RU2760582C2 - Анти-LAG-3 антитела - Google Patents
Анти-LAG-3 антитела Download PDFInfo
- Publication number
- RU2760582C2 RU2760582C2 RU2018111508A RU2018111508A RU2760582C2 RU 2760582 C2 RU2760582 C2 RU 2760582C2 RU 2018111508 A RU2018111508 A RU 2018111508A RU 2018111508 A RU2018111508 A RU 2018111508A RU 2760582 C2 RU2760582 C2 RU 2760582C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- antibody
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 266
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 266
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 266
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 260
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 222
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 194
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 133
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 77
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 claims abstract 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 1244
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 94
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 86
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 54
- 229940056913 eftilagimod alfa Drugs 0.000 claims description 49
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 48
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 46
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 44
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 41
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 32
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 31
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 31
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 28
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 13
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 7
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 5
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004362 Penile Induration Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020758 Peyronie disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060932 Postoperative adhesion Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004982 autoimmune uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 claims description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000020694 gallbladder disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027530 Meniere disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 claims description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims 2
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 claims 1
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 43
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 abstract 1
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 93
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 86
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 74
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 59
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 58
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 51
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 40
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 38
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 36
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 36
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 34
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 32
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 31
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 30
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 23
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 22
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 22
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 22
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 22
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 20
- -1 polyoxymethylenes Polymers 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 17
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 14
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 14
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 13
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 12
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 11
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 10
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100032741 SET-binding protein Human genes 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001079285 Homo sapiens Immunoglobulin heavy joining 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100028078 Immunoglobulin heavy joining 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 5
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 5
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 5
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101000843762 Homo sapiens Immunoglobulin heavy diversity 1-1 Proteins 0.000 description 4
- 101001091242 Homo sapiens Immunoglobulin kappa joining 1 Proteins 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 4
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 4
- 102100030644 Immunoglobulin heavy diversity 1-1 Human genes 0.000 description 4
- 102100034892 Immunoglobulin kappa joining 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 4
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 3
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 3
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 3
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 2
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 2
- 238000012450 HuMAb Mouse Methods 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N Lactic Acid Natural products CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108090000951 RNA polymerase sigma 70 Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 2
- 108010076570 Recoverin Proteins 0.000 description 2
- 102000018210 Recoverin Human genes 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229940070805 p-chloro-m-cresol Drugs 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920006214 polyvinylidene halide Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 2
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 2
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide group Chemical group NNC(=O)N DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- LDDMACCNBZAMSG-BDVNFPICSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-(methylamino)hexanal Chemical compound CN[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO LDDMACCNBZAMSG-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N (2s)-5-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CC[C@@H](C(O)=O)N1 KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- ICGQLNMKJVHCIR-UHFFFAOYSA-N 1,3,2-dioxazetidin-4-one Chemical compound O=C1ONO1 ICGQLNMKJVHCIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]methyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C=C1)=CC=C1CC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)-n-[4-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]butyl]propanamide Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSCCC(=O)NCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 241000242757 Anthozoa Species 0.000 description 1
- 101100490659 Arabidopsis thaliana AGP17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100388296 Arabidopsis thaliana DTX51 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000151861 Barnettozyma salicaria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150085381 CDC19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016838 Calbindin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010028310 Calbindin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010028326 Calbindin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 1
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 1
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 1
- 102100021849 Calretinin Human genes 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- DQEFEBPAPFSJLV-UHFFFAOYSA-N Cellulose propionate Chemical compound CCC(=O)OCC1OC(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C1OC1C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(COC(=O)CC)O1 DQEFEBPAPFSJLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001651 Cyanoacrylate Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000219 Ethylene vinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical group [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101001074571 Homo sapiens PIN2/TERF1-interacting telomerase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001073025 Homo sapiens Peroxisomal targeting signal 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101100273566 Humulus lupulus CCL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050358 Igkv6-17 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 241000170280 Kluyveromyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101100200099 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) rps13 gene Proteins 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 102000016349 Myosin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010067385 Myosin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- SSURCGGGQUWIHH-UHFFFAOYSA-N NNON Chemical compound NNON SSURCGGGQUWIHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010077960 Neurocalcin Proteins 0.000 description 1
- 102000010751 Neurocalcin Human genes 0.000 description 1
- 101100234604 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ace-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100049938 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) exr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241000489470 Ogataea trehalophila Species 0.000 description 1
- 241000826199 Ogataea wickerhamii Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 102100036257 PIN2/TERF1-interacting telomerase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150093629 PYK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 102000001675 Parvalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108060005874 Parvalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000530350 Phaffomyces opuntiae Species 0.000 description 1
- 241000529953 Phaffomyces thermotolerans Species 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235062 Pichia membranifaciens Species 0.000 description 1
- 241000288935 Platyrrhini Species 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 229920002367 Polyisobutene Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000012738 S100 Calcium Binding Protein G Human genes 0.000 description 1
- 108010079423 S100 Calcium Binding Protein G Proteins 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 101100215626 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100386089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MET17 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101100406813 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) pagC gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710142113 Serine protease inhibitor A3K Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000013534 Troponin C Human genes 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000775914 Valdivia <angiosperm> Species 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710194459 Visinin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038287 Visinin-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000370136 Wickerhamomyces pijperi Species 0.000 description 1
- 101000979710 Xenopus laevis Neuronal calcium sensor 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000180 alkyd Polymers 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002344 aminooxy group Chemical group [H]N([H])O[*] 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 150000001552 barium Chemical class 0.000 description 1
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 150000001621 bismuth Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 108010068032 caltractin Proteins 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229920006217 cellulose acetate butyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920001727 cellulose butyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 description 1
- 229920006218 cellulose propionate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- NLCKLZIHJQEMCU-UHFFFAOYSA-N cyano prop-2-enoate Chemical class C=CC(=O)OC#N NLCKLZIHJQEMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- UFRKOOWSQGXVKV-UHFFFAOYSA-N ethene;ethenol Chemical compound C=C.OC=C UFRKOOWSQGXVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004715 ethylene vinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000009459 flexible packaging Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003682 fluorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- XQZDWKBCGAJXLC-UHFFFAOYSA-N n-butylpropanamide Chemical compound CCCCNC(=O)CC XQZDWKBCGAJXLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000011234 negative regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000020912 omnivore Nutrition 0.000 description 1
- 244000054334 omnivore Species 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 1
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920003192 poly(bis maleimide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001490 poly(butyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920006211 poly(glycolic acid-co-trimethylene carbonate) Polymers 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 229920001849 poly(hydroxybutyrate-co-valerate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000218 poly(hydroxyvalerate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 1
- 229920002463 poly(p-dioxanone) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002432 poly(vinyl methyl ether) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002859 polyalkenylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000000622 polydioxanone Substances 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920001290 polyvinyl ester Polymers 0.000 description 1
- 229920001289 polyvinyl ether Polymers 0.000 description 1
- 229920001291 polyvinyl halide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001003 psychopharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 101150101384 rat1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150049069 rpsM gene Proteins 0.000 description 1
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012929 tonicity agent Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 108010072106 tumstatin (74-98) Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010079528 visinin Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/75—Agonist effect on antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенному агонистическому антителу против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3) и его антигенсвязывающему фрагменту, а также к содержащей его композиции. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело или его фрагмент, а также содержащие ее вектор и клетка. Изобретение эффективно для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения. 9 н. и 55 з.п. ф-лы, 31 ил., 36 табл., 23 пр.
Description
Данное изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с геном активации лимфоцитов-3 (LAG-3), в частности, антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые являются агонистами LAG-3, и применению антител или фрагментов в качестве лекарственных средств, в частности, для лечения состояний, связанных с пролиферацией и/или активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, в частности, воспалительных и аутоиммунных нарушений.
Ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3) является гомологом мембранного белка типа I CD4, содержащим четыре внеклеточных домена суперсемейства Ig. Аналогично CD4, LAG-3 олигомеризуется на поверхностях Т-клеток и связывается с молекулами МНС класса II на антигенпредставляющих клетках (АРС), но со значительно более высокой аффинностью, чем CD4. LAG-3 экспрессируется на активированных CD4-положительных и CD8-положительных Т-лимфоцитах, где он ассоциирует с комплексом CD3-TCR на клеточной поверхности и негативно регулирует сигнальную трансдукцию. Как следствие, он негативно регулирует пролиферацию, функцию и гомеостаз Т-клеток. Когда происходит распознавание комплекса МНС класса II-пептид специфическим TCR, внутриклеточные сигналы трансдуцируются в Т-клетку посредством TCR и в АРС через молекулы МНС класса II. Негативная регуляторная роль передачи сигнала LAG-3 в Т-клетки осуществляется в первичных ответах CD4 и CD8 Т-клеток человека (, et al., Immunology. 2005 Jun; 115(2): 170-178). Также, LAG-3 кодирует вариант альтернативного сплайсинга, который переводится в растворимую форму LAG-3 (sLAG-3). В виде растворимой молекулы LAG-3 активирует антигенпредставляющие клетки (АРС) путем передачи сигнала МНС класса II, что приводит к увеличению антигенспецифических Т-клеточных ответов in vivo (Triebel, Trends Immunol., 2003, 24: 619-622).
Аминокислотная последовательность человеческого и мышиного белка LAG-3 представлена на фигуре 1 в работе Huard et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997). Последовательность человеческого белка LAG-3 воспроизведена на фигуре 1 ниже (SEQ ID NO: 27). Аминокислотные последовательности четырех внеклеточных доменов суперсемейства Ig (D1, D2, D3 и D4) человеческого LAG-3 находятся в аминокислотных остатках: 1-149 (D1) (SEQ ID NO: 28); 150-239 (D2) (SEQ ID NO: 29); 240-330 (D3) (SEQ ID NO: 39); и 331-412 (D4) (SEQ ID NO: 51).
В работе Baixeras, et al. (J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337) описано получение 17B4, мышиного моноклонального антитела (изотип IgG1) к человеческому белку LAG-3. Это антитело распознает внешнюю петлю из 30 аминокислот первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3. 17 В4 ингибирует взаимодействия LAG-3/класс МНС и увеличивает пролиферацию Т-клеток в качестве антагониста передачи сигнала LAG-3 (Huard at al., Eur J Immunol. 1996;26:1180-6). Моноклональное антитело (mAb) 17B4 не обладает агонистической активностью, что определяется его неспособностью индуцировать повышение уровня внутриклеточного свободного кальция в Т-клетках в отсутствие вторичного сшивающего реагента (Hannier et al., J Immunol. 1998;161:4058-65.).
Крайне желательны агенты, способные модулировать функции активации и/или эффекторные функции CD8-положительных и CD4-положительных Т-клеток. В частности, известно, что во многие аутоиммунные нарушения вовлечены аутореактивные Т-клетки и аутоантитела. Таким образом, существует потребность в агентах, которые способны ингибировать или элиминировать аутореактивные лимфоциты, не нарушая способность иммунной системы осуществлять защиту от патогенов.
В работе Poirier et al. (Clinical and Experimental Immunology, 2011, 164: 265-274) описана оценка цитотоксического химерного антитела против LAG-3 (химерного А9Н12). In vivo антитело истощало LAG-3+-активированные Т-клетки в лимфатических узлах и показало эффективность в отношении уменьшения воспаления кожи в модели туберкулин-индуцированной гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у бабуинов. Антитела, которые специфически истощают активированные Т-клетки, представляют перспективную терапевтическую стратегию для предупреждения и/или лечения аутоиммунных нарушений.
В качестве альтернативной стратегии заявитель установил, что агонисты LAG-3 будут негативно регулировать пролиферацию и/или функцию Т-клеток без истощения Т-клеток, и что такие агонисты можно также использовать для лечения воспалительных или аутоиммунных нарушений.
Заявитель смог получить моноклональные анти-LAG-3 агонистические антитела. Эти антитела ингибируют антиген-индуцированную пролиферацию CD4-положительных и CD8-положительных Т-клеток. Такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для лечения иммунных нарушений, в частности, иммунных нарушений, опосредованных Т-клетками, включая воспалительные и аутоиммунные нарушения.
В соответствии с изобретением предлагается агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В частности, антитело представляет собой моноклональное агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Используемый здесь термин «LAG-3» относится к гену активации лимфоцитов-3. Термин «LAG-3» включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфические в отношении человеческого белка LAG-3, могут в некоторых случаях перекрестно реагировать с белком LAG-3 видов, отличных от человека. В других вариантах осуществления антитела, специфические в отношении человеческого белка LAG-3, могут быть полностью специфическими в отношении человеческого белка LAG-3 и могут не проявлять видовую или другие типы перекрестной реактивности, или могут перекрестно реагировать с LAG-3 некоторых других, но не всех других видов (например, перекрестно реагировать с LAG-3 обезьяны, но не мышиным LAG-3). Термин «человеческий LAG-3» относится к последовательности человеческого LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность человеческого LAG-3, имеющая номер доступа в Genbank NP 002277 (SEQ ID NO: 38), или аминокислотная последовательность человеческого белка LAG-3, представленная на фигуре 1 (SEQ ID NO: 27). Термин «мышиный LAG-3» относится к мышиной последовательности LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность мышиного LAG-3, имеющая номер доступа в Genbank NP_032505. В уровне техники LAG-3 также известен, например, как CD223. Последовательность человеческого LAG-3 может отличаться от поледовательности человеческого LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277, наличием, например, консервативных мутаций или мутаций в неконсервативных областях, и LAG-3 обладает по существу такой же биологической функцией, что и человеческий LAG-3, имеющий номер доступа в Genbank NP_002277. Например, биологическая функция человеческого LAG-3 заключается в наличии эпитопа во внеклеточном домене LAG-3, который специфически связан с антителом согласно настоящему изобретению, или биологической функцией человеческого LAG-3 является связывание с молекулами МНС класса II.
Термин «обезьяний LAG-3» охватывает белки LAG-3, экспрессируемые обезьянами Старого и Нового Света, включая, но без ограничения, LAG-3 макак-крабоедов и LAG-3 макак-резус. Репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой аминокислотную последовательность LAG-3 макак-резус, которая также депонирована в Genbank под номером доступа XM_001108923. Другая репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой альтернативную последовательность макак-резус клона ра23-5, описанную в US 2011/0150892 А1. Эта альтернативная аминокислотная последовательность макак-резус имеет единственное отличие в положении 419 от последовательности, депонированной в Genbank.
Конкретная последовательность человеческого LAG-3 обычно по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности человеческого LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют аминокислотную последовательность как человеческую при сравнении с аминокислотными последовательностями LAG-3 других видов (например, мышей). В некоторых случаях аминокислотная последовательность человеческого LAG-3 может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. В некоторых вариантах осуществления последовательность человеческого LAG-3 будет проявлять не более 10 аминокислотных отличий от последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. В некоторых вариантах осуществления человеческий LAG-3 может проявлять не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотного отличия от последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. Процентная идентичность может быть определена, как описано в настоящем документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления агонистическое анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
Агонистическое анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой выделенное агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Термин «агонистический» используется в настоящем документе взаимозаменяемо с термином «агонист».
Также, в соответствии с изобретением предлагается выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с LAG-3 и ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и/или антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток больше, чем антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
На фигуре 21 показаны различия между истощающими анти-LAG-3 антителами, антагонистическими анти-LAG-3 антителами и антителами согласно изобретению (то есть агонистическими анти-LAG-3 антителами и антителами, которые связываются с LAG-3 и ингибируют антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток).
Истощающее анти-LAG-3 антитело вызывает истощение активированных Т-клеток путем связывания с LAG-3, экспрессируемым на поверхности клеток. Истощение может достигаться через антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). В ADCC область Fc истощающего антитела связывается с рецепторами Fc (FcγRs) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как природные клетки-киллеры и макрофаги, что приводит к лизису клеток-мишеней. В CDC область Fc истощающего антитела связывается с C1q-компонентом комплемента, и клетка-мишень уничтожается путем запуска каскада комплемента на клеточной поверхности. Таким образом, истощающие анти-LAG-3 антитела ингибируют опосредованные Т-клетками иммунные ответы. Следует учесть, что эффекты истощающих анти-LAG-3 антител являются длительными и необратимыми, так как они вызывают деструкцию активированных Т-клеток. Такие антитела являются полезными, например, для лечения воспалительных и аутоиммунных нарушений, и для предотвращения отторжения трансплантата.
Антагонистическое анти-LAG-3 антитело связывается с LAG-3 на поверхности активированных Т-клеток и предотвращает взаимодействие LAG-3 с молекулами МНС класса II на поверхности антигенпредставляющих клеток (АРС). Это блокирует негативную регуляцию сигнальной трансдукции, что происходит, когда АРС связываются с LAG-3 на поверхности активированных Т-клетках. Соответственно, антагонистические анти-LAG-3 антитела предотвращают негативную регуляцию пролиферации, функции и гомеостаза Т-клеток, обычно опосредованную LAG-3. Такие антитела являются полезными, например, для лечения рака и инфекционного заболевания.
Антитела согласно изобретению связываются с LAG-3 на поверхности активированных Т-клеток и негативно регулируют сигнальную трансдукцию через агонизм LAG-3, вызывая негативную регуляцию пролиферации и/или активации Т-клеток.
Таким образом, антитела согласно изобретению ингибируют иммунные ответы, опосредованные Т-клетками, в частности, путем ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, и/или антиген-индуцированной активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. Эффекты таких антител являются обратимыми и могут быть менее длительными, чем эффекты истощения анти-LAG-3 антител, поскольку они не вызывают деструкции активированных Т-клеток. Следует учесть, что период времени, в течение которого антитело согласно настоящему изобретению является эффективным, будет зависеть от периода полужизни антитела в плазме.
Ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примером подходящего способа является измерение пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента, по сравнению с соответствующей пролиферацией в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. CD4+ и CD8+ Т-клетки могут присутствовать, например, в образце мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здорового донора. Пролиферацию клеток можно индуцировать любыми подходящими антигенными пептидами, такими как пул пептидов, охватывающих последовательность CMV рр35. Пролиферацию клеток можно измерить путем мечения клеток, например, флуоресцентным красителем, таким как сукцинимидильный эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE). Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток описан более подробно в примере 10 ниже.
Процентное ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено в виде процентного ингибирования индекса пролиферации (PI), рассчитанного как сумма процента CD4+ и/или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления (оцененное с помощью FACS), умноженная на число делений, как описано более подробно в примере 10 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток, каждых, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток, соответственно, в отсутствие антитела или фрагмента.
В одном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток по меньшей мере на 20% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента, и ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 30% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
Ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток антителом согласно изобретению или его фрагментом можно сравнить с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в присутствие отрицательного контрольного антитела такого же изотипа или его фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% больше, чем антитело или фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток является LAG-3-зависимым и IL-2-независимым.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток и антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
В частности, антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с LAG-3 и ингибировать антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с LAG-3 и ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную активацию CD8+ Т-клеток.
Ингибирование активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примером подходящего способа является измерение эффекта антитела или фрагмента на экспрессию маркера активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или секрецию маркера активации Т-клеток. Например, активация CD8+ Т-клеток может быть измерена путем измерения экспрессии CD25, в качестве маркера активации, на CD8+ Т-клетках, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента по сравнению с соответствующей экспрессией CD25 в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. Альтернативно, активация Т-клеток может быть измерена путем измерения секреции IFN-γ в клеточном супернатанте Т-клеток, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента, по сравнению с соответствующей секрецией в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. Т-клетки могут присутствовать, например, в образце РВМС, полученных от здорового донора. Активация клеток может быть индуцирована любыми подходящими антигенными пептидами, такими как пул пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35. Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной активации Т-клеток путем измерения секреции маркера активации Т-клеток описан более подробно в примере 15 ниже. Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной активации CD8+ Т-клеток путем измерения экспрессии маркера активации CD8+ Т-клеток описан более подробно в примере 16 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
Ингибирование антиген-индуцированной активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток антителом согласно изобретению или его фрагментом можно сравнить с антиген-индуцированной активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа или его фрагмента.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками.
IMP321 (также называемый как «LAG-3Ig» ниже) представляет собой рекомбинантный растворимый человеческий белок слияния LAG-3Ig. Белок слияния получен в виде димера с молекулярной массой 200 кДа, продуцируемого в клетках яичника китайского хомячка (СНО), трансфицированных плазмидой, кодирующей внеклеточный домен человеческого LAG-3, слитый с Fc-фрагментом IgG1 человека. Последовательность IMP321 представлена в SEQ ID NO: 17 в заявке на патент США 2011/0008331.
Связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками может быть определено путем измерения связывания конъюгата IMP321-метка (например, конъюгат IMP321-А1ех 488) с клетками Raji (которые являются МНС класса II-положительными В-клетками), например, как описано в примере 8 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%) по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 30% по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 составляет 0,1:1.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 80% по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 составляет 0,3:1 или 1:1.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует индуцированную IMP321 активацию моноцитов.
IMP321 способен активировать клетки человеческой моноцитарной клеточной линии ТНР-1. Активация клеток ТНР-1 может быть определена по уровню секреции лиганда хемокина 4 (CCL4, также известного как макрофагальный белок воспаления 1β, MIP-1β) клетками ТНР-1. Предварительную инкубацию антитела или фрагмента согласно изобретению с IMP321 перед инкубацией смеси с клетками ТНР-1 можно использовать для определения, ингибирует ли антитело или фрагмент IMP321-индуцированную активацию моноцитов. Способ определения ингибирования IMP321-индуцированной активации моноцитов описан более подробно в примере 9 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует IMP321-индуцированную активацию моноцитов по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством IMP321-индуцированной активации моноцитов в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует IMP321-индуцированную активацию моноцитов по меньшей мере на 70% по сравнению с количеством IMP321-индуцированной активации моноцитов в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 равно 1:1.
В работе Huard et al (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997) описана характеристика участка связывания МНС класса II на белке LAG-3. Многие остатки, важные для связывания белков МНС класса II, сгруппированы на основе крупной структуры внешней петли из 30 аминокислот в домене D1 LAG-3. Аминокислотная последовательность структуры внешней петли домена D1 человеческого белка LAG-3 представляет собой GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 40), подчеркнутую последовательность на фигуре 1.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом человеческого LAG-3, который перекрывается с участком связывания МНС класса II на LAG-3.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом, который перекрывается с внешней петлей из 30 аминокислот первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3.
В других вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается с последовательностью внешней петли из 30 аминокислот (SEQ ID NO: 40) первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3.
Антитело согласно изобретению может ингибировать связывание LAG-3 с молекулами МНС класса II in vivo. В частности, антитело согласно изобретению может антагонизировать МНС класса II-активирующий сигнал в антигенпредставляющие клетки (АРС). Таким образом, антитело согласно изобретению может ингибировать индуцированную LAG-3 активацию АРС, например, активацию дентритных клеток, например, индуцированную LAG-3 активацию моноцитов или макрофагов.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание LAG-3 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению со связыванием LAG-3 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует LAG-3-индуцированную активацию АРС по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством LAG-3-индуцированной активации АРС в отсутствие антитела или фрагмента.
Моноклональное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Также, в соответствии с изобретением предлагается анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: l, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5, 6, 24, 25 и 26.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, где CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, где CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.
В предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или которая является идентичной аминокислотной последовательности VH и/или VL областей мышиного моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, описанного в настоящем документе в примерах 1, 2 и 3 (аминокислотная последовательность VH 13Е2: SEQ ID NO: 7; аминокислотная последовательность VL 13Е2: SEQ ID NO: 8).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с антителом, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с мышиным моноклональным анти-LAG-3 антителом 13Е2.
Моноклональное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Также, в соответствии с изобретением предлагается анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13, 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15, 16, 34, 35 и 36.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, где CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, где CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
В предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или которая является идентичной аминокислотной последовательности VH- и VL-областей мышиного моноклонального анти-LAG-3 антитела 34F4, описанного в настоящем документе в примерах 4, 5 и 6 (аминокислотная последовательность VH 34F4: SEQ ID NO: 17; аминокислотная последовательность VL 34F4: SEQ ID NO: 18).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с антителом, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с мышиным моноклональным анти-LAG-3 антителом 34F4.
В определенных вариантах осуществления антитела согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, которые отличаются от последовательностей антитела 13Е2 или 34F4 одной или более консервативными модификациями, например, пятью консервативными модификациями. В данной области следует понимать, что могут быть сделаны определенные модификации консервативных последовательностей, которые не нарушают связывание антигена. См., например, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 и Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43.
Используемое здесь выражение «модификации консервативной последовательности» относится к аминокислотным модификациям, которые значительно не влияют или значительно не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего эту аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело согласно изобретению обычными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в пределах CDR-участков антитела согласно изобретению могут быть заменены на другие аминокислотные остатки из того же самого семейства боковых цепей, а измененное антитело можно тестировать на сохраненную функцию (то есть функции, представленные выше) с помощью функциональных анализов, описанных в настоящем документе.
Антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием антитела, имеющего одну или более последовательностей VH и/или VL 13Е2 или 34F4 в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела. Антитело может быть сконструировано путем модифицирования одного или более остатков в пределах одной или в обеих вариабельных областей (то есть VH и/или VL), например, в пределах одного или более CDR-участков и/или в пределах одной или более каркасных областей. Дополнительно или альтернативно антитело может быть сконструировано путем модифицирования остатков в пределах константной области(ей), например, с целью изменения эффекторной функции(й) антитела.
