JPH0977685A - 抗アレルギー剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遅発型アレルギー反応及び即時型アレルギー
反応を抑制することができる抗アレルギー剤を提供する
こと。 【解決手段】 ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体または
その活性フラグメントを有効成分として含有する抗アレ
ルギー剤。気管支喘息用である前記の抗アレルギー剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術の分野】本発明は、抗アレルギー剤
に関し、さらに詳しくは、ヒトのＰＡＦ受容体に対する
抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有
する抗アレルギー剤に関する。本発明の抗アレルギー剤
は、アレルギー疾患の中でも特にアレルギー性の気管支
喘息の治療に効果的である。

【０００２】

【従来の技術】従来、気管支喘息は、ＧｅｌｌとＣｏｏ
ｍｂｓが分類したアレルギー反応の４つの型のうちＩ型
アレルギー反応による疾患として理解されていた。すな
わち、肥満細胞表面にあるＦｃεＲＩに、抗原と結合し
たＩｇＥが結合することにより肥満細胞が活性化され、
ヒスタミン、ロイコトリエン等の炎症性物質が放出され
る。これにより、血管透過性亢進、平滑筋収縮、腺分泌
亢進が引き起こされ、気道が閉塞するとされていた。し
かし、この反応で起こるのは、即時型アレルギー反応
（即時型喘息反応）であって、６時間から１０時間後に
起こる遅発型アレルギー反応（遅延型喘息反応）を説明
することはできなかった。近年、この点について、喘息
死の剖検所見から様々なことがわかってきた。すなわ
ち、粘液栓による気道内腔の閉塞、気管支上皮剥離、主
として好酸球や単該球よりなる細胞浸潤が認められた。
このことは、軽度の症例でも同様であった。最近では、
気管支内視鏡による観察等により、気管支喘息は、ＣＤ
４⁺−Ｔ細胞や好酸球による慢性炎症性疾患であるとみ
られるようになってきた。現在、日本アレルギー学会の
喘息治療ガイドラインによると、気管支喘息は、「広範
かつ種々の程度の気道閉塞と気道炎症により特徴づけら
れる。気道炎症はリンパ球、好酸球、マスト細胞など多
くの炎症細胞が関与し、気道粘膜上皮の損傷を示し、種
々の刺激に対する気道の反応性の亢進を伴う。」とされ
ている。

【０００３】近年、気管支喘息では、遅延（発）型喘息
反応を如何にして抑制するのかが重要な課題として考え
られ、その解析が進められてきた。これについては、
（株）現代医療社発行の「分子生物学からみた気管支喘
息」に詳しく述べられている。すなわち、同書には、
「気管支喘息をはじめとするアレルギー性疾患の病態形
成に炎症が重要な役割を担っていることが認識されてき
ている。炎症細胞には肥満細胞、好酸球、好中球、リン
パ球、マクロファージなどの細胞があるが、これらのな
かでアレルギー性炎症においては好酸球が注目されてお
り、とりわけ遅延型気管支喘息反応の中心と考えられて
いる。好酸球は、気管支喘息の炎症局所に多彩なＥＣＦ
（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆ
ａｃｔｏｒ）とサイトカインの共同作用により集積する
と考えられている。また、気管支粘膜に動員された好酸
球は、気管上皮の障害を起こし気道反応性を亢進させる
ことが知られている。これは、好酸球の特異顆粒である
ＭＢＰやＥＣＰなどが組織傷害作用を有し、さらに肥満
細胞や好塩基球からのヒスタミン遊離を促すため、ある
いは好酸球自身が活性酵素やＬＴＣ_４ 、ＰＡＦなどの
強い炎症性メディエータを産生し、気道収縮や粘膜剥離
に関与するためと考えられている。このため最近では、
気管支喘息の慢性化、遷延化に好酸球が中心的な役割を
演じていると考えられるようになってきた。さらに最
近、好酸球の抗原提示能が証明され、免疫担当細胞とし
ての役割も注目されている。」（第３２８頁）と説明さ
れている。これらの解析によれば、好酸球をうまく制御
することが可能ならば、気管支喘息を抑制し得る可能性
があることを示唆している。すなわち、同書には、「以
前より気管支喘息患者において、喀痰、末梢血好酸球増
多、剖検例でも好酸球の肺への集簇がよく知られていた
が、現在では好酸球はＬＡＲ（遅延型アレルギー反応）
のエフェクターとして認識されている。

【０００４】気管支喘息患者の気管支粘膜生検では、活
性型好酸球（ＥＧ²⁺）、ＭＢＰ（ｍａｊｏｒ ｂａｓｉ
ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）が存在し、好酸球数と症状の相関
が指摘されている。好酸球は分泌型ＩｇＡ，ＩｇＧ，Ｐ
ＡＦ，Ｃ３ｂ，Ｃ３ｂｉ，ＩＬ−５，ＧＭ−ＣＳＦ，サ
ブスタンスＰ，ＦＭＬＰなどで脱顆粒、すなわちＭＢ
Ｐ、ＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ），ＥＤＮ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ），ＥＰＯ（ｅ
ｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を放出
し、ＭＢＰはヒト気道上皮に投与すると上皮剥離を起こ
す。またＬＴＣ₄、ＰＡＦ、過酸化物も遊離し、これら
は気道組織傷害のほか、平滑筋収縮、血管透過性亢進、
粘液分泌亢進、炎症性細胞遊走活性を持つ。以上のよう
に、好酸球により組織障害が惹起される。

