ES2315664T3 - Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido unido con PEG que comprende uno o dos dominios variables únicos de anticuerpo, en el que el polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y un tamaño total de PEG de 20 a 60 kDa, en el que el tamaño hidrodinámico se determina usando una columna de cromatografía sobre gel Superose 6 HR o 12 HR, una concentración de polipéptido de 1,5 mg/ml, y una velocidad de flujo de 0,5 ml/min; y en el que cada dominio variable comprende una región marco y tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de anticuerpo en el polipéptido y, adicionalmente, en el que dicho PEG se encuentra presente como una o múltiples moléculas unidas al polipéptido a través de un residuo aminoácido en las regiones marco de dichos uno o dos dominios variables únicos de anticuerpo.

Description

Anticuerpos de dominio único (dAb) pegilados.
Antecedentes
Los anticuerpos convencionales son grandes moléculas de proteínas de múltiples subunidades, que comprenden al menos cuatro cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, la IgG humana exhibe dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que están unidas por puentes disulfuro para formar el anticuerpo funcional. El tamaño de una IgG convencional es de aproximadamente 150 kD. Debido a su tamaño relativamente grande, los anticuerpos completos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, etc.) ven limitada su utilidad terapéutica debido a problemas, por ejemplo, para penetrar en los tejidos. Se han centrado esfuerzos considerables en la identificación y producción de fragmentos de anticuerpo más pequeños que retienen la función de unión al antígeno y la solubilidad.
Las cadenas polipeptídicas pesadas y ligeras de los anticuerpos comprenden regiones variables (V) que participan directamente en las interacciones con antígenos, y regiones constantes (C) que proporcionan soporte estructural y funcionan en interacciones no antígeno-específicas con los efectores inmunológicos. El dominio de unión al antígeno de un anticuerpo convencional está formado por dos dominios separados: un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) y un dominio variable de cadena ligera (V_{L}: que puede ser V_{\kappa} o V_{\lambda}). El sitio de unión al antígeno propiamente tal está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio V_{H} (H1, H2 y H3), y tres del dominio V_{L} (L1, L2 y L3). In vivo, la redistribución combinatoria de segmentos de genes producen un repertorio primario diverso de genes V, que codifican los dominios V_{H} y V_{L}. Las regiones C incluyen las regiones C de cadena ligera (a las que se designa regiones C_{L}) y las regiones de cadena pesada (denominadas regiones C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3).
Después de la digestión con proteasa, se ha identificado una serie de fragmentos más pequeños de unión a antígenos procedentes de anticuerpos de origen natural. Éstos incluyen, por ejemplo, el "fragmento Fab" (V_{L}-C_{L}-C_{H}1-V_{H}), el "fragmento Fab'" (un Fab con la región bisagra de la cadena pesada), y el "fragmento F(ab')_{2}" (un dímero de fragmentos Fab' enlazados por la región bisagra de la cadena pesada). Se han utilizado métodos recombinantes para generar fragmentos de unión a antígenos incluso de menor tamaño, a los que se designa "Fv" de cadena única'' (fragmento variable) o "scFv", consistentes en V_{L} y V_{H} unidos por un enlazador peptídico sintético.
Mientras que se sabe que la unidad de unión al antígeno de un anticuerpo de origen natural (por ejemplo, en el ser humano y en la mayor parte de otros mamíferos) está compuesta generalmente por un par de regiones V (V_{L}/V_{H}), las especies camélidas expresan una elevada proporción de anticuerpos completamente funcionales y altamente específicos que están exentos de secuencias de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de los camélidos se detectan como homodímeros de una única cadena pesada, dimerizados a través de sus regiones constantes. Los dominios variables de estos anticuerpos camélidos de cadena pesada se designan como dominios V_{H}H y conservan la capacidad de, una vez aislados como fragmentos de la cadena V_{H}, unirse a los antígenos con una alta especificidad (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363:446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Se han identificado también dominios de V_{H} única que se unen a antígenos en, por ejemplo, una biblioteca de genes V_{H} de ratón amplificados a partir de ADN genómico procedente de bazos de ratones inmunizados y expresados en E. coli (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546).Ward et al. denominaron los dominios V_{H} únicos aislados "dAbs" como abreviatura de "anticuerpos de dominio". En el presente documento, la expresión "dAb" hará referencia a un polipéptido de dominio (V_{H} o V_{L}) variable único de anticuerpo que se une específicamente a antígenos. Un "dAb" se une al antígeno de manera independiente de otros dominios V; sin embargo, tal como se utiliza el término en este documento, un "dAb" puede estar presente en un homo- o heteromultímero con otros dominios V_{H} o V_{L}, donde los otros dominios no son necesarios para la unión del antígeno por parte del dAb, es decir, cuando el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios V_{H} o V_{L} adicionales.
Los dominios variables de los anticuerpos, por ejemplo, V_{H}H, son la unidad de anticuerpo más pequeña conocida que se une a los antígenos. Para el uso terapéutico, se prefieren los anticuerpos humanos, principalmente debido a su baja probabilidad de provocar una respuesta inmune cuando se administran a pacientes. Como se ha indicado anteriormente, los dominios V_{H} no camélidos aislados tienden a ser relativamente insolubles y, a menudo, se expresan de manera escasa. La comparación de V_{H}H camélido con los dominios V_{H} de anticuerpos humanos revela varias diferencias clave en las regiones marco del dominio V_{H}H camélido correspondientes a la interface V_{H}/V_{L} de los dominios V_{H} humanos. Se ha llevado a cabo la mutación de estos residuos de V_{H}3 humano para asemejarse más a la secuencia V_{H}H (específicamente Gly 44\rightarrowGlu, Leu 45\rightarrowArg y Trp 47\rightarrowGly) para producir dominios V_{H} humanos "camelizados" que conservan la actividad de unión a antígenos (Davies y Riechman, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290), disponiendo, sin embargo, de una expresión y solubilidad mejoradas. (La numeración de los aminoácidos del dominio variable utilizada en este documento concuerda con la convención de numeración de Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5ª ed., Ministerio de Sanidad y Servicios Humanos de EE.UU., Washington, D.C.). El documento WO 03/035694 (Muyldermans) informa de que la mutación Trp 103\rightarrowArg mejora la solubilidad de dominios V_{H} no camélidos. Davies y Riechman (1995, Biotechnology N.Y. 13: 475-479) informan también acerca de la producción de un repertorio expresado en fagos de dominios V_{H} humanos camelizados, y de una selección de clones que fijan haptenos, con afinidades dentro del intervalo de 100-400 nM, pero los clones seleccionados para unirse a antígenos proteicos tuvieron afinidades más débiles.
El documento WO 00/29004 (Plaskin et al.) y Reiter et al. (1999, J. Mol. Biol. 290: 685-698) describen dominios V_{H} aislados de anticuerpos de ratón expresados en E. coli, que son muy estables y se unen a antígenos proteicos con una afinidad en el intervalo nanomolar. El documento WO 90/05144 (Winter et al.) describe un fragmento de anticuerpo de dominio V_{H} de ratón que se fija al antígeno experimental lisozima con una constante de disociación de 19 nM.
El documento WO 02/051870 (Entwistle et al.) describe fragmentos de anticuerpo de dominio único V_{H} humanos que se fijan a antígenos experimentales, incluido un dominio V_{H} que se une a un scFv específico para un antígeno de Brucella con una afinidad de 117 nM, y un dominio V_{H} que se une a una IgG anti-FLAG.
Tanha et al. (2001, J. Biol. Chem. 276: 24774-24780) describen la selección de dominios V_{H} humanos camelizados que fijan dos anticuerpos monoclonales usados como antígenos experimentales, y que tienen constantes de disociación en el intervalo micromolar.
El documento U.S. 6.090.382 (Salfeld et al.) describe anticuerpos humanos que fijan TNF-\alpha humano con afinidades de 10^{-8} M o menores, tienen un índice de disociación ("velocidad off", K_{off}) para la disociación de TNF-\alpha humano de 10^{-3} seg^{-1} o menor, y neutralizan la actividad del TNF-\alpha humano en un ensayo convencional de células L929.
Mientras que muchos anticuerpos y sus derivados tienen utilidad diagnóstica y terapéutica, normalmente no suele alcanzarse la farmacocinética ideal de los anticuerpos en una aplicación particular. Con el fin de optimizar la farmacocinética de las moléculas de anticuerpo, la presente invención ofrece polipéptidos de región variable de dominios únicos que se encuentran unidos a polímeros que confieren estabilidad y semivida aumentadas. La unión de moléculas polímeras (por ejemplo, polietilenglicol, PEG) a proteínas es un hecho bien establecido y se ha demostrado que modula las propiedades farmacocinéticas de las proteínas modificadas. Por ejemplo, se ha demostrado que la modificación con PEG de proteínas altera la semivida circulante, antigenicidad, solubilidad y resistencia a la proteólisis de las proteínas in vivo (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1977, 252:35678; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6:133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R.T. ed.); y Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991, págs. 235-263, Plenum, NY).
La PEGilación tanto sitio-específica como aleatoria de moléculas proteicas es conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, Zalipsky y Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, págs. 347-370, Plenum, NY; Goodson y Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991, PNAS 88:7185). De manera más específica, se ha descrito la PEGilación aleatoria de moléculas de anticuerpo en residuos de lisina y derivados tiolados (Ling y Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al., 1987, Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et al., 1991, Cancer Res. 51: 4310; Delgado et al., 1996, Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley et al., 1994, Br. J. Cancer, 70:1126).
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la unión de restos polímeros tales como PEG a polipéptidos de dominio variable único de anticuerpos (anticuerpos de dominio; dAb) confiere una semivida más prolongada in vivo y una mayor resistencia a la proteólisis, sin pérdida de la actividad del dAb ni de la afinidad de unión a la diana. La invención ofrece, igualmente, moléculas de dAb en diversos formatos, incluidos dímeros, trímeros y tetrámeros unidos a una o múltiples moléculas polímeras tales como PEG. La invención se define en su sentido más amplio en la reivindicación 1 de las reivindicaciones anexas al documento.
En una realización, la presente invención comprende un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1, donde el polipéptido tiene una semivida de entre 1,3 y 70 horas.
En una realización, el polipéptido conjugado con PEG retiene al menos 90% de su actividad en relación con el mismo polipéptido no conjugado con PEG, donde la actividad se mide por afinidad del polipéptido conjugado o no conjugado con PEG por un ligando diana.
En una realización, cada dominio variable comprende un marco universal.
En una realización adicional, el marco universal comprende un marco V_{H}, seleccionado de un grupo consistente en DP47, DP45 y DP38; y/o el marco V_{L} es DPK9.
La presente invención comprende también un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1, que comprende un sitio de unión de antígeno específico para TNF-\alpha, donde el polipéptido tiene uno o dos dominios variables de anticuerpo, cada uno de los cuales exhibe un sitio de unión de TNF-\alpha.
En una realización, el polipéptido se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-7} a 1x10^{-1} s^{-1}, según se determina por una resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, el polipéptido neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, el polipéptido conjugado con PEG comprende un marco universal, donde el citado marco universal comprende un marco V_{H} seleccionado del grupo consistente en DP47, DP45 y DP38; y/o el marco V_{L} es DPK9.
La invención comprende, asimismo, un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1, que tiene una semivida de al menos 1,3 horas, y en el que el PEG está unido directa o indirectamente al dominio variable único del anticuerpo a un residuo cisteína o lisina del dominio variable único del anticuerpo.
En una realización, el residuo cisteína o lisina se encuentra en la localización predeterminada en el dominio variable único del anticuerpo.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C terminal del dominio variable único del anticuerpo.
En una realización, el PEG está conjugado en el dominio variable único del anticuerpo con el residuo cisteína o lisina presente en una región marco del dominio variable diferente del extremo C- o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, el PEG está conjugado con el dominio variable único del anticuerpo en un residuo cisteína o lisina situado al menos a dos residuos de distancia de los extremos C- y/o N-terminales.
En una realización, el PEG está unido a un dominio variable de cadena pesada que comprende un residuo cisteína o lisina, sustituido en una posición seleccionada del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo comprende una región bisagra C- terminal.
En una realización, uno o más residuos predeterminados de dicho dominio variable único del anticuerpo han mutado a un residuo cisteína o lisina, y donde dicho PEG está unido con dicho residuo mutado.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo es un dominio variable de cadena pesada.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo es un dominio variable de cadena ligera (V_{L}).
En una realización, el polipéptido tiene una semivida de entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
La invención incluye también un polipéptido según la definición de la reivindicación 1, en forma de un multímero conjugado con PEG de dominios variables único de anticuerpo que poseen una semivida de al menos 1,3 horas, donde dicho PEG está conjugado con dicho multímero en un residuo cisteína o lisina de dicho multímero, y en el que cada dominio variable tiene un sitio de unión de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de anticuerpo en el polipéptido.
En una realización, el multímero es un dímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el multímero es un trímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el multímero es un tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el residuo cisteína o lisina se encuentra en el extremo C-terminal o N-terminal de un dominio variable único de anticuerpo comprendido por dicho multímero.
En una realización, uno o más residuos predeterminados de al menos uno de dichos dominios variables únicos de anticuerpo mutan en un residuo cisteína o lisina, donde PEG está conjugado con dicho residuo mutado.
En una realización, el residuo mutado se halla presente en la región marco del dominio variable único de anticuerpo diferente del extremo C-terminal o N-terminal de dichos dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el polipéptido del dominio variable único de anticuerpo es un dominio variable de cadena pesada, y dicho residuo mutado se selecciona del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
En una realización, el PEG está conjugado con dichos dominios variables únicos de anticuerpo en un residuo cisteína o lisina separado por al menos dos residuos del extremo C- y/o N-terminal.
En una realización, la semivida es de entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 5,8 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
La invención incluye también un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con PEG que comprenden tres o más dominios variables únicos de anticuerpo, donde el dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único.
El multímero tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa.
En una realización, el multímero tiene 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el multímero conjugado con PEG tiene una semivida de al menos 1,3 horas.
En una realización, la semivida se encuentra entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 alfa de entre 0,55 y 6 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, el PEG está conjugado con dicho trímero o tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo en un residuo cisteína o lisina predeterminado, proporcionado por una región marco del dominio variable del multímero.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal o N-terminal de un dominio variable único de anticuerpo de dicho multímero.
En una realización, uno o más residuos predeterminados de dicho dominio variable único de anticuerpo han mutado a un residuo cisteína o lisina, donde PEG está conjugado con dicho residuo mutado.
En una realización, el residuo mutado está presente en la región marco del dominio variable único de anticuerpo diferente del extremo C-terminal o N-terminal de dichos dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el dominio variable único del anticuerpo es un dominio variable de cadena pesada, y dicho residuo mutado se selecciona del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
En una realización, el PEG está conjugado con dichos dominios variables únicos de anticuerpo en un residuo cisteína o lisina, que está a una distancia de al menos dos residuos del extremo C- o N-terminal.
La invención incluye, igualmente, un polipéptido según la definición de la reivindicación 1, que comprende un sitio de unión específico para TNF-\alpha, donde dicho polipéptido comprende uno o dos dominios variables de anticuerpo.
En una realización, cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de anticuerpo en el polipéptido.
El polipéptido está conjugado con un polímero PEG que tiene un tamaño de entre 20 y 60 kDa.
El polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa.
En una realización, la semivida es de entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el polipéptido tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el polipéptido tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, el polipéptido comprende un dominio variable que está conjugado con un resto PEG en un residuo cisteína o lisina de dicho dominio variable.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, uno o más residuos predeterminados de dicho dominio variable han mutado a un residuo cisteína o lisina, donde dicho PEG está conjugado con dicho residuo mutado.
En una realización, en residuo mutado está presente en la región marco del dominio variable único de anticuerpo diferente del extremo C-terminal o N-terminal de dichos dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada, y dicho residuo mutado se selecciona del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
La invención comprende un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo, donde dicho homomultímero tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 1,3 horas.
En una realización, cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único en el homomultímero.
El homomultímero está conjugado con al menos un polímero PEG.
En una realización, la semivida es de entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el homomultímero tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el homomultímero tiene una t1/2 beta de entre 1 y 40 horas.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho homomultímero comprende un dominio variable de cadena pesada o de V_{L}.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho homomultímero ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los dominios variables únicos de anticuerpo de dicho homomultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el homomultímero comprende sólo un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, donde dicho primer dominio variable único de anticuerpo de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y donde dicho segundo dominio variable único de anticuerpo de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
En una realización, el homomultímero muestra especificidad por TNF-\alpha.
En una realización, el homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, el homomultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo de dicho homomultímero fija TNF-\alpha.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie. En una realización, el homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo de dicho homomultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La invención comprende, adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo, donde dicho heteromultímero tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 1,3 horas, y donde cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable único de anticuerpo fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único en el heteromultímero.
El heteromultímero está conjugado con al menos un polímero PEG.
En una realización, la semivida del homomultímero es de entre 1,3 y 170 horas.
En una realización, el heteromultímero tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el heteromultímero tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero comprende un dominio variable de cadena pesada o de V_{L}.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los dominios variables únicos de anticuerpo de dicho heteromultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el heteromultímero comprende sólo un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, donde dicho primer dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y donde dicho segundo dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
En una realización, el heteromultímero muestra especificidad por TNF-\alpha.
En una realización, el heteromultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, el heteromultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero muestra especificidad por TNF-\alpha.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, cada dominio variable único del anticuerpo de dicho heteromultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La invención comprende, asimismo, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG específico para un ligando diana que conserva la actividad en relación con un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG, que presenta el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG, donde la actividad se mide por afinidad de dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG por el ligando diana.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG retiene al menos 90% de la actividad del mismo dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad de dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 o DM50 que no es más de 10% mayor que la CI50 o ND50, respectivamente, de un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG que posee el mismo dominio variable único de anticuerpo que dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG.
La invención incluye también un dominio variable único de anticuerpo conjugado a PEG específico para un antígeno diana, que fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
La invención incluye también un dominio variable único de anticuerpo conjugado a PEG específico para un antígeno diana, que fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
La invención incluye también un dominio variable único de anticuerpo conjugado a PEG específico para un antígeno diana, que fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se fija al TNF-\alpha con una constante de disociación (K_{d}) de 60 nM a 20 pm y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la unión se mide como la capacidad de dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La presente invención incluye, todavía adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con PEG que retiene la actividad, en relación con un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG que posee el mismo dominio variable único de anticuerpo que dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG, donde la actividad se mide por la afinidad de dicho homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado o no conjugado con PEG por un ligando diana.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG retiene 90% de la actividad del mismo homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, la actividad se mide como la unión de dicho homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG a TNF-\alpha.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad de dicho homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG para inhibir la citotoxicidad en respuesta a TNF-\alpha.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 que no es más de 10% mayor que la CI50 del homomultímero de dominios variables de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, cada miembro de dicho homomultímero comprende un dominio variable de cadena pesada o de V_{L}.
En una realización, el homomultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo que ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los miembros de dicho multímero están unidos entre sí a través de un enlazador peptídico.
En una realización, cuando dicho multímero comprende sólo un primer y un segundo miembro, dicho primer miembro de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y dicho segundo miembro de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
La invención comprende, todavía adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo, conjugado con PEG, que retiene la actividad con respecto al mismo heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG, donde la actividad se mide por la afinidad de dicho heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG o del
heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG, en relación con un ligando diana.
En una realización, la actividad se mide como la unión de dicho heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG con TNF-\alpha.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad de dicho heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG para inhibir la citotoxicidad celular en respuesta a TNF-\alpha-.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 que no es más de 10% mayor que la CI50 de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG que presenta el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG.