В некоторых вариантах осуществления для конструирования вариабельных областей антител может быть использована прививка CDR. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно за счет аминокислотных остатков, локализованных в шести участках, определяющих комплементарность (CDR), тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах CDR индивидуальных антител более различны между собой, чем последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, то можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструирования экспрессирующих векторов, которые включают последовательности CDR из специфического встречающегося в природе антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; патенты США 5225539; 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (то есть CDR-участки 13Е2). Несмотря на то, что такие антитела содержат CDR-последовательности VH- и VL-областей моноклонального антитела 13Е2, они могут содержать различные каркасные последовательности.
Аналогично, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязыващий фрагмент, например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 (то есть CDR-участки 34F4). Несмотря на то, что такие антитела содержат последовательности CDR VH и VL моноклонального антитела 34F4, они могут содержать различные каркасные последовательности. Такие каркасные последовательности могут быть получены из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылочных материалов, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступной в Интернете на сайте www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat et al. (1991), см. выше; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; и Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание которых специально включено в настоящий документ посредством ссылки. В качестве другого примера ДНК-последовательности зародышевой линии для генов вариабельной оласти тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных Genbank. Например, следующие последовательности зародышевой линии тяжелой цепи, обнаруженные у мыши НСо7 HuMAb, доступны в сопутствующих номерах доступа Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 и ВС070333), 3-33 (NG_0010109 и NT_024637) и 3-7 (NG_0010109 и NT_024637). В качестве другого примера, следующие последовательности зародышевой линии тяжелой цепи, обнаруженные у мышей НСо12 HuMAb, доступны в сопутствующих номерах доступа Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 и ВС070333), 5-51 (NG_0010109 и NT_024637), 4-34 (NG_0010109 и NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) и 3-23 (AJ406678).
Белковые последовательности антител сравнивали с собранной базой данных белковых последовательностей, используя один из методов поиска сходства последовательностей, называемый Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), supra), который хорошо известен специалистам в данной области.
Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, структурно сходные с каркасными последовательностями антител 13Е2 или 34F4.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH моноклонального антитела 13Е2, включают следующие гены зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VL моноклонального антитела 13Е2, включают следующие гены зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH моноклонального антитела 34F4, включают следующие гены зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VL моноклонального антитела 34F4, включают следующие гены зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
Предпочтительными каркасными последовательностями тяжелой цепи для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, которые структурно сходны с каркасными последовательностями, кодируемыми геном V зародышевой линии IGHV8-8*01, IGHV8-11*01 или IGHV8-12*01, особенно IGHV8-8*01. Предпочтительными каркасными последовательностями легкой цепи для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, которые структурно сходны с каркасными последовательностями, кодируемыми геном V зародышевой линии IGKV6-17*01, IGKV6-25*01 или IGKV6-23*01, особенно IGKV6-17*01.
Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL могут быть привиты на каркасные области, которые имеют последовательность, идентичную последовательности, обнаруженной в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена указанная последовательность, или такие последовательности CDR могут быть привиты на каркасные области, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях предпочтительно осуществлять мутацию остатков в каркасных областях для сохранения или усиления антигенсвязывающей способности данного антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370).
Другим типом модификации вариабельной области является мутирование аминокислотных остатков в пределах участков CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VL для улучшения одного или более свойств связывания (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез или PCR-опосредованный мутагенез может быть выполнен для введения мутации (мутаций), и действие на связывание антител или другое представляющее интерес функциональное свойство может быть оценено в анализах in vitro или in vivo, описанных в настоящем документе и представленных в примерах. Предпочтительно вводят консервативные модификации (описанные выше). Такими мутациями могут быть замены, добавления или делеции аминокислот, но предпочтительно являются замены. Кроме того, обычно изменяют не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков в пределах CDR-участка. В некоторых вариантах осуществления в общей сложности изменяют не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков для всех шести CDR-участков.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательностью, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или его вариант, в котором не более одного, двух, трех, четырех или пяти аминокислотных остатков изменены путем замены, добавления или делеции аминокислот в пределах последовательностей CDR.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательностью, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
его вариант, в котором не более одного, двух, трех, четырех или пяти аминокислотных остатков изменены путем замены, добавления или делеции аминокислот в пределах последовательностей CDR.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1 -участок VH, имеющий SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 1; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 2; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 3; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 4; (b) CDR2-участок VL, содержащий SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 5; и (с) CDR3-участок VL, содержащий SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 11; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 12, или аминокислотную последовательность, имеющую одно, два, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 12; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 13; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 14; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 15, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 15; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 16, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 16.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 21, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 21; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 22, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 22; и (с) а CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 23, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 23; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1 -участок VL, имеющий SEQ ID NO: 24, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 24; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 25, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 25; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 26, или или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 26.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 31, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 31; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 32, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 32; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 33, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 33; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 34, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 34; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 35, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 35; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 36, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 36.
Сконструированные антитела согласно изобретению включают антитела, в которых модификации были произведены в каркасных остатках в VH и/или VL, например, для улучшения свойств данного антитела. Обычно такие каркасные модификации производят для уменьшения иммуногенности антитела. Например, одним подходом является «обратное мутирование» одного или более каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой получено данное антитело.
Другой тип модификации каркаса включает мутацию одного или более остатков в каркасной области или даже в одном или более CDR-участках для удаления эпитопов Т-клеток для уменьшения таким образом потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход также называют «деиммунизацией», и он описан более подробно в публикации патента США 20030153043.
В качестве допонения или альтернативы модификациям, произведенным в каркасных областях или CDR-участках, антитела согласно изобретению могут быть сконструированы таким образом, что они включают модификации в Fc-области, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антиген-независимая клеточноопосредованная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно изобретению может быть также химически модифицировано (например, к антителу могут быть присоединены одна или более химических групп), или может быть модифицировано для изменения его гликозилирования, опять для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждый из указанных вариантов осуществления описан более подробно ниже. Нумерация остатков в Fc-области является нумерацией EU-индекса Кабата.
В одном варианте осуществления шарнирная область домена CF11 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменено, например, увеличено или уменьшено. Такой подход описан дополнительно в патенте США 5677425. Количество остатков цистеина в шарнирной области домена CF11 изменяют, например, для облегчения сборки легких или тяжелых цепей, или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.
В другом варианте осуществления шарнирную область Fc антитела мутируют для повышения или уменьшения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в области контакта доменов CF12-CF13 Fc-шарнирного фрагмента таким образом, что данное антитело имеет нарушенное связывание стафилококкового белка A (SpA) по сравнению со связыванием нативного Fc-шарнирного домена с SpA. Такой подход описан более подробно в патенте США 6165745.
В другом варианте осуществления антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полужизни. Класс IgG является наиболее стабильным и имеет период полужизни в сыворотке 20 дней, тогда как IgM и IgA он продолжается только 5-8 дней (Brekke & Sandlie, 2003, Nature Reviews Drug Discovery 2, 52-62). Возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375. Альтернативно, для увеличения биологического периода полужизни антитело может быть изменено в пределах области CF11 или CL таким образом, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора реутилизации, образованный из двух петель CF12-домена Fc-области IgG, как описано в патентах США 5869046 и 6121022.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент должно быть лишено антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), таким образом, что антитело или фрагмент может быть использовано для негативного регулирования пролиферации и/или функции Т-клеток без истощения Т-клеток в результате ADCC или CDC.
В ADCC, Fc-область антитела связывается с Fc-рецепторами (FcγRs) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как естественные киллеры и макрофаги, что приводит к лизису клеток-мишеней. В CDC Fc-область связывается с компонентом C1q комплемента и клетки-мишени уничтожаются путем запуска каскада комплемента на клеточной поверхности. Активность ADCC и CDC антитела зависит от его изотипа. Как IgM, так и IgG могут опосредовать фиксацию комплемента, тогда как только IgG может способствовать антитело-зависиомой клеточной цитотоксичности (ADCC). Изоформы IgG проявляют различные уровни CDC и ADCC:
IgG: CDC (hIgG3>hIgG1>hIgG2>hIgG4; mIgG2a>mIgG1);
ADCC (hIgG1≥hIgG3>hIgG2≥IgG4; mIgG2a>mIgG1).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент IgG1 мыши или IgG4 человека, чтобы гарантировать, что антитело или фрагмент не имеют активности ADCC и CDC.
Активность ADCC и CDC антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента может быть определена с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примеры подходящих анализов активности CDC и ADCC описаны в WO 2008/132601 и ниже.
Анти-LAG-3 антитело, проявляющее CDC-активность, будет последовательно уничтожать LAG-3+ клетки в присутствии комплемента по сравнению с его изотипическим контролем.
Для тестирования CDC клетки-мишени, используемые для оценки анти-LAG-3 антитела, могут представлять собой трансфицированную LAG-3 клеточную линию или первичные Т-клетки, активированные для индукции экспрессии LAG-3. Например, в одном возможном анализе для тестирования CDC клетками-мишенями являются LAG-3+ клетки СНО по сравнению с клетками wt СНО (wt, дикого типа). Оба типа клеток (то есть клетки, экспрессирующие LAG-3, и эквивалентные клетки, не экспрессирующие LAG-3), инкубировали в течение 1 часа при 37°С либо с тестируемым анти-LAG-3 антителом, либо с его изотипически сходным отрицательным контрольным антителом и кроличьей сывороткой, содержащей активный комплемент. Затем оценивали жизнеспособность клеток с использованием флуоресцентного красителя 7-амино-актиномицина D (7-AAD), метящего клетки, которые утратили целостность своей мембраны, явление, которое появляется быстро после смерти. Процент 7-AAD-положительных клеток СНО (то есть мертвых клеток-мишеней) определяли методом проточной цитометрии. Антитело, проявляющее активность CDC, будет уничтожать только клетки LAG-3+ (например, LAG-3+ клетки СНО) в присутствии комплемента. анти-LAG-3 антитело можно титровать, чтобы определить эффективность антитела для активации CDC при низкой концентрации антитела.
Анализ CDC может быть также выполнен на РВМС, стимулированных суперантигеном SEB. Цитотоксичность тестируемого антитела анализировали как на активированных (а именно CD25+/LAG-3+ клетках), так и неактивированных (а именно CD25-/LAG-3- клетках) CD4+ хелперных Т- и CD8+ цитотоксических Т-клетках. Только активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки специфически уничтожались антителом, проявляющим CDC.
При тестировании ADCC РМВС стимулировали в течение одного дня с помощью IL-2 для использования в качестве эффекторных клеток, и LAG-3-экспрессирующие клетки (например, LAG-3+ клетки СНО) метили витальным красителем CFSE для использования в качестве клеток-мишеней. В присутствии тестируемого анти-LAG-3 антитела, если эффекторные клетки (РВМС) способны уничтожать значительный процент LAG-3-экспрессирующих клеток (например, LAG-3+ клеток СНО) по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, то указанное тестируемое антитело проявляет ADCC. Этот эффект должен увеличиваться с количеством эффекторных клеток. Тестируемое антитело может быть титровано для определения эффективности антитела для индукции ADCC при низкой концентрации антитела.
Тестируемое анти-LAG-3 антитело можно рассматривать как не проявляющее CDC или ADCC, когда оно уничтожает менее чем вдвое больше LAG-3+ клеток по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом в любом из анализов, описанных выше.
Гибель клеток-мишеней используется в классических биологических анализах ADCC, в которых используют донорские мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или субпопуляцию естественных клеток-киллеров (NK) в качестве эффекторных клеток. Однако эти клетки могут варьировать по ответу и могут привести к высоким показаниям фона. В анализе ADCC Reporter Bioassay, доступном от фирмы Promega, используется альтернативное считывание в более ранней точке на пути активации ADCC: активации транскрипции генов посредством пути NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток) в эффекторной клетке. Кроме того, в анализе ADCC Reporter Bioassay используются сконструированные клетки Jurkat, стабильно экспрессирующие FcγRIIIa-рецептор, вариант V158 (с высоким сродством) и элемент ответа NFAT, управляющий экспрессией люциферазы светлячка, в качестве эффекторных клеток. Биологическую активность антител в ADCC количественно определяли посредством люциферазы, продуцируемой в результате активации пути NFAT; активность люциферазы в эффекторной клетке количественно оценивали с помощью считывания люминесценции. Используя этот анализ, сигнал является высоким, а фоновый уровень в анализе является низким. Удовлетворительный ответ в анализе достигается только в случае присутствия клеток-мишеней с правильным поверхностным антигеном, правильным специфическим антителом и эффекторными клетками, экспрессирующими FcγRIIIa. В случае отсутствия одного из перечивленного выше, ответа нет.
При оценке ADCC-активности антитела с использованием ADCC Reporter Bioassay, тестируемое антитело можно считать не проявляющим ADCC, когда измеренное увеличение биолюминесценции в два раза меньше, чем изотипически сходного отрицательного контрольного антитела.
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность IgG4 Fc с мутацией S228P для отмены обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(A) для химерного антитела Chim13E2IgG4 содержащего последовательность 13E2IgG4mut тяжелой цепи).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит С-часть человеческой каппа-цепи иммуноглобулинов Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(B) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемая для человеческого мутанта IgG4 Fc, описанного выше, представляет собой стандартную нумерацию Eu-индекса как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
В еще одном варианте осуществления модификации подвергается гликозилирование антитела. Например, может быть получено дегликозилированное антитело (то есть антитело, не имеющее гликозилирования). Гликозилирование может быть подвергнуто изменениям, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие модификации углеводного состава могут осуществляться, например, изменением одного или более сайтов гликозилирования в аминокислотной последовательности антитела. Например, может быть проведено замещение одного или более аминокислотных остатков, которое приводит к уничтожению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельных областей, чтобы тем самым устранить гликозилирование по этому сайту. Такое дегликозилирование может увеличивать сродство антитела к антигену. См., например, патенты США 5714350 и 6350861.
Другой модификацией антител по настоящей заявке, которая рассматривается в настоящем изобретении, является пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения его биологического (например, в сыворотке) времени полужизни. Для осуществления пегилирования антитела это антитело или его фрагмент, как правило, вводят во взаимодействие с полиэтиленгликолем (PEG), например, реакционноспособным сложным эфиром или альдегидным производным PEG, в условиях, при которых одна или более групп PEG присоединяются к антителу или его фрагменту. Предпочтительно пегилирование выполняют с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Предполагается, что используемый здесь термин «полиэтиленгликоль» охватывает любую из форм PEG, которые применялись для получения производных других белков, таких как моно (С1-С10)алкокси или арилокси полиэтиленгликоли или полиэтиленгликольмалеимид. В некоторых вариантах осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой дегликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области, и они могут быть применены для пегилирования антител согласно изобретению. См., например, европейские патенты ЕР 0154316 и ЕР 0401384.
Антитело согласно изобретению может представлять собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Термины «антитело» и «иммуноглобулин» охватывают антитела или иммуноглобулины любого изотипа, фрагменты антител, сохраняющие специфическое связывание с антигеном, включая, но без ограничения, фрагменты Fab, Fv, scFv и Fd, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (scAb), однодоменные антитела (dAb), однодоменные антитела тяжелой цепи, однодоменные антитела легкой цепи, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела и белки слияния, содержащие антиген-связывающую (также называемую здесь как антиген связывающую) часть антитела и белка, не являющегося антителом. Также, термин охватывает Fab', Fv, F(ab')2 и/или другие фрагменты антител, которые сохраняют специфическое связывание с антигеном, и моноклональные антитела. Антитело может быть моновалентным или бивалентным. Антитело может представлять собой мономер Ig, который представляет собой «Y-образную» молекулу, которая состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепей, связанных дисульфидными связями. Антитела могут быть помечены детектируемой меткой, например, радиоизотопом, ферментом, образующим детектируемый продукт, флуоресцентным белком и т.п. Антитела также могут быть конъюгированы с другими молекулами, как-то членами специфически связывающихся пар, например, биотином (член специфически связывающейся пары биотин-авидин) и др. Антитела также могут быть связаны с твердой подложкой, включая, но без ограничения, полистирольные планшеты или частицы, и т.п.
«Фрагменты антител» содержат части интактного антитела, например, связывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); доменные антитела (dAb; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab» фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный «Fc» фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих сайта и все еще способен вызывать перекрестное сшивание антигена.
«Fv» представляет наименьший фрагмент антител, который содержит сайт распознавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи, тесно связанных нековалентными связями. Именно в этой конфигурации взаимодействуют три CDR-участка каждого вариабельного домена, составляя антигенсвязывающий участок на поверхности димера VH-VL. Все вместе эти шесть CDR-участков придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR-участка, специфических в отношении антигена) обладает способностью к распознаванию и связыванию антигена, хотя и с меньшим сродством, чем полный участок связывания.
Фрагмент «Fab» также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1 тяжелой цепи, в том числе одного или более цистеинов из шарнирной области антител. В настоящем документе Fab'-SH обозначает такие Fab'-фрагменты, в которых остаток (остатки) цистеина в константных доменах содержат свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител первоначально были получены в виде пары Fab'-фрагментов, содержащих между ними шарнирные цистеины. Известны также и другие химические конъюгаты фрагментов антител.
«Легкие цепи» антител из любого вида позвоночных могут относиться к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотной последовательности их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей иммуноглобулины могут относиться к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Подклассы могут дополнительно подразделяться на типы, например, IgG2a и IgG2b.
«Одноцепочечные Fv» или «sFv» или «scFv» фрагменты антител содержат домены VH и VL антител, при этом эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fv, кроме того, содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который дает возможность sFv образовывать требуемую для связывания антигена структуру. Для обзора sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, слишком короткого, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, создавая при этом два антигенсвязывающих участка. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Используемое здесь «моноклональное антитело» представляет собой антитело, продуцируемое группой идентичных клеток, все из которых были получены из одной клетки путем повторной клеточной репликации. То есть клон клеток производит только один вид антител. Несмотря на то, что моноклональное антитело может быть получено с использованием технологии получения гибридомы, могут быть также использованы другие способы получения, известные специалистам в данной области, (например, антитела, полученные из библиотек фагового дисплея антител).
Используемый здесь термин «CDR» или «участок, определяющий комплементарность» служит для обозначения несмежных антигенсвязывающих центров, находящихся в вариабельых областях полипептидов тяжелой и легкой цепи. CDR-участки описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (также называемые здесь как Kabat 1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) (also referred to herein as Chothia 1987); и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996). Дополнительной системой является система нумерации International ImMunoGeneTics (IMGT) (Lefranc et al., Nucleic Acids Research 27:209-212 (1999)). Определения включают перекрывающиеся или подгруппы аминокислотных остатков при сравнении их друг с другом. Тем не менее применение любого из этих определений в отношении CDR антител или привитых антител либо их вариантов должно быть в рамках термина, определенного и используемого здесь. Аминокислотные остатки, охватывающие CDR-участки, определенные в каждой из указанных выше ссылок, представлены ниже для сравнения в таблице 1. CDR-участки, перечисленные в таблице 4 в примере 2 и в таблице 9 в примере 5. были определены в соответствии с Lefranc 1999, и Kabat 1991.
Используемые здесь термины «CDR-L1», «CDR-L2» и «CDR-L3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам в вариабельной области легкой цепи. Используемые здесь термины «CDR-H1», «CDR-H2» и «CDR-Н3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам в вариабельной области тяжелой цепи. Используемые здесь термины «CDR-1», «CDR-2» и «CDR-3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам каждого вариабельного домена цепи.
Используемый здесь термин «аффинность» относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов (например, антитела и антигена) и выражается в виде константы диссоциации (Kd). Аффинность может быть по меньшей мере в 1 раз больше, по меньшей мере в 2 раза больше, по меньшей мере в 3 раза больше, по меньшей мере в 4 раза больше, по меньшей мере в 5 раз больше, по меньшей мере в 6 раз больше, по меньшей мере в 7 раз больше, по меньшей мере в 8 раз больше, по меньшей мере в 9 раз больше, по меньшей мере в 10 раз больше, по меньшей мере в 20 раз больше, по меньшей мере в 30 раз больше, по меньшей мере в 40 раз больше, по меньшей мере в 50 раз больше, по меньшей мере в 60 раз больше, по меньшей мере в 70 раз больше, по меньшей мере в 80 раз больше, по меньшей мере в 90 раз больше, по меньшей мере в 100 раз больше или по меньшей мере в 1000 раз больше, или более, чем аффинность антитела к неродственным аминокислотным последовательностям. Аффинность антитела к белку-мишени может составлять, к примеру, примерно от 100 нМ (наномолярная концентрация) до 0,1 нМ, примерно от 100 нМ до 1 пМ (пикомолярная концентрация), или примерно от 100 нМ до 1 фМ (фемтомолярная концентрация) или более. Используемый здесь термин «авидность» относится к устойчивости комплекса из двух или более агентов к диссоциации после разбавления. Термины «иммунореактивный» и «предпочтительно связывается» применяются взаимозаменяемо в настоящем документе в отношении антител и/или антигенсвязывающих фрагментов.
Термин «связывание» относится к прямой ассоциации между двумя молекулами благодаря, например, ковалентным, электростатическим, гидрофобным и ионным взаимодействиям и/или водородным связям, включая такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики. Антитело согласно изобретению специфически связывается с эпитопом в пределах белка LAG-3, в частности, человеческого белка LAG-3. «Специфическое связывание» относится к связыванию с аффинностью по меньшей мере около 5×10-7 M или больше, например, 10-7 М, 5×10-8 M, 10-8 M или больше. «Неспецифическое связывание» относится к связыванию с аффинностью менее чем около 10-7 М, например, связыванию с аффинностью 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M и т.д. Как используется в настоящем документе, антитело, которое «специфически связывается с человеческим LAG-3 », относится к антителу, которое связывается с человеческим белком LAG-3 (и возможно белком LAG-3 от одного или более других видов, отличных от человека), но практически не связывается с белками, отличными от белка LAG-3. Предпочтительно антитело связывается с человеческим белком LAG-3 с «высокой аффинностью», а именно, с Kd 1×10-7 M или менее, более предпочтительно 1×10-8 M или менее, более предпочтительно 5×10-9 M или менее, более предпочтительно 1×10-9 M или менее.
Используемое здесь выражение «практически не связывается» с белком или клетками означает не связывается или не связывается с высокой аффинностью с белком или клетками, то есть связывается с белком или клетками с Kd 1×10-6 M или более, более предпочтительно 1×10-5 M или более, более предпочтительно 1 χ 10-4 M или более, более предпочтительно 1×10-3 M или более, даже более предпочтительно 1×10-2 M или более.
Используемый здесь термин «Kassoc» или «Ka» относится к константе скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как используемый здесь термин «Kdis» или «Kd» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Используемый здесь термин «KD» относится к константе диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ka (то есть Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (М).
Термин «высокоаффинное» в отношении антитела IgG относится к антителу, имеющему KD 1×10-7 M или менее, более предпочтительно 5×10-8 M или менее, даже более предпочтительно 1×10-8 M или менее, даже более предпочтительно 5×10-9 M или менее и даже более предпочтительно 1×10-9 M или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокоаффинное» связывание может меняться для других изотипов антител. Например, «высокоаффинное» связывание для IgM изотипа относится к антителу, имеющему KD 10-6 M или менее, более предпочтительно 10-7 M или менее, даже более предпочтительно 10-8 M или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с белком LAG-3 человека с более высокой аффинностью (то есть с более низкой константой диссоциации), чем антагонистическое анти-LAG-3 моноклональное антитело 17 В4 (Baixeras, et al., J. Exp.Med., 1992, Vol.176: 327-337). В примере 7 ниже описаны результаты анализа Biacore связывания антитела 17 В4 с белком LAG-3Ig человека. Результаты показали, что константа диссоциации 17 В4 для LAG-3Ig человека составила 3,69 нМ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или белком LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) менее 3,69 нМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или его производным, таким как белок LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) не более 3,5 нМ, не более 2,5 нМ, не более 2 нМ, не более 1 нМ, не более 0,9 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,7 нМ, не более 0,6 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,4 нМ, не более 0,3 нМ, не более 0,2 нМ, не более 0,1 нМ. В некоторых вариантах осуществления анти-LAG-3 антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека с KD не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ, не более 20 пМ, не более 10 пМ, не более 9 пМ, не более 8 пМ, не более 7 пМ, по не более 6 пМ, не более 5 пМ, не более 4 пМ, не более 3 пМ, не более 2 пМ или не более 1 пМ.
В примере 20 ниже описаны результаты анализа Biacore связывания химерного антитела IgG4 13Е2 (описанного ниже) и гуманизированного IgG4 13Е2 (описанного ниже) с белком LAG-3Ig человека. Результаты показали, что константа диссоциации химерного антитела IgG4 13Е2 для LAG-3Ig человека составила 21,9 пМ, а гуманизированного 13Е2 IgG4 для LAG-3Ig человека - 22,8 пМ.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или белком LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ, или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
В некоторых вариантах осуществления аффинность антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента может быть по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% более высокой, чем аффинность 17 В4 в отношении белка LAG-3 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 3 или 3,5 раз превышать аффинность 17 В4 в отношении белка LAG-3 человека.