【０００５】気道過敏性については、ＢＡＬ（ｂｒｏｎ
ｃｈｏａｌｖｅｄａｒ ｌａｖａｇｅ）液中好酸球数、
ＭＢＰ、剥離した軌道上皮細胞数とＰＣ２０との相関が
認められている。気道過敏性亢進の機序については、気
道上皮剥離、傷害による知覚神経末端の露出、上皮透過
性亢進などが考えられている。このように気道組織傷害
同様、気道過敏性亢進についても好酸球がエフェクター
細胞であると考えられる。最近、好酸球がアレルギー性
炎症で直接炎症を引き起こす以外に、他の役割も果たし
得ることが分かってきた。好酸球はＩＬ−３、ＩＬ−
５、ＧＭ−ＣＳＦで活性化されるが、自らもこれらサイ
トカインを産生する。ＭＢＰ、ＭＰＯは組織傷害を引き
起こすだけでなく、肥満細胞にヒスタミン遊離を起こ
す。また、ＡＰＣとしての特徴、すなわちＩＬ−４、Ｉ
ＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦに反応して、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉ
ＣＡＭ−１を発現し、ＩＬ−１αを産生する。実際に、
気管支喘息においてどの程度これらが寄与しているのか
は、まだ分かっていない。」（第４０頁）と説明されて
いる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、この好
酸球の遊走及び活性化を担う物質１つとして、ＰＡＦ
（ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔ
ｏｒ：血小板活性化因子）に注目した。ＰＡＦは、血小
板の活性化、例えば、形態変化、ヒスタミン遊離、凝集
を引き起こす白血球由来の因子として発見されたリン脂
質で、１−アルキル−２−アセチルグリセロ−３−ホス
ホコリン（１−ｏ−ａｌｋｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓ
ｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ
ｅ）の構造を有している。ＰＡＦは、血小板、白血球、
肺、脾臓、腎臓、脳などで産生されるリン脂質性オータ
コイドであり、微量で強力な起炎作用及び降圧作用をも
ち、気管支喘息、エンドトキシンショック、アナフィラ
キシーショックなどに関与すると考えられている。すな
わち、ＰＡＦは、血小板活性化作用だけではなく、好中
球活性化作用、マクロファージ活性化作用、血圧降下作
用、血管透過性亢進作用、平滑筋収縮作用、肝臓でのグ
リコーゲン分解促進作用などをも有し、生体内でのアナ
フィラキシー、炎症、アレルギーなどの進展にかかわる
因子である。ＰＡＦは、細胞膜上の受容体（ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）を介して、血小板、好中球、マクロファージな
どの標的細胞を活性化するとともに、好酸球についても
遊走／活性化する作用のあることが見出されてきた。

【０００７】この生理活性リン脂質は、１９７２年に存
在が確認され、１９７９年にはその構造も明らかにされ
た。ところが、ＰＡＦ受容体に関する解析については、
現在までのところ、あまり進展していない。その理由
は、ＰＡＦが脂溶性で、細胞膜に対する非特異的結合性
が高いため、基本的なリカンド結合実験でさえ困難であ
ること、受容体タンパクが細胞膜内に微量しか存在しな
いため精製が難しいことなどにあると考えられる。清水
らは、１９９１年、遺伝子工学的手法を用いて、モルモ
ット肺及びヒト白血球からＰＡＦ受容体のｃＤＮＡを分
離することに成功した（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４
９，ｐ．３４２，１９９１）。そして、この２つのｃＤ
ＮＡから推定されるＰＡＦ受容体の構造及び発現実験か
ら、ＰＡＦ及びＰＡＦ受容体の機能やＰＡＦが関連する
病態の発病メカニズム等に関する知見が得られつつあ
る。

【０００８】本発明者の１人である中田らは、ＰＡＦ受
容体に特異的に反応するモノクローナル抗体を開発した
（特開平７−１０１９９８号公報）。このモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは、工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−４７２３（Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ ＰＡＦ−Ｒ１）、及びＦＥＲＭ ＢＰ−
４７２２（ＹＭ−ＰＡＦＲ）として寄託されている。Ｐ
ＡＦ−Ｒ１については、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．（１９
９５）Ｖｏｌ．３０５，ｐ．８２９−８３５に、その製
法と性質の詳細が述べられている。該文献では、ハイブ
リドーマの分泌する抗体をａｎｔｉ−（ｇｐＰＡＦ−Ｒ
^158-173）Ａｂ−ＩＶ（Ａｂ−ＩＶ）と記載している。
これらの文献では、ＰＡＦ受容体に関する抗体が、モル
モットとヒトのＰＡＦ受容体のいずれにおいても、特異
的な結合力を有することが記載されている。このこと
は、モルモットの動物実験で得られた結果は、ヒトにも
あてはめることができることを示唆している。このこと
は、医薬品の開発において非常に有利であると考えられ
る。