En una realización, cada miembro de dicho heteromultímero comprende un dominio variable de cadena pesada o de V_{L}.
En una realización, cada uno de estos dominios variables únicos de anticuerpo ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los miembros de dicho heteromultímero están unidos entre sí por medio de un enlazador peptídico.
En una realización, el multímero comprende sólo un primer y un segundo miembro, donde dicho primer miembro de dicho heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y dicho segundo miembro de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
En una realización, el homo- o heteromultímero anterior se selecciona del grupo consistente en un dímero, trímero y tetrámero.
En una realización, el resto PEG del homo- o heteromultímero anterior es un PEG ramificado.
La invención comprende, igualmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG se une con TNF-\alpha con una constante de disociación (K_{d}) de 5 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la unión se mide como la capacidad de dicho homomultímero conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TGF en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
La presente invención incluye un polipéptido según se define en la reivindicación 1 que comprende un dominio variable único de anticuerpo que comprende al menos un residuo lisina accesible al disolvente en una localización predeterminada de dicho dominio variable único de anticuerpo que está conjugado con una molécula de PEG.
En una realización, el PEG está unido a dicha lisina accesible el disolvente en forma de un éster activo de N-hidroxilsuccinimida conjugado con PEG.
En una realización, el éster activo de N-hidroxilsuccinimida se selecciona del grupo consistente en PEG-O-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-S-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; PEG-O_{2}CNH-CH(R)-CO_{2}-NHS; PEG-NHCO-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; y PEG-O-CH_{2}-CO_{2}-NHS; donde R es (CH_{2})_{4})NHCO_{2}(mPEG).
En una realización, el PEG es un PEG ramificado.
La invención comprende un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en la forma de un multímero de dominios variables únicos de anticuerpo, donde cada miembro de dicho multímero comprende al menos un residuo lisina accesible al disolvente, que está unido con una molécula de PEG.
En una realización, el residuo lisina accesible al disolvente es resultado de una mutación en uno o más residuos seleccionados del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
En una realización, el multímero es un homomultímero.
En una realización, el multímero es un heteromultímero.
En una realización, el multímero es un hetero- u homotrímero.
En una realización, el multímero es un hetero- u homotetrámero.
La invención comprende también un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homo- o heterotrímero o tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo que comprende al menos un residuo lisina accesible al disolvente, que está unido a una molécula de PEG.
En una realización, el PEG está unido a dicha cisteína accesible al disolvente por medio de un reactivo selectivo para sulfhidrilo, seleccionado del grupo consistente en maleimida, vinil-sulfona y tiol.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo es un dominio variable de cadena pesada y dicho residuo cisteína accesible al disolvente es resultado de una mutación en uno o múltiples residuos seleccionados del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
La invención comprende también un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un polipéptido de regiones variables de anticuerpo conjugado con PEG que tiene una semivida que es, al menos, siete veces mayor que la semivida del mismo polipéptido de regiones variables de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, la región variable de anticuerpo conjugada con PEG tiene un tamaño hidrodinámico de entre 24 kDa y 500 kDa.
La presente invención comprende una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1; y un vehículo.
En una realización, la formulación farmacéutica comprende un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1, en forma de un heterotrímero u homotrímero u homotetrámero o heterotetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo , donde cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único.
En una realización, la formulación farmacéutica comprende un polipéptido conjugado con PEG según se define en la reivindicación 1, que comprende un dominio variable único de anticuerpo, donde dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se degrada en no más de 10% tras la administración de dicha formulación farmacéutica al estómago de un animal.
Preferentemente, dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se degrada en no más de 10% in vitro, por la exposición a una proteasa seleccionada del grupo consistente en pepsina, tripsina, elastasa, quimotripsina, y carboxipeptidasa, donde si dicha proteasa es pepsina, entonces dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se degrada en no más de 10% en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos y, donde, si dicha proteasa es tripsina, elastasa, quimotripsina y carboxipeptidasa, entonces dicho dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se degrada en no más de 10% en presencia de tripsina, elastasa, quimotripsina y carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos.
En una realización, la formulación farmacéutica es apropiada para la administración oral o es apropiada para la administración parenteral, a través de una vía seleccionada del grupo consistente en inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, implantación, administración rectal y trasdérmica.
En una realización, la formulación farmacéutica es una formulación de dosificación parenteral u oral de liberación prolongada.
En una realización, uno o múltiples residuos predeterminados del dominio variable único de anticuerpo han mutado a un residuo cisteína o lisina, donde el PEG está unido con el residuo mutado.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo es un dominio variable de cadena pesada (V_{H}).
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo es un dominio variable de cadena ligera (V_{L}).
En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con el polímero tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con el polímero tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
La presente invención comprende, asimismo, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un multímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo que tiene una semivida de al menos 0,25 horas, y donde el PEG está conjugado con el multímero en un residuo cisteína o lisina del multímero, y donde cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de antígeno en el multímero.
En una realización, el multímero es un dímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el multímero es un trímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización adicional, el multímero es un tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal de un dominio variable único de anticuerpo comprendido por el multímero.
En una realización, uno o múltiples residuos predeterminados de al menos uno de los dominios variables únicos de anticuerpo ha mutado en un residuo cisteína o lisina, donde el PEG está conjugado con el residuo mutado.
En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 5,8 horas.
En una realización, el dominio variable de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
La presente invención comprende también un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un multímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo que comprende tres o más dominios variables únicos de anticuerpo, donde el dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único.
El multímero conjugado con PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa.
En una realización, el multímero tiene 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dominios variables únicos de anticuerpo.
En una realización, el multímero conjugado con PEG tiene una semivida de al menos 0,25 horas. En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 alfa de entre 0,55 y 6 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, el PEG está unido con el trímero o tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo en un residuo cisteína o lisina predeterminado, proporcionado por un dominio variable del multímero.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal de un dominio variable único de anticuerpo del multímero.
En una realización, uno o múltiples residuos predeterminados del dominio variable único de anticuerpo han mutado a un residuo cisteína o lisina, donde el PEG está unido al residuo mutado.
La invención comprende, adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, que comprende un sitio de fijación de antígeno, donde el polipéptido comprende uno o dos dominios variables de anticuerpo, donde el polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 0,25 horas, donde cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de anticuerpo en el polipéptido.
En una realización, el polipéptido comprende un sitio de unión específico para TNF-\alpha, donde el polipéptido comprende uno o dos dominios variables de anticuerpo, donde el polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 0,25 horas.
En una realización, cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo en el polipéptido.
El polipéptido está unido a un polímero PEG que tiene un tamaño de entre 20 y 60 kDa.
El polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa.
En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el polipéptido tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, el polipéptido comprende un dominio variable que está unido a un resto PEG en un residuo cisteína o lisina del dominio variable.
En una realización, el residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal del dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, uno o múltiples residuos predeterminados del dominio variable han mutado en un residuo cisteína o lisina, donde el PEG está único al residuo mutado.
La invención comprende, igualmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo, donde el homomultímero tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 0,25 horas.
En una realización, cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único en el homomultímero.
El homomultímero está unido a al menos un polímero PEG.
En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el homomultímero tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el homomultímero tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero comprende V_{H} o V_{L}.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero está tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal del dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los dominios variables únicos de anticuerpo del homomultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el homomultímero comprende sólo un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, donde el primer dominio variable único de anticuerpo del homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CHI), y donde el segundo dominio variable único de anticuerpo del homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena
ligera (CL).
En una realización, el homomultímero muestra especificidad por TNF-\alpha.
En una realización, el homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, el homomultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero fija TNF-\alpha.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie. En una realización, el homomultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del homomultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La invención incluye, adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo, donde el heteromultímero tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y una semivida de al menos 0,25 horas, y donde cada dominio variable tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable único de anticuerpo fija el antígeno como un dominio variable de anticuerpo único en el heteromultímero.
El heteromultímero está unido al menos a un polímero PEG.
En una realización, la semivida es de entre 0,25 y 170 horas.
En una realización, el heteromultímero tiene una t1/2 alfa de entre 0,25 y 6 horas.
En una realización, el heteromultímero tiene una t1/2 beta de entre 2 y 40 horas.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero comprende un V_{H} o V_{L}.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal del dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los dominios variables únicos de anticuerpo del heteromultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el heteromultímero comprende solamente un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, donde el primer dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y donde el segundo dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
En una realización, el heteromultímero muestra especificidad por TNF-\alpha.
En una realización, el heteromultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, el heteromultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero muestra especificidad por
TNF-\alpha.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, cada dominio variable único de anticuerpo del heteromultímero neutraliza el TNF-\alpha humano en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La invención comprende también un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG específico para un ligando diana, que retiene la actividad, con respecto a un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG y que tiene el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG, donde la actividad se mide por afinidad del dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG o no conjugado con PEG frente al ligando
diana.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG retiene al menos 90% de la actividad de un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, la actividad se mide por resonancia de plasmón de superficie como la unión del dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG a TGF-\alpha.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad del dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
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En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 o DN50 que no es más de 10% mayor que la CI50 o DN50, respectivamente, de un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG que posee el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG específico para un antígeno diana fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG fija específicamente el antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG se une con TNF-\alpha con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la unión se mide como la capacidad del dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
La presente invención comprende, igualmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG que retiene la actividad, con respecto a un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG que tiene el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG, donde la actividad se mide por afinidad del homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG o no conjugado con PEG frente al ligando diana.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG retiene 90% de la actividad de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, la actividad se mide como la unión del homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG a TNF-\alpha.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad del homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG para inhibir la citotoxicidad celular en respuesta a TNF-\alpha.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 que no es más de 10% mayor que la CI50 de un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG.eur cada miembro del homomultímero comprende V_{H} o V_{L}.
En una realización, el homomultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo que ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal del dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los miembros del homomultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el multímero comprende sólo un primer y un segundo miembro, donde el primer miembro del homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y el segundo miembro del homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
La invención comprende, todavía adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG que conserva la actividad, con respecto al heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG que tiene el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG, donde la actividad se mide por afinidad del heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG o no conjugado con PEG frente a un ligando diana.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG retiene 90% de la actividad de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG.
En una realización, la actividad s mide como la unión del heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG a TNF-\alpha.
En una realización, la actividad se mide como la capacidad del heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG para inhibir la citotoxicidad celular en respuesta a TNF-\alpha.
En una realización, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG tiene una CI50 que no es más de 10% mayor que la CI50 de un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo no conjugado con PEG que posee el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG.
En una realización, cada miembro del heteromultímero comprende V_{H} o V_{L}.
En una realización, cada uno de los dominios variables únicos de anticuerpo ha sido tratado por ingeniería para contener un residuo cisteína adicional en el extremo C-terminal del dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, los miembros del heteromultímero están unidos entre sí por un enlazador peptídico.
En una realización, el multímero comprende sólo un primer y un segundo miembro, donde el primer miembro del heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y el segundo miembro del homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
La invención incluye, todavía adicionalmente, un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un homomultímero conjugado con PEG de dominios variables únicos de anticuerpo que se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG se une con TNF-\alpha con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de índice K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
En una realización, la unión se mide como la capacidad del homomultímero conjugado con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
En una realización, el homomultímero conjugado con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
En una realización, el homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
En una realización, el homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
En una realización, el heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG se une específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
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Definiciones
Tal como se usa en este documento, el término "dominio" se refiere a una estructura de proteínas plegada que retiene su estructura terciaria, independientemente del resto de la proteína. Por lo general, los dominios son responsables de discretas propiedades funcionales de las proteínas y, en muchos casos, se pueden agregar, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.
Por "dominio variable único de anticuerpo" se entiende un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulinas, y que fija específicamente un antígeno como un dominio variable único; es decir, sin ningún dominio variable complementario. Un "dominio variable único de anticuerpo" incluye, por lo tanto, dominios variables de anticuerpo completos, así como dominios variables modificados, por ejemplo, donde se han sustituido uno o múltiples bucles por secuencias que no son características de dominios variables anticuerpo o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados, o comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor), y la especificidad por el antígeno diana del dominio de longitud completa. Preferentemente, un dominio variable único de anticuerpo de utilidad en la invención se selecciona del grupo de V_{H} y V_{L}, incluidas V_{kappa} y V_{lambda}. De acuerdo con la presente invención, los métodos y composiciones descritos en este documento que utilizan dominios V_{H} pueden utilizar también dominios V_{HH} camélidos. Los dominios variables únicos de anticuerpo son conocidos en la técnica y aparecen descritos, por ejemplo, en Ward et al., Nature, 1989 Oct. 12:341 (6242):544-6, que se incorpora en su totalidad a este documento como referencia.
La expresión "dominio variable único de anticuerpo" comprende no sólo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos de mayor tamaño que comprenden uno o múltiples monómeros de una secuencia de polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo. Un "dominio de anticuerpo" o "dAb" es equivalente a un polipéptido de "dominios variables únicos de anticuerpo" según el término empleado en este documento. Un polipéptido de dominios variables únicos de anticuerpo, tal como se usa en este documento, hace referencia a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina único de mamífero, preferentemente humano, pero incluye también dAbs de roedores (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 00/29004, cuyo contenido se incorpora a este documento en su totalidad) o V_{HH} camélido. Los dAbs camélidos son polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo que se derivan de especies que incluyen el camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada que están naturalmente exentos de cadena ligera: V_{HH}. Las moléculas V_{HH} son aproximadamente 10 veces más pequeñas que las moléculas de IgG y, como polipéptidos sencillos, son muy estables, y resistentes a condiciones de pH y temperatura extremas. Adicionalmente, los polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo camélidos son resistentes a la acción de las proteasas. Se describen anticuerpos camélidos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 5.759.808; 5.800.988; 5.840.526; 5.874.541; 6.005.079; y 6.015.695, cuyos contenidos se incorporan a este documento en su totalidad. Polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo camélidos útiles según la invención incluyen una clase de polipéptidos de dominios VHH variables únicos de anticuerpo camélido que poseen secuencias similares a las humanas, donde la clase se caracteriza porque los dominios VHH portan un aminoácido del grupo consistente en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, Metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en la posición 45 tal como, por ejemplo, L45 y comprenden, adicionalmente un triptófano en posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat. Se describen polipéptidos de V_{HH} camélido humanizados, por ejemplo, en el documento WO 04/041862, el cual se incorpora a este documento en su totalidad. El experto en la técnica entenderá que los polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo camélidos de origen natural pueden ser modificados de acuerdo con las enseñanzas del documento WO 04/041862 (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 45 y 103) para generar polipéptidos de V_{HH} camélidos humanizados.
De acuerdo con la invención, las expresiones "polipéptido de dominio variable único de anticuerpo", "dominio variable único de anticuerpo", "dominio variable de anticuerpo único" y "dominio variable único de inmunoglobulina" se entienden como equivalentes.
Tal como se usa en este documento, la expresión "secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es homóloga durante 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más o, incluso, 50 o más aminoácidos contiguos, a una secuencia comprendida por una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
Tal como se usa en este documento, "unido" /"enlazado"/"conjugado" se refiere a la unión de un resto de polímero PEG, a un residuo aminoácido de un dominio variable único de anticuerpo o polipéptido de la invención. La conjugación de un polímero PEG a un residuo aminoácido de un dAb o polipéptido se denomina "PEGilación", y se puede lograr usando varios restos de unión de PEG, incluidos, pero sin estar limitados a los mismos, un éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS), propionato de succinimidilo (SPA), maleimida (MAL), vinil-sulfona (VS) o tiol. Un polímero PEG puede estar unido a un polipéptido dAb en una posición predeterminada, o se puede unir de forma aleatoria a la molécula de dAb. Sin embargo, se prefiere que el polímero PEG esté unido al dAb o al polipéptido en una posición predeterminada. Un polímero PEG puede estar unido a cualquier residuo en el dAb o el polipéptido, si bien es preferible que el polímero esté unido a una lisina o cisteína, que o bien existe de manera natural en el dAb o polipéptido, o ha sido insertada por ingeniería en el dAb o polipéptido, por ejemplo, por mutagénesis de un residuo de origen natural en el dAb en una cisteína o lisina. Tal como se usa en este documento, "unido" puede hacer referencia, también a la asociación de dos o más monómeros polipeptídicos de dominio variable único de anticuerpo para formar un dímero, trímero, tetrámero u otro multímero. Los monómeros de dAb pueden unirse para formar un multímero por medio de varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, la expresión de los monómeros de dAb como proteínas de fusión, unión de dos o más monómeros a través de un enlazador peptídico entre monómeros, o uniendo los monómeros de forma química después de la traducción, ya sea directamente entre sí, o a través de un enlazador por enlaces disulfuro, o mediante unión a un resto enlazador di-, tri- o multivalente (por ejemplo, un PEG "multi-brazo").
Tal como se usa en este documento, la expresión "unido directamente" con respecto a un polímero "unido directamente" con un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo hace referencia a una situación en la que el polímero está unido a un residuo (de origen natural o insertado por ingeniería) que forma parte del dominio variable, por ejemplo, que no está contenido en una región constante, una región bisagra ni en un péptido de enlace. Por el contrario, como se usa en este documento, la expresión "unido indirectamente" a un dominio variable único de anticuerpo se refiere a la unión de una molécula de polímero a un dominio variable único de anticuerpo, donde el polímero no está unido a un residuo aminoácido que forma parte de la región variable (por ejemplo, puede estar unido a una región bisagra). Un polímero se encuentra "unido indirectamente" si lo está con el dominio variable único a través de un péptido de enlace, es decir, el polímero no está unido a un residuo aminoácido que forma parte del propio dominio variable único de anticuerpo. De manera alternativa, un polímero se encuentra "unido indirectamente" a un dominio variable único de anticuerpo si lo está a una región bisagra C-terminal del dominio variable único, o unido a cualquier residuo de una región constante, que puede estar presente como parte del polipéptido de dominio variable único de anticuerpo.
Tal como se usa en este documento, los términos "homología" o "similitud" o "identidad" se refiere al grado de parecido estructural entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos. Una secuencia homóloga, según la invención, puede ser un polipéptido modificado por la adición, deleción o sustitución de aminoácidos, donde dicha modificación no altera de forma sustancial las características funcionales en comparación con el polipéptido no modificado. Cuando el polipéptido de dominio variable único de anticuerpo de la invención es un polipéptido camélido, una secuencia homóloga, según la invención, puede ser una secuencia que existe en otra especie camélida tal como camello, dromedario, llama, alpaca y guanaco. Tal como se usa en este documento, "similitud" de secuencia es una medición del grado en que las secuencias de aminoácidos comparten residuos aminoácidos similares en posiciones correspondientes cuando las secuencia están alineadas. De manera específica, "similitud" incluye aminoácidos que son sustitutos conservativos uno de otro. Una sustitución "conservativa" es cualquier sustitución que tiene una puntuación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Por la afirmación "la secuencia A es n% similar a la secuencia B" se quiere indicar que n% de las posiciones de un alineamiento global óptimo entre las secuencias A y B consiste en aminoácidos o sustituciones conservativas idénticos. Los alineamientos globales óptimos se pueden llevar a cabo usando los siguientes parámetros en el algoritmo de alineamiento de Needleman-Wunsch:
Para polipéptidos:
Matriz de sustitución: blosum62
Función de puntuación de gap: -A-B*LG, donde
A = 11 (el penalty de gap), B = 1 (penalty de longitud del gap) y LG es la longitud del gap.
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Para secuencias de nucleótidos:
Matriz de sustitución: 10 para coincidencias, 0 para divergencias.