Аффинность антитела в отношении белка LAG-3 человека может быть определена специалистом в данной области, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore (Murphy et al, Using Biacore to measure the binding kinetics of an antibody-antigen interaction; Curr Protoc Protein Sci. 2006 Sep; Chapter 19:Unit 19.14). Например, анализ Biacore может быть использован для определения константы диссоциации между антителом согласно изобретению и белком LAG-3 человека.
Связывание с LAG-3 человека может быть оценено с использованием одного или более других методик, также хорошо известных в данной области. Например, антитело может быть подвергнуто тестированию с помощью анализа методом проточной цитометрии, в котором антитело взаимодействует с клеточной линией, экспрессирующей LAG-3 человека, такой как клетки СНО, которые были трансфицированы для экспрессии LAG-3 человека на своей клеточной поверхности. Другие подходящие клетки для использования в анализах методом проточной цитометрии включают SEB-стимулированные РВМС, или анти-CD3-стимулированные CD4+ активированные Т-клетки, которые экспрессируют нативный LAG-3. Еще другие подходящие анализы связывания включают анализы ELISA, например, с использованием рекомбинантного белка LAG-3.
Антитело согласно изобретению представляет собой выделенное антитело. «Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено, и/или извлечено из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают (1) до более чем 90%, более чем 95% или более чем 98% по массе антитела, что определяют по методу Лоури, например, до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент природного окружения антитела. В некоторых случаях выделенное антитело будет получено посредством по меньшей мере одной стадии очистки.
В предпочтительных вариантах осуществления антитело согласно изобретению представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности, гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать гуманизированную каркасную область легкой цепи и/или гуманизированную каркасную область тяжелой цепи.
Используемый в настоящем документе термин «гуманизированное антитело» относится к иммуноглобулину, содержащему части иммуноглобулинов разного происхождения, при этом по меньшей мере одна часть содержит аминокислотные последовательности человеческого происхождения. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения с необходимой специфичностью, такого как мышь, и из последовательностей иммуноглобулина человеческого происхождения (например, иммуноглобулин), соединенные вместе химически обычными способами (например, синтетическими) или полученные в виде непрерывного полипептида с использованием методов генной инженерии (например, ДНК, кодирующая белковые части химерного антитела, может быть экспрессирована для получения непрерывной полипептидной цепи). Другим примером гуманизированного иммуноглобулина является иммуноглобулин, содержащий одну или более цепей иммуноглобулина, содержащих CDR-участок, полученный из антитела нечеловеческого происхождения, и каркасную область, полученную из легкой и/или тяжелой цепи человеческого происхождения (например, CDR-привитые антитела с изменениями или без изменений каркаса). Химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела также охвачены термином гуманизированный иммуноглобулин. См., например, Cabilly et al., патент США 4816567; Cabilly et al., Европейский патент 0125023 B1; Boss et al., патент США 4816397; Boss et al., Европейский патент 0120694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., Европейский патент 0194276 B1; Winter, патент США 5225539; Winter, Европейский патент 0239400 B1; Padlan, E. A. et al., Европейская заявка на патент 0519596 A1. См., также, Ladner et al., патент США 4946778; Huston, патент США 5476786; и Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), касающиеся одноцепочечных антител.
Термин «химерное антитело» относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, и последовательности константной области получены из другого вида, таким как антитело, в котором последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела и последовательности константной области получены из антитела человека. Аминокислотная последовательность вариабельной области может быть идентична аминокислотной последовательности вариабельной области видов, из которых она получена (например, мышиная последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична этой последовательности вариабельной области. Например, аминокислотная последовательность вариабельной области химерного антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеций, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеций, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области видов, из которых она получена.
Аналогично, аминокислотная последовательность константной области может быть идентична аминокислотной последовательности константной области видов, из которых она получена (например, человеческая последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности этой константной области. Например, аминокислотная последовательность константной области химерного антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеции, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеции, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью константной области видов, из которых она получена.
Например, как описано выше, аминокислотная последовательность Fc шарнирной области химерного антитела может быть мутирована, чтобы уменьшить биологический период полужизни антитела, или аминокислотная последовательность Fc-области может быть мутирована, чтобы увеличить биологический период полужизни химерного антитела.
Например, в некоторых вариантах осуществления химерных антител согласно изобретению последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит или получена из мышиного антитела, и последовательность константной области тяжелой цепи содержит или получена из последовательности Fc IgG4. В других вариантах осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи содержит или получена из мышиного антитела, и последовательность константной области легкой цепи содержит или получена из последовательности человеческой С цепи каппа Ig (IgK).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность Fc IgG4 с мутацией S228P для отмены обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(A) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность тяжелой цепи 13E2IgG4mut).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит часть С цепи каппа человеческого Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(B) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемая для человеческого мутанта Fc IgG4, описанного выше, представляет собой стандартную нумерацию индекса Eu, как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием синтетических и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения генов (например, кДНК), кодирующих желательную гуманизированную цепь. Например, последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК), кодирующие гуманизированные вариабельные области, могут быть сконструированы с использованием способов PCR-мутагенеза для изменения последовательностей ДНК, кодирующих человеческую или гуманизированную цепь, такую как темплат ДНК, из ранее гуманизированной вариабельной области (см., например, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); и Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Используя эти или другие подходящие методы, могут быть также получены варианты. Например, клонированные вариабельные области могут быть подвергнуты мутагенезу, и могут быть выбраны последовательности, кодирующие варианты с требуемой специфичностью (например, из фаговой библиотеки; см., например, Krebber et al., U.S. Pat. No. 5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, published Apr. 1, 1993)).
Используемый здесь термин «каркас» применительно к вариабельной области антитела служит для обозначения всех аминокислотных остатков вне участков CDR в пределах вариабельной области антитела. Каркас вариабельной области обычно представляет собой прерывистую аминокислотную последовательность длиной примерно 100-120 аминокислот, но к нему относятся только те аминокислоты, которые находятся вне участков CDR. Используемый здесь термин «каркасный участок» служит для обозначения тех участков каркаса, которые разделены участками CDR.
Гуманизация каркасной области(ей) снижает риск появления антител, вызывающих реакцию на человеческое антимышиное антитело (НАМА) у людей. Признанные в данной области способы определения иммунного ответа могут быть выполнены для контроля ответа HAMA у конкретного пациента или во время клинических испытаний. Пациенты, которым вводили гуманизированные антитела, могут быть оценены на иммуногенность вначале и во время проведения терапии. Ответ НАМА измеряют, например, путем детекции антител к гуманизированному терапевтическому реагенту в образцах сыворотки от пациентов с использованием способа, известного в данной области, включая технологию поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE) и/или твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA). Во многих случаях гуманизированное антитело согласно изобретению по существу не вызывает ответ НАМА у субъектов-людей.
Определенные аминокислоты остатков каркаса вариабельной области человека выбирают для замены исходя из их возможного влияния на CDR-конформацию и/или связывание с антигеном. Неестественное сочленение мышиных CDR-участков с человеческой вариабельной каркасной областью может привести к неестественным конформационным ограничениям, которые, при отсутствии коррекции путем замены определенных аминокислотных остатков, приводят к утрате афинности связывания.
Выбор аминокислотных остатков для замены может быть определен, в частности, путем компьютерного моделирования. Компьютерное аппаратное обеспечение и программное обеспечение для получения трехмерных изображений молекул иммуноглобулина известно в данной области. Как правило, молекулярные модели создают, начиная от разрешенных структур для иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Цепи для моделирования сравнивали по сходству аминокислотной последовательности с цепями или доменами разрешенной трехмерной структуры, и цепи или домены, демонстрирующие наибольшее сходство последовательностей, выбирают в качестве отправной точки для конструирования молекулярной модели. Для моделирования выбирают цепи или домены, обладающие по меньшей мере 50% идентичностью последовательности, например, такие цепи или домены, которые обладают по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности или более. Разрешенные начальные структуры моделируют таким образом, чтобы допустить различия между фактическими аминокислотами в цепях иммуноглобулина или доменах, которые моделируются, и таковыми в начальной структуре. Модифицированные структуры затем компонуют в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняется по минимизации энергии и по проверке того, что все атомы находятся в пределах соответствующих расстояний один от другого, и что длины связей и углы находятся в химически допустимых пределах.
CDR и каркасные области могут быть определены согласно ссылке Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Альтернативное структурное определение было предложено Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); и J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (совместно называемые как "Chothia"). Когда каркасные остатки, как определено Kabat выше, представляют собой структурные остатки петли, как определено Chothia выше, аминокислоты, присутствующие в мышином антителе, могут быть выбраны для замены в гуманизированное антитело. Остатки, которые «прилегают к CDR-участку», включают аминокислотные остатки в положениях, расположенных непосредственно рядом с одним или более CDR в первичной последовательности цепи гуманизированного иммуноглобулина, например, в положениях, непосредственно прилегающих CDR, как определено Kabat, или CDR, как определено Chothia (см., например, Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987)). Особенно вероятно, что эти аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в CDR-участках и, если выбраны из акцептора, деформируют донорские CDR и снижают аффинность. Кроме того, соседние аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (Amit et al., Science, 233:747 (1986)) и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для сохранения всех контактов с антигеном, которые обеспечивают аффинность исходного антитела. Альтернативно, CDR и каркасные области могут быть такими, как определено MacCallum et al., или Lefranc et al. (смотри выше таблицу 1).
В некоторых случаях гуманизированная каркасная область VH или каркасная область VL представляет собой консенсусную гуманизированную каркасную область. Консенсусная гуманизированная каркасная область может представлять наиболее широко встречающийся аминокислотный остаток при селекции каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его фрагмент содержит один или более гуманизированных каркасных участков (FR). В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два, три или четыре FR-участка легкой цепи, которые были гуманизированы. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, как описано в настоящем документе; и гуманизированный FR4 легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 выбраны из: SEQ ID NO: 4 и 24 (CDR-L1); SEQ ID NO: 5 и 25 (CDR-L2); и SEQ ID NO: 6 и 26 (CDR-L3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 выбраны из: SEQ ID NO: 14 и 34 (CDR-L1); SEQ ID NO: 15 и 35 (CDR-L2); и SEQ ID NO: 16 и 36 (CDR-L3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два, три или четыре FR-участка тяжелой цепи, которые были гуманизированы. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, как описано в настоящем документе; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из следующих: SEQ ID NO: I и 21 (CDR-H1); SEQ ID NO: 2 и 22 (CDR-H2); и SEQ ID NO: 3 и 23 (CDR-H3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из следующих: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из: SEQ ID NO: 11 и 31 (CDR-H1); SEQ ID NO: 12 и 32 (CDR-H2); и SEQ ID NO: 13 и 33 (CDR-H3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
Примеры подходящих гуманизированных каркасных последовательностей включают:
вариант 1 VH (VH1)
VH1 FR1: QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 52);
VH1 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 53);
VH1 FR3: RLTISKDTSKSQVILNMTNMDPVDTATYYC (SEQ ID NO: 54); и
VH1 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 55);
вариант 2 VH (VHi)
VH2 FR1: QITLKESGPALVKPTQTLTLTCSFS (SEQ ID NO: 56);
VH2 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 57);
VH2 FR3: RLTISKDTSKNQVVLTMANMDPVDTATYYC (SEQ ID NO: 58);
VH2 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 59);
вариант 3 VH (VH3)
VH3 FR1: QITLKETGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 60);
VH3 FR2: WIRQPPGKALEWVT (SEQ ID NO: 61);
VH3 FR3: RVTIRKDTSKNQVALTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 62);
VH3 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63);
вариант 4 VH (VH4)
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66);
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67);
вариант 1 VL (VLi)
VL1 FR1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 68);
VL1 FR2: WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 69);
VL1 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 70); и
VL1 FR4: FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 71);
вариант 2 VL (VL2)
VL2 FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 72);
VL2 FR2: WYQQKPGQAPKLLIF (SEQ ID NO: 73);
VL2 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTLSSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 74); и
VL2 FR4: FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 75);
вариант 3 VL ГУЪз)
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 78); и
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 79);
вариант 4 VL (VLt)
VL4 FR1: EIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 80);
VL4 FR2: WYQQKAGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 81);
VL4 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 82); и
VL4 FR4: FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 83).
На фигуре 22 показаны последовательности вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VH и вариантов 1-4 VL, выровненные с соответствующей последовательностью исходного мышиного антитела 13Е2. Последовательности CDR выделены серым цветом. Изменения в гуманизированных каркасных последовательностях вариантов по сравнению с исходной мышиной последовательностью показаны подчеркнутыми и выделенными жирным шрифтом. Измененные остатки в гуманизированной последовательности для каждого варианта также показаны в таблице 26 (последовательности тяжелой цепи) и 27 (последовательности легкой цепи) в примере 18.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело согласно изобретению (или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит гуманизированную тяжелую цепь, которая содержит любую из аминокислотных замен, показанных для VH1, VH2, VH3 или VH4 в таблице 26, и/или гуманизированную легкую цепь, которая содержит любую из аминокислотных замен, показанных для VL1, VL2, VL3 или VL4 в таблице 27.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать любую из вышеуказанных гуманизированных каркасных последовательностей (SEQ ID NO: 52-83), или любую комбинацию вышеуказанных гуманизированных каркасных последовательностей (SEQ ID NO: 52-83).
В некоторых вариантах осуществления гуманизированная каркасная область тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из: SEQ ID NO: 52, 53, 54 или 55; любой из SEQ ID NO: 56, 57, 58 или 59; любой из SEQ ID NO: 60, 61, 62 или 63; или любой из SEQ ID NO: 64, 65, 66 или 67.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать:
каркасную область 1 VH I (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 52; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 53; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 54; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 55;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 56; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 57; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 58; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 59;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 60; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 61; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 62; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 63; или
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 64; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 65; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 66; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 67.
Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления гуманизированная каркасная область легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из: SEQ ID NO: 68, 69, 70 или 71; любой из SEQ ID NO: 72, 73, 74 или 75; любой из SEQ ID NO: 76, 77, 78 или 79; или любой из SEQ ID NO: 80, 81, 82 или 83.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать:
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 68; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 69; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 70; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 71;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 72; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 73; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 74; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 75;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 76; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 77; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 78; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 79; или
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 80; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 81; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 82; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 83.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать любую из следующих комбинаций гуманизированных каркасных последовательностей:
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL4;
FR1 -FR4 VH2; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH2; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH2; и FR1-FR4 VL3;
FR1 -FR4 VH2; и FR1 -FR4 VL4;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL4;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL4.
В конкретном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит следующие гуманизированные каркасные последовательности:
FR1 VH4: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
FR2 VH4: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
FR3 VH4: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66); и
FR4 VH4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67); и
FR1 VL3: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 76);
FR2 VL3: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 77);
FR3 VL3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 78); и
FR4 VL3: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 79).
В конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; или
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
В конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84.
Альтернативно или дополнительно, в конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент сдержит область VL антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
В конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85.
В следующем конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
Альтернативно или дополнительно, в конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; или
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83. В некоторых случаях рассматриваемое антитело содержит константную область иммуноглобулина (например, Fc-область). В некоторых вариантах осуществления Fc-область, в случае присутствия, представляет собой человеческую Fc-область. Если присутствуют константные области, антитело может содержать константные области легкой цепи и тяжелой цепи.
Подходящие константные области тяжелой цепи включают СН1, шарнирную, СН2, СН3 и СН4 области.
Примером подходящей Fc-области тяжелой цепи является Fc-область изотипа IgG4 человека. Константные области легкой цепи могут представлять собой лямбда или каппа. Рассматриваемое антитело (например, рассматриваемое гуманизированное антитело) может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессироваться в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены с помощью спейсера.
В некоторых случаях область тяжелой цепи может представлять собой область изотипа IgG4. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену S241P. См., например, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену L236E (или L235E, с использованием нумерации EU; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication No. 91-3242). См., например, Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925; и Klechevsky et al. (2010) Blood 116:1685. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену S241P и замену L236E.
Аминокислотная последовательность константной области может быть идентична аминокислотной последовательности константной области видов, из которых она получена (например, человеческая последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична этой аминокислотной последовательности константной области. Например, аминокислотная последовательность константной области антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеций, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеций, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью константной области видов, из которых она получена.
Например, как описано выше, аминокислотная последовательность Fc шарнирной области антитела согласно изобретению может быть мутирована для уменьшения биологического времени полужизни антитела, или аминокислотная последовательность Fc-области может быть мутирована для увеличения биологического времени полужизни антитела.
Необходимо обеспечить, чтобы антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент было лишено антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), чтобы антитело или фрагмент можно быть использовать для негативного регулирования пролиферации и/или функции Т-клеток без истощения Т-клеток в результате ADCC или CDC.
Например, в некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит человеческую последовательность Fc-области IgG4 дикого типа.
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность Fc IgG4 с мутацией S228P для устранения обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(А) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность тяжелой цепи 13E2IgG4mut).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит С-часть каппа-цепи Ig (IgK) человека дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(В) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемых для человеческого мутанта Fc IgG4, описанного выше, представляет стандартную нумерацию индекса EU, как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication №91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
Рассматриваемое антитело может содержать свободную тиольную (-SH) группу на карбоксильном конце, при этом свободная тиольная группа может быть использована для присоединения антитела ко второму полипептиду (например, другому антителу, включая рассматриваемое антитело), каркасу, носителю и т.д.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит одну или более не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота содержит карбонильную группу, ацетильную группу, аминооксигруппу, гидразиновую группу, гидразидную группу, семикарбазидную группу, азидную группу или алкиновую группу. См., например, патент США 7632924, где описаны типичные не встречающиеся в природе аминокислоты. Включение неприродной аминокислоты может обеспечивать присоединение к полимеру, второму полипептиду, каркасу и т.п. Например, рассматриваемое антитело, соединенное с водорастворимым полимером, можно получить путем реакции водорастворимого полимера (например, PEG), содержащего карбонильную группу, с антителом, содержащим неприродную аминокислоту, содержащую аминоокси, гидразиновую, гидразидную или семикарбазидную группу. В качестве другого примера, рассматриваемое антитело, соединенное с водорастворимым полимером, можно получить путем реакции рассматриваемого антитела, содержащего алкинсодержащую аминокислоту, с водорастворимым полимером (например, PEG), содержащим азидную группу; в некоторых вариантах осуществления азидная или алкиновая группа соединяется с молекулой PEG амидной связью. «Не встречающаяся в природе аминокислота» означает такую аминокислоту, которая не является одной из 20 распространенных аминокислот или пирролизином, или селеноцистеином. Другие термины, которые могут применяться как синонимы термину «не встречающаяся в природе аминокислота» - это «не природная аминокислота», «неприродная аминокислота», «аминокислота не природного происхождения» и различные их варианты с написанием через дефис и без него. Термин «не встречающаяся в природе аминокислота» также включает, но без ограничения, аминокислоты, возникающие при модификации (например, посттрансляционной модификации) аминокислот природного происхождения (включая, но без ограничения, 20 распространенных аминокислот или пирролизин и селеноцистеин), но сами они не встраиваются трансляционным комплексом в растущую полипептидную цепь. Примеры таких не встречающихся в природе аминокислот включают, но без ограничения, N-ацетилглюкозаминил-L-серин, N-ацетилглюкозаминил-L-треонин и O-фосфотирозин.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело связано (например, ковалентно связано) с полимером (например, полимером, отличным от полипептида). Подходящими полимерами являются, например, биосовместимые полимеры и водорастворимые биосовместимые полимеры. Подходящие полимеры включают синтетические полимеры и полимеры природного происхождения. Подходящие полимеры включают, например, замещенные или незамещенные линейные или разветвленные полиалкиленовые, полиалкениленовые или полиоксиалкиленовые полимеры либо разветвленные или неразветвленные полисахариды, например, гомо- или гетерополисахариды. Подходящие полимеры включают, например, сополимеры этилена и винилового спирта (широко известные под общим названием EVOH или под торговой маркой EVAL); полибутилметакрилат; поли(гидроксивалерат); поли(L-молочную кислоту); поликапролактон; поли(лактид-ко-гликолид); поли(гидроксибутират); поли(гидроксибутират-ко-валерат); полидиоксанон; полиортоэфир; полиангидрид; поли(гликолевую кислоту); поли(D,L-молочную кислоту); поли(гликолевую кислоту-ко-триметиленкарбонат); полифосфоэфир; полифосфоэфир уретана; поли(аминокислоты); цианоакрилаты; поли(триметиленкарбонат); поли(иминокарбонат); сополимеры простых и сложных эфиров (например, сополимеры поли(этиленоксида)-поли(молочной кислоты) (PEO/PLA); полиалкиленоксалаты; полифосфазены; биомолекулы, такие как фибрин, фибриноген, целлюлоза, крахмал, коллаген и гиалуроновая кислота; полиуретаны; силиконы; сложные полиэфиры; полиолефины; сополимеры полиизобутилена и этилен-альфа-олефинов; акриловые полимеры и сополимеры; винилгалидные полимеры и сополимеры, такие как поливинилхлорид; поливиниловые простые эфиры, такие как поливинилметиловый эфир; поливинилиденгалиды, такие как поливинилиденфторид и поливинилиденхлорид; полиакрилонитрил; поливинилкетоны, поливиниловые ароматические полимеры, такие как полистирол; поливиниловые сложные эфиры, такие как поливинилацетат; сополимеры виниловых мономеров друг с другом и олефинами, такие как сополимеры этилена и метилметакрилата, сополимеры акрилонитрила и стирола, ABS-смолы и сополимеры этилена и винилацетата; полиамиды, такие как Nylon 66 и поликапролактам; алкидные смолы; поликарбонаты; полиоксиметилены; полиимиды; полиэфиры; эпоксидные смолы; полиуретаны; вискозу; триацетат вискозы; целлюлозу; ацетат целлюлозы; бутират целлюлозы; ацетат-бутират целлюлозы; целлофан; нитрат целлюлозы; пропионат целлюлозы; эфиры целлюлозы; аморфный тефлон; поли(этиленгликоль); и карбоксиметилцеллюлозу.
Подходящие синтетические полимеры включают незамещенный и замещенный линейный или разветвленный поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) и их производные, например, замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль), и его производные. Подходящие природные полимеры включают, например, альбумин, амилозу, декстран, гликоген и их производные.
Средняя молекулярная масса подходящих полимеров может составлять от 500 Да до 50000 Да, например, от 5000 Да до 40000 Да, или от 25000 Да до 40000 Да. Например, в некоторых вариантах осуществления, в которых рассматриваемое антитело содержит полимер поли(этиленгликоль) (PEG) или метоксиполи(этиленгликоль), этот полимер PEG или метоксиполи(этиленгликоль) может иметь молекулярную массу в диапазоне примерно от 0,5 килодальтон (кДа) до 1 кДа, примерно от 1 кДа до 5 кДа, от 5 кДа до 10 кДа, от 10 кДа до 25 кДа, от 25 кДа до 40 кДа или от 40 кда до 60 кДа.
Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело ковалентно связано с непептидным синтетическим полимером. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело ковалентно связано с полимером PEG. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый мультимер scFv ковалентно связан с полимером PEG. См., например, Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Methods 310:100. Способы и реагенты, подходящие для пегилирования белка, хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в патенте США 5849860.
PEG, подходящий для конъюгирования с белком, как правило, растворим в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу R(O-CH2-CH2)nO-R, где R представляет собой водород или защитную группу, такую как алкильная или алканольная группа, и где п представляет целое число от 1 до 1000. Когда R является защитной группой, то обычно он содержит от 1 до 8 атомов углерода.
В некоторых вариантах осуществления PEG, конъюгированный с рассматриваемым антителом, является линейным. В некоторых вариантах осуществления PEG, конъюгированный с рассматриваемым антителом, является разветвленным. Разветвленные производные PEG описаны в патенте США 5643575, «звездчатые PEG» и многолучевые PEG описаны в каталоге Shearwater Polymers, Inc. "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998". Звездчатые PEG описаны в данной области, включая, например, патент США 6046305.
Рассматриваемое антитело может быть гликозилировано, например, рассматриваемое антитело может содержать ковалентно связанный углеводный или полисахаридный фрагмент. Гликозилирование антител обычно бывает N-связанным или O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серина и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из Сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя могут быть также использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования в антитело удобным образом осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть осуществлено путем добавления или замены одним или более остатками серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов O-связанного гликозилирования). Аналогичным образом, удаление сайтов гликозилирования может быть осуществлено путем модификации аминокислот в природных сайтах гликозилирования антитела.
Рассматриваемое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит «рентгеноконтрастную» метку, например, метку, которую можно легко визуализировать, например, с помощью рентгеновских лучей. Рентгеноконтрастные материалы хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее распространенными рентгеноконтрастными материалами являются соли иода, брома или бария. Также известны и другие рентгеноконтрастные материалы, которые включают, но без ограничения, органические производные висмута (см., например, патент США 5939045), рентгеноконтрастные мультиуретаны (см. патент США 5346981), висмуторганические композиты (смотри, например, патент США 5256334), рентгеноконтрастные мультимерные комплексы бария (см., например, патент США 4866132), и т.п.