【０００９】前記したとおり、アレルギー疾患の１つで
ある気管支喘息は、その解析結果から、好酸球が重要な
役割を担っていることがわかってきた。そこで本発明者
たちは、ＰＡＦが好酸球の遊走や活性に重要な作用をも
つのではないかと考え、ＰＡＦ受容体に対する抗体を用
いて、好酸球を解析したところ、図１に示すように、好
酸球にはＰＡＦ受容体があり、しかも、図２にあるよう
に、ＰＡＦによる好酸球の遊走は、ＰＡＦ受容体に対す
る抗体で阻害できることを見いだした。この知見をもと
に鋭意検討を行った結果、ＰＡＦ受容体に対する抗体が
気管支喘息を抑制することができるという新規な効果を
見出し、この抗体を有効成分とする組成物が気管支喘息
などのアレルギー疾患に対する治療薬（抗アレルギー
剤）として有用であることを見出し、本発明を完成する
に至った。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトの
ＰＡＦ受容体に対する抗体またはその活性フラグメント
を有効成分として含有する抗アレルギー剤が提供され
る。また、本発明によれば、次のような好ましい実施態
様が提供される。 １．気管支喘息用である前記の抗アレルギー剤。 ２．ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体が、モノクローナ
ル抗体である前記の抗アレルギー剤。 ３．ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体のエピトープが、
ＰＡＦ受容体の細胞外第３ドメインにある前記の抗アレ
ルギー剤。 ４．ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体の活性フラグメン
トが、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び
組換えＦｖ体からなる群より選ばれる少なくとも１種で
ある前記の抗アレルギー剤。 ５．遅発型アレルギー反応及び即時型アレルギー反応を
抑制することができる前記の抗アレルギー剤。 ６．好酸球及びリンパ球の気管支組織への浸潤を抑制す
ることができる前記の抗アレルギー剤。 ７．好酸球のＥＣＰ放出を抑制することができる前記の
抗アレルギー剤。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の抗アレルギー剤の有効成
分として使用されるＰＡＦ受容体に対する抗体（すなわ
ち、抗ＰＡＦ受容体抗体）は、細胞表面分子であるＰＡ
Ｆ受容体と反応する抗体である。ＰＡＦ受容体に対する
抗体としては、ＰＡＦ受容体に特異的に反応するモノク
ローナル抗体が好ましい。このようなモノクローナル抗
体は、例えば、次のような方法により得ることができ
る。 （１）齧歯類動物をＰＡＦ受容体ペプチドで免疫感作
し、（２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾
細胞の懸濁液を形成し、（３）該脾細胞の懸濁液をマウ
スのミエローマ細胞と融合促進剤の存在下で混合して、
両細胞を融合し、（４）融合した細胞を未融合のミエロ
ーマ細胞を支持しない媒質中で希釈して培養し、抗体産
生細胞とミエローマ細胞とが融合したハイブリドーマを
選別し、（５）ハイブリドーマを含有する各培養穴中の
上清液について、ＰＡＦ受容体ペプチドとの反応性を指
標にして抗体の存在を確認し、（６）所望の抗体を生成
するハイブリドーマを選択した後、限界希釈法により単
一クローンにし、（７）その単一クローンのハイブリド
ーマの培養上清液から抗体を回収する。

【００１２】本発明の抗アレルギー剤の有効成分として
使用するモノクローナル抗体としては、例えば、工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４７２
３（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＰＡＦ−Ｒ１）、及びＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４７２２（ＹＭ−ＰＡＦＲ）として寄託さ
れているハイブリドーマにより産生されるモノクローナ
ル抗体を挙げることができる。ＰＡＦ受容体に特異的に
反応するモノクローナル抗体は、ヒトのＰＡＦ受容体に
対する抗体のエピトープがＰＡＦ受容体の細胞外第３ド
メインに存在する。ＰＡＦ受容体に対するポリクローナ
ル抗体は、例えば、齧歯類動物をＰＡＦ受容体ペプチド
で免疫感作し、免疫感作した齧歯類動物から血液を採取
し、血清成分を分離して、目的の抗血清（未精製ポリク
ローナル抗体）を得る方法により得ることができる。抗
血清は、常法により精製して、精製ポリクローナル抗体
とすることが好ましい。