Función de puntuación de gap: -A-B*LG, donde
A = 50 (el penalty de gap), B = 3 (el penalty de longitud del gap) y LG es la longitud del gap.
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Las sustituciones conservativas típicas ocurren entre Met, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos Asp, Glu y Asn; entre los residuos Gln, Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr.
Tal como se usa en este documento, dos secuencias son "homólogas" o "similares" entre sí cuando tienen al menos una similitud de secuencia de 85% entre sí cuando están alineadas usando el algoritmo de Needleman-Wunsch o el algoritmo "secuencias BLAST2" descrito por Tatusova y Madden, 1999, FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. Cuando se alinean secuencias de aminoácidos usando el "algoritmo de secuencias BLAST2", la matriz blosum62 es la matriz por defecto.
Tal como se usan en este documento, las expresiones "baja estringencia", "estringencia media", "estringencia alta" o "condiciones de muy alta estringencia" describen las condiciones para la hibridación y lavado de ácidos nucleicos. Las normas para llevar a cabo reacciones de hibridación se pueden encontrar en la obra Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6, que se incorpora en su totalidad a este documento como referencia. En dicha referencia, se describen métodos acuosos y no acuosos que pueden ser utilizados. Las condiciones específicas de hibridación usadas en este documento son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja fidelidad en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguidas de dos lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55ºC para las condiciones de baja fidelidad); (2) condiciones de hibridación de fidelidad media en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguidas de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60ºC; (3) condiciones de hibridación de alta fidelidad en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguidas de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65ºC; y, preferentemente, (4) las condiciones de hibridación de muy alta fidelidad son fosfato sódico 0,5 M, 7% SDS a 65ºC, seguidas de uno o más lavados a 0,2X SSC, 1% SDS a 65ºC.
Tal como se usa en este documento, la expresión "se une específicamente" se refiere a la unión de un antígeno por un dominio variable único de anticuerpo con una constante de disociación (K_{d}) de 1 \muM o menor, medida por análisis de resonancia de plasmón de superficie usando, por ejemplo, el sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore® y el software de evaluación cinética BIAcore® (por ejemplo, versión 2.1). La afinidad o K_{d} para una interacción de unión específica es, preferentemente, de aproximadamente 500 nM o menor, preferentemente de alrededor de 300 nM, preferentemente de alrededor de 100 nM o menor, más preferentemente, de alrededor de 80 nM o menor y, preferentemente, del orden de 10 pM.
Tal como se usa en este documento, la expresión "unión de alta afinidad" hace referencia a una unión con una K_{d} menor o igual a 100 nM.
Tal como se usa en este documento, la expresión "a una concentración de" significa que un polipéptido determinado se disuelve en solución (preferentemente, solución acuosa) a la cantidad en peso o molar indicada por unidad de volumen, por lo que dicha expresión incluye la concentración molar y los porcentajes en peso/en volumen. Un polipéptido presente a "una concentración de X" o "a una concentración de al menos X" es, por consiguiente, exclusivo de las preparaciones tanto secas como cristalizadas de un polipéptido.
Como se utiliza en este documento, el término "repertorio" hace referencia a una colección de variantes, por ejemplo, variantes de ácidos nucleicos, que difieren en secuencias de nucleótidos, o variantes de polipéptidos que difieren en secuencias de aminoácidos. Una biblioteca según la invención incluirá un repertorio de polipéptidos o ácidos nucleicos. De acuerdo con la presente invención, un repertorio de polipéptidos debe poseer un sitio de unión para un ligando genérico y un sitio de unión para un ligando diana. Los sitios de unión pueden estar solapados, o estar situados en la misma región de la molécula, pero sus especificidades serán diferentes. Una biblioteca usada en la presente invención incluirá un repertorio de polipéptidos que comprenden al menos 1000 miembros.
Tal como se usa en este documento, el término "biblioteca" se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por miembros, cada uno de los cuales tiene una única secuencia polipeptídica o de ácidos nucleicos. En este sentido, biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencias entre los miembros de la biblioteca son las responsables de la diversidad presente en la biblioteca. Ésta puede adoptar la forma de una simple mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en forma de organismos o células, por ejemplo, bacterias, virus, células vegetales o animales y similares, transformadas con una biblioteca de ácidos nucleicos. Preferentemente, cada organismo o célula individual contiene solamente uno o un número limitado de miembros de la biblioteca. De manera conveniente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. Por lo tanto, en un aspecto preferido, una biblioteca puede adoptar la forma de una población de organismos hospedadores, donde cada organismo contiene una o más copias de un vector de expresión que contiene un único miembro de la biblioteca en forma de ácido nucleico, que se puede expresar para producir su correspondiente miembro polipeptídico. Así, la población de organismos hospedadores tiene el potencial de codificar un extenso repertorio de variantes de polipéptidos genéticamente diferentes.
Tal como se usa en este documento, "polímero" se refiere a una macromolécula compuesta por unidades monómeras repetidas, y puede hacer referencia a un polímero de origen sintético o natural tal como un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o sin ramificar. Un "polímero", como se usa en este documento, se refiere, preferentemente, a un poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(alcohol vinílico) opcionalmente sustituido o de cadena ramificada, y sus derivados.
Tal como se usa en este documento, "PEG" o "polímero PEG" se refiere a polietilenglicol y, de forma más específica, puede referirse a una forma derivatizada de PEG que incluye, pero sin estar limitado a ellas, ésteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS) de PEG tales como propionato de succinimidilo; ésteres activos de benzotriazol, PEG derivatizado con maleimida, vinil-sulfonas, o grupos tiol. Formulaciones particulares de PEG pueden incluir PEG-O-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-S-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; PEG-O_{2}CNH-CH(R)-CO_{2}-NHS; PEG-NHCO-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; y PEG-O-CH_{2}-CO_{2}-NHS; donde R es (CH_{2})_{4}NHCO_{2}(mPEG). Los polímeros PEG útiles en la invención pueden ser moléculas lineales, o pueden estar ramificadas, donde múltiples restos PEG se encuentran presentes en un único polímero. Algunas conformaciones especialmente preferidas de PEG de utilidad en la invención incluyen, pero sin estar limitadas a ellas:
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1
2
3
4
Tal como se usa en este documento, un "reactivo sulfhidrilo-selectivo" es un reactivo útil para la unión de un polímero PEG a un aminoácido que contiene tiol. Los grupos tiol en el residuo aminoácido cisteína son especialmente útiles para interactuar con un reactivo sulfhidrilo-selectivo. Reactivos sulfhidrilo-selectivos de utilidad en la invención incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, maleimida, vinil-sulfona y tiol. El uso de reactivos sulfhidrilo-selectivos para el acoplamiento a residuos cisteína es conocido en la técnica y se puede adaptar en función de las necesidades según la presente invención (véanse, por ejemplo, Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6:150; Greenwald et al., 2000, Crit. Rev- Ther. Drug Carrier Syst. 17:101; Herman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195:203).
Tal como se usa en este documento, un "antígeno" es fijado por un anticuerpo o una región de fijación (por ejemplo, un dominio variable) de un anticuerpo. Típicamente, los antígenos son capaces de generar una respuesta de anticuerpo in vivo. Un antígeno puede ser un péptido, polipéptido, proteína, ácido nucleico, lípido, carbohidrato u otra molécula, e incluye moléculas con múltiples subunidades. En general, se selecciona un dominio variable de inmunoglobulina para dianizar la especificidad contra un antígeno particular.
Tal como se usa en este documento, el término "epítope" se refiere a una unidad de estructura unida convencionalmente por un par V_{H}/V_{L} de dominio variable único de anticuerpo. Los epítopes definen el sitio mínimo de unión de un anticuerpo y representan por tanto, la diana de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un dominio variable único de anticuerpo, un epítope representa la unidad de estructura fijada por un dominio variable aislado.
Tal como se usa en este documento, el término "neutralización", cuando se usa en referencia a un polipéptido de dominios variables únicos de anticuerpo como se ha descrito anteriormente, significa que el polipéptido interfiere (por ejemplo, suprime o erradica completa o al menos parcialmente) con una actividad o función mensurable del antígeno diana en al menos 50% y, preferentemente, en al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, hasta incluir una inhibición de 100% (es decir, ausencia de efecto o función detectable del antígeno diana). El experto en la técnica puede evaluar esta reducción de actividad o función mensurable de un antígeno diana usando métodos convencionales para medir uno o más indicadores de dicha actividad o función. Por ejemplo, cuando la diana es TNF-\alpha, la actividad de neutralización se puede evaluar usando un ensayo convencional de células L929, o midiendo la capacidad de un polipéptido de dominios variables únicos de anticuerpo para inhibir la expresión, inducida por TNF-\alpha, de ELAM-1 en HUVEC, que mide la activación celular inducida por TNF-\alpha. De manera análoga al término "neutralización" usado en este documento, la expresión "inhibe la citotoxicidad celular", tal como se emplea en este documento, se refiere a un descenso de la lisis celular medida, por ejemplo, usando un ensayo convencional de lisis de células L929, donde dicha citotoxicidad celular se inhibe cuando la lisis celular disminuye en 10% o más.
Tal como se usa en este documento, una "actividad o función mensurable de un antígeno diana" incluye, pero sin estar limitada a las mismas, por ejemplo, la señalización de células, actividad enzimática, actividad de fijación, internalización dependiente del ligando, lisis celular, activación celular, estímulo de la supervivencia celular, y expresión de genes. El experto en la técnica puede llevar a cabo ensayos que miden tales actividades para un determinado antígeno diana. Preferentemente, "actividad", tal como se usa en este documento, se define por (1) DN50 en un ensayo basado en células; (2) afinidad por un ligando diana; (3) unión de ELISA, o (4) un ensayo de unión al receptor. Los métodos para llevar a cabo estos ensayos con conocidos para los expertos en la técnica y se describen de forma más detallada más adelante.
Tal como se usa en este documento, "actividad de dAb" o "actividad del dominio variable único de anticuerpo" se refiere a la capacidad del dominio variable único de anticuerpo o polipéptido para fijar un antígeno. Tal como se usa en este documento, "retiene actividad" se refiere a un nivel de actividad del dominio variable único de anticuerpo o polipéptido conjugado con PEG que es de, al menos, 10% del nivel de actividad del dominio variable único de anticuerpo o polipéptido no conjugado con PEG, preferentemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y hasta 90%, preferentemente hasta 95%, 98% y hasta 100% de la actividad de un dominio variable único de anticuerpo o polipéptido no conjugado con PEG que comprende el mismo dominio variable que el dominio variable único de anticuerpo o polipéptido conjugado con PEG, donde la actividad se determina de la forma descrita anteriormente. Más específicamente, la actividad de un dominio variable único de anticuerpo o polipéptido conjugado con PEG, comparada con la de un dominio variable único de anticuerpo o polipéptido no conjugado con PEG, se deberá determinar sobre la base molar de un dominio variable de anticuerpo o polipéptido único; es decir, se deberá usar un número equivalente de moles de cada uno de los dominios variables únicos de anticuerpo conjugados y no conjugados con PEG en cada ensayo, manteniendo equivalente todas las demás condiciones entre ensayos. Para determinar si un dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG en particular "retiene actividad", es preferible comparar la actividad del dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG con la del mismo dominio variable único de anticuerpo en ausencia de PEG.
Tal como se usa en este documento, la expresión "se une específicamente" se refiere a la unión de un antígeno por parte de un dominio variable o polipéptido de una inmunoglobulina con una constante de disociación (K_{d}) de 1 \muM o menor, medida por análisis de resonancia de plasmón de superficie usando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore® y el software de evaluación BIAcore® (por ejemplo, versión 2.1). La afinidad o K_{d} para una interacción de unión específica es, preferentemente, de aproximadamente 1 \muM o menor, preferentemente 500 nM o menor, más preferentemente 100 nM o menor, más preferentemente de aproximadamente 80 nM o menor y, preferentemente, del orden de 10 pM.
Tal como se usan en este documento, los términos "heterodímero", "heterotrímero" y "heteromultímero" se refieren a moléculas que comprenden dos, tres o más (por ejemplo, cuatro, cinco, seis, siete y hasta ocho o más) monómeros de dos o más secuencias polipeptídicas de dominios variables de inmunoglobulina, respectivamente. Por ejemplo, un heterodímero incluiría dos secuencias V_{H} tales como V_{H1} y V_{H2}, o V_{HH1} y V_{HH2} o, de forma alternativa, puede incluir una combinación de V_{H} y V_{L}. De forma similar a un homodímero, trímero, o tetrámero, los monómeros en un heterodímero, heterotrímero o heteromultímero se pueden unir por expresión como un polipéptido de fusión, por ejemplo, con un enlazador peptídico entre monómeros o uniendo químicamente monómeros tras la traducción entre sí, o directamente o por medio de un enlazador por enlaces de disulfuro, o por fijación a un resto de unión di-, tri- o multivalente. En una realización, los monómeros en un heterodímero, trímero, tetrámero o multímero pueden estar unidos por un polímero PEG multi-brazo, donde cada monómero del dímero, trímero, tetrámero o multímero está unido de la forma descrita anteriormente al resto PEG del PEG multi-brazo.
Tal como se usa en este documento, el término "semivida" se refiere al tiempo que tarda la concentración en suero de un ligando (por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina única) en reducirse en 50%, in vivo, debido, por ejemplo, a la degradación del ligando y/o al aclaramiento o secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los dominios variables únicos de anticuerpo según la invención están estabilizados in vivo y su semivida está aumentada por la unión a moléculas que, hipotéticamente, resisten la degradación y/o el aclaramiento o secuestro, tales como PEG. La semivida de un dAb o polipéptido aumenta si persiste su actividad funcional (en cierta medida), in vivo, durante un período mayor que un dAb similar no conjugado con un polímero PEG. Típicamente, la semivida de un dAb o polipéptido PEGilado aumenta en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más con respecto a un dAb o polipéptido no PEGilado. Resultan posibles incrementos dentro del intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más de la semivida. Alternativa o adicionalmente, son posibles también incrementos dentro del intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la semivida. De acuerdo con la invención, un dominio variable único de anticuerpo o polipéptido conjugado con PEG tiene una semivida de entre 0,25 y 170 horas, preferentemente entre 1 y 100 horas, más preferentemente entre 30 y 100 horas y, de forma todavía más preferida, entre 50 y 100 horas, y de hasta 180, 180, 190 y 200 horas, o más.
Tal como se usa en este documento, "resistente a la degradación" o "resiste a la degradación" con respecto a un PEG u otro polímero conjugado con un monómero o multímero dAb significa que el monómero o multímero dAb conjugado con PEG u otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se le expone a pepsina a un pH de 2,0 durante 30 minutos y, preferentemente, no se degrada en absoluto. Haciendo referencia específicamente a un multímero dAb (por ejemplo, hetero- u homodímero, trímero, tetrámero, etc.) conjugado con PEG u otro polímero según la invención, un multímero de este tipo se degrada en menos de 5% y, preferentemente, no se degrada en absoluto en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos.
Tal como se usa en este documento, "tamaño hidrodinámico" se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basándose en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o desplazamiento de una proteína a través de una solución, se puede procesar para derivar un tamaño aparente de la proteína, donde el tamaño se obtiene por el "radio de Stokes" o "radio hidrodinámico" de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto del peso como de la forma (conformación), de modo que dos proteínas que tengan el mismo peso molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos basándose en la conformación de la proteína. El tamaño hidrodinámico de un dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG (incluidos los multímeros de dominio variable de anticuerpo descritos anteriormente) puede estar dentro del intervalo de 200 a 500 kDa; 250 a 500 kDa; 300 a 500 kDa; 350 a 500 kDa; 400 a 500 kDa y 450 a 500 kDa. Preferentemente, el tamaño hidrodinámico de un dAb PEGilado según la invención es de 200 a 300 kDa.
Tal como se usa en este documento, "TAR1" se refiere a un dAb cuyo antígeno diana es TNF-\alpha.
Tal como se usa en este documento, "TAR2" se refiere a un dAb cuyo antígeno diana es el receptor de p55-TNF-\alpha humano.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de unión de receptor que determina la afinidad de una serie de formatos PEGilados de TAR1-5-19.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad celular que determina la afinidad de una serie de formatos PEGilados de TAR1-5-19.
La Figura 3 muestra geles de SDS-PAGE con los resultados de la unión por afinidad de diversos formatos de dAb HEL4 PEGilados a lisozima. En los Ejemplos se describen las pistas.
La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de unión al receptor, que establece la afinidad de TAR2-10-27 y el monómero PEGilado de 40 K.
La Figura 5 muestra la estabilidad ante la proteasa de TAR1-5-19 y variantes PEGiladas frente a la acción de pepsina a pH 2,0.
La Figura 6 muestra de forma esquemática la PEGilación monómera de dAb. La Figura 6-1 muestra un dAb V_{H} o V_{L} no modificado. La Figura 6-2 muestra una V_{H} o V_{L} con PEGilación superficial. La Figura 6-3 muestra un dAb V_{H} o V_{L} con una cisteína C-terminal conjugada con PEG.
La Figura 7 muestra de forma esquemática dAbs hetero- u homodímeros V_{H} o V_{L}. La Figura 7-4 muestra un dímero V_{H} o V_{L} disulfuro formado por un enlace disulfuro C-terminal. La Figura 7-5 muestra un dímero V_{H} o V_{L} disulfuro PEGilado en una subunidad. La Figura 7-6 muestra dímeros V_{H} o V_{L} disulfuro PEGilados en ambas subunidades. La Figura 7-7 muestra dímeros V_{H} o V_{L} formados por un PEG ramificado/bifurcado/multi-brazo a través de una cisteína C-terminal. La Figura 7-8 muestra un dímero V_{H} o V_{L} disulfuro formado por un enlace disulfuro superficial. La Figura 7-9 muestra un dímero V_{H} o V_{L} disulfuro, PEGilado en una subunidad. La Figura 7-10 muestra un dímero V_{H} o V_{L} PEGilado en ambas subunidades. La Figura 7-11 muestra un dímero V_{H} o V_{L} formado por un PEG ramificado/bifurcado/multi-brazo a través de residuos superficiales de cisteína.
La Figura 8 muestra, de forma esquemática, hetero- u homodímeros V_{H} o V_{L} PEGilados adicionales. La Figura 8-12 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazado, formado por un enlazador (Gly_{4}Ser) (n=0-10). La Figura 8-13 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado en una subunidad. La Figura 8-14 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado en ambas subunidades. La Figura 8-15 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado a través del enlazador. La Figura 8-16 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador con un residuo cisteína C-terminal. La Figura 8-17 muestra dos dímeros V_{H} o V_{L} enlazador dimerizados por enlaces disulfuro.
La Figura 9 muestra, de forma esquemática, dímeros de enlazadores dAb PEGilados. Las Figuras 9-18 y 9-19 muestran dímeros V_{H} o V_{L} enlazadores PEGilados a través de un residuo cisteína C-terminal en una subunidad. La Figura 9-20 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado a través de una cisteína presente en el enlazador. La Figura 9-21 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado a través de una cisteína presente en una subunidad. La Figura 9-22 muestra un dímero V_{H} o V_{L} enlazador PEGilado a través de una cisteína presente en ambas subunidades.
La Figura 10 muestra representaciones esquemáticas de la PEGilación de dAbs hetero- u homotrímeros V_{H} o V_{L}. Las Figuras 10-23 y 10-24 muestran la PEGilación y formación de trímeros dAb usando PEG de 3 brazos para trimerizar de manera covalente a través de aminoácidos C-terminales. La Figura 10-25 muestra la PEGilación superficial de uno de los monómeros dAb, donde el trímero dAb está formado a través de péptidos enlazadores. La Figura 10-26 muestra la PEGilación C-terminal de uno de los monómeros del trímero dAb. La Figura 10-27 muestra un trímero dAb doblemente específico en el que dos de los monómeros dAb tienen afinidad por TNF-\alpha y el tercer monómero exhibe especificidad de unión por la albúmina sérica. Este formato también se puede PEGilar tal como se muestra en la Figura 10-25 ó 10-26.