Рассматриваемое антитело может быть ковалентно связано со второй молекулой (например, липидом, полипептидом, отличным от рассматриваемого антитела, синтетическим полимером, углеводом и т.п.) при помощи, например, глутаральдегида, гомобифункционального сшивающего реагента, или гетеробифункционального сшивающего реагента. Глутаральдегид сшивает полипептиды посредством своих аминогрупп. Гомобифункциональные сшивающие реагенты (например, гомобифункциональный имидоэфир, гомобифункциональный N-гидроксисукцинимидиловый (NHS) эфир или гомобифункциональный реагирующий с сульфгидрилами сшивающий реагент) содержат два или более идентичных реакционноспособных фрагмента и могут быть использованы в одностадийных реакциях, в которых сшивающий реагент добавляется в раствор, содержащий смесь полипептидов, подлежащих сшиванию. Гомобифункциональный NHS-эфир и имидоэфиры сшивают аминосодержащие полипептиды. При слегка щелочном рН имидоэфиры реагируют только с первичными аминами с образованием имидоамидов и не влияют на общий заряд сшитых полипептидов. Гомобифункциональные реагирующие с сульфгидрилами сшивающие реагенты включают бисмалеимидгексан (ВМН), 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB) и 1,4-ди-(3',2'-пиридилдитио)пропионамидобутан (DPDPB).
Гетеробифункциональные сшивающие реагенты содержат два или более различных реакционноспособных фрагментов (например, реагирующий с амином фрагмент и реагирующий с сульфгидрилом фрагмент) и сшиваются с одним из полипептидов через реагирующий с амином или сульфгидрилом фрагмент, а затем реагируют с другим полипептидом через непрореагировавший фрагмент. Существует множество гетеробифункциональных галогенацетильных сшивающих реагентов, а также пиридилдисульфидных сшивающих реагентов. Карбодиимиды являются классическим примером гетеробифункциональных сшивающих реагентов для конъюгирования карбоксилов с аминами, что дает амидную связь.
Рассматриваемое антитело может быть иммобилизовано на твердой подложке. Подходящие подложки хорошо известны в данной области и содержат, в частности, коммерчески доступные колоночные материалы, полистиреновые шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или силиконовые чипы и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, дурациты, лунки реакционных планшетов (например, многолуночных планшетов), пластиковые пробирки и т.д. Твердая подложка может включать любые из целого ряда веществ, включая, например, стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природную и модифицированную целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Подходящие способы иммобилизации рассматриваемого антитела на твердой подложке хорошо известны и включают, но без ограничения, ионные, гидрофобные, ковалентные взаимодействия и т.п. Твердые подложки могут быть растворимыми или нерастворимыми, например, в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления подходящая твердая подложка обычно нерастворима в водном растворе.
Рассматриваемое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит детектируемую метку. Подходящие детектируемые метки включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Подходящие метки включают, но без ограничения, магнитные частицы (например, Dynabeads™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцанат, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок и т.п.), радиоактивные метки (например, 3H, 125I, 35S, 14C или 32P), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, люцифераза и другие широко используемые в ферментном иммуносорбентном анализе (ELISA)) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото, или цветные стеклянные или пластиковые (например, полистирольные, полипропиленовые, латексные и т.д.) шарики.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит контрастное вещество или радиоизотоп, при этом контрастное вещество или радиоизотоп является подходящим для применения в визуализации, например, процедурах видуализации, проводимых на человеке. Неограничивающие примеры меток включают радиоизотоп, такой как 1231I (иод), 18F (фтор), 99Tc (технеций), 111In (индий) и 67Ga (галлий), и контрастное вещество, такое как гадолиний (Gd), диспрозий и железо.
Радиоактивные изотопы Gd (153Gd) также являются доступными и подходящими для процедур визуализации на млекопитающих, не относящихся к человеку.
Рассматриваемое антитело может быть мечено с использованием стандартных методов. Например, рассматриваемое антитело может быть йодировано с использованием хлорамина Т или 1,3,4,6-тетрахлор-3а,6а-дифенилгликоурила. При фторировании фтор добавляют к рассматриваемому антителу в ходе синтеза путем реакции замещения ионов фтора. См. обзоры по синтезу белков с такими радиоизотопами: Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) и Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 16(2):209-244 (1999). Рассматриваемое антитело также может быть мечено контрастным веществом при помощи стандартных методов. Например, рассматриваемое антитело может быть мечено Gd путем конъюгирования с антителом низкомолекулярных хелатов Gd, таких как Gd-диэтилентриаминпентауксусная кислота (GdDTPA) или Gd-тетраазациклододекантетрауксусная кислота (GdDOTA). См., Caravan et al., Chem. Rev. 99:2293-2352 (1999) и Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985). Рассматриваемое антитело может быть мечено Gd, например, путем конъюгирования с антителом хелатов полилизин-Gd. См., например, Curtet et al.. Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998). Альтернативно, рассматриваемое антитело может быть мечено Gd путем инкубации парамагнитных полимеризованных липосом, содержащих липид-хелатор Gd, с авидином и биотинилированным антителом. См., например, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998).
Подходящие флуоресцентные белки, которые могут быть присоединены к рассматриваемому антителу, включают, но без ограничения, зеленый флуоресцентный белок из Aequoria victoria или его мутант или производное, например, как описано в патентах США 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304; например. Enhanced GFP, многие такие GFP, которые являются коммерчески доступными, например, от фирмы Clontech, Inc.; красный флуоресцентный белок; желтый флуоресцентный белок; любой из различных флуоресцентных и окрашенных белков из видов Anthozoan, как описано, например, в работе Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973; и т.п.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело конъюгировано с терапевтическим средством. Любое из рассматриваемых антител, описанных здесь, может быть использовано для образования конъюгата антитело-агент. Агент может быть присоединен к N-концу легкой цепи, С-концу легкой цепи, N-концу тяжелой цепи или С-концу тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления агент присоединен к шарнирной области антитела или к одному или более другим участкам на антителе. Для одноцепочечного антитела агент может быть присоединен к N- или С-концу одноцепочечного антитела. Агент может быть конъюгирован к антителу напрямую или посредством линкера с использованием методик, известных специалистам в данной области. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Примеры таких терапевтических агентов (например, для применения в терапии) известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело будет связано (например, ковалентно или не ковалентно) с партнером по слиянию, например, лигандом; эпитопной меткой; пептидом; белком, отличным от антитела; и т.п. Подходящие партнеры по слиянию включают пептиды и полипептиды, которые наделяют повышенной стабильность in vivo (например, увеличенным временем полужизни в сыворотке); обеспечивают легкость очистки, например, (His)n, например, 6His, и т.п.; обеспечивают секрецию белка слияния из клетки; обеспечивают эпитопную метку, например, GST, гемагглютинин (НА; например, YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 41), FLAG (например, DYKDDDDK; SEQ ID NO: 42), c-myc (например, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 43), и т.п.; обеспечивают детектируемый сигнал, например, фермент, генерирующий детектируемый продукт (например, β-галактозидаза, люцифераза), или белок, который сам является детектируемым, например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок и т.д.; обеспечивают мультимеризацию, например, домен мультимеризации, такой как Fc-часть иммуноглобулина; и т.п.
Слияние может также охватывать домен аффинности, включая пептидные последовательности, которые могут взаимодействовать с партнером по связыванию, например, иммобилизованным на твердой подложке, применяющимся для идентификации или очистки. Последовательные единичные аминокислоты, такие как гистидин, при слиянии с белком могут быть использованы для одностадийной очистки белка слияния путем высокоаффинного связывания со смолой на колонке, такой как никелевая сефароза. Типичными доменами аффинности являются His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 44), HisX6 (НННННН) (SEQ ID NO: 45), c-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 46), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 42), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 47), гемагглютинин, например, НА-Tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 41), глутатинон^-трансфераза (GST), тиоредоксин, целлюлозосвязывающий домен, RYIRS (SEQ ID NO: 48), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 49), хитин-связывающий домен, S-пептид, T7 пептид, домен SH2, С-концевой РНК-тег, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO: 50), металлсвязывающие домены, например, цинк-связывающие домены или кальций-связывающие домены, такие как домены кальций-связывающих белков, например, кальмодулин, тропонин С, кальцинейрин В, легкая цепь миозина, рековерин, S-модулин, визинин, VILIP, нейрокальцин, гиппокальцин, фреквенин, калтрактин, большая субъединица кальпаина, белок S100, парвальбумин, кальбиндин D9K, кальбиндин D28K, и кальретинин, интеины, биотин, стрептавидин, MyoD, последовательности лейциновой «молнии», и мальтозосвязывающий белок.
В отношении нуклеотидной и аминокислотной последовательнотей термин «идентичный» или «идентичность» означает степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот при оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делениями.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений, разделяемых последовательностями (то есть % идентичности = количеству идентичных положений/общее количество положений, умноженному на 100%), с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которое требуется для введения для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма, как описано ниже.
Процент идентичности между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваемой последовательностью нуклеиновой кислоты представляет собой величину «идентичности», выраженную в виде процента, которую рассчитывают с помощью алгоритма BLASTN, когда рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты имеет 100% запрашиваемое покрытие с запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты после выполнения попарного выравнивания BLASTN. Такие попарные выравнивания BLASTN между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваеомой последовательностью нуклеиновой кислоты выполняли путем использования параметров по умолчанияю алгоритма BLASTN, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute без фильтрации областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемая нуклеотидная последовательность может быть описана с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной в одном или более пунктах формулы изобретения в настоящем документе.
Процент идентичности между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью представляет собой величину «идентичностей», выраженную в виде процента, который рассчитывают с помощью алгоритма BLASTP, когда рассматриваемая аминокислотная последовательность имеет 100% запрашиваемое покрытие с запрашиваемой аминокислотной последовательностью после выполнения попарного выравнивания BLASTP. Такие попарные выравнивания BLASTN между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваеомой аминокислотной последовательностью выполняли путем использования параметров по умолчанияю алгоритма BLASTN, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute без фильтрации областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемая нуклеотидная последовательность может быть описана с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной в одном или более пунктах формулы изобретения в настоящем документе.
Способы получения рассматриваемого антитела
Рассматриваемое антитело может быть получено с помощью любого известного способа, например, стандартными методами синтеза белков; методами рекомбинантной ДНК; и др. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело получали с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из рекомбинантного получения и химического синтеза.
Когда рассматриваемое антитело представлено одноцепочечным полипептидом, его можно синтезировать при помощи стандартных методов химического синтеза пептидов. Когда полипептид синтезирован химическим способом, то синтез может происходить в жидкой фазе или твердой фазе. Твердофазный синтез полипептидов (SPPS), при котором С-концевая аминокислота данной последовательности фиксируется на нерастворимой подложке, после чего последовательно добавляются остальные аминокислоты из последовательности, является примером подходящего способа химического синтеза рассматриваемого антитела. Для синтеза рассматриваемого антитела подходят различные формы SPPS, такие как Fmoc и Вое. Методы твердофазного синтеза описаны в Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al.. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984); а также Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 и Camarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8. Вкратце, небольшие нерастворимые пористые шарики обрабатываются функциональными звеньями, из которых строятся пептидные цепи. После многократных циклов присоединения/деблокирования свободный N-концевой амин прикрепленного к твердой фазе пептида конъюгируют с одним N-блокированным аминокислотным звеном. Затем это звено деблокируют, открывая новый N-концевой амин, к которому может присоединяться следующая аминокислота. Пептид остается иммобилизованным на твердой фазе и подвергается процессу фильтрации, после чего его отщепляют.
Для получения рассматриваемого антитела могут быть использованы стандартные рекомбинантные методы. Например, в экспрессионные векторы вводятся нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, необязательно связанные с константными областями. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном и том же или в разных экспрессионных векторах. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально соединяют с контрольными последовательностями в экспрессионном векторе(ах), обеспечивающими экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Контролирующие экспрессию последовательности включают, но без ограничения, промоторы (например, собственные или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы, репрессорные элементы и последовательности терминации транскрипции. Контролирующие экспрессию последовательности могут быть представлены эукариотическими системами промоторов в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева (например, клетки COS или СНО). После встраивания вектора в подходящего хозяина, хозяина содержат в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей и для извлечения и очистки антител.
Вследствие вырожденности генетического кода каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулинов могут кодировать различные нуклеотидные последовательности. Требуемые последовательности нуклеиновых кислот могут быть получены посредством твердофазного синтеза ДНК de novo, полимеразной цепной реакции (PCR) или мутагенеза ранее полученного варианта данного полинуклеотида. Опосредованный олигонуклеотидами мутагенез является примером подходящего способа получения вариантов замен, делеций и вставок в ДНК искомого полипептида. См., Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Вкратце, ДНК искомого полипептида подвергается изменению путем гибридизации олигонуклеоида, кодирующего требуемую мутацию, с одноцепочечной ДНК матрицы. После гибридизации с помощью ДНК-полимеразы синтезируется полная вторая комплементарная цепь матрицы, содержащая олигонуклеотидный праймер, которая и кодирует выбранное изменение в ДНК искомого полипептида.
Подходящие экспрессионные векторы обычно реплицируются в организмах хозяев в виде эписом, либо как часть, вошедшая в состав хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат селекционные маркеры (например, устойчивости к ампициллину, устойчивости к гигромицину, устойчивости к тетрациклину, устойчивости к канамицину или неомицину), позволяющие обнаружить клетки, трансформированные требуемой последовательностью ДНК.
Escherichia coli является примером прокариотических клеток-хозяев, которые можно использовать для клонирования полинуклеотида, кодирующего рассматриваемое антитело. Другие подходящие для этого хозяева-микробы включают бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia, и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических организмах можно получать экспрессионные векторы, которые должны будут содержать контролирующие экспрессию последовательности, совместимые с клеткой-хозяином (например, начало репликации). Кроме того, будет присутствовать любое число различных хорошо известных промоторов, таких как система лактозных промоторов, система триптофановых (trp) промоторов, промотора бета-лактамазы или промоторов фага лямбда. Промотры будут, как правило, контролировать экспрессию, необязательно с последовательностью оператора, и содержать последовательности сайта связывания с рибосомой и др. для инициации и завершения транскрипции и трансляции.
Для экспрессии применимы также и другие микроорганизмы, такие как дрожжи. Примерами подходящих дрожжевых клеток-хозяев являются Saccharomyces (например, S. cerevisiae) и Pichia с соответствующими векторами, содержащими контролирующие экспрессию последовательности (например, промоторы), начало репликации, последовательности терминации и др., как потребуется. Типичными промоторами являются промоторы 3-фосфоглицераткиназы и других гликолитических ферментов. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают, среди прочего, промоторы алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы.
Наряду с микроорганизмами, для экспрессии и продукции анти-LAG-3 антитела согласно настоящему изобретению (например, полинуклеотиды, кодирующие рассматриваемое анти-LAG-3 антитело) можно использовать и клетки млекопитающих (например, клетки млекопитающих, выращенные в культуре клеток in vitro). См. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Подходящими клетками-хозяевами млекопитающих являются линии клеток СНО, различные линии клеток Cos, клетки HeLa, линии клеток миеломы и трансформированные В-клетки или гибридомы. Экспрессионные векторы для этих клеток могут включать контролирующие экспрессию последовательности, такие как начало репликации, промотор и энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), и необходимые для процессинга сайты, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминаторов транскрипции. Примерами подходящих контролирующих экспрессию последовательностей являются промоторы, происходящие из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовирусов, бычьего вируса папилломы, цитомегаловируса и др. См. Со et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). В других способах антитела согласно изобретению могут быть получены у мышей (см., например, Laffleur et al. "Production of human or humanized antibodies in mice", Methods Mol Biol. 2012;901:149-59).
После синтеза (химического или рекомбинантного) целые антитела, их димеры, индивидуальные легкие и тяжелые цепи или другие формы рассматриваемого антитела (например, scFv и др.) могут быть очищены согласно стандартным процедурам, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, гель-электрофореза и др. (см., как правило, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Рассматриваемое антитело может быть по существу очищенным, например, по меньшей мере примерно на 80-85%, по меньшей мере примерно 85-90%, по меньшей мере примерно на 90-95% или на 98-99%, или больше, например, свободным от таких загрязнений, как клеточный дебрис, макромолекулы, отличные от рассматриваемого антитела и т.д. Молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессионные векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рассматриваемое антитело, может быть функционально связана с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые дают возможность экспрессии нуклеотидной последовательности в предполагаемых клетках-мишенях (например, клетке, которая является генетически модифицированной для синтеза кодируемого антитела).
Подходящие промоторные и энхансерные элементы известны в данной области. Подходящие промоторы для применения в прокариотических клетках-хозяевах включают, но без ограничения, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; промотор Т3; промотор Т5; промотор лямбда Р; промотор trp; промотор lac-оперона; гибридный промотор, например, гибридный промотор lac/tac, гибридный промотор tac/trc, промотор trp/lac, промотор Т7/lac; промотор trc; промотор tac и т.п.; промотор gpt; промотор araBAD; т vivo регулируемые промоторы, такие как промотор ssaG или родственный промотор (см., например, публикацию патент США 20040131637), промотор pagC (Pulkkinen and Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), промотор nirB (Harbome et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813) и т.п.{см., например, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; и Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); промотор сигма 70, например, консенсусный промотор сигма 70 (см., например, GenBank, номера доступа АХ798980, АХ798961 и АХ798183); промотор стационарной фазы, например, промотор dps, промотор spv и т.п.; промотор, происходящий из острова патогенности SPI-2 (см., например, W096/17951); промотор actA (см., например, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); промотор rpsM (см., например, Valdivia и Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367); промотор tet (см., например, Hillen, W. и Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds). Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); промотор SP6 (см., например, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); и т.п. Подходящие сильные промоторы для использования в прокариотах, таких как Escherichia coli, включают, но без ограничения, Trc, Tac, Т5, Т7 и Pbambda. Неограничивающие примеры операторов для использования в бактериальных клетках-хозяевах включают оператор промотор лактозы (LacI репрессорный белок изменяет конформацию при контакте с лактозой, тем самым предотвращая связывание репрессорного белка Lad с оператором), оператор промотор триптофана (при образовании комплекса с триптофаном репрессорный белок TrpR имеет конформацию, которая связывается с оператором; в отсутствие триптофана репрессорный белок TrpR имеет конформацию, которая не связывается с оператором) и оператор промотор tac (см., например, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25).
В некоторых вариантах осуществления, например, для экспрессии в клетках дрожжей, подходящий промотор представляет собой конститутивный промотор, такой как промотор ADH1, промотор PGK1, промотор ENO, промотор PYK1 и т.п.; или регулируемый промотор, такой как промотор GAL1, промотор GAL10, промотор ADH2, промотор РН05, промотор CUP1, промотор GAL7, промотор МЕТ25, промотор МЕТ3, промотор CYC1, промотор HIS3, промотор ADH1, промотор PGK, промотор GAPDH, промотор ADC1, промотор TRP1, промотор URA3, промотор LEU2, промотор ENO, промотор ТР1 и АОХ1 (например, для использования в Pichia).
Для экспрессии в эукариотической клетке подходящие промоторы включают, но без ограничения, промотор легкой и/или тяжелой цепей гена иммуноглобулина и энхансерные элементы; промотор гена немедленного раннего ответа цитомегаловируса; тимидин киназа вируса простого герпеса; ранний и поздний промоторы SV40; промотор, присутствующий в длинных концевых повторах ретровируса; промотор мышиного металлотионеина-1; и различные известные в данной области тканеспецифические промоторы.
Отбор подходящего вектора и промотора находится в компетенции специалиста в данной области.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рассматриваемое антитело, может присутствовать в экспрессионном векторе и/или клонирующем векторе. В настоящем изобретении предлагается рекомбинантный вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рассматриваемое антитело в векторе клонирования. В настоящем изобретении также предлагается рекомбинантная молекула, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рассматриваемое антитело, функционально связанное с соответствующей регуляторной последовательностью(ями) в экспрессионном векторе для обеспечения экспрессии кодируемого антитела. Когда рассматриваемое антитело содержит два отдельных полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие два полипептида, могут быть клонированы в один и тот же или отдельные векторы с образованием одной или более рекомбинантных молекул. Рекомбинантная молекула может включать селектируемый маркер, начало репликации и другие отличительные признаки, которые обеспечивают репликацию и/или сохранение рекомбинантной молекулы.
Большое количество подходящих векторов и промоторов известно специалистам в данной области; многие являются коммерчески доступными для создания рассматриваемой рекомбинантной молекулы. Следующие векторы представлены в качестве примера. Бактериальные: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 и pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Эукариотические: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia).
Экспрессионные векторы, как правило, имеют сайты рестрикции, расположенные возле последовательности промотора для обеспечения вставки нуклеотидных последовательностей, кодирующих гетерологичные белки. Может присутствовать селектируемый маркер, функциональный в хозяине экспрессии. Подходящие векторы экспрессии включают, но без ограничения, вирусные векторы. Примеры вирусных векторов включают, но без ограничения, вирусные векторы на основе: вируса осповакцины; полиовируса; аденовируса (см., например, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655); аденоассоциированного вируса (см., например, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; и Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; вируса простого герпеса; ретровирусного вектора (например, вирус лейкемии мышей, вирус некроза селезенки и векторы, полученные из ретровирусов, таких как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы мышей Харви, вирус лейкоза птиц, вирус иммунодефицита человека (см., например, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999), миелопролиферативный вирус саркомы мышей и вирус опухоли молочной железы); и т.п.
Как отмечалось выше, рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-LAG-3 антитело согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR-участки тяжелой и легкой цепей рассматриваемого антитела 13Е2 или 34F4. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR-участки тяжелой и легкой цепей рассматриваемого антитела, где CDR-кодирующие последовательности перемежаются с FR-кодирующими нуклеотидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления FR-кодирующие нуклеотидные последовательности представляют собой человеческие FR-кодирующие нуклеотидные последовательности. Клетки-хозяева
В настоящем изобретении предлагаются выделенные генетически модифицированные клетки-хозяева (например, клетки in vitro), которые являются генетически модифицированными рассматриваемой молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая выделенная генетически модифицированная клетка-хозяин может продуцировать рассматриваемое антитело. Такая клетка называется рекомбинантной клеткой. Рекомбинантная клетка содержит рекомбинантную молекулу, кодирующую рассматриваемое антитело.
Подходящие клетки-хозяева включают эукариотические клетки-хозяева, такие как клетку млекопитающего, клетку насекомого-хозяина, клетку дрожжей; и прокариотические клетки, такие как бактериальная клетка. Введение рассматриваемой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина может быть достигнуто, например, путем осаждения фосфатом кальция, опосредованной декстраном DEAE трансфекции, опосредованной липосомой трансфекции, электропорации или другого известного способа.
Подходящие клетки млекопитающего включают первичные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающего включают человеческие клеточные линии, нечеловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мыши, крысы) и т.п. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но без ограничения, клетки HeLa (например. Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) No. CCL-2), клетки CHO (например, ATCC No. CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, ATCC No. CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3Т3 (например, ATCC No. CRL-1658), клетки Huh-7, клетки ВПК (например, ATCC No. CCL10), клетки РС12 (ATCC No. CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (ATCC No. CRL1651), клетки RAT1, мышиные клетки L (ATCC No. CCL1.3), человеческие эмбриональные клетки почек (ПЕК) (ATCC No. CRL1573), клетки HLHepG2, и т.п. В некоторых случаях клетки представляют собой клетки HEK. В некоторых случаях клетки представляют собой клетки CHO, например, клетки СНО-K1 (ATCC No. CCL-61), клетки СНО-М, клетки CHO-DG44 (АТСС No. PTA-3356) и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку COS. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку 293. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
Подходящие клетки дрожжей включают, но без ограничения, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Saccharomyces. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Pichia.
Подходящие прокариотические клетки включают, но без ограничения, любые из разнообразных лабораторных штаммов Escherichia coli. Bacillus (например, В. subtilis), Lactobacillus sp., и т.п. См., например. Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; патент США 6447784; и Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Обычно лабораторный штамм представляет собой штамм, который является непатогенным. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Bacillus subtilis. Композиции
В настоящем описании представлены композиции, содержащие рассматриваемое антитело. Композиция рассматриваемого антитела, наряду с рассматриваемым антителом, может содержать одно или более из следующего: соль, например, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 и т.д.; буферный агент, например, фосфатный буфер, цитратный буфер, трис-буфер, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновую кислоту) (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), натриевую соль 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS) и т.п.; солюбилизирующий агент; детергент, например, неионный детергент, такой как Твин-20, и т.п.; ингибитор протеазы; глицерин; и т.п.
Фармацевтические композиции
В настоящем описании представлены композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие рассматриваемое антитело. В целом, фармацевтическая композиция также называется в настоящем документе как лекарственная форма, содержащая эффективное количество рассматриваемого антитела. «Эффективное количество» означает дозу, достаточную для получения желательного результата, например, сокращения неблагоприятного симптома, связанного с иммунным нарушением, ослабление симптома иммунного нарушения, замедление прогрессирования иммунного нарушения и т.п. В целом, желательным результатом является по меньшей мере ослабление симптома иммунного нарушения по сравнению с контролем.