【００１３】ＰＡＦ受容体に対する抗体は、免疫グロブ
リンである。ＰＡＦ受容体に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体は、均一な免疫グロブリンであり、例えば、
ＩｇＭのクラスに属し、Ｌ鎖がκ鎖であるもの、あるい
は、ＩｇＧ２ａのサブクラスに属し、Ｌ鎖がκ鎖である
ものなどが存在する。ＰＡＦ受容体の活性フラグメント
は、抗ＰＡＦ受容体抗体の有する抗原抗体反応活性を有
する免疫グロブリンのフラグメントを意味する。このよ
うな活性フラグメントとしては、具体的には、Ｆ（ａ
ｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組換えＦｖ体
などがある。これらの活性フラグメントは、免疫グロブ
リン（抗ＰＡＦ受容体抗体）から常法により調製するこ
とができる。例えば、Ｆ（ａｂ′）₂フラグメントは、
免疫グロブリンＩｇＧをペプシンを用いて消化すること
により得ることができる。Ｆａｂ′フラグメントは、Ｆ
（ａｂ′）₂フラグメントを２−メルカプトエタノール
などの試薬で還元して、モノヨード酢酸でアルキル化す
ることにより得ることができる。Ｆａｂフラグメント
は、ＩｇＧをパパイン消化することにより得ることがで
きる。Ｆｖフラグメントは、Ｈ鎖可変部（Ｖ_H）とＬ鎖
可変部（Ｖ_L）を非共役結合で結合して得られる。組換
えＦｖ体は、例えば、モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマから抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変部にあたる
遺伝子についてＤＮＡをシーケンスして、Ｈ鎖可変部
（Ｖ_H）とＬ鎖可変部（Ｖ_L）をコードする塩基配列を決
定し、次いで、これらのＤＮＡ断片をベクターに組み込
んで、Ｖ_H−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｖ_L構造を有する一価の抗体
活性フラグメントを大腸菌や動物細胞等の細胞に産生さ
せることにより得ることができる。

【００１４】抗ＰＡＦ受容体抗体は、ヒト、マウス、ラ
ット、及びモルモットの各ＰＡＦ受容体のいずれとも反
応する可能性がある。例えば、前記の方法により得られ
たモノクローナル抗体は、ヒトのＰＡＦ受容体を発現し
ているヒト好酸球と反応（認識）する。また、該抗体
は、細胞培養したマウスまたはラットのＰＡＦ受容体を
発現している肥満細胞とも反応する。したがって、例え
ば、モルモットを使用した動物実験の結果により、ヒト
に対する薬理効果を推定することが可能である。本発明
の実施例で使用したモルモットは、喘息の解析、アレル
ギー、炎症の解析に非常に良いモデルである。このモル
モットは、アレルギー，Ｖｏｌ．３７、Ｎｏ．１０、
ｐ．９８０〜９９１（１９８８年）に記載のごとく、卵
白アルブミンを吸入感作させることで、喘息様の症状を
呈する。すなわち、１０ｍｇ／ｍｌに調製した卵白アル
ブミン（ｏｖａｌｕｂｍｉｎ＝ＯＶＡ）を１０分間、１
０日間毎日吸入感作させ、その後、１週おきに２回同量
のＯＶＡを吸入感作させることにより、モルモットの感
作を行えば、喘息の良いモデルとなる。このモルモット
に対し、最終のＯＶＡを感作させる前に抗ＰＡＦ受容体
抗体を投与し、その効果を確かめることで、本発明の抗
アレルギー剤を完成するに至った。

【００１５】本発明の抗アレルギー剤は、遅発型アレル
ギー反応（遅発型気管支喘息）及び即時型アレルギー反
応（即時型気管支喘息）を抑制することができる。ま
た、本発明の抗アレルギー剤は、好酸球及びリンパ球の
気管支組織への浸潤を抑制することができる。さらに、
本発明の抗アレルギー剤は、好酸球のＥＣＰ放出を抑制
することができる。抗ＰＡＦ受容体抗体の抗アレルギー
剤として活性をより高めるには、該抗ＰＡＦ受容体抗体
をヒト型化あるいはキメラ型化することが効果的であ
る。これらの技術は、すでに公知の文献あるいは特許公
報に記載されており、抗体産生ハイブリドーマさえあれ
ば、容易に実施することができる。特許公報では、ＥＰ
−０１２０６９４、ＥＰ−０１２５０２３、ＥＰ−０１
７１４９６、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４、ＷＯ８６１０
１５３３等があり、文献には、Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．
３２２（１９８８）ｐ．３２３−３２７，Ｎａｔｕｒｅ
ｖｏｌ．３２１（１９８６）ｐ．５２２−５２５，Ｎ
ａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３２８（１９８７）ｐ．７３１−
７３４等が挙げられる。これらの公知技術に基づいて、
抗ＰＡＦ受容体抗体を容易にヒト型化またはキメラ化す
ることができる。

【００１６】本発明の抗アレルギー剤の剤形としては、
活性な有効成分を含む通常の医薬または医薬組成物と同
様に、例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、座剤、噴霧
剤、クリーム剤、パップ剤、点眼剤等を挙げることがで
きる。例えば、注射剤であれば、当該抗体を含む溶液を
無菌状態で調製し、必要があれば、マンニトール等の安
定化剤、賦形剤等を補助成分として添加してもよい。こ
れをアンプル、バイアル等に充填し、そのまま使用する
こともできるし、必要に応じて、凍結乾燥等を行うこと
も可能である。本発明の抗アレルギー剤は、乾燥品の場
合は、注射用蒸留水等に溶解して投与することができ
る。投与方法は、経口投与、静脈注射、吸入、経皮投
与、点眼、局所投与、皮下投与等から適切な方法を選ん
で投与すれば良い。本発明の抗アレルギー剤は、ＰＡＦ
受容体に対する抗体またはその活性フラグメントを有効
成分として、通常、０．１〜１００重量％、好ましくは
０．５〜７０重量％の割合で含有するものである。本発
明の抗アレルギー剤の投与量は、有効成分を基準とし
て、ヒト成人１日あたり、通常、０．００１〜１０００
ｍｇ、好ましくは０．０１〜６００ｍｇである。もちろ
ん、上記投与量は、一応の目安にすぎず、患者の年齢、
性別、体重、さらには疾患の種類とその程度に応じた投
与量を適宜選択すればよい。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明する。

