KR100381128B1 - 사구체신염및다른염증질환의치료방법및치료용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사구체신염(GN)을 치료하는데 항-C5 항체, 예컨대, 단클론 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 항체를 낮은 투여량으로 투여하면 사구체 염증/확대 및 다른 GN과 관련된 병태 질환을 상당히 감소시키는 것으로 발견되었다. 또한, 본 발명은 신규한 항-C5 항체 및 항-C5 항체-암호 핵산 분자에 관한 것이다. 이 항체들은 GN 및 보체계의 병태학적 활성화와 관련된 다른 염증 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

사구체신염 및 다른 염증 질환의 치료방법 및 치료용 조성물

1. 면역 복합체 매개 질환

면역 복합체의 형성은 주로 특이적인 항체와 항원의 상호작용의 결과로서 나타난다. 이러한 복합체가 일정 구역내에 축적하는 경우 발생하는 염증 반응은 정상의 숙주 방어기작의 주요 인자로서, 식세포에 의해 면역 복합체가 제거되고 항원도 파괴된다. 이에 반해, 면역 복합체 질환은 특이적인 항원 투여 또는 면역학적 조절이상의 조건하에서, 과도한 복합체 형성 또는 제거율의 지연을 반영한다. 이러한상황하에, 면역 복합체는 특정의 조직 부위에만 형성되거나 침착되고, 결과적으로 산출되는 염증반응은 국소 또는 전신 조직 손상으로 인한 질병 상태를 유도한다. 신장, 특히 사구체라고 공지된 신장 구조는 특히 주요한 면역 복합체 침착 부위로서, 심각한 질병 상태로 진행되게 되는 곳이다.

인체 연구 및 인간 질환에 대하여 동물을 모델로 한 연구를 통해, 병리 생태중의 보체계가 다수의 면역 복합체 관련 질환과 연관이 있는 것으로 나타났다. 이러한 질환과 관련된 병리상태를 매개하는 보체의 활성은 자가면역 기작의 결과이거나, 또는 본래 비면역원성인 것일 수 있다.

조직내 또는 순환계내에 존재하는 항원에 항체가 결합할 때 발생하는 과민증 반응은 보체 활성화 및 염증을 매개하는 분자의 방출로 인해 초래된다. 이 과정은 고정 조직이나 세포 결합된 항원(II 형 과민증)에 대한 항체의 결합에 의해 매개되는 것 또는 순환 항원에 대한 항체의 결합에 의해 매개되는 것으로 분류되며, 이로써 순환성 면역 복합체가 형성되고 이어서 이 복합체들이 조직내 병원성을 유발하며 침착하게 된다(III 형 과민증).

II 형 과민증은 고정된 조직 항원에 대한 항체의 결합에 이어 보체의 활성화를 통해 매개된다. 염증 반응의 발생은 보체계의 선구염증 성분 및 용해유발 성분의 활성화 및 잇따른 면역 복합체 형성 부위로의 자극된 백혈구의 축적으로부터 초래된다. C3a 및 C5a의 아나필라톡신 활성으로부터 산출되는 혈관 투과성의 증가는 또한 면역복합체 침착과 백혈구 축적을 증진시킨다.

호중구, 혈소판, NK 세포 및 단핵 세포와 같은 작동인자 세포의 그 Fc 수용체를 통한 항체 결합 세포 또는 조직의 가교반응은 선구염증반응의 역할을 한다. 이러한 가교반응은 작동인자 세포를 활성화시켜 산소 라디칼, 프로스타글란딘 및 류코트리엔의 방출을 자극시키고, 이러한 방출의 자극은 활성화된 보체 성분의 활성에 의해 증가된다.

II 형 과민증 매개 증상의 예로는 이식 기관의 초급성 거부반응, 자가면역 용혈상태 및 혈소판감소 상태, 굿파스튜어증후군(및 관련된 사구체신염과 폐출혈), 중증 근무력증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병과 관련된 병리학적 후유증, 및 심상성 천포창을 포함한다.

순환 항원과 관련된 III 형 과민증 반응은 또한 다양한 병리학적 상태를 진행시킬 수 있다. 그 예로는 사구체신염(하기 상세히 기술됨), 혈관염(생명을 위협할 정도로 강력한 대혈관 및/또는 소혈관 염증 질환), 류마티스양 관절염, 피부염 및 기타 다른 질환을 포함한다.

III 형 과민증 반응과 관련있는 기타 다른 질환으로는 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다양한 감염 질환, 종양 질환, 및 기타 다른 다양한 질환과 같은 자가면역 질환을 포함한다(Dixon 등, Immune Complex Injury, in Samter, (ed.) 면역 질환, 제 4판, Little Brown & Co. 보스톤 소재, 1987).

II. 사구체신염

사구체는 신장의 주요한 구조적 및 기능적 구조이다. 각 사구체는 신장의 주요 기능적 단위로서 작용하고 네프론이라 명명되는 보다 큰 구조의 일부분으로서 발견된다. 약 100만의 네프론이 각 신장중에서 발견된다. 각 사구체는 보우만낭으로 알려진 구조중에 쌓인 50개 이하의 평행 모세관으로 구성된 그물망구조이다. 사구체 모세관이 차지하고 있지 않은 보우만낭내의 영역은 보우만 구역이라고 공지되어 있다. 사구체는 혈액의 단백질과 세포로부터의 특정 용질과 물을 보우만 구역내로 분리시킨 뒤, 곡세관 헨레계제, 및 네프론의 집합관으로 진행시키는 여과기처럼 작용한다.

사구체신염(GN)은 염증 및 이에 따라 산출되는 일반적으로 면역 복합체 형성으로 인한 사구체 확장을 특징으로 하는 신장 질환이다. 사구체내에 면역 복합체의 축적은 특히 세포과다와 관련된 염증 반응을 초래하고, 이 세포과다는 다른 요인들중에서도 모세관강의 협소화를 통해 사구체의 부분 또는 전체 폐색을 유발시킬 수 있다. 이러한 과정의 한 결과는 사구체의 정상적인 여과 기능이 저해되는 것이다. 폐색은 다수의 사구체내에서 발생할 수 있어, 신장 기능을 직접적으로 손상시키고, 종종 사구체를 구성하는 모세관의 벽내에 단백질을 비정상적으로 침착시키기도 한다. 이러한 침착으로 인해, 결국에는 사구체 기저막을 손상시킬 수 있다. 폐색되지 않은 사구체는 투과성의 증가를 나타내어, 다량의 단백질을 소변내로 이동시켜 단백뇨증이라는 질환을 유발시킨다.

심각한 GN의 대부분의 경우, 겸상형 구조로 명명되는 병리학적 구조를 보우만 구역내에 형성시켜, 사구체 여과 기능을 더욱 저해한다. 이러한 구조들은 생체검사 또는 부검시 수득되는 조직 샘플을 현미경 검사하므로써 관찰할 수 있으므로, 따라서, 이 구조들이 나타나는 환자들중에서 항상 관찰되는 것은 아니다. 겸상형 구조는 세포과다의 징후로서, 보우만낭의 내막을 형성하는 세포인 두정부 표피 세포의 상당한 비정상적인 증식으로부터 발생하는 것으로 사료된다. 임상적인 연구 결과, 겸상형의 사구체 비율과 그 질환의 임상적 정도간에는 대략적인 상관관계가 있음을 나타내었다. 다수의 겸상형 구조가 존재한다면, 겸상형 구조는 좋지 않은 예후이다.

GN의 증상으로는 단백뇨; 사구체 여과 속도(GFS)의 감소; 고질소혈증(요독증, 혈액 요소 질소의 과량상태-BUN) 및 수분 유지를 유도하여 고혈압과 수종을 산출하는 염류 유지를 비롯한 혈청 전해질의 변화; 적혈구 원주를 포함하는 비정상적인 요침전물 및 혈뇨; 저알부민혈증; 과지질혈증; 및 지질뇨증을 포함한다.

미국 신장 데이터 시스템(USRDS)에 따르면, 1990년에 미국내 21만명 이상의 환자들은 만성 신부전을 치료하기 위해 혈액투석 및 이식에 연간 70억 달러 이상의 비용을 사용하였다. USRDS는 국립보건소 산하의 국립 당뇨병 및 소화기와 신장질환 연구소(NIDDKD)의 신장, 비뇨기 및 혈액 질환 분과와 함께 미국내의 신장 질환에 대한 데이터를 수집하고 있다. USRDS는 신부전의 치료비용이 해마다 20%씩 증가하고 있다고 추정하고 있다.

GN은 당뇨병 및 고혈압에 이어 말기 신장 질환 환자의 제 3의 주요 사망 원인이다. 따라서, 의학회에서는 이 질환의 효과적인 치료방법이 절실히 필요함을 통감하고 있다. 이에 따라, GN의 신규 치료방법을 개발하고자 하는 연구가 전세계적으로 진행되고 있다. 미국에서는 NIDDKD, 국립 신장 재단, 및 여러 다른 공공기관 및 사립기관들이 이 분야의 연구를 후원하고 있다. 국립 신장 재단은 단독적으로 신장 연구가들에게 해마다 200만 달러 이상을 투자하고 있다.

III. 현재 통용되는 GN의 치료방법

일반적으로 고 투여량의 "펄스" 정맥내 메틸프레드니솔론 또는 구강 프레드니손 치료법과 같은 코르피코스테로이드 투여법은 현재 GN 치료에 사용되는 가장 효과적인 약리제인 것으로 사료된다. 이러한 스테로이드 치료제는 종종 아자티오프린 또는 시클로포스파미드와 같은 세포독성의 일반적인 면역억제제와 함께 투여된다. 이러한 약물이 나타내는 전반적인 면역 억제와 이에 따라 산출되는 감염 민감성의 증가는 스테로이드 및 세포독성 약물 투여와 관련된 다른 쇠약성 부작용과 함께 상기 약물이 효과적으로 사용되지 못하도록 한다.

또한, 아스피린계의 비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 사구체 염증 및 GN의 확대를 억제시키는데 사용되어 왔다. 그러나, 이 약물은 아마도 비교적 약한 항염증 효과 및 많은 환자들중에서 위장 부작용 및 다른 부작용을 유발하는 경향으로 인해 상기 목적에 일반적으로 사용되지 않는다.

헤파린 또는 와르파린 나트륨과 같은 항응고제 및 사이프로헤파딘, 디피리다몰 또는 설핀피라존과 같은 항혈전제의 투여는 사구체 겸상형 구조의 발생에 응혈 과정이 관련되어 있음을 나타내는 증거를 기초로 하여 사용되었다. 그러나, 실험적으로 유도된 겸상형 GN을 겪는 동물중에 상기 치료법을 처치한 결과 나타나는 객관적인 잇점의 증거는 일정하지 않았다. 또한, 항응고제는 생명을 위협할 정도의 출혈 에피소드를 증진시킬 수 있는 위험한 약물이다. 이런 점에서, 진행성 신부전 환자들에게 특히 위험하다.

약리학적 시도외에도, 매일(또는 어떤 경우에는 1주에 3회) 2 내지 4리터의혈장을 점진적으로 교환하는 방법(혈장분리반출법)은 염증 과정의 신속 개입이 필요할 때 다량의 순환형 면역 복합체를 급격하게 감소시킬 수 있다. 그러나, 이러한 처치법은 비용이 많이 들고 환자가 매주 수시간동안 혈장분리반출기를 연결하고 있어야만 한다. 또한, 혈액을 제거하고 환자에게 재공급하는 모든 과정은 증가된 감염 위험율을 갖고 있다. 그럼에도 불구하고 혈장 교환은 GN을 유발시킬 수 있는 순환형 면역 복합체를 제거하는 가장 효과적인 비약리학적 치료법으로서 간주되고 있다.

순환 면역 복합체양은 또한 예컨대, 근본적인 감염 또는 변화를 항생제로 효과적으로 치료하여 복합체내에 함유된 항원 또는 항원들의 공급원을 제거하거나 감소시키므로써 저하시킬 수 있다. 그러나, 이러한 치료법은 대부분 선택에 따른 치료법이지만, 항원 부하량의 저하가 면역 복합체의 형성과 관련된 항원 대 항체의 몰비를 변화시켜, 위험한 정도의 염증과정의 일시적인 악화를 유발시킬 수 있으므로 상당한 주의가 필요로 된다(하기 생리학 및 병리학 배경 기술분야를 참조하라).

IV. 항체 조작

천연 항체는 고도로 특이적인 항원 결합 성질을 지닌 다중 서브유니트의 동물 단백질 분자이다. 동물은 여러 군의 항체를 제조한다. 여기에는 5가지 주요 군(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 다양한 아군이 있다. 천연의 항체는 각각 하나의 중쇄(H) 및 하나의 경쇄(L)를 함유하는 2개 이상의 헤테로이량체 서브유니트로 구성되어 있다. 항체 군간의 차이는 상이한 중쇄간의 차이로부터 유래되는 것이다. 중쇄는 분자량이 약 53kDa 인 반면, 경쇄는 분자량이 약 23kDa 이다.

모든 개개의 천연 항체는 1종의 경쇄 및 1종의 중쇄를 갖고 있고, 이들은 이황화결합에 의해 함께 유지되어 헤테로이량체 서브유니트를 형성한다. 일반적으로, 천연의 항체(예, IgG)는 상기 서브유니트를 2개 갖고 있고, 이들은 또한 이황화 결합에 의해 함께 유지된다. 각 쇄내에서 약 110개의 아미노산 잔기들의 유니트는 접혀있어 치밀한 도메인을 형성한다. 각 도메인은 하나의 사슬내 이황화 결합에 의해 함께 유지된다. 경쇄는 2개의 도메인을 갖는 반면, 중쇄는 4개 또는 5개의 도메인을 갖고 있다. 대부분의 중쇄는 처음(즉, 아미노 말단에 위치된) 2개의 도메인 다음에 접번부를 갖고 있다. 헤테로이량체 서브유니트를 함께 연결하는 이황화 결합은 이 접번부에 위치한다. 접번부는 특히 단백분해 절단에 민감하고, 단백분해작용은 2개 또는 3개의 단편(즉, 절단의 정확한 부위에 따라), 즉 중쇄의 C 영역(Fc)만을 함유하는 비항원 결합단편 및 1개의 이가(Fab'2) 항원 결합 단편 또는 2개의 일가(Fab) 항원 결합 단편을 산출한다. 접번부는 항원 결합 부위들(각각 하나의 경쇄와 처음 2개의 중쇄 도메인으로 구성됨)을 나머지 중쇄 도메인을 함유하는 천연 항체의 나머지에 상대적으로 자유롭게 이동할 수 있도록 한다.

각 쇄의 제 1 도메인은 아미노산 서열이 고도로 가변적이어서, 광대한 범위의 항체 결합 특이성이 각 개체중에서 관찰된다. 따라서, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인으로 공지되어 있다. 각 쇄의 제 2 도메인 및 그 다음의 도메인(존재하는 경우)은 그 아미노산 서열이 비교적 불변적이다. 따라서, 불변 중쇄(CH) 및 불변 경쇄(CL) 도메인이라고 공지되어 있다.

각 가변 영역은 항원의 가변영역에 상보적인 구조를 제공하며 항원에 결합될때의 접촉 부위인 것에 따라 항체의 항원 결합 특이성을 결정짓는데 중요한 3개의 루프로 이루어진 과가변 서열을 포함한다. 이 루프들은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 알려져 있다. 각 가변 도메인은 가변성이 훨씬 적은 4개의 골격 분절(FR)내에 끼여있는 3개의 CDR로 구성되어 있다. 동일선상의 CDR 및 FR의 세트는 함께 주로 항체 분자의 가변 영역의 입체 배좌를 결정짓는데 중요한 역할을 한다.

CDR 및 FR은 항체 가변부의 구조적 성질로부터 추론된 특징이다. 항체 가변영역의 아미노산 서열(1차 구조) 및 입체 모델링(추론되는 2차 및 3차 구조)은 여러 연구가들에 의해 CDR 및 디폴트에 의해 FR을 정의하는데 사용되었다. CDR의 위치는 확실하였지만, 당해분야의 모든 연구가들이 VH 또는 VL 영역내에 존재하는 각 CDR의 경계를 나타내는 정확한 위치에 대하여 동의하고 있지 않으며, 즉 CDR/FR 경계를 나타내는 명확하게 가로지르는 구조적 표식인자는 없다.

CDR 위치에 대해 2가지 정의가 현재 당해 기술분야에 일반적으로 통용되고 있다. 즉, 카베트 등에 의한 "서열 가변성" 정의("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4판, 와싱톤. 디.씨.: Public Health Service, N.I.H.) 및 초티아 및 레스크의 "구조적 가변성" 정의(J.Mol.Biol. 1987, 196:901)이다. 본원에 사용된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3이란 용어는 최소한으로는 상기 2가지 정의 각각에서 각 CDR에 대해 나타낸 영역들간의 중복 영역만을 의미하는 것이고, 최대한으로는 상기 2가지 정의 각각에서 각 CDR에 대해 나타낸 영역들을 조합했을 때 걸치는 총 영역을 의미하는 것이다.

항체 조작법이 처리해야만 하는 한가지 문제점은 치료용으로 환자에게 투여되는 천연 뮤린(또는 다른 인간을 제외한 동물) 항체, 일반적으로 mAb에 대한 반응으로 나타나는 인체 환자의 면역 활성이다. 이 뮤린 항체에 대한 활성은 치료 효과 및 환자 건강에 유해 효과를 나타낼 수 있는 인간 항마우스 항체(HAMA) 반응을 특징으로 한다. 이러한 거의 모든 항비인간의 항체("HAMA형") 활성은 천연의 비인간 항체의 가변 도메인의 FR 영역 및 불변 도메인에서 유래되는 것으로 밝혀졌다.

항체 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 조작하여, 비인체 가변부를 인체 불변부를 구성하는 항체내로 유입시킬 수 있다. 산출되는 항체는 "키메라 항체"라고 지칭되며, 이것은 일반적으로 가변부가 유래되는 비인체 항체보다 HAMA 형 반응을 유도하기가 쉽지 않다.

HAMA 형 반응을 유도하는 비인체 항체의 잠재성을 제거하기 위한 보다 효과적인 접근 방법은 그 항체를 "인체화"하는 것이며, 즉, 비인체 골격 영역을 인체 골격영역으로 대체시키는 것이다. 이러한 인체화를 수득하는 한가지 방법은 인체화될 항체의 비인체 CDR을 암호하는 폴리뉴클레오티드 단편을 다른 인체 항체(필요하다면 인체 불변부를 갖고 있음)를 암호하는 핵산 분자내로 삽입하여, 인간의 CDR을 대체시키고 산출되는 핵산 분자를 사용하여 암호된 "인체화된" 항체를 발현하는 것이다.

그러나, 불운하게도 비인체 항체의 인체화는 항체 항원 상호반응, 예컨대 항원 결합 성질에 예상치못한 효과를 나타냈다. 이러한 불예측성의 일부는 CDR의 성질에서 유래하는 것이다. 특정 CDR들은 다른 항체의 성질보다는 비인체 CDR 공여 항체의 성질을 보유하는 인체화된 항체로 작제되기가 더욱 쉬울 수도 있다. CDR 이항체의 항원 결합 성질의 주요 인자이지만, CDR과 FR은 항체의 항원 특이성이 인체화 이후에도 보유되어야만 한다면 적절하게 상호작용해야만 한다. 특성이 규명되지 않은 비인체 CDR에 대한 특정 인체 FR의 조합 효과는 공지된 임의 방법으로 예측하기가 어렵다. 그러나 항체가 성공적으로 인체화되었다는 것은 일반적으로 다른 인체 FR이나 변화된 인체 FR을 사용하여도 그 항체의 CDR을 용이하게 성공적으로 인체화할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 성공적인 인체화의 가능성을 증진시키기 위해 인체 FR을 용이하게 개조하는 방법이 사용될 수 있다.

항체 조작시 나타나는 다른 문제점은 효과적인 항체 생산 및 항체 약력학의 개질을 포함한다. 재조합 단백질 생산은 일반적으로 세균 숙주내에서 가장 효과적으로 수행된다. 그러나, 천연 항체의 큰 크기와 다합체 본성으로 인해 세균내에서 그 항체를 생산하는 것은 어려운 일이다. 항체 생산의 문제점을 다루는 한가지 방법은 중쇄와 경쇄를 링커 펩타이드로 결합시켜 1본쇄(sc)의 항체를 제조하는데 재조합 DNA 방법을 사용하는 것이다. 하기 기술되는 바와 같이, 작제될 수 있는 1본쇄 항체는 여러 가지 유형이 있다.

인체화 경우와 같이, 1본쇄 항체의 일부분으로서 작용하는 기능과 관련하여 특성이 규명되지 않은 중쇄 및 경쇄를 사용하여 특정 형태의 1본쇄 항체를 제작할때 항원 결합 성질에 미치는 효과는 어떤 공지의 방법으로도 신뢰할만한 결과를 예측할 수 없다. 그러나, 특정한 천연 항체로부터 임의의 한 종류의 1본쇄 항체가 성공적으로 작제되었다는 것은 일반적으로 그 천연 항체로부터 다른 종류의 1본쇄 항체도 성공적으로 용이하게 작제할 수 있다는 것을 의미한다.

1본쇄 항체는 단지 VH 및 VL 도메인 각각을 1개 함유할 수 있고, 이런 경우 scFv 항체라고 지칭된다: 이 항체들은 VH, VL, CH, 및 CL 도메인을 각각 1개만을 함유할 수 있고, 이런 경우 scFab 항체라고 지칭된다. 또는 이 항체들은 천연 항체의 가변부 및 불변부를 모두 함유할 수 있고, 이런 경우, 이 항체를 총 길이의 sc 항체하고 지칭한다.

상이한 크기의 상기 항체들은 각각 상이한 약력학적 성질을 갖고 있다. 일반적으로, 보다 작은 단백질은 동일한 일반적인 조성의 보다 큰 단백질들보다 빠르게 순환계로부터 제거된다. 따라서, 총 길이의 sc 항체 및 천연 항체들은 작용 지속기간이 가장 길고, scFab 항체는 이보다 짧으며, scFv 항체는 이보다 더욱 짧다.

처치되는 질환에 따라, 작용 기간이 길거나 짧은 치료제가 필요하다는 것은 당연한 것이다. 예컨대, 체외 순환 절차(일반적으로 지속기간이 짧음)와 관련된 면역 및 울혈질환을 예방하는데 사용하기 위한 치료제는 그 작용이 비교적 짧은 것이 바람직한 반면, 장기간의 만성 질환(예컨대, 관절 염증 질환 또는 GN)을 치료하는데 유용한 항체는 그 작용이 비교적 긴 것이 바람직하다.

항체 조작에 관한 상세한 논의는 최근 많은 문헌들에 공개되어 있고, 그 예로는 Borrebaek, "Antibody Engineering, A Practical Guide", 1992. W.H.Freeman and Co. NY; 및 Borrebaek, "Antibody Engineering", 2판, 1995, Oxord University Press, NY, Oxford가 있다.

본 발명은 사구체신염(GN) 및 다른 염증 질환의 치료방법에 관한 것이며, 보다 개괄적으로는 환자의 보체계의 약리학적 억제작용과 관련된 치료학적 방법에 관한 것이다. 이러한 치료법을 달성하기 위해, 특히 본 발명은 인간의 보체 성분 C5에 특이적인 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이가 항체에 의해 산출될 수 있는, 항체 대 항원의 화학량론적 양이 이론값인 1 대 2의 범위에 실질상 도달하는 농도일 때 C5a 생성 및 보체 용혈 활성을 차단하는 인간의 보체 성분 C5에 특이적인 천연의 단클론 항체(mAb)를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 천연 mAb와 본질적으로 동일한 차단 활성을 제공하는 천연 mAb의 유도체(일가 유도체 포함)인 재조합 mAb를 제공한다.