Лекарственные формы
В рассматриваемых способах данное антитело можно вводить в организм любым стандартным способом, способным вызывать желательный терапевтический эффект или диагностический эффект. Так, оно может входить в целый ряд лекарственных форм для терапевтического введения. В частности, рассматриваемое антитело может быть составлено в фармацевтические композиции путем комбинирования с подходящими, фармацевтически приемлемыми носителями, фармацевтически приемлемыми разбавителями или другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, и может входить в препараты в твердых, полутвердых, жидких или газообразных формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляторы и аэрозоли. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит рассматриваемое антитело и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В фармацевтических лекарственных формах рассматриваемое антитело можно вводить в виде их фармацевтически приемлемых солей, которые могут применяться сами по себе или в подходящей ассоциации, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Следующие способы и вспомогательные вещества приводятся только для примера и никоим образом не для ограничения.
Для пероральных препаратов рассматриваемое антитело можно применять отдельно или в комбинации с соответствующими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связующими веществами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатины; с дезинтегрирующими веществами, такими как кукурузный кразмал, картофельный крахмал или натрий карбоксиметилцеллюлоза; со смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния; и по желанию с разбавителями, буферными веществами, увлажняющими веществами, консервантами и вкусовыми агентами.
Рассматриваемое антитело может быть составлено в препараты для инъекций путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела в водном или неводном растворителе, таком как растительное или другие подобные масла, пропиленгликоль, синтетические глицериды алифатических кислот, инъецируемые органические сложные эфиры (например, этилолеат), сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; и по желанию, с обычными добавками, таким как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие вещества, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор рингера с лактатом или фиксированные масла. Внутривенные носители включают добавки для восполнения жидкости и питательных веществ, добавки для восполнения электролита (такие как добавки на основе декстрозы Рингера) и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные агенты, такие как допамин или психофармакологические лекарственные средства в зависимости от предполагаемого применения фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции, содержащие рассматриваемое антитело, получали смешиванием рассматриваемого антитела требуемой степени чистоты с необязательными физиологически приемлемыми носителями, другими вспомогательными веществами, стабилизаторами, поверхностно-активными веществами, буферами и/или изотоническими веществами. Приемлемые носители, другие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы не должны быть токсичными для реципиента в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы типа фосфатного, цитратного и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту, глутатион, цистеин, метионин и лимонную кислоту; консерванты (такие как этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, бензалконий хлорид или их комбинации); аминокислоты, такие как аргинин, глицин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серин, пролин и их комбинации; моносахариды, дисахариды и дргуие угелеводы; низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как желатин или сывороточный альбумин; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как трегалоза, сахароза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза. галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин и нейраминовая кислота; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Tween, Brij Pluronics, Triton-X или полиэтиленгликоль (PEG).
Фармацевтическая композиция может находиться в жидкой форме, лиофилизованной форме или жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной формы, при этом лиофилизированный препарат должен быть восстановлен стерильным раствором перед введением. Стандартная методика восстановаления лиофилизированной композиции состоит в добавлении туда объема чистой воды (обычно эквивалентного объему, удаленному при лиофилизации); однако при получении фармацевтических композиций для парентерального введения можно использовать растворы, содержащие антибактериальные средства; см. также Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
Типичные концентрации антитела в рассматриваемой фармацевтической композиции могут составлять примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл или примерно от 50 мг/мл до 200 мг/мл, или примерно от 150 мг/мл до 200 мг/мл.
Водные составы антител можно готовить в забуференном растворе, например, до рН в диапазоне примерно от 4,0 до 7,0 или примерно от 5,0 до 6,0, или же при около 5,5. Примеры буферов, подходящих для рН в этом диапазоне, включают фосфатный, гистидиновый, нитратный, сукцинатный, ацетатный буфер и буферы из других органических кислот. Концентрация буфера может составлять примерно от 1 мМ до 100 мМ или примерно от 5 мМ до 50 мМ в зависимости, например, от буфера и желаемой тоничности состава.
В лекарственную форму антитела может входить вещество для модулирования тоничности состава. Типичными веществами для поддержания тоничности являются хлорид натрия, хлорид калия, глицерин и любые другие компоненты из группы аминокислот, Сахаров, а также их комбинации. В некоторых вариантах осуществления водные формы являются изотоничными, хотя могут быть подходящими и гипертоничные или гипотоничные растворы. Термин «изотоничный» обозначает раствор, имеющий такую же тоничность, как и другой раствор, с которым он сравнивается, такой как физиологический солевой раствор или сыворотка. Вещества для поддержания тоничности могут применяться в количестве примерно от 5 мМ до 350 мМ, например, в количестве от 100 мМ до 350 нМ.
В состав лекарственной формы антитела может также входить поверхностно-активное вещество для уменьшения агрегации заключенных в нем антител и/или минимизации образования твердых частиц и/или уменьшения адсорбции. Типичными поверхностно-активными веществами являются полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот (Tween), алкильные эфиры полиоксиэтилена (Brij), алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена (Triton-X), сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена (полоксамер, плюроник), и додецилсульфат натрия (SDS). Примерами подходящих полиоксиэтиленсорбитановых эфиров жирных кислот являются полисорбат 20 (продается под торговой маркой Tween 20™) и полисорбат 80 (продается под торговой маркой Tween 80™). Примерами подходящих сополимеров полиэтилена и полипропилена являются те, которые продаются под наименованием Pluronic® F68 или Poloxamer 188™. Примерами подходящих алкильных эфиров полиоксиэтилена являются те, которые продаются под торговой маркой Brij™. Типичные концентрации поверхностно-активных веществ могут варьировать в диапазоне примерно от 0,001% до 1% масса/объем.
Для защиты лабильного активного ингредиента (например, белка) от дестабилизирующих условий в процессе лиофилизации также можно добавлять лиопротекторы. Например, известными лиопротекторами являются сахара (в том числе глюкоза и сахароза); полиолы (в том числе маннит, сорбит и глицерин); и аминокислоты (в том числе аланин, глицин и глутаминовая кислота). Лиопротекторы можно включать в количестве примерно от 10 мМ до 500 нМ.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая лекарственная форма включает рассматриваемое антитело и одно или более из указанных выше веществ (например, поверхностно-активное вещества, буфер, стабилизатор, вещество для поддержания тоничности) и в основном не содержит один или более консервантов, таких как этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, бензалконий хлорид и их комбинации. В других вариантах осуществления консервант входит в состав, например, в концентрации примерно от 0,001% до 2% (масса/объем).
Например, рассматриваемая лекарственная форма может представлять собой жидкую или лиофилизированную форму, пригодную для парентерального введения, и может содержать: примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл рассматриваемого антитела; примерно от 0,001% до 1% по меньшей мере одного поверхностно активного вещества; примерно от 1 мМ до 100 мМ буфера; необязательно примерно от 10 мМ до 500 мМ стабилизатора; и примерно от 5 мМ до 305 мМ поддерживающего тоничность вещества; и имеет рН примерно от 4,0 до 7,0.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой жидкую или лиофилизированную форму, содержащую: примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой лиофилизированную форму, содержащую: 1) 15 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 2) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5.5; или 3) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 4) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 5) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5.5.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой жидкую форму, содержащую: 1) 7,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 120 мМ L-гистидина; и 250 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 2) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 3) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 4) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; 125 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 5) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 6) 5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 7) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ маннита; и имеет рН 5,5; или 8) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L гистидина; и 140 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5.5; или 9) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 10) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ маннита; и имеет рН 5,5; или 11) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 140 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5,5; или 12) 10 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 40 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5,5.
Рассматриваемое антитело можно применять в составе аэрозоля для введения путем ингаляции. Рассматриваемое антитело может входить в состав находящихся под давлением приемлемых вытеснителей, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Аэрозольные лекарственные формы, такие как лекарственные формы в виде назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервантами и изотоническими агентами. Такие составы скорректированы по рН и изотоническому состоянию, совместимому со слизистыми оболочками полости носа.
Кроме того, рассматриваемое антитело может входить в состав суппозиториев путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Рассматриваемое антитело можно вводить ректально посредством суппозитория. Суппозиторий может включать носители, такие как масло какао, карбовакс и полиэтиленгликоли, которые плавятся при температуре тела, но затвердевают при комнатной температуре.
Могут предусматриваться стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, при этом каждая единица дозирования, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит заданное количество композиции. Аналогично, стандартные лекарственные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать рассматриваемое антитело в композиции в виде раствора в стерильной воде, нормальном солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.
Термин «стандартная лекарственная форма», используемый в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для человека и животных, при этом каждая единица содержит заданное количество анти-LAG-3 антитела согласно настоящему изобретению, рассчитанное в количестве, достаточном для получения желаемого эффекта вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Спецификации для рассматриваемого антитела могут зависеть от конкретного используемого антитела и того эффекта, который нужно получить, а также фармакодинамики по каждому антителу в организме.
Другие способы введения также находят применение в рассматриваемом способе.
Например, рассматриваемое антитело может быть заключено в суппозитории, а в некоторых случаях в аэрозоли и интраназальные композиции. Для суппозиториев в состав наполнителя должны входить традиционные связывающие вещества и носители, такие как полиалкиленгликоли или триглицериды. Такие суппозитории могут быть получены из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне примерно от 0,5% до 10% (масса/масса), например, примерно от 1% до 2%.
Интраназальные составы обычно включают наполнители, которые не вызывают раздражения слизистой оболочки носа или значительно не нарушают цилиарную функцию. Могут быть использованы разбавители, такие как вода, водный солевой раствор или другие известные субстанции. Назальные формы могут также содержать консерванты, такие как, но без ограничения, хлорбутанол и бензалконий хлорид. Может присутствовать и поверхностно-активное вещество для усиления всасывания рассматриваемого антитела слизистой оболочкой носа.
Рассматриваемое антитело можно вводить в виде инъекционного состава. Обычно композиции для инъекций готовят в виде жидких растворов или суспензий; также, могут быть изготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких наполнителях перед инъекцией. Также препарат может быть эмульгирован или антитело может быть инкапсулировано в липосомных носителях.
Подходящие вспомогательные наполнители представляют собой, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, наполнитель может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, или рН-буферные вещества. Конкретные способы изготовления таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области. См., например. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985. Вводимая композиция или состав, в любом случае, будет содержать количество рассматриваемого антитела, достаточное для достижения желаемого состояния у подлежащего лечению субъекта.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, являются легкодоступными. Более того, легкодоступными являются и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты, регулирующие уровень рН и буферные агенты, регулирующие тоничность агенты, стабилизаторы, смачивающие вещества и т.п.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело составлено в виде состава с контролируемым высвобождением. Препараты с замедленным высвобождением могут быть изготовлены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом матрицы находятся в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамина, неразлагаемый этилен-винилацетат, гидрогели, полилактиды, разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислоты и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Возможную утрату биологической активности и возможные изменения в иммуногенности антител, содержащихся в препаратах с замедленным высвобождением, можно предотвратить путем использования подходящих добавок, путем контроля содержания влаги и путем разработки специфических композиций полимерных матриц.
Контролируемое высвобождение в пределах объема настоящего изобретения может означать любые из целого ряда лекарственных форм с замедленным высвобождением. Следующие термины можно рассматривать как практически эквивалентные контролируемому высвобождению для целей настоящего изобретения: непрерывное высвобождение, контролируемое высвобождение, отсроченное высвобождение, депо, пролонгированное высвобождение, ступенчатове высвобождение, немедленное высвобождение, длительное высвобождение, программируемое высвобождение, пролонгированное высвобождение, равномерное высвобождение, длительное высвобождение, депонирующийся, ретард, медленное высвобождение, высвобождение с интервалами, пролонгированное высвобождение, покрытие во времени, высвобождение во времени, задержанное действие, расширенное действие, послойное действие, длительное действие, пролонгированное действие, повторное действие, замедленное действие, задержанное действие и лекарственные средства с замедленным действием. Дополнительные описания этих терминов содержатся в Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).
Различные технологии контролируемого высвобождения охватывают очень широкий круг лекарственных дозированных форм. Технологии контролируемого высвобождения включают, но без ограничения, физические системы и химические системы.
Физические системы включают, но без ограничения, резервуарные системы с контролирующими скорость мембранами, такие как микроинкапсулирование, макроинкапсулирование и мембранные системы; резервуарные системы без контролирующих скорость мембран, такие как полые волокна, ультрапористый триацетат целлюлозы и пористые полимерные субстраты и пены; монолитные системы, включая системы, физически растворенные в непористых, полимерных или эластомерных матрицах (например, неэродируемых, эродируемых, пропускающих окружающие вещества и разлагаемых), и материалы, физически диспергированные в непористых, полимерных или эластомерных матрицах (например, неэродируемых, эродируемых, пропускающих окружающие вещества и разлагаемых); ламинированные структуры, включая резервуарные слои, химически сходные или несходные с внешними контрольными слоями; и другие физические методы, такие как осмотические насосы или адсорбция на ионообменные смолы.
Химические системы включают, но без ограничения, химическую эрозию полимерных матриц (например, гетерогенную или гомогенную эрозию) или биологическую эрозию полимерной матрицы (например, гетерогенную или гомогенную). Дополнительное обсуждение различных систем для контролируемого высвобождения можно найти в Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).
Существует ряд лекарственных форм с контролируемым высвобождением, разработанных для перорального введения. Они включают, но без ограничения, контролируемые осмотическим давлением системы желудочно-кишечной доставки; контролируемые гидродинамическим давлением системы желудочно-кишечной доставки; контролируемые проницаемостью мембранные системы желудочно-кишечные доставки, которые включают контролируемые проницаемостью микропористые мембранные устройства желудочно-кишечной доставки; устойчивые к желудочному соку, нацеленные на кишечник устройства желудочно-кишечной доставки с контролируемым высвобождением; контролируемые диффузией в геле системы желудочно-кишечной доставки; и контролируемые ионным обменом системы желудочно-кишечной доставки, которые включают катионные и анионные препараты. Дополнительная информация по системам доставки лекарственных средств с контролируемым высвобождением приведена в Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.).
Дозировка
Подходящую дозировку может определить лечащий врач или другой квалифицированный персонал, исходя из различных клинических факторов. Как хорошо известно в области медицины, дозировка для любого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол пациента, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. Рассматриваемое антитело можно вводить в количестве от 1 нг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела на дозу, например, от 0,001 до 10, от 0,01 до 10, от 0,1 до 10, от 1 до 10, от 0,001 до 1, от 0,01 до 1, от 0,1 до 1, от 0,05 до 5, от 0,05 до 0,5 или от 0,5 до 5 мг/кг массы тела. Однако предусмотрены и дозы ниже или выше этого типичного диапазона, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. Если схема предусматривает непрерывную инфузию, то доза может находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг/кг массы тела в минуту.
В некоторых вариантах осуществления доза рассматриваемого анти-LAG-3 антитла находится в диапазоне от 0,001 мкг до 100 мг, например, от 0,001 мкг до 10 мг, от 0,001 мкг до 1 мг, от 0,001 мкг до 0,1 мг, от 0,01 мкг до 10 мг, от 0,1 мкг до 10 мг, от 0,1 мкг до 1 мг или от 0,1 мкг до 0,1 мг, или от 0,01 мг до 100 мг, от 0,01 мг до 10 мг, от 0,01 мг до 1 мг, от 0,01 мг до 0,1 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 1 мг.
В некоторых вариантах осуществления доза может изменяться, например, от около 0,0001 до 100 мг/кг, или от около 0,01 до 5 мг/кг (например, от 0,02 до 5 мг/кг, от 0,25 до 5 мг/кг, от 0,5 до 5 мг/кг, от 0,75 до 5 мг/кг, от 1 до 5 мг/кг, от 2 до 5 мг/кг, и т.д.) массы тела. Например, дозы могут составлять 0,1, 1 или 10 мг/кг массы тела или находиться в пределах диапазона 0,01-10 мг/кг, или составлять по меньшей мере 0,1 мг/кг.
В конкретных вариантах осуществления доза анти-LAG-3 антитела согласно изобретению или его фрагмента составляет до 0,5 мг/кг массы тела, например, находится в диапазоне от 0,0001 до 0,5 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,5 мг/кг, от 0,1 до 0,5 мг/кг, от 0,0001 до 0,1 мг/кг, от 0,001 до 0,1 мг/кг, от 0,01 до 0,1 мг/кг массы тела.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке примерно от 0,001 мкг/мл до 1 мг/мл, например, от 0,0001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, от 0,01 до 1, или от 0,01 до 0,1 мкг/мл, или примерно от 0,005 мкг/мл до 1 мкг/мл, или примерно от 0,1 мкг/мл до 1 мкг/мл, или примерно от 1 мкг/мл до 2,5 мкг/мл, примерно от 2,5 мкг/мл до 5 мкг/мл, примерно от 5 мкг/мл до 7,5 мкг/мл, примерно от 7,5 мкг/мл до 10 мкг/мл, примерно от 10 мкг/мл до 25 мкг/мл, примерно от 25 мкг/мл до 50 мкг/мл, примерно от 50 мкг/мл до 100 мкг/мл, примерно от 100 мкг/мл до 250 мкг/мл, примерно от 250 мкг/мл до 500 мкг/мл, примерно от 500 мкг/мл до 750 мкг/мл, или примерно от 750 мкг/мл до 1000 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое, анти-LAG-3 антитело вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке, составляющую более 1 мг/мл, например, примерно от 1 мг/мл до 2 мг/мл, примерно от 2 мг/мл до 5 мг/мл, или примерно от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В других вариантах осуществления анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его фрагмент вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке вплоть до 1 мкг/мл, например, в диапазоне от 0,0001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,01 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,1 до 1 мкг/мл, от 0,0001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, или от 0,01 мкг/мл до 0,1 мкг/мл. Подходящим образом такое введение осуществляют путем подкожной инъекции.
Индивидуумам можно вводить такие дозы ежедневно, через день, один раз в неделю или согласно любой другой схеме, определенной путем эмпирического анализа. Иллюстративное лечение предусматривает введение множества доз в течение длительного периода, например, по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные иллюстративные режимы лечения предусматривают введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев.
Иллюстративные режимы дозирования включают от 0,01 до 1 мг/кг, от 0,01 до 0,1 мг/кг, от 0,1 до 1 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг или 15 мг/кг в последующие дни, от 0,02 до 20 мг/кг, например, 0,2 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 20 мг/кг через день, или от 0,1 до 100 мг/кг, например, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг или 60 мг/кг один раз в неделю. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными специфичностями связывания вводят одновременно, и в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Прогресс можно наблюдать путем периодической оценки.
Число CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, экспрессирующих LAG-3, у субъекта является относительно низким. Предполагается, что однократное введение антитела согласно изобретению (в частности, антитела согласно изобретению, которое имеет время полужизни в сыворотке, составляющее по меньшей мере две недели, и которое лишено значительной активности CDC и ADCC, такое как изотип IgG человека (которое лишено активности CDC и ADCC), или антитела, которое содержит одну или более мутаций для уменьшения или устранения активности CDC и ADCC) может быть эффективным в отношении ингибирования антиген-индуцированной CD4+ и/или CD8+ Т-клеточной пролиферации в течение по меньшей мере нескольких недель. Ввиду этого, подходящий режим лечения может включать введение антитела согласно изобретению (например, от 0,01 до 1 мг/кг антитела) один раз каждые четыре, шесть, восемь или десять недель, или один раз каждые два или три месяца. Такое лечение может быть обеспечено в течение периода, составляющего по меньшей мере шесть месяцев или по меньшей мере один, два, три, четыре или пять лет, или дольше, например, на протяжении течения заболевания, которое подвергают лечению путем введения, или на протяжении жизни субъекта.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что уровни доз и схемы введения могут изменяться в зависимости от конкретного антитела, тяжести симптомов и подверженности субъекта побочным эффектам. Специалисты в данной области легко смогут определить предпочтительные дозы и схемы введения для данного соединения различными способами.
Способы введения
Рассматриваемое антитело вводят индивидууму любым доступным способом или путем, подходящим для доставки лекарственного средства, включая способы in vivo и ex vivo, а также системные и местные способы введения.
Обычные и фармацевтически приемлемые способы введения включают интраназальную, внутримышечную, внутритрахеальную, интракраниальную, подкожную, интрадермальную, местную, внутривенную, интраперитонеальную, внутриартериальную (например, через сонную артерию), спинальную доставку или доставку в головной мозг, ректальный, назальный, пероральный и другие энтеральные и парентеральные способы введения. Способы введения можно комбинировать, по желанию, или подбирать в зависимости от антитела и/или желаемого эффекта. Композицию рассматриваемого антитела можно вводить в виде однократной дозы или множественных доз. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят путем ингаляции. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интраназально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят локально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интракраниально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интратекально.
Антитело согласно настоящему изобретению может быть введено в организм любым стандартным способом и путем, подходящим для доставки обычных лекарственных средств, включая системные или локальные пути. В целом, предусмотренные способы введения включают, но без особых ограничений, энтеральное, парентеральное или ингаляционное введение.
Парентеральные способы введения, помимо ингаляции, включают, но без особых ограничений, местное, трансдермальное, подкожное, внутримышечное, интраорбитальное, интракапсулярное, интраспинальное, интрастернальное, интратекальное и внутривенное введение, то есть любой способ введения, кроме как через пищеварительный тракт. Парентеральное введение может осуществляться для системной или локальной доставки рассматриваемого антитела. Если требуется системная доставка, то введение обычно включает инвазивное либо топическое или или мукозальное введение действующих системно фармацевтических препаратов.
Рассматриваемое антитело также может вводиться субъекту энтерально. Энтеральные способы введения включают, без особых ограничений, пероральное и ректальное (например, с помощью суппозитория) введение.
Под «лечением» подразумевается по меньшей мере ослабление симптомов, связанных с патологическим состоянием у хозяина, при этом ослабление используется в широком смысле и означает по меньшей мере уменьшение величины параметра, например, симптома, связанного с патологическим состоянием, подлежащим лечению, таким как иммунное нарушение. Таким образом, лечение также охватывает ситуации, при которых патологическое состояние или по меньшей мере связанные с ним симптомы полностью подавлялись, например, не возникали или прерывались, например, прекращались с тем, чтобы организм больше не страдал от патологического состояния или по меньшей мере от симптомов, которые характеризуют патологическое состояние.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело вводят посредством инъекции и/или уколом, например, в артерию головного мозга или прямо в ткань мозга. Рассматриваемое антитело также можно вводяить непосредственно в намеченное место, например, посредством биолистической доставки в намеченное место.
Разнообразные хозяева (при этом термин «хозяин» применяется взаимозаменяемо в настоящем документе с терминами «субъект», «индивидуум» и «пациент») могут быть подвергнуты лечению в соответствии с рассматриваемыми способами. Как правило, такие хозяева представляют собой «млекопитающих» или «относяться к млекопитающим», причем эти термины используются в широком смысле для обозначения организмов из класса млекопитающих, включая отряды плотоядных животных (например, кошки), травоядных животных (например, крупный рогатый скот, лошади и овцы), всеядных животных (например, собак, коз и свиней), грызунов (например, мышей, морских свинок и крыс) и приматов (например, человека, шимпанзе и обезьян). В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой индивидуума, который обладает системой комплемента, такой как млекопитающее, рыба или позвоночное. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой млекопитающее, содержащее систему комплемента, рыбу или беспозвоночное домашнее животное, сельскохозяйственное животное, рабочее животное, животное зоопарка или лабораторное животное. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой человека.
Варианты осуществления включают композиции, содержащиеся в подходящем контейнере, включающие рассматриваемое анти-LAG-3 антитело для введения индивидууму. Например, рассматриваемое антитело может находиться внутри контейнера, подходящего для содержания фармацевтической композиции. Контейнер может представлять собой, например, бутыль (например, с закрывающим устройством, таким как крышка), блистерную упаковку (например, которая может содержать одну или более доз на блистер), флакон, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые мешки), ампулу (для однократных доз в растворе), пипетку, шприц, тонкую пленку, пробирку и т.п. В некоторых вариантах осуществления контейнер, такой как стерильный контейнер, содержит рассматриваемую фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой бутыль или шприц. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой бутыль. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой шприц.
Предлагаются наборы с единичными дозами рассматриваемого антитела, например, в пероральных или инъекционных дозах. В таких наборах, дополнительно к контейнерам, содержащим единичные дозы, прилагается информационный листок-вкладыш с описанием применения и соответствующих преимуществ антитела в лечении представляющего интерес патологического состояния. Предпочтительные соединения и однократные дозы представляют собой такие, которые описаны в настоящем документе выше.
Способы лечения
В соответствии с изобретением предлагается также антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Антитело, фрагмент или композиция согласно настоящему изобретению может быть использована в любой терапии, в которой желательно повысить эффекты LAG-3 у субъекта.
Термин «субъект» включает любого человека или животное, отличное от человека. Термин «животное, отличное от человека» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и пресмыкающиеся, хотя млекопитающие являются предпочтительными, такие как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки и коровы и лошади.