【００１８】［実施例１］ （１）好酸球上のＰＡＦ受容体の染色 特開平７−１０１９９８号公報に記載されたのと同じ方
法で、同じ抗体を用いて染色した。すなわち、ＦＥＲＭ
ＢＰ−４７２２として寄託されているハイブリドーマ
ＹＭ−ＰＡＦＲが産生するモノクローナル抗体とヒトの
好酸球との反応を調べた。ヒト好酸球の分離は、以下の
方法にて行った。 １）静脈血をヘパリン含有ディスポーザブル注射筒に採
取した。 ２）静脈血を５０ｍｌ試験管に移し、血液５容につき１
容の割で６％デキストラン溶液を加え転倒混和した。な
お、６％デキストランは、０．１５０ＭのＮａＣｌと６
％（ｗ／ｖ）のＤｅｘｔｒａｎ Ｔ７０（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）をフィルター滅菌して保存した。 ３）別の５０ｍｌ試験管に、気泡を作らぬよう静かに移
し、３７℃で６０分間静置した。 ４）白血球を含む上清を別の５０ｍｌ試験管にとり、Ｐ
ｉｐｅｓ／ＦＣＳを加えて２５０×ｇ、１０分間遠心し
た。白血球を更に２回、Ｐｉｐｅｓ／ＦＣＳで洗浄し
た。

【００１９】Ｐｉｐｅｓ／ＦＣＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）： ０．１１０Ｍ ＮａＣｌ ５．０ ｍＭ ＫＣｌ ４０ ｍＭ ＮａＯＨ ２５ ｍＭ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ′−ｂ
ｉｓ−（２−ｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄ） ５．４ ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ １％（ｖ／ｖ） 熱不活化仔牛血清（ＦＣＳ） をフィルター滅菌保存した。細胞凝集を起こさぬよう使
用直前にｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇ
ｍａ）を３０ｍｇ／Ｌの割合で加えた。 ５）Ｈｅａｖｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎとＬｉｇｈｔ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎを適量混合することにより、比重１．１０
０、１．０９０、１．０８５、１．０８０、１．０７０
のＰｅｒｃｏｌｌ溶液を作成した。混合量は、表１に示
すとおりであった。

【００２０】

【表１】

【００２１】なお、Ｈｅａｖｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｌ
ｉｇｈｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、以下の組成のものであ
る。ＰｅｒｃｏｌｌのＨｅａｖｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ｐＨ７．３５〜７．４５） ５００ ｍｌ Ｐｅｒｃｏｌｌ原液（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ） ４６．５ｍｌ １０倍濃度のＰｉｐｅｓ緩衝液 １２ ｍｌ 精製水 濃酸塩でｐＨを調整する。 浸透圧 ２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ 比重 １．１２２〜１．１２３ＰｅｒｃｏｌｌのＬｉｇｈｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ｐＨ７．３５〜７．４５） ５０ ｍｌ Ｈｅａｖｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４５０ ｍｌ Ｐｉｐｅｓ緩衝液（ＦＣＳ不含、ｐ
Ｈ未調整） １０ＮのＮａＯＨでｐＨを調整する。 浸透圧 ２８０〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ 比重 １．０２０〜１．０２１ いずれもフィルター滅菌した。

【００２２】６）１６ｍｌポリカーボネート試験管に比
重１．１００、１．０９０、１．０８５、１．０８０の
Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を各々１．５、３．０、３．０、
３．０ｍｌずつ重層する。重層は、ペリスタルティック
ポンプを用いて静かに行った。 ７）洗浄した白血球を比重１．０７０のＰｅｒｃｏｌｌ
溶液に５×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度になるよ
うに浮遊させ、その２ｍｌを６）で作成した比重勾配上
に重層した。 ８）１６００×ｇ、１０℃で２０分間遠心した。比重勾
配にショックを与えぬよう固定角のローターを使用、ｓ
ｌｏｗ ａｃｃｅｌ装置を作働させ、ｂｒａｋｅｏｆｆ
とした。 ９）遠心終了後、長さ１３ｃｍ、１６ゲージ、直角切り
口の針を試験管底に静かに挿入し、接続してあるローラ
ーポンプで静かに回収した。この時、ポンプにフラクシ
ョネーターを連結しておくと、１ｍｌずつ自動分画回収
が可能である。全容量は１２．５ｍｌであるため、１ｍ
ｌずつ分画回収すると１３画分になる。 １０）各画分中の好酸球数を算定後、純度の高い画分を
１つの試験管に集め、Ｐｉｐｅｓ／ＦＣＳで２回洗浄
し、実験に用いる。通常、第３〜第６画分で好酸球の純
度が高いため、今回はその分画を回収した。