La Figura 11 muestra una representación esquemática de dAbs hetero- u homotetrámeros V_{H} o V_{L}. La Figura 11-28 muestra un tetrámero dAb formado por la unión de un PEG de 4 brazos con cisteínas C-terminales en cada monómero dAb. Las Figuras 11-29 y 11-31 muestran la formación de un tetrámero dAb mediante la unión de dos dímeros dAb enlazadores a través de un PEG ramificado/multi-brazos, donde el PEG está unido a una cisteína C-terminal (11-29) o al péptido enlazador (11-31). La Figura 11-30 muestra un tetrámero dAb en el que cada uno de los monómeros del tetrámero está unido por un PEG de ramificación sencilla a residuos cisteína C-terminales en cada monómero. La Figura 11-32 muestra un tetrámero dAb en el que cada uno de los monómeros está unido con el otro por medio de un péptido enlazador. Esta configuración se puede PEGilar usando cualquiera de las estrategias mostradas en las Figuras 10-25 ó 10-26.
La Figura 12 muestra otros formados de dAb conjugados con PEG útiles en la invención. La Figura 12-31 muestra un tetrámero de dímeros dAb enlazadores que están unidos entre sí para formar el tetrámero por medio de un PEG multi-brazos, donde el PEG está único a residuos cisteína C-terminales presentes en uno de los monómeros de cada dímero. La Figura 32 muestra un tetrámero de dímeros dAb enlazadores que están unidos entre sí para formar el tetrámero por un PEG multi-brazos, donde cada PEG está unido a residuos cisteína presentes en el enlazador de cada par de dímeros.
La Figura 13 muestra la secuencia del marco V_{\kappa} basado en la línea germinal DP47-JH4b (SEC. ID Nº: 1, 2). Los HCDRs 1-3 se subrayan.
La Figura 14 muestra la secuencia del marco V_{\kappa} basado en la línea germinal DP\kappa9-J\kappal (SEC. ID Nº: 3,4). Los LCDRs 1-3 se subrayan.
La Figura 15 muestra un trazado gráfico de la relación del tamaño hidrodinámico nativo del dAb frente a la semivida sérica in vivo en el ratón. El gráfico se generó usando los datos de la Tabla 8.
La Figura 16 muestra el perfil de estabilidad a la proteasa del TAR1-5-19 monómero y PEGilado 40K. La actividad relativa es un porcentaje del control en ausencia de proteasa. Las proteasas usadas fueron pepsina, peptidasa de la mucosa intestinal porcina, elastasa, proteasa pancreática bovina bruta (CBP) y polvo intestinal de rata (Rat In).
Descripción detallada
La presente invención proporciona dAbs y homo- y heteromultímeros de dAb conjugados con PEG, dotados de una semivida y resistencia aumentadas contra la degradación proteolítica con respecto a los dAbs no conjugados con PEG. La invención se refiere, en una realización, a monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros de dAb conjugados con PEG que exhiben una semivida de al menos 0,25 horas y que, además, tienen un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa. Preferentemente, el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG conserva su actividad, con respecto a un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG que comprende el mismo dominio variable único de anticuerpo que el dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG. Esto proporciona moléculas de dAb
con una mayor eficacia terapéutica gracias a su tiempo de circulación prolongado y a su actividad potente y eficaz.
En una realización, la invención proporciona multímeros dAb conjugados con PEG que comprenden al menos dos dominios variables no complementarios. Por ejemplo, los dAbs pueden comprender un par de dominios V_{H} o un par de dominios V_{L}. De manera conveniente, los dominios son de origen no camélido; preferentemente, son dominios humanos o comprenden regiones marco humanas (FWs) y uno o más CDRs heterólogas. CDRs y las regiones marco son aquellas regiones de un dominio variable de inmunoglobulina según se define en la base de datos de Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico. En una realización, los dominios dAb son de origen camélido.
Las regiones marco humanas preferidas son las codificadas por los segmentos génicos de la línea germinal DP47 y DPK9. De manera conveniente, FW1, FW2 y FW3 de un dominio V_{H} o V_{L} tienen la secuencia de FW1, FW2 o FW3 de DP47 o DPK9. Los marcos humanos pueden contener, opcionalmente, mutaciones, por ejemplo, hasta aproximadamente 5 cambios de aminoácidos o hasta aproximadamente 10 cambios de aminoácidos, de forma colectiva en los marcos humanos usados en los dAbs de la invención.
Preparación de Dominios Variables de Inmunoglobulina Únicos
Los dominios variables únicos de anticuerpo (o dAbs) que se utilizan en esta invención son un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulinas y que se unen específicamente a un antígeno (es decir, constante de disociación de 500 nM o menos), y que fijan el antígeno como un dominio variable único; es decir, sin ningún dominio variable complementario. Por lo tanto, un dominio variable único de anticuerpo incluye dominios variables de anticuerpo completos, así como dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o múltiples bucles han sido sustituidos por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor), y la especificidad por el antígeno diana del dominio de longitud completa. Preferentemente, se selecciona un dominio variable único de anticuerpo útil en la invención del grupo consistente en V_{HH}, V_{H} y V_{L}, incluidos V_{kappa} y V_{lambda}.
Los dominios variables de inmunoglobulina únicos se preparan de diferentes formas. Para cada uno de estos métodos, son aplicables las técnicas de preparación bien conocidas (por ejemplo, amplificación, mutación, etc.) y manipulación de secuencias de ácidos nucleicos.
Un medio consiste en amplificar y expresar la región V_{H} o V_{L} de un gen de cadena pesada o cadena ligera para un anticuerpo clonado del que se sabe que fija el antígeno deseado. Kabat et al. (1991, véase más arriba) establecen los límites de los dominios V_{H} y V_{L}. La información relativa a los límites de los dominios V_{H} y V_{L} de los genes de cadena pesada y ligera se utiliza para diseñar cebadores de PCR que amplifican el dominio V a partir de una secuencia que codifica una cadena pesada y ligera clonada, que codifica un anticuerpo del que se sabe que fija un antígeno determinado. El dominio V amplificado se inserta en un vector de expresión apropiado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4133-137) y se expresa, ya sea solo o como una fusión con otra secuencia polipeptídica. A continuación, se rastrea en el dominio V_{H} o V_{L} expresado la unión de alta afinidad con el antígeno deseado, aislándolo del resto del polipéptido de cadena pesada o ligera. Para todos los aspectos de la presente invención, el rastreo de unión se lleva a cabo de la forma conocida en la técnica, o como se describe más adelante.
Por ejemplo, se rastrea un repertorio de dominios V_{H} o V_{L} por medio de la expresión en fago, con inmunopurificación ("panning") contra el antígeno deseado. Los métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de bacteriófagos y bibliotecas de expresión en fago lambda son bien conocidos, y se describen, por ejemplo, en McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:4363; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 4133; Chang et al., 1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104: 147; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992), J. Biol. Chem., 267: 16007; y Lerner et al. (1992), Science, 258: 1313. Las bibliotecas de scFv se describen por ejemplo, en Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, véase antes; Clackson et al., 1991, véase antes; Marks et al., 1991, véase antes; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; y Marks et al., 1992, véase antes. Se han descrito diversas realizaciones de bibliotecas scFv expresadas en las proteínas de cubierta de bacteriófagos. También se conocen perfeccionamientos de los métodos de expresión en fagos, por ejemplo, tal como se describen en los documentos WO 96/06213 y WO 92/01047 (Medical Research Council et al.) y WO 97/08320 (Morphosys, véase antes).
El repertorio de dominios V_{H} o V_{L} puede ser un repertorio de origen natural de secuencias de inmunoglobulina, o un repertorio sintético. Un repertorio de origen natural es el que se prepara, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulinas recolectadas de uno o múltiples animales, incluidos el ser humano. Estos repertorios pueden ser "vírgenes" ("naïve"), es decir, preparados a partir de células humanas fetales o de recién nacidos que expresan inmunoglobulinas, o redistribuidos, es decir, preparados a partir de, por ejemplo, células B humanas adultas. Los repertorios naturales se describen, por ejemplo, en Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581, y Vaughan et al., 1996, Natural Biotech.14: 309. Si se desea, los clones identificados de un repertorio natural, o de cualquier repertorio si se da el caso, que fijan el antígeno diana, s someten a mutagénesis y subsiguiente rastreo con el fin de producir y seleccionar variantes con características de unión optimizadas.
Los repertorios sintéticos de dominios variables de inmunoglobulina únicos se preparan por medio de la introducción artificial la diversidad en un dominio V clonado. Repertorios sintéticos aparecen descritos, por ejemplo, en Hoogenboom y Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13; 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13; 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; y documento WO 99/20749.
El dominio que fija el antígeno de un anticuerpo convencional comprende dos regiones separadas: un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) y un dominio variable de cadena ligera (V_{L}, que puede ser V_{\kappa} o V_{\lambda}). El sitio de fijación del antígeno de un anticuerpo de este tipo está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio V_{H} (H1, H2 y H3), y tres del dominio V_{L} (L1, L2 y L3). Los límites de estos bucles están descritos, por ejemplo, en Kabat et al. (1991, véase antes). La redisposición combinatoria de segmentos de genes da lugar, in vivo, a un repertorio primario diverso de genes V que codifican los dominios V_{H} y V_{L}. El gen V_{H} está producido por la recombinación de tres segmentos génicos, V_{H}, D y JH. En el ser humano existen aproximadamente 51 segmentos V_{H} funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25 segmentos D funcionales (Corbett et al. (1997), J. Mol. Biol. 268: 69), y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento V_{H} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y el segundo bucles de fijación de antígeno del dominio V_{H} (H1 y H2), en tanto que los segmentos V_{H}, D y JH se combinan para formar el tercer bucle de fijación del antígeno del dominio V_{H} (H3).
El gen V_{L} es producto de la recombinación de sólo dos segmentos génicos, V_{L} y JL. En el ser humano, existen aproximadamente 40 segmentos V_{\kappa} funcionales (Schäble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001), 31 segmentos V_{\lambda} funcionales (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7:250), 5 segmentos J_{\kappa} funcionales (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516), y 4 segmentos J_{\lambda} funcionales (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento V_{L} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo bucles de fijación del antígeno del dominio V_{L} (L1 y L2), en tanto que los segmentos V_{L} y J_{L} se combinan para formar el tercer bucle de fijación del antígeno del dominio V_{L} (L3). Se cree que los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario son suficientemente diversos para fijar casi todos los antígenos con una afinidad al menos moderada. In vivo, los anticuerpos de alta afinidad se producen por "maduración de afinidad" de los genes reordenados, donde el sistema inmune genera y selecciona mutaciones puntuales sobre la base de una fijación optimizada.
El análisis de las estructuras y secuencias de los anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de fijación de antígenos (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de la cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877). Las conformaciones de cadena principal están determinadas por (i) la longitud del bucle de fijación del antígeno, y (ii) residuos particulares, o tipos de residuos, en ciertas posiciones clave en el bucle de fijación del antígeno y el marco del anticuerpo. El análisis de las longitudes de los bucles y de los residuos clave ha permitido predecir las conformaciones de cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificados por la mayoría de las secuencias de anticuerpos humanos (Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), ésta forma también un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes cortas de bucle, que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave del bucle y del marco del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399:1).
Mientras que, según una realización de la invención, es posible agregar diversidad a los repertorios sintéticos en cualquier lugar en las CDRs de los distintos bucles de fijación del antígeno, este método da como resultado una mayor proporción de dominios V que no se pliegan adecuadamente y contribuyen, por lo tanto, a una proporción más baja de moléculas dotadas del potencial de fijar antígenos. La comprensión de los residuos que contribuyen a la conformación de la cadena principal de los bucles de fijación del antígeno permite identificar residuos específicos para diversificarse en un repertorio sintético de dominios V_{H} o V_{L}. Es decir, la diversidad se introduce de manera óptima en residuos que no son esenciales para mantener la conformación de la cadena principal. Por ejemplo, para la diversificación del bucle L2, el método convencional consistiría en diversificar todos los residuos en la CDR correspondiente (CDR2), tal como lo definen Kabat et al. (1991, véase antes), es decir, alrededor de siete residuos. Sin embargo, para L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos de origen natural, y se ha observado que establecen contacto con el antígeno. El método preferido sería diversificar sólo estos dos residuos en este bucle. Esto representa una mejora significativa en términos de la diversidad funcional necesaria para crear una gama de especificidades de fijación de antígenos.
En un aspecto, se preparan repertorios de dominios variables sintéticos sobre las bases de V_{H} o V_{\kappa}, usando como base secuencias de líneas germinales V_{H} o V_{\kappa} diversificadas de forma artificial. Por ejemplo, el dominio del repertorio V_{H} se basa en los segmentos génicos de la línea germinal V_{H} V3-23/DP47 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:7768) y JH4b. El repertorio del dominio V_{\kappa} se basa, por ejemplo, en los segmentos génicos de la línea germinal V_{\kappa} O2/O12/DPK9 (Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) y J_{\kappa}1.
Se introduce la diversidad en estos u otros segmentos génicos, por ejemplo, por mutagénesis de PCR. La diversidad se puede introducir de forma aleatoria, por ejemplo, por PCR propensa a error (Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) o mutagénesis química. Sin embargo, tal como se ha analizado anteriormente, se prefiere que la introducción de la diversidad esté dirigida a residuos particulares. Se prefiere, adicionalmente, que los residuos deseados sean dianizados por la introducción del codón NNK, usando cebadores mutagénicos (utilizando la nomenclatura de la IUPAC, donde N = G, A, T o C, y K = G o T), que codifican todos los aminoácidos y el codón de terminación TAG. También se pueden usar otros codones que logran fines similares, incluido el codón NNN (que conduce a la producción de los codones de terminación adicionales TGA y TAA), el codón DVT ((A(/G/T) (A/G/C)T), el codón DVC ((A/G/T)(A/G/C)C) y el codón DVY ((A/G/T)(A/G/C)C/T). El codón DVT codifica 22% de serina y 11% de tirosina, aspargina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína, lo cual imita de manera muy importante la distribución de residuos aminoácidos para los sitios de fijación de antígenos de los anticuerpos humanos naturales. Los repertorios se preparan usando cebadores PCR que tienen el o los codones degenerados seleccionados en cada uno de los sitios a diversificar. La mutagénesis por PCR es bien conocida en la técnica; sin embargo, más adelante se discuten las consideraciones para el diseño de cebadores y la mutagénesis por PCR útiles en los métodos según la invención, en la sección titulada "Mutagénesis por PCR".
Los repertorios diversificados se clonan en vectores de expresión en fago, tal como se conoce en la técnica y se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/20749. En general, las moléculas de ácidos nucleicos y las construcciones de vectores necesarias para llevar a cabo la presente invención están disponibles en la técnica, y se construyen y manipulan tal como se indica en los manuales de laboratorio convencionales tales como Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, EE.UU.
La manipulación de ácidos nucleicos en la presente invención se lleva a cabo, de forma característica, en vectores recombinantes. Tal como se usa en este documento, "vector" se refiere a un elemento discreto que se utiliza para introducir ADN heterólogo en células para su expresión y/o replicación. Los métodos para la construcción y subsiguiente uso de tales vectores son bien conocidos para el experto en la técnica. Numerosos vectores están disponibles públicamente, incluidos plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episomales. Estos vectores se pueden utilizar para la clonación y mutagénesis sencillas; de forma alternativa, tal como resulta típico en vectores portadores de miembros del repertorio (o pre-repertorio) según la invención, se emplea un vector de expresión génica. Para su uso en la invención, se selecciona un vector que se adapte a una secuencia de codificación del polipéptido del tamaño deseado, típicamente desde 0,25 kilobases (kb) hasta 40 kb de longitud. Tras las manipulaciones de clonación in vitro, se transforma con el vector una célula hospedadora apropiada. Cada vector contiene diversos componentes funcionales que incluyen, por lo general, un sitio de clonación (o "polienlazador"), un origen de replicación y, al menos, un gen marcador seleccionable. Si un vector determinado es un vector de expresión, éste posee, adicionalmente, uno o más de los elementos siguientes: un elemento potenciador, un promotor, secuencias de terminación y señalización, cada uno de ellos situados en las proximidades del sitio de clonación, de modo que estén unidos operativamente con el gen que codifica un miembro del repertorio polipeptídico según la invención.
Tanto los vectores de clonación como los de expresión contienen, por lo general, secuencias de ácidos nucleicos que permiten que el vector se replique en una o múltiples células hospedadoras seleccionadas. Típicamente en los vectores de clonación, esta secuencia permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador e incluye orígenes de replicación o secuencias que replican de forma autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayor parte de las bacterias gran-negativas, el origen plasmídico de 2 micrómetros es adecuado para las levaduras, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, adenovirus) resultan útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Por lo general, no es necesario el origen de replicación para vectores de expresión en mamíferos, a menos que se les utilice en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como las células COS.
De manera conveniente, un vector de clonación o expresión contiene también un gen de selección, al que se denomina también marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospedadoras transformadas, cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán, por lo tanto, en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, suplen déficits auxotróficos, o proporcionan nutrientes críticos que no se encuentran disponibles en los medios de cultivo.
Dado que la replicación de vectores según la presente invención se lleva a cabo, de manera especialmente conveniente, en E. coli, se utiliza un marcador seleccionable para E. coli, por ejemplo, el gen de \beta-lactamasa que confiere resistencia contra el antibiótico ampicilina. Se les puede obtener a partir de plásmidos de E. coli tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19.
Los vectores de expresión contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador, y que está unido de forma operativa con la secuencia codificadora de interés. Un promotor de este tipo puede ser inducible o constitutivo. La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se hallan en una relación que les permite funcionar de la forma prevista para ellos. Una secuencia de control "unida operativamente" con una secuencia codificadora está ligada de tal manera que se logra la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
Promotores adecuados para ser usados con hospedadores procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas de \beta-lactamasa y promotor de lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores que se usan en sistemas bacterianos contendrán, por lo general, también una secuencia de Shine-Dalgamo unida operativamente con la secuencia codificadora.
En las bibliotecas o repertorios como los que se describen en este documento, los vectores preferidos son los de expresión, que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de la biblioteca de polipéptidos. Por lo tanto, la selección se efectúa por propagación y expresión separadas de un único clon que expresa el mimbro de la biblioteca de polipéptidos, o utilizando cualquier sistema de expresión de selección. Tal como se ha descrito anteriormente, un sistema de expresión de selección preferido usa la expresión en bacteriófago. Así, se pueden usar vectores de fagos o fagémidos. Vectores preferidos son los de fagémidos, que tienen un origen de replicación de E. coli (para la replicación de doble cadena) y, también, un origen de replicación de fago (para la producción de ADN de cadena sencilla). La manipulación y expresión de tales vectores es bien conocida en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992), véase antes; Nissim et al. (1994), véase antes). En pocas palabras, el vector contiene un gen marcador de \beta-lactamasa u otro marcador seleccionable que confiere selectividad al fagémido, y el promotor lac corriente arriba de un cartucho de expresión consistente en una secuencia líder (N a C-terminal) (que dirige el polipéptido expresado hacia el espacio periplasmático), un sitio de clonación múltiple (para clonar la versión nucleotídica del miembro de la biblioteca), opcionalmente , uno o más tags peptídicos (para la detección), opcionalmente uno o más codones de terminación TAG, y la proteína de fago pIII. Las secuencias líderes, que se pueden usar en la expresión bacteriana y/o la expresión en fago o fagémido, incluyen peIB, stII, ompA, phoA, bla y pelA. Utilizando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli, y con la adición de glucosa, isopropil-tio-\beta-D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar tal como VCS M13, el vector es capaz de replicar como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de la biblioteca de polipéptidos solamente, o producir fagos, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII en su superficie.