Антитело, фрагмент или композицию можно применять в любой терапии, когда желательно негативно регулировать пролиферацию и/или функцию Т-клеток.
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в лечении нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта.
Также, в соответствии с изобретением предлагается применение антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается способ лечения нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта, который включает введение эффективного количества антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
Нарушение, связанное с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может представлять собой иммунное нарушение, в частности, иммунное нарушение, опосредованное Т-клетками, такое как воспалительное заболевание или аутоиммунное нарушение.
Антитело, фрагмент или композицию можно применять для уменьшения воспалительного процесса или для предупреждения возникновения воспалительного процесса. В одном варианте осуществления предлагается in vivo уменьшение пролиферации или активации Т-клеток, в частности, вовлеченных в ненадлежащие воспалительные иммунные ответы, например, рекрутированные в близлежащую область/локализацию такого ответа.
Уменьшение пролиферации или активации Т-клеток, как используется в настоящем документе, может представлять собой уменьшение на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или более процентов по сравнению с состоянием до лечения или отсутствием лечения.
Предпочтительно лечение антителом, фрагментом или композицией согласно настоящему изобретению может обеспечить уменьшение пролиферации или активации Т-клеток без уменьшения общего уровня Т-клеток у пациента (неактивированных Т-клеток). Это может привести к меньшему количеству побочных эффектов и предотвратить истощение Т-клеток у пациента.
Иммунное нарушение может, например, быть выбрано из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, таких как множественный склероз, красная волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, атонического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдрома Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы (хирургического вмешательства), реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероза, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
Антитело, фрагмент или композицию согласно изобретению можно применять в любой терапии, когда желательно ингибировать связывание LAG-3 с молекулами МНС класса II, чтобы антагонизировать активирующий МНС класса II сигнал в антигенпредставляющие клетки (АРС), или ингибировать индуцированную LAG-3 активацию АРС.
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в лечении нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта.
Также, в соответствии с изобретением предлагается применение антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается способ лечения нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта, который включает введение эффективного количества антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
Используемые здесь термины «терапия», «лечение», «лечить» и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения возникновения заболевания или его симптома, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, вызванного заболеванием. «Терапия», как используется здесь, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности, у человека, и включает: (а) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) ингибирование заболевания, то есть купирование его развития; и (с) ослабление заболевания, то есть вызывание регрессии заболевания.
Термины «индивидуум», «субъект», «хозяин» и «пациент», используемые здесь взаимозаменяемо, включают человека или животное, отличное от человека. Термин «животное, отличное от человека» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и пресмыкающиеся, хотя млекопитающие являются предпочтительными, такие как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки и коровы и лошади.
«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству анти-LAG-3 антитела, которое при введении млекопитающему или другому субъекту для лечения заболевания является достаточным для лечения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» будет изменяться в зависимости от анти-LAG-3 антитела, заболевания и его тяжести, а также возраста, веса и т.п. пациента, подлежащего лечению.
Все упомянутые здесь публикации включены в качестве ссылок для раскрытия и описания способов и/или материалов, применительно к которым эти публикации цитируются. Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
на фигуре 1 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 27) зрелого человеческого белка LAG-3. Четыре внеклеточных домена надсемейства Ig находятся в аминокислотных остатках: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); и 331-412 (D4). Аминокислотная последовательность структуры внешней петли домена D1 белка LAG-3 человека показана подчеркнутой и выделенной жирным шрифтом (SEQ ID NO: 40);
на фигуре 2 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 3 показана аминокислотная последовательность домена vh моноклонального антитела 13Е2, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 4 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 5 показана аминокислотная последовательность домена vl моноклонального антитела 13Е2, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 6 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 7 показана аминокислотная последовательность домена vh моноклонального антитела 34F4, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 8 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 9 показана аминокислотная последовательность домена vl моноклонального антитела 34F4, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 10 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-D-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vh моноклонального антитела 13Е2;
на фигуре 11 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vl моноклонального антитела 13Е2;
на фигуре 12 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-D-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vh моноклонального антитела 34F4;
на фигуре 13 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vl моноклонального антитела 34F4;
на фигуре 14 показаны результаты связывания различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 с клетками яичника китайского хомячка (СНО), трансфицированными LAG-3, по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1);
на фигуре 15 показаны результаты связывания различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 с CD4+ и CD8+ первичными клетками (SEB-стимулированные РВМС), по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) от здорового донора (донор 1);
на фигуре 16А показаны результаты ингибирования связывания IMP321 (LAG-3 Ig, 1 мкг/мл) с МНС класса II-положительными В-клетками различными концентрациями агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1). На фигуре 16В показаны результаты ингибирования активации клеток ТНР-1 с помощью IMP321 (20 нг/мл) в присутствии различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13А2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1);
на фигуре 17 (А) показаны CMV-индуцированные профили пролиферации CD8+ Т-клеток одного донора в присутствии mIgG1, 17В4, 13Е2 или 34F4, подвергнутые анализу методом проточной цитометрии, и стратегия гейтирования, используемая для анализа, описанного в примере 10. На фигуре 17(В) показаны результаты анализа ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток антителами 13Е2, 34F4 и 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) для того же самого донора. Также, показана исходная пролиферация (No Stim);
на фигуре 18 показаны результаты анализа ингибирования пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток антителами 13Е2 или 34F4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) у нескольких разных доноров;
на фигуре 19 показано влияние различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток;
на фигуре 20 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc обозначена как 13E2IgG4mut на фигуре), и аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 13Е2-человеческого IgK антитела (аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 13Е2-человеческого IgK обозначена как 13E2IgK на фигуре);
на фигуре 21 показаны различные эффекты на Т-клетки истощающих, антагонистических и агонистических анти-LAG-3 антител;
на фигуре 22 показано выравнивание вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VH (VH1, VH2, VH3 и VH4) и выравнивание вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VL (VL1, VL2, VL3 и VL4) с соответствующей последовательностью исходного мышиного моноклонального антитела 13Е2 (VH 13Е2 и VL 13Е2, соответственно). Последовательности CDR выделены серым цветом. Изменения в гуманизированных каркасных последовательностях вариантов по сравнению с исходной мышиной последовательностью показаны подчеркнутыми и выделенными жирным шрифтом;
на фигуре 23 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (IMP761), выровненная с химерной аминокислотной последовательностью тяжелой цепи 13Е2-человеческого IgG4 Fc (13E2IgG4mut) антитела Chim13E2IgG4. Область vh выделена жирным шрифтом, и область Fc выделена. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которая отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2IgG4mut, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе объединенной идентификации последовательностей CDR IMGT/Kabat) почеркнуты двойной линией;
на фигуре 24 показана аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного 13Е2-человеческого IgE антитела (IMP761), выровненная с химерной аминокислотной последовательностью легкой цепи 13Е2-человеческого IgK (13E2IgK) антитела Chim13E2IgG4. Область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK выделена. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2Ig, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе объединенной идентификации последовательностей CDR IMGT/Kabat) показаны двойным подчеркиванием;
на фигуре 25 показаны результаты анализа, проведенного для тестирования связывания химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (Chim13E2IgG4) и IMP761 с клетками CHO-LAG-3+;
на фигуре 26 показаны результаты анализа, проведенного для тестирования эффекта IMP761 и Chim13E2IgG4 на: (а) антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток; и (b) экспрессию CD25 в CD8+ Т-клетках;
на рис. 27 показан эффект IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25 в виде графика: (а) процентного ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток; и (b) процентного ингибирования экспрессии CD25 в CD8+ Т-клетках по сравнению с изотипически сходным контролем;
на фигуре 28 показан эффект различных концентраций IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток;
на фигуре 29 показаны результаты анализов ADCC, проводимых для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3, с использованием: ADCC Reporter Bioassay, доступного от фирмы Promega (а); и анализа ADCC с использованием IL-2-стимулированных РВМС в качестве эффекторных клеток - результаты нанесены на график в виде процента: CD4+ и CD8+ Т-клеток (b); или LAG-3+ CD4+ и LAG-3+ CD8+ Т-клеток (с) в популяции РВМС;
на фигуре 30 показаны результаты анализов CDC с использованием кроличьего комплемента для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3 - результаты нанесены на график в виде процента: (а) CD4+ и CD8+ Т-клеток; или (b) LAG-3+ CD4+ и LAG-3+ CD8+ Т-клеток в популяции РВМС; и
на фигуре 31 показаны результаты анализа для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3, после культивирования антиген-стимулированных РВМС с антителом в течение 3 дней. Результаты нанесены на график в виде: (а) процента CD4+ и CD8+ Т-клеток в популяции РВМС; и (b) процента LAG-3+ клеток в субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Пример 1
Получение анти-LAG-3 моноклонального антитела 13Е2
Для получения анти-LAG-3 антител 15 мышей Balb/c (называемых как мыши под номерами 1-15 ниже) иммунизировали в соответствии с протоколом иммунизации, описанным ниже.
Тринадцать мышей, каждую, иммунизировали путем подкожных (s.c.) инъекций 100 мкг IMP321 (LAG-3Ig), партия клинического применения S017/LC1/041011 (называемая ниже как «LC1»): 3 раза (мышь под номером 12); 4 раза (мышь под номером 9); 5 раз (мышей под номерами 5 и 14); или 6 раз (мышей под номерами 3 и 11) на День 0, День 15, День 30, День 50, День 67 и День 108. Мышей под номерами 1, 2, 4, 8, 10, 13 и 15 иммунизировали до 4-х дополнительных раз. Параллельно двух мышей (мышь под номером 6 и мышь под номером 7), используемых в качестве контролей, иммунизировали 10 мкг LC1 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) один раз на День 0 и такой же дозой антигена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) на День 15, День 30, День 50, День 67 и День 108.
Через 12 дней после 6-й иммунизации у мышей под номерами 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13 и 15 отбирали сыворотку (мыши под номерами 5, 9, 12 и 14 уже были умерщвлены) и анализировали в ферментном иммуносорбентном анализе (ELISA) с использованием D1-D4 LAG-3 в качестве покрытого антигена, очищенного анти-LAG-3 мышиного моноклонального антитела 17В4 в качестве эталона, и козьего антимышиного Ig-HRP в качестве меченого вторичного антитела для определения концентрации анти-LAG-3 антител, присутствующих в сыворотке. Результаты показаны в таблице 2 ниже:
После шести иммунизации сыворотка от нескольких мышей (включая мышь под номером 3) неожиданно показала результаты лучше, чем сыворотка от двух положительных контрольных мышей (под номерами 6 и 7), хотя эти мыши были иммунизированы IMP321 в отсутствие CFA или IFA в качестве адъюванта. Этот нетрадиционный метод (то есть иммунизация с помощью IMP321 в PBS без использования CFA или IFA в качестве адъюванта) также дала хорошие результаты по сравнению с другими экспериментами, проводимыми с использованием LAG-3-экспрессирующих клеток СНО в IFA (данные не показаны). Без привязки к какой-либо теории полагают, что это может быть обусловлено тем, что IMP321 сам по себе является адъювантом, то есть напрямую запускает активацию и созревание дендритных клеток.
Те же образцы сыворотки оценивали на их способность ингибировать связывание IMP321 с его лигандом, МНС класса II, экспрессируемым на клетках Raji В. Десять микролитров раствора Alexa Fluor488-конъюгированного IMP321 при концентрации 10 мкг/мл предварительно инкубировали с 5 мкл сыворотки, собранной от каждой мыши, или без нее, или нативной сыворотки в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки Raji добавляли к конечному объему 50 мкл и инкубировали в течение 30 минут при 4°С.
Связанную клетками флуоресценцию анализировали с помощью проточной цитометрии.
Была выбрана мышь под номером 3, так как сыворотка от этой мыши показала высокий титр (423 мкг/мл) в анализе ELISA сыворотки D1-D4 (таблица 1) и высокую способность ингибировать связывание IMD321 с МНС класса II+-клетками Raji В.
Через 12 дней после шестой иммунизации мышь под номером 3 получала внутривенную (i.v.) стимуляцию 10 мкг D1-D4 LAG-3 (без Fc-хвоста) рекомбинантного белка (продуцируемого в клетках СНО и очищенного). Через три дня после i.v. стимулирующей инъекции мышь под номером 3 умерщвляли и удаляли селезенку. Спленоциты выделяли путем сжимания кусочков селезенки с помощью резинового поршня шприца 5 мл в чашке Петри, содержащей полную безсывороточную среду DMEM. Спленоциты и клетки миеломы Sp2/0 (культивированные в среде RPMI 1640+10% FCS+2 мМ глутамина + 0,5% P/S) промывали в бессывороточной среде. Два типа клеток смешивали вместе в соотношении 5:1 спленоцитькмиелома, а затем осаждали центрифугированием. Агент слияния (PEG-1500, раствор полиэтиленгликоля, 50% масса/объем в PBS, Roche 10783641001, 1 мл на 108 клеток) предварительно нагревали при 37°С и по каплям добавляли к клеточному осадку. Клетки осторожно ресуспендировали и разбавляли путем удвоения объема через 90 секунд. Клетки дополнительно разбавляли через регулярные интервалы до конечного разведения 1 к 15 в течение примерно 5 минут. Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде, содержащей 10% FBS, и инкубировали в течение приблизительно одного часа при 37°С. Затем клетки (10000 клеток/лунку) высевали в 46 96-луночных планшетов в полной среде RPMI, содержащей 10% Ultralow Ig FBS (Gibco 16250), 2% HAT (Gibco 21060) и дополняли 10% ВМ Condimed H1 (добавка к культуральной среде для поддержки роста В-клеточной гибридомы после слияния и во время клонирования, Roche 11088947001), и культивировали до скрининга.
Скрининг выполняли путем цитометрии с использованием клеток СНО с экспрессируемым мембраной LAG-3 для анализа связывающей способности антител, присутствующих в супернатантах растущих гидридом, выявленных с помощью FITC-конъюгированного козьего антимышиного Ig. Положительные гибридомы размножали и повторно подвергали скринингу на клетках LAG-3+ СНО и клетках СНО дикого типа. Из этого слияния в общей сложности 632 лунки были подвергнуты скринингу с помощью анализа FACS на экспрессирующих LAG-3 клетках СНО (выход 14%). Было обнаружено, что 4 клона гибридом стабильно экспрессировали анти-LAG-3 антитело, включая 13Е2.
Затем гибридому субклонировали путем предельного разведения.
Пример 2
Аминокислотная последовательность вариабельной области антитела 13Е2
Аминокислотная последовательность VH:
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела 13Е2. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)). CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 2 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Затемненные круги (остатки под номерами 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 на сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR-участка.
Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты;
Аминокислотная последовательность vl:
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (vl) антитела 13Е2. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)). CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 4 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Затемненные круги (остатки под номерами 4, 1 1, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Остатки аминокислот под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты.
Пример 3
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные домены антитела 13Е2
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 13Е2, показана на фигуре 3 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показало, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 13Е2, обладает значительной идентичностью с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
На фигуре 10 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VH-домен антитела 13Е2, с ее наилучшим совпадением с геном зародышевой линии. На фиг.10 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-301 VH-области 13Е2 (которая охватывает каркасные области тяжелой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 92,7% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGHV8-8*01.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 13Е2, показана на фигуре 5 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показало, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 13Е2, обладает значительной идентичностью с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
На фигуре 11 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VL-домен антитела 13Е2, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 11 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-284 области VL 13Е2 (которая охватывает каркасные области легкой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,7% идентична нуклеотидной последовательности V-гена IGKV6-17*01.
Пример 4.
Создание анти-LAG-3 моноклонального антитела 34F4
Каждую из 4 мышей линии Balb/c (называемых ниже как мыши под номерами 1-4) иммунизировали с помощью четырех (мыши под номерами 2 и 4) или пяти (мыши под номерами 1 и 3) подкожных (s.c.) инъекций 100 мкг IMP321 (LAG-3Ig), партия клинического применения S017/LC1/041011 (названная ниже как «LC1»), на День 0, День 14, День 28, День 43 и День 70. Дополнительную мышь Balb/c (называемую ниже как мышь под номером 5) иммунизировали с помощью трех подкожных (s.c.) инъекций D1-D4 LAG-3.
Через две недели после третьей инъекции сыворотку от каждой мыши тестировали на содержание анти-LAG-3 антитела в анализе ELISA (как описано в примере 1).
Результаты представлены ниже в таблице 7:
Способность сыворотки от каждой мыши ингибировать связывание IMP321 с клетками Raji В определяли с помощью анализа FACS (как описано в примере 1).
Как видно из таблицы 7, титры антитела были низкими у всех мышей. Ни одна из сывороток не ингибировала связывание IMP321 с МНС класса II+ В-клетками Raji после трех иммунизации. Других отборов не проводилось для тестирования титров сыворотки и ингибирующей способности. Процесс иммунизации продолжали и мышь под номером 3, которая получила пять s.c. инъекций LC1, стимулировали 10 мкг D1-D4 LAG-3 i.v. на День 92.
Через три дня послестимулирующей внутривенной (i.v.) инъекции 73 миллиона спленоцитов от мыши под номером 3 сливали с 15 миллионами клеток миеломы Sp2/0, следуя такой же процедуре, которая описана в примере 1. В лунки 40 96-луночных планшетов высевали приблизительно 25500 клеток на лунку, а затем культивировали с добавлением культуральной среды, содержащей 10% ВМ Condimed H1. 2256 лунок подвергали скринингу с помощью анализа FACS на экспрессирующие LAG-3 клетки СНО (выход 59%). Были выбраны две устойчивые анти-LAG-3 гибридомы, включая 34F4 (см. таблицу 8 ниже).
Пример 5
Аминокислотная последовательность вариабельной области антитела 34F4
Аминокислотная последовательность VH;
SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (NH) антитела 34F4. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 6 показано графическое изображение петель vh CDR моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Закрашенные круги (остатки под номерами 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области являются структурно консервативными аминокислотами.
Аминокислотная последовательность vl:
SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (vl) антитела 34F4. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al. Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 8 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Закрашенные круги (остатки под номерами 4, 11, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты.
Пример 6.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные домены антитела 34F4
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 34F4, показана на фигуре 7 и ниже:
Выравнивание последовательности нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 34F4, имеет значительную идентичность с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
На фигуре 12 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VH-домен антитела 34F4, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 12 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-301 области VH 34F4 (которая охватывает каркасные области тяжелой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,4% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGHV8-8*01.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 34F4, показана на фигуре 9 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 34F4, имеет значительную идентичность с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
На фигуре 13 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VL-домен антитела 34F4, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 13 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-284 VL-области 34F4 (которая охватывает каркасные области легкой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,7% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGKV6-17*01.
Пример 7.
Связывание агонистических моноклональных антител 13Е2 и 34F4 с LAG-3+ трансфицированными и первичными клетками по сравнению с антагонистическим моноклональным антителом 17В4 LAG-3+-трансфицированные клетки СНО или SEB-стимулированные РВМС от здорового донора инкубировали с анти-LAG-3 моноклональным антителом или изотипическим контролем (mIgG1) в течение 30 минут в PBS, 0,5% BSA, 0,1% азиде при 4°С. Клетки промывали, и клеточно-связанное антитело выявляли с помощью FITC-конъюгированного козьего F(ab')2-антимышиного Ig (H+L) (Coulter). Вторичное антитело вымывали, и клетки СНО напрямую анализировали с помощью проточной цитометрии. РВМС фенотипировали с использованием CD4-PE-Cy7 и CD8-APC-Cy7.
Связывание с LAG-3+ клетками СНО
Результаты представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток СНО, трансфицированных плазмидой, кодирующей человеческий LAG-3, в зависимости от концентрации антител. Результаты показаны в таблице 12 ниже и на фигуре 14.
На основании результатов, показанных в таблице 12, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с LAG-3-экспрессирующими клетками СНО составило: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,3 нМ; 34F4: 0,5 нМ.
Средние значения ЕС50 из четырех независимых экспериментов (данные не показаны) для связывания каждого антитела с экспрессирующими LAG-3 клетками СНО составляют: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,4 нМ; 34F4: 0,5 нМ. Среднее значение ЕС50 13E2 из четырех независимых экспериментов в 2,7 раз превышает среднее значение ЕС50 17В4.
Среднее значение ЕС50 34F4 из четырех независимых экспериментов в 1,6 раз превышает среднее значение ЕС50 17В4.
Связывание с SEB-стимулированными РВМС.
Результаты представлены в виде средней интенсивности флуоресценции на CD4+ или CD8+ клетках из РВМС донора (Донор 1), стимулированных в течение трех дней 0,5 мкг/мл SEB в зависимости от концентрации антитела. Результаты по связыванию с CD4+ и CD8+ клетками для Донора 1 показаны в таблице 13 ниже и на фигуре 15.
На основании результатов, представленных в таблице 13, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с CD4+ клетками составило: 17В4: 0,5 нМ; 13Е2: 0,1 нМ; 34F4: 0,1 нМ.
Среднее значение ЕС50 от трех доноров (данные не показаны) для связывания каждого антитела с CD4+ клетками составило: 17В4: 0,8 нМ; 13Е2: 0,2 нМ; 34F4: 0,2 нМ.
Среднее значение ЕС50 CD4+ 13Е2 и 34F4 от трех доноров в 3,8 раза превысило среднее значение ЕС50 17В4.
На основании результатов, показанных в таблице 13, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с CD8+ клетками составило: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,3 нМ; 34F4: 0,2 нМ.
Среднее значение ЕС50 от трех доноров (данные не показаны) для связывания каждого антитела с CD8+ клетками составило: 17В4: 1 нМ; 13Е2: 0,4 нМ; 34F4: 0,5 нМ.
Среднее значение ЕС50 CD8+ 13Е2 и 34F4 от трех доноров в 2,5 раза превысило среднее значение ЕС50 17В4.
Результаты показали, что моноклональные антитела 13Е2 и 34F4, каждое, связывается с клетками СНО, экспрессирующими LAG-3+, и с CD4+-T клетками и CD8+-Т-клетками с более высокой аффинностью, чем 17В4.
Анализ Biacore с LAG-3 Ig на чипе и антителом 17В4 в подвижном буфере показал следующие результаты:
ka (1/Ms) | 1,09 × 106 |
kd (1/s) | 1,32 × 10-4 |
KD (M) | 1,21 × 10-10 |
Анализ Biacore с антителом 17В4 на чипе и LAG-3 Ig в подвижном буфере дал следующие результаты:
ka (1/Ms) | 2,22 × 105 |
kd (1/s) | 8.18 × 10-4 |
KA(1/M) | 2.71 × 108 |
KD(M) | 3.69 × 10-9 |
Пример 8
Ингибирование связывания IMP321 (LAG-3Ig) с МНС класса II-положительными клетками с помощью 13Е2 и 34F4
Связывание конъюгата IMP321 (LAG-3 Ig-Alexa 488) с MHC класса II-положительными В-клетками (клетки Raji) определяли после предварительной инкубации конъюгата (1 мкг/мл при 4°С) с анти-LAG-3 моноклональным антителом (13Е2, 34F4 или 17В4) или изотипическим контролем (mIgG1). Анализ клеточно-связанной флуоресценции осуществляли с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
Средняя интенсивность флуоресценции (MFI), соответствующая клеточно-связанному LAG-3Ig в зависимости от концентрации антитела показана в таблице 14 ниже и на фигуре 16А.
Результаты показали, что связывание IMP321 с клетками Raji было ингибировано путем предварительной инкубации с каждым из LAG-3-специфических моноклональных антител.
Пример 9
Ингибирование IMP321 (LAG-3Ig)-индуцированной активации моноцитов с помощью 13Е2 и 34F4
IMP321 (20 нг/мл) предварительно инкубировали с анти-LAG-3 моноклональным антителом 13Е2, 34F4 или 17В4, или изотипическим контролем (mIgG1) в течение 5 минут при 37°С перед инкубацией смеси с клетками ТНР-1 в течение 4 часов при 37°С.
Количество CCL4, секретируемое клетками ТНР-1 использовали для определения уровня активации моноцитов.
Концентрация CCL4 (выраженная в пг/мл) в зависимости от концентрации Ab показана в таблице 15 ниже и на фигуре 16В.
Результаты показали, что IMP321-индуцированная активация моноцитов ингибирована путем предварительной инкубации IMP321 с антагонистическим анти-LAG-3 моноклональным антителом 17В4, а также путем предварительной инкубации с агонистическими моноклональными антителами 13Е2 и 34F4.
На основании этих результатов и результатов, полученных в примере 8, можно сделать вывод о том, что агонистические моноклональные антитела 13Е2 и 34F4, подобно антагонистическому моноклональному антителу 17В4, взаимодействуют с участком связывания MHC класса II с LAG-3 или вблизи него, о чем свидетельствует их способность блокировать связывание и активность LAG-3 Ig (IMP321).