도 1A, 도 1B, 및 도 1C는 마우스 신장의 PAS 염색 단편의 현미경 사진이다. 도 1A--유도되지 않고 처리되지 않은 마우스. 도 1B--GN-유도된 PBS(대조용)-처리된 마우스. 도 1C--GN-유도된 항C5 처리된 마우스. 각 배율은 약 400X로, 동일하다.

도 2A, 도 2B, 및 도 2C는 마우스 신장의 면역형광성 염색된 단편의 현미경 사진이다. 도 2A--유도되지 않고 처리되지 않은 마우스. 도 2B--GN-유도된 PBS(대조용)-처리된 마우스. 도 2C--GN-유도된 항C5 처리된 마우스. 각 배율은 약 200X로 동일하다.

도 3은 PBS중의 항C5 항체("항C5") 또는 PBS 단독물("PBS 대조군)로 처리한 GN-유도된 동물로부터 채취한 혈청의 용혈(세포 용해) 분석 결과이다. 이와 함께 정상 혈청을 사용하여 수행한 분석 결과도 제시되어 있다.

도 4는 가용성 C5b-9("sC5b-9") 분석 결과이다. "ND"는 측정되지 않은 것을 나타낸다.

도 5A, 도 5B, 및 도 5C는 마우스 C3에 대해 염색한 신장 단편의 면역형광성 현미경사진이다. 도 5A--유도되지 않고 처리되지 않은 마우스. 도 5B--GN-유도된 PBS(대조용)-처리된 마우스. 도 5C--GN-유도된 항C5 처리된 마우스. 각 배율은 약 400X로, 동일하다.

도 6은 순환성 인체 혈액 샘플의 C3a 분석 결과이다. "ND"는 측정되지 않은 것을 나타낸다.

도 7A 및 도 7B는 항C5 항체로 처리한 후의 마우스 혈액(도 7A) 또는 인체 혈액(도 7B)의 세포 용해력의 감소를 약력학적 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2 및 5의 면역형광 염색은 사구체 모세관 그물망(총맥)에 제한되는 것으로, 도 1B에서 관찰되는 사구체의 확대는 도 2B 및 도 5B에서는 관찰할 수 없다.

도 8은 C5에 대한 천연 5G1.1 결합성의 스캐챠드 분석 결과이다.

도 9는 C5에 대한 천연 N19/8 결합성의 스캐챠드 분석 결과이다.

도 10은 천연 5G1.1의 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플내에 생성되는 C3a 양을 나타낸 그래프이다.

도 11은 천연 5G1.1의 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플내에 생성되는 sC5b-9 양을 나타낸 그래프이다.

도 12는 천연 5G1.1 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플의 혈청 용혈 활성을 나타낸 그래프이다.

도 13은 m5G1.1 scFv의 존재하에 혈청 용혈 활성을 나타낸 그래프이다.

도 14는 m5G1.1 scFv의 존재하에 C5a 생성율을 나타낸 그래프이다.

도 15는 m5G1.1 scFv 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플중의 C3a 생성결과를 나타낸 그래프이다.

도 16은 5G1.1 scFv 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플의 혈청 용혈 활성을 나타낸 그래프이다.

도 17은 m5G1.1 scFv 존재하에 순환성 인체 혈액 샘플의 sC5b-9 생성율을 나타낸 그래프이다.

도 18은 항체 5G1.1의 경쇄 가변영역이다. 가변영역의 PCR 증폭에 사용된 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 유래되는 서열은 밑줄에 나타낸다. 아미노산은 카베트 등에 의한 문헌(상기 문헌 참조)에 따라 번호가 매겨진다. 상자안의 아미노산은 성숙한 5G1.1 경쇄 또는 5G1.1의 엔도프로테이나제 Lys C 펩타이드로부터 수득한 펩타이드 서열에 상응하는 것이다. 서열 가변성 정의 및 구조 가변성 정의에 따른 상보성 결정 영역(CDR) 잔기는 각각 밑줄 및 윗줄이 그어져 있다.

도 19는 항체 5G1.1의 중쇄 가변영역이다. 가변영역의 PCR 증폭에 사용된 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 유래되는 서열은 밑줄에 나타낸다. 아미노산은 카베트 등에 의한 문헌(상기 문헌 참조)에 따라 번호가 매겨지며, +1은 가공처리된 성숙한 가변영역의 제 1 아미노산을 나타내는 것이다. 상자안의 아미노산은 파이로글루타메이트 아미노펩티다제로 처리한 후의 5G1.1 중쇄로부터 수득한 펩타이드 서열에 상응하는 것이다. 서열 가변성 정의 및 구조 가변성 정의에 따른 상보성 결정 영역(CDR) 잔기는 각각 밑줄 및 윗줄이 그어져 있다.

생리학 및 병리학 배경

본 항에서의 기술내용은 본 발명이 아닌 "종래기술"로 간주되는 기술사상에 대해서만 제한하는 것은 아니다. 따라서, 이러한 종래 기술 상태에서의 어떤 자명한 사실이 본 항에 특정 기술사상을 내포시키므로써 암시되거나 유추될 수 있는 것이 아니며, 이러한 기술 사상이 내포된다고 하여 본 발명자들의 권리에 대하여 표명되는 바도 없을 것이다.

I. 서론

전술한 바와 같이, 본 발명은 GN 및 다른 면역 복합체 매개의 질환의 치료학적 치료방법, 뿐만 아니라 기타 다른 보체 매개 질환의 치료 방법 및 보체 성분 C5의 억제방법에 관한 것이다. 하기 기술되는 본 발명의 바람직한 양태의 상세한 설명 및 실시예의 배경 설명을 위해, 먼저 면역계의 보체 아암, GN의 병태생리학적 특징 및 GN 병인론에 있어서의 보체의 역할에 대한 종래 연구에 대해 일반적인 사항을 기술하고자 한다.

보체계 및 GN의 일반적인 사항은 예컨대, 문헌[Glassock and Brenner, 1994; Couser, 1993; Couser, 1992; Couser et al., 1992; Rich, 1992; Glassock and Brenner, 1987; Robbins and Cotran, 1979; 및 Guyton, 1971]을 참조하기 바란다.

II. 보체계

보체계는 신체의 다른 면역계와 함께 세포 병원균 및 바이러스 병원균의 침투에 대해 방어하는 작용을 한다. 이 계에는 혈장 단백질 및 막 보조인자의 복합 수집물로서 발견되는 25가지 이상의 보체 단백질이 있다. 혈장 단백질은 척추동물 혈청내에 존재하는 약 10%의 글로불린을 구성한다. 보체 성분들은 일련의 복잡하지만 정확한 효소적 절단 및 막 결합 과정을 통해 상호작용하므로써 면역 방어 기능을 수행한다. 산출되는 보체 폭상반응(cascade)은 옵소닌 작용, 면역조절 작용 및 용해 작용을 지닌 생성물을 생산시킨다.

보체 폭상반응은 정경로 또는 대체경로를 통해 진행한다. 이 경로들은 많은 성분들을 공유하고, 초기 단계의 성분들은 다르지만, 표적 세포의 활성화 및 파괴와 관련이 있는 "종말 보체" 성분(C5 내지 C9)은 동일하게 공유한다.

보체 정경로는 표적 세포상의 항원 부위를 항체가 인식하여 결합하므로써 통상적으로 개시된다. 대체 경로는 통상 항체와는 무관하고, 병원체 표면상의 특정 분자에 의해 개시될 수 있다. 이 두가지 경로는 보체 성분 C3이 활성 프로테아제(각 경로마다 상이함)에 의해 절단되어 C3a 및 C3b를 산출하는 점에서 합류한다. 또한, 보체공격을 활성화시킬 수 있는 기타 다른 경로들은 보체 기능의 다양한 양태로 유도하는 일련의 과정중에서 이후에 작용할 수 있다.

C3a는 아나필라톡신이다(하기 기술됨). C3b는 세균 및 기타 다른 세포, 뿐만 아니라 특정 바이러스와 면역 복합체에 결합하여, 이들을 표지시켜 순환계로부터 제거한다(이러한 역할의 C3b는 옵소닌이라고 공지되어 있다). C3b의 옵소닌 기능은 보체계의 가장 중료한 항감염 작용인 것으로 간주된다. C3b 기능을 차단하는 유전자 병변을 지닌 환자들은 다양한 병원체에 의해 감염되기 쉬운 반면, 보체 폭상 반응 순서중의 C3b 이후에 병변이 있는 환자, 즉, C5 기능을 차단하는 병변을 지닌 환자들은 나이세리아에 의해서만 보다 감염되기 쉽고, 그 후 다소 더 감염되기 쉬워진다(Fearson, in Intensive Review of Internal Medicine, 2nd Ed. Fanta and Minaker, eds. Brigham and Women's and Beth Israel Hospitals, 1983).

C3b는 또한 C5를 C5a 및 C5b로 절단하는 정경로 또는 대체 경로의 C5 전환 효소를 형성하는 각 경로에 독특한 기타 다른 성분과 복합체를 형성한다. 따라서, C3는 정경로와 대체 경로 모두에서 필수적이므로 보체 반응 순서중의 중심 단백질로서 간주된다(Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340. 1991). 이러한 C3b의 성질은 C3b에 대해 작용하여 iC3b를 산출시키는 혈청 프로테아제 I 인자에 의해 조절된다. C3b가 여전히 옵소닌으로서 작용성일지라도, iC3b는 활성 C5 전환효소를 형성할 수 없다. C5는 약 75㎍/ml(0.4μM)의 정상 혈청중에서 발견되는 190kDa 베타 글로불린이다. C5는 글리코실화되어 있고, 이의 약 1.5 내지 3%는 탄수화물에 의해 글리코실화된다. 성숙한 C5는 656개의 아미노산으로 구성된 75kDa의 베타 쇄에 이황화결합된 999개의 아미노산으로 구성된 115 kDa의 알파 쇄의 이종이량체이다. C5는 단일 복사 유전자의 1본쇄 전구체 단백질 생성물로서 합성된다(Haviland et al., J.Immunol. 1991, 146:362-368). 이 유전자 전사물의 cDNA 서열은 18개 아미노산 선도 서열과 함께 1659개의 아미노산으로 구성된 분비형 프로-C5 전구체를 유도한다(서열 번호 2).

프로-C5 전구체는 아미노산 655번과 659번 다음에서 절단되어 아미노산 말단 단편으로서 베타쇄(서열 번호 2의 아미노산 잔기 +1 내지 655번) 및 카르복실 말단 단편으로서 알파쇄(서열번호 2의 아미노산 잔기 660번 내지 1658번)를 산출하며, 이 두 단편사이에서 4개의 아미노산(서열 번호 2의 아미노산 잔기 656번 내지 659번)이 삭제된다.

C5a는 C5 알파쇄의 처음 74개의 아미노산(즉, 서열번호 2의 아미노산 잔기 660번 내지 733번)을 함유하는 아미노 말단 단편으로서, C5의 알파쇄로부터 대체 경로 또는 정경로의 C5 전환효소에 의해 절단된다. 11 kDa 질량의 C5a의 약 20%는 탄수화물에 의한 것이다. 이 때 전환효소 작용의 절단 부위는 서열 번호 2의 아미노산 잔기 733번이거나 또는 여기에 인접한 부위이다. 이 절단부위 또는 이 부위에 인접하게 결합할 수 있는 화합물은 C5 전환효소가 그 절단부위에 접근하는 것을 차단할 수 있어 보체 저해제로서 작용한다.

C5는 또한 C5 전환효소 활성이외의 다른 수단에 의해 활성화될 수 있다. 예컨대, 일정한 트립신 분해(Minta and Man, J.Immunol. 1977, 119:1597-1602:Wetseland Kolb, J.Immunol. 1982, 128:2209-2216) 및 산처리법(Yammamoto and Gewurz, J.Immunol. 1978, 120:2008; Damerau et al., Milec. Immunol. 1989, 26:1133-1142)은 또한 C5를 절단하여 활성 C5b를 생산한다.

C5a는 또다른 아나필라톡신이다(하기 상세히 기술됨). C5b는 C6, C7 및 C8과 결합하여 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 여러개의 C9 분자가 결합하면, 막공격 복합체(MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체-TCC)가 형성된다. 이 MAC가 충분한 수로 표적 세포막에 삽입되면 이들이 산출하는 개구부(MAC 포어)는 표적 세포의 급속한 삼투 용해작용을 매개한다. 또한, 보다 소량인 비용해성 MAC 농도는 다른 효과를 산출할 수 있다. 특히, 상피 세포 및 혈소판에 소수의 C5b-9 복합체가 막에 삽입되면 유해한 세포 활성화를 유발할 수 있다. 어떤 경우에는 세포 용해에 앞서 활성화가 일어날 수 있다.

전술한 바와 같이, C3a 및 C5a는 아나필라톡신이다. 이 활성화된 보체 성분들은 히스타민과 염증의 다른 매개인자를 방출시키는 비만 세포 탈과립화를 자극하여 평활근 수축, 증가된 혈관 투과성, 백혈구 활성화, 및 세포과다를 초래할 수 있는 세포증식을 비롯한 기타 다른 염증 현상을 산출할 수 있다. C5a는 또한 선구-염증성 과립세포를 보체 활성화 부위로 유인하는 작용을 하는 화학주성 펩타이드로서 작용한다.

III. GN의 병태생리학

GN은 이상한 범위의 병리학적 과정을 수반할 수 있지만, 가장 일반적으로는 감염 질환 과정, 자가면역중에, 그리고 일부 다른 질환 과정의 치료 결과로서 나타난다. GN의 원인 기작은 일반적으로 신장중에 순환성 면역 복합체의 침착으로 부터 생겨난다. GN의 병인론과 관련이 있는 인자들로는 관련된 특정 항원 및 항체, 그리고 면역 복합체의 침착 결과로서 나타나는 염증 과정을 포함한다.

GN을 유발하는 면역 복합체 형성에 관련된 항원:

GN을 유발시키는데 관련이 있는 항원들은 크게 내인성, 감염성 및 의인성(의료 행위의 결과로서 나타남)으로서 분류될 수 있다. 일반적으로 보편적인 부류는 확인할 수 있지만 대부분의 경우에 특이적인 항원은 알려져 있지 않다.

내인성 면역 복합체를 형성하는 가장 잘 알려진 예는 전신홍반성루푸스(루푸스, SLE)와 관련하여 생성되는 DNA 항DNA 복합체이다. 다른 중요한 내인성 항원 공급원으로는 면역 복합체 형성이 방종양성 증후군을 발생시킬 수 있는 악성종양을 포함한다.

다른 유형의 개체에 의한 감염은, 특히 만성 감염은 또한 GN을 유발시킬 수 있는 면역 복합체의 발생과 관련이 있다. 이러한 복합체를 생성할 수 있는 세균 및 곰팡이 감염으로는 연쇄상구균 속의 특정 균주에 의한 감염, 슈도모나스에 의한 감염, 파종 임균 감염, 나종성라, 아급성 세균 심내막염, 기관지폐 국균증, 2기 매독, 및 낭포성 섬유증 환자중의 만성 감염을 포함한다.

면역 복합체 침착이 주요 특징일 수 있는 바이러스 질환으로는 B형 간염 감염, 뎅그열, 전염성 단핵세포증, 및 아급성 경화성 범뇌염을 포함한다. GN은 또한 톡소플라스마증, 트리파노소마증, 및 주혈흡충증 뿐만 아니라 사일열 말라리아에 걸린 어린이에게서 관찰되는 GN과 같은 많은 기생충 감염증의 주요 특징이다.

의인성 항원은 특정 부류의 외인성 항원으로 구성된다. 그 예는 이종성 혈청 구성성분과 자가유래의 항체간에 면역 복합체를 형성시키는 원형의 면역 복합체 질환인 혈청병의 원인이 되는 것이다. 혈청병은 금세기초에 감염질환을 종종 이종의 항혈청으로 치료했을 때 일정하게 관찰되었다.

본질적으로 고전적인 혈청병과 구별할 수 없는 의인성 질환은 고용량의 항생제 치료법의 결과로서 나타날 수 있다. 이들 약물에 대한 혈청병-유사 면역반응의 증상으로는 GN을 포함하고, 이는 특정 약물, 특히, β-락탐 및 설폰아미드 항생제가 자가유래의 단백질에 자발적인 결합시 항체 반응을 유도할 수 있는 효과적인 합텐이라는 사실을 반영하는 것이다.

면역복합체 형성 및 침착에 영향을 미치는 인자:

항원 및 항체의 특징은 병리학적 면역 복합체 형성 및 잇따른 신장내 침착의 가능성을 결정한다. 이들중 주요 인자는 반응물의 절대농도와 각각의 상대적인 몰비율이다.

대부분의 항원들은 다수의 에피토프를 나타내고 일반적으로 다클론성 항체 반응을 자극한다. 모든 천연 발생적인 항체 분자는 이가 이상이다. 이러한 특성은 광대한 항원-항체 격자를 형성시키고, 그 크기는 주로 항체의 친화성과 항원 대 항체의 몰비율에 따라 결정된다.

일반적으로, 항체 반응은 항원이 항체에 비해 과량으로 존재하는 상태하에서 시작하며, 이러한 상대적인 비율은 항체 반응이 크게 증가함에 따라 변화한다. 초기에 형성된 복합체는 통상 작고 거의 병원성 활성을 나타내지 않는다. 이와 반해상당히 큰 복합체는 종종 항원의 양이 제한될 때, 항체가 과량이 되는 조건하에서 항체 반응의 과정중에 후기에 형성된다. 이러한 상당히 큰 복합체는 간중의 세망내피계에 의해 용이하게 제거되기 때문에 또한 비교적 비병원성이다.

GN을 유발할 수 있는 면역 복합체의 형성은 약간의 항원이 과량인 상태 또는 항원-항체 등량점 부근인 상태에서 일어나는 것으로 사료되며, 이때 격자 형성이 최대로 일어나고 격자 크기도 크지만, 매우 큰 것은 아니다.

면역 복합체가 침전되는 속도와 위치에는 여러 인자들이 영향을 미칠 수 있다. 항체 분자의 Fc 영역 사이의 상호작용은 면역 복합체의 급속한 침전을 촉진시킨다. 면역 복합체 침전에 있어서 Fc-Fc 상호작용의 역할은 Fc 영역을 함유하고 있지 않은 F(ab')2 항체 단편의 성질을 연구하므로써 설명된다. F(ab')2 단편의 결합가가 대부분의 전체 면역글로불린의 결합가와 다르지 않을지라도, F(ab')2 항체 단편은 격자를 더 느리게 형성시킨다.

항원의 전하는 면역 복합체 침전물이 침적되는 조직 편재화 부위를 결정하는데 역할을 한다. 실제 양성 전하를 지닌 복합체는 강한 음성 전하를 띤 기저막, 특히 신사구체에 우선적으로 유인된다.

항원의 편재화는 주로 기관 특이적인 면역 복합체 침착의 특정 증례를 나타낸다. 굿파스튜어 증후군(GN의 희귀 형태)과 같은 질환은 일반적으로 면역 복합체 질환으로 분류되지 않으며, 이는 이 복합체가 순환중에 예비형성되어 침착되기 보다는 오히려 신장중에 동일계내에서 형성되기 때문이다. 면역 복합체가 일단 형성되면, 연속적으로 나타나는 염증은 예형된 복합체의 침착에 따라 관찰되는 것과 거의 동일한 것으로 추정된다. 따라서, 이 증후군은 순환형 면역 복합체에 의해 유발되는 통상적인 GN과 상이한 침착 방식으로 구별할 수 있다.

혈류 및 혈관 구조의 특징이 또한 면역 복합체 침착물의 편재화를 결정하는데 중요하다. 이들중의 주요 요인은 모세관 투과성이다. 모세관의 내피는 천공되어 있기 때문에 신사구체가 면역 복합체 침착의 바람직한 부위이다. 면역 복합체 편재화를 증진시키는 혈류역학의 변수로는 혈류의 와류 및 증가된 혈압을 포함하고, 이 두가지는 신사구체에서 나타나는 것이다.

면역복합체 침착의 조절인자로서의 보체 및 보체 수용체:

보체 성분들의 선구염증 작용이외에도, 이 성분들은 또한 면역 복합체 침착을 저해할 수 있고 면역 복합체 침전물을 침착 부위로부터 재가용화시킬 수도 있다. 또한, C3b의 적혈구 수용체, 예컨대, CR1이 옵소닌화된 순환성 면역 복합체의 세망내피에 의한 제거에 중요한 것으로 알려져 있다.

특정 보체 성분이 결손된 환자중의 면역 복합체 질환의 임상적 패턴을 분석한 결과 복합체 침착을 억제하는데 있어서 상기 성분들의 정상적인 역할에 관한 정보를 알 수 있었다. Clq, Clr, Cls, C4, C2 또는 C3이 결손된 환자중의 면역 복합체 질환의 발생율은 60 내지 90%로 다양하고, 이 환자들중의 대부분은 루푸스-유사 증후군을 나타냈다. 면역 복합체 질환은 드물게는 후기-작용 경로 또는 대체 경로 성분들의 결손과 관련이 있다.

면역 복합체에 보체 성분들의 결합은 큰 항원-항체 격자의 형성을 방해하고 면역 침전을 저해한다. 이 과정은 정경로를 통한 활성화를 필요로 하며; 즉, Clq,C4 또는 C2가 결손된 혈청은 격자 형성과 복합체 침전을 효과적으로 저해하지 못한다. 정경로의 의존성은 면역 침전에 기여하는 IgG 분자들간의 Fc-Fc 상호작용을 방해하면서 C1 성분의 초기 결합을 반영할 것이다. 그 다음 복합체에 C3b가 공유 결합되고 이것은 면역 침전을 더욱 억제하여 이전에 침전되었던 복합체들도 가용화시킨다.

가용화 과정은 또한 대체 경로의 성분들의 활성화에 따라 달라진다. 결과적으로, 면역 복합체의 제거를 촉진시키고 염증 부위에 복합체 침착을 저해하므로써, 보체 성분 및 그 수용체는 질병의 진행을 지연시킬 수 있는 면역 복합체 질환의 음성 조절인자로서 작용한다.

본 발명은 보체 성분 C5의 활성을 차단하는 것과 관련이 있는 것이다. 이 성분의 표적화는 초기 보체 성분의 기능을 변화시키지 않으므로, 그 초기 성분들의 면역복합체 침착에 대한 음성 조절 효과를 약화시키지 않는다.

면역 복합체 매개 염증:

호염기구는 이들 세포에 의해 방출되는 혈소판-활성화 인자 및 히스타민과 같은 혈관작용성 아민의 작용에 의해 모세관 투과성이 크게 증가되므로, 면역 복합체 매개의 염증 반응을 개시하는데 중요하다. 혈관 투과성은 또한 혈소판-활성화 인자의 방출 및 미소혈전의 형성과 함께 염증 병변부에 있어서의 혈소판의 응집에 의해 촉진된다.

호염기구 탈과립화는 보체 C3a 및 C5a의 아나필라톡신 성분의 정교함 뿐만 아니라 IgE 항체의 효과를 반영하는 것이다.

호염기구 및 혈소판외에, 면역 복합체 매개 염증의 원발성 세포 작동자는 다형 핵백혈구, 단핵구, 및 대식세포이다.

IV. GN 병인론에 있어서 보체 역할에 대한 종래의 연구

GN 형성에 보체의 가능한 역할을 이해하고자 많은 연구를 수행하였다. 이러한 연구로는 특히 다음과 같은 다수의 동물 모델을 이용한 GN 연구를 포함한다. Unanue et al.,(1964); Cochrane et al., (1965); Kniker et al., (1965); Salant et al., (1980); Groggel et al.,(1983): Falk and Jennette (1986); Jennette et al.,(1987); Passwell et al., (1988); Schrijver et al.,(1988); Baker et al.,(1989); Schrijver et al.,(1990): Couser et al., (1991); 및 Couser et al., (1992).