Un ejemplo de un vector preferido es el vector de fagémido pHEN1 (Hoogenboom et al. 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137; la secuencia está disponible, por ejemplo, como SEC. ID Nº: 7 en el documento WO 03/031611), en el que la producción de la proteína de fusión pIII está bajo el control del promotor LacZ, que resulta inhibido en presencia de glucosa, e inducido con IPTG. Cuando se cultiva en cepas supresoras de B. coli, por ejemplo, TG1, se genera la proteína de fusión del gen III, que se envuelve en un fago, en tanto que el crecimiento de cepas no supresoras, por ejemplo, HB2151, permite la secreción de la proteína de fusión soluble hacia el periplasma bacteriano y hacia el medio de cultivo. Debido a que la expresión del gen III impide la infección posterior con el fago auxiliar, las bacterias que albergan los vectores fagémidos se propagan en presencia de glucosa antes de la infección con el fago auxiliar VCSM13 para el rescate de fagos.
La construcción de vectores según la invención utiliza técnicas de ligado convencionales. Vectores o fragmentos de ADN aislados se escinden, confeccionan y vuelven a ligarse en la forma deseada, para generar el vector requerido. Si se desea, se llevan a cabo análisis de secuencias para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido, usando métodos convencionales. Los expertos en la técnica conocen los métodos apropiados para construir vectores de expresión, preparar transcriptos in vitro, introducir ADN en células hospedadoras, y realizar análisis para evaluar la expresión y función. Se detecta la presencia de una secuencia génica en una muestra, o se cuantifica su amplificación y/o expresión por métodos convencionales tales como análisis de Southern o Northern, transferencia de Western, transferencia de mancha ("dot blotting") de ADN, ARN o proteína, hibridación in situ, inmuno-citoquímica o análisis de secuencia de ácidos nucleicos o moléculas proteicas. Los expertos en la técnica podrán determinar, en caso deseado, la forma de modificar estos métodos.
Estructuras a utilizar en la Construcción de Dominios Variables Únicos de Anticuerpo i. Selección de la conformación de cadena principal
Todos los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas comparten un pliegue similar para su cadena polipeptídica. Por ejemplo, aunque los anticuerpos muestran una gran diversidad en términos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, al contrario de lo esperado, cinco de los seis bucles de fijación de antígenos (H1, H2, L1, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de la cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 106: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Por lo tanto, el análisis de las longitudes del bucle y residuos clave ha permitido predecir las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 halladas en la mayoría de los anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996), J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 exhibe una diversidad mucho mayor en términos de secuencias, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también ésta forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes de bucle cortas, que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el bucle y en el marco del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
Los monómeros y multímeros de dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con PEG de la presente invención están ventajosamente ensamblados de bibliotecas de dominios, tales como bibliotecas de dominios V_{H} y/o bibliotecas de dominios V_{L}. Además, los propios dAbs conjugados con PEG de la invención pueden ser suministrados en forma de bibliotecas. En un aspecto de la presente invención, se diseñan bibliotecas de dominios variables únicos de anticuerpo en las que se han elegido ciertas longitudes de bucle y residuos clave para garantizar que la conformación de la cadena principal de los miembros sea conocida. Convenientemente, estas son conformaciones reales de moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas halladas en la naturaleza, con el fin de minimizar las posibilidades de que sean no funcionales, como se ha discutido anteriormente. Los segmentos génicos de la línea germinal V sirven como un marco básico apropiado para la construcción de bibliotecas de anticuerpos o receptores de células T; otras secuencias son también útiles. Pueden surgir variaciones con baja frecuencia, tales como que un reducido número de miembros funcionales posea una conformación de cadena principal alterada, lo cual no afecta a esta función.
La teoría de las estructuras canónicas también es de utilidad para evaluar el número de diferentes conformaciones de cadena principal codificadas por ligandos, para predecir la conformación de la cadena principal basada en secuencias de ligandos, y para seleccionar residuos para la diversificación que no afectan a la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio V_{\kappa} humano, el bucle L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el bucle L2 tiene una única estructura canónica, y que un 90% de los dominios V_{\kappa} humanos adopta una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el bucle L3 (Tomlinson et al. (1995), véase antes); así, solamente en el dominio V_{\kappa}, pueden combinarse diferentes estructuras canónicas para crear una gama de diferentes conformaciones de cadena principal. Dado que el dominio V_{\lambda} codifica una gama diferente de estructuras canónicas para los bucles L1, L2 y L3, y que los dominios V_{\kappa} y V_{\lambda} pueden aparearse con cualquier dominio V_{H} capaz de codificar diversas estructuras canónicas para los bucles H1 y H2, el número de combinaciones de estructuras canónicas observado para estos cinco bucles es muy elevado. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede resultar esencial para la producción de una extensa gama de especificidades de unión. Sin embargo, mediante la construcción de una biblioteca de anticuerpos basada en una única conformación de cadena principal conocida, se ha encontrado que, al contrario de lo esperado, no es necesaria la diversidad en la conformación de la cadena principal para generar una diversidad suficiente para dianizar sustancialmente todos los antígenos. De manera aún más sorprendente, la conformación de cadena principal única no necesita ser una estructura de consenso: se puede usar una única conformación de origen natural como base para una biblioteca completa. Así, en un aspecto, los dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con un polímero de la invención poseen una única conformación de cadena principal conocida.
La conformación de cadena principal única seleccionada es, preferentemente, un lugar común entre las moléculas del tipo de superfamilia de inmunoglobulinas en cuestión. Una conformación adquiere carácter de lugar común cuando un número significativo de moléculas de origen natural demuestran haberla adoptado. En consecuencia, en un aspecto preferido de la invención, se consideran por separado las apariciones naturales de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada bucle de fijación de un dominio de inmunoglobulina y, seguidamente, se selecciona un dominio de variable de origen natural que posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes bucles. Si no se dispone de ninguna, se puede seleccionar la conformación equivalente más próxima. Es preferible que los segmentos génicos de la línea germinal se expresen frecuentemente en la naturaleza y, de forma especialmente preferida, que sean los más frecuentemente expresados de todos los segmentos génicos de la línea germinal natural.
En el diseño de dominios variables únicos de anticuerpo o bibliotecas de los mismos, se puede considerar por separado la incidencia de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los seis bucles de fijación de antígenos. Para H1, H2, L1, L2 y L3, se selecciona una conformación determinada, que sea adoptada por entre un 20% y un 100% de los bucles de fijación de antígenos de las moléculas de origen natural. Típicamente, su incidencia observada es mayor que 35% (es decir, entre 35% y 100%) y, de manera ideal, mayor que 50% o, incluso, mayor que 65%. Dado que la inmensa mayoría de bucles H3 carece de estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de cadena principal que sea común entre los bucles que sí exhiben estructuras canónicas. Para cada uno de los bucles, se selecciona por lo tanto la conformación que se observa más a menudo en el repertorio natural. En anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada bucle son las siguientes: H1-CS 1 (79% del repertorio expresado), H2-CS 3 (46%), L1-CS 2 de V_{\kappa} (39%), L2-CS 1 (100%), L3-CS 1 de V_{\kappa} (36%) (el cálculo supone una relación \kappa:\lambda de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para los bucles H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud de CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Ministerio de EE.UU. de Sanidad y Servicios Humanos) de siete residuos, con un puente salino desde el residuo 94 hasta el residuo 101, parece ser el más frecuente. Existen al menos 16 secuencias de anticuerpos humanos en la biblioteca de datos EMBL con la longitud requerida de H3 y residuos clave para formar esta conformación, y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que se pueden usar como base para el modelamiento de anticuerpos (2cgr y 1tet). Los segmentos génicos de línea germinal más frecuentemente expresados en esta combinación de estructuras canónicas son el segmento V_{H} 3-23 (DP-47), el segmento J_{H} JH4b, el segmento V_{\kappa} O2/O12 (DPK9) y el segmento J_{\kappa} J\kappa1. Los segmentos de V_{H} DP45 y DP38 son también apropiados. Por lo tanto, se pueden usar estos segmentos en combinación, como base para construir una biblioteca con la conformación de cadena principal única deseada.
De manera alternativa, en lugar de seleccionar la conformación de cadena principal única basada en la aparición natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los bucles aislados, se utiliza la incidencia natural de combinaciones de conformaciones de cadena principal como base para elegir la conformación de cadena principal única. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, es posible determinar la incidencia natural de combinaciones de estructuras canónicas para dos, tres, cuatro, cinco cualesquiera o para los seis bucles de fijación de antígenos. En este caso, es preferible que la conformación elegida sea común en anticuerpos de origen natural y, de forma especialmente preferida, que se observe de forma particularmente frecuente en el repertorio natural. Así, en anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran las combinaciones naturales de los cinco bucles de fijación de antígenos, H1, H2, L1, L2 y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas y, a continuación, se combina con la conformación más popular para el bucle H3, como base para seleccionar la conformación de cadena principal única.
Diversificación de la secuencia canónica
Después de haber seleccionado varias conformaciones de cadena principal conocidas o, preferentemente, una única conformación de cadena principal, se pueden construir dominios variables únicos de anticuerpo según la invención o bibliotecas para usar en la invención mediante la variación del sitio de unión de la molécula con el fin de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que se generan variantes, de forma que posean suficiente diversidad en su estructura y/o en su función para que sean capaces de ofrecer una gama de
actividades.
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La diversidad deseada se genera, típicamente, variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que se alteran se pueden elegir de manera aleatoria o, preferentemente, se seleccionan. A continuación, la variación se puede lograr por aleatorización, durante la cual el aminoácido residente se remplaza con cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, lo que produce un número muy elevado de variantes, o remplazando el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo así un número más limitado de variantes.
Se han comunicado diversos métodos para introducir dicha diversidad. Es posible utilizar la PCR propensa a errores (Hawkins et al. (1992), J. Mol. Biol. 226: 889), mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) para introducir mutaciones aleatorias en los genes que codifican la molécula. También son bien conocidos en la técnica los métodos para mutar posiciones seleccionadas, e incluyen el uso de oligonucleótidos divergentes o degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado diversas bibliotecas de anticuerpos sintéticos dianizando mutaciones en los bucles de fijación de anticuerpos. La región H3 de un Fab que fija el toxoide del tétanos humano ha sido aleatorizada para crear una gama de nuevas especificidades de unión (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Se han anexado regiones H3 y L3 aleatorias o semi-aleatorias a segmentos génicos de la línea germinal V para producir grandes bibliotecas con regiones marco que no han mutado (Hoogenboom y Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Barbas et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Este tipo de diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos los restantes bucles de fijación de antígenos (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) BiolTechnology, 13: 475; Morphosys, documento WO 97/08320, véase en lo que antecede).
Dado que la aleatorización de bucles tiene el potencial de crear aproximadamente más de 10^{15} estructuras sólo para H3, y un número similarmente elevado de variantes para los otros cinco bucles, no resulta factible utilizar la tecnología de transformación actual ni utilizar sistemas acelulares para producir una biblioteca que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes construidas hasta la fecha, se generaron 6 x 10^{10} anticuerpos diferentes, que es sólo una fracción de la diversidad potencial para una biblioteca de este diseño (Griffiths et al. (1994), véase en lo que antecede).
En una realización preferida, se diversifican exclusivamente aquellos residuos que intervienen directamente en la creación o modificación de la función deseada de la molécula. Para muchas moléculas, la función será la de fijar una diana y, por lo tanto, la diversidad deberá concentrarse en el sitio de fijación de la diana, evitando al mismo tiempo cambiar residuos que resultan cruciales para el empaquetamiento global de la molécula o para mantener la conformación de cadena principal elegida.
Diversificación de la secuencia canónica, aplicada a los dominios de anticuerpo
En el caso de dominios variables únicos de anticuerpo, el sitio de fijación de la diana es muy a menudo el sitio de fijación del antígeno. Así, en un aspecto altamente preferido, la invención proporciona bibliotecas de o para ensamblar dominios variables únicos de anticuerpo en los que varían únicamente los residuos del sitio de fijación del antígeno. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio del anticuerpo humano y se sabe que establecen contacto en complejos anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos de origen natural, y se observa que establecen contacto con el antígeno. Por el contrario, el método convencional habría sido el de diversificar todos los residuos en la correspondiente Región Determinante de la Complementariedad (CDR1), según la definen Kabat et al. (1991, véase antes), alrededor de siete residuos, comparados con los dos diversificados en la biblioteca usada según la invención. Esto representa una mejora significativa en términos de la diversidad funcional requerida para crear una gama de especificidades de fijación de antígenos.
En la naturaleza, la diversidad de los anticuerpos es el resultado de dos procesos: la recombinación somática de los segmentos génicos V, D y J de la línea germinal para generar un repertorio primario virgen (llamada diversidad de la línea germinal y de la unión), y la hipermutación somática de los genes V redistribuidos resultantes. El análisis de las secuencias de anticuerpos humanos ha demostrado que la diversidad del repertorio primario está focalizada en el centro del sitio de fijación de antígenos, en tanto que la hipermutación somática disemina la diversidad hacia regiones situadas en la periferia del sitio de fijación de antígenos, que están altamente conservadas en el repertorio primario (véase Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 813). Esta complementariedad ha evolucionado probablemente como una eficaz estrategia para la búsqueda de espacio de secuencias y, aunque aparentemente es exclusiva para los anticuerpos, puede ser aplicada fácilmente a otros repertorios polipeptídicos. Los residuos que sufren variaciones forman un subconjunto de aquellos que forman el sitio de unión para la diana. Si se desea, durante la selección se diversifican subconjuntos de residuos diferentes (algunos, solapados) en el sitio de fijación de la diana, en etapas diferentes.
En el caso de un repertorio de anticuerpo, el repertorio "virgen" inicial se genera allí donde algunos, pero no todos los residuos del sitio de fijación de antígenos están diversificados. Tal como se usa en este documento y dentro de este contexto, el término "virgen" se refiere a moléculas de anticuerpo que carecen de una diana predeterminada. Estas moléculas se parecen a las que son codificadas por los genes de inmunoglobulinas en un individuo que no ha sufrido una diversificación inmune, tal como es el caso de individuos fetales o recién nacidos, cuyos sistemas inmunológicos no han sido estimulados aún por una extensa variedad de estímulos antigénicos. Se selecciona, entonces, este repertorio contra una gama de antígenos o epítopes. Si es preciso, se puede introducir, entonces, una diversidad adicional fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado se puede seleccionar para funciones, especificidades o afinidades modificadas.
En la construcción de bibliotecas para usar según la invención, la diversificación de posiciones seleccionadas se logra, típicamente, a nivel de ácido nucleico, alterando la secuencia de codificación que especifica la secuencia del polipéptido, de manera que se pueda incorporar una serie de posibles aminoácidos (los 20, o un subconjunto de los mismos) en esa posición. Utilizando la nomenclatura de la IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos, así como el codón de terminación TAG. El codón NNK se utiliza, preferentemente, con el fin de introducir la diversidad requerida. También se pueden usar otros codones, que alcanzan los mismos objetivos, incluido el codón NNN, que conduce a la producción de codones de terminación adicionales TGA y TAA.
Una característica de la diversidad de la cadena lateral en el sitio de fijación del antígeno de los anticuerpos humanos es un sesgo pronunciado que favorece a determinados residuos aminoácidos. Si se suma la composición en aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones V_{H}, V_{\kappa} y V_{\lambda}, más de un 76% de la diversidad de la cadena lateral procede de solamente siete residuos diferentes, que son serina (24%), tirosina (14%), asparagina (11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) y treonina (6%). Este sesgo hacia residuos hidrófilos y pequeños residuos que pueden proporcionar flexibilidad de la cadena principal refleja, probablemente, la evolución de superficies que están predispuestas para fijar una extensa gama de antígenos o epítopes, y puede ayudar a explicar la promiscuidad requerida de los anticuerpos en el repertorio primario.
Dado que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de los aminoácidos en las posiciones que deben ser variadas imita, preferentemente, la observada en el sitio de fijación de antígenos de los anticuerpos. Este sesgo en la sustitución de aminoácidos, que permite la selección de ciertos polipéptidos (no sólo polipéptidos de anticuerpos) frente a una gama de antígenos diana se aplica con facilidad a cualquier repertorio de polipéptidos. Existen diversos métodos para sesgar la distribución de aminoácidos en la posición que se debe variar (incluido el uso de mutagénesis tri-nucleotídica, véase el documento WO 97/08320), de los que el método preferido, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Comparando el perfil de aminoácidos codificados por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración simple, doble, triple y cuádruple en proporciones iguales en cada posición), con el uso de aminoácidos naturales, resulta posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT), (AGC)T, (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT) - es decir, DVT, DVC y DVY, respectivamente, usando la nomenclatura IUPAC - son los más próximos al perfil de aminoácidos deseado; codifican 22% de serina y 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína. Preferentemente, por lo tanto, las bibliotecas se construyen usando el codón DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.
Mutagénesis de PCR
El cebador es complementario a una porción de una molécula diana presente en una combinación de moléculas de ácidos nucleicos, usadas en la preparación de conjuntos de miembros del repertorio de ácidos nucleicos, que codifican miembros del repertorio de polipéptidos. Más a menudo, los cebadores se preparan por métodos sintéticos, ya sean químicos o enzimáticos. Los cebadores de oligonucleótidos mutagénicos tienen, por lo general, una longitud de 15 a 100 nucleótidos, idealmente de 20 a 40 nucleótidos, aunque se pueden usar oligonucleótidos de diferente longitud.
De manera típica, la hibridación selectiva se produce cuando dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente complementarias (al menos, aproximadamente complementarias en 65% a lo largo de una extensión de al menos 14 a 25 nucleótidos, preferentemente al menos alrededor de 75%, más preferentemente, una complementariedad de al menos aproximadamente 85% ó 90%). Véase Kanehisa, 1984, Nucleic Acid Res. 12: 203, incorporada como referencia al presente documento. En consecuencia, cabe esperar que se tolere un cierto grado de divergencia en el sitio cebador. Esta divergencia puede ser pequeña, tal como de un mino- bi- o tri-nucleótido. De forma alternativa, puede comprender bucles nucleotídicos, que se definen en este documento como regiones en las que la divergencia comprende una serie ininterrumpida de cuatro o más nucleótidos.
En general, cinco factores influyen sobre la eficacia y selectividad de la hibridación del cebador con una segunda molécula de ácidos nucleicos. Estos factores, que son (i) longitud del cebador, (ii) la secuencia y/o composición de la secuencia nucleotídica, (iii) la temperatura de hibridación, (iv) química del tampón, y (v) el potencial de impedimento estérico en la región con la que el cebador debe hibridar, son consideraciones importantes cuando se diseñan secuencias de cebado no aleatorias.
