por NHS como parte de un brazo enlazador que contiene una amina secundaria con carga positiva. Otro enlazador cargado se 25 divulga en lapatente de EE. Uu. N.° 5.260.373. Se puede usar un brazo enlazador más corto compuesto por

arginina para facilitar el acoplamiento a un soporte de agarosa. El enlazador de arginina se activa con NHS y porta

una carga positiva.

Los anticuerpos anti-sFlt-1, fragmentos de unión de los mismos y polipéptidos y ligandos específicos de sFlt-1

30 pueden acoplarse covalentemente a un soporte sólido de una manera que proporcione una orientación más

uniforme y una unión a sFlt-1 eficiente. La mayoría de los procedimientos implican modificar una proteína con un único grupo químico en una posición predefinida, y hacer reaccionar ese grupo con un grupo complementario en el soporte sólido. Los anticuerpos anti-sFlt-1, fragmentos de anticuerpos y ligandos se producen con enlazadores N- o C-terminales capaces de acoplarse a un soporte sólido. Los polipéptidos y ligandos se sintetizan directamente sobre 35 un soporte sólido.

Los procedimientos de diagnóstico conocidos en la técnica se pueden usar para monitorizar la preeclampsia o eclampsia de un sujeto durante la terapia para determinar la eficacia de la terapia según el uso médico divulgado en el presente documento. Los procedimientos de diagnóstico adecuados se describen en, por ejemplo,la patente de 40 EE. UU. N.° 7.335.362; la;la patente de EE. UU. N.° 7.435.419; yla patente de EE. UU. N.° 7.407.659.

Se emplean procedimientos de diagnóstico que determinan y/o monitorizan la concentración de sFlt-1 en la sangre de un sujeto con el fin de identificar sujetos adecuados para el tratamiento o la prevención usando el uso médico divulgado en el presente documento. Los procedimientos de diagnóstico se emplean para identificar sujetos que 45 corren el riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo gestacional, tal como preeclampsia o eclampsia, donde los sujetos son mujeres embarazadas con una concentración sFlt-1 en sangre mayor de aproximadamente 5 ng/ml, mayor de aproximadamente 6 ng/ml, mayor de aproximadamente 7 ng/ml, mayor de aproximadamente 8 ng/ml, mayor de aproximadamente 9 ng/ml, mayor de aproximadamente 10 ng/ml, mayor de aproximadamente 15 ng/ml, mayor de aproximadamente 20 ng/ml, mayor de aproximadamente 25 ng/ml, mayor de aproximadamente 30 ng/ml, 50 mayor de aproximadamente 40 ng/ml, o mayor de aproximadamente 45 ng/ml, pero que no muestran otros signos de un trastorno hipertensivo gestacional, tal como preeclampsia.

En el presente documento se describe un procedimiento para identificar un sujeto que tiene, o que corre el riesgo de desarrollar, un trastorno hipertensivo gestacional y poner en práctica a continuación los procedimientos ex vivo 55 divulgados en el presente documento en el sujeto así identificado, tratando o previniendo de este modo el trastorno hipertensivo gestacional. Un ser humano en periodo de gestación se identifica como un sujeto adecuado para el tratamiento o la prevención mediante el uso médico divulgado en el presente documento si se determina que la concentración de sFlt-1 en la sangre del sujeto durante el segundo trimestre del embarazo está por encima de aproximadamente 3,5 ng/ml, por encima de aproximadamente 4 ng/ml, por encima de aproximadamente 5 ng/ml, por 60 encima de aproximadamente 7,5 ng/ml, por encima de aproximadamente 10 ng/ml, por encima de aproximadamente

20 ng/ml, por encima de aproximadamente 30 ng/ml, por encima de aproximadamente 40 ng/ml o por encima de aproximadamente 50 ng/ml.

Cuando se determinan y/o monitorizan los niveles sanguíneos de sFlt-1 del sujeto, el uso médico descrito en el 5 presente documento se puede emplear hasta que la concentración de sFlt-1 en la sangre del sujeto sea menor de aproximadamente 50 ng/ml, menor de aproximadamente 45 ng/ml, menor de aproximadamente 40 ng/ml, menor de

aproximadamente 35 ng/ml, menor de aproximadamente 30 ng/ml, menor de aproximadamente 25 ng/ml, menor de

aproximadamente 20 ng/ml, menor de aproximadamente 15 ng/ml, menor de aproximadamente 10 ng/ml, menor de

aproximadamente 7,5 ng/ml, menor de aproximadamente 5 ng/ml, menor de aproximadamente 4 ng/ml, menor de

10 aproximadamente 3 ng/ml, menor de aproximadamente 2 ng/ml, menor de aproximadamente 1,5 ng/ml o menor de aproximadamente 1 ng/ml.

El uso médico divulgado en el presente documento puede emplearse hasta que se detecte una mejoría en los síntomas de un trastorno hipertensivo gestacional. El trastorno hipertensivo gestacional puede ser preeclampsia y la 15 mejoría puede ser una disminución de la presión arterial a un valor de menos de 140 mmHg (sistólica) y/o menos de 90 mmHg (diastólica).

La presente invención proporciona una carcasa o cámara tal como una columna que contiene anticuerpos anti-sFlt- 1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de lo mismos, unidos a un soporte sólido, donde la carcasa o cámara es adecuada 20 para uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno hipertensivo gestacional, tal como eclampsia o preeclampsia.

En ciertas realizaciones, la carcasa o cámara es una columna. «Columna» se refiere a un recipiente, cámara o carcasa, generalmente de forma cilíndrica, que contiene un soporte sólido al que pueden fijarse o se han fijado 25 anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, o ligandos de sFlt-1.

La columna contiene un volumen de aproximadamente 5 ml a 2000 ml, aproximadamente 10 ml a aproximadamente 1000 ml, aproximadamente 50 ml a aproximadamente 500 ml, o aproximadamente 200 ml a aproximadamente 400 ml de anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido. La 30 columna contiene un volumen de aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 25 ml, aproximadamente 50 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 300 ml, aproximadamente 500 ml, aproximadamente 750 ml, aproximadamente 1000 ml, aproximadamente 1500 ml, o aproximadamente 2000 ml de anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido. La columna puede contener una o más sustancias anticoagulantes, por ejemplo, heparina. El interior 35 de la columna puede haber sido tratado de una manera destinada a reducir la cantidad de bacterias, micoplasmas y/o virus en el interior de la columna. El interior de la columna puede ser estéril.