이들 연구들은 보체가 GN 병인론에 역할을 함을 나타냈다. 그러나, 다양한 보체 성분들의 특이적인 명확한 역할을 규명되지 않았다. 특히, GN 병인론에 있어서의 종말 보체 성분들의 역할에 대한 C3 및 다른 아나필락톡신의 상대적인 역할이 명확하게 규명되지 않았다. 또한, 일부 연구가들은 보체의 고갈이 사구체 손상을 감소시키지 않는다고 보고하였다. 문헌[Kniker et al.,(1965)] 참조.

상기 연구중에서, 포크와 자네트(1986)의 연구는 보체 성분 C5의 결손을 초래하는 유전자 결함을 지닌 마우스내에 GN을 유도하기 위한 시도들을 실험한 결과를 보고한 것이다. 이 보고서는 C5 또는 이것에 의존적인 일부 종말 보체 성분이 GN의 병인론에 역할을 한다고 결론짓고 있다.

본 발명과 관련하여 중요한 것은, 포크와 자네트는 C5에 대한 항체가 GN을치료하는데 사용될 수 있다는 것을 개시하거나 암시한 바도 전혀 없다. 통상적으로 순환성 항체-항원 면역 복합체의 형성 및 침착과 관련이 있는 질환을 치료하는데 항체를 이용하는 것은 직관적으로 알 수 있는 것이 아니다. 솔직히, 순환성 면역 복합체에 의해 유발될 수 있는 문제를 해결하기 위한 마지막 방법은 보다 많은 순환성 면역 복합체를 창출하는 것으로 생각될 것이다. 그러나, 하기 제시되는 놀라운 결과들로 증명되는 바와 같이, 또다른 순환성 면역 복합체가 창출되면 그 작용 방식이 고유할지라도 항C5 항체가 GN을 효과적으로 차단하는 것으로 발견되었다.

베이커 등(1989), 쿠저 등(1991) 및 쿠저 등(1992)(이하에서는 집합적으로 "C6"연구라 지칭함)은 고농도의 항C6 다클론성 항체 제제를 래트에게 투여하여 래트 신장내의 동일계내에서 면역 복합체가 형성된다는 실험에 대해 기술하고 있다. 본 발명과 관련하여 중요한 것은, 항C6 항체 제제가 기존의 신장 질환을 지닌 동물에게 투여된 것이 아니라는 점, 즉 치료용 치료법에 사용되지 않았다는 점이다. 또한, C6 실험에 사용된 실험 프로토콜에는 순환성 면역 복합체를 포함하는 것이 아니라, 동일계내에서 형성된 복합체가 포함되어 있었다. 따라서, 이 실험들은 순환성 면역 복합체에 의해 유발되는 질환 상태를 치료하는 과정중에 보다많은 순환성 면역 복합체가 형성된다는 본 발명의 역직관적인 발견을 개시하거나 암시하지도 못했다.

또한, C6 연구에서 사용된 항C6 항체 투여량은 실제 의료용으로 사용하기에는 지나치게 높은 것이었다. 구체적으로, 이 항체들은 1 gm/kg의 투여량으로 사용되었는데, 이 투여량은 70 kg(155 lb) 개체에 대해 항체 70 gm을 투여하는 것에 상응하는 것이다. 이에 반해, 본 발명의 양태에서 사용된 항C5 항체는 0.1 mg/kg 이하의 농도로 사용되며, 이는 C6 연구에서 사용된 양보다 10배 이상 적은 양이다. 또한, 하기 제시되는 실시예를 통해 확인되는 바와 같이, 0.03 mg/kg 만큼 낮은 항C5 항체 투여량, 즉, C6 연구에서 사용한 양의 33배 이하의 양으로도 GN을 치료하는데 있어서 본 발명의 치료학적 효과를 수득할 수 있는 것으로 관찰되었다. 즉, 70kg 개체의 경우, 이 항체 농도는 단지 2.1 gm의 투여량에 상응하는 것이다.

심지어 본 발명의 신규한 항KSSKC 항체는 보다 낮은 투여량을 사용하여 GN 및 다른 염증 질환을 치료할 수 있다. 인체 혈액중에 있어서의 상기 항체들의 활성 정도에 따라, 상기 항체는 0.005 g/kg 이하의 투여량에서 완전한 보체 억제를 제공하고, 0.003 g/kg 이하의 투여량에서 치료적으로 유효한 보체 억제작용을 제공하는 것으로 예상되었다. 이러한 3mg/kg의 투여량은 항C5(베타 쇄 특이적인) mAb N19/8에 대한 실시예 4 및 5에 기술된 투여량의 1/10의 양이다. 본 발명의 총 길이의 항KSSKC mAb중 일부는 0.0022 g/kg 이하의 투여량에서도 치료학적 잇점을 제공할 것이다. 이는 실시예 9에서 기술되는 바지만, CPB 순환중의 인체 혈액에 항KSSKC 5G1.1 mAb를 사용하여 수득한 데이터로부터 계측되는 바와 같이 완전한 보체 억제반응을 제공할 수 있는 최소 투여량이다.

따라서, 바람직한 투여량은 0.005 g/kg 이하이고, 보다 바람직한 투여량은 0.003 g/kg 이하이며, 특히 바람직한 투여량은 0.0022 g/kg 이하이다. 70 kg 개체의 경우, 이 항체 투여량 농도는 바람직한 투여량의 최고량이 0.35g 미만, 보다 바람직한 투여량이 0.21g 미만, 가장 바람직한 투여량이 0.15 g 이하의 양에 상응하는 것이다.

물론, 1본쇄 및 본 발명의 기타 다른 재조합 mAb의 투여량은 각각의 활성수준(예컨대, 결합 친화성, C5 활성화를 차단하는 작용력, 및/또는 보체 용혈 활성을 차단하는 작용력), 결합가 및 분자량에 따라 조정될 수 있다. 예컨대, 실시예 11의 인체화된 scFv 항KSSKC mAb는 약 155 kDa 질량인 천연의 총 길이의 IgG 항체의 약 1/6인 약 27 kDa 이다. 이 항체들은 천연의 5G1.1 보다 보체 용혈 활성 및 C5a 생성을 3:1의 비율로 6배 크게 완전히 차단시킨다(하지만 항체-항원 결합 부위의 수와 관련하여 관찰해 보면 단지 3배 더 크다).

따라서, 천연 5G1.1의 단일 분자와 동일한 효과를 갖는 상기 scFv 각 분자들의 수는 차단을 완료하는 비율에 맞추기 위해서는 6배 증가시켜야만 한다. 그러나, 이 분자들의 질량이 천연 5G1.1 질량의 약 1/6 정도되므로, scFv 투여량은 천연 5G1.1 mAb 투여량과 동일한 범위가 된다.

투여량의 저하외에도, 본 발명을 실시(즉, GN의 치료)하는데 사용된 항C5 항체는 항C6 항체로 수득되지 않았던 중요한 치료학적 효과를 산출한다. 구체적으로, C6 연구에서 사용된 대조용 및 시험 동물들은 모두 세포과다 및 모세관 내강의 협소화를 나타냈다. 이와는 정반대로, 항C5 항체로 치료된 질환 개체들은 그러한 세포과다 및 모세관 내강의 협소화를 나타내지 않았다(도 1 참조).

더욱이, 본 발명에 사용된 항C5 항체는 사구체 확대를 감소시켜, 본 발명을 실시하는데 사용된 항C5 항체가 예상치 못했던 강력한 항염증 효과를 가짐을 명백히 나타내는 것이다. C6 연구에서는 이러한 항염증 효과에 대하여 개시된 바나 암시된 바도 전혀 없다.

V. 보체 용혈 활성을 차단하고 C5a의 생성을 차단하는 항C5 단클론 항체

보체 용혈 활성을 차단하고 C5a의 생성을 차단하는 바람직한 작용을 갖는 항C5mAb(따라서, 본 발명에 따라 GN 및 다른 염증 질환을 치료하는데 사용하기에 바람직함)는 적어도 1982년 이래로 당 기술분야에 공지되어왔다(Moongkarndi et al. Immunobiol 1982, 162:397; Moongkarndi et al. Immunobiol 1983, 165:323). C5 또는 C5 단편에 대해 면역반응성인 당기술분야에 공지된 항체로는 C5 베타쇄에 대한 항체(Moongkarndi et al. Immunobiol 1982, 162:397; Moongkarndi et al. Immunobiol 1983, 165:323; Wurzner et al., 1991, 상기 문헌 참조; mollnes et al. Scand, J. Immunol. 1988, 28:307-312); C5a(예컨대, Ames et al. J.Immunol 1994, 152:4572-4581, 미국 특허 제 4,686,100호 및 유럽 특허 공개 번호 0,411,306호); 및 비인체 C5에 대한 항체(예컨대, Giclas et al. J. Immunol.Meth. 1987, 105:201-209 참조)를 포함한다. 중요한 것은, 이러한 항C5 mAb들이 본 발명의 신규한 항C5 mAb의 특성과 같은 특성을 갖는 것이 없고, 즉, C5 절단 생성물인 C5a를 제외한 C5 알파쇄에는 결합하지 않으며, 동일한 항체 농도에서 보체 용혈 활성 및 C5a의 생성을 본질적으로 동일한 정도로 거의 차단하는 특성을 갖고 있는 것이 없었다. 특히, 상기 문헌중 하나인 우르쯔너 등(1991)에 의해 제조된 N19/8 항체의 scFv 유도체는 천연 N19/8 항체보다 C5a 생성에 대한 차단 활성이 50% 미만이었다(실시예 15 참조). 이러한 결과는 C5a 생성에 대해 거의 완전한 억제활성을 갖고 있는 5G1.1 scFv와 대조적인 것이었다(실시예 12 참조).

이러한 차이를 특정 이론으로 규정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 항체들이 특이적인 결합 특성을 갖고 있기 때문인 것으로 사료된다. 따라서, C5의 알파쇄 내의 부위에 결합하지 않는 항체, 및 C5 절단 생성물인 C5a(유리 C5a)에 결합하는 항체는 보체 용혈 활성 및 C5a의 생성을 동일한 항체 농도에서 본질적으로 동일한 정도로 거의 차단하는 특성이 부족한 것으로 추정된다.

바람직한 양태의 상세한 설명

전술한 바와 같이, 본 발명은 GN 및 기타 다른 질환을 겪는 환자를 치료하는데 항C5 항체를 사용하는 방법 및 특이적인 C5 항체 및 항체 제제에 관한 것이다. 바람직하게는, 그리고 GN을 치료하는데 사용될 때, 항C5 항체는 환자 혈액내에 존재하는 보체의 세포-용해 활성을 본질적으로 감소(예컨대, 약 50% 이상 감소)시키는데 효과적인 양으로 사용한다("환자 혈액내에 존재하는 보체의 세포-용해 활성"이란 표현은 또한 본원에서 "환자 혈액의 혈청 보체 활성"이라고도 나타냄). 환자 혈액내에 존재하는 보체의 세포-용해 활성의 감소는 예컨대, "세포 용해 분석"이라는 표제하에 하기 기술되는 병아리 적혈구 용혈법과 같이 당 기술분야에 공지된 방법으로 측정할 수 있다.

바람직한 감소율을 수득하기 위해, 항C5 항체는 다수의 단위 투여량 형태로 투여할 수 있다. 이 투여량은 특정 항체에 따라 다를 것이다. 예컨대, 상이한 항체들은 상이한 질량 및/또는 친화성을 가질 것이고, 따라서 상이한 단위 투여량을 필요로 한다, Fab' 단편으로서 제조된 항체는 또한 이 단편이 천연의 면역글로불린보다 질량이 훨씬 작고, 따라서 환자 혈액중에 동일한 몰량을 수득하는데 보다 낮은투여량을 필요로 하므로 등가의 천연 면역글로불린과는 상이한 투여량을 필요로 할 것이다.

이 투여량은 또한 투여 방식, 치료되는 환자의 특정 증상, 환자의 전반적인 건강, 상태, 크기 및 연령과 처치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 인체에 대한 항체의 투여량은 일반적으로 처치시 각 환자마다 약 1mg/kg 내지 약 100mg/kg 사이, 바람직하게는 처치시 각 환자마다 약 5mg/kg 내지 약 50mg/kg 사이이다. 혈장 농도로 나타내면, 항체 농도는 약 25㎍/ml 내지 약 500㎍/ml 사이인 것이 바람직하다.

처치의의 판단을 필요로 하는 일반적인 치료학적 요법에는 BUN량, 단백뇨 량 등과 같은 임상적 종점을 모니터하면서 투여하는 것이 일반적인 일련의 투여량을 포함하며, 이 투여량은 바람직한 임상 결과를 수득하는데 필요한 것으로 조정된 양이다. 또한, 환자 혈액내에 허용되는 혈청 보체 활성의 농도는 하기 표제 "세포 용해 분석" 하에 기술된 기법을 사용하여 모니터하므로써 항체의 추가 투여량이 필요한 지 또는 보다 높거나 낮은 투여량이 필요한지를 결정하고, 이러한 투여량은 혈청 보체 활성을 약 50% 이상의 감소, 바람직하게는 약 95% 이상의 감소를 유지하는데 필요로 되는 투여량이다. 처치의의 결정에 따라 필요하다면 다른 프로토콜을 사용할 수도 있다.

항C5 항체의 투여는 일반적으로 혈관내 경로, 예컨대, 주사에 의한 정맥내 주입을 통해 실시될 수 있다. 다른 투여 경로도 필요하다면 사용될 수 있다. 주입용으로 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 펜실베니아 필라델피아 소재, 17판(1985)]에 기술된 바에 따라 제조한다. 이러한 제제는 멸균성이며 발열물질도 없어야 하고, 일반적으로 식염수, 완충(예, 인산염 완충) 식염수, 항크스액, 링거액, 덱스트로스/식염수, 글루코스 용액등과 같은 약학적 허용 담체를 포함한다. 또한, 이 제제는 필요한 경우, 긴장도 조정제, 습윤화제, 살균제, 보존제, 안정화제 등과 같은 약학적 허용성 보조 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 제제는 충전 물질과 항C5 항체를 함유하는 제조 물품으로서 보급할 수 있다. GN 치료용으로 제조하는 경우, 충전 물질은 그 제제가 신장 질환 치료용, 특히 신염 또는 사구체신염 치료용임을 나타내는 표식을 포함할 수 있다.

항C5 항체는 단클론 항체인 것이 바람직하지만, 필요하다면 통상적인 기법으로 제조되고 선별되는 다클론 항체를 사용할 수도 있다. 전술한 바와 같이, 항C5 항체는 인체 혈액내에 존재하는 보체의 세포-용해 활성을 감소시키는데 효과적이어야만 한다. 또한 전술한 바와 같이, 이러한 특성의 항체는 예컨대, 하기 "세포 용해 분석"이라는 표제하에 기술되는 병아리 적혈구 용혈 반응법과 같은 당 기술분야에 공지된 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명을 실시하는데 사용되는 항C5 항체는 C5 또는 그 단편, 즉 C5a 또는 C5b에 결합한다. 항C5 항체는 정제된 인간 보체 성분 C5의 베타 쇄상에 존재하는 에피토프에 대해 면역반응성이고, C5가 C5 전환효소에 의해 C5a 및 C5b로 전환되는 것을 차단할 수 있어 바람직하다. 이러한 특성은 우르쯔너 등(Complement Inflamm 8:328-340, 1991)에 의해 기술된 기법을 사용하여 측정할 수 있다. 이 항C5 항체는 환자 혈액내에 유효한 C5 전환효소 활성을 약 50% 이상 감소시키는데 유용한 양으로 GN을 치료하는데 사용하는 것이 바람직하다.

특히 바람직한 본 발명의 양태에 있어서, 항C5 항체는 베타쇄상에 존재하는 에피토프에 대해서는 면역반응성이 아니고, 정제된 인간 보체 성분 C5의 알파쇄 중에 존재하는 에피토프에 대해서 면역반응성이다. 이러한 양태에서 또한, 항체는 C5가 C5 전환효소에 의해 C5a 및 C5b로 전환되는 반응을 차단시킬 수 있다. 이 양태의 특히 바람직한 실시예에 있어서, 항체는 이러한 차단 활성을 용혈 활성을 차단하는데 필요한 농도와 동일한 농도로 사용할 경우 나타낼 수 있다.

알파쇄중에서도 아미노-말단 영역에 결합하는 것이 가장 바람직한 항체이지만, 이 항체는 유리 C5a에는 결합하지 않는다. 알파쇄내에서 상기 항체들에게 특히 바람직한 표적으로는 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 5G200aa 펩타이드 또는 KSSKC 에피토프를 포함한다. 본 발명의 영역에는 또한 본 발명의 항체를 생산하는 리간드를 선별하고 면역원으로서 유용한 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 5G200aa 펩타이드 또는 KSSKC 에피토프를 포함한다.

보체 성분 C5와 반응성인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 심스 등의 미국 특허 제 5,135,916 호에 기술된 바에 따라 수득할 수 있다. 본원에 기술된 바와같이, 항체는 면역원으로서 보체막 공격 복합체의 정제 성분을 사용하여 제조한다. 본 발명에 따라, 보체 성분 C5 또는 C5b는 면역원으로서 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 면역원은 C5의 알파쇄이다. 알파쇄중, 가장 바람직한 면역원으로는 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 또는 5G200aa 펩타이드를 포함한다. 이 보다 덜 바람직한 면역원은 KSSKC 에피토프이다.

본 발명에 따라서, 본 발명의 항체는 모두 필요한 특정의 기능적 특성을 갖고 있다. 그 예는 보체 용혈 활성을 본질적으로 억제하고 C5a를 생산하는 C5의 전환반응을 본질적으로 억제하는 특성이다. 필수적인 것은 아니지만, 이 특성은 사용된 항체 대 항원(C5)의 몰비가 3:1 이하일 때 나타나는 것이 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 항체는 5G1.1 항체이다(ATCC 기탁번호 HB-11625호서 5G1.1 하이브리도마에 의해 생산되는 5G1.1). 본 발명의 다른 특히 바람직한 항체는 상기 문단에서 기술한 필요로 되는 기능적 특성을 갖고 있고, 다음과 같은 특성중 어느 하나의 특성을 갖는 것이다:

(1) 5G1.1와 특이적으로 면역반응성인 C5부, 즉 C5 알파쇄, 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 5G200aa 펩타이드 또는 KSSKC 에피토프에 결합하기 위해 5G1.1과 경쟁하는 특성; 및

(2) C5 알파쇄, 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 5G200aa 펩타이드, 및/또는 KSSKC 에피토프에 특이적으로 결합하는 특성. 이러한 특이적인 결합 및 결합 경쟁성은 플라스몬 표면 레조넌스 법(Johne et al., J.Immunol.Meth. 1993, 160:191-198)을 비롯한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

(3) C3 또는 C4(C5 전환효소의 성분임)중 어느 하나에 C5가 결합하는 것을 차단하는 특성.

또한, 본 발명에 따르면, 항체가 바람직하게는 C5a 및 C5b를 형성하기 위해 C5를 절단하는 것을 차단하여, C5a와 관련된 아나필라톡신 활성 생성 및 C5b와 결합하는 막 공격 복합체의 조합을 차단해야만 한다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 상기 항C5 항체는 C3 전환효소에 의한 보체 성분 C3의 활성화와 관련된 옵소닌 기능을 손상시키지 않을 것이다. 혈장 C3 전환효소 활성은 하기 "조직학"이라는 표제하에 기술된 바와같이 C3a의 존재에 대해 혈장을 분석하므로써 측정할 수 있다. 항C5 항체는 혈장 C3a 농도를 거의 감소시키지 않아 바람직하다.

동물의 면역화(이 경우, C5 또는 C5b 또는 다른 바람직한 면역원 사용), 다클론 항체 또는 항체 생산 세포의 분리, 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위한 상기 세포와 무한증식성 세포(예, 골수종 세포)의 융합, 바람직한 항원(이 경우, C5 또는 C5b 또는 다른 바람직한 면역원)과 분비된 단클론 항체의 반응성에 대한 하이브리도마 상청액의 선별법, 하이브리도마 상청액 또는 복수액중에 존재하는 상기 항체들의 정량 및 상기 단클론 항체의 정제 및 저장에 대한 일반적인 방법들은 많은 문헌들에 공개되어 있다. 그 예는 다음과 같다: Coligan et al., eds. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell and Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991; Montz, et al., Cellular Immunol, 127:337-351, 1990; Wurzner, et al., Complement Inflamm, 8:328-340, 1991; 및 Mollnes et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312, 1988.

본원에 사용된 바와 같은 "항체"라는 용어는 생체내에서 생성된 면역글로불린 뿐만 아니라, 하이브리도마에 의해 시험관내에서 생성된 면역글로불린, 및 이러한 면역글로불린의 항원 결합 단편(예컨대, Fab' 제조물), 뿐만 아니라 재조합적으로 발현된 항원 결합 단백질, 예컨대, 면역글로불린, 키메라성 면역글로불린, "인체화된" 면역글로불린, 이러한 면역글로불린의 항원 결합 단편, 1본쇄 항체 및 기타 다른 면역글로불린으로부터 유래되는 항원 결합 도메인을 함유하는 재조합 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 또한 면역글로불린 항원 결합 도메인의 서열로부터 유래되는 서열을 포함하는 항원 결합 합성 펩타이드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 mAb"란 용어는 재조합적으로 발현된 항원 결합 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항체-항원 결합 부위"라는 용어는 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 항체의 항원 결합 부위를 의미한다.

아미노산 서열이 절두(예컨대, scFv 또는 Fab를 생성함) 또는 변이(예컨대, 접목되어 키메라 항체를 형성하거나 인체화됨)된 바 없는 완전한 길이의 면역글로불린 서열인 항체를 본원에서는 "천연" 항체로 명명한다. 바로 상기에 기술한 문헌외에도 이러한 항체를 제조하는 방법을 기술하고 있는 문헌은 다음과 같다: Reichmann et al., Nature, 332:323-327, 1988; Winter and Milstein, Nature, 349:293-299, 1991; Clackson, et al., Nature, 352:624-628, 1991; Morrison, Annu Rev Immunol, 10:239-265, 1992; Haber, Immunol Rev, 130:189-212, 1992; 및 Rodrigues, et al., J. Immunol, 151:6954-6961, 1993.

본 발명의 방법에 따른 GN의 치료법은 다클론 항체 또는 단클론 항체를 사용하여 수행할 수 있지만, 단일특이성 항체가 바람직하다. 본원에 사용된 "단일특이성 항체"라는 용어는 특정 항원의 특이적인 영역에 결합하는 항체를 의미하는 것이다. 모든 단클론 항체는 단일특이성이지만, 다클론 항체는 일반적으로 단일특이성이 아니다.

그러나, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 단일특이성 다클론 항체를 다양한 방법으로 제조할 수도 있다. 예컨대, 펩타이드(예, 올리고펩타이드-본원에서는 5 내지 200개의 아미노산으로 구성된 중합체를 의미함)는 면역원으로서 사용될 수 있다. 단일특이성 다클론 항체를 제조하는데 사용할 수 있는 다른 방법은 다클론 항체 혼합물로부터 단일특이성 항체 군을 분리하는 항원 친화성 정제법을 사용하는 것이다. 본 발명에 따르면, 펩타이드는 단일특이성 다클론 항KSSKC 항체를 생산하는데 있어서 면역원으로서, 그리고 그 항체를 정제하는데 있어서 친화성 리간드로서 바람직하다.

본 발명의 천연(즉, 조작되지 않음) 단클론 항체는 선별 리간드(들)로서 5G46k 단편, 5G27k 단편, 5G325aa 펩타이드, 5G200aa 펩타이드 및/또는 KSSKC 펩타이드(예, 실시예 13에 기술되는 바와 같이 폴리프로필렌 막상에 고정화시킴)를 사용하여 통상적인 방법으로 바람직하게 제조할 수 있다. 이 방법은 하이브리도마 상청액이 각 선별 리간드에 결합하는 시험을 포함한다.