Пример 10
Ингибирование пролиферации Т-клеток с помощью 13Е2 и 34F4 по сравнению с 17В4
РВМС от 3 здоровых доноров (0,2 × 106 клеток/лунку, при 1 × 106/мл в полной среде RPMI + 10% FBS) метили сложным сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, 34F4, 17В4 или изотипического контроля (mIgG1) (сверхоптимальная доза, 300 нг/мл для донора №1 и №2, 100 нг/мл для донора №3).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток на основе CFSE на день 5. Профили FACS для CD8+ Т-клеток донора №1 в присутствии каждого антитела, а также стратегия гейтирования показаны на фигуре 17(А). На фигуре 17 (В) показан процент CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления в зависимости от клеточного деления для того же донора. Результаты для 3 доноров показаны в таблице 16 ниже. Также, измеряли исходную пролиферацию без антигенных пептидов (без стимула) (см. фигуру 17(А), нижняя панель, и таблицу 16). CD4+ Т-клетки донора №1 не показали какой-либо CMV-специфической пролиферации, поэтому результаты для этой популяции не включены.
Индекс пролиферации (PI) (рассчитанный как сумма: процента CD4+ или CD8+ T-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) показан в таблице 17.
Этот индекс обозначает процент клеток, которые испытали несколько кругов деления. В таблице 17 также указано процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипическим контролем (mIgG1) на основе значений PI.
Результаты показали, что моноклональные антитела 13Е2 и 34F4 сопоставимо ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, индуцированную антигенными пептидами, тогда как моноклональное антитело 17В4 имеет незначительный положительный эффект при тестируемой концентрации.
РВМС от 12 здоровых доноров (0,2 × 106 клеток/лунку, при 1 × 106 /мл в полной среде RPMI + 10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35 в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, 34F4 или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали на 5-й день путем измерения пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток на основе CFSE. Процент CD4+ или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления рассчитывали как функцию деления клеток, используя стратегию гейтирования, показанную на фигуре 17(А). Также, измеряли исходную пролиферацию без антигенных пептидов (нет стимула). CD4+ Т-клетки доноров №1, №5 и №12 не показали какой-либо CMV-специфической пролиферации, поэтому результаты для этих образцов не были включены.
Индекс пролиферации (PI) (рассчитанный как сумма: процента CD4+ или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) для каждого донора показан в таблице 18, и результаты нанесены на график на фигуре 18. В таблице 18 также указано процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипическим контролем (mIgG1) на основе значений PI.
Донор №1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9: 300 нг/мл; Донор №3: 10 нг/мл; Донор №10, 11, 12: 1000 нг/мл
Средние значения этих результатов приведены в таблице 19.
Результаты показали, что моноклональные анти-LAG-3-антитела 13Е2 и 34F4 ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, индуцированную антигенными пептидами. Результаты дают основание предположить, что ингибирующий эффект каждого антитела может быть более выраженным для CD8+ Т-клеток, чем для CD4+ Т-клеток. У большинства подвергнутых тестированию доноров эффекты антител 13Е2 и 34F4 имели высокое сходство, таким образом, антитела, по всей видимости, обладают сравнимой активностью.
Пример 12
Дозозависимый эффект агонистического антитела на пролиферацию CD8+ Т-клеток CFSE-меченые РВМС стимулировали CMV-пептидом, как описано выше, в присутствии различных концентраций агонистического анти-LAG-S моноклонального антитела 13Е2, 34F4 или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5-й день пролиферации CD8+ Т-клеток на основе CFSE. Индекс пролиферации (рассчитанный как сумма процента CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) показан в таблице 20.
В таблице 21 ниже указан индекс пролиферации CD8+ Т-клеток в зависимости от концентрации антител. Результаты в таблице 21 нанесены на график на фигуре 19.
Результаты показали, что доза всего лишь 30 нг/мл моноклонального анти-LAG-3-антитела 13Е2 или 34F4 вызывает максимальное ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток. Результаты также показали, что эффекты антител являются очень схожими.
Пример 13
Ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток с помощью 34F4 изменяется путем предварительной инкулации с IMP321
CFMS-меченые РВМС от 2 доноров стимулировали CMV-пептидом, как описано выше, в присутствии различных концентраций антитела 34F4. Дозу 1 мкг/мл 34F4 также оценивали после нейтрализации 10-кратным избытком IMP321.
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5-й день основанной на CFSE пролиферации CD8+ Т-клеток. Процент ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток рассчитывали исходя из процента делящихся клеток, наблюдаемых в присутствии антитела 34F4 или антитела 34F4 и IMP321 (LAG-31g), по сравнению с контролем с IMP321 или без него.
Результаты показаны в таблице 22 ниже.
Результаты показали, что предварительная инкубация антитела 34F4 с IMP321 изменяет ингибирующий эффект антитела 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток. Это показывает, что ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток, опосредованное 34F4, зависит от связывания антитела 34F4 с LAG-3.
Пример 14
Ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток антителами 13Е2 и 34F4 не изменяется под влиянием IL-2
CFSE-меченые РВМС стимулировали CMV-пептидами, как описано выше, в присутствии антитела 13Е2 или 34F4 с IL-2 или без него.
Т-клеточный ответ исследовали на 5-й день путем измерения основанной на CFSE пролиферации CD8+ Т-клеток. Процент ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток рассчитывали исходя из процента делящихся клеток, наблюдаемых в присутствии антитела 13Е2 или 34F4 с IL-2 или без него по сравнению с изотипическим контролем с IL или без него.
Результаты показаны в таблице 23 ниже.
Результаты показали, что добавление экзогенного IL-2 не смогло преодолеть ингибирующий эффект антитела 13Е2 или 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток. Из этих результатов можно сделать вывод о том, что антитела 13Е2 и 34F4, каждое, непосредственно ингибируют сигнал 1 (ответ на антиген CMV, путь, зависимый от Т-клеточного рецептора), но не сигнал 2 (ответ на IL-2, который является помощью от CD4-клеток) в CD8+ Т-клетках.
Пример 15 Эффект 13Е2 на секрецию маркера активации Т-клеток
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) включают лимфоциты (Т-клетки, В-клетки и NK-клетки), моноциты и дендритные клетки. IFN-γ преимущественно секретируется активированными CD4+ и CD8+ Т-клетками памяти и эффекторными Т-клетками и NK-клетками при активации. После повторной стимуляции специфическим антигеном in vitro индуцируется секреция IFN-γ.
РВМС от четырех здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку при 1×106/мл в полной среде RPMI+10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35 в присутствии моноклонального анти-LAG-3-антитела 13Е2 или изотипического контроля (mIgG1). Т-клеточный ответ исследовали путем измерения высвобождения IFN-γ в клеточном супернатанте на день 2. Концентрация IFN-γ и процентное ингибирование секреции IFN-γ антителом 13Е2 показаны ниже в таблице 24.
Результаты показали, что моноклональное антитело 13Е2 ингибирует секрецию ifn-γ у каждого из тестируемых доноров. Это свидетельствует о том, что моноклональное антитело 13Е2 ингибирует активацию Т-клеток.
Пример 16 Эффект 13Е2 и 34F4 на экспрессию маркера активации Т-клеток
РВМС от четырех здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку, при 1×106/мл в полной среде RPMI+10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2 или 34F4, или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5- день экспрессии CD25, в качестве маркера активации, на CD8+ Т-клетках. Процент CD8+ Т-клеток, экспрессирующих CD25, а также процентное ингибирование экспрессии CD25 антителом 13Е2 или 34F4 представлено в таблице 25 ниже.
Результаты показали, что каждое моноклональное антитело, 13Е2 и 34F4, значительно ингибировало экспрессию CD25 на CD8+ Т-клетках. Это свидетельствует о том, что каждое антитело ингибирует активацию CD8+ Т-клеток.
Пример 17 Последовательности химерного человеческого антитела 13Е2
Нуклеотидные последовательности, кодирующие мышиную вариабельную область тяжелой и легкой цепей 13Е2, сливали с последовательностями, кодирующими константную область тяжелой цепи и легкой каппа-цепи IgG4 человека, соответственно. Эти синтетические химерные последовательности субклонировали в экспрессионный вектор и экспрессировали в клетках СНО, выращенных в суспензии.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного человеческого антитела 13Е2 к Fc-фрагменту IgG4 показана ниже и на фигуре 20(А). Антитело содержит домен vh мышиного моноклонального антитела 13Е2 и Fc-фрагмент IgG4 человека с мутацией S228P (для отмены обмена Fab-фрагментами) (13E2IgG4mut). На фигуре область vh показана жирным шрифтом и Fc-область показана выделенной цветом.
3E2IgG4mut
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCARIVEGSYSSSYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 30)
Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного человеческого антитела 13Е2 класса IgK показана ниже и на фигуре 20(В). Антитело содержит домен vl моноклонального антитела 13Е2 и человеческую С-область каппа-цепи Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK). На фигуре область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK показана выделенной цветом.
13E2IgK
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKASQDVIFDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRVSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGGGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 37)
Химерное человеческое антитело 13Е2 (называемое как Chim13E2IgG4) содержит химерные тяжелую и легкую цепи: 13E2IgG4mut; и 13E2IgK.
Пример 18 Последовательности гуманизированного моноклонального антитела 13Е2 (IMP761)
Для оптимального удержания конформации петли CDR использовали комбинированную идентификацию последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat для прививки CDR мышиного антитела 13Е2 в человеческие каркасы для получения гуманизированной версии 13Е2. Эти синтетические химерные последовательности субклонировали в экспрессионный вектор и экспрессировали в клетках СНО, выращенных в суспензии.
Ниже показаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 13Е2 (называемого как IMP761). Вариабельные домены выделены жирным шрифтом, последовательности CDR показаны подчеркнутыми.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи IMP761
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQITLKESGPTLVKPTOTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIROPPGKTLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLSITKDTSKNOWLTMTNMDPLDTGTYYCAMVEGSYSSSYFDVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LGK (SEQ ID NO: 84)
Выравнивание этой последовательности (тяжелая цепь IMP761) с химерной последовательностью тяжелой цепи, 13E2IgG4mut, из примера 17 показано на фигуре 23. На этой фигуре область vh выделена жирным шрифтом и Fc-область показана выделенной цветом. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2IgG4mut, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе комбинированной идентификации последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat) подчеркнуты двойной линией. Замененные остатки в гуманизированной последовательности также приведены ниже в таблице 26 (как VH-вариант 4, VH4, а также замененные остатки в трех других гуманизированных вариантах исходной последовательности тяжелой цепи 13Е2: VH-варианты 1, 2 и 3, VH1, VH2 и VH3).
Каркасные последовательности тяжелой цепи гуманизированного антитела (антитело IMP761) представляют собой следующие:
VH FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
VH FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
VH FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66); и
VH FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67).
Аминокислотная последовательность легкой цепи IMP761
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCPIVMTQTPSSLSASVGPRVTITCKASQDVIFPVAWYQORPGOAPKLLIYSASSRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEPFATYYCQQHYSTPYTFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 85)
Выравнивание этой последовательности (легкая цепь IMP761) с химерной последовательностью легкой цепи, 13E2Ig, из примера 17 показано на фигуре 24. На этой фигуре область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK выделена цветом. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2Ig, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе комбинированной идентификации последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat) подчеркнуты двойной линией. Замененные остатки в гуманизированной последовательности показаны ниже в таблице 27 (как VL-вариант 3, VH3, а также замененные остатки в трех других гуманизированных вариантах исходной последовательности легкой цепи 13Е2: VL-варианты 1, 2 и 4, VL1, VL2 и VL4).
Каркасные последовательности легкой цепи гуманизированного антитела (антитело IMP761) представляют собой:
VL FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVT1TC (SEQ ID NO: 64);
VL FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 65);
VL FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); и
VL FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 67)
Пример 19
Связывание химерного 13Е2-человеческого антитела (Cbim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) с CHQ-LAG-3+ клетками
Клетки СНО, экспрессирующие на своей поверхности LAG-3 (0,05×106 клеток/лунку в PBS, 0,5% BSA, 0,1% азида) инкубировали с различными концентрациями химерного 13Е2-человеческого антитела (называемого как Chim13E2IgG4), содержащего химерные тяжелые и легкие цепи, описанные в примере 17 (тяжелая цепь: 13E2IgG4mut; легкая цепь: 13E2IgK), IMP761 или человеческий IgG4 (в качестве изотипически сходного отрицательного контроля). Вторичное козье антитело против человеческого IgG-FITC использовали для детекции присутствия антител на поверхности LAG-3+ клеток СНО. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) FITC определяли после анализа методом проточной цитометрии. Результаты показаны ниже в таблице 28 и на фигуре 25.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 связывается с клетками СНО, экспрессирующими LAG-3 на своей поверхности, очень сходным образом с химерным антителом.
Пример 20
Аффинность связывания химерного 13Е2-человеческого антитела (Chim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) с человеческим белком LAG-3Ig
Анализ методом плазмонного поверхностного резонанса Biacore™ проводили с использованием химерного антитела Chim13E2IgG4 (содержащего химерную тяжелую цепь 13E2IgG4mut и химерную легкую цепь 13E2IgK, описанную в примере 17), или гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761), описанного в примере 18, ковалентно иммобилизованного на сенсорном чипе С1. Покрытие проводили в 10 мМ ацетате натрия, рН 5,0, до достижения 13±1 RU. Затем рекомбинантный человеческий белок LAG-3Ig (IMP321) пропускали над захваченными антителами в 6 различных концентрациях в диапазоне 0,078-2,5 нМ в аналитическом буфере (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20) при 25°С с регенерацией в каждом цикле. Анализ проводили с помощью прибора Biacore™ T200 и данные подгоняли с использованием модели кинетической глобальной подгонки (Langmuir 1:1). Параметры кинетики показаны в таблице 29 и представляют среднее значение трех прогонов.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 обладало такой же аффинностью к человеческому белку LAG-3Ig, как химерное антитело. Оба антитела показали очень высокую скорость ассоциации, что объясняет высокую аффинность антител, происходящих из 13Е2, в отношении LAG-3.
Пример 21
Эффект гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) на пролиферацию CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25, индуцированную антигенной стимуляцией
CFMS-меченные РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10%FBS) инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в трех повторах с 300 нг/мл IgG4 человека (изотипический контроль), Chim13E2IgG4 или IMP761. Т-клеточный ответ оценивали путем измерения пролиферации, оцененной с использованием индекса пролиферации (рассчитанного как сумма процента CD8+ Т-клеток под пиком деления, умноженная на число делений) и экспрессии CD25 на 5-й день методом проточной цитометрии. Процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипически сходным отрицательным контролем (huIgG4) рассчитывали исходя из значений индекса пролиферации процента GD25+ Т-клеток в популяции CD8+ Т-клеток. Результаты показаны в таблицах 30 и 31, и на фигурах 26 и 27.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 имело эффект на ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25+ Т-клеток, сходный с химерным антителом Chim13E2IgG4. Оба антитела вызывали в среднем примерно 60% ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток и приблизительно 45% ингибирования CD25+ Т-клеток в CD8+ популяции Т-клеток. Пример 22
Эффект различных доз химерного 13Е2-человеческого антитела (Chim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) на ответ CD8+ Т-клеток
CFMS-меченые РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10%FBS) инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в трех повторах с различными дозами Chim13E2IgG4, IMP761 или IgG4 человека (изотипически сходный отрицательный контроль). Ответ Т-клеток оценивали путем измерения пролиферации (разбавление CFSE) на 5-й день с помощью проточной цитометрии. Процентное содержание CD8+ Т-клеток для каждого числа делений рассчитывали для различных используемых доз антител.
Результаты показаны ниже в таблице 32 и на фигуре 28.
Результаты показали, что ингибирующий эффект IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток был дозозависимым. В частности, ингибирующий эффект каждого антитела увеличивался при увеличении дозы от 10 нг/мл до 100 нг/мл антитела. При 300 нг/мл антитела ингибирующий эффект был аналогичен эффекту 100 нг/мл антитела. Ингибирующий эффект IMP761 был аналогичен эффекту Chim13E2IgG4 при всех тестируемых дозах.
Пример 23
Гуманизированное антитело 13Е2 (IMP761) не обладают цитотоксической активностью против LAG-3-экспрессирующих клеток
Несколько типов анализов использовали для подтверждения того, что гуманизированное антитело 13Е2 (IMP761) не обладает цитотоксической активностью против клеток, экспрессирующих LAG-3. 1) ADCC Reporter Bioassay (Promega, G7015)
В этом анализе первичные донорские РВМС или NK-клетки заменяли клетками Jurkat, стабильно экспрессирующими человеческий FcγRIIIa (высокоаффинный V158-рецептор) и NFAT-чувствительный элемент, стимулирующий экспрессию репортерного гена люциферазы. Если тестируемое антитело обладает активностью ADCC, оно будет связывать вместе клетку-мишень и рецептор FcγRIIIa клетки Jurkat. Результирующая активация сигнального пути даунстрим рецептора FcγRIIIa приводит к активации пути NFAT, тем самым индуцируя экспрессию репортерного гена люциферазы. Активность люциферазы количественно определяли путем считывания люминесценции.
LAG-3-трансфицированные клетки СНО и Jurkat, и РВМС, стимулированные SEB в течение 2 дней, чтобы вызвать экспрессию LAG-3 (55% РВМС были LAG-3+), использовали в качестве клеток-мишеней для анализа ADCC-активности IMP761 по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, hIgG4 (рекомбинантное mAb от BioRad). В качестве положительного контроля использовали антитело против CD20 и клетки Raji, обеспеченные в наборе для анализа. Антитело против CD20 также тестировали на SEB-стимулированных РВМС. Анализы проводили, следуя инструкциям производителя, используя 75000 эффекторных клеток с 12500 клетками-мишенями. После инкубации в течение 6 часов при 37°С в соответствии с инструкциями изготовителя использовали систему анализа люциферазы Bio-Glo для измерения люминесценции с использованием люминометра PerkinElmer EnVision 2103 (время интегрирования 0,5 сек/лунку).
Результаты показаны ниже в таблице 33 и на фигуре 29(а). Результаты представлены в виде кратного изменения интенсивности сигнала люминесценции (RLU), рассчитанного путем деления величины RLU, полученной в присутствии тестируемого антитела (при максимальной концентрации, рекомендованной изготовителем, 3 мкг/мл), на величину RLU, полученную без антитела.
Результаты показали, что кратное изменение RLU для антитела IMP761 было приблизительно однократным для каждой из различных тестируемых клеток-мишеней, независимо от того, экспрессировала клетка-мишень LAG-3 или нет. Кратное изменение величины RLU, полученной для изотипически сходного негативного контрольного антитела, hIgG4, было немного выше и варьировалось от 1,4 до 2,5 раз для разных клеток-мишеней. Положительное контрольное анти-CD20 антитело показало значительную ADCC-активность против клеток Raji (В-клеточная линия) и против SEB-стимулированных РВМС, содержащих незначительный процент В-клеток.
Из этих результатов было сделано заключение о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо ADCC-активностью против клеток, экспрессирующих LAG-3. 2) Общепринятый анализ ADCC
В этом анализе использовали РВМС, стимулированные в течение одного дня в среде X-Vivo 10 (Lonza) со 100 МЕ/мл IL-2 (Roche) и CFSE-меченых РВМС, стимулированных SEB в течение двух дней для обеспечения экспрессии LAG-3 на Т-клетках. Анализ проводили в среде X-Vivo 10 при соотношении эффектор:мишень 50:1, с высокой дозой (3 мкг/мл) IMP761 или изотипически сходного отрицательного контрольного антитела, hIG4. Через 4 часа клеточные смеси собирали и окрашивали на CD4, CD8, CD25 и LAG-3 с использованием конъюгированных с флуорохромом антител. Жизнеспособность клеток в каждой популяции клеток крови оценивали; с помощью проточной цитометрии после исключения клеток, которые оказались положительными на окрашивание 7-амино-актиномицином D (7-AAD), флуоресцентным красителем, который метит клетки, утратившие свою мембранную целостность, явление, которое быстро появляется после гибели клетки.
Результаты показаны в таблице 34 и на фигуре 29(b) и (с). Результаты представлены в виде процентного содержания живых CD4+ или CD8+ клеток в популяции РВМС (b), и процентного содержания живых LAG-3+CD4+ или LAG-3+CD8+ клеток в популяции РВМС (с).
Результаты показали, что антитело IMP761 не снижает процентное содержание CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции РВМС, или процентное содержание LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции РВМС. Изотипически сходное отрицательное контрольное антитело, hIgG4, вызвало незначительное снижение жизнеспособности Т-клеток в популяции РВМС, особенно активированных Т-клеток, экспрессирующих LAG-3.
Из этих результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо ADCC-активностью против LAG-3-экспрессирующих Т-клеток. 3) CDC-анализ.
Для тестирования CDC SEB-стимулированные клетки, используемые в качестве клеток-мишеней, инкубировали с 3 мкг/мл IMP761, изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, hIgG4, CDC-положительным анти-CD3-контрольным антителом (клон MEM-57, Cerdalane) или изотипически сходным отрицательным контрольным мышиным антителом, mIgG2a, в течение 45 минут в PBS, 0,5% BSA. Затем несвязанные антитела вымывали и клетки инкубировали с кроличьим комплементом, разбавленным 3 объемами в среде RPMI, в течение 1 часа при 37°С. Клетки окрашивали на CD4, CD8, CD25 и LAG-3 с использованием конъюгированных с флуорохромом антител. Жизнеспособность клеток в каждой популяции клеток крови оценивали с помощью проточной цитометрии после исключения клеток, меченных 7-AAD.
Результаты показаны в таблице 35 и на фигуре 30. Результаты представлены в виде процентного содержания живых CD4+ или CD8+ клеток в популяции РВМС (а), и процентного содержания живых LAG-3+CD4+ или LAG-3+CD8+ клеток в популяции РВМС (b).
Результаты показали, что антитело IMP761 не уменьшает процентного содержания CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции РВМС, или процентного содержания LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток, или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции РВМС. Как и ожидалось, анти-CD3-положительное контрольное антитело действительно вызвало уменьшение процентного содержания Т-клеток в популяции РВМС и активированных Т-клеток, экспрессирующих LAG-3.
На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо CDC-активностью против LAG-3-экспрессирующих Т-клеток. 4) Оценка цитотоксичности в анализе пролиферации Т-клеток
Антитело IMP761 не показало цитотоксической активности в любом из коротких анализов цитотоксичности, описанных выше в пунктах (1)-(3). Цитотоксичность IMP761 в отношении LAG-3-экспрессирующих Т-клеток также оценивали после культивирования антиген-стимулированных РВМС в течение нескольких дней. Аналогично описанным в предыдущих примерах анализам пролиферации, РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10% FBS) инкубировали в трех повторах с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии 300 нг/мл IMP761 или IgG4 человека (в качестве изотипически сходного отрицательного контроля). Через три дня процентное содержание CD8+ и CD4+ Т-клеток, гейтированных по живым лимфоцитам, а также процентное содержание LAG-У клеток в этих поднаборах Т-клеток, измеряли с помощью проточной цитометрии.
Результаты показаны в таблице 36 и на фигуре 31.
Результаты показали, что антитело IMP761 не уменьшает процентное содержание CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции лимфоцитов, или процентное содержание LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции лимфоцитов.
На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не проявляет какой-либо цитотоксической активности против Т-клеток, экспрессирующих LAG-3, в этом анализе пролиферации.
На основании представленных в этом примере результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает цитотоксической активностью, таким образом, ингибирование антиген-индуцированной пролиферации и активации Т-клеток этим антителом не обусловлено какой-либо цитотоксической активностью против активированных Т-клеток.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИММУТЕП С.A.С.