La columna contiene suficientes anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido, para retirar al menos 10 pg, al menos 25 pg, al menos 50 pg, al menos 75 pg, al menos 100 pg, al 40 menos 150 pg, al menos 200 pg, al menos 300 pg, al menos 400 pg, al menos 500 pg, al menos 600 pg, al menos 700 pg, al menos 800 pg, al menos 900 pg, al menos 1000 pg, al menos 1500 pg o al menos 2000 pg de sFlt-1 de sangre o plasma humanos. La columna contiene suficientes anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido, para retirar al menos de 10 pg a 2000 pg, al menos de 20 pg a 1000 pg, al menos de 50 pg a 500 pg o al menos de 100 pg a 200 pg de sFlt-1 de sangre o plasma humanos.

45

Los procedimientos de fabricación de un dispositivo para tratar o prevenir un trastorno hipertensivo gestacional, tal como eclampsia o preeclampsia, comprenden:

(a) fijar anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, a un soporte sólido para producir 50 anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido,

(b) introducir los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido en una carcasa o cámara tal como una columna para producir una carcasa o cámara que contiene los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido,

55

(c) conectar de forma fluida la carcasa o cámara que contiene los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, a un medio para transportar sangre o plasma desde un sujeto a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno anti-sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido,

60 (d) conectar de forma fluida la carcasa o cámara que contiene los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a

sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, a un medio para transportar la sangre o el plasma desde los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, al sujeto, donde los medios están conectados a la carcasa o cámara para permitir el contacto de la sangre o el plasma del sujeto con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno anti-sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, y 5 retirar de ese modo sFlt-1 de la sangre o el plasma.

Los procedimientos de fabricación de un dispositivo para tratar o prevenir un trastorno hipertensivo gestacional, tal como eclampsia o preeclampsia, comprenden modificar un dispositivo o sistema de diálisis o aféresis para dotal al dispositivo o sistema de diálisis o aféresis de una carcasa o cámara tal como una columna que contiene anticuerpos 10 anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos a un soporte sólido, para permitir que el dispositivo o sistema de diálisis o aféresis proporcione el contacto de sangre o plasma de un sujeto con los anticuerpos anti- sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno anti-sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido y retirar, de este modo, sFlt-1 de la sangre o el plasma para producir sangre o plasma agotados en sFlt-1.

15 Los procedimientos de identificación de un anticuerpo anti-sFlt-1 adecuado para su uso en procedimientos ex vivo de tratamiento o prevención de un trastorno hipertensivo gestacional, tal como eclampsia o preeclampsia, comprenden:

(a) obtener un anticuerpo que se une a sFlt-1;

20

(b) fijar el anticuerpo que se une a sFlt-1 a un soporte sólido para producir un soporte sólido que comprende anticuerpo anti-sFlt-1 unido;

(c) determinar si el soporte sólido que comprende el anticuerpo anti-sFlt-1 unido puede unirse a sFlt-1 en una 25 muestra de fluido de un sujeto y retirar, de ese modo, sFlt-1 de la muestra de fluido;

donde si el soporte sólido que comprende anticuerpo anti-sFlt-1 unido puede unirse a sFlt-1 en una muestra de fluido de un sujeto y retirar, de ese modo, sFlt-1 de la muestra de fluido, el anticuerpo de la etapa (a) se identifica como un anticuerpo anti-sFlt-1 adecuado para uso en procedimientos ex vivo de tratamiento o prevención de un trastorno hipertensivo gestacional, tal como eclampsia o preeclampsia.

30

En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

La muestra de fluido es sangre, plasma, líquido amniótico u orina.

35 Puede usarse un sistema de diálisis o aféresis modificado para poner en práctica el uso médico divulgado en el presente documento, en el que el sistema de diálisis o aféresis modificado proporciona los medios mediante los cuales se extrae la sangre, se le hace pasar sobre un soporte sólido que contiene anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt- 1 de los mismos, unidos y se devuelve al cuerpo del sujeto después de la retirada de sFlt-1 de la sangre por los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos. En algunas 40 realizaciones, el sistema de aféresis es un sistema de plasmaféresis y se hace pasar plasma en lugar de sangre sobre un soporte sólido que contiene anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos y se devuelve al cuerpo del sujeto tras la retirada de sFlt- 1 del plasma por los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos.

45 El uso médico divulgado en el presente documento puede llevarse a cabo usando una versión modificada de un dispositivo conocido en la técnica que permite la retirada y el tratamiento extracorpóreo de un fluido corporal tal como sangre completa o plasma. Un dispositivo de este tipo es una máquina de diálisis. Las máquinas de diálisis son de uso rutinario y los procedimientos para controlar el flujo sanguíneo, eliminar las burbujas de aire y mantener el equilibrio electrolítico, la glucemia, la oxigenación, la temperatura, la esterilidad y otros factores vitales durante la 50 diálisis son bien conocidos y establecidos en la técnica. El uso médico divulgado en el presente documento puede llevarse a cabo usando sistemas de diálisis existentes donde el dializador se sustituye por una carcasa o cámara, tal como una columna, que contiene un soporte sólido al que están fijados anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos. Cuando la sangre fluye a través de la carcasa o cámara, los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, retiran sFlt-1 de la sangre, lo que rebaja la concentración de sFlt-1 en la 55 sangre y trata o previene un trastorno hipertensivo gestacional, tal como preeclampsia o eclampsia.

Otro dispositivo bien conocido que se puede usar para poner en práctica el uso médico descrito en el presente documento es un sistema de aféresis, por ejemplo, un sistema de plasmaféresis. La plasmaféresis implica la manipulación extracorpórea y la retirada de ciertos componentes celulares de la sangre, después de lo cual la 60 sangre se reinfunde en el sujeto para inducir un efecto clínico deseado. Durante la plasmaféresis, la sangre se

extrae inicialmente del cuerpo a través de un dispositivo de acceso, tal como una aguja o un catéter. El plasma se retira de la sangre mediante un separador de células. Tres procedimientos se usan comúnmente para separar el plasma de las células sanguíneas: (1) Centrifugación de flujo discontinuo, donde, normalmente, se retira un volumen de 300 ml de sangre cada vez y se centrifuga para separar el plasma de las células sanguíneas. (2) Centrifugación 5 de flujo continuo, donde la centrifugación se usa para escindir continuamente el plasma. (3) Filtración de plasma, donde el plasma se filtra usando equipo de hemodiálisis estándar.