바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 천연 mAb는 인체 C5의 알파 쇄 또는 이의 단편을 면역원으로서 사용하여 제조한다. 이러한 목적에 바람직한 인체 C5의 알파쇄의 단편으로는 5G46k 단편, 5G27k 단편, 및/또는 5G200aa 단편을 포함한다.보다 바람직하지 않지만, KSSKC 펩타이드도 또한 면역원으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 신규 항체 범위내에 속하는 항체를 제조하는데 사용할 수 있는 또다른 면역원(보다 바람직하지 않지만) 및 선별 리간드는 "절단 부위 펩타이드", 즉, 실시예 13에 기술된 바와 같은 서열 번호 2의 아미노산 725 내지 754까지의 펩타이드(C5a 절단 부위)이다.

본 발명의 또다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 천연 mAb는 인간의 면역글로불린을 발현하는 돌연변이 마우스내에서 제조된다(예컨대, Green et al., Nature Genet. 1994, 7:13-21 참조). 이 경우, 다른 천연 mAb의 제조 방법에서 기술한 바와같은 동일한 바람직한 면역원 및 선별 리간드를 사용한다.

본 발명의 또다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 재조합 mAb는 재조합 mAb-암호 폴리뉴클레오티드(바람직하게는 인간 재조합 mAb를 암호하는 것)를 발현하는 파아지형 라이브러리를 선별하므로써 제조된다. 예컨대, 문헌[Ames et al., 1994, 상기 문헌 참조; Smith and Scott, Meth,Enzymol. 1993, 217:228; Kay et al., 1993, 128;59-65]을 참조하라. 이 선별방법은 천연 mAb를 제조하기 위한 전술한 선별 리간드를 사용하여 실시한다. 본 발명의 재조합 mAb는 재조합 mAb-암호 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현벡터에 서브클로닝하고, 이를 적합한 숙주(하기 기술됨)내에서 발현시켜, 재조합 mAb를 분리하므로써 제조된다.

본 발명은 본 발명의 합성, 게놈 또는 cDNA 유래의 핵산 단편, 즉 본 발명의 mAb를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 그 다음 본 발명의 임의의 mAb를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터, 즉,삽입된 단백질-암호 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자를 함유하는 벡터에 삽입할 수 있다. 또한, 필수적인 전사 및 해독 시그널을 천연 또는 공급 유전자 및/또는 그 인접 영역으로 공급할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 발현하는데에는 다양한 숙주 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 그 예로는 재조합 바이러스(예, 종두 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스등)로 감염된 포유류 세포계; 재조합 플라스미드로 형질감염된 포유류 세포계; 재조합 바이러스(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포계; 효모 발현 벡터를 함유하는 효모 또는 재조합 박테리오파지 DNA, 재조합 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균과 같은 미생물을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다(예컨대, Goeddel, 1990 참조).

세균용으로 유용한 발현 벡터는 공지의 클로닝 벡터 pBR322(미국 모식균 수집 배양소, "ATCC", 미국, 매릴랜드 20852, 록크빌, 파크랜드 드라이브 12301 소재; ATCC 수탁번호 37017호)의 유전 인자를 함유하는 시판용 플라스미드로부터 유래되는 선택성 표지인자 및 세균 복제 기원을 포함할 수 있다. 이 pBR322의 "골격 구역", 또는 기능적 등가의 서열을 적절한 프로모터와 발현될 구조 유전자와 결합시킨다. 재조합 미생물 발현 벡터에 일반적으로 사용되는 프로모터로는 락토스 프로모터계(Chang et al., Nature 275:615), 트립토판(trp) 프로모터(Goeddel et al., 1980, Gene Expression Technology, 185권, Academic Press, Inc., 캘리포니아 산디에고 소재) 및 tac 프로모터, 또는 trc 프로모터라고 명명되는 tac과 trp 프로모터간의 융합체(Maniatis, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕 콜드스프링 하버 소재)를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 프로모터로는 T7 RNA 폴리머라제의 숙주 세포 발현에 사용되는 T7 프로모터(Studier et al. 1990, Meth, Enzymol, 185:60-89), 및 하기 기술되는 바와 같이 여러 시판용 벡터중에서 관찰되는 trc 프로모터를 포함한다.

바람직한 세균 발현용 벡터로는 pET 벡터(Studier et al. 1990, 상기 문헌 참조) 및 Trc 벡터를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 많은 pET 벡터들은 스트라타진 클로닝 시스템스(캘리포니아 라졸라 소재)에서 시판된다. 특히 바람직한 벡터는 하기 기술되는 pET Trc SO5/NI 벡터(서열 번호 18)이다. Trc 벡터, pTrc 99A는 파마시아로부터 입수용이하다. 다른 Trc 벡터로는 pSE 벡터를 포함한다(Invitrogen, 캘리포니아 산디에고 소재).

재조합 mAb의 발현에 바람직한 세균으로는 바실러스 서브틸리스 및 가장 바람직하게는 에스케리히아 콜리이다. 이.콜리의 특히 바람직한 균주는 W3110(ATCC 기탁번호 27325) 균주이다. 임의의 특정 조건하에서, 예컨대, 세균 조작이 실시되는 실험실에 오염성 박테리오파지("파지")가 존재할 때에는 W3110의 유도체 균주를 제조하는데 표준 세균 유전학 방법을 사용하는 것이 필요로 될 것이다. 일반적으로, 특히 본 발명의 재조합 항KSSKC mAb를 다량 제조하는 경우에는 비변형된 W3110이나, 또다른 완전한 특성을 갖고 있는 균주를 사용하는 것이 바람직하다.

파지 오염이 문제가 되고 멸균 조작이 실시될 수 없거나 바람직하지 않은 경우, 파지 오염물을 규명한 다음, 그 파지에 내성이 있는 세균을 제공하는 공지의돌연변이를 지닌 완전한 특성을 갖고 있는 세균 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 그 돌연변이는 파지 수용체에 대한 널(null) 돌연변이체인 것이 바람직하다. 그러나, 일부 경우에 비교적 특성이 규명되지 않은 파지-내성의 유도체 균주를 제생성하여 사용하는 것도 허용되며, 특히 소규모 실험용 연구에 적합하다. 이러한 유도체 균주가 필요한 경우에는 하기 실시예 11에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다.

대부분의 경우에는 변형되지 않은 W3110 이나 또다른 완전한 특성을 지닌 세균 균주가 일반적으로 바람직하다. 이러한 경우는 특히 본 발명의 재조합 항KSSKC mAb를 함유하는 약제를 제조할 때이다. 이는 약제 성분을 제조하는 경우 특성이 규명되지 않거나 부분 규명된 돌연변이를 함유하는 세균 균주를 사용할 때 나타날 수 있는 당 기술분야에 공지된 문제점들 때문이다.

본 발명의 재조합 mAb는 또한 진균류 숙주, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에와 같은 사카로마이세스 속의 효모중에서 발현시킬 수 있다. 또한 기타 다른 아스퍼질러스, 피키아 또는 클루이베로마이세스와 같은 속의 진균류들을 사용할 수도 있다. 진균용 벡터는 일반적으로 2㎛ 효모 플라스미드 또는 또다른 자율증식성 복제 서열(ARS) 유래의 복제 기원, 프로모터, 본 발명의 mAb를 암호하는 DNA, 폴리아데닐화 및 전사 종결 유도성 서열, 및 선택가능성 표지 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 진균용 벡터는 이.콜리 및 진균류 양자를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 복제 기원 및 선택가능한 표지인자를 포함한다.

진균류에 적합한 프로모터계로는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제, 또는 에놀라제, 헥소키나제, 피로베이트 키나제, 글루코키나제와 같은 기타다른 해당작용성 효소의 프로모터, 글루코스-억제성 알콜 데히드로게나제 프로모터(ADH2), 알콜 데히드로게나제 유전자 유래의 구성형 프로모터, ADH1 등을 포함한다. 예컨대, 문헌[Schena et al., 1991 Meth. Enzymol. 194:389-398]을 참조하라. 또한, 진균류의 성장 배지내로 가용성 재조합 mAb의 분비를 촉진시키기 위해 진균류 벡터에 효모 알파-인자 또는 효모 전화효소의 분비를 유도하는 것과 같은 분비 시그널을 병입시킬 수 있다. 예컨대, 문헌[Moir et al. 1991, Meth, Enzymol. 194:491-507]을 참조하라.

바람직한 진균용 발현 벡터는 세균내에서 선별 및 복제하기 위한 pBR322 유래의 DNA 서열 및 벡터 pAAH5에서 발견되는 바와 같은 ADH1 프로모터 및 알콜 데히드로게나제 ADH1 종지 서열을 함유하는 진균류 DNA 서열을 사용하여 조합할 수 있다(Ammerer, 1983, Meth. Enzymol. 101:192). ADH1 프로모터는 ADH1 mRNA가 총 폴리(A) RNA의 1 내지 2%인 것으로 추정되는 효모중에 효과적이다.

재조합 mAb를 발현시키는데에는 다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양제가 사용될 수 있다. 곤충 세포중에서 이종 단백질을 생산하는데 적합한 바큘로바이러스계는 문헌[Luckow, et al., 1988]에 고찰되어 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 기원의 COS 세포, 마우스 L 세포, 뮤린 C127 포유류 상피 세포, 마우스 Balb/3T3 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 인체 293 EBNA 및 HeLa 세포, 골수종, 및 어린 햄스터 신장(BHK) 세포를 포함하고, 특히 골수종 세포, CHO 세포, 및 인체 293 EBNA 세포가 바람직하다.

포유류 발현 벡터는 복제 기원, 발현될 재조합 mAb 유전자에 결합된 적합한프로모터 및 증강인자, 및 리보솜 결합부위, 폴리아데닐화 서열, 접목 공여 및 수용 부위 및 전사 종지 서열 등의 다른 5' 또는 3' 인접 서열과 같은 비해독 인자를 포함할 수 있다.

척추동물 세포를 형질전환시키는데 사용되는 포유류 발현 벡터계내의 전사 및 해독 조절 서열은 바이러스원으로부터 제공될 수 있다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터 및 증강인자는 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 시토메가로바이러스 즉시형-초기 유전자 1 프로모터 및 증강인자(CMV)를 포함하는 인체 시토메가로바이러스로부터 유래되는 것이다.

재조합 항KSSKC mAb를 발현시키는데 특히 바람직한 진핵세포용 벡터는 pAPEX-1(서열번호 3), 및 보다 바람직하게는 pAPEX-3p(서열번호 4)이다. 벡터 pAPEX-1은 단백질 발현율을 증가시키기 위해 변형시킨 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)의 유도체이다. 먼저, 3'-비해독성 SV40 소-t 항원 인트론을 이 인트론이 상류 암호 영역에 이상 접목하기 쉬우므로 601개 염기쌍의 XbaI/HpaI 단편을 결실시키므로써 제거했다(Evans and Scarpulla, 1989, Gene 84:135; Huang and Gorman, 1990, Molec. Cell Biol. 10:1805). 그 다음, 484개 염기쌍의 NdeI-NotI 단편을 벡터 pRc/CMV7SB로부터의 상응하는 845개 염기쌍 NdeI-NotI 단편으로 대체시켜 키메라성 아데노바이러스-면역글로불린 하이브리드 인트론을 5'-비해독성 영역내로 유입시켰다(Sato et al. 1994, J.Biol.Chem. 269:17267). 마지막으로, 이.콜리로부터의 플라스미드 DNA 수율을 증가시키기 위해, 산출되는 CMV 프로모터 발현 카세트를 벡터 pGEM-4Z(프로메가 코오포레이션, 위스콘신 매디슨 소재)내로 셔틀주입시켰다.

벡터 pAPEX-3은 벡터 pDR2(클론테크 레보레이토리즈, 인코오포레이티드, 캘리포니아 팔로알토 소재)중의 2.4kb ClaI/AccI 단편을 먼저 절단시켜 EBNA 유전자를 제거한 상기 벡터의 유도체이다. 그 다음, pDR2의 450bP의 MluI/BamHI 단편을 벡터 pAPEX-1로부터의 1.0kb MIuI/BamHI 단편으로 대체시켜, RSV 프로모터를 CMV 프로모터 및 아데노바이러스/면역글로불린 키메라성 인트론으로 대체시켰다. pAPEX-3P를 작제하기 위해, pAPEX-3으로부터 HSV tk 프로모터 및 히그로마이신 포스포트란스퍼라제(hyg) 유전자를 함유하는 1.7kb BstBI/SwaI 단편을 제거하고 SV40 초기 프로모터 및 퓨로마이신 아세틸트란스퍼라제(pac) 유전자를 함유하는 1.1kb SnaBI/NheI 단편(Morgenstern and Land, 1990, Nucleic Acids Res. 18:3587-3596) + 벡터 pAPEX-1으로부터의 SV40 폴리아데닐화 시그널을 함유하는 137bp XbaI/ClaI 단편으로 대체시켰다.

pAPEX 벡터내의 재조합 mAb-암호 삽입체를 발현시키는데 특히 바람직한 숙주세포는 인체 293 EBNA 세포주이다(인비트로겐, 캘리포니아 산디에고 소재).

재조합 mAb를 발현시키는데 바람직한 또다른 진핵세포용 벡터는 pcDNAI/Amp(인비트로겐 코오포레이션, 캘리포니아 산디에고 소재)이다. pcDNAI/Amp 발현 벡터는 인간 시토메가로바이러스 즉시-초기형 유전자 I 프로모터 및 증강인자, 시미안 바이러스 40(SV40) 콘센서스 인트론 공여체 및 수용체 접목 서열 및 SV40 콘센서스 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 이 벡터는 또한 SV40 대 T 항원으로 형질전환된 세포(예, COS 세포, MOP8 세포등)내에서 에피솜형 증폭을 허용하는 SV40의 복제 기원 및 세균 숙주내에서 전파 및 선별할 수 있는 암피실린 내성 유전자를 함유한다.

정제된 재조합 mAb는 본 발명의 핵산 분자의 재조합 mAb 해독 생성물을 발현하는 적합한 숙주/벡터계를 배양하고, 그다음 이 숙주계, 예컨대 세균, 곤충 세포, 진균류, 또는 포유류 세포의 배양액 또는 세포 추출물로부터 정제하여 제조한다. 분비형 생성물로서 히스티딘 tag 서열(5개 이상의 히스티딘 잔기의 스트레치를 함유하는 서열)을 함유하는 재조합 mAb 단백질을 발현하는 진균류 또는 포유류 세포의 발효 배양은 정제 단계를 매우 간료화시킨다. 이러한 히스티딘 tag 서열은 특정 조건하에서 니켈과 같은 금속에 결합할 수 있도록 하여, 니켈(또는 다른 금속) 정제용 칼럼을 이용할 수 있다. 재조합 mAb는 또한 단백질 G 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다(Proudfoot et al., 1992, Protein Express, Purif. 3:368).

하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 충분하게 설명하려고 하며, 이는 제한하고자 하는 것이 아니다. 각 실시예에 공통적인 방법 및 재료는 다음과 같다.

재료 및 방법

마우스에서의 GN의 유도

평균 약 25g 이고 4개월령의 암컷 B10.D2/nSnJ 마우스를 잭슨 레보레이토리즈(메인주 바 하버 소재)로부터 수득했다. 이 마우스에게 PBS로 HAF의 식염수 용액(시그마 케미칼 컴패니 카탈로그 번호 A-3641)을 희석하여 제조한, 말 아포페리틴(HAF)40mg/ml 용액을 매일 0.1ml씩(1주에 6일) 주입했다.

항C5 단클론 항체

마우스의 보체 성분 C5에 결합하는 단클론 항체는 표준 방법을 사용하여 국립의학연구소(영국, 런던 밀 힐 소재)의 브리지타 스톡잉거 박사에게서 입수한 하이브리도마 BB5.1(Frei et al, 1987)의 배양물 상청액으로부터 IgG 분획으로서 제조했다.

조직학

신장은 표준 조직화학적 염색법 및 면역형광성 기법을 사용하여 현미경 분석하였다. 5μ 파라핀 절편의 과요오스산 시프(PAS) 염색은 HARLECO PAS 조직화학적 반응세트(EM Diagnotic Systems, 뉴저지 깁스타운 소재, 번호 64945/93)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 표준방법으로 실시했다.

5μ 냉각기 절편의 면역형광성 염색은 뮤린 보체 성분 C3 검출용의 FITC 결합된 양 항마우스 C3(Biodesign International, 메인주 케네벙크 소재, 카탈로그 번호 W90280F)를 사용하거나, 또는 면역 복합체 검출용의 FITC 결합된 염소 항마우스 IgG, IgA 및 IgM(Zymed Laboratories, 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재, 카탈로그 번호 65-6411)을 사용하여 표준 방법으로 실시하였다.

요 검사

요 샘플을 CHEMSTRIP 2GP 계측봉(Boehringer Mannheim Diagnostics, 인디아나 인디아나폴리스 소재, 카탈로그 번호 200743))상에 점적하여 단백질 및 글루코스 양을 측정했다. 이 봉의 검출 영역들은 단백질 또는 글루코스를 함유하는 요에 노출되었을 때 색의 변화를 일으킨다; 색 변화의 부족은 검출가능한 단백질이나 글루코스가 없음을 나타내는 것이다. 시험 요중의 분석물의 농도는 제조자에 의해 공급된 색대조표와 변화된 색을 비교하여 판독한다. 요 단백질 색대조표는 미량, 30, 100 및 500 mg/dL에 상응하는 색을 나타내고 있다.

세포 용해 분석

혈액내에 존재하는 보체의 세포-용해 작용력은 다음과 같이 수행되는 용혈 분석법을 사용하여 측정할 수 있다: 병아리 적혈구를 GVBS(Rollins et al., J.Immunol 144:3478-3483, 1990, 시그마 케미컬 컴패니, 미주리 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 G-6514)로 잘 세정한 뒤 GVBS중에 2 x 108/mL로 재현탁시켰다. 이 세포에 항병아리 적혈구 항체(항병아리-RBC 항혈청의 IgG 분획, Intercell Technologies, 뉴저지 호프웰 소재)를 최종 농도 25㎍/mL로 첨가하고 이 세포를 23℃에서 15분동안 항온처리했다. 이 세포를 GVBS로 2회 세정하고 5 x 106 세포를 GVBS 30㎕중에 재현탁시켰다. 그 다음 여기에 혈청 시험 용액 10㎕를 첨가하여 최종 반응 혼합물 용액 130㎕로 만들었다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 분석에서 혈청% 및/또는 혈청 유입량이란 혈청 시험 용액 100㎕ 용량중에 존재하는 혈청의 %를 나타내는 것이다.

마우스 혈청 활성 분석에 있어서, 혈청 시험 용액 100㎕ 용량은 희석(GVBS)된 마우스 혈청 50㎕ 및 인체 C5 결손 혈청(Quidel Corporation, 캘리포니아 산디에고 소재) 50㎕를 함유한다. 인체 혈청 활성 분석에 있어서, 혈청 시험 용액은 100% 이하의 인체 혈장 또는 혈청을 함유할 수 있고, 100㎕ 용량을 만들기 위해 하이브리도마 상청액 및/또는 GVBS를 첨가할 수도 있다. 실시예 7에 기술되는 하이브리도마 상청액을 선별하는데 사용되는 분석법에 있어서, 각 혈청 시험 용액 100㎕ 용량은 하이브리도마 상청액 50㎕ 및 GVBS중의 10% 인체 혈청 용액 50㎕를 함유하여, 인체 혈청 유입량은 5%가 된다.

37℃에서 30분간 항온처리한 후, 용혈반응%는 완전 용해된 대조용 샘플에 대해 상대적으로 계측했다. 용혈반응은 세포를 침강시킨 뒤, 상청액중에 방출된 헤모글로빈을 415nm에서의 광학 밀도로 측정하여 결정했다.

본 발명을 실시하는데 사용된 항C5 항체로 처리한 후 나타나는 용혈반응의 50% 감소율은 처리후 응혈반응%가 처리전 용혈반응%의 1/2임을 의미한다.

전술한 것을 토대로, 본 발명의 목적은 GN과 관련된 신부전 및 사구체 염증을 감소시키는 신규 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 신규 방법은 인간의 보체 성분 C5에 대한 항체를 함유하는 제제를 약제로서 사용하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 보체 성분 C5 또는 이의 활성 단편에 결합하는 항C5 항체의 사용방법을 제공한다. 이 항체는 보체 성분 C5a 및 C5b의 생성 및/또는 활성을 차단하는 것이 바람직하다. 대부분의 용도에서 항체는 단클론 항체이다.

본 발명의 바람직한 양태에 있어서, GN 증상이 발현되면, 예킨대 단백뇨가 나타나면 항C5 항체 제제를 투여하기 시작한다. 또한, 본 발명은 기존의 GN이 급속하게 악화할 위험이 있는 환자, 예컨대, 전신성 홍반성 루푸스 증상의 발적이나 이와 유사하게 GN을 산출시킨 자가면역 질환을 겪었던 환자들을 치료하는데 예방용으로 사용할 수 있다.

하기 제시되는 실시예들에서 나타나는 바와 같이, GN이 개시된 다음 투여되는 항C5 항체는 본질적으로 사구체 염증/확대를 제거하고 신부전을 감소시킨다(실시예 1 및 2 참조).

이러한 작용을 특정하게 이론화하고자 하는 것은 아니지만, 항C5 항체는 보체성분 C5의 C5a 및/또는 C5b의 활성 단편의 발생 또는 활성을 차단하는 작용을 통해 상기와 같은 치료 효과 및 기타 다른 치료 효과를 나타내는 것으로 사료된다. 이러한 차단 효과를 통해, 상기 항체는 C5a의 전구염증(아나필라톡신성) 효과 및 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)의 발생을 억제한다. 중요한 것은, 항C5 항체가 발휘하는 차단 효과가 보체 성분 C5의 수준에서 일어나므로, 특히 보체 성분 C3에 의해매개되는 보체계의 주요한 옵소닌성, 항감염성 및 면역 복합체 제거 기능은 유지시키는 장점을 갖고 있다.

본 발명은 또한 보체 응혈 활성 및 C5a 생성을 차단하는 항C5 항체를 함유하는 조성물을 제공한다. 이 항체들은 GN 뿐만 아니라 다수의 다른 질환을 치료하는데 유용하다. 그 용도의 예로는 체외 순환과 관련된 면역 및 울혈 기능 부전의 치료법(본원에 참고문헌으로 포함되는 공계류중인 미국 특허 출원 08/217,391 호를 참조), 염증성 관절 질환의 치료법(본원에 참고문헌으로 포함되는 공계류중인 미국 특허 출원 08/311,489 호 참조), 및 다른 보체 관련 질환, 특히 염증 질환의 치료법을 포함한다.

본 발명에 따라 GN을 치료하는데 다른 항체들이 사용될 수 있을지라도, 본 발명의 신규 항체가 바람직하다. 이 신규 항체는 C5의 알파 쇄에 결합하나, 알파쇄의 절단 생성물인 C5a(이후에는 "유리 C5a"라고 지칭함)에는 본질적으로 결합하지 않는다. 항체가 결합하는 기타 다른 바람직한 표적으로는 본 발명의 가장 바람직한 항체인, 하기 기술되는 5G1.1 항체와 면역반응성인 인체 C5의 알파쇄의 단편을 포함한다. 이러한 바람직한 표적으로는 C5의 46kDa 산 가수분해 단편("5G46k" 단편), C5의 27kDa 의 트립신 분해 단편("5G27k" 단편), 서열번호 2의 아미노산 잔기 725 내지 1049에 걸쳐 존재하는 325aa 펩타이드("5G325aa" 펩타이드), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 850 내지 1049에 걸쳐 존재하는 200개의 아미노산 펩타이드("5G200aa" 펩타이드)를 포함하며, 실시예 13에 후술된다.

본 발명의 신규 항체는 이후 KSSKC 에피토프라고 명명되는, 아미노산 서열Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser(서열 번호 1) 내의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 이 KSSKC 에피토프에 결합하는 신규 항체는 이후 항KSSKC 항체하고 지칭하며, 이 KSSKC 에피토프에 결합하는 단클론 항체는 이후 항KSSKC mAb 라고 지칭한다.