【００２３】このように調製したヒト好酸球を回収後、
フィッシャーチューブに細胞を１×１０⁶個づつ入れ、
これに精製抗体を５０μｇ／ｍｌとして１００μ１加
え、氷上で２０分間反応させ、ＰＢＳで遠心洗浄（３０
０ｒｐｍ、１分間、３回）し、次いで、ＦＩＴＣ−抗マ
ウスＩｇ’ｓ（カルタグ社製）（１００倍希釈）を１０
０μｌ入れ、氷上で２０分間反応させ、ＰＢＳで遠心洗
浄を２回行い、ＰＢＳ２００μｌに懸濁し、ＦＡＣＳｃ
ａｎで測定した。その結果、図１に示すように、ハイブ
リドーマＹＭ−ＰＡＦＲが生産するモノクローナル抗体
がヒト好酸球上のＰＡＦ−Ｒと反応することを確認し
た。すなわち、図１は、ヒト好酸球と抗ＰＡＦ受容体抗
体との反応を示すＦＡＣＳグラフであり、実線は、抗Ｐ
ＡＦ受容体抗体添加の場合を示し、点線は、無添加の場
合を示す。

【００２４】（２）抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡ
Ｆ誘導好酸球遊走の抑制効果 上述のごとく調製したヒトの末梢好酸球１×１０⁶個／
ｍｌをケモタキシスチャンバーの上部に２００μｌ入れ
た。この中に、抗ＰＡＦ受容体抗体をそれぞれ１０μｇ
／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌに
なるように加えた。また、比較のコントロールとして、
ゼロ（何も加えないもの）を用意した。チャンバーの上
部は、フィルターで下部と分かれている。この下部に
は、ＰＡＦを入れた培養液を入れておいた。ＰＡＦは、
エタノールで溶解した後、２．５％ＢＳＡが入った生理
食塩水に希釈し、最終湿度は３×１０^-8Ｍに調製した。
これを２００μｌ／チャンバー加えた。その後、３７℃
で３時間培養した後、フィルターの上層にいる細胞をピ
ペットを用いてＰＢＳにて洗浄することにより除去し、
フィルターを取り出した。その後、このフィルターにつ
いて、下部の部分の固定を飽和昇汞等量液にて行った。
このとき、下部のフィルターの面を上に向けて固定し
た。固定は、１２時間行った。その後、染色を行い、染
色した下部のフィルター上の細胞を顕微鏡にて計測し
た。染色法は、以下に示す方法により行った。

【００２５】染色方法 １２時間固定後、以下の要領でフィルターの染色を行
った。 １．固定液からフィルターを取り出し１０分間水洗。 ２．ヘマトキシレン液にて１０分間染色。 ３．２分間水染。 ４．１％ＨＣｌ含有７０％エタノールに５秒浸す。 ５．１０分間水染。 ６．クロモトロープ２Ｒで３０秒染色。 ７．２分間水染。 ８．１００％エタノールで脱水（数秒を３回）。 ９．ｎ−プロピルアルコールに２分浸す。 １０．ｎ−プロピルアルコール・キシロール等量液に２
分浸す。 １１．キシレンで透徹。５分以上。 染色したフィルターをカナダバルサムを用いて封入し
た。この際、フィルター下室側が上になるようにしてス
ライドグラスにのせ封入した。 顕微鏡（倍率４００倍）にて、予め規定した視野数
（１０〜２０視野）の遊走細胞数を算出した。ニトロセ
ルロースフィルターは厚みが１３０μｍあり、ポリカー
ボネートフィルター（厚み１５μｍ）に比し、ケモタキ
シス時の細胞移動距離が大きく、ケモカイネシスと区別
がつきやすく、再現性も高いので、遊走抑制実験に望ま
しい。フィルターの下面より、８μｍの深さまでに遊走
してきている細胞数をカウントして、その合計を試料の
遊走活性とした。 使用後のチャンバーを例えばケモタキシスチャンバー
洗浄装置を用いて洗浄した。その結果を図２に示す。図
２は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ誘導好酸球
遊走の抑制効果を示すグラフである。その結果、図２に
示すように、抗体の濃度依存的に好酸球の遊走が抑制さ
れることが判明した。（図２；＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝
３、ｍｅａｎ±ＳＥ）

【００２６】（３）ＰＡＦ刺激好酸球からのＥＣＰ（Ｅ
ｏｓｉｎｏｐｈｉｌｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）放出に対するＰＡＦ受容体に対する抗体の抑制効果 上述（１）のごとく調製したヒトの末梢好酸球を１×１
０⁶個／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６
４０培地で調製した後、２４ウェルマイクロプレートに
１ｍｌずつ９ウェルに加えた。このうち、３ウェルには
何も入れないコントロール、別の３ウェルにはＰＡＦを
１×１０^-6Ｍ加えた。残りの３ウェルには、ＰＡＦ１×
１０^-6Ｍと抗ＰＡＦ受容体抗体（αＰＡＦＲＡｂ）１０
μｇ加えた。３０分後、培養上清中のＥＣＰの量をＲＩ
Ａ（ファルマシア）キットで測定した。その結果、図３
に示すように、ＰＡＦの添加による好酸球細胞のＥＣＰ
の放出を、抗ＰＡＦ受容体抗体の添加により有意に抑制
することがわかった。図３は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与
によるＰＡＦ刺激好酸球からのＥＣＰ放出の抑制を示す
グラフである。（図３；＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、ｍｅ
ａｎ±ＳＥ）