Dispositivos de aféresis adecuados para modificación para uso en el uso médico divulgado en el presente documento se describen, por ejemplo, enla patente de EE. UU. N.° 5.098.372;la patente de EE. UU. N.° 5.112.298; 10 yla patente de EE. UU. N.° 6.319.471. Otros dispositivos adecuados incluyen el dispositivo de terapia de plasma LIfE-18® de PlasmaSelect (Munich, Alemania), Diapact® CRRT de B. Braun (Melsungen, Alemania), COBE SPECTRA®, un producto de Cobe BCT, Incorporated, 1201 Oak Street , Lakewood, Co. 80215, y el sistema de Separación Celular ELUTRA® de Gambro BCT, Inc.

15 El dispositivo de acceso para acceder al aparato circulatorio del sujeto y/o al dispositivo de retorno para devolver sangre, plasma o componentes celulares de la sangre a un sujeto es un catéter de una sola luz o un catéter de doble luz tal como, por ejemplo, los catéteres de una sola luz o de doble luz comercializados por Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Alemania). Dichos catéteres pueden estar fabricados de poliuretano termosensible que se adapta al contorno de un vaso sanguíneo a medida que el poliuretano se calienta a la temperatura corporal.

20

Retirar sangre del sujeto incluye retirar una cantidad de sangre del sujeto suficiente para derivar al menos aproximadamente 650 mililitros de plasma de la sangre. Retirar la sangre del sujeto incluye retirar al menos dos litros de sangre del sujeto. Retirar la sangre del sujeto incluye retirar de forma continua sangre del sujeto hasta que sustancialmente todo el volumen sanguíneo del sujeto se pone en contacto con anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos 25 de unión a sFlt-1 de los mismos, al menos una vez, al menos dos veces o al menos tres veces. Retirar la sangre del sujeto incluye retirar de forma continua sangre del sujeto hasta que aproximadamente dos tercios, aproximadamente la mitad, aproximadamente una cuarta parte, aproximadamente una quinta parte, o aproximadamente una décima parte del volumen total de sangre del sujeto se pone en contacto con anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos. Retirar la sangre del sujeto incluye retirar de forma continua sangre del sujeto hasta que la 30 concentración de sFlt-1 en la sangre del sujeto alcance una concentración preseleccionada. La concentración preseleccionada es menor de aproximadamente 50 ng/ml, menor de aproximadamente 40 ng/ml, menor de aproximadamente 25 ng/ml, menor de aproximadamente 10 ng/ml, menor de aproximadamente 5 ng/ml, menor de aproximadamente 4 ng/ml, menor de aproximadamente 3 ng/ml, menor de aproximadamente 2 ng/ml, menor de aproximadamente 1 ng/ml, menor de aproximadamente 0,75 ng/ml o menor de aproximadamente 0,5 ng/ml. La 35 concentración preseleccionada es aproximadamente 40-50 ng/ml, aproximadamente 30-40 ng/ml, aproximadamente 20-30 ng/ml, aproximadamente 10-20 ng/ml, aproximadamente 5-10 ng/ml, aproximadamente 5-8 ng/ml, aproximadamente 3-7 ng/ml, aproximadamente 1-5 ng/ml, aproximadamente 1-3 ng/ml, aproximadamente 0,752 ng/ml, o aproximadamente 0,5-1 ng/ml.

40 La concentración de sFlt-1 se puede medir automáticamente en sangre o plasma, ya sea de forma continua o en intervalos preestablecidos. Por ejemplo, las muestras de plasma del sujeto se pueden hacer reaccionar con un reactivo etiquetado que se une a sFlt-1 o partículas que contienen sFlt-1 y mide la cantidad de sFlt-1. Como alternativa, se puede usar un sensor con un reactivo enlazado que se une específicamente a sFlt-1 (incluidas las partículas que contienen sFlt-1) para detectar de forma continua la cantidad de sFlt-1 unido. El procedimiento de 45 filtración de sangre finaliza cuando la concentración de sFlt-1 detectada en la sangre o plasma de un sujeto cae por debajo de un valor predeterminado.

EJEMPLOS

50 Ejemplo 1 - Retirada de sFlt-1 del líquido amniótico humano usando un dispositivo de columna que contiene un soporte sólido con anticuerpos o ligandos anti-sFlt-1 unidos

Las condiciones experimentales se diseñaron para aproximarse al uso en un entorno clínico, pero a menor escala. El líquido amniótico se obtuvo de pacientes humanos con preeclampsia con niveles elevados de sFlt-1 de 55 aproximadamente 40 ng/ml.

Todos los anticuerpos usados fueron anticuerpos monoclonales de ratón que se unen a sFlt-1, con la excepción de una columna de control que usó anticuerpos policlonales para el Factor VIIi humano. Los anticuerpos monoclonales anti-sFlt-1 se prepararon inmunizando ratones con proteína sFlt-1 humana (dominios 1-3 similares a Ig) que incluye 60 los aminoácidos Ser27 a Ile328. Esta proteína también tenía una cola de afinidad de polihistidina en el extremo

carboxi. 12 anticuerpos que se unieron a sFlt-1 se seleccionaron y se ensayó su afinidad de unión a sFlt-1.

Se fabricó un dispositivo para retirar la proteína sFlt-1 de una solución biológica fijando anticuerpos anti-sFlt-1 a una matriz en fase sólida (perlas de agarosa). Las perlas de agarosa se trataron químicamente con bromuro de 5 cianógeno para crear un grupo químico reactivo sobre las perlas. Estas perlas activadas se mezclaron a continuación con anticuerpo para fijar covalentemente los anticuerpos a las perlas.

Las perlas con los anticuerpos fijados se vertieron a continuación en una columna de 1 ml que contenía una malla/frita en el fondo, que retenía las perlas dentro de la columna, pero que permitía que los fluidos o soluciones 10 pasaran a través de la columna. Al dispositivo resultante, que contenía anticuerpos anti-sFlt-1 fijados a perlas, se le añadió líquido amniótico de pacientes con preeclampsia en la parte superior del dispositivo y se recogió la solución que fluía a través del dispositivo y hacia el fondo de la columna. Se midió la cantidad de sFlt-1 en el líquido amniótico antes y después de pasar a través del dispositivo, y se calculó el % de sFlt-1 agotada.

15 Detalles adicionales fueron los siguientes:

(1) Se añadieron 0,1 ml de perlas de agarosa acopladas a anticuerpo anti-sFlt-1 a una columna de 1 ml.