Existe una correlación positiva entre la longitud del cebador y tanto la eficacia como la exactitud con la que un cebador hibridará con una secuencia diana: secuencias más largas muestran una temperatura de fusión (Tm) más alta que las cortas, y tienen menos posibilidades de estar repetidas dentro de una secuencia diana determinada, minimizando de este modo la hibridación promiscua. Las secuencias de cebadores con un elevado contenido en G-C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a la auto-hibridación, al igual que sus sitios diana previstos, dado que, en solución, se ve favorecida la cinética de hibridación unimolecular sobre la bimolecular; al mismo tiempo, es importante diseñar un cebador que contenga un número suficiente de apareamientos nucleotídicos G-C para fijar fuertemente la secuencia diana, dado que cada uno de tales parejas está unida por tres enlaces de hidrógeno, en lugar de los dos observados cuando se aparean las bases A y T. La temperatura de hibridación varía de manera inversa con la eficacia de hibridación del cebador, al igual que la concentración de disolventes orgánicos, por ejemplo, formamida, que pueden estar incluidos en una mezcla de hibridación, en tanto que aumenta en la unión que facilita la concentración salina. Bajo condiciones de hibridación estrictas, las sondas más largas hibridan de manera más eficaz que las más cortas, que son suficientes bajo condiciones más permisivas. Las condiciones estrictas de hibridación para los cebadores incluyen, típicamente, concentraciones salinas de menos de aproximadamente 1M, más habitualmente menores que aproximadamente 500 mM y, preferentemente, menores que aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridación se encuentran dentro de un intervalo de 0ºC hasta más de 22ºC, mayores que aproximadamente 30ºC y (más frecuentemente) superiores a aproximadamente 37ºC. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridación más altas para una hibridación específica. Dado que son numerosos los factores que afectan a la estringencia de la hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellos por separado.
Los cebadores se diseñan teniendo en cuenta estas consideraciones. Mientras que un experto en la técnica puede calcular mentalmente los méritos relativos de numerosas secuencias, se han creado programas informáticos que contribuyen a la evaluación de estos diversos parámetros y a la optimización de las secuencias de cebadores. Ejemplos de tales programas son "PrimerSelect" del paquete de software DNAStar® (DNAStar, Inc.; Madison, WI), y OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.). Una vez que han sido diseñados, se preparan los oligonucleótidos apropiados mediante métodos adecuados, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers, 1981, (Tetrahedron Lett. 22: 1859), o el método triéster según Matteucci y Carruthers, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, ambos incorporados como referencia al presente documento, o por otros métodos, utilizando un sintetizador automatizado de nucleótidos disponible en el comercio o, por ejemplo, la tecnología VLSIPS®.
La PCR se lleva a cabo utilizando ADN molde (al menos 1 fg; más útil, 1-1000 ng) y al menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótidos; puede ser conveniente utilizar una cantidad mayor de cebador cuando el conjunto de cebadores es fuertemente heterogéneo, puesto que cada secuencia está representada sólo por una pequeña fracción de las moléculas del conjunto, y las cantidades resultan limitantes en ciclos de amplificación posteriores. La mezcla de reacción típica incluye: 2 \mul de ADN, 25 pmol de cebador oligonucleótido, 2,5 \mul de tampón 1 10 X de PCR (Perkin-Elmer), 0,4 \mul de dNTP 1,25 \muM, 0,15 \mul (ó 2,5 unidades) de ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 \mul. Se extiendo superficialmente aceite mineral y la PCR se lleva a cabo usando un termociclador programable.
La longitud y temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajustan de acuerdo con los requisitos de estringencia en vigor. La temperatura y los tiempos de hibridación se determinan tanto por la eficacia con que se espera que un cebador hibride con un molde, como por el grado de divergencia que puede ser tolerado; evidentemente, cuando se amplifican y mutagenizan simultáneamente moléculas de ácidos nucleicos, se requiere una divergencia, al menos en la primera ronda de síntesis. Al intentar amplificar una población de moléculas usando un conjunto de cebadores mutagénicos, se debe sopesar la pérdida, bajo condiciones de hibridación estrictas (alta temperatura), de potenciales productos mutantes que serían el resultado de bajas temperaturas de fusión frente a la hibridación promiscua de cebadores a secuencias diferentes del sitio diana. La capacidad para optimizar la estringencia de las condiciones de hibridación del cebador se encuentra dentro del conjunto de conocimientos del experto en la técnica. Se usa una temperatura de hibridación de entre 30ºC y 72ºC. La desnaturalización inicial de las moléculas molde se produce, normalmente, a entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguido a 20-40 ciclos consistentes en desnaturalización (94-99ºC durante 15 segundos a 1 minuto), hibridación (determinación de la temperatura de la forma descrita anteriormente; 1-2 minutos), y extensión (72ºC durante 1-5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final dura, por lo general, 4 minutos a 72ºC, y puede ir seguida de una etapa indefinida (0-24 horas) a 4ºC.
Rastreo de Dominios Variables de Inmunoglobulina Únicos para la Fijación de Antígenos
Después de la expresión de un repertorio de dominios variables de inmunoglobulina únicos en la superficie de un fago, se lleva a cabo la selección poniendo en contacto el repertorio del fago con el antígeno diana inmovilizado, lavando para eliminar el fago no fijado, y propagación del fago fijado, proceso conocido frecuentemente como "panning" (inmunopurificación). De manera alternativa, se preseleccionan los fagos para la expresión de los variantes de los miembros adecuadamente plegados por inmunopurificación contra un ligando genérico inmovilizado (por ejemplo, proteína A o proteína L), que sólo es fijado por los miembros plegados. Esto tiene la ventaja de reducir la proporción de miembros no funcionales, aumentando de este modo la proporción de miembros con posibilidades de fijar un antígeno diana. La preselección con ligandos genéricos se describe en el documento WO 99/20749. El rastreo de bibliotecas de anticuerpos fago se describe, en general, por ejemplo en Harrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83-109.
Normalmente, el rastreo se lleva a cabo usando antígeno purificado inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo, tubos o pocillos de plástico, o en una matriz cromatográfica, por ejemplo, Sefarosa® (Pharmacia). El rastreo o selección se puede efectuar también en antígenos complejos, tales como la superficie de células (Marks et al., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3938). Otra alternativa consiste en la selección mediante la fijación de antígeno biotinilado en solución, seguida por la captura sobre perlas recubiertas con estreptavidina.
En un aspecto preferido, la inmunopurificación se efectúa inmovilizando el antígeno (genérico o específico) sobre tubos o pocillos en una placa, por ejemplo, bandas de 8 pocillos del tubo inmunológico Nunc MAXISORP®. Los pocillos se recubren con 150 \mul de antígeno (100 \mug/ml en PBS) y se incuban durante la noche. A continuación, los pocillos se lavan 3 veces con PBS y se bloquean con 400 \mul de PBS-leche desnatada al 2% (2%MPBS) a 37ºC durante 2 horas. Los pocillos se enjuagan 3 veces con PBS y se agregan fagos en 2%MPBS. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos y se retira el líquido que contiene los fagos no fijados. Los pocillos se enjuagan 10 veces con PBS-0,1% de Tween 20 y, a continuación, 10 veces con PBS para eliminar el detergente. Los fagos fijados se eluyen mediante la adición de 200 \mul de trietilamina 100 mM recién preparada, mezclando íntimamente e incubando durante 10 min a temperatura ambiente. Los fagos eluidos se transfieren a un tubo que contiene 100 \mul de Tris-HCl 1M, a pH 7,4 y agitados en vórtex para neutralizar la trietilamina. Se infectan células hospedadoras de E. coli (por ejemplo, TG1) de cultivo exponencial con, por ejemplo, 150 ml de los fagos eluidos, incubando durante 30 min a 37ºC. Las células infectadas se centrifugan, se re-suspenden en medio fresco y se siembran en placas con agarosa en la parte superior. Las placas de fagos se eluyen o recogen en cultivos frescos de células hospedadoras para su propagación, con el fin de efectuar análisis o realizar ciclos de selección adicionales. Si es necesario, se llevan a cabo uno o más ciclos de purificación de placas para garantizar la obtención de poblaciones puras del fago seleccionado. Harrison et al., 1996, véase antes, describen otros métodos de rastreo.
Tras la identificación del fago que expresa un único dominio variable de inmunoglobulina que fija una diana deseada, si se ha utilizado un vector fagémido tal como pHEN1, se producen fácilmente las proteínas de fusión del dominio variable en forma soluble, mediante la infección de cepas bacterianas no supresoras, por ejemplo, HB2151, que permiten la secreción de la proteína de fusión solubles del gen III. De manera alternativa, es posible sub-clonar la secuencia del dominio V en un vector de expresión apropiado para producir una proteína soluble de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Purificación y Concentración de Dominios Variables Únicos de Inmunoglobulina
Los polipéptidos del dominio variable único de inmunoglobulina secretados hacia l espacio periplasmático o al medio de bacterias se recogen y purifican según métodos conocidos (Harrison et al., 1996, véase antes). Skerra y Pluckthun (1988, Science 240: 1038) y Breitling et al. (1991, Gene 104: 147) describen la recogida de polipéptidos de anticuerpos del periplasma, y Better et al. (1988, Science 240: 1041) describen la cosecha desde el sobrenadante del cultivo. La purificación se puede lograr también por la unión a ligandos genéricos tales como proteína A i Proteína L. Alternativamente, los dominios variables se pueden expresar con un tag peptídico, por ejemplo el tag Myc, HA o 6X-His, lo que facilita la purificación por cromatografía de afinidad.
Los polipéptidos se concentran por medio de varios métodos bien conocidos en la técnica incluida, por ejemplo, la ultrafiltración, diafiltración y la filtración de flujo tangencial. El proceso de ultrafiltración utiliza membranas semipermeables y presión para separar especies moleculares sobre la base del tamaño y peso. La presión se proporciona por presión gaseosa o centrifugación. Los productos de ultrafiltración comerciales están disponibles, por ejemplo, en Millipore (Bedford, MA; los ejemplos incluyen los concentradores Centricon® y Microcon®), y Vivascience (Hannover, Alemania; los ejemplos incluyen los concentradores Vivaspin®). Por la selección de un corte de peso molecular menor que el polipéptido diana (habitualmente 1/3 a 1/6 del peso molecular del polipéptido diana, aun cuando se pueden utilizar con éxito diferencias del orden incluso de 10 kD), el polipéptido queda retenido cuando el disolvente y solutos menores atraviesan la membrana. De esta forma, resulta útil un corte de peso molecular de aproximadamente 5 kD para la concentración de los polipéptidos del dominio variable único de inmunoglobulinas.
La diafiltración, que utiliza membranas de ultrafiltración con un proceso de "lavado", se usa cuando se desea eliminar o intercambiar la sal o tampón en una preparación polipeptídica. El polipéptido se concentra por el paso del disolvente y solutos pequeños a través de la membrana, y las sales o el tampón restantes se retiran por dilución del polipéptido retenido con una nueva solución de tampón o sal o agua, según se desee, acompañado por una ultrafiltración continua. En la diafiltración continua, se agrega nuevo tampón al mismo ritmo que el filtrado pasa a través de la membrana. Un volumen de diafiltración es el volumen de la solución de polipéptidos previo al inicio de la diafiltración; usando la diafiltración continua, es posible retirar más de 99,5% de un soluto totalmente permeable mediante el lavado a través de seis volúmenes de diafiltración con el nuevo tampón. De forma alternativa, el proceso se puede llevar a cabo de manera discontinua, donde la muestra se diluye repetidamente y, a continuación, se filtra hasta restaurar su volumen original, para eliminar o intercambiar la sal o el tampón y concentrar el polipéptido en último término. El equipo para la diafiltración y metodologías detalladas para su uso se encuentran disponibles, por ejemplo, en Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) y Sartorius AG/Vivascience (Hannover, Alemania).
La filtración de flujo tangencial (TFF), conocida también como "filtración de flujo cruzado", utiliza igualmente una membrana de ultrafiltración. El líquido que contiene el polipéptido diana se bombea tangencialmente a lo largo de la superficie de la membrana. La presión determina que una parte del líquido pase a través de la membrana, en tanto que el polipéptido diana quede retenido por encima del filtro. En contraste con la ultrafiltración, sin embargo, las moléculas retenidas no se acumulan en la superficie de la membrana, sino que fluyen a lo largo del flujo tangencial. La solución que no atraviesa el filtro (que contiene el polipéptido diana) se puede hacer circular de manera repetida a través de la membrana para alcanzar el grado de concentración deseado. El equipo para TFF y metodologías detalladas para su uso se encuentran disponibles, por ejemplo, en Millipore (por ejemplo, el sistema ProFlux M12® Benchtop TFF y los sistemas Pellicon®), Palla Life Sciences (por ejemplo, el sistema de Filtración de Flujo Tangencial Minim®).
La concentración de proteína se mide de una serie de formas bien conocidas en la técnica. Éstas incluyen, por ejemplo, análisis de aminoácidos, absorbancia a 280 nm, los métodos "Bradford" y "Lowry", y SDS-PAGE. El método más exacto es la hidrólisis total, seguida de análisis de aminoácidos por HPLC, y la concentración se determina, seguidamente, por comparación con la secuencia conocida del polipéptido del dominio variable único de la inmunoglobulina. Aunque este método es el más preciso, es caro y requiere mucho tiempo. La determinación de proteínas por medición de la absorbancia UV a 280 nm es más rápido y mucho menos costoso, aunque relativamente exacto y se prefiere como compromiso sobre el análisis de aminoácidos. La absorbancia a 280 nm se utilizó para determinar las concentraciones de proteínas comunicadas en los Ejemplos que se describen en este documento.
Los ensayos de proteínas "Bradford" y "Lowry" (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) comparan la concentración de proteínas de la muestra con una curva estándar basada, muy frecuentemente, en la albúmina de suero bovino (BSA). Estos métodos son menos exactos, y tienden a subestimar la concentración de dominios variables únicos de inmunoglobulina. Su precisión podría mejorar, sin embargo, usando un polipéptido de dominio único V_{H} o V_{\kappa} como estándar.
Un ensayo adicional de proteínas es el ensayo de ácido bicinconínico descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.839.295 (que se incorpora a este documento como referencia), y comercializado por Pierce Biotechnology (Rockford, IL) como "Ensayo de Proteínas BCA" (por ejemplo, Nº de Catálogo de Pierce 23227).
El método SDS-PAGE usa electroforesis de gel y tinción con Azul Coomassie en comparación con concentraciones estándares conocidas, por ejemplo, cantidades conocidas de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina. La cuantificación se puede efectuar visualmente o por densitometría.
Los polipéptidos fijadores de antígeno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina humana descritos en este documento conservan la solubilidad a concentración elevada (por ejemplo, al menos 4,8 mg (\sim400 \muM) en solución acuosa (por ejemplo, PBS) y, preferentemente, al menos 5 mg/ml (\sim417 \muM), 10 mg/ml (\sim833 \muM), 20 mg/ml (\sim1,7 mM), 25 mg/ml (\sim2,1 mM), 30 mg/ml (\sim2,9 mM), 40 mg/ml (\sim3,3 mM), 45 mg/ml (\sim3,75 mM), 50 mg/ml (\sim4,2 mM), 55 mg/ml (\sim4,6 mM), 60 mg/ml (\sim5,0 mM), 65 mg/ml (\sim5,4 mM), 70 mg/ml (\sim5,8 mM), 75 mg/ml (\sim6,3 mM), 100 mg/ml (\sim8,33 mM), 150 mg/ml (\sim12,5 mM), 200 mg/ml (\sim16,7 mM), 240 mg/ml (\sim20 mM) o mayor). Una característica estructural que estimula la alta solubilidad es el tamaño relativamente pequeño de los polipéptidos de dominio variable único de la inmunoglobulina. Un anticuerpo convencional de cuatro cadenas y de longitud completa, por ejemplo, IgG, tiene un tamaño de aproximadamente 150 kD. Por el contrario, los dominios variables únicos de inmunoglobulina, todos los cuales tienen una estructura general que comprende 4 regiones marco (FW) y 3 CDRs, tienen tamaños de aproximadamente 12 kD, o menos de 1/10 del tamaño de un anticuerpo convencional. Del mismo modo, los dominios variables únicos de inmunoglobulina tienen aproximadamente la mitad del tamaño de una molécula de scFv (\sim26 kD), y aproximadamente 1/5 del tamaño de una molécula de Fab (\sim60 kD). Se prefiere que el tamaño de una estructura que contenga dominios variables únicos de inmunoglobulina descrita en este documento sea de 100 kD o menor, incluyendo estructuras de, por ejemplo, aproximadamente 90 kD o menor, 80 kD o menor, 70 kD o menor, 60 kD o menor, 50 kD o menor, 40 kD o menor, 30 kD o menor, 20 kD o menor, hasta e incluyendo aproximadamente 12 kD, o un único dominio variable de inmunoglobulina aislado.
La solubilidad de un polipéptido se determina, principalmente, por las interacciones de las cadenas laterales de aminoácidos con el disolvente que lo rodea. Las cadenas laterales hidrófobas tienden a localizarse en el interior como pliegues polipeptídicos, alejados de las superficies del polipéptido que interactúan con el disolvente. Por el contrario, los residuos hidrófilos tienden a localizarse en las superficies del polipéptido que interactúan con el disolvente. Por lo general, los polipéptidos que tienen una secuencia primaria que permite que la molécula se pliegue para exponer más residuos hidrófilos al entorno acuoso son más solubles que los que se pliegan para exponer menos residuos hidrófilos a la superficie. Así, la disposición y el número de residuos hidrófobos e hidrófilos es un factor importante de determinación de la solubilidad. Otros parámetros que determinan la solubilidad de los polipéptidos incluyen el pH del disolvente, su temperatura y la potencia iónica. En la práctica común, la solubilidad de los polipéptidos se puede mantener o potenciar por medio de la adición de glicerol (por ejemplo, \sim10% en v/v) a la solución.
Como se ha discutido anteriormente, se han identificado residuos de aminoácidos específicos en residuos conservados de dominios V_{H} humanos que varían en los dominios V_{H} de las especies camélidas que, por lo general, son más solubles que los dominios V_{H} humanos. Éstos incluyen, por ejemplo, Gly 44 (Glu en camélidos), Leu 45 (Arg en camélidos) y Trp 47 (Gly en camélidos). El residuo aminoácido 103 de V_{H} interviene en la solubilidad, con la mutación de Trp a Arg para intentar conferir una solubilidad aumentada de V_{H}.
En aspectos preferidos de la invención, los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina se basan en el segmento del gen V_{H} de la línea germinal DP47 o en el segmento del gen V_{\kappa} de la línea germinal DPK9. Por lo tanto, estos segmentos de genes de la línea germinal son capaces, en especial cuando están diversificados en las localizaciones estructurales seleccionadas que se describen en este documento, de producir polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulinas con fijación específica, dotados de una alta solubilidad. En particular, las cuatro regiones marco que, preferentemente, no están diversificadas, pueden contribuir a la alta solubilidad de las proteínas resultantes.
Cabe esperar que un único dominio variable de inmunoglobulina humana que exhiba una elevada homología con uno que muestre una elevada solubilidad, tienda también a ser altamente soluble. Así, como medio de predicción o reconocimiento de que un determinado dominio variable único de inmunoglobulina tendría la alta solubilidad mencionada anteriormente, es posible comparar la secuencia de un polipéptido de un dominio variable único de inmunoglobulina con uno o múltiples polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina con una solubilidad conocida. De esta forma, cuando se identifica un polipéptido de un dominio variable único de inmunoglobulina que tiene una afinidad de unión pero solubilidad desconocida, la comparación de su secuencia de aminoácidos con la de uno o múltiples (preferentemente, múltiples) polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina humana conocidos por tener una elevada solubilidad (por ejemplo, una secuencia de dAB descrita en este documento), puede permitir predecir su solubilidad. Aunque no se trata de un sistema absoluto de predicción, cuando existe un alto grado de similitud con una secuencia altamente soluble conocida, por ejemplo, similitud de 90-95% o mayor y, en particular, cuando existe un alto grado de similitud con respecto a los residuos aminoácidos hidrófilos, o residuos susceptibles de ser expuestos a la interface con el disolvente, es más probable que un polipéptido de fijación recién identificado tenga una solubilidad similar a la de la secuencia altamente soluble conocida.