【００２７】（４）ＰＡＦ刺激モルモットに対する抗Ｐ
ＡＦ受容体抗体の気道抵抗の抑制効果 ハートレー系モルモットに対し、３匹について、あらか
じめ、抗ＰＡＦ受容体抗体を４ｍｇ／ｋｇの割合で静脈
投与した。抗体投与後、１時間後に、抗体を投与したモ
ルモット３匹と、非投与モルモット３匹に、ＰＡＦを１
００μｇ／ｍｌにしたものを１０ｍｌ用意し、これを６
リットル／ｍｉｎの流量で２０分間連続して吸入させ
た。ＰＡＦ吸入開始後、５分、１０分、２０分、さらに
ＰＡＦの吸入終了後、１０分、２０分、３０分、１時
間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時
間、８時間、９時間、１０時間後に、気道の抵抗を測定
した。その結果を図４にまとめた。すなわち、図４は、
抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ吸入モルモット気
道抵抗の抑制効果を示すグラフである。図４より明らか
なように、抗ＰＡＦ受容体抗体投与群は、非投与群に比
べ、気道抵抗の値が低く、喘息様発作が抑制されている
ことが判明した。（図４；＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、ｍ
ｅａｎ±ＳＥ）

【００２８】（５）ＰＡＦ刺激モルモットに対する抗Ｐ
ＡＦ受容体抗体の気道組織好酸球浸潤の抑制効果 上記（４）の実験で用いたモルモットに関し、ＰＡＦ吸
入（ＰＡＦ刺激）終了後２４時間で、気道組織へ浸潤し
てきた好酸球の数をカウントした。すなわち、気道組織
をホルマリン固定後、パラフィン包埋し、切片を調製し
た。各３枚ずつ、Ｈａｎｓｅｌ、ヘマトキシリン−エオ
シン、及びギムザ染色にて染色し、好酸球の数をヘンセ
ル（Ｈａｎｓｅｌ）染色法でカウントした。その結果を
図５に示す。図５は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰ
ＡＦ吸入モルモット気道組織好酸球浸潤の抑制を示すグ
ラフである。図５から明らかなように、気道粘膜上皮及
び皮下組織のいずれにおいても、好酸球の浸潤を有意に
抑制していた。（図５；＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、ｍｅ
ａｎ±ＳＥ）

【００２９】（６）ＰＡＦ刺激モルモットに対する抗Ｐ
ＡＦ受容体抗体のＢＡＬＦ中の細胞に対する浸潤抑制効
果 上記（４）の実験で用いたモルモットに関し、ＰＡＦ刺
激後２４時間でのＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏ
ｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）中の細胞について
比較した。ＢＡＬＦは、生理食塩水１０ｍｌ×３回用い
て洗浄後回収した液体を用いて、遠心後、ディフ・クイ
ック染色法にて細胞を染色し、カウントした。その結
果、図６に示すように好酸球は、ＢＡＬＦ中には抗体の
投与により有意に抑えられていた。図６は、抗ＰＡＦ受
容体抗体投与によるＰＡＦ刺激モルモットＢＡＬＦ中細
胞分画への影響を示すグラフである。（図６；＊Ｐ＜
０．１、ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＥ）

【００３０】（７）卵白アルブミン感作実験的喘息モル
モットにおける抗ＰＡＦ受容体抗体の気道抵抗の抑制効
果 ハートレー系モルモットに対し、６匹について、あらか
じめ卵白アルブミン１０ｍｇ／ｍｌを１０分間連続吸入
させ、感作を行った。感作には、当初１０日間毎日１回
１０分間行った後、１週間後、２週間後に追加の感作を
１０分間行い、実験的喘息モルモットのモデルとした。
ＰＣＡ反応をみてタイターが３２０以上のものをモデル
モルモットとした。この喘息モルモットに対し、半分の
３匹は、４ｍｇ／ｋｇの割合で抗ＰＡＦ受容体抗体を静
脈投与した。投与後１時間目から卵白アルブミン１０ｍ
ｇ／ｍｌを１０分間連続吸入させた。吸入開始から１５
分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時
間、７時間、８時間、９時間、１０時間後に気道の抵抗
を測定した。その結果を図７にまとめた。すなわち、図
７は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるモルモット喘息モ
デルにおける気道抵抗の抑制効果を示すグラフである。
図７から明らかなように、抗ＰＡＦ受容体抗体投与群
は、非投与群に比べ、気道抵抗が抑制された。この現象
は、１５分をピークとして現われる即時型喘息反応、及
び４〜６時間後にピークとして現われる遅延型喘息反応
のいずれをも有意に抑制した。（図７；＊Ｐ＜０．０
５、＊＊Ｐ＜０．１、ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＥ）