(2) 500 pg de anticuerpo se unieron a las perlas de agarosa.

(3) La columna se lavó con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

20 (4) Se añadió 1 ml de líquido amniótico de pacientes con preeclampsia (que contenía aproximadamente 40 ng de proteína sFlt-1) a la parte superior de la columna.

(5) El líquido amniótico se hizo pasar por la columna a un caudal de aproximadamente 1 ml/15 minutos a temperatura ambiente (21-24 °C).

(6) El líquido amniótico se recogió y se volvió a aplicar al dispositivo dos veces, dando como resultado un total de 25 tres pases por la columna.

(7) Después del tercer pase por la columna, se recogió la solución de flujo continuo y se ensayó su concentración de sFlt-1.

(8) El dispositivo se lavó con 4 ml de tampón para retirar cualquier material que estuviera unido inespecíficamente a las perlas/columna. A continuación, se añadieron 0,5 ml de ácido acético 0,5 M (pH 3,0) al dispositivo para disociar

30 el sFlt-1 unido del dispositivo. Las fracciones de la solución eluida se recogieron y se midió la concentración de sFlt- 1 para determinar si hubo algún cambio.

Los resultados para anticuerpos ejemplares, que incluyen la afinidad por sFlt-1 y el % de sFlt-1 retirado del líquido amniótico se muestran en la tabla 2 a continuación.

35

Tabla 2.

Muestra: Kd (M) % de sFlt-1 retirado

líquido amniótico antes de la columna: 0

columna (sin anticuerpo): 0

columna con anticuerpo para el Factor VIII: <1

columna con anticuerpo 101: 1,44E-09 53

columna con anticuerpo 102: 2,17E-10 85

columna con anticuerpo 103: 3,12E-10 87

columna con anticuerpo 104: n.d. 85

columna con anticuerpo 105: 7,05E-08 <1

columna con anticuerpo 106: 1,58E-09 59

columna con anticuerpo 107: 8,11E-09 <1

columna con anticuerpo 108: 4,99E-09 11

columna con anticuerpo 109: 7,66E-10 48

columna con anticuerpo 110: 3,36E-10 58

columna con anticuerpo 111: 3,18E-10 50

columna con anticuerpo 112: 5,35E-10 28

columna con VEGF121: n.d. 50

Se usó un procedimiento similar con VEGF121. El VEGF121 se expresó en bacterias, se purificó por cromatografía en columna y se acopló a perlas de agarosa activadas con bromuro de cianógeno. En caso contrario, el procedimiento para aplicar líquido amniótico a la columna que contenía el VEGF121 acoplado a perlas de agarosa fue 40 sustancialmente el mismo que para los anticuerpos.

Los resultados para los anticuerpos anti-sFlt-1 y VEGF121 se muestran en la figura 2.

Los resultados muestran que los anticuerpos anti-sFlt-1 y el ligando de sFlt-1 unidos a un soporte sólido fueron capaces de retirar específicamente sFlt-1 del líquido amniótico de pacientes con preeclampsia. Un dispositivo de 5 columna de control que contenía la matriz/perlas solo sin anticuerpo o ligando unido no retiró la proteína sFlt-1 del líquido amniótico. Un dispositivo de columna de control que contenía un anticuerpo que se une al Factor VIII de coagulación tampoco retiró sFlt-1. Sin embargo, cuando se usaron anticuerpos o ligandos que se unen a sFlt-1 en la columna, los niveles de proteína sFlt-1 se redujeron en el flujo continuo de líquido amniótico hasta en un 87 %. Se observó una variación significativa en lo eficaces que eran los anticuerpos individuales en la retirada de sFlt-1 (1110 87 %). La Kd de unión aparente entre anticuerpos monoclonales purificados y sFlt1 se midió mediante resonancia del plasmón superficial (SPR). (Figura 2B). Los anticuerpos se inmovilizaron en la fase sólida y sFlt-1 (dominios 1-3) estaba en la fase líquida. No hubo una correlación directa entre la afinidad del anticuerpo (según lo medido en un experimento de unión cinética) (figura 2B) y la eficacia (figura 2A) en el dispositivo. Tampoco hubo una correlación directa con las constantes de asociación o de disociación y la eficacia del dispositivo. Estos resultados muestran que 15 los dispositivos que comprenden anticuerpos anti-sFlt-1 unidos a un soporte sólido pueden usarse para tratar trastornos hipertensivos gestacionales, incluyendo preeclampsia.

Ejemplo 2 - Quimerización

20 Se produjeron anticuerpos monoclonales quiméricos que tenían regiones variables murinas y regiones constantes de IgG1 humana. Se produjeron varias variaciones de anticuerpo quimérico. El anticuerpo AG10A (SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36) consiste en los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 102 y una región constante de IgG1 humana. El anticuerpo AG10B (SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:36) incorpora una mutación (N298Q) que elimina un sitio de glucosilación en la región constante. El anticuerpo AG10C (SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36)

25 incorpora una mutación (I254A) que altera la unión a FcRn. El anticuerpo AG10D (SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:36)

incorpora las dos mutaciones mencionadas anteriormente.

Ejemplo 3 - Características del anticuerpo AG10B inmovilizado

30 Se realizaron diversos ensayos de las características de agotamiento de sFlt-1 del Anticuerpo AG10B.

Caudal - Se aplicaron cuarenta volúmenes de lecho de suero de caballo adicionado con 40 ng/ml de sFlt1 (entrada) a una columna que contenía 1 ml de perlas de Sepharose compactadas acopladas al anticuerpo monoclonal AG10B (0,8 mg) y se recogieron las fracciones de flujo continuo (FT). Las concentraciones de sFlt1 en las fracciones de 35 entrada y FT se determinaron usando el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321). El % de agotamiento de sFlt1 se calculó

mediante la fórmula, % de agotamiento de sFlt1 = [(sFlt1Entrada-sFlt1FT)/ sFlt1Entrada]. La variación del agotamiento de

sFlt-1 con el caudal se muestra en la tabla 3 y la figura 4.