본 발명의 신규 항체는 다른 항C5 항체에 비하여 많은 장점을 갖고 있으며, 특히 항염증성 치료제로서의 용도와 관련하여 장점을 갖고 있다. 이러한 장점으로는 동일한 항체 농도에서 본질적으로 동일한 정도로 전구염증성 보체 절단 생성물인 C5a의 발생 및 보체 용혈 활성을 본질적으로 차단하는 작용을 포함한다. 본 발명의 바람직한 일부 항체들은 C3 또는 C4에 대한 C5의 결합을 차단하는 부가적인 유리한 특성을 갖고 있다.

특히 바람직한 본 발명의 항체는 단일특이성의 천연의 항KSSKC 항체이다. 이 5G1.1 천연의 항KSSKC mAb는 이가 항체가 산출할 수 있는 이론적인 결합 범위인 1:2(항체:항원)에 근접한 항체 대 C5의 화학량론적 비로 사용할 때 보체 용혈 활성 및 C5a의 생성을 본질적으로 차단하는 특징적인 잇점을 갖고 있다. 이것은 상기와 같은 비율에서 기능할 수 없는 다른 유사 항체의 필요량보다 소량의 항체를 투여하여 치료 효과를 산출할 수 있기 때문에 바람직한 성질이다.

본 발명은 또한 상기 천연 mAb의 유도체인 재조합 mAb(일가 유도체 포함)를 제공한다. 그 예로는 항KSSKC 재조합 mAb를 포함한다. 이 항체는 농도가 천연의 mAb의 농도의 1배 범위내일 때 수득되는 보체 용혈 활성 및 C5a 생성의 차단 활성정도를 제공하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 항KSSKC 재조합 mAb는 항체 농도가 본 발명의 천연 mAb 농도의 3배 이하일 때 상기와 같은 차단 활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 상기 재조합 항KSSKC mAb를 암호하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열, 뿐만 아니라 본 발명의 핵산 분자가 암호하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인체화된 항체 작제에 유용한 CDR 서열, 뿐만 아니라 본 발명의 항체 작제 및 특성 규명에 유용한 펩타이드 및 올리고펩타이드를 제공한다.

본 발명의 항C5 항체는 보체 C5의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편들의 생성 또는 활성을 차단하는 활성을 갖고 있다. 이러한 차단 효과를 통해, 상기 항체는 C5a의 전구염증(아나필락톡신성) 효과 및 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)의 생성을 억제한다. 중요한 것은, 항C5 항체가 발휘하는 차단 효과가 보체 성분 C5의 수준에서 일어나므로, 특히 보체 성분 C3에 의해 매개되는 보체계의 주요한 옵소닌성, 항감염성 및 면역 복합체 제거 기능을 유지시키는 장점을 갖고 있다.

본원 명세서에 포함되며 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 특정 양태를 예시한 것으로 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 것이다. 그 도면과 상세한 설명이 단지 예시적인 것이지 본 발명을 제한하고 하는 것이 아님은 자명한 것이다.

실시예 1

사구체 염증 및 확대를 억제하는 항C5 항체

본 실시예는 항C5 항체가 사구체 염증 및 확대를 억제하는 것임을 예시한 것이다.

본 실시예의 프로토콜은 다음과 같다. GN-유도된 마우스를 GN 유도 2주후 항C5 항체 또는 대조용으로서 PBS로 처리했다. 각 마우스에게 PBS 중의 항C5 단클론 항체 750㎍(25g 마우스에 대해 30mg/kg) 또는 동 부피의 PBS 단독물을 주입했다. 주입된 양은 0.25 내지 0.365mL(PBS중의 항체 농도를 변화시킴)였고, 1일에 1회씩, 1주에 6일간 복강내로 주입했다. 2주간 유도 및 처리한 후, 동물을 치사시키고 신장을 꺼내 전술한 바와 같이 조직 검사 준비를 했다. 신장을 또한 동일 연령의 유도 및 처리 반응되지 않은 대조용의 마우스로부터 수득했다.

도 1은 주위 간질중에 하나의 사구체가 중심에 위치하고 있는 마우스 신장의 단면 및 각 단면중의 곡세관의 횡단면을 나타낸 것이다. 본원에서 확인할 수 있는바와같이, GN-유도성, PBS-처리된 마우스의 신장(도 1B)은 염증성 사구체 세포과다. 명백한 기저막 비대 및 사구체 확대를 비롯하여 심각한 겸상 사구체 병태를 나타내는 반면, GN-유도성, 항C5-처리된 동물의 사구체(도 1C)는 유도되지 않고 처리되지 않은 마우스의 정상 건강 신장의 사구체(도 1A)와 거의 구별되지 않았다.

심각한 겸상 병태를 지닌 사구체에서 사구체의 모세혈관망(사구체 총)의 크기는 확대되지 않았으나, 상피세포의 겸상형 증식 및 PAS-양성 물질에 의한 압박의 징후가 나타나고 보우만낭도 급격히 확대되었다. 또한 도 1B에 나타나는 질병에 걸린 사구체의 단면에서 모세혈관망은 세포과다성 겸상체의 돌출로 인해 절반으로 분리되었다.

도 1A에 나타낸 유도되지도 처리되지도 않은 마우스의 비염증성 사구체는 직경이 약 100μ이었고: 도 1B에 나타낸 GN-유도되고 PBS 처리된 마우스의 염증성 사구체는 직경이 약 175μ이었으며; 도 1C에 나타낸 GN-유도되고 항C5-처리된 마우스의 비염증성 사구체는 직경이 약 90μ이었다.

실시예 2

GN과 관련된 단백뇨를 억제시키고 감소시키는 항C5 항체

본 실시예는 항C5 항체로 처리시 요중의 단백질량이 상당히 감소(요중의 단백질량이 100mg/dL이하로 존재함)하는 것으로 증명되는 바와 같이, 신장 손상을 예방/감소시킴을 예시한 것이다.

본 실시예의 실험 프로토콜은 실시예 1의 실험에서 사용된 것과 동일했다. 본 연구에는 5마리의 PBS-처리된 GN-유도된 마우스, 6마리의 항C5-처리되고, GN-유도된 마우스, 및 4마리의 동일 연령의 처리되지 않고 유도되지 않은 마우스를 사용했다. 제 1군의 요 샘플은 처음 2주 유도 기간후 처리하기 전에 분석했다. 제 2군의 요샘플은 2주동안 처리한 후 분석했다. 처리되지 않고 유도되지 않은 대조용 동물은 상기 분석 시점에서 모두 요중의 검측가능한 단백질을 갖고 있지 않았다.

GN-유도된 마우스에게서 수득되는 결과를 표 1에 기술하였다. 본원에 나타낸 바와 같이, 2주간의 PBS 처리 기간말에 5마리의 PBS 처리된(대조용) 동물중 4마리는 상당한 단백뇨, 즉 요중에 100mg/dL 이상의 단백질을 나타냈다. 5번째 동물(표 1중의 마우스 D)은 상기 어느 시점에서도 요중에 검측가능한 단백질을 갖고 있지 않았으나, 연구된 다른 마우스와 달리, 2주간의 PBS 처리후 요중에 상당히 높은 글루코스 농도를 갖고 있는 것으로 발견되었고, 이는 이 동물이 생리학적으로 약화되어 있음을 암시하는 것이다.

항C5-처리되고, GN-유도된 군에 있어서, 처음 2주간의 유도 기간 말에 상당한 단백뇨를 나타낸 한 마우스(표 1중의 마우스 6)는 2주간의 항체 처리 기간말에 증상의 개선을 나타냈다. 또한 5마리 PBS-처리되고 GN-유도된 마우스중 4마리에서는 상당한 단백뇨를 나타낸 반면, 항5C-처리되고 GN-유도된 마우스는 2주간의 항체 처리 기간말에 단백뇨를 거의 나타내지 않았다.

실시예 3

사구체 면역 복합체 침착을 억제하지 않는 항C5 항체

본 실시예는 PBS-처리된 동물의 사구체내에서 관찰되는 면역복합체의 침착정도와 동일한 수준으로 본 발명의 실시에 사용된 항C5 항체가 처리된 동물내에서도 면역복합체가 침착될지라도 상기 항체는 그 치료 효과를 산출한다는 것을 예시하고있다. 본 실시예는 또한 항C5 항체의 작동 기작이 사구체내의 면역복합체 침착 정도를 억제하므로써 수행되는 것이 아님을 예시한 것이다.

본 실시예의 실험에 사용된 프로토콜은 실시예 1의 실험에 사용된 프로토콜과 동일한 것이다. 전술한 면역형광성 염색은 실시예 1에서 수득한 동일한 신장의 절편을 사용하여 실시했다.

그 결과를 도 2에 제시한다. 도 2를 통해 알수 있는 바와 같이, PBS-처리되고 GN-유도된 마우스(도 2B)와 항C5-처리되고 GN-유도된 마우스(도 2C)의 신장 사구체내에 동일한 양의 면역복합체가 침착되었으나, 처리되지 않고 유도되지 않은 대조군(도 2A)에는 침착되지 않았다. 처리하기 전에 2주간의 유도 기간후 수거한 GN-유도된 마우스의 신장은 사구체내에 면역 복합체 침착물을 나타냈으나, 도 2B 및 도 2C에서 나타내는 신장 절편중의 양보다 훨씬 소량(보다 낮은 형광성 강도를 나타냄)이었다.

실시예 4

C5b-9 생성을 억제하는 항C5 항체

본 실시예는 본 발명의 실시에 사용된 항C5 항체가 C5b-9 생성을 억제함을 예시한 것이다. C5b-9 생성은 다음의 2가지 방식으로 분석했다: (1) 혈액 샘플의 세포-용해(용혈)성의 시험법, 및 (2) 혈액 샘플내의 가용성 C5b-9 양의 측정법.

도 3은 전술한 바와 같이 수행한 세포 용해 분석 결과를 나타낸 것이고, 마우스 혈청은 X축상에 나타낸 백분율("혈청 유입량%")의 양으로 첨가하였다. 이 분석에서, PBS 중의 항C5 항체 또는 PBS 단독물로 처리한 GN-유도된 동물(상기 참조)로부터의 혈청을 2주간의 처리 기간 말에 분석했다. 또한 시그마 케미칼 컴패니(미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 S-3269)에서 수득한 정상적인 유도되지도 항체 주입되지도 않은 마우스로부터의 혈청("정상 마우스 혈청")을 또다른 대조군으로서 분석했다. 그 결과 30mg/kg의 투여량으로 마우스에게 투여한 항C5 단클론 항체가 분석중에 최대 용혈반응을 산출하는 정상 혈청 농도보다 4배 많은 농도의 혈청 유입량에서 마우스 혈액의 세포 용해성을 완전히 차단시키는 것으로 나타났다.

인체 C5에 대해 유발되는 항C5 단클론 항체의 효과는 순환성 인체 혈액중에서 평가했다. 하이브리도마 N19/8(Wurzner et al., 1991)은 독일 괴팅겐 대학, 면역학부에 소속되어 있는 오토 괴쩨 박사에게서 얻었다. C5 단클론 항체는 문헌[Wurzner et al.(1991)]에 기술된 바와 같이 정제된 인체 C5 단백질로 마우스를 면역화시켜 수득하였다. 이 하이브리도마를 마우스중에서 전파시켜, 마우스 복강액에서 단클론 항체를 IgG 분획으로서 회수 및 정제했다(Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕, 1988: Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons. 뉴욕. 1992).

실시예 5 및 6에 기술된 것 뿐만 아니라 이 실험을 실시하기 위해, 건강한 인간 헌혈자로부터 총 인간 혈액 300mL를 채혈하고, 추후 분석하기 위해 대조용 샘플로서 추가로 1mL를 채혈했다. 혈액을 10U/mL 헤파린을 함유하는 링거 젖산염 용액을 첨가하여 600mL로 희석했다. 이 희석된 혈액에 항C5 mAb(멸균 PBS 중의 30mg)를 50㎍/mL의 최종 농도로 첨가했다(이러한 방식으로 수득한 시험 샘플을 사용한결과는 도 4 및 도 6의 표지된 "+항C5 샘플"임). 대조용 실험에서, 희석된 혈액에 동일한 부피의 멸균 PBS를 첨가했다(이러한 방식으로 수득한 대조군 샘플을 사용한 결과는 도 4 및 도 6의 표지된 "-항C5 샘플"임).

그 다음 상기 혈액을 COBE CML EXCEL 막형 산소공급기 심폐 바이패스(CPB) 기(Cobe BCT, Inc., CO 레이크우드 소재)의 체외 순환로에 주입하고, 그 순환로를 통해 순환을 개시시켰다. 이 순환로를 28℃로 냉각시키고 60분동안 순환시켰다. 그 다음 이 순환로를 37℃로 가온하고 추가 30분동안 순환시킨 후, 실험을 종료시켰다. 이러한 방식으로 혈액을 기계적으로 순환시키면 보체 폭상반응을 활성화시킬 수 있다. 여러 시간마다 샘플을 채취했다.

각 시간대에서 혈액 일정량을 취하고, 그중 일부인 준일정량을 원심분리시켜 모든 세포를 제거하고 남아있는 혈장을 퀴델 샘플 보존 용액(퀴델 코오포레이숀, 캘리포니아 산디에고 소재)으로 1:1로 희석하고, 추후 가용성 C5b-9(sc5b-9) 생성을 평가하기 위해 -80℃에 보관했다. 또한 희석된 혈장의 준일정량을 C3a 생성을 평가하기 위해 냉동시켰다(하기 실시예 5 참조). 희석하지 않은 혈장의 준일정량도 혈액내에 존재하는 보체의 세포 용해 활성에 대한 항C5 항체 효과의 약력학을 평가하기 위한 용혈 분석법에 사용하기 위해 -80℃에 냉동시켜 두었다(실시예 6 참조). 이 실험들은 또한 공계류중인 1994년 3월 23일 출원된 미국 특허 출원 번호 08/217.391호에 기술되어 있다.

sC5b-9 분석은 희석하지 않은 혈액(즉, 혈액을 링거 젖산염 용액으로 희석하기 전에 취한 1mL 샘플에서 수득한 혈액--도 4 및 도 6에 "비희석"으로 표시됨) 및링거 젖산염 용액으로 희석된 혈액(도 4 및 도 6에 "희석"으로 표시됨)을 사용하여 항체를 첨가하기 전이나 또는 CPB 순환로를 개시시키기 전(도 4 및 도 6에 "Tx 전" 으로 표시됨)에 실시하였다. 항체를 첨가한 링거 젖산염 용액 희석된 혈액 샘플(도 4 및 도 6에서 "Tx 후"라고 표시됨)은 CPB 순환로를 개시시킨 후 표시된 시간에 분석하였다.

도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 비처리된 샘플에서 sc5b-9 농도가 순환전 보다 순환 90분후 4배 더 높았지만, 90분간의 순환시간동안 모든 시간점에서 sc5b-9 농도가 대조용의 비순환된 샘플과 거의 동일한 농도가 되도록 항C5 항체가 C5b-9 생성을 완전히 억제시켰다.

실시예 5

C3 침착 또는 활성화를 억제하지 않는 항C5 항체

본 실시예는 항C5 항체로 처리한 결과 보체 성분 C3의 활성화가 억제되지 않거나 또는 사구체내에 C3 또는 그 활성 단편이 침착되지 않는다는 것을 예시한 것이다.

GN-유도된 마우스 및 GN-유도되지 않은 마우스의 사구체내에 형성되는 C3 또는 이의 활성화로 생성된 단편(예, C3a 및 C3b)의 침착은 전술한 바와 같이, 표준방법을 사용하여 FITC-결합된 양 항마우스 C3 항체 제조물로 면역형광성 염색하여 가시화시켰다. 도 5에 제시된 바와 같이, PBS-처리되고(도 5B) 및 항C5 항체-처리되고 GN-유도된 마우스의 신장(도 5C)은 거의 동등한 수준의 C3 면역반응성 물질을 사구체내에 갖고 있는 반면, 유도되지 않고 처리되지 않은 대조용 마우스는 신장내에 단지 미량의 C3 면역반응성 물질을 갖고 있었다(도 5A).

도 5A에 도시한 인쇄물은 정상적인 비유도성 신장내에 존재하는 극소량의 반응성을 나타내기 위해 도 5B 및 도 5C에 비해 과잉노출시킨 것임을 유의하기 바란다. 처리하기 전 2주간의 유도기간후 수득한 GN-유도된 마우스의 신장은 사구체내에 C3 면역반응성 물질이 존재함을 나타냈으나, 도 5B 및 도 5C에 나타낸 신장 절편에서 나타나는 양보다 소량이었다(보다 낮은 형광성 강도로서 확인됨).

또한 항인간 C5 항체를 사용하여 실시예4에 기술한 바와 같이 제조하여 순환시킨 인간 혈액중에 존재하는 C3 활성화의 가능한 억제율에 대해서도 시험했다. 보체성분 C3의 활성화는 혈액내 C3 활성화 생성물인 C3a가 존재함을 나타내는 것이다. C3a 분석은 다음과 같이 실시했다.

퀴델 샘플 보존 용액으로 희석하여 동결시켜 두었던 혈장 샘플(실시예 4 참조)을 사용하여 C3a의 존재에 대해 퀴델 C3a EIA 킷트(퀴델 코오포레이션, 캘리포니아 산디에고 소재)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분석했다. 샘플중의 C3a의 농도는 공지량의 인간 C3a를 함유하는 샘플을 분석하여 수득한 표준 곡선과 비교 결정하여 ng/웰로 나타냈다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 이 실험에서 인간 혈액의 순환중에 C3a의 생성에 대해 첨가된 항C5 mAb는 어떤 억제 효과도 나타내지 않았다.

실시예 6

항C5 항체의 약력학

메인주 바 하버에 소재하는 잭슨 레보레이토리에서 수득한 정상 암컷BALB/cByJ 마우스(각각 평균 약 20g)를 사용하여 mAb BB 5.1 및 이의 Fab' 단편(표준 방법으로 제조함)의 생체내 작용 지속 시간을 측정했다. 상기 mAb 또는 이의 Fab' 단편(또는 대조용으로서 동량의 PBS)을 마우스에게 정맥내 일회 주입했다(35mg/kg 체중). 안와후방총으로부터 혈액 샘플을 PBS 주입후 1시간, 4시간, 24시간, 96시간 및 144시간째; mAb BB5.1의 Fab' 단편 투여후 4시간, 16시간 및 24시간째; 및 천연 mAb BB5.1 투여후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 144시간째 수거했다.

도 7A는 mAb, 이의 Fab' 단편 또는 PBS를 생체내 투여한 후의 마우스 혈액에서 나타나는 보체의 세포-용해 활성의 억제율을 시간경과에 따라 나타낸 것이다(혈액에서 수득하여 2.5%로 희석시켜 전술한 바와 같이 측정함). 이 도면에서 나타나는 바와 같이, mAb는 6일간의 시험 기간동안 혈액의 용혈 활성을 거의 완전히 억제하였다. 그러나, Fab'는 약 24시간의 반감기를 갖고 있었다.

전술한 실험외에, 6일간의 시험 기간말에 모든 마우스를 치사시켰다. 신장, 폐 및 간을 수거하여 육안적 조사, 뿐만 아니라 염색한 절편을 현미경 검사하여 조사했다. 항C5 항체로 처리한 동물의 기관은 모두 PBS 대조군으로 처리한 동물에서 수거한 것과 동일한 양태를 나타냈다. 부검하기 이전에 시험 마우스 및 대조용 마우스의 외관도 또한 구별할 수 없었다.

항인간 C5 항체를 사용하여 또한 실시예 4에서 전술한 바와 같이 순환성 인간 혈액중에서의 약력학적 성질에 대해 시험했다. 본원에 기술된 바와 같이, 항인간 C5 단클론 항체의 용혈 억제 효과를 90분의 순환기간동안 분석했다. 이 분석 결과는 도 7B에 도시하였고, 이는 N19/8 항C5 mAb가 전체 90분간의 순환기간동안 인체 혈액의 세포 용해성을 거의 완전히 억제한다는 것을 나타냈다.

이러한 실험 결과는 항C5 항체가 대부분의 시간동안 혈류중에서 활성을 유지하므로, 주기적인 투여를 실용화할 수 있다는 것을 입증한 것이다.

실시예 7

항C5 단클론 항체의 제조

본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 단클론 항체는 미국 특허 제5,135,916호(심스 등)의 교시에 따라 다음과 같이 제조했다.

Balb/c 마우스에게 인체 C5 단백질(퀴델 코오포레이션, 캘리포니아 산디에고 소재, 카탈로그 번호 A403)을 복강내 3회 주입하여 면역화시켰다. 1차 주입물은 완전 프로인트 보조유제중에 C5 단백질을 100㎍ 함유하고 있고, 2차 면역화 주입물은 불완전 프로인트 보조 유제중에 C5 단백질을 100㎍ 함유하고 있으며, 3차 면역화 주입물은 PBS 중에 단백질 100㎍을 함유하고 있다. 이러한 주입은 대략 2개월간의 간격을 두고 마우스에게 실시했다.

골수종 세포에 비장세포를 융합시켜 하이브리도마를 생성하기 위해 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, 뉴욕 소재, 1992, p. 2.5.1에서 2.5.17]에 기술된 바와 같이 거의 실시했다. 융합 1일전에 C5 단백질 100㎍으로 IV 를 추가항원자극시켰다. 융합후, 면역화된 마우스를 치사시키고 비장을 수거했다. 융합 파트너로서 SP2/0-AG14 골수종 세포(ATCC CRL#1581)를 사용했다. 활성 세포 절단을 유도하기 위해 융합 전일에 SP2/0-AG14 배양물을 분리하였다. 융합시 1:10(골수종 세포:비장세포)의 비율을 사용했다.

세포는 칼슘이 제거된 PBS중의 PEG 1450(시그마 케미컬 컴패니, 미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 P-7181)을 사용하여 융합시키고 1웰당 1 내지 2.5 × 105 세포 농도로 평판배양했다. 그 다음 날에 10% 열 불활성화된 태내 송아지 혈청(FBS); 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신(GPS); 및 HAT (시그마 케미컬 컴패니, 미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 H-0262) 보강된 EX-CELL 300 배지(JRH Biosciences, KS 렉세나 소재, 카탈로그 번호 14337-78P)중에서의 선별을 개시했다. 그 후 매일 이 융합체에 새로운 FBS, GPS, 및 HAT 보강 배지를 공급했다. 선별반응을 개시한 후 2일째 세포 사멸이 관찰되기도 하고 5일째 생세포 응집이 관찰되기도 하였다. HAT중에서 선별반응을 실시한지 2주 후, 추가 연구에 사용하기 위해 선정한 생존 하이브리도마를 FBS, GPS, 및 HT 보강된 EX-CELL 300 배지(시그마 케미컬 컴패니, 미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 H-0137)로 1주동안 전이시켜둔 다음, FBS 및 GPS가 보강된 EX-CELL 300 배지중에서 배양했다.

하이브리도마를 융합후 10 내지 14일째, C5에 대한 반응성 및 보체 매개의 용혈반응의 억제성에 대해 선별하고, 이 선별반응은 적어도 그 결과가 수득될 때까지 지속하였다. 용혈반응의 억제성에 대한 선별반응은 전술한 병아리 적혈구 용해 분석법으로 실시했다. C5 반응성에 대한 선별법은 ELISA였고, 이 방법은 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 실시했다.