También se puede usar software para el modelamiento molecular para predecir la solubilidad de una secuencia polipeptídica con respecto a la de un polipéptido de solubilidad conocida. Por ejemplo, cabe esperar que la sustitución o adición de un residuo hidrófobo en la superficie expuesta al disolvente, en relación con una molécula de solubilidad conocida que tiene un residuo menos hidrófobo o, incluso, hidrófilo expuesto en esa posición, reduzca la solubilidad relativa del polipéptido. De igual forma, se espera que la sustitución o adición de un residuo más hidrófilo en esa localización aumente la solubilidad relativa. Es decir, una variación del número neto de residuos hidrófilos o hidrófobos localizados en la superficie de la molécula (o la naturaleza hidrófoba o hidrófila global de los residuos expuestos a la superficie), en relación con la estructura de un polipéptido de un dominio variable único de inmunoglobulina con una solubilidad conocida, puede predecir la solubilidad relativa de un polipéptido de un dominio variable único de inmunoglobulina.
De manera alternativa o junto con dicha predicción, es posible determinar los límites de la solubilidad de un polipéptido de un dominio variable único de inmunoglobulina simplemente por medio de la concentración del polipéptido.
Determinación de Afinidad/Actividad
Los polipéptidos aislados que contienen dominios variables únicos de inmunoglobulina humana, descritos en este documento, tienen afinidades (constante de disociación, K_{d} = K_{off}/K_{on}) de al menos 300 nM o menos y, preferentemente, de al menos 300 nM -50 pM, 200 nM -50 pM y, más preferentemente, de al menos 100 nM -50 pM, 75 nM -50 pM, 50 nM -50 pM, 25 nM -50 pM, 10 nM -50 pM, 5 nM -50 pM, 1 nM -50 pM, 950 pM -50 pM, 900 pM -50 pM, 850 pM -50 pM, 800 pM -50 pM, 750 pM -50 pM, 700 pM -50 pM, 650 pM -50 pM, 600 pM -50 pM, 550 pM -50 pM, 500 pM -50 pM, 450 pM -50 pM, 400 pM -50 pM, 350 pM -50 pM, 300 pM -50 pM, 250 pM -50 pM, 200 pM -50 pM, 150 pM -50 pM, 100 pM -50 pM, 90 pM -50 pM, 80 pM -50 pM, 70 pM -50 pM, 60 pM -50 pM o, incluso, del orden de 50 pM.
La afinidad de fijación de antígenos de un polipéptido de dominio variable se puede medir, de manera conveniente, por resonancia de plasmón de superficie (SPR), usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.). En este método, el antígeno se acopla con el chip BIAcore a concentraciones conocidas, y se introducen los polipéptidos de dominio variable. La unión específica entre el polipéptido de dominio variable y el antígeno inmovilizado da como resultado un incremento de la concentración de proteína en la matriz del chip y en un cambio de la señal de SPR. Los cambios de la señal de SPR se registran como unidades de resonancia (RU) y se expresan con respecto al tiempo a lo largo del eje Y de un sensograma. La señal basal se toma con el paso a través del chip de disolvente solo (por ejemplo, PBS). La diferencia neta entre la señal basal y la señal tras finalizar la inyección del polipéptido de dominio variable representa el valor de unión de una muestra determinada. Para establecer las constantes del índice de apagado (off) (K_{off}), de encendido (on) (K_{on}) y de disociación (K_{d}), se utiliza el software de evaluación cinética BIAcore (por ejemplo, versión 2.1).
La alta afinidad depende de la complementariedad entre una superficie del antígeno y las CDRs del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La complementariedad se determina por el tipo e intensidad de las interacciones moleculares posibles entre porciones de la diana y la CDR, por ejemplo, las interacciones iónicas potenciales, las atracciones de van der Waals, la formación de enlaces de hidrógeno u otras interacciones que pueden producirse. La CDR3 tiende a contribuir en mayor medida a las interacciones de fijación de antígeno que las CDRs 1 y 2, probablemente debido a su tamaño generalmente mayor, que ofrece más oportunidades para interacciones de superficie favorables. (Véanse, por ejemplo, Padlan et al., 1994, Mol. Immunol. 31: 169-217; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 904-917; y Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). La alta afinidad indica apareamientos de dominios variables únicos de inmunoglobulina/antígeno que exhiben un elevado grado de complementariedad, que está directamente relacionada con las estructuras del dominio variable y la diana.
Las estructuras que confieren alta afinidad a un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina para un antígeno determinado se pueden hacer resaltar usando un software de modelamiento molecular que permite el acoplamiento de un antígeno con la estructura del polipéptido. Por lo general, se puede acoplar un modelo computadorizado de la estructura de un dominio variable único de inmunoglobulina con un modelo computadorizado de un polipéptido u otro antígeno diana de estructura conocida, para determinar las superficies de interacción. Dada la estructura de las superficies de interacción para una interacción conocida de este tipo, es posible predecir, entonces, el impacto - positivo o negativo - de sustituciones conservativas o menos conservativas en la secuencia del dominio variable sobre la intensidad de la interacción, permitiendo de esta forma el diseño racional de moléculas de unión optimizadas.
Formas Multiméricas de Dominios Variables Únicos de Anticuerpo
En un aspecto, se multimeriza un dominio variable único de anticuerpo como se describe en este documento como, por ejemplo, hetero- u homodímeros, hetero- u homotrímeros, hetero- u homotetrámeros, o hetero- u homomultímeros de un orden superior (por ejemplo, hetero- u homopentámero y hasta octámeros). La multimerización puede aumentar la intensidad de la fijación de antígenos a través del efecto de avidez, en el que la intensidad de la fijación está relacionada con la suma de las afinidades de unión de los múltiples sitios de unión.
Los hetero- y homomultímeros se preparan mediante la expresión de dominios variables únicos de anticuerpo fusionados, por ejemplo, a través de un enlazador peptídico, que conduce a la configuración dAb-enlazador-dAb o un múltiplo superior de dicha disposición. Los multímeros pueden estar unidos entre sí también por restos adicionales; por ejemplo, PEG. Se puede utilizar cualquier secuencia de enlazador peptídico para generar hetero- u homomultímeros, por ejemplo, una secuencia de enlace como la que se usa en la técnica para generar un scFv. Un enlazador a menudo útil comprende unidades repetidas de la secuencia peptídica (Gly_{4}Ser)_{n}, donde n = 1 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, n= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10). Por ejemplo, el enlazador puede ser (Gly_{4}Ser)_{3}, (Gly_{4}Ser)_{7} u otro múltiplo de la secuencia (Gly_{4}Ser).
Una alternativa a la expresión de multímeros como monómeros unidos por secuencias peptídicas es el enlace de los dominios variables únicos de inmunoglobulina monoméricos después de la traducción mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otro enlace químico. Por ejemplo, se trata por ingeniería una cisteína libre, por ejemplo, en el extremo C-terminal del polipéptido monomérico, que permite la formación de enlaces disulfuro entre monómeros. En estos u otros aspectos que requieren una cisteína libre, la cisteína se introduce mediante la inclusión de un codón de cisteína (TGT, TGC) en un cebador adyacente al último codón de la secuencia dAb (para una cisteína C-terminal, la secuencia en el cebador será, en realidad, el complemento inverso, es decir, ACA o GCA, porque se incorporará en el cebador de PCR corriente abajo), e inmediatamente antes de uno o más codones de terminación. Si se desea, se coloca una secuencia peptídica de unión, por ejemplo, (Gly_{4}Ser)_{n} entre la secuencia dAb y la cisteína libre. La expresión de los monómeros que tienen un residuo cisteína libre da como resultado una mezcla de formas monómeras y dímeras en una relación de aproximadamente 1:1. Los dímeros se separan de los monómeros usando cromatografía sobre gel, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico con elución con un gradiente salino.
De forma alternativa, se usa una cisteína libre tratada por ingeniería para acoplar monómeros a través de enlaces de tiol a un enlazador químico multivalente, tal como una molécula de maleimida trimérica (por ejemplo, Tris[2-maleimido-etil]amina, TMEA) o una molécula de bi-maleimida-PEG (disponible en, por ejemplo, Nektar (Shearwater)).
En una realización, un homodímero o heterodímero según la invención incluye dominios V_{H} o V_{L} que están unidos covalentemente en un aminoácido C-terminal con un dominio C_{H1} de inmunoglobulina o un dominio C_{\kappa}, respectivamente. DE este modo, el hetero- u homodímero puede ser una molécula semejante a Fab en la que el dominio de fijación del antígeno contiene dominios V_{H} y/o V_{L} asociados, unidos covalentemente en sus extremos C-terminales a un dominio C_{H1} o C_{\kappa}, respectivamente. Adicional o alternativamente, se puede modelar un multímero dAb según la invención en las especies camélidas que expresan una alta proporción de anticuerpos altamente específicos y totalmente funcionales, exentos de secuencias de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada camélidos se encuentran como homodímeros de una única cadena pesada, dimerizados a través de sus regiones constantes. Los dominios variables de estos anticuerpos de cadena pesada camélidos se denominan dominios V_{H}H y conservan la capacidad, cuando se les aísla como fragmentos de la cadena V_{H}, de fijar antígeno con alta especificidad (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). De esta forma, se puede construir un multímero de dominio variable único de anticuerpo según la invención usando métodos conocidos en la técnica, anteriormente descritos, para que posean la conformación V_{H}H de los anticuerpos de cadena pesada de las especies camélidas.
Antígenos Diana
Los antígenos diana para los polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo descritos en este documento son antígenos humanos relacionados con una enfermedad o trastorno. Es decir, los antígenos diana descritos en este documento son dianas terapéuticamente relevantes. Una "diana terapéuticamente relevante" es una que, cuando es fijada por un dominio variable único de anticuerpo u otro polipéptido que fija antígenos diana y actúa como antagonista o agonista de la actividad de dicha diana, tiene un efecto beneficioso sobre el individuo (preferentemente, un mamífero, preferentemente humano)en el que fija la diana. Se demuestra un "efecto beneficioso" mediante una mejoría de al menos 10% de uno o más indicios clínicos de una enfermedad o trastorno o, de manera alternativa, cuando se opta por el uso preventivo del polipéptido del dominio variable único de inmunoglobulina, por un aumento de al menos 10% del tiempo antes de que se registren los síntomas de la enfermedad o trastorno dianizado, con respecto a un individuo no tratado con la preparación del polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina. Ejemplos no limitantes de antígenos que constituyen dianas apropiadas para los polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina descritos en este documento incluyen enzimas, co-factores enzimáticos, o proteínas de unión de ADN. Las citoquinas y factores de crecimiento adecuados incluyen, pero no están limitados a los mismos: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF ácido, FGF básico, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-g, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina \alpha, Inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibitoria Mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína de atracción de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-Ia, MIP-I\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor 1 inhibidor del progenitor mieloide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, \beta-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, sitio de reconocimiento TACE, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGA-\beta2, TGF-\beta3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-\alpha, TNF-\beta, receptor I de TNF (p55), receptor II de TNF, TNL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP2, GRO(MGSA, GRO-\beta, GRO-\gamma, HCCI, 1-09, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4. Los receptores de citoquinas incluyen receptores para cada una de las citoquinas anteriores, por ejemplo, IL-1R, IL-6R, IL-10R, IL-18R, etc. Se apreciará que la presente relación no es en absoluto exhaustiva. Dianas preferidas para los polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo según la invención se describen en el documento WO 04/041867 (cyo contenido se incorpora en su totalidad a este documento) e incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, TNF-\alpha, IgE, IFN\gamma, MMP-12, EGFR, CEA, H.pylori, TB, influenza, PDK-1, GSK 1, Bad, caspasa, Forkhead y el Factor de Von Willebrand (vWF). Las dianas pueden ser también fragmentos de las dianas anteriores. Así, una diana es también un fragmento de las dianas anteriores, capaz de inducir una respuesta inmune. Diana es también un fragmento de las dianas anteriores, capaz de fijarse a un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo generado contra la diana de longitud completa.
En un aspecto, un dominio variable único de inmunoglobulina está unido a otro dominio variable único de inmunoglobulina para formar un homodímero o heterodímero, en el cual cada dominio individual es capaz de fijar su antígeno afín (cognado). La fusión de dominios variables únicos de inmunoglobulina como homodímeros puede incrementar la eficacia de la fijación de dianas, por ejemplo, a través del efecto de avidez. La fusión de dominios variables únicos de inmunoglobulina como heterodímeros, en el que cada monómero fija un antígeno diana diferente, puede producir un ligando doblemente específico, capaz, por ejemplo, de unir mediante puentes los respectivos antígenos diana.
Estos ligandos doblemente específicos se pueden utilizar para dianizar citoquinas y otras moléculas que cooperan de forma sinérgica en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. Así, se proporciona un método para sinergizar la actividad de dos o más citoquinas, que comprende administrar un heterodímero de dominio variable único de inmunoglobulina doblemente específico capaz de fijar las dos o más citoquinas. En este aspecto, el ligando doblemente específico puede ser cualquier ligando doblemente específico, incluido un ligando compuesto por dominios complementarios y/o no complementarios. Por ejemplo, este aspecto se relaciona con combinaciones de dominios V_{H} y dominios V_{L}, dominios V_{H} solamente y dominios V_{L} solamente.
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Preferentemente, las citoquinas fijadas por el heterodímero del dominio variable único de inmunoglobulina doblemente específico de este aspecto de la invención, se seleccionan de la lista siguiente:
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Se conocen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para los antígenos diana relacionados anteriormente y otros, y están disponibles para los expertos en la técnica. El experto en la técnica utiliza métodos convencionales de expresión de proteínas recombinantes para expresar y purificar estos y otros antígenos en los casos necesarios, por ejemplo, para inmunopurificar dominios variables únicos de inmunoglobulina que se fijan al antígeno diana.
Ensayos Funcionales
En una realización, los dominios variables únicos de anticuerpo (y multímeros de dominio único) descritos tienen actividad neutralizadora (por ejemplo, actividad antagonista) o actividad agonista con respecto a sus antígenos diana. La actividad (neutralizante o agonista) de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina descrita en este documento se mide en relación con la actividad del antígeno diana en ausencia del polipéptido en cualquier ensayo aceptable para dicha actividad. Por ejemplo, si el antígeno diana es una enzima, se utiliza un ensayo funcional in vivo o in vitro que controle la actividad de esa enzima para monitorizar la actividad o efecto de un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo.
Cuando el antígeno diana es, por ejemplo, un receptor, por ejemplo, un receptor de citoquina, la actividad se mide en términos de fijación reducida o aumentada de ligando al receptor, o en términos de actividad reducida o aumentada de señalización por parte del receptor en presencia de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina. La actividad de señalización de receptores se mide monitorizando, por ejemplo, la conformación del receptor, la fijación de co-factor o polipéptido socio, GDP para intercambio de GTP, una quinasa, fosfatasa u otra actividad enzimática que posea el receptor activado, o monitorizando un resultado corriente debajo de dicha actividad, tal como la expresión de un gen (incluido un gen informador) u otro efecto, incluido, por ejemplo, la lisis celular, replicación de ADN, adhesión celular, o secreción de una o más moléculas que se producen normalmente como resultado de la activación del receptor.
Cuando el antígeno diana es, por ejemplo, una citoquina o factor de crecimiento, la actividad se monitoriza analizando la unión de la citoquina a su receptor, o monitorizando la activación del receptor, por ejemplo, estudiando la actividad de señalización del receptor, como se ha indicado anteriormente. Un ejemplo de ensayo funcional capaz de medir el efecto corriente debajo de una citoquina es el ensayo de lisis de células L929 para la actividad de TNF-\alpha, que es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 6.090.382). En este documento, el siguiente ensayo de citotoxicidad L929 se designa como el ensayo de citotoxicidad L929 "convencional". Se analiza la capacidad de dominios variables de inmunoglobulina único anti-TNF ("dAbs anti-TNF") para neutralizar la actividad citotóxica de TNF en fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). En pocas palabras, células L929 sembradas en placas de microtitulación se incuban durante la noche con dAbs anti-TNF, 100 pg/ml de TNF y 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, R.U.). La viabilidad celular se mide leyendo la absorbancia a 490 nm tras una incubación con [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-5-(3-carboxi-metoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, EE.UU.). La actividad de dAb anti-TNF conduce a un descenso de la citotoxicidad de TNF y, por lo tanto, a un aumento de la absorbancia, comparada con el control de TNF solo. Un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina descrito en este documento, y que es específico para TNF-\alpha o el receptor de TNF-\alpha, tiene una CI_{50} de 500 nM o menor en este ensayo convencional de células L929, preferentemente 50 nM o menor, 5 nM o menor, 500 pM o menor, 200 pM o menor, 100 pM o menor o, incluso, 50 pM.
En la técnica se conocen ensayos para medir la fijación del receptor por parte de un ligando, por ejemplo, una citoquina. Por ejemplo, se puede analizar la capacidad de los dAbs anti-TNF para inhibir la unión de TNF al receptor 1 de TNF recombinante (p55). En pocas palabras, se incuban placas Maxisorp durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de Fc anti-humano de ratón (Zymed, San Francisco, EE.UU.). Los pocillos se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,05% de Tween 20 y, a continuación, se bloquean con 1% de BSA en PBS, antes de incubarlas con 100 ng/ml de proteína de fusión Fc del receptor 1 de TNF (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.). Se mezcla dAb anti-TNF con TNF, que se agrega a los pocillos lavados a una concentración final de 10 mg/ml. La fijación de TNF se detecta con 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCult biotechnology, Uben, Holanda), seguido por una dilución de 1/500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, RU) e incubación con sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD). La reacción se interrumpe por la adición de HCl y se lee la absorbancia a 450 nm. La actividad inhibitoria del dAb anti-TNF conduce a un descenso de la fijación de TNF y, por lo tanto, a una reducción de la absorbancia, comparada con el control de TNF único.
En la técnica se conocen ensayos para medir la fijación del receptor por parte de un ligando, por ejemplo, una citoquina. Por ejemplo, se puede analizar la capacidad de los dAbs del receptor de anti-TNF para inhibir la unión de TNF al receptor 1 de TNF recombinante (p55). En pocas palabras, se incuban placas Maxisorp durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de Fc anti-humano de ratón (Zymed, San Francisco, EE.UU.). Los pocillos se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,05% de Tween 20 y, a continuación, se bloquean con 1% de BSA en PBS, antes de incubarlos con 100 ng/ml de proteína de fusión Fc del receptor 1 de TNF (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.). Se incuba dAb del receptor 1 de anti-TNF en la placa durante 30 min, antes de la adición de TNF, que se agrega a una concentración final de 3 mg/ml, y se continúa la incubación durante 60 min. Se lava la placa para retirar cualquier proteína que no se haya fijado antes de la etapa de detección. La fijación de TNF se detecta con 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCult biotechnology, Uben, Holanda), seguido por una dilución de 1/500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, RU) e incubación con sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD). La reacción se interrumpe por la adición de HCl y se lee la absorbancia a 450 nm. La actividad inhibitoria del dAb anti-TNF conduce a un descenso de la fijación de TNF y, por lo tanto, a una reducción de la absorbancia, comparada con el control de TNF único.