Tabla 3.

caudal (ml/min): % de agotamiento de sFlt1

0,5: 98 %

1,0: 94 %

1,5: 87 %

3,0: 77 %

40 Caudal lineal - Se aplicaron cuarenta volúmenes de lecho de suero de caballo adicionado con 40 ng/ml de sFlt1 (entrada) a una columna que contenía 1 ml de perlas de Sepharose acopladas al anticuerpo monoclonal AG10B (0,8 mg) y se recogieron las fracciones de flujo continuo (FT). Las concentraciones de sFlt1 en las fracciones de entrada y FT se determinaron usando el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321). El % de agotamiento de sFlt1 se calculó mediante la fórmula, % de agotamiento de sFlt1 = [(sFlt1Entrada-sFlt1FT)/sFlt1Entrada]. La variación del agotamiento de 45 sFlt-1 con el caudal lineal se muestra en la tabla 4 y la figura 5.

Tabla 4.

Caudal lineal (cm/h): % de agotamiento de sFlt1

38: 98 %

76: 94 %

113: 87 %

230: 77 %

Tiempo de residencia - Se aplicaron cuarenta volúmenes de lecho de suero de caballo adicionado con 40 ng/ml de sFlt1 (entrada) a una columna que contenía 1 ml de perlas de Sepharose acopladas al anticuerpo monoclonal AG10B (0,8 mg) y se recogieron las fracciones de flujo continuo (FT). Las concentraciones de sFlt1 en las fracciones de entrada y FT se determinaron usando el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321). El % de agotamiento de sFlt1 se calculó 5 mediante la fórmula, % de agotamiento de sFlt1 = [(sFlt1Entrada-sFlt1FT)/sFlt1Entrada]. La variación del agotamiento de sFlt-1 con el tiempo de residencia en la columna se muestra en la tabla 5 y la figura 6.

Tabla 5.

Tiempo de residencia (min): % de agotamiento de sFlt1

0,33: 77 %

0,67: 87 %

1,00: 94 %

2,00: 98 %

Densidad de Ab monoclonal - Se aplicó suero de caballo adicionado con sFlt1 recombinante sobre una columna de 10 1 ml que contenía perlas de Sepharose (aproximadamente 1,5 x 106 perlas/ml), acopladas a diversas cantidades de AG10B a un caudal de 0,5 ml/min (tiempo de residencia de 2 min).

Para 0,8 mg de Ab (aproximadamente 3,2x1015 moléculas) por ml, esto supone aproximadamente 2,1 x 109 moléculas por perla. De forma similar, a 0,4 mg de Ab (1,6x1015 moléculas) hay aproximadamente 1,05 x 109 15 moléculas por perla. Dada un área superficial de la perla de 2,5x10'4 cm2, 0,8 mg de Ab por perlas de 1 ml suponen aproximadamente 8,4xE12 moléculas de Ab por cm2 de área superficial de perla (sin incluir poros). El % de agotamiento de sFlt1 se determinó dividiendo la cantidad agotada de sFlt1 por la entrada de sFlt1 total. Las concentraciones de sFlt1 se determinaron usando el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321). La variación del agotamiento de sFlt-1 con la densidad de MAb se muestra en la tabla 6 y la figura 7.

20

Tabla 6.

Densidad de Ab (mg/ml de perlas): % de agotamiento de sFlt1

0,025: 74 %

0,050: 82 %

0,100: 84 %

0,200: 90 %

0,400: 96 %

0,800: 97 %

Agotamiento de sFlt-1 del plasma y el suero.

Se aplicó plasma humano normal adicionado con sFlt1 recombinante sobre columnas de 0,1 ml que contenían 25 perlas de Sepharose acopladas a AG10B o Erbitux. El porcentaje de agotamiento se determinó para un amplio intervalo de relaciones Ab:ligando. La disminución de la capacidad de la columna se produce cuando la relación AG10B:sFlt1 está por debajo de 200:1. (Figura 8). Los desplazamientos en columna se realizaron por flujo gravitacional, por lo que el tiempo de residencia y los caudales fueron variables. Las cantidades de sFlt1 se determinaron mediante el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321).

30

Se aplicó suero de caballo adicionado con sFlt1 recombinante sobre columnas de 1 ml que contenían perlas de Sepharose acopladas a AG10B. El porcentaje de agotamiento se determinó para el intervalo de relaciones MAb:ligando. La disminución de la capacidad de la columna se produce cuando la relación AG10B:sFlt1 está por debajo de 25:1. (Figura 9). El desplazamiento en las columnas fue a 1 ml/min con un tiempo de residencia de 1 min. 35 Las cantidades de sFlt1 se determinaron mediante el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321).

El agotamiento de sFlt-1 por AG10B no varía con el tamaño de la columna. Se aplicó suero de caballo adicionado con 40 volúmenes de lecho de 40 ng/ml de sFlt1 en el tiempo de residencia de 2 minutos a columnas de 1 ml o 50 ml que contenían perlas de Sepharose acopladas a anticuerpo monoclonal AG10B (0,8 mg o 40 mg, 40 respectivamente), y se recogieron las fracciones de flujo continuo (FT). Las concentraciones de sFlt1 en las fracciones de entrada y FT se determinaron usando el kit R&D Flt-1 DuoSet (DY321). El % de agotamiento de sFlt1 se calculó mediante la fórmula, % de agotamiento de sFlt1 = [(sFlt1Entrada-sFlt1FT)/ sFlt1Entrada]. La figura 10 muestra que columnas de dispositivo tanto de 1 ml como de 50 ml pueden agotar casi toda la proteína sFlt1 en el suero.

45 La heparina no interfiere en el agotamiento de sFlt-1 por AG10B. Se aplicó suero de caballo que contenía sFlt1

recombinante con o sin 0,45 U de heparina sobre una columna de 0,1 ml que contenía perlas de Sepharose acopladas a AG10B. Las muestras se analizaron para determinar los niveles de sFlt1 antes (carga) y después (FT) de fluir a través de las columnas que contenían AG10B. Los niveles de sFlt1 se analizaron usando el kit R & D Flt-1 DuoSet (DY321). (Tabla 7, figura 11)

5

Tabla 7.