탄산 나트륨/중탄산 완충액(pH 9.5)중의 C5 2㎍/mL 용액(퀴델 코오포레이션,캘리포니아 산디에고 소재) 50㎕ 일정량을 96 웰 평판(Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, 덴마크 록킬드 소재)의 각 시험웰에 주입하여 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리했다. 그 다음 이 웰을 세정 단계로 처리했다(각 세정 단계는 TBST로의 3회 세정 단계로 구성된다). 그 다음, 시험 웰을 TBS중의 1% BSA(BSA/TBS)로 구성된 차단 용액 200㎕로 37℃에서 1시간동안 차단시켰다. 추가 세정 단계 이후, 하이브리도마 상청액 50㎕ 일정량을 각 시험 웰중에 주입하여 37℃에서 1시간동안 항온처리하고 이어서 세정하였다. 제 2 항체(검측용)로서, BSA/TBS중에 1:2000의 비율로 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 결합된 염소 항마우스 IgG 50㎕를 각 시험 웰중에 주입하여 1시간동안 37℃에서 항온처리한 다음 세정 처리했다. 제조업자의 지시에 따라 O-페닐렌디아민 10mg(시그마 케미컬 컴패니, 미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 P-8287)을 인산염-구연산염 완충액(시그마 케미컬 컴패니, 미주리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 P-4922) 25mL에 용해시킨 뒤, 이 기질 용액 50㎕를 각 웰에 첨가하여 퍼옥시다제 활성에 대해 검측했다. 마지막으로, 퍼옥시다제 검측 반응을 중지시키기 위해, 3N 염산 50㎕ 일정량을 각 웰에 첨가했다. 하이브리도마 상청액중의 C5와 반응성인 항체의 존재는 490nm에서의 분광분석계에 의한 OD 측정으로 판독했다.

5G1.1로 표시된 하이브리도마로부터의 상청액은 ELISA 시험 결과 양성으로 나타났고, 병아리 적혈구 용혈분석법에서 정상 인체 혈액중에 존재하는 보체의 세포-용해 활성을 상당히 감소시켰다. 또다른 분석 결과, 용혈 분석중에 약 1/2 몰농도의 인체 C5가 존재할때에도 5G1.1 항체가 혈청 용혈 활성을 거의 완전히 중화시킬 수 있을 정도로 정상 인체 혈액중에 존재하는 보체의 세포-용해 활성을 효과적으로 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

5G1.1 mAb의 또다른 특성을 규명하기 위해 면역블롯 분석을 실시했다. 인체 C5(퀴델 코오포레이션, 캘리포니아 산디에고 소재, 카탈로그 A403)를 환원 조건하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하고, 니트로셀룰로스 막으로 전이시킨 뒤, 정제된 IgG 제조물로서 5G1.1 mAb를 사용하여 탐침하였다. 2개의 밴드가 인체 C5 단백질의 알파 쇄 및 베타 쇄에 상응하는 겉보기 분자량을 지닌 5G1.1 mAb와 면역반응성인 것으로 나타났다. 이어서, 이 웨스턴 블롯상에 나타난 2개의 5G1.1 면역반응성 밴드는 본 실험에 사용된 C5 제조물중에 존재하고 C5의 베타쇄와 동일한 겉보기 분자량(약 75kDa)을 지닌 알파쇄의 큰 단편 및 115kDa C5 알파쇄에 대한 5G1.1 항체의 결합으로 부터 산출되는 것으로 밝혀졌다.

또한, 실시예 4 및 5에서 기술된 N19/8 mAb와 작용성 용혈 분석중의 5G1.1 mAb와의 상대적인 활성을 측정하고, 이 mAb들이 C5a를 산출하는 C5의 절단반응을 차단하는지를 측정하는 분석을 실시했다. 이러한 목적을 위해, N19/8 및 5G1.1 mAb를 인체 보체 용혈분석 및 C5a 방출율 분석으로 직접 비교했다.

20% v/v 인체 혈청의 존재하에 수행한 용혈 분석 결과, 5G1.1 mAb가 6.25 ㎍/ml의 최종 농도(5G1.1/C5의 몰비율, 0.5/1)에서 혈청 용혈 활성을 효과적으로 차단하는 반면, N19/8 mAb는 25.0 ㎍/ml의 보다 높은 최종 농도(N19/8/C5의 몰비율, 2.0/1)에서 차단하는 것으로 나타났다. 이 분석에서의 상청액을 C5a의 존재에 대해 시험했을 때, 5G1.1 mAb가 C5b-9 매개의 용혈 활성을 차단시키는데 필요한 투여량과 동일한 투여량에서 C5a 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다.

이와 반대로, N19/8 mAb는 상기 분석으로 C5a의 방출을 차단시키는데 5G1.1 mAb와 비교해볼 때 10배 정도 효과적이지 못했다. 또한, 보체 매개의 용혈반응을 차단하는 N19/8 mAb의 능력은 C5a 생성을 차단하는 능력과 동일하지 않아, 25㎍/ml투여량의 N19/8은 용혈반응을 완전히 차단한 반면, C5a 생성은 단지 37% 정도만을 감소시켰다.

하이브리도마 5G1.1은 미국 매릴랜드 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 1994년 4월 27일에 기탁되어 있으며, 기탁번호는 HB-11625이다. 이 기탁은 특허 절차를 밟기 위해 미생물 기탁을 국제적으로 인정받기 위한 부다페스트 조약(1977)하에 이루어진 것이다.

실시예 8

항인체 C5 단클론 항체 5G1.1 및 N19/8의 친화도 상수(K _p ) 측정

용액중의 항체-항원 평형 해리 상수(K_p)를 측정하기 위해 사용한 절차는 문헌[Friguet et al., J.Immunol.Meth. 1985, 77:305-319]에 기술된 것에 따랐다. 이 방법을 사용하여 항인체 C5 단클론 항체 N19/8 및 5G1.1의 K_p를 측정하였다. 먼저, 단클론 항체를 용액중의 항원(C5)과 평형에 도달할때까지 항온처리했다. 평형상태에서 결합되지 않은(자유) 상태를 유지하는 항체의 비율을 통상적인 효소 결합 면역흡착법(ELISA)으로 측정했다. 이 방법으로 수득한 K_D의 실험값은 다른 방법(방사능표지된 항원의 면역침전법 및 형광성 전이법)으로 수득한 K_D값과 동일한 것으로 나타났다. 이 방법은 변형되지 않은 항원을 사용한다는 장점을 갖고 있다.

도 8 및 도 9는 ELISA 로 측정된 바와 같은 인체 C5에 대한 항인체 C5 단클론 항체 5G1.1 및 N19/8의 결합성을 스캐챠드 플롯으로 나타낸 것이다. 각 그래프에 있어서, (v)는 결합된 항체의 분획을 나타내고, (a)는 평형상태에서의 자유 항원의 농도를 나타낸다.

5G1.1 mAb의 계측된 K_D는 30pM인 반면, N19/8 mAb의 계측된 K_D는 43pM이었다. 이러한 결과는 5G1.1 및 N19/8 mAb들의 K_D가 유사하며, 따라서, 두 항체간의 작용적 상이성이 단지 C5 항원에 대한 친화성의 차이로 나타나는 것으로 설명할 수 없다는 것을 교시하는 것이다.

실시예 9

CPB 동안의 보체 활성화에 대한 5G1.1 mAb의 효과

실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 CPB 순환중의 인체 혈액의 재순환과 관련된 실험은 3가지 투여량의 5G1.1 mAb(15mg, 7.5mg, 3.75mg)를 사용하여, 그리고 대조용으로서 5G1.1 mAb의 부재하에 실시하였다. 이러한 일련의 농도로 수행한 5회의 대조 실험에서, C3a(도 10) 및 sC5b-9(도 11) 농도는 처음 30분 동안에 증가하였고, 또한 전체 실험동안에도 지속적으로 상승하였다. CPB 순환에 5G1.1 mAb를 첨가하여도 본 실험중의 C3a의 생성에는 어떤 영향도 미치지 않았다.

이와 반대로, 5G1.1 mAb를 2가지 고 투여량(15mg 및 7.5mg)으로 첨가한 결과, 본 실험중의 sC5b-9의 생성은 완전히 차단한 반면, 최저 투여량(3.75mg)은 sC5b-9의 생성을 단지 부분 차단하였다. 이 실험을 시간이 경과함에 따라 채취한 혈청 샘플에 대해 용혈 분석한 결과, 총 혈청 보체 활성이 대조군 실험에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 12). 이와 반대로, 5G1.1 mAb 의 최고 투여량(15mg)은 보체 용혈 활성을 완전히 차단한 반면, 이보다 낮은 투여량(7.5mg 및 3.75mg)은 용혈 활성을 차단하지 못했다.

이러한 결과는 7.5mg 투여량이 CPB 순환중의 C5b-9 생성을 효과적으로 차단하나 C5b-9 매개의 용혈 활성은 차단하지 못하며, 이는 용혈 분석만으로는 CPB중에 일어나는 보체 활성화를 정확하게 반영할 수 없다는 것을 암시한다. 상기 결과는 또한 5G1.1 mAb가 70kg 환자에 대해 150mg의 투여량과 대략 동등한 투여량인 15mg/500ml의 투여량에서, 어떤 기준으로 측정할때에도 인체 혈액중의 보체 활성화를 완전하게 차단시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 10

항C5 재조합 항KSSKC 가변영역 유전자의 클로닝

아미노산 서열결정:

5G1.1 mAb의 N-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해, 12%의 아크릴아미드 겔(37.5:1 아크릴아미드/N,N'-메틸렌-비스아크릴아미드)을 제조하고, 1x 예비-전기영동 완충액(123mM 비스-트리스, pH 6.6, 음극 완충액 보유조에 1mM 환원된 글루타치온을 첨가하여 보강한 것)을 사용하여 10mA에서 45분동안 예비-전기영동시켰다. 다음날, 음극 보유조중의 예비-전기영동 완충액을 음극 보유조 완충액(44mM N-트리스-(히드록시메틸)-메틸-2-아미노에탄설폰산, 113mM 비스-트리스, 0.1% (w/v)도데실 황산 나트륨(SDS), 0.067%(w/v) 티오글리콜산)으로 대체시키고, 양극 보유조중의 예비-전기영동 완충액을 양극 보유조 완충액(63mM 비스-트리스, pH 5.9)으로 대체시켰다.

75㎍ 5G1.1 단클론 항체를 램리 샘플 완충액(30mM 트리스-HCl pH 6.8, 3%(w/v) SDS, 10mM EDTA, 0.02%(w/v) 브로모페놀 블루, 5%(v/v) 글리세롤, 2.5%(v/v) 베타-머캅토에탄올)에 첨가하고, 브로모페놀 블루가 이끄는 염료가 겔의 바닥에 도달할때까지 10mA로 전기영동한다. 단백질은 50V 에서 1시간동안 1X 전사완충액(10mM 시클로헥실아미노프로판 설폰산, 0.05(w/v) 디티오트레이톨, 15%(v/v) 메탄올)을 사용하여 PROBLOTT 막(어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아 포스터 시티 소재)으로 전이시켰다.

단백질 밴드는 0.2% 폰큐 S(3% 트리클로로아세트산, 3% 설포살리실산중에 첨가)를 사용하여 염색하고 그 다음 물로 탈색시켜 나타냈다. 밴드를 절제하여, 펄스형 액체 단백질 서열결정기(ABI 모델 477A)를 사용하여 에드만 화학법으로 아미노산 서열을 분석하고, 수득된 PTH 아미노산을 온라인 마이크로보어 HPLC 시스템(ABI 모델 120A)으로 분석했다.

5G1.1 중쇄의 아미노 말단의 보호기를 제거하기 위해, 10mg의 5G1.1 단클론항체를 PD-10 칼럼(파마시아, 뉴저지 피스카터웨이 소재)을 사용하여 환원 완충액(5M 구아니딘-HCl, 50mM 트리스-HCl, 10mM 디티오트레이톨, pH 8.5)중에서 교환시켰다. 실온에서 1시간동안 항온처리한 후, 50mM 요오도아세트아미드를 첨가하고 30분동안 항온처리를 지속시켰다. 이로써 수득된 카르브아미도메틸화된 경쇄 및 중쇄를 5M 구아니딘-HCl, 50mM 트리스-HCl, pH 8.5로 평형화시킨 SUPEROSE 12(파마시아) 칼럼상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분리했다. 이 카르브아미도메틸화된 중쇄는 PD-10 칼럼을 사용하여 50mM 인산 나트륨, pH 7.0으로 교환시키고, 피로글루타메이트 아미노펩티다제(판베라, 위스콘신 매디슨 소재, 중쇄 단백질 0.5 mU/nmol)로 분해한 다음, 전술한 바와 같이 서열결정했다.

내부 아미노산 서열을 결정하기 위해, 카르브아미도메틸화된 5G1.1 경쇄를 2M 우레아, 25mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0 으로 교환시키고, 엔도프로테이나제 Lys-C(프로메가, 위스콘신 매디슨 소재; 프로테아제:단백질 비 1:40)와 함께 37℃에서 하룻밤동안 항온처리했다. 분해물을 C18 역상 HPLC 칼럼(베크만 인스트루먼츠, 캘리포니아 풀러톤 소재)상에 장입하고, 0.1% 트리플루오로아세트산중의 선형 0 내지 50% 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출시켰다. 피크의 분획을 전술한 바와 같이 아미노산 서열분석했다.

PCR 클로닝:

5G1.1 가변 중쇄 영역의 클로닝은 시판용 프라이머 세트(마우스 Ig-PRIMER SET, 카탈로그 번호 69831-1, 노바겐, 위스콘신 매디슨 소재)를 사용하여 수행했다. 산/구아니디늄 티오시아네이트 기법(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 1987, 162:156-159)을 사용하여 5G1.1 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 분리했다. 제 1 가닥의 cDNA를 합성하기 위해, 10㎍의 총 RNA 를 65℃에서 5분동안 변성시키고, 얼음상에서 냉각시킨 뒤, 10mM 트리스 pH 8.3, 50mM KCl 1.5mM MgCl2,10mM 디티오트레이톨, 250μM의 각 dNTP, 20 유니트의 AMV 역전사효소(Seikagaku America, 매릴랜드 록크빌 소재), 및 10 pmol의 적절한 3' 프라이머(Ig-PRIMER SET 킷트 프로토콜)를 함유하는 100㎕의 반응물에 첨가했다. 37℃에서 1시간동안 배양한 후, cDNA 합성 반응물 5㎕를 다음을 함유하는 100㎕ PCR 반응물에 첨가했다: 10mM 트리스-HCl, 25℃에서 pH 9.0, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.1%(w/v) 젤라틴, 1.0%(v/v) 트리톤 X-100, 200μM의 각 dNTP, 2.5 유니트의 AMPLITAQ DNA 폴리머라제(퍼킨-엘머-시투스, CT 노르워크 소재) 및 25 pmol의 적절한 5' 및 3' 프라이머(Ig-PRIMER SET 킷트 프로토콜에 기술된 바와 같음), 반응 조건은 95℃에서 1분, 42℃에서 1분, 및 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10분동안 최종 신장시켰다.

추정되는 크기(약 450bp)를 갖는 PCR 생성물을 T/A 클로닝 킷트(인비트로겐)를 사용하여 벡터 pCRII(인비트로겐, 캘리포니아 산디에고 소재)내로 클로닝시켰다. 클로닝된 DNA 단편의 DNA 서열 분석은 주형으로서 2본쇄 플라스미드 DNA를 사용하여 디데옥시 사슬-종지법으로 실시했다. 이 방법으로 고유한 중쇄 가변영역을 분리했고, 산출되는 플라스미드를 p5G1.1 VH 2-1-3으로 표기했다. 각각의 복제 PCR 반응으로부터 수득한 여러 클론들을 이 가변영역의 PCR 증폭반응동안 도입된 임의의 돌연변이를 검측하기 위해 서열결정했다.

5G1.1 경쇄 가변영역을 클로닝하기 위해, 전술한 바와 같이 아미노산 서열결정하여 수득한 19량체의 의문시되는 아미노산 서열 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu The Val Thr로 GenBank 설치류 서브디렉토리를 연구하기 위해 UWGCC 프로그램 TFASTA(위스콘신 대학, 위슨콘신 매디슨 소재)를 사용하여 PCR 프라이머를 디자인했다. 이 서열에 대한 정확한 정합체는 v-카파 k2 가변영역을 암호하는 뮤린 배선 유전자중에 위치하고 있었다(세이트만 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978 75: 3881-3885). 이 배선 유전자의 DNA 서열은 가변 영역 5'-프라이머로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 UDEC690(서열 번호 5)을 디자인하는데 사용했다. 뮤린 카파 유전자 불변 영역 프라이머 UDEC 395(서열 번호 6)을 또한 합성하여 이 반응에 사용했다. 5G1.1 가변 경쇄의 클로닝은 UDEC690 가변영역 5'-프라이머 및 UDEC395 뮤린 카파 유전자 불변 영역 프라이머를 사용하여 실시했다.

폴리A mRNA는 하이브리도마 5G1.1로부터 분리했다. 총 RNA를 분리하기 위해, 산/구아니디늄 티오시아네이트 절차(Chomczynski and Sacchi, 상기 문헌 참조)를 사용했고, 이로써 수득한 총 RNA 1mg을 올리고(dT)-셀룰로스 크로마토그래피하였다.

제 1 가닥 cDNA 합성을 위해, 올리고(dT)-셀룰로즈 용출액(정제된 5G1.1mRNA 약 2㎍을 함유함) 25㎕ 중 1㎕를 65℃에서 5 분간 변성시키고, 얼음상에서 냉각시키고, 100 nM UDEC395(서열번호:6) 및 25 유니트의 AMV 역 전사효소(미국, 매릴랜드, 록빌에 소재한 세이카가쿠 아메리카)를 함유하는 확장 완충액(10mM 트리스 pH 8.3, 50mM KCl, 1 mM 디티트레이톨, 240 μM의 각 dNTP) 중에 42℃에서 1 시간 동안 항온시켰다. 완성된 제 1 가닥 반응물 5㎕를 2.5 유니트의 AMPLITAQ DNA 폴리머라제(미국, 캘리포니아, 포스터 시티에 소재한 퍼킨, 엘마이어) 및 프라이머UDEC690(서열번호:5) 및 UDEC395(서열번호:6) 각 500mM로 보충시킨 증폭 완충액을 사용하여 PCR 증폭처리하였다. 증폭은 95℃에서 1분, 52℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1 분으로 이루어지는 30 회의 사이클을 통해 수행하고, 이후, 72℃에서 한 번 10 분간 항온시켰다.

수득한 PCT 생성물을 제조업자의 지시(미국, 캘리포니아, 라 졸라, 바이오 101)에 따라 제네클린(GENECLEAN)을 사용하여 정제하고, Sse8387 I 및 Hind III로 분해시키고, 겔정제하고, 상기 벡터 블루우스크립트 II SK⁺(미국, 캘리포니아, 라 졸라, 스트라타겐)내로 연결시켰다. 연결된 플라스미드를 전기 침투에 의해 세균 균주 DH10B 로 형질전환시켰다.

제조업자의 지시(미국, 캘리포니아, 차트워쓰, 퀴아겐)에 따라 QUIAGEN-TIP-500 컬럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 비롯한 종래의 방법에 의해 형질전환된 세균 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하고, 이를 SEQUENASE 효소(미국, 오하이오, 클리블랜드, U.S.바이오케미칼)를 사용하여 Sanger 디데옥시 연쇄 종결 방법에 의해 서열결정하였다. 제 2 의 각각의 PCR 반응으로부터 얻은 클론으로 어떠한 돌연변이도 상기 증폭과정중 도입되지 않았다는 것을 입증하였다. 상기 클로닝된 가변영역을 포함하는 수득한 플라스미드는 SK(+)690/395로 표시되었다. 이 플라스미드내의 경쇄 암호화 삽입물은 전술한, 5G1.1 의 아미노산 서열결정에 의해 측정된 바와 같이 N-말단 및 내부 경쇄 서열을 모두 암호화하였다.

실시예 11

재조합 mAb의 작제 및 발현

5G1.1 CDR들을 포함하는 재조합 mAb들을 암호하는 재조합 DNA 구조는 제한 단편 2차 클로닝 및 중첩 PCR 과정을 비롯한 통상적인 재조합 DNA 방법에 의해 제조하였다. 수득한 재조합 mAb-암호화 DNA는 하기 DNA를 포함한다 :

(1) 5G1.1M1 scFv(서열번호:7)로 표시된 비인체화된(유린) scFv 를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR L1은 서열번호 7의 아미노산 잔기 28-34이고 ; CDR L2는 서열번호 7 의 아미노산 잔기 52-54이고 ; CDR L3은 서열번호 7의 아미노산 잔기 93-98이고 ; CDR H1은 서열번호 7의 아미노산 잔기 156-159이고 : CDR H2는 서열번호 7 의 아미노산 잔기 179-183이고 ; CDR H3은 서열번호 7의 아미노산 잔기 226-236이다.

(2) 5G1.1M1 scFv CB(서열번호:8)로 표시된 인체화된(CDR 이식됨) scFv를 암호하는 DNA : 여기서, CDR L1은 서열번호 8의 아미노산 잔기 26-36이고 ; CDR L2는 서열번호 8의 아미노산 잔기 52-58이고 ; CDR L3은 서열번호 8의 아미노산 잔기 91-99이고 ; CDR H1은 서열번호 8의 아미노산 잔기 152-161이고 ; CDR H2는 서열번호 8의 아미노산 잔기 176-192이고 ; H3은 서열번호 8의 아미노산 잔기 225-237이다.

(3) 5G1.1M1 VL HuK(서열번호:9)로 표시된 키메라성 경쇄(Fab의 경쇄 부분을 형성할 수 있음)를 암호하는 DNA ;

(4) 5G1.1M1 VH HuG1(서열번호:10)로 표시된 키메라성 Fd(Fab의 중쇄부분을 형성할 수 있음)를 암호하는 DNA ;

(5) 5G1.1 VH + IGHRL(서열번호:11)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이 변경된) Fd를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR H1은 서열번호 11의 아미노산 잔기 26-35이고 ; CDR H2는 서열번호 11의 아미노산 잔기 50-60이고 ; CDR H3은 서열번호 11의 아미노산 잔기 99-111이다.

(6) 5G1.1 VH + IGHRL(서열번호:12)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이변화된) Fd를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR H1은 서열번호 12의 아미노산 잔기 26-35이고 : CDR H2는 서열번호 12의 아미노산 잔기 50-66이고 ; CDR H3은 서열번호 12의 아미노산 잔기 99-111이다.

(7) 5G1.1 VL + KLV56(서열번호:13)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이변화된) 경쇄를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR L1은 서열번호 13의 아미노산 잔기 26-35이고 ; CDR L2는 서열번호 13의 아미노산 잔기 52-58이고 ; CDR L3은 서열번호 13의 아미노산 잔기 91-99이다.

(8) 5G1.1 VL + KLV56B(서열번호:14)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이 변화되지 않은) 경쇄를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR L1은 서열번호 14의 아미노산 잔기 26-35이고 ; CDR L2는 서열번호 14의 아미노산 잔기 52-58이고 ; CDR L3은 서열번호 14의 아미노산 잔기 91-99이다.

(9) 5G1.1 VL + 012(서열번호:15)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이 변화되지 않은) 경쇄를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR L1은 서열번호 15의 아미노산 잔기 24-34이고 ; CDR L2는 서열번호 15의 아미노산 잔기 50-56이고 ; CDR L3은 서열번호 15의 아미노산 잔기 89-97이다.

(10) 5G1.1 VH + IGHRLD(서열번호:16)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이 변화되지 않은) Fd를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR H1은 서열번호 16의 아미노산 잔기 26-36이고 ; CDR H2는 서열번호 16의 아미노산 잔기 50-60이고 ; CDR H3은 서열번호 16의 아미노산 잔기 99-111이다.

(11) 5G1.1 scFv DO12(서열번호:17)로 표시된 인체화된(CDR 이식되고 골격서열이 변경되지 않은) scFv를 암호하는 DNA ; 여기서, CDR L1은 서열번호 17의 아미노산 잔기 26-35이고 : CDR L2는 서열번호 17의 아미노산 잔기 52-58이고 ; CDR L3은 서열번호 17의 아미노산 잔기 91-99이고 ; CDR H1은 서열번호 17의 아미노산 잔기 152-161이고 : CDR H2는 서열번호 17의 아미노산 잔기 176-186이고 ; CDR H3은 서열번호 17의 아미노산 잔기 225-237이다.