【００３１】（８）卵白アルブミン感作実験的喘息モル
モットに対する抗ＰＡＦ受容体抗体の気道組織好酸球浸
潤の抑制効果 上記（７）の実験で用いたモルモットに関し、卵白アル
ブミン吸入２４時間後の気道組織へ浸潤してきた好酸球
の数をカウントした。組織は（５）と同様でホルマリン
固定後、パラフィン包埋し、各３枚づつの切片をつくっ
て用いた。染色は、（５）と同様、Ｈａｎｓｅｌ、ヘマ
トキシリン−エオシン、及びギムザ染色し、好酸球を計
測した。その結果、図８から明らかなように、気道粘膜
上皮及び皮下組織のいずれにおいても好酸球の浸潤を有
意に抑制していた。図８は、抗ＰＡＦ受容体投与による
モルモット喘息モデル気道組織における好酸球浸潤の抑
制を示すグラフである。（図８；＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝
３、ｍｅａｎ±ＳＥ）

【００３２】（９）卵白アルブミン感作実験的喘息モル
モットにおける抗ＰＡＦ受容体抗体のＢＡＬＦ中の細胞
に対する浸潤抑制効果 上記（７）の実験で用いたモルモットに関し、卵白アル
ブミン吸入２４時間後のＢＡＬＦ中の細胞について比較
した。ＢＡＬＦは、上記（６）と同様、生理食塩水で洗
浄し、細胞をディフ・クイック染色法にて染色した。細
胞数は、図９に示すように、好酸球の浸潤のみならず、
リンパ球の浸潤をも抗ＰＡＦ受容体抗体投与により抑制
していた。図９は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるモル
モット喘息モデルにおけるＢＡＬＦ中細胞分画への影響
を示すグラフである。（図９；＊Ｐ＜０．５。＊＊Ｐ＜
０．３、ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＥ）

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の抗アレル
ギー剤は、気管支喘息をはじめとする炎症性の疾患の治
療に有効である。とりわけ、好酸球が関与している疾患
についてより効果的である。その理由は、本発明の抗ア
レルギー剤は、好酸球の浸潤を抑制し、かつ、ＥＣＰ放
出を抑制するからである。好酸球が関与する疾患は、好
酸球増加症として分類されている、喘息をはじめとした
アレルギー疾患、寄生虫感染、白血病、筋膜炎等であ
る。また、今回の本発明の抗アレルギー剤をより効果的
にするには、抗ＰＡＦ受容体抗体をヒト型化あるいはキ
メラ抗体にすることが効果的である。また、本発明の抗
アレルギー剤である抗ＰＡＦ受容体抗体のメリットは、
ヒトとマウス、ラット、モルモットのＰＡＦ受容体のい
ずれにも反応（認識）することができる点である。すな
わち、今回示した実施例の効果は、そのままヒトに対し
ても予想される効果であり非常に有用である。また、こ
の治療薬の副作用等についても、上記動物種のいずれに
も反応することより、モルモットで何もなければ、ヒト
でも何もないことは予想がつくことである。以上、本発
明の抗アレルギー剤は非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の抗体がヒト好酸球と反応する
ことを示すフローサイメトリーの図である。

【図２】図２は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ
誘導好酸球遊走の抑制効果を示す図である。

【図３】図３は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ
誘導好酸球からのＥＣＰ放出の抑制を示す図である。

【図４】図４は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ
吸収モルモット気道抵抗の抑制効果を示す図である。

【図５】図５は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ
吸収モルモット気道組織浸潤細胞の抑制を示す図であ
る。

【図６】図６は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるＰＡＦ
吸収モルモットＢＡＬＦ中細胞分画への抑制を示す図で
ある。

【図７】図７は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるモルモ
ット喘息モデルにおける気道抵抗の抑制効果を示す図で
ある。

【図８】図８は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるモルモ
ット喘息モデル気道組織浸潤細胞の抑制を示す図であ
る。

【図９】図９は、抗ＰＡＦ受容体抗体投与によるモルモ
ット喘息モデルＢＡＬＦ中細胞分画への抑制を示す図で
ある。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体または
   その活性フラグメントを有効成分として含有する抗アレ
   ルギー剤。
2. 【請求項２】 気管支喘息用である請求項１記載の抗ア
   レルギー剤。
3. 【請求項３】 ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体が、モ
   ノクローナル抗体である請求項１または２記載の抗アレ
   ルギー剤。
4. 【請求項４】 ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体のエピ
   トープが、ＰＡＦ受容体の細胞外第３ドメインにある請
   求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗アレルギー
   剤。
5. 【請求項５】 ヒトのＰＡＦ受容体に対する抗体の活性
   フラグメントが、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、
   Ｆｖ、及び組換えＦｖ体からなる群より選ばれる少なく
   とも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の抗アレルギー剤。
6. 【請求項６】 遅発型アレルギー反応及び即時型アレル
   ギー反応を抑制することができる請求項１または２記載
   の抗アレルギー剤。
7. 【請求項７】 好酸球及びリンパ球の気管支組織への浸
   潤を抑制することができる請求項１または２記載の抗ア
   レルギー剤。
8. 【請求項８】 好酸球のＥＣＰ放出を抑制することがで
   きる請求項１または２記載の抗アレルギー剤。