Niveles de sFlt-1 (ng/ml): Suero Suero + Heparina

sFlt-1 total: 29,3 26,2

sFlt-1 agotado mediante Ag10B: 21,6 20,9

% de agotamiento: 74 % 80 %

El AG10B unido a sFlt-1 no bloquea la unión de sFlt-1 a VEGF. Como se representa en la figura 12, las placas de ELISA se revistieron con sFlt1 o VEGF. Después del lavado, se añadió PBS a un pocillo revestido con sFlt-1, y se añadió PBS o sFlt1 a los pocillos revestidos con VEGF. Después del lavado, se añadió AG10B o 18F1 (un 10 anticuerpo que bloquea la interacción sFlt1 - VEGF) a los pocillos que contenían VEGF inmovilizado unido a sFlt-1, y sFlt1 precomplejado con AG10B, o sFlt1 precomplejado con 18F1 a pocillos revestidos con PBS. Como se indica en la figura 12, el AG10B se une a sFlt1 y a complejos de sFlt1/VEGF. El sFlt1/AG10B precomplejado también se une a VEGF. En contraste, 18F1, un anticuerpo bloqueante, no se une a los complejos de sFlt1/VEGF. De forma similar, la adición de 18F1 a sFlt1 impide la interacción de VEGF y sFlt1.

15

Activación del complemento - El AG10B acoplado a las perlas no activa el sistema del complemento más que las perlas solas (figura 13). Se aplicó plasma sanguíneo humano adicionado con sFlt1 purificado a columnas de 0,1 ml que contenían perlas de Sepharose acopladas a anticuerpo monoclonal AG10B purificado o una columna de control negativo sin anticuerpo (PBS pH 7,4, perlas). Las muestras se calentaron a 37 °C y se ensayaron para la activación 20 del complemento del producto C3a usando el kit Quidel MicroVue C3a Plus EIA según las instrucciones del fabricante. Los patrones C3a proporcionados en el kit se usaron para generar una curva patrón usadas para determinar las concentraciones de C3a en las fracciones de plasma.

AG10B se une a un epítopo en el dominio d1-d3 de sFlt-1. La tabla 8 muestra que AG10B se une a un epítopo en 25 formas de sFlt1 nativas que existen en el líquido amniótico (LA) de pacientes con PE, así como a dos formas recombinantes (dominio d1-d3 o de longitud completa) de sFlt1. El anticuerpo bloqueante 18F1 que compite con VEGF por un sitio de unión en sFlt1 no es capaz de unirse tan eficientemente a sFlt1 (d1-d3) en presencia de VEGF. El anticuerpo 508 no puede unirse a sFlt1 (d1-d3) pero puede unirse a isoformas de sFlt1 nativas en el LA, lo que indica que su epítopo de unión en sFlt1 puede estar ubicado fuera del dominio d1-d3. El anticuerpo de control 30 negativo Ebx no puede unirse a formas nativas o recombinantes de sFlt1.

Tabla 8.

: sFlt1 nativo en líquido amniótico sFlt1 recombinante (d1-d3) sFlt1 recombinante (d1-d3) +VEGF sFlt1 recombinante de longitud completa

AG10B: + + + +

18F1: n.d. + +/- n.d.

508: + - n.d. -

Ebx: - - - -

LISTADO DE SECUENCIAS

35 <110> Aggamin, Inc.

Kussie, Paul Joo, Woo S.

<120> PROCEDIMIENTOS Y SISTEMAS PARA TRATAR O PREVENIR TRASTORNOS HIPERTENSIVOS GESTACIONALES 40 <130> 15088/461WO1 <140> sin asignar <141> 07/02/2012 <150> US 61/440.169 <151> 07/02/2011 45 <160> 39

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 15 <212>ADN

5 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(15)

<400> 1

aat tat ggt gta cat 15

Asn Tyr Gly Val His 1 5

10

<210> 2 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus

15 <400> 2

Asn Tyr Gly Val His 1 5

<210> 3 <211> 48 <212>ADN

20 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(48)

<400> 3

gtg ata tgg agt ggt gga age ate gat tat aat gca gtt ttc aca tcc 48

Val lie Trp Ser Gly Gly Ser lie Asp Tyr Asn Ala Val Phe Thr Ser 15 10 15

25

<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus 30 <400> 4

Val lie Trp Ser Gly Gly Ser lie Asp Tyr Asn Ala Val Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 5 <211> 42 <212>ADN

35 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(42)

<400>5

aat gtg ggc Asn Val Gly 1

40

<210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus 45 <400> 6

imagen1

Asn Val Gly Tyr Arg Tyr Asp Asp Gly Tyr Val Met Asp Tyr 15 10

<210> 7 <211> 33 <212>ADN

5 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(33)

<400>7

aag gcc agt cag agt gtg agt att gat gta gct Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser lie Asp Val Ala

10 1 5 10

<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

15 <400> 8

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser lie Asp Val Ala 15 10

<210> 9 <211> 21 20 <212>ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(21)

25 <400> 9

cat gca tcc aat cgg tac act His Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 10 <211>7 <212> PRT

30 <213> Mus musculus

<400> 10

His Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 11 <211> 27 35 <212>ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(27)

40 <400> 11

cag cag aat tat gac tct cea ttc acg

Gln Gln Asn Tyr Asp Ser Pro Phe Thr

1 5

<210> 12 <211>9 <212> PRT

45 <213> Mus musculus

<400> 12

33

21

Gln Gln Asn Tyr Asp Ser Pro Phe Thr 1 5

<210> 13 <211> 366 <212>ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(366) <400> 13 cag gtg cag Gln Val Gln 1

age ctg tcc Ser Leu Ser

ggt gta cat Gly Val His 35

gga gtg Gly Val 50

ata

lie

tcc aga ttg Ser Arg Leu 65

aaa gtg aac Lys Val Asn

ctg: aag cag tea gga cct ggc cta gtg cag ccc tea cag

Leu: Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

: 5 10 15

etc: acc tgc aca gtc tet ggt ttc tea tta act aat tat

Leu: Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20: 25 30

tgg: att cgc cag tet cea gga aag ggt ctg gag tgg ctg

Trp: lie Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu




: 40 45

tgg: agt ggt gga age ate gat tat aat gca gtt ttc aca

Trp: Ser Gly Gly Ser lie Asp Tyr Asn Ala Val Phe Thr



: 55 60

acc: ate acc aag gac cat tcc aag age caa gtt ttc ttt

Thr: lie Thr Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe


: 70 75 80

agt: ctg gaa agt aat gac aca gee ata tat tac tgt gee

Ser: Leu Glu Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala

48

96

144

192

240

288

85

90

95

aga aat gtg Arg Asn Val

ggt caa gga

Gly Gln Gly 115

<210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus 15 <400> 14

10

ggc: tat agg tac gac

Gly 100: Tyr Arg Tyr Asp

acc: tea gtc ate gtc

Thr: Ser Val lie Val 120

gac ggc tat gtt atg gac tac tgg Asp Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp 105 110

tcc tea Ser Ser

336

366

5

Gln: Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser
Gln

1: 5 10 15

Ser: Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr



: 20 25 30

Gly: Val His Trp lie Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu


: 35 40 45

Gly: Val lie Trp Ser Gly Gly Ser lie Asp Tyr Asn Ala Val Phe Thr

: 50 55 60

Ser: Arg Leu Thr lie Thr Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65: 70 75 80