본 발명에 따르면, 전술한 (1) 내지 (11)에서 논급된 다양한 L1, L2 및 L3 CDR들 각각을 임의의 기타 경쇄 CDR들과 결합시켜 재조합 항체 또는 합성 펩타이드 항체(즉, 본 발명의 재조합 펩타이드의 서열을 갖는 합성 펩타이드) 부분으로서, 하나의 L1, 하나의 L2 및 하나의 L3 CDR을 포함하는 3 개의 경쇄 CDR 한 세트를 만들 수 있다.

본 발명에 따르면, 전술한 (1) 내지 (11)에서 논급된 다양한 H1, H2 및 H3 CDR들 각각을 임의의 기타 경쇄 CDR들과 결합시켜 재조합 항체 또는 합성 펩타이드 항체(즉, 본 발명의 재조합 펩타이드의 서열을 갖는 합성 펩타이드) 부분으로서, 하나의 H1, 하나의 H2 및 하나의 H3 CDR을 포함하는 3 개의 경쇄 CDR 한 세트를 만들 수 있다.

본 발명에 따르면, 전술한 다양한 항체 분자, Fd들 및 경쇄로 된 가변 구간(예, VL 및 VH 구간)들의 쌍을 재조합 DNA 에 의해 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법에 의해 일정한 구간 영역과 결합시킬 수 있다. 특히, 이런 목적을 위한 일정한 구간으로는 IgG 일정구간이 바람직한 바, 이는 변경되지 않거나 또는 IgG의 다양한 아형, 예를 들면 IgG1 및 IgG4로부터 일정한 도메인들의 혼합물로 구성될 수 있다.

바로 위에서 언급한 Fd 및 경쇄 암호화 DNA의 정합쌍들---즉, (3)와 (4), (5)와 (7), (6)과 (8), 및 (6)과 (9)---을 N19/8에 대해 실시예 15에서 주로 후술하는 바와 같이 APEX-3P벡터내로 함께 2 차 클로닝하였다. (1)과 (2)의 상기 scFv 작제물은 종래의 기술을 사용하여 pET Trc SO5/NI내로 2 차 클로닝하였다.

이렇게 얻은 플라스미드를 균주 MF2(pET 플라스미드)내로 종래의 전기 침투법에 의해 도입하거나 또는 제조업자의 지시에 따라 DNA 1 ㎍당 TRANSFECTAM 시약(미국, 위스콘신, 매디슨, 프로메가)2-3㎕를 사용하여 리포펙션(lipofection)에 의해 인체 293 EBNA 세포(APEX 플라스미드)내로 도입시켰다. 균주 ME1과 ME2는 하기에서 제조되는 에스케리히아 콜리 균주 W3110(ATCC 표시 27325)의 유도체이다.

W3110 유도체 ME1 및 ME2의 제법

비인체화되고, 비키메라성인 뮤린의 5G1.1-scFv"m5G1.1-scFv"--경쇄(3) 및 Fd(4)로 구성됨--는 유도체 이. 콜리 K12 균주 W3110의 유도체내에서 발현되었다. 이 유도체는 용균 박테리오파지에 의해 감염되는 것을 막기위해 특성규명이 되지 않은 유전자를 불활성시키므로써 제조하였다. 이 콜리 균주 W3110은 완전히 특성규명이 되었으며 통상, 재조합 DNA 생성 발효물로서 사용되므로 특히 바람직하다.

이. 콜리 균주 W3110의 단일 콜로니를 하룻밤동안 30℃ L 배지에서 성장시켰다. 그 세포를 원심분리기에 의해 수거하고 10mM MgSO4에서 재현탁시켰다. 상기 배양액 총 0.1 ㎖를 45℃에서 0.7% L 연성 한천에 가하고 재빨리 L 평판에 부었다. 플라크 정제된 파지 용균물의 희석되지 않은 분획, 10^-2로 희석된 분획 및 10^-4로 희석된 분획 각 50㎕를 한천 표면에 점적시켰다. 0.45㎛막을 통해 파지 용해질을 미리 여과하고 멸균관에 클로로포름 한 방울과 함께 ℃에서 저장하였다. 그 점적들을 연성 한천 표면에서 건조시키고 37℃에서 하룻밤 항온시켰다.

다음날, L 평판에 10⁹파지 PFU를 도말하고 그것을 건조시켰다. 멸균한, 평평한 이쑤시개를 사용하여, 상기 스폿평판의 파지 용해구간에서 성장하는 분리된 콜로니로부터 나온 세포를 10⁹파지 PFU로 도말시킨 평판상에서 단일 콜로니에 대해 스트리킹하고 37℃에서 하룻밤동안 항온하였다. 단일 콜로니를 정제한 후, 교차 스트리킹에 의해 단일 콜로니의 파지 내성을 재검사하였다. 파지 감성에 대한 교차 스트리킹 테스트는 하기와 같이 수행하였다. 50㎕(10⁸pfu/㎖)의 파지를 파스쳐 피펫을 사용하여 평판의 왼손 부분에 수직선으로 도말하였다. 이것에 평행하게 오른쪽으로 추가의 파지를 테스트하였다. 상기 평판을 건조시키고 감성 또는 내성을 조사한 균주를 왼쪽에서 오른쪽으로 가는 단일한 줄안에 모든 파지 라인을 따라 수직하게 교차하여 도말시켰다. 내성이 있는 균주는 감성 균주가 용해되는 동안 파지 스트리킹의 영역에서 성장한다.

L 배지에서 하룻밤 성장시키고 DNA 손상제인 미토마이신 C 로 처리한 후, 파지 내성 돌연변이 균주 ME1 을 테스트하였다. 상기 균주는 표준 플라크 분석법 및 파지 감성 지시 균주로서 이. 콜리 W3110을 사용하여 생육성이 있는 파지를 생성하는 데 실패하였다. 이러한 결과는 균주 ME1이 정주성 프로파지를 내포하지 않는다는 것을 제안한다.

λDE3 프로파지(스튜디어 등,1990, Meth. Enzymol. 185:60-89)를 상기 ME1 염색체내로 부위 특이적으로 통합시키므로써 균주 ME2를 작제한다. 프로파지에 따른 T7 RNA 폴리머라제의 발현은 용원화된 숙주내에 T7 프로모터의 조절하에서 pET벡터내로 클로닝된 상기 표적 유전자를 발현시킨다(스튜디어 등, 전술함). 용원화는 λDE3, λ헬퍼 파지, λB10 및 선택 파지인 λB482 와 세가지 방법으로 감염시켜 실시한다(스튜디어등, 전술함).

λDE3(imm21)은 스튜디어 및 그의 동료에 의해 이. 콜리 lacUV5 프로모터 뒤의 T7 RNA 중합 효소 유전자를 λD69(imm21)의 BamHI 클로닝 부위내로 삽입시키므로써 만들어졌다. λD69(imm21)의 BamHI 부위내로의 클로닝은 상기 통합효소(intergrase)를 방해하므로, λDE3은 통합되거나 저절로 염색체로부터 절단될 수 없다. 상기 헬퍼 파지 λB10은 λDE3이 결핍되어 저절로 용원을 형성할 수 없는 통합효소기능을 제공한다. 선택 파지, λB482는 살아있는 세포중에 존재하는 임의의 λDE3 숙주 범위 돌연변이체를 용해시키나, 민감성 세포내로 통합될 수 없고 λDE3 용원을 용해시킬 수 없는 데, 이는 그것이 λDE3(imm21)으로서 동일한 면역구간을 갖기 때문이다.

용원화 프로토콜 :

균주 ME1은 37℃에서 0.2% 말토오즈 및 10 mM MgSO₄로 보충한 L배지 중에서 약 10⁸세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. ME1 세포 1㎕를 2x10⁸플라크 형성 유니트(pfu)의 λDE3 및 10⁸(pfu)의 λB10 및 λB482 로 항온시켰다. 상기 숙주/파지 혼합물을 37℃에서 20 분간 항온 처리하여 ME1세포에 대해 파지 흡착시켰다. 세포/파지 현탁물의 몇몇 희석물을 L평판에 도말하여 분리된 콜로니로서 약 30-200 대상 용원을 함유하는 평판을 생성하였다. 상기 평판을 뒤집고 37℃에서 하룻밤동안 항온시켰다. 몇 개의 분리된 콜로니들을 후술하는 바와 같이 λDE3 프로파지 획득을 위해 스크리닝하였다.

λDE3 용원의 확인

활성 T7 RNA 폴리머라제가 트랜스로서 제공되지 않는다면 완전히 불완전한 T7 파지 4107, 즉 T7 파지 결실 돌연변이의 성장을 돕는 λDE3 용원 대상의 성능을 테스트하였다. 단지 λDE3 용원만이 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드)의 존재하에 정상적인 파지의 성장을 지지할 것이다. 상기 T7 파지는 IPTG의 존재하에 λDE3 용원상에 매우 큰 플라크를 발생시키는 반면, 유발인자의 부재하에서는 매우 작은 플라크가 관찰된다. IPTG의 부재하에서 플라크의 크기는 상기 용원내 T7 RNA 폴리머라제의 기본적인 수준을 나타낸다. 추정 람다DE3 용원은, 37℃에서 0.2%의 말토오스 및 10 mM의 MgSO₄로 보충된 L 브로스내에서 성장되어, 대략 10⁸세포/ml 의 세포밀도가 되었다. 총 0.5 ml의 세포를 원심분리한 후 펠릿을, 2 X10⁴pfu 를 함유하는 T7 파지 용해물 0.2 ml 내에 재현탁시켰다. 파지는 37 ℃에서 30분동안 흡착되었다. 47 ℃에서 현탁액의 절반(0.1 ml)을 용융된 최상부 아가로즈 3.0 ml 에 첨가하고, L 평판에 부었다. 세포/파지 현탁액의 남은 량을, 0.4 M IPTG로 보충된 L 평판상에 부어 T7 RNA 폴리머라아제의 유도를 점검했다. 평판을 뒤접어 37°에서 하룻밤동안 항온배양했다.

전술한 교차 스트리킹 방법에 의해서 각각의 균주가, 동일한 면역군(imm21)내에 있는 파지 람다 B482 에 의한 감염에 내성이 있는 것을 밝힘으로써, 균주도 또한 람다DE3 용원의 존재에 대해 테스트되었다. 용원은, pET 벡터로부터 단백질 생산을 위해 낮은 기초 발현수치를 갖는 것으로 선택되었다. ME2로 표시되는, 생성 균주는, 파지에 내성을 지니며 IPTG의 존재하에서 T7 RNA 폴리머라제를 과도발현시킨다.

이. 콜리로부터의 인체화된 5G1.1-scFv 의 정제

인체화된 5G1.1-scFv(h5G1.1-scFv) cDNA 작제물이, 세균 발현 플라스미드 pET Trc SO5/NI(서열번호 18)내로 클론된 후 이. 콜리 균주 ME1내로 형질전환되었다. 생성되는 균주 발현 h5G1.1-scFv 은, 37 ℃에서 100 ㎍/ml 의 암피실린으로 보충된 테리픽 브로스(1.2 (중량/부피)% 박토-트립톤, 2.4 (중량/부피)% 박토-이이스트 추출물, 0.4 (부피/부피)% 글리세롤, 90 mM KPO₄, pH 7.0)를 함유하는 2 리터의 아플리콘 유리 용기 발효기내에서 성장되었다. 배양액의 O.D.₅₅₀가 10에 도달했을때, 1mM IPTG의 첨가에 의해 재조합 scFv의 생산이 유도되었다. 37℃에서 추가로 3시간동안 항온배양한 후에, 원심분리에 의해 세포를 모으고 세포 펠릿을 -80 ℃에서 저장했다.

세포를 10 ml/g 중량으로 1 mM EDTA(pH 5.0)내에 재현탁시키고, 마이크로유체화기(메릴랜드, 뉴톤 소재의 마이크로플루이딕사에서 시판하는 모델 M110T)를 일회 통과시켜 용해시켰다. 17,000 x g 에서 15분 동안 원심분리한 후에, 테크마 폴리트론을 사용하여 봉입체 1g 당 10 ml 로, 20 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.15 (중량/부피)% 데옥시콜레이트내에 재현탁시켜 생성되는 봉입체 펠릿을 세척하였다. 봉입체를 17,500 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 다시 펠릿화시킨 후 1g 당 10 ml 로, 20 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 8 M 우레아내에 재현탁시켰다. 1시간동안 교반한 후에, 시료를 14,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 잔류하는 불용성 물질을 펠릿화하였다.

상청액 추출물을 20 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 7 M 우레아 및 50 μM 황산 쿠프린을 사용해 10배로 희석한 후 4℃에서 16 시간 이상동안 교반하여 scFv를 재폴딩 시켰다. 응집제로서 비오크릴 BPA-1000 (몬트고메리빌 소재, 토분해스사 제품)을 3 μl/ml로 첨가한 후에 시료를 15,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거했다. 재폴딩 혼합물은 디이필트레이션(dicafiltration)에 의해 20 mM 트리스 (pH 9.0). 1 mM EDTA로 교환시키고, YM10 멤브레인(매사츄세츠, 비벌리소재, 아미콘사 제품)에 맞추어진 교반된 세포를 사용하여 한외여과에 의해 농축되었다.

그후 적절하게 재폴딩된 scFv는, Q 세파로즈 패스트 플로우(Fast Flow)(뉴저지, 피스카타웨이 소재, 파마시아사 제품)를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 응집된 물질 및 오염 단백질로부터 분리되었다. 결합된 scFv는 선형 NaCl구배(0-0.5 M)를 함유하는 20 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 1 mM EDTA로 용출되었다. scFv를 함유하는 분획은 혼합되고, YM10 멤브레인에 맞추어진 교반된 세포를 사용하여 한외여과에 의해 농축된 후 20 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 로 평형화된 세파크릴 S200 HR 26/100 컬럼(파마시아사 제품)에 적용되었다. scFv를 함유하는 분획은 혼합되고, 디아필트레이션(Diafiltration)에 의해 인산염-완충된 생리식염수내로 교환된 후 한외여과에 의해 농축되고, 0.22 μM 밀렉스-GV 필터(메릴랜드, 베드포스드소재, 밀리포어사 제품)를 통해 여과된 후 4℃에서 저장되었다.

이. 콜리로부터의 m5G1.1-scFv 의 정제

동결된 세균 세포 페이스트를 해동시킨 후 세포 페이스트 g당 2.5 ml의 1 mM EDTA (pH 5)로 내에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을, 상호작용 챔버가 일직선으로 있는 마이크로유체화기(마이크로플루이딕사 제품)내로 18000 psi의 지지 압력으로 통과시켜 용해시켰다. 그후 세포용해물을 4℃에서 15 분동안 JA-10 원심분리 로터(rotor)내에서 10,000 rpm으로 원심분리했다. 그리고 상청액을 따라버렸다.

펠릿을 펠렛 1g 당 10 ml의 20 mM 트리스 (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15% 나트륨 데옥시콜레이트내에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 상기와 같이 10분동안 교반한 후에, 상청액을 다시 따라버린다. 상기 세정제로 세척된 펠릿을10 ml의 8 M 우레아, 20 mM 트리스-HCl (pH 9), 1 mM EDTA 내에 재현탁시켰다. 현탁액을 4℃에서 1 시간동안 교반한 후 7 M 우레아, 20 mM 트리스-HCl(pH 9)로 10 배로 희석하고 4℃에서 교반했다. 그후 CuSO₄를 첨가하여 최종 농도를 50 μM으로 하고 4℃에서 하룻밤동안 계속 교반했다.

오염 단백질의 대다수(m5G1.1-scFv가 부정확하게 폴딩된 것을 포함함)는, 완충액으로 재폴딩된 시료를 5배로 희석(교반과 함께 행함)하여 희석후 최종 농도가 4℃에서 1.4 M 우레아, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM 나트륨 아세테이트가 되도록 하여 침전시킴으로써 제거되었다. 실온에서 제조되었을 때 희석 완충액의 pH는 pH 5.0 이었다. 희석하기 전에, 희석 완충액의 pH는 4℃ 에서 결정된다. 희석후에 시료의 pH는 pH 5.5 보다 컸다. 6 N HCl로 시료의 pH를 완충액의 초기 pH 5.0으로 조정하였다. 즉시 용액은 뿌옇게 되었고, 0.5-24 시간동안 4-8℃에서 교반되었다.

시료를 300 kDa 컷-오프 한외여과 멤브레인(메릴랜드, 베드포드 소재, 밀리포어사 제품)을 통해 시료를 여과하여 침전물을 제거하였다. 투과물을 수집한 후 10 kDa 컷-오프 한외여과 멤브레인(밀리포어사 제품)을 사용해 5배로 농축시켰다. 이 농축된 보유물을 20 μM 나트륨 아세테이트, 1 mM EDTA(pH 5.0)으로 2배로 희석하여 NaCl 농도를 12.5 mM로 낮추었다.

희석된 보유물을 4℃에서, 0.7 M 우레아, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, 20 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)으로 평형화시킨 SP 세파로즈 FF 칼럼(파마시아사 제품)상에서 5 cm/분의 선형 유속으로 로딩하였다. 베드높이는 3.5 cm 이상이었다. 로딩후에 컬럼을 40 컬럼 부피(CV)의 평형완충액으로 세척했다. 그후 컬럼을 20 CV 의 20 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0), 1 mM EDTA로 세척했다. 결합된 scFv를 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 5.8), 1 mM EDTA를 사용하여 용출했다. 대략 4 컬럼부피내에서 단일의 피크를 수득했다.

그후 1 M 트리스-HCl (pH 8)을 첨가하여 세파로즈 용출물을 20 mM 트리스-HCl로 조정했다. 1N NaOH를 첨가하여 시료의 pH 를 8.0으로 조정했다. 실온에서 20 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA 내에서 평형화된 Q 세파로즈 FF 컬럼(파마시아사 제품)상에 이 시료를 5 cm/분의 유속으로 로딩하였다. scFv를 함유하는 분획을 통과한 유동물을 수집하였다.

분획을 통과하는 Q 세파로즈 유동물을 150 mM NaCl 조정하였고, 10 kDa 컷오프 한외여과 멤브레인을 사용하여 ml 당 10 mg의 scFv로 농축시켰다. 이 농축된 시료를, 인산염 완충된 생리식염수(pH 7.4)내에서 평형화된 세파크릴 S200 컬럼상에 로딩한 후 0.4 cm/분으로 용출시켰다. 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 은(silver) 염색시켰다. 오염물의 다수를 포함하는 정면 및 배면 숄더 분획을 따라버린 후에 피크 분획을 결합시켰다.

실시예 12

m5G1.1 scFv의 기능적 분석

용혈 분석법에서 m5G1.1 scFv의 적정으로, m5G1.1 scFv 가 인체 보체 매개된 용해를 용량의존적으로 저해한다는 것을 밝혀냈다(제 13도). m5G1.1 scFv의 효능을 5G1.1 mAb 및 Fab와 직접적으로 비교하면, m5G1.1 scFv는 20% 인체 혈청내에서0.15 μM 농도일 때 C5b-9 매개된 용혈을 완전히 차단하는 반면에, 5G1.1 mAb 및 Fab는 0.06-0.08 μM 농도일 때 용혈을 차단했다. 이들 분석법에서 C5a 생성을 분석하면, 유사한 결과가 나타나는데, 5G1.1 scFv는 0.15 μM 농도일 때 C5a 생성을 완전히 차단하는 반면에, 5G1.1 mAb 및 Fab는 0.06-0.08 μM 농도일 때 차단했다(제 14도). 이들 실험결과를 보면, scFv(서열번호 19)로서 엔지니어되었을 때 C5a 생성을 차단하는 효율성의 절반을 상실하는 N19/8 와는 달리, 5G1.1 유린(murine) scFv는 C5a 및 C5b-9 의 생성을 차단하는 능력을 보유했다.

부가적으로, 이들 자료는 C5a 및 C5b-9 을 완전히 차단하는데 요구되는 m5G1.1 scFv의 몰농도(0.15 μM)가, 5G1.1 mAb 및 Fab에 대해 요구되는 농도(0.06-0.08 μM)의 2배였다는 점에서, m5G1.1 scFv가 모분자(천연 뮤린 5G1.1 mAb)와 유사한 활성을 보유했다는 것을 나타낸다.

m5G1.1 scFv가 심폐 바이패스 생체외(ex vivo) 모델에서 보체 활성화를 차단하는 능력을 보유했는지를 결정하기 위해, 세균으로 생성된 정제 5G1.1 뮤린 scFv 4.5mg을 CPB 순환로에 첨가하고 보체 활성화를 모니터했다. 대조군 실험에서, C5a 및 C5b-9 수치는 실험시간동안 증가되었다. 단일 실험에서, 4.5 mg의 m5G1.1 scFv 를 CPB 순환로에 첨가해도 C3a의 생성에 아무 영향이 없었다(제 15도 참고). 대조적으로, C5b-9의 생성과 함께 보체 용혈 활성은 이 실험에서 완전히 차단되었다(제 16도 및 제 17도 참고).

실시예 13

5G1.1에 의해 인식되는 에피토프의 특징화

트립신 분해: 20 ㎍의 정제된 인체 C5 (캘리포니아주, 샌디에고 소재의 어드밴스드 테크로놀로지사 제품)를, 1 ㎍의 TPCK-처리된 트립신(뉴저지주, 프리폴드 소재의 워팅톤 바이오캐미칼사 제품)으로 효소분해시켰다. 분해를 3분동안 계속시킨 후 20 ㎍의 콩 트립신 저해제(워팅톤사 제품)를 첨가하여 정지시켰다. 반응물을 변성시킨 후 단백질 시료 완충액을 첨가하여 환원시키고 즉시 5분동안 끓였다. 분해된 단편을 12% 겔상에서 SDS-PAGE를 통해 크기 분별시켰다. 그후 전이 완충액(20 (부피/부피)% 메탄올, 25 mM 트리스-염기(pH 8.0), 및 192 mM 글리신)내에서 니트로셀룰로즈(캘리포니아주, 헤르큘레스 소재, 바이오라드 레보러토리즈사 제품)로 겔을 전기블롯시키고, 5G1.1 또는 C5a 특이적 단클론 항체(독일, 괴팅턴 대학, 면역부, 오도 괴츠 박사로부터 수득한 G25/2)를 사용하여 ECL 웨스턴 블릇 분석하였다,

각각의 차단 용액(500 mM NaCl, 5 mM 트리스 (pH 7.4), 10 (부피/부피)% 탈지 분유, 및 0.2 (부피/부피)% 트윈-20) 내에서 필터를 30분동안 2회 항온배양했다. 필터를, 1차 항체를 함유하는 신선한 차단 용액(20 ml)으로 교환하고 진동 플랫폼 상에서 40 분동안 항온배양했다. 필터를 세정액(500 mM NaCl, 35 mM 트리스 (pH 7.4), 0.1% SDS, 1% NP40, 및 0.5% 데옥시콜린산)으로 세척하여 우유를 제거하고 신선한 세정액을 첨가한 후 궤도형 진탕기상에서 20 분 간격으로 2회 항온배양했다. 필터를 10-20 ml 의 이차 항체 용액(500 mM NaCl, 5 mM 트리스(pH 7.4), 10 (부피/부피)% 비지방 분유, 0.2 (부피/부피)% 트윈-20, 및 1% NP40)으로 세정하고, 진동 플랫폼 상에서 20 분동안 1: 2000 의 HRP 결합된 염소 항마우스 희석액을 함유하는 신선한 이차 항체 용액으로 항온배양했다. 필터를 전술한 바와같이 세척하고 ECL 시약(일리노이주, 알링턴 하이츠 소재, 아머샴사 제품)내에서 1분동안 항온배양한 후 ECL 하이퍼필름(아머샴사 제품)에 노출시켰다.