<120> Анти-LAG-3 антитела
<130> P/73968.WO01
<150> GB 1515572.4
<151> 2015-09-02
<150> GB 1612437.2
<151> 2016-07-18
<160> 85
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 2
Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 3
Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 4
Gln Asp Val Ile Phe Asp
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 5
Ser Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 6
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 7
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr Asn Pro Asp
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Ile
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Pro His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Glu
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 370
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 9
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtctagg ctggattcgt 120
cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg acacacattt ggtgggatga tatcaagcgc 180
tataacccag acctgaggag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccagatt 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catattactg tgctcgaata 300
gtggagggtt catacagtag tagttacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag 370
<210> 10
<211> 322
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 10
gacattgtga tgacccagcc tcacaaattc atgtccacat cagtggaaga cagggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgatt tttgatgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaattact gatttactcg gcatcctccc gggtcagtgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagtag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cactatagta ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccacgc tggaaataaa ac 322
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 11
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 12
Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys
1 5
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 13
Ala Arg Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 14
Gln Asp Val Ser Ile Ala
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 15
Ser Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 16
Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 123
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 17
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 370
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 19
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg acacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300
gagggggata cttactacga ctattacttt gactactggg gccaaggcgt cactctcaca 360
gtctcctcag 370
<210> 20
<211> 322
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 20
gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc atgtccacat cagttggaga cgggctcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagc attgctgtag tctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 21
Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 22
His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr Asn Pro Asp Leu Arg Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 23
Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 24
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Asp Val Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 25
Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 26
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
180 185 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
195 200 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
260 265 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
275 280 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
290 295 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305 310 315 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
325 330 335
Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val
340 345 350
Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln
355 360 365
Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu
370 375 380
Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser
405 410 415
Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu
420 425 430
Thr Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly
435 440 445
Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu
450 455 460
Glu Gln Gly Ile His Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu
465 470 475 480
Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu
485 490 495
Pro Glu Pro Glu Gln Leu
500
<210> 28
<211> 149
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met
145
<210> 29
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu
1 5 10 15
Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe
20 25 30
Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His
35 40 45
His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp
50 55 60
Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val
65 70 75 80
Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly
85 90
<210> 30
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH domain of mouse monoclonal antibody 13E2, and a human IgG4 Fc
portion with an S228P mutation
<400> 30
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Gln Ile Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 31
Thr Ser Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 32
His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 33
Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 34
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Val
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 35
Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 36
Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL domain of monoclonal antibody 13E2, and a wild-type human Ig
kappa (IgK) chain C portion
<400> 37
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Pro His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ile Phe Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 38
<211> 525
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 39
<211> 91
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe
20 25 30
Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln
50 55 60
Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
85 90
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
20 25 30
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Hemagglutinin epitope tag
<400> 41
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FLAG epitope tag
<400> 42
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc epitope tag
<400> 43
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> His5 affinity domain
<400> 44
His His His His His
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HisX6 affinity domain
<400> 45
His His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc affinity domain
<400> 46
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> StrepTag affinity domain
<400> 47
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 48
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 49
Phe His His Thr
1
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 50
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
1 5 10 15
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
20 25 30
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
50 55 60
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
65 70 75 80
Pro Gly
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 52
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 53
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 54
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ile Leu Asn
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 56
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser
20 25
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 57
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 58
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 59
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 60
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Thr Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 61
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 62
Arg Val Thr Ile Arg Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 64
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 65
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 66
Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 67
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 69
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 70
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 71
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 73
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 74
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 75
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 76
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 77
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 78
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 79
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 81
Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 82
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 83
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Heavy chain amino acid sequences of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 84
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Thr Leu Glu Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210> 85
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Light chain amino acid sequence of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 85
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ile Phe Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<---
Claims (171)
1. Выделенное агонистическое антитело против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3) или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с LAG-3 и ингибирует: антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток и/или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, которое содержит:
определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR-участки вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; или
CDR-участки VH-области антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR-участки VL-области антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток.
3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток больше, чем антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток является зависимым от LAG-3 и независимым от IL-2.
5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, и антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с LAG-3 с более высокой аффинностью, чем моноклональное антитело 17В4.
7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует связывание LAG-3 или IMP321 с МНС класса II-положительными клетками.
8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует LAG-3-индуцированную активацию антигенпредставляющих клеток (АРС) или IMP321-индуцированную активацию моноцитов.
9. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с эпитопом LAG-3, который перекрывается с участком связывания МНС класса II LAG-3.
10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 5, 6, 24, 25 и 26.
11. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, которое содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, при этом CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
12. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 11, отличающееся тем, что:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
13. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, отличающееся тем, что CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
14. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 13, отличающееся тем, что:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
15. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 11-14, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и/или CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
16. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что:
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6; или
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
17. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6; или
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
18. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
19. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
20. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, отличающееся тем, что CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13, 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, 15, 16, 34, 35 и 36.
21. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 20, которое содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
22. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 21, отличающееся тем, что:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
23. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 20-22, которое содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, при этом CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
24. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 23, отличающееся тем, что:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
25. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 21-24, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и/или CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
26. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 20-25, отличающееся тем, что:
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16; или
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
27. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16; или
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
28. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
29. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 28, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентичная аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
30. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
31. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит гуманизированную каркасную область легкой цепи.
32. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 31, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность с любыми из аминокислотных замен, показанных для VL1, VL2, VL3 или VL4 в таблице ниже:
33. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 31 или 32, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 68-83.
34. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, которое содержит:
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 68; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 69; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 70; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 71;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 72; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 73; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 74; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 75;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 76; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 77; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 78; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 79; или
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 80; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 81; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 82; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 83.
35. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 31-34, которое содержит VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; или
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
36. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит гуманизированную каркасную область тяжелой цепи.
37. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 36, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность с любыми из аминокислотных замен, показанных для VH1, VH2, VH3 или VH4 в таблице ниже:
38. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 36 или 37, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 52-67.
39. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 38, которое содержит:
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 52; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 53; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 54; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 55;
каркасную область 1 VH (FR1VH) последовательности SEQ ID NO: 56; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 57; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 58; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 59;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 60; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 61; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 62; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 63; или
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 64; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 65; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 66; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 67.
40. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-39, которое содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; a FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; или
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
41. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
42. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
43. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
44. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое представляет собой молекулу химерного антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
45. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 44, которое содержит аминокислотную последовательность человеческой константной области.
46. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое лишено комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
47. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с человеческим белком LAG-3 с константой диссоциации (KD), составляющей не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
48. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 47, которое связывается с человеческим белком LAG-3Ig с константой диссоциации (Kd), составляющей не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
49. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое не связывается с последовательностью внешней петли, состоящей из 30 аминокислот SEQ ID NO: 40, первого N-концевого домена D1 человеческого белка LAG-3.
50. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, 30-38 или 46-49, которое содержит:
VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и
VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55; или
модифицированный вариант указанного антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит одну или более аминокислотных замен, что приводит в результате к уничтожению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельных областей, чтобы тем самым устранить гликозилирование по этому сайту.
51. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, 30-38 или 46-49, которое содержит:
VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и
VH-область антитела, содержащую:
CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, при этом CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3 и 23; и гуманизированную каркасную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 52-67.
52. Выделенное агонистическое антитело против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3), или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с LAG-3 и ингибирует: антиген-индуцированную пролиферацию CD4+и/или CD8+Т-клеток и/или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, которое содержит:
вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи (VL) антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
53. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту.
54. Нуклеиновая кислота по п. 53, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 9, 10, 19 или 20, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 9, 10, 19 или 20.
55. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 53 или 54.
56. Рекомбинантная клетка для получения антитела, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 53 или 54, или рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 55.
57. Фармацевтическая композиция для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, содержащая эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
58. Применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 в лечении опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения.
59. Применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 в изготовлении лекарственного средства для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения.
60. Способ лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения, который включает введение эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
61. Применение по п. 58 или 59, отличающееся тем, что опосредованное Т-клетками иммунное нарушение выбрано из группы, состоящей из инфекций, эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, такой как множественный склероз, красная волчанка и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдром Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
62. Применение по п. 61, отличающееся тем, что инфекции представляют собой вирусные, бактериальные, грибковые или паразитарные инфекции, или что волчанка представляет собой системную красную волчанку, или что травма представляет собой травму хирургического вмешательства.
63. Способ по п. 60, отличающийся тем, что опосредованное Т-клетками иммунное нарушение выбрано из группы, состоящей из инфекций, эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, такой как множественный склероз, красная волчанка и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдром Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
64. Способ по п. 63, отличающиеся тем, что инфекции представляют собой вирусные, бактериальные, грибковые или паразитарные инфекции, или что волчанка представляет собой системную красную волчанку, или что травма представляет собой травму хирургического вмешательства.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1515572.4 | 2015-09-02 | ||
GBGB1515572.4A GB201515572D0 (en) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | Anti-LAG-3 antibodies |
GBGB1612437.2A GB201612437D0 (en) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Anti-lag-3 antibodies |
GB1612437.2 | 2016-07-18 | ||
PCT/EP2016/070664 WO2017037203A1 (en) | 2015-09-02 | 2016-09-01 | Anti-LAG-3 Antibodies |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021133819A Division RU2021133819A (ru) | 2015-09-02 | 2016-09-01 | Анти-lag-3 антитела |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018111508A RU2018111508A (ru) | 2019-10-04 |
RU2018111508A3 RU2018111508A3 (ru) | 2020-02-18 |
RU2760582C2 true RU2760582C2 (ru) | 2021-11-29 |
Family
ID=56852278
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018111508A RU2760582C2 (ru) | 2015-09-02 | 2016-09-01 | Анти-LAG-3 антитела |
RU2021133819A RU2021133819A (ru) | 2015-09-02 | 2016-09-01 | Анти-lag-3 антитела |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021133819A RU2021133819A (ru) | 2015-09-02 | 2016-09-01 | Анти-lag-3 антитела |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11680104B2 (ru) |
EP (2) | EP3798234A1 (ru) |
JP (3) | JP7074341B2 (ru) |
KR (1) | KR20180042412A (ru) |
CN (2) | CN117510633A (ru) |
AU (2) | AU2016316730B2 (ru) |
BR (1) | BR112018004181A2 (ru) |
CA (1) | CA2995639A1 (ru) |
DK (1) | DK3344654T3 (ru) |
ES (1) | ES2842306T3 (ru) |
HK (1) | HK1256116A1 (ru) |
IL (1) | IL257798B1 (ru) |
MX (2) | MX2018002610A (ru) |
PH (1) | PH12018500369A1 (ru) |
PL (1) | PL3344654T3 (ru) |
PT (1) | PT3344654T (ru) |
RU (2) | RU2760582C2 (ru) |
SG (1) | SG10201913864RA (ru) |
WO (1) | WO2017037203A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201801432B (ru) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
CA2995639A1 (en) * | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Immutep S.A.S. | Anti-lag-3 antibodies |
SG10202008325XA (en) | 2015-10-02 | 2020-09-29 | Hoffmann La Roche | Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3 |
CA3026477A1 (en) | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Kymab Limited | Anti-pd-l1 antibodies |
US10844119B2 (en) | 2016-10-11 | 2020-11-24 | Agenus Inc. | Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof |
CN117003887A (zh) | 2017-04-03 | 2023-11-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗pd-1抗体与突变体il-2或与il-15的免疫缀合物 |
WO2018185043A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3 |
JP6871415B2 (ja) * | 2017-04-05 | 2021-05-12 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗lag3抗体 |
MX2019012793A (es) * | 2017-04-27 | 2020-02-13 | Tesaro Inc | Agentes anticuerpos dirigidos contra el gen de activación de linfocitos-3 (lag-3) y usos de los mismos. |
BR112019022873A8 (pt) | 2017-05-02 | 2023-04-11 | Merck Sharp & Dohme | Formulação, e, vaso ou dispositivo de injeção. |
JOP20190260A1 (ar) | 2017-05-02 | 2019-10-31 | Merck Sharp & Dohme | صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها |
KR20200011447A (ko) | 2017-05-30 | 2020-02-03 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 항-lag-3 항체 또는 항-lag-3 항체 및 항-pd-1 또는 항-pd-l1 항체를 포함하는 조성물 |
HRP20231457T1 (hr) | 2017-05-30 | 2024-05-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Liječenje lag-3-pozitivnih tumora |
AU2018323955A1 (en) * | 2017-08-30 | 2020-03-19 | Phanes Therapeutics, Inc. | Anti-LAG-3 antibodies and uses thereof |
US20220031842A1 (en) * | 2017-12-22 | 2022-02-03 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Lag-3 antibody pharmaceutical composition and use thereof |
WO2019129137A1 (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-04 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 抗lag-3抗体及其用途 |
CN109970856B (zh) | 2017-12-27 | 2022-08-23 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 抗lag-3抗体及其用途 |
US11661452B2 (en) | 2018-03-20 | 2023-05-30 | WuXi Biologics Ireland Limited | Anti-lag-3 antibody polypeptide |
CN110343178B (zh) * | 2018-04-03 | 2022-07-22 | 上海开拓者生物医药有限公司 | 抗人lag-3单克隆抗体及其应用 |
CN110606892B (zh) * | 2018-06-14 | 2023-09-26 | 华博生物医药技术(上海)有限公司 | 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用 |
CN111620949A (zh) * | 2019-02-28 | 2020-09-04 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途 |
GB201906127D0 (en) | 2019-05-01 | 2019-06-12 | Immutep S A | Assays |
GB201906118D0 (en) | 2019-05-01 | 2019-06-12 | Immutep S A | Anti-LAG-3 binding molecules |
CA3136568A1 (en) | 2019-05-13 | 2020-11-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer |
EP3984554A4 (en) * | 2019-06-11 | 2023-11-08 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | IMMUNOSUPPRESSION AGENT |
TW202204412A (zh) * | 2020-04-03 | 2022-02-01 | 美商索倫多醫療公司 | 結合lag3之工程化抗體 |
WO2021242876A1 (en) * | 2020-05-27 | 2021-12-02 | Agilent Technologies, Inc. | Anti-human lag-3 antibodies and their use in immunohistochemistry (ihc) |
EP4196502A1 (en) | 2020-08-13 | 2023-06-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of redirecting of il-2 to target cells of interest |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011016238A1 (en) * | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Immunas Pharma, Inc. | Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof |
US20110070238A1 (en) * | 2007-04-30 | 2011-03-24 | Immutep Parc Club Orsay | Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease |
EA201100340A1 (ru) * | 2008-08-11 | 2011-08-30 | Медарекс, Инк. | Человеческие антитела, связывающие ген активатор лимфоцитов-3 (lag-3), и их применение |
Family Cites Families (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57106673A (en) | 1980-12-24 | 1982-07-02 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
US4666884A (en) | 1984-04-10 | 1987-05-19 | New England Deaconess Hospital | Method of inhibiting binding of von Willebrand factor to human platelets and inducing interaction of platelets with vessel walls |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4866132A (en) | 1986-04-17 | 1989-09-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel radiopaque barium polymer complexes, compositions of matter and articles prepared therefrom |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
AU612370B2 (en) | 1987-05-21 | 1991-07-11 | Micromet Ag | Targeted multifunctional proteins |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US5677425A (en) | 1987-09-04 | 1997-10-14 | Celltech Therapeutics Limited | Recombinant antibody |
US5256334A (en) | 1988-09-08 | 1993-10-26 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Homogeneous radiopaque polymer-organobismuth composites |
ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
US5976877A (en) | 1990-01-08 | 1999-11-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Proteins produced by human lymphocytes DNA sequence encoding these proteins and their pharmaceutical and biological uses |
EP0521985B1 (en) | 1990-03-20 | 1997-09-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region |
US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
JP3534749B2 (ja) | 1991-08-20 | 2004-06-07 | アメリカ合衆国 | アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送 |
EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
ES2165851T3 (es) | 1991-11-25 | 2002-04-01 | Enzon Inc | Proteinas multivalentes que se unen a antigenos. |
US5714350A (en) | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
EP0640094A1 (en) | 1992-04-24 | 1995-03-01 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells |
EP0673431A1 (en) | 1992-12-03 | 1995-09-27 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
US5346981A (en) | 1993-01-13 | 1994-09-13 | Miles Inc. | Radiopaque polyurethanes |
CA2115811A1 (en) | 1993-02-17 | 1994-08-18 | Claus Krebber | A method for in vivo selection of ligand-binding proteins |
ES2249761T3 (es) | 1993-06-24 | 2006-04-01 | Advec Inc. | Vectores de adenovirus para terapia genica. |
CN1263864C (zh) | 1993-10-25 | 2006-07-12 | 坎吉公司 | 重组腺病毒载体及其使用方法 |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5625048A (en) | 1994-11-10 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
GB9424449D0 (en) | 1994-12-02 | 1995-01-18 | Wellcome Found | Antibodies |
KR100445103B1 (ko) | 1994-12-09 | 2004-12-04 | 임페리얼 컬리지 이노베이션스 리미티드 | 유전자의동정 |
AU4188196A (en) | 1994-12-22 | 1996-07-10 | Nissan Chemical Industries Ltd. | Organobismuth derivatives and process for producing the same |
US5958713A (en) | 1995-01-31 | 1999-09-28 | Novo Nordisk A/S | Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein |
US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
US5739277A (en) | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5747035A (en) | 1995-04-14 | 1998-05-05 | Genentech, Inc. | Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor |
EP0843557B1 (en) | 1995-07-21 | 2002-11-13 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Methods for detecting, identifying, isolating, and selectively labelling and targeting th1 lymphocytes by means of the lag-3 protein |
US5968738A (en) | 1995-12-06 | 1999-10-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Two-reporter FACS analysis of mammalian cells using green fluorescent proteins |
US5874304A (en) | 1996-01-18 | 1999-02-23 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Humanized green fluorescent protein genes and methods |
US6020192A (en) | 1996-01-18 | 2000-02-01 | University Of Florida | Humanized green fluorescent protein genes and methods |
WO1997035614A1 (en) | 1996-03-27 | 1997-10-02 | Crc For Biopharmaceutical Research Pty. Ltd. | The use of antibodies against cd48 for the treatment of t and b cell lymphomas and leukemias |
WO1997043316A1 (en) | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same |
US5976796A (en) | 1996-10-04 | 1999-11-02 | Loma Linda University | Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes |
TW371617B (en) | 1996-10-09 | 1999-10-11 | Of Animal And Plant Health Inspection And Quarantine Council Of Agriculture Executive Yuan Bureau | Method to transplant GFP into autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus for inflicting pest in an attempt to detect and flow up it existence and to improve life span against UV |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
DE69833755T2 (de) | 1997-05-21 | 2006-12-28 | Biovation Ltd. | Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen |
US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
DE59813875D1 (de) | 1997-09-23 | 2007-02-22 | Bundesrepublik Deutschland Let | Ko-stimulierendes polypeptid von t-zellen, monoklonale antikörper sowie die herstellung und deren verwendung |
US6046305A (en) | 1997-12-12 | 2000-04-04 | Macromed, Inc. | Heterofunctionalized star-shaped poly(ethylene gycols) for protein modification |
HUP0100813A3 (en) | 1998-02-25 | 2003-08-28 | Lexigen Pharmaceuticals Corp L | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-07-08 | Glaxo Group Ltd | Antibody |
WO2000009560A2 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
US5985577A (en) | 1998-10-14 | 1999-11-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Protein conjugates containing multimers of green fluorescent protein |
CN1237076C (zh) | 1999-01-15 | 2006-01-18 | 杰南技术公司 | 具有改变的效应功能的多肽变体 |
EP2264166B1 (en) | 1999-04-09 | 2016-03-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
JP4210454B2 (ja) | 2001-03-27 | 2009-01-21 | 日本たばこ産業株式会社 | 炎症性腸疾患治療剤 |
CA2388245C (en) | 1999-10-19 | 2012-01-10 | Tatsuya Ogawa | The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides |
JP3597140B2 (ja) | 2000-05-18 | 2004-12-02 | 日本たばこ産業株式会社 | 副刺激伝達分子ailimに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
US6374470B1 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-23 | Milliken & Company | Face plate for spun-like textured yarn |
US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
EP1355919B1 (en) | 2000-12-12 | 2010-11-24 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
GB0105924D0 (en) | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Microscience Ltd | Promoter |
US20050089932A1 (en) | 2001-04-26 | 2005-04-28 | Avidia Research Institute | Novel proteins with targeted binding |
US20050053973A1 (en) | 2001-04-26 | 2005-03-10 | Avidia Research Institute | Novel proteins with targeted binding |
NZ603111A (en) | 2001-08-03 | 2014-05-30 | Roche Glycart Ag | Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity |
WO2003076567A2 (en) | 2002-03-05 | 2003-09-18 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
US9321832B2 (en) | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
AU2003288675B2 (en) | 2002-12-23 | 2010-07-22 | Medimmune Limited | Antibodies against PD-1 and uses therefor |
EP3427741A3 (en) | 2003-02-28 | 2019-02-13 | The Johns Hopkins University | T cell regulation |
ES2315664T3 (es) | 2003-06-30 | 2009-04-01 | Domantis Limited | Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados. |
US20050164301A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-07-28 | Avidia Research Institute | LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers |
CN102816241B (zh) | 2004-02-09 | 2015-07-22 | 人类基因科学公司 | 清蛋白融合蛋白 |
AU2005235718B2 (en) | 2004-04-23 | 2011-09-22 | Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch Das Robert-Koch-Institut Vertreten Durch Seinen Prasidenten | Method for the treatment of T cell mediated conditions by depletion of icos-positive cells in vivo |
KR20070034512A (ko) | 2004-06-18 | 2007-03-28 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
AU2005269759A1 (en) | 2004-07-21 | 2006-02-09 | Glycofi, Inc. | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US20060062787A1 (en) | 2004-07-22 | 2006-03-23 | Genentech, Inc. | Method for treating Sjogren's syndrome |
US7923538B2 (en) | 2005-07-22 | 2011-04-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Recombinant antibody composition |
AU2006270718B2 (en) | 2005-07-22 | 2011-07-21 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Genetically modified antibody composition |
EP1987839A1 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-05 | I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale | Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease |
WO2009033161A1 (en) | 2007-09-07 | 2009-03-12 | The John Hopkins University | Adenosine receptor agonists and antagonists to modulate t cell responses |
EP2044949A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Immutep | Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response |
AR077594A1 (es) | 2009-07-31 | 2011-09-07 | Organon Nv | Anticuerpos completamente humanos para btla (atenuante de linfocitos b y t) |
TW201134488A (en) | 2010-03-11 | 2011-10-16 | Ucb Pharma Sa | PD-1 antibodies |
PL2616489T3 (pl) | 2010-09-16 | 2017-07-31 | Baliopharm Ag | Przeciwciało anty-huTNFR1 |
US9701749B2 (en) | 2011-08-11 | 2017-07-11 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Therapeutic agent for autoimmune diseases comprising PD-1 agonist |
AR091649A1 (es) | 2012-07-02 | 2015-02-18 | Bristol Myers Squibb Co | Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos |
EP2970464B1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-05-06 | GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited | Anti-lag-3 binding proteins |
UY36032A (es) | 2014-03-14 | 2015-10-30 | Novartis Ag | Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3 y usos de las mismas |
CA2995639A1 (en) * | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Immutep S.A.S. | Anti-lag-3 antibodies |
-
2016
- 2016-09-01 CA CA2995639A patent/CA2995639A1/en active Pending
- 2016-09-01 EP EP20197814.5A patent/EP3798234A1/en active Pending
- 2016-09-01 JP JP2018511202A patent/JP7074341B2/ja active Active
- 2016-09-01 BR BR112018004181A patent/BR112018004181A2/pt active Search and Examination
- 2016-09-01 IL IL257798A patent/IL257798B1/en unknown
- 2016-09-01 US US15/756,767 patent/US11680104B2/en active Active
- 2016-09-01 CN CN202311238293.2A patent/CN117510633A/zh active Pending
- 2016-09-01 ES ES16759785T patent/ES2842306T3/es active Active
- 2016-09-01 RU RU2018111508A patent/RU2760582C2/ru active
- 2016-09-01 MX MX2018002610A patent/MX2018002610A/es unknown
- 2016-09-01 PL PL16759785T patent/PL3344654T3/pl unknown
- 2016-09-01 KR KR1020187008670A patent/KR20180042412A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-09-01 DK DK16759785.5T patent/DK3344654T3/da active
- 2016-09-01 CN CN201680064139.XA patent/CN108699145A/zh active Pending
- 2016-09-01 RU RU2021133819A patent/RU2021133819A/ru unknown
- 2016-09-01 WO PCT/EP2016/070664 patent/WO2017037203A1/en active Application Filing
- 2016-09-01 AU AU2016316730A patent/AU2016316730B2/en active Active
- 2016-09-01 EP EP16759785.5A patent/EP3344654B1/en active Active
- 2016-09-01 SG SG10201913864RA patent/SG10201913864RA/en unknown
- 2016-09-01 PT PT167597855T patent/PT3344654T/pt unknown
-
2018
- 2018-02-19 PH PH12018500369A patent/PH12018500369A1/en unknown
- 2018-03-01 ZA ZA2018/01432A patent/ZA201801432B/en unknown
- 2018-03-01 MX MX2023001226A patent/MX2023001226A/es unknown
- 2018-11-27 HK HK18115194.2A patent/HK1256116A1/zh unknown
-
2021
- 2021-03-15 JP JP2021041608A patent/JP2021097706A/ja active Pending
-
2022
- 2022-07-14 JP JP2022113055A patent/JP2022137218A/ja active Pending
-
2023
- 2023-05-05 US US18/312,629 patent/US20230272107A1/en active Pending
- 2023-07-11 AU AU2023204589A patent/AU2023204589A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110070238A1 (en) * | 2007-04-30 | 2011-03-24 | Immutep Parc Club Orsay | Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease |
EA201100340A1 (ru) * | 2008-08-11 | 2011-08-30 | Медарекс, Инк. | Человеческие антитела, связывающие ген активатор лимфоцитов-3 (lag-3), и их применение |
WO2011016238A1 (en) * | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Immunas Pharma, Inc. | Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
POIRIER N. et al., Antibody-mediated depletion of lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3+)-activated T lymphocytes prevents delayed-type hypersensitivity in non-human primates, Clinical and Experimental Immunology, Vol.164, pp. 265-274. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2760582C2 (ru) | Анти-LAG-3 антитела | |
AU2019200448B2 (en) | Anti-complement C1s antibodies and uses thereof | |
JP7326393B2 (ja) | 抗補体Bb因子抗体及びその使用 | |
KR20230009441A (ko) | 항-tigit 항체, 이의 제조 방법 및 용도 | |
JP2018513213A (ja) | ヒト化抗C1s抗体及びその使用方法 | |
CA3189730A1 (en) | Anti-tigit antibody and methods of use thereof | |
KR20220044946A (ko) | 항-b7-h3 항체 및 이의 사용 방법 | |
US20220380483A1 (en) | Antibodies that bind to c1s and uses thereof | |
KR20240096672A (ko) | 항-보체 인자 bb 항체 및 이의 용도 |