Lys: Val Asn Ser Leu Glu Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala




: 85 90 95

Arg: Asn Val Gly Tyr Arg Tyr Asp Asp Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp



: 100 105 110

Gly: Gln Gly Thr Ser Val lie Val Ser Ser

115 120

<210> 15 <211> 327 5 <212>ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(327)

10 <400> 15

agt

Ser

1

gac

Asp

gta

Val

tat

Tyr

agt

Ser

65

gaa

Glu

acg

Thr

att: gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt gta tea gca

lie: Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala



: 5 10 15

agg: gtt acc ata acc tgc aag gee agt cag agt gtg agt att

Arg: Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser lie


: 20 25 30

gct: tgg tac caa cag aag cea ggg cag tet cct aaa ctt ctg

Ala: Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu

: 35 40 45

cat: gca tcc aat cgg tac act gga gtc cct gat cgc ttc att

His: Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe lie

50: 55 60

aga: tat ggg acg gat ttc act ttc acc ate age act gtg cag

Arg: Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gln




: 70 75

gac: ctg gca gtt tat ttc tgt cag cag aat tat gac tet cea

Asp: Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Ser Pro



: 85 90 95

ttc: ggc tcg ggg aca aag ttg gaa tta aaa cgg gct

Phe: Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala


: 100 105

<210> 16 <211> 109 <212> PRT

5 <213> Mus musculus <400> 16

gga

Gly

gat

Asp

ata

lie

gga

Gly

gct

Ala

80

ttc

Phe

48

96

144

192

240

288

327

Ser: lie Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1: 5 10 15

Asp: Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser lie
Asp



: 20 25 30

Val: Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie


: 35 40 45

Tyr: His Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe lie Gly

: 50 55 60

Ser: Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gln Ala

65: 70 75 80

Glu: Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Ser Pro Phe




: 85 90 95

Thr: Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 17 10 <211> 30 <212>ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS

<222> (1)..(30)

5 <400> 17

gga tac aca ttc act gac tat gtt ata agt Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val lie Ser 15 10

<210> 18 <211> 10 <212> PRT

10 <213> Mus musculus

<400> 18

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val lie Ser 15 10

<210> 19 <211> 60 15 <212> ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(60)

20 <400> 19

30

imagen2

<210> 20 <211> 20 <212> PRT

25 <213> Mus musculus <400> 20

imagen3

<210> 21 <211> 27 30 <212>ADN

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(27)

35 <400> 21

ggg cat tat tac Gly His Tyr Tyr 1

<210> 22 <211>9 <212> PRT

40 <213> Mus musculus <400> 22

ggt

Gly

5

tac

Tyr

ttt

Phe

gac

Asp

tac

Tyr

10

imagen4

<210> 23 <211> 39 <212>ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(39)

<400> 23

aag gcc agt cag gat gtg act att act gta gcc Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr lie Thr Val Ala

15 10

<210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus 15 <400> 24

Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr lie Thr Val Ala Trp Tyr 15 10

tgg

Trp

tat

Tyr

39

<210> 25 <211> 33 <212>ADN

20 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(33)

<400> 25

ctt ctg att tac tcg gca tcc tac cgg tac act Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

25 1 5 10

<210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

30 <400> 26

Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 15 10

33

<210> 27 <211> 27 <212>ADN

35 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS

.(27)

cat

His

tat

Tyr

<222> (1)

<400> 27 cag caa Gln Gln 1

<210> 28 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus 45 <400> 28

40

act

Thr

5

act

Thr

ccg

Pro

tgg

Trp

acg

Thr

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 29 <211> 354 <212>ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(354) <400> 29 cag Gln 1

tea Ser

gtt

Val

gga

Gly

aag

Lys

65

atg

Met

gca

Ala

act

Thr

gtt: cag ctg cag cag tet gga cct

Val: Gln Leu Gln 5 Gln Ser Gly Pro

gtg: aag atg tcc tgc aag gct tet

Val: Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser


: 20 25

ata: agt tgg gtg aaa cag aga act

lie: Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr

: 35 40

gag: att tat cct gga agt ggt agt

Glu: lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser

50: 55

ggc: aag gee aca ctg act gca gac

Gly: Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp




: 70

cag: etc age age ctg aca ttt gag

Gln: Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu



: 85

aga: ggg cat tat tac ggt tac ttt

Arg: Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Phe


: 100 105

etc: aca gtc tcc tea

Leu: Thr Val Ser Ser

gag ctg gtg aag cct ggg gct Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15

gga tac aca ttc act gac tat Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

30

gga cag ggc

Gly Gln Gly

ctt gag tgg Leu Glu Trp 45

att

lie

att tac tac aat gag aag ttc lie Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 60

aca tcc tcc aac aca gee tac Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 75 80

gac tet gcg gtc att ttc tgt Asp Ser Ala Val lie Phe Cys 90 95

gac tac tgg ggc caa ggc acc Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110

10

115

<210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus 15 <400> 30

Gln: Val Gln Leu
Gln

1: 5

Ser: val Lys Met
Ser

Gln Ser Gly Pro

Glu

10

Leu Val Lys Pro

Gly

15

Ala

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

5

48

96

144

192

240

288

336

354

20

25

30

Val lie Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser lie Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val lie Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 31 <211> 327 <212>ADN

5 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(327)