산 가수분해: 20 ㎍의 정제된 인체 C5 (어드밴스드 테크로놀로지사 제품)를, 1 N 아세트산내에서 가수분해시켰다. 20 ㎍의 인체 C5 (1 ㎍/μl)를 20 μl의 2N 아세트산에 첨가하고 100℃에서 10분동안 항온배양시켰다. 시료를 변성시키고 역시 100 ℃에서 5분동안 단백질 시료 완충액을 첨가하여 환원시켰다. 시료가 푸른 색이 될 때까지 포화된 트리스 염기 용액을 적가하여 산을 중화시켰다. 절단 생성물을 SDS-PAGE를 통해 치수 분획시키고 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯시켰다. N-말단 서열을 위해, 겔 분획된 산 가수분해물을 PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. PVDF 멤브레인으로부터 46 kDa 산 가수분해 단편 밴드를 절단하고 그것을 실시예 10에서 전술한 바와 같이 아미노산 서열분석하여 N-말단 서열을 수득했다.

탈글리코실화: 인체 C5의 환원 및 변성된 산 가수분해 단편 또는 트립신 분해단편을, 제조자의 지시에 따라 N-글리코시다아제 F (인디아나주, 인디아나폴리스 소재, 베링거 만하임사 제품, 펩타이드-N-글리코시다아제 F)로 탈글리코실화시켰다.

결과: 인체 C5를 산 가수분해하여 항C5a mAb G25/2 및 항C5 알파 쇄 mAb 5G1.1 에 대해 면역반응성이며 SDS-PAGE 에 의해 겉보기 분자량이 46 kDa인 단편을 생성했다. 은 염색 SDS-PAGE 분석과 함께 상기 양 항체로 동시에 프로브된 웨스턴 블롯은, 양 항체에 면역반응성인 단일 46 kDa 단편의 존재를 확인시켰다. 5G1.1 및G25/2 에 대한 결합 부위를 함유하는 단일 면역반응성 단편의 존재는, C5의 알파 쇄의 N-말단의 대략 첫번째 46 kDa 내에 5G1.1 에피토프가 함유되었다는 것을 암시한다.

"배경 생리학 및 병리학"이라는 표제하의 보체계의 설명에서 전술한 바와 같이, C5a 절단 부위 또는 그에 아주 인접하는 부위에 결합하는 화합물(예, 항체)은 말단 보체 저해제로서 작용할 가능성이 있다. 이 부위에 결합하는 항체의 잠재적인 저해 활성으로, C5 알파 쇄-결합 5G1.1 항체가 C5a 절단 부위 또는 그에 인접하는 부위에서 에피토프에 결합할 것이라고 예상할 수 있다. 5G1.1가 C5의 46 kDa 산 가수분해단편에 결합했다는 사실은 이런 예상을 지지해 준다.

트립신 분해 생성물의 웨스턴 블롯 분석법은, 5G1.1에 면역반응성인 대략 27 kDa에서 이동하는 하나의 단백분해 단편을 동정했다. 이와 유사하게, 항C5a mAb G25/2로 웨스턴 블롯 분석한 경우 대략 29 kDa에서 이동하는 하나의 면역반응성 단백분해 단편이 관찰되었다. 블롯이 5G1.1 및 G25/2로 프로브된 실험으로, 각각의 밴드는 구별이 뚜렷했고 그 겉보기 시차 이동성은 겔 변칙(anomaly)이 아니었다. 5G1.1 mAb는 C5 전환효소 절단 부위에 결합하는 것으로 생각되었기 때문에, 이것은 의외였다. 그러므로 5G1.1는, G25/2와 면역반응성을 나탄낸 12 kDa 의 C5의 모든 단편에 면역반응성인 것으로 생각되었다. 이러한 단편은, 항C5a mAb에 특이적으로 결합하기에 충분히 C5 알파 쇄의 과도한 아미노 말단을 함유하고, C5 전환효소 절단부위 및 그 부위를 넘어서는 확장 영역을 포함할 정도로 충분히 함유한다.

29 kDa 단편과 G25/2 의 면역반응성은, 단편이, 절단되어 C5a를 생성하는 C5알파 쇄의 N-말단 영역을 함유한다는 것을 나타낸다. 더구나, 5G1.1는 이 밴드와 면역반응하지 않기 때문에, 5G1.1 에피토프는 C5 알파 쇄의 N-말단의 대략 첫번째 29 kDa 내에 함유되지 않을 것이고, 따라서 5G1.1 에피토프는 C5 전환효소 절단부위근처에 위치할 수 없다.

이들 트립신 분해 및 산 가수분해 지도 자료는, 5G1.1 에피토프가 C5 알파 쇄의 N-말단으로부터 약 29 kDa 에서 시작하고 C-말단 방향으로 계속되는 17 kDa, 즉 N-말단으로부터 46 kDa 영역내에 함유되었다는 것을 암시한다. 이는, 항체가 C5 알파 쇄로부터 C5a가 절단되는 부위 또는 그 인접한 부위(즉, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 733 부위 또는 그 인접부위)에 결합된다는 상기 예상으로부터 볼때 의외의 발견이다.

해독후 변형은 SDS-PAGE 전기영동 동안에 단백질의 이동성을 변화시킬 수 있다. 상기의 하나의 변형은, N-연결된 글리코실화를 통한 탄수화물의 첨가이다. "배경 생리학 및 병리학"이라는 표제하에 전술한 바와 같이, C5는 C5a 와 같이, 글리코실화된다. C5a는, 인체 C5의 전체 길이의 프로-C5 전구체의 아미노산 번호 723에 상응하는 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된다(서열번호 2).

인체 C5 알파 쇄를 컴퓨터 분석하면, 서열번호 2의 아미노산 번호 893. 1097 및 1612에 상응하는 부위에서 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위를 암시한다. 트립신 분해 단편 및 산 분해 단편의 전기영동적 이동성에 대한 탄수화물의 기여를 결정하기 위해 단편을 효소로 탈글리코실화시키고, 웨스턴 블롯 분석을 했다. 각각의 트립신 분해 단편은 겉보기분자량에서 대략 3 kDa 을 잃었고, 산 분해 단편은대략 6 kDa을 잃었다고 결정된다.

이 결과는, 트립신 분해 단편이 단일 부위에서 각각 글리코실화되었고 46 kDa 산 분해 단편은 2개의 부위에서 글리코실화되었음을 나타낸다고 해석된다(그중 하나는, 상기와 같이 C5a내의 공지된 글리코리실화 부위임). 탈글리코실화 이후 관찰된 감소된 이동성은 C5 α쇄의 제 1 의 233 아미노 산내에 있는 제 2의 N-연결된 글리코실화 부위의 계산된 예측과 일치한다.

N-말단 서열 분석에 의해 1N 아세트산 처리에 의해 발생된 46kDa의 4 개의 제 1 아미노산이 Thr Leu Gln Lys라는 것을 결정된다. 이 서열은 서열번호 2의 아미노산 660 내지 663에 상응하는 위치에서 인체 프로-C5 전구체 분자-총길이에 걸쳐 단지 한 번만 발견된다. 이 4개의 아미노산 서열은 또한 인체 C5의 α쇄의 아미노-말단의 서열에 상응하므로 인체 C5a의 아미노-말단에도 상응한다.

5Gl.1의 결합부위를 더욱 상세히 지도화하기 위해서는 중첩하는 펩타이드 분석을 수행한다. N-말단쪽으로 43 개의 아미노산을 확장하고 C-말단쪽으로 30개의 아미노산을 확장시킴과 함께 전술한 인체 C5의 17 kDa 구간내(서열 번호:2 ; 아미노산 893 내지 1019)에 포함되어 있는 것으로 예측되는 서열은 폴리프로필렌 필터(미국, 알라바마, 헌츠빌에 소재한 리서치, 제네틱스 인코오포레이티드.)상에서 고체상 합성에 의해 88 개의 중첩하는 일련의 펩타이드로서 합성된다.

상기 43개 및 30개의 아미노산 신장물을 가하여 이러한 17 kDa 영역의 길이예측에 있어서 부정확성의 여지를 허용한다. 이러한 부정확성은 다양한 C5a 영역들 각각의 특정한 글리코실화 범위의 불확실성에 기인할 뿐만아니라 SDS-PAGE 에 의해고도로 충전된 폴리펩타이드(예를 들면, 5G46k. 단편 및 5G27k 단편)가 분석되는 경우 통상적으로 보여지는 변형된 겔 이동성에 기인하는 경향이 있다. 본 발명의 개요에서 전술한 바와 같이, 이 중첩하는 펩타이드에 의해 커버되는 영역에 상응하는 200 아미노산 펩타이드를 본 명세서에서는 "5G200aa"펩타이드로 언급한다.

5G1.1 항체가 C5a 절단 부위에 결합할 것이라는 예측으로 인해, 8 개의 중첩하는 펩타이드로 된 추가 세트는 상기 C5a 절단부위(서열번호: 2 의 아미노산 725 내지 754)에 걸친 30개의 아미노산 영역으로 연장하여 합성된다. 이 30 개의 아미노산 영역으로 된 서열을 갖는 펩타이드는 "절단 부위 펩타이드"로 본 명세서에서 언급한다. 서열번호 2 의 아미노산 잔기 725-1049에 걸친 325aa 펩타이드(이 펩타이드는 상기 절단 부위펩타이드 및 5G200aa 펩타이드에 의해 커버된 영역에 걸쳐있음)는 본 명세서에서 "5G325aa"로 언급한다.

이러한 필터를 ECL 웨스턴 블롯 분석에 대해 전술한 바와 같은 5G1.1으로 탐침하였는 바, KSSKC 펩타이드(서열번호:1)의 아미노산 잔기 3-19에 상응하는 영역에 걸친 4 개의 중첩하는 펩타이드 한 세트는 각각 모노클론 항체 결합을 나타내는 양성 신호를 보이는 반면, C5a 절단 부위에 상응하는 펩타이드는 5G1.1 항체에 결합하지 않는다.

실시예 14

C3/C4 결합 분석

C3 및 C4는 모두 전형적인 C5 전환효소의 주요성분이며, C3은 또한 다른 C5 전환효소의 주요성분이다. 이 C5 전환효소는 C5 를 활성 C5a 및 C5b 로 전환시키는데 필요하다. 그러므로, C3 및 C4에 대한 C5결합을 차단하는 성능은 본 발명에 따른 보체 매개 질환의 치료에 사용되는 항체에 대한 바람직한 성질이다.

96개의 웰 미량역가 평판을 1 시간 동안 37℃에서 정제된 인체 C3 또는 C4(Quidel) 10 ㎍/㎖로 웰 당 50㎕피복하였다. 그 평판을 그후 실온에서 1 시간동안 1% BSA를 함유하는 TBS 로 된 200 ㎕/웰로 블로킹하였다. TBS 0.1% BSA 중에서 3회 세척한 후, 정제된 인체 C5(Quidel, TBS 1% BSA중의 20㎍/㎖)를 5G1.1Fab(종래의 파파인 분해에 의해) 존재시(20㎍/㎖) 또는 부재시에 상기 평판에 가하고 1 시간 동안 37℃에서 항온하였다. TBS/0.1% BSA중에서 3회 세척한 후, C5β쇄(N19/8, 5㎍/㎖)에 대해 지시된 단클론 항체를 상기 웰에 가하여 C3 또는 C4에 결합하는 C5를 감지하였다. 마지막으로 TBS/0.1% BSA중에서 3 회 세척한 후, 양고추 냉이 퍼옥시다아제-결합된 2 차 항체 및 적당한 기질을 사용하여 상기 평판을 전개하였다.

이러한 분석의 결과, 5G1.1 mAb는 정제된 인체 C5가 C3 또는 C4에 결합하는 것을 60% 내지 90% 까지 억제하는 것을 보여준다. 본 명세서 및 특허청구범위에 에 기술된 바와 같이, C3 또는 C4 결합에 있어서 60% 내지 90%의 감소는 C3 또는 C4 결합의 "실질적인 감소"이다.

실시예 15

N19/8 키메라성 Fab의 작제 및 기능 분석

하이브리도마 N19-8로부터 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 제조업자에 의해 전술된 대로 Ig-Prime 시스템(Novagen)을 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. 각각의 다수 PCR 반응으로부터 나온 클론을 서열결정하여 상기 PCR 증폭화동안 도입된 돌연변이를 탐지하였다. N19-8 중쇄 가변 영역을 함유하는 플라스미드 및 플라스미드 pHuCk(히어터 등.,1980 Cell, 22:197-207)를 중첩하는 PCR 반응에서 주형으로 사용하여 N19-8 VL/인체 κ불변 영역 키메라성 cDNA를 생성하였다.

유사하게, N19-8 중쇄 가변 영역을 함유하는 플라스미드 및 인체 IgG1 유전자를 함유하는 플라스미드(일란 알. 커스크, 미국, 메릴랜드, 베테스다에 소재한 국립 암 인스튜티트로부터 입수함)를 주형으로 사용하여 N19-8 VH/인체 IgG1 Fd 키메라성 cDNA를 생성하였다. 이 Fd 구조물은 IgG1 접번 영역의 제 1 의 아미노산 9개를 함유하는 데, 이는 상기 κ경쇄의 말단 시스테인 잔기와 통상적으로 이황화물 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함한다.

상기 PCR 증폭과정 동안 도입되어 서열결정된 적당한, 인접 제한효소 부위를 사용하여 상기 수득한 키메라성 cDNA를 따로 상기 APEX-1 벡터내로 클로닝하였다. 프로모터 인트론 및 이 APEX 벡터들중 하나로부터의 cDNA 삽입물을 함유하는 단편을 연이어 다른 폴리링커내로 2 차 클로닝하여 경쇄 및 Fd 모두의 발현을 나타내는 단일 벡터를 생성하였다. 이 APEX-1 로부터의 상기 직렬식 발현 카세트를 연이어 APEX-3P 내로 2 차 배양하였으며, 이는 키메라성 Fab의 발현을 위한 293 EBNA 세포로 형질전환되었다.

보체 용혈 활성 및 C5a 발생을 차단하는 성능 테스트를 하여 상기 키메라성 N19/8 Fab 가 용혈 활성을 차단하는 성능을 보유하나, 그것의 C5a 발생 차단 성능은 50% 손실한다는 것을 알게 되었다.

본 명세서에서는 다양한 간행물 및 특허 관련문헌을 언급하였다. 전체적으로, 이 문헌내용들은 본 발명에 관계한 당해 기술분야의 수준을 더욱 상세하게 기술하기위해 본 명세서에서 참고로 인용하였다.

본 발명의 바람직한 실시태양 및 기타 실시태양은 본 명세서에 기술되어 있으나 하기한 특허청구 범위에서 정의한 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한 추가의 실시태양도 당업자라면 인지할 것이다.

참고문헌

[표 1]

항C5 항체 처리에 의한 단백뇨의 예방/감소

PBS 대조군

항C5 처리한 것

^*마우스 D는 처리후 요 글루코스를 500 mg/dL이상 갖는다.

[서열표]

Claims (57)

1. 하나 이상의 항체 항원 결합 부위를 포함하고, 인체 보체 성분 C5에 특이적인 결합을 나타내며, 이 특이적인 결합이 이루어지는 표적부는 인체 보체 성분 C5의 알파쇄인 항체로서, 인간 체액중에서의 보체 활성화를 억제하고, 인체 보체 활성화 생성물인 자유 C5a에 특이적으로 결합되지 않는 항체.
2. 제1항에 있어서, 인간 체액중에서의 보체 활성화 억제가 C5a 생성 차단율의 실질적인 증가 및 상기 체액중의 보체 용혈 활성 차단율의 실질적인 증가로서 측정할 수 있고, 상기 C5a 생성 차단율의 증가가 상기 보체 용혈 활성 차단율의 증가와 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는 항체.
3. 제1항에 있어서, 항체가 인체 C5에 결합시, 인체 보체 성분 C3에 결합하는 C5의 작용을 실질적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
4. 제1항에 있어서 항체가 인체 C5에 결합시, 인체 보체 성분 C4에 결합하는 C5의 작용을 실질적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
5. 제1항에 있어서, 인체 체액중에서의 보체 활성화의 억제가, 그 항체의 항체-항원 결합 부위 대 체액중의 인체 C5의 비가 10몰 대 1몰 또는 10몰 미만 대 1몰의비가 되는 농도로 항체를 체액중에 첨가했을 때, 체액중에 산출되는 실질상 완전한 C5a 생성의 차단율이나 또는 체액중에 산출되는 실질상 완전한 보체 용혈 활성의 차단율로서 측정할 수 있는 것임을 특징으로 하는 항체.
6. 제5항에 있어서, 농도가, 항체의 항체-항원 결합 부위 대 체액중의 인체 C5의 비로서 3몰 대 1몰 또는 3몰 미만 대 1몰의 비가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 항체.
7. ATCC 기탁번호 HB-11625의 하이브리도마 5G1.1.
8. 제7항의 하이브리도마에 의해 생성된 항체.
9. 서열 번호 7의 아미노산 1 내지 아미노산 248에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 scFv 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
10. 서열 번호 9이 아미노산 3 내지 아미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
11. 서열 번호 10의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
12. (a) 서열 번호 9의 아미노산 3 내지 아미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 10의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 포함하는 분리된 단백질.
13. 제9항, 제10항 또는 제11항의 핵산 분자에 의해 암호된 아미노산 서열을 포함하고, 항체인 것이 특징인 분리된 폴리펩타이드.
14. 벡터 함유 숙주가 제9항, 제10항 또는 제11항의 핵산 분자인 제1 핵산 분자에 의해 암호되는 폴리펩타이드를 발현하도록 제2 핵산 분자에 작동적으로 공유 결합되어 있는 제1 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
15. 제14항의 핵산 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포.
16. 제15항의 재조합 숙주 세포를 증식시켜 이 숙주 세포가 벡터의 제1 핵산 분자에 의해 암호되는 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 단계, 이에 따라 발현된 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하며, 이 발현된 폴리펩타이드가 항 C5 항체인 분리된 C5 항체 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
17. 제16항의 분리된 항 C5 항체.
18. 서열 번호 8의 아미노산 1 내지 아미노산 248에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 scFv를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
19. 서열 번호 17의 아미노산 1 내지 아미노산 248에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 scFv를 방호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
20. 서열 번호 15의 아미노산 1 내지 아미노산 108에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
21. 서열 번호 14의 아미노산 3 내지 아미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
22. 서열 번호 16의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
23. 서열 번호 12의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
24. 서열 번호 11의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
25. (a) 서열 번호 15의 아미노산 1 내지 아미노산 108에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 16의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 함유하는 분리된 단백질.
26. (a) 서열 번호 15의 아미노산 1 내지 아미노산 108에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 12의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 포함하는 분리된 단백질.
27. (a) 서열 번호 15의 아미노산 1 내지 아미노산 108에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 11의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 포함하는 분리된 단백질.
28. (a) 서열 번호 14의 아미노산 3 내지 이미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 16의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 함유하는 분리된 단백질.
29. (a) 서열 번호 14의 아미노산 3 내지 아미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 12의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 포함하는 분리된 단백질.
30. (a) 서열 번호 14의 아미노산 3 내지 아미노산 110에 상응하는 가변부 경쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제1의 폴리펩타이드 영역; 및

    (b) 서열 번호 11의 아미노산 1 내지 아미노산 122에 상응하는 가변부 중쇄 영역의 아미노산 서열을 함유하는 제2의 폴리펩타이드 영역을 함유하는 분리된 단백질.
31. 재18항, 제19항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항 또는 제24항의 핵산 분자에 의해 암호된 아미노산 서열을 포함하고, 항 C5 항체인 분리된 단백질.
32. 벡터 함유 숙주가 제18항, 제19항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항 또는 제24항의 핵산 분자인 제1 핵산 분자에 의해 암호되는 폴리펩타이드를 발현하도록 제2 핵산 분자에 작동적으로 공유 결합되어 있는 제1 핵산분자를 포함하는 핵산 벡터.
33. 제32항의 핵산 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포.
34. 제33항의 재조합 숙주 세포를 증식시켜 이 숙주 세포가 핵산 분자에 의해 암호되는 단백질을 발현하도록 하는 단계, 이에 따라 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하고, 이 발현된 단백질이 항 C5 항체인 것이 특징인, 분리된 항 C5 항체단백질을 생산하는 방법.
35. 제31항의 분리된 C5 항체.
36. (a) 서열 번호 7의 아미노산 93 내지 아미노산 98에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 경쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
37. (a) 서열 번호 8의 아미노산 91 내지 아미노산 99에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 경쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴글레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
38. (a) 서열 번호 7의 아미노산 156 내지 아미노산 159에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR1을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
39. (a) 서열 번호 8의 아미노산 152 내지 아미노산 161에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR1을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
40. (a) 서열 번호 7의 아미노산 179 내지 아미노산 182에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
41. (a) 서열 번호 8의 아미노산 176 내지 아미노산 186에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
42. (a) 서열 번호 7의 아미노산 226 내지 아미노산 236에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
43. (a) 서열 번호 8의 아미노산 225 내지 아미노산 237에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
44. (a) 서열 번호 8의 아미노산 91 내지 아미노산 99에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 경쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) 서열 번호 8의 아미노산 152 내지 아미노산 161에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR1을 암호하는 뉴글레오티드 서열;

    (c) 서열 번호 8의 아미노산 176 내지 아미노산 186에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴글레오티드 서열; 및

    (d) 서열 번호 8의 아미노산 225 내지 아미노산 237에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
45. (a) 서열 번호 8의 아미노산 91 내지 아미노산 99에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 경쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) 서열 번호 8의 아미노산 152 내지 아미노산 161에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR1을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (c) 서열 번호 8의 아미노산 176 내지 아미노산 192에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 및

    (d) 서열 번호 8의 아미노산 225 내지 아미노산 237에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
46. (a) 서열 번호 8의 아미노산 91 내지 아미노산 99에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 경쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) 서열 번호 8의 아미노산 152 내지 아미노산 161에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR1을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (c) 서열 번호 7의 아미노산 179 내지 아미노산 182에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 및

    (d) 서열 번호 8의 아미노산 225 내지 아미노산 237에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR3을 암호하는 뉴글레오티드 서열로 구성된 분리된 핵산 분자.
47. 서열 번호 1의 아미노산 8 내지 아미노산 12에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 분리된 올리고펩타이드.
48. 대상 항체를 인체 C5의 분리된 알파쇄로 선별하는 단계를 포함하는 항 C5 항체의 식별 방법.
49. 대상 항체를 제47항의 분리된 올리코펩타이드로 선별하는 단계를 포함하는 항C5 항체의 식별 방법.
50. 제1항에 있어서, 항체가 인체 불변부 도메인을 함유하는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
51. (a) 서열 번호 8의 아미노산 176 내지 아미노산 192에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 가변부 중쇄 영역 CDR2를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

    (b) (a)에 상보적인 서열; 또는

    (c) (a) 및 (b)를 함유하는 분리된 핵산 분자.
52. 제36항, 제37항, 제38항, 제39항, 제40항, 제41항, 제42항, 제43항, 제44항, 제45항 또는 제51항의 핵산 분자에 의해 암호된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 단백질.
53. 제52항에 있어서, 단백질이 항 C5 항체인 분리된 단백질.
54. 벡터 함유 숙주가 제36항, 제37항, 제38항, 제39항, 제40항, 제41항, 제42항, 제43항 또는 제51항의 핵산 분자에 상응하는 제1 핵산 분자에 의해 암호되는 단백질을 발현하도록 제2 핵산 분자에 작동적으로 공유결합되어 있는 제1 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터.
55. 제54항의 핵산 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포.
56. 제55항의 재조합 숙주 세포를 증식시켜 이 숙주 세포가 핵산 분자에 의해 암호된 단백질을 발현하도록 하는 단계, 이에 따라 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하고, 이 발현된 단백질이 항 C5 항체인, 항 C5 항체를 생산하는 방법.
57. 제56항의 항 C5 항체.