<400>31

gac att gtg atg acc cag tct cae aaa ttc atg tcc aca

Asp lie Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr

15 10

gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag gat gtg

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val

20 25

gta gee tgg tat caa cag aaa cea gga caa tct cct aaa

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

35 40 45

tac teg gca tcc tac cgg tac act gga gtc cct gat cgc

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

agt gga tct ggg acg gat ttc act ttc acc ate age agt

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser

65 70 75

gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat act

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr

85 90

tea: gta gga

Ser: Val Gly

: 15

act: att
act

Thr: lie
Thr

30

ctt: ctg att

Leu
Leu: lie

ttc: act ggc

Phe: Thr Gly

gtg: cag gct

Val: Gln Ala


: 80

act: ccg tgg

Thr: Pro Trp

: 95

48

96

144

192

240

288

acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa cgg gct

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala 100 105

<210> 32 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus 5 <400> 32

imagen5

<210> 33 <211> 4017 <212>ADN

10 <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(4017) <400> 33 atg Met 1

tgt Cys

gaa

Glu

ctg

gtc Val: age Ser tac Tyr tgg Trp 5 gac Asp acc Thr

ctg Leu: ctt Leu etc Leu 20 aca Thr gga Gly tet Ser

ctg Leu: agt Ser 35 tta Leu aaa Lys ggc Gly acc Thr

cat: etc caa tgc agg 999

ggg gtc ctg ctg tgc gcg Gly Val Leu Leu Cys Ala 10

agt tea ggt tea aaa tta Ser Ser Gly Ser Lys Leu

25

cag cae ate atg caa gca Gln His lie Met Gln Ala 40 45

gaa gca gee cat aaa tgg

ctg: etc age

Leu
Leu: Ser

: 15

aaa: gat cct

Lys: Asp Pro

30

ggc: cag aca

Gly: Gln Thr

tet: ttg cct

48

96

144

192

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno hipertensivo gestacional en un sujeto,

5

en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28, o compite por la unión con un anticuerpo que comprende CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID No:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la 10 SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28;

donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.
2. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso como en la reivindicación 15 1, en el que el trastorno hipertensivo gestacional es eclampsia o preeclampsia.
3. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso como en las reivindicaciones 1 o 2, en el que el sujeto es un ser humano en periodo de gestación o un ser humano postparto.

20 4. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso como en cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 3, en el que el uso comprende:

hacer pasar la sangre, o un componente de la misma, que se ha retirado del sujeto, tal como plasma, sobre un soporte sólido al que están fijados anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, para 25 disminuir el nivel de sFlt-1 en la sangre o el componente de la misma, debiendo la sangre o el componente de la misma devolverse al cuerpo del sujeto.
5. Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso para agotar sFlt-1 del

plasma humano, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo,

30

agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, está fijado a un soporte sólido, y la relación anticuerpo:sFlt-1 es 50, 100 o 250; donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende cDr de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO:18, la SEQ ID 35 NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28; y

en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1. 40 6. Un sistema que comprende:

(a) los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, como se definen en la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, agota al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in

45 vitro, cuando el anticuerpo está fijado a un soporte sólido, y la relación molar anticuerpo:sFlt-1 es 50;

(b) un primer medio para transportar sangre o un componente de la misma de un sujeto a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido para poner en contacto la sangre o un componente de la misma con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, y de ese

50 modo retirar sFlt-1 de la sangre o un componente de la misma; y

(c) un segundo medio para transportar la sangre o un componente de la misma al sujeto después del contacto de la sangre o un componente de la misma con los anticuerpos anti-sFlt-1 o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos.

55 7. El sistema de la reivindicación 6,

en el que el primer medio comprende:

(i) un dispositivo de acceso, insertado en un vaso sanguíneo del sujeto, para acceder al aparato circulatorio del 60 sujeto; y

(ii) un sistema de conductos, que conecta de forma fluida el dispositivo de acceso a los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, unidos al soporte sólido, permitiendo de este modo que la sangre del sujeto o un componente de la misma fluya hacia y contacte con los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos 5 de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, en los que el primero medio comprende preferentemente un dispositivo para separar la sangre del sujeto en plasma y componentes celulares y donde el dispositivo para separar la sangre del sujeto en plasma y componentes celulares es, preferentemente, una centrífuga o una membrana, o un dispositivo de aféresis; y

10 en el que el segundo medio comprende:

(i) un sistema de conductos; y

(ii) un dispositivo de retorno, donde el dispositivo de retorno se inserta en un vaso sanguíneo del sujeto, y en el que 15 el sistema de conductos conecta de forma fluida la sangre o un componente de la misma en contacto con los

anticuerpos anti-sFlt-1 o fragmentos de unión al antígeno sFlt-1 de los mismos, al dispositivo de retorno para permitir el retorno de la sangre o un componente de la misma al sujeto.
8. Una columna que contiene los anticuerpos anti-sFlt-1, o fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos,

20 como se definen en la reivindicación 1, unidos a un soporte sólido, en la que los anticuerpos anti-sFlt-1, o los fragmentos de unión a sFlt-1 de los mismos, agotan al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % de sFlt-1 del plasma humano en un análisis in vitro, cuando el anticuerpo está fijado a un soporte sólido, y la relación molar anticuerpo:sFlt-1 es 50.

25 9. El anticuerpo anti-sFlt-1 para uso como en la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1 es un

anticuerpo quimérico.
10. Un anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en el que la cadena pesada comprende la SEQ ID NO:30 o una secuencia al menos el 85 % idéntica a la misma, y donde la cadena ligera

30 comprende la SEQ ID NO:32 o una secuencia al menos el 85 % idéntica a la misma, donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión al sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.
11. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en el sistema de las

35 reivindicaciones 6 o 7, o el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, en la columna de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, se une a uno o más de los dominios 1-3 de sFlt-1 humano.
12. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso como en la reivindicación 40 1, en el que el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, comprende CDR de cadena pesada

que tienen la SEQ ID No:18, la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:22 y CDR de cadena ligera que tienen la SeQ ID No:24, la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:28; y donde el anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, no bloquea la unión del ligando a sFlt-1.

45 13. El anticuerpo anti-sFlt-1, o fragmento de unión a sFlt-1 del mismo, para uso como en la reivindicación

1, en el que la cadena pesada comprende la SEQ ID NO:37 y la cadena ligera comprende la SEQ ID NO:36.

imagen1

SEPARADOR DE PLASMA/ CÉLULAS

PLASMA

SANGRE

COMPLETA

CELULAS

SANGU NEAS

Anticuerpo anti

Matriz de Sepharose

PLASMA AGOTADO EN SFLT-1 <

imagen2

1.0E-09

1.CE-07

Fig.2

% de sFlt-1 agotado

60%

40%

sí7o de sFlt-1 agotado

KdíM’j
1 .0E-10

imagen3

% de agotamiento de sFtt-1

imagen4

% de agotamiento de sFlt-1

imagen5

O)

Z1.

qS*

imagen6

CD

3

O

100%

*Tl

OQ*

oc

imagen7

?A

m

%

o

CE

% de agotamiento de sFlt-1

imagen8

1 mi 50 mL

Volumen de lecho de columna

Fig. 10

imagen9

Heparina

Fig. 1 1

imagen10