Como alternativa de la evaluación del efecto de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina sobre el receptor de TNF-\alpha p55, se puede utilizar el siguiente ensayo basado en células HeLa de la inducción de la secreción de IL-8 por TNF en células HeLa (el método ha sido adaptado del de Alceson, L. et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523, que describe la inducción de IL-8 por la IL-1 en HUVEC; en este caso, los presentes inventores analizan la inducción por parte del TNF-\alpha humano, y usan células HeLa en lugar de la línea celular HUVEC). Brevemente, se incuban células HeLa sembradas en placas de microtitulación durante la noche con dAb y 300 pg/ml de TNF. Tras la incubación, se retira por aspiración el sobrenadante de las células y se mide la concentración de IL-8 en el sobrenadante, comparada con el control de TNF solo.
Como alternativa de la evaluación del efecto de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina sobre el receptor de TNF-\alpha p55, se puede utilizar el siguiente ensayo con células MRC-5 de la inducción de la secreción de IL-8 por TNF en células MRC-5 (el método ha sido adaptado del de Alceson, L. et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523, que describe la inducción de IL-8 por la IL-1 en HUVEC; en este caso, los presentes inventores analizan la inducción por parte del TNF-\alpha humano, y usan células MRC-5 en lugar de la línea celular HUVEC). Brevemente, se incuban células MRC-5 sembradas en placas de microtitulación durante la noche con dAb y 300 pg/ml de TNF. Tras la incubación, se retira por aspiración el sobrenadante de las células y se mide la concentración de IL-8 por medio de un ELISA emparedado (R&D Systems). La actividad del dAb anti-TNFR1 conduce a un descenso de la secreción de IL-8 en el sobrenadante, comparada con el control de TNF solo.
Los expertos en la técnica conocen ensayos funcionales similares de la actividad de otros ligandos (citoquinas, factores de crecimiento, etc.) o sus receptores, y que se pueden usar para evaluar el efecto antagonista o agonista de polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina.
En una realización de la invención, los polipéptidos dAb PEGilados (monómeros y/o multímeros) conservan su actividad con respecto a los monómeros o multímeros de dAb no PEGilados, donde la actividad se mide de la forma descrita anteriormente; es decir, se mide por la afinidad del dAb PEGilado por la molécula diana. Un monómero o multímero de dAb PEGilado según la invención conservará un nivel de actividad (por ejemplo, afinidad por la diana) que es de al menos 10% del nivel de actividad de un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG, preferentemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y hasta 90% o más de la actividad de un dominio variable único de anticuerpo no conjugado con PEG, donde la actividad se determina de la forma descrita más arriba. En una realización preferida, un monómero o multímero de dAb PEGilado retiene al menos 90% de la actividad de un monómero o multímero de dAb no PEGilado y, de forma todavía más preferida, retiene toda (100%) la actividad de un monómero o multímero de dAb no PEGilado.
Secuencias homólogas
La invención comprende clones de dominios variables únicos de anticuerpo y clones con una similitud u homología sustancial con ellos, de forma que también fijan el antígeno diana con alta afinidad, y son solubles en altas concentraciones (así como los clones de dominios variables únicos de anticuerpo incorporados en multímeros). Tal como se usa en este documento, una similitud u homología "sustancial" es una similitud u homología de al menos 85%.
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan de forma intercambiable en este documento) se llevan a cabo del modo siguiente. Se alinean las secuencias para lograr una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir separaciones o gaps en uno o ambas secuencias del primer y segundo aminoácidos o ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo, y las secuencias no homólogas se pueden desechar para los fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para comparación es de al menos 30%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 50%, todavía más preferido de al menos 60% y, aún más preferentemente de 70%, 80%, 90% ó 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoácido o nucleótido que en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en este documento, la "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). La identidad porcentual entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en consideración el número de gaps, y la longitud de cada uno de ellos, que se deben introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
Como se usa en este documento, la "similitud" de secuencias es la medición del grado en que las secuencias de aminoácidos comparten residuos aminoácidos similares en posiciones correspondientes, en cualquier alineamiento de las secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí cuando sus cadenas laterales son similares. Específicamente, "similitud" incluye aminoácidos que son sustitutos conservativos entre sí. Una sustitución "conservativa" es cualquier sustitución que muestra una puntuación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 10915-10919). La afirmación "la secuencia A es n% similar a la secuencia B" indica que n% de las posiciones de un alineamiento óptimo entre las secuencias A y B consiste en aminoácidos idénticos o sustituciones conservativas. Es posible efectuar alineamientos óptimos globales usando los siguientes parámetros en el algoritmo de alineamiento farmacéuticamente Needleman-Wunsch:
Para polipéptidos:
Matriz de sustitución: blosum62
Función de puntuación de gaps: -A-B*LG, donde A = 11 (penalty de gap), B = 1 (penalty de la longitud de gap), y LG es la longitud del gap.
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Para secuencias de nucleótidos:
Matriz de sustitución: 10 para convergencias, 0 para divergencias
Función de puntuación de gaps: -A-B*LG, donde A = 50 (penalty de gap), B = 3 (penalty de la longitud de gap), y LG es la longitud del gap.
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Las sustituciones conservativas típicas se producen entre Met, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos Asp, Glu y Asn; entre los residuos Gln, Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr. Al calcular el grado (muy a menudo, en forma de porcentaje) de similitud entre dos secuencias de polipéptidos, se toma en consideración el número de posiciones en que se observa identidad o similitud entre residuos aminoácidos correspondientes en las dos secuencias polipeptídicas, con respecto a las longitudes totales de las dos moléculas que se comparan.
De manera alternativa, se utiliza el algoritmo BLAST (Instrumento de Búsqueda de Alineamiento Local Básico) para el alineamiento de secuencias, fijando los parámetros en valores por defecto. El algoritmo BLAST "BLAST 2 Sequences" está disponible en Internet (página web) del Centro Nacional de Información de Biotecnología (".ncbi") de la Biblioteca Nacional de Medicina (".nlm") de los Institutos Nacionales de Sanidad ("nih") del gobierno de Estados Unidos (".gov"), en el directorio "/blast/", sub-directorios "bl2seq/bl2.html." Este algoritmo alinea dos secuencias para su comparación, y se describe en Tatusova y Madden, 1999, FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250.
Una medición adicional de homología o similitud es la capacidad de hibridar bajo condiciones de hibridación de alta estringencia. De esta forma, una primera secuencia que codifica un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina es sustancialmente similar a una segunda secuencia codificadora si la primera secuencia hibrida con la segunda secuencia (o su complemento) bajo condiciones de hibridación de alta estringencia (tales como las que se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, Nueva York). Las "condiciones de hibridación de alta estringencia" se refieren a la hibridación de 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguida de uno o más lavados en 0,2X SDS a 65ºC. Las "condiciones de hibridación de muy alta estringencia" se refieren a la hibridación de fosfato sódico 0,5 M, 7% de SDS a 65ºC, seguida de uno o más lavados con 0,2X SSC, 1% de SDS a 65ºC.
PEGilación de dAbs
La presente invención proporciona monómeros y multímeros de dAb PEGilados que ofrecen una mayor semivida y resistencia a la degradación, sin una pérdida de actividad (por ejemplo, afinidad de fijación) en relación con dAbs no PEGilados.
Las moléculas dAb según la invención se pueden acoplar, usando métodos conocidos en la técnica, con moléculas de polímero (PEG) útiles para alcanzar las propiedades de semivida y resistencia a la degradación aumentadas incluidas en la presente invención. Los restos de polímeros PEG que se pueden usar en la invención pueden ser sintéticos o de origen natural, e incluyen polímeros de cadena lineal o ramificada. Polímeros especialmente preferidos y útiles en la invención incluyen PEG sustituido, incluyendo el metoxi(polietilenglicol). Las formas derivatizadas de moléculas polímeras que se usan en la invención incluyen, por ejemplo, derivados que poseen restos adicionales o grupos reactivos presentes en los mismos que permiten la interacción con residuos aminoácidos de los polipéptidos de dAb descritos anteriormente. Estos derivados incluyen ésteres Activos de N-hidroxil-succinimida (NHS), polímeros de propionato de succinimidilo, y agentes reactivos selectivos para sulfhidrilo tales como maleimida, vinil-sulfona, y tiol. Los polímeros derivatizados especialmente preferidos incluyen, pero sin limitación, polímeros PEG de las fórmulas: PEG-O-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-S-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; PEG-O_{2}CNH-CH(R)-CO_{2}-NHS; PEG-NHCO-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; y PEG-O-CH_{2}-CO_{2}-NHS; donde R es (CH_{2})_{4})NHCO_{2}(mPEG). Polímeros PEG útiles en la invención pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificadas, donde múltiples restos PEG se encuentran presentes en un solo polímero. Algunos derivados PEG especialmente preferidos de utilidad en la invención incluyen, pero sin limitación, los siguientes:
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El grupo reactivo (por ejemplo, MAL; NHS, SPA, VS o Tiol) puede estar unido directamente al polímero PEG, o puede estar unido con PEG a través de una molécula de enlace.
El tamaño de los polímeros de utilidad en la invención puede estar dentro del intervalo de entre kDa y 60 kDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, 40 kDa y 60 kDa y hasta 50 kDa y 60 kDa. Los polímeros utilizados en la invención, en especial PEG, pueden ser polímeros de cadena lineal o pueden exhibir una conformación ramificada. Dependiendo de la combinación de peso molecular y conformación, las moléculas de polímero útiles en la invención, cuando están unidas a un monómero o multímero de dAb, darán una molécula con un tamaño hidrodinámico medio de al menos 200 kDa. El tamaño hidrodinámico de una molécula de polímero usada en este documento se refiere al tamaño aparente de la molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basado en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento de una proteína en una solución, se puede procesar para derivar un tamaño aparente de la proteína, donde el tamaño viene dado por el radio de Stokes o radio hidrodinámico de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de manera que dos proteínas que tengan la misma masa molecular pueden tener tamaños hidrodinámicos diferentes basados en la conformación general de la proteína. El tamaño hidrodinámico de un dominio variable único de anticuerpo conjugado con PEG (incluidos los multímeros de dominios variables únicos de anticuerpo descritos en este documento) puede encontrarse dentro del intervalo de 200 a 500 kDa; 250 a 500 kDa; 300 a 500 kDa; 350 a 500 kDa; 400 a 500 kDa; 450 a 500 kDa. Preferentemente, el tamaño hidrodinámico de un dAb PEGilado según la invención es de 200 a 300 kDa.
El tamaño hidrodinámico de los monómeros y multímeros de dAb conjugados con PEG se puede determinar usando métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar filtración sobre gel para determinar el tamaño hidrodinámico de un monómero o multímero de dAb conjugado y no conjugado con PEG, donde el tamaño de la banda de dAb en el gel se compara con un estándar de peso molecular. Otros métodos para la determinación del tamaño hidrodinámico incluyen, pero sin limitaciones, columnas de cromatografía por exclusión de tamaño SDS-PAGE tales como, por ejemplo, Superose 12 HR (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.). Otros métodos para determinar el tamaño hidrodinámico de un monómero o multímero de dAb conjugado o no conjugado con PEG según la invención serán fácilmente apreciados por el experto en la técnica. En una realización, el tamaño hidrodinámico de polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con PEG u otros polímeros, según la invención, se puede determinar usando matrices de filtración sobre gel. Las matrices de filtración sobre gel usadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de diferentes polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo conjugados con PEG puede basarse en agarosa altamente reticulada. Por ejemplo, el intervalo de fraccionamiento de las dos columnas para proteínas globulares puede ser: Superose 12 HR 1000-3x105 Mr y Superose 6 HR 5000-5x106 Mr. Los límites de exclusión de tamaño de la proteína globular son \sim2x06 para Superose 12 HR y \sim4x107 Mr para Superose 6 HR.
De este modo, el tamaño de la molécula de polímero unida a un dAb o multímero de dAb según la invención se puede modificar en función de la aplicación deseada. Por ejemplo, cuando el dAb PEGilado está previsto que abandone la circulación y entre en tejidos periféricos, es deseable mantener bajo el tamaño del polímero conjugado para facilitar la extravasación desde el torrente sanguíneo. Alternativamente, cuando se desee que el dAb PEGilado permanezca en la circulación durante un período mayor de tiempo, se puede usar un polímero de peso molecular más alto (por ejemplo, un polímero de 30 a 60 kDa).
Las moléculas de polímero (PEG) útiles en la invención se pueden unir a los polipéptidos de dAb (multímeros polipeptídicos) empleando métodos bien conocidos en la práctica. El primer paso en la unión de PEG u otro resto polímero a un monómero o multímero de dAb según la invención es la sustitución de los grupos hidroxilo terminales del polímero PEG por grupos funcionales que contienen electrófilos. En particular, los polímeros PEG se unen a residuos cisteína o lisina presentes en los monómeros o multímeros de dAb según la invención. Los residuos cisteína y lisina pueden ser de origen natural, o pueden haber sido introducidos por ingeniería en la molécula de dAb. Por ejemplo, se pueden tratar los residuos de cisteína con ingeniería recombinante en el extremo C-terminal de los polipéptidos de dAb, o se pueden sustituir con cisteína o lisina residuos situados en localizaciones específicas, accesibles al disolvente, en el dAb. En una realización preferida, se une un resto PEG a un residuo cisteína o lisina que es de origen natural o ha sido insertado por ingeniería en el extremo N-terminal del polipéptido de dominio variable único de anticuerpo según la invención. En una realización todavía adicional, se une un resto PEG a un dominio variable único de anticuerpo según la invención en un residuo cisteína o lisina (tanto de origen natural como artificial) que está a una distancia de al menos dos residuos de (por ejemplo, hacia el interior del) extremo C y/o N-terminal del polipéptido de dominio variable único de anticuerpo.
En una realización, el o los polímeros PEG están unidos a uno o más residuos cisteína o lisina presentes en una región marco (FWs) y una o más CDRs de dominio variable único de anticuerpo. CDRs y regiones marco son aquellas regiones de un dominio variable único de anticuerpo según se ha definido en la base de datos de Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Ministerio de Sanidad y Servicios Humanos de EE.UU.). En una realización preferida, un polímero PEG está unido a un residuo cisteína o lisina en el segmento marco V_{H} DP47, o del segmento marco V_{\kappa} DPK9. Los residuos cisteína y/o lisina de DP47 que pueden unirse con PEG según la invención incluyen la cisteína en posiciones 22 ó 96, y la lisina en posiciones 43, 65, 76 ó 98 de SEC. ID Nº: 2 (Figura 13). Los residuos cisteína y/o lisina de DPK9 que pueden unirse con PEG según la invención incluyen los residuos cisteína en posiciones 23 u 88, y los residuos lisina en posiciones 39, 42, 45, 103 ó 107 de SEC. ID Nº: 4 (Figura 14). Además, residuos cisteína o lisina específicos pueden estar unidos a PEG en la región marco canónica V_{L} DP38, o DP45.
Adicionalmente, sitios específicos accesibles al disolvente de la molécula dAb, en los que no hay residuos cisteína o lisina de origen natural, se pueden mutar en cisteína o lisina para unirlos a un polímero PEG. Los residuos accesibles al disolvente en cualquier monómero o multímero de dAb dado se pueden determinar usando métodos conocidos en la técnica tales como análisis de la estructura cristalina de un dAb determinado. Por ejemplo, empleando la estructura cristalina disuelta del dAb de V_{H} HEL4 (SEC. ID Nº: 5), se han identificado los residuos Gln-13, Pro-14, Gly-15, Pro-41, Gly-42, Lys-43, Asp-62, Lys-65, Arg-87, Ala-88, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119 y Ser-120 como accesibles al disolvente y, de acuerdo con la presente invención, serían candidatos apropiados para la mutación en residuos cisteína o lisina para la unión de un polímero PEG. Adicionalmente, usando la estructura cristalina disuelta del dAb "dummy" de V_{\kappa} (SEC. ID Nº: 6), se han identificado los residuos Val-15, Pro-40, Gly-41, Ser-56, Gly-57, Ser-60, Pro-80, Glu-81, Gln-100, Lys-107 y Arg-108 como accesibles al disolvente y, según la presente invención, serían candidatos apropiados para la mutación en residuos cisteína o lisina para la unión de un polímero PEG. Preferentemente, se fija un resto PEG a un residuo cisteína o lisina que está sustituido en una o más de las posiciones Gln-13, Pro-41 o Leu-115, o residuos que tengan accesibilidad similar al disolvente en otros polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo según la invención. En una realización de la invención, se une un polímero PEG a múltiples residuos cisteína o lisina accesibles al disolvente, o a residuos accesibles al disolvente que han sido mutados en un residuo cisteína o lisina. De forma alternativa, solamente un residuo accesible al disolvente está unido a PEG, ya sea cuando el dAb particular posea sólo una cisteína o lisina accesible al disolvente (o residuo modificado en cisteína o lisina), o cuando se selecciona un residuo accesible al disolvente en particular, de entre diversos residuos de este tipo para la PEGilación.
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Secuencia de aminoácidos primaria de HEL4 (SEC. ID Nº: 3)
100 
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Secuencia de aminoácidos primaria del "dummy" de V_{\kappa} (SEC. ID Nº: 4)
101 
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La Compañía Nektar (San Carlos, CA) ofrece diversos esquemas de conjugación que son de utilidad en la invención. Por ejemplo, cuando se desea la unión de PEG u otro polímero a un residuo lisina, se pueden utilizar ésteres activos de polímeros PEG que han sido derivatizados con N-hidroxil-succinimida, tales como propionato de succinimidilo. Cuando está prevista la unión a un residuo cisteína, se pueden utilizar polímeros PEG que han sido derivatizados con reactivos selectivos para sulfhidrilo tales como maleimida, vinil-sulfona o tioles. Otros ejemplos de realizaciones específicas de derivados de PEG que se pueden usar según la invención para generar dAbs PEGilados se pueden encontrar en el Catálogo de Nektar (disponible en su página web nektar.com). Adicionalmente, se pueden utilizar varias formas derivatizadas de PEG según la invención para facilitar la unión del polímero PEG a un monómero o multímero de dAb según la invención. Los derivados de PEG útiles en la invención incluyen, pero sin limitaciones, PEG-succinato de succinimidilo, PEG conjugado con uretano, carbonato de PEG-fenilo, carbonato de PEG-succinimidilo, azida de PEG-carboximetilo, anhídrido dimetil-maleico PEG, derivados de ditiocarbonato de PEG, tresilatos de PEG (2,2,2-trifluoro-etanosulfonatos), imidoésteres de mPEG, y otros, según se describen en Zalipsky y Lee (1992) ("Use of functionalized poly(ethylen glycol)s for modification of peptides", en Poly(Ethylen Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed. Plenum Press, NY).
Las Figuras 6-11 muestran diferentes realizaciones del dAb y multímeros de dAb PEGilados de la invención. En cada una de las figuras, "X" representa la modificación química de un aminoácido en un dAb con un PEG activado químicamente, por ejemplo, PEG-NHS, SPA, MAL, VS, tiol, etc. El aminoácido modificado puede ser cualquier residuo en el dAb, pero es preferentemente una cisteína o lisina y, más preferentemente, es un residuo accesible al disolvente. "PEG" como se usa en las figuras representa un PEG lineal, ramificado, bifurcado y/o multi-brazos. "S" representa el aminoácido cisteína.
La Figura 7 muestra diversos formados de dAb dimerizados, en los que el dímero está formado por un enlace disulfuro entre residuos cisteína internos de la estructura del dAb, o que están presentes en el extremo C-terminal del dAb. En una realización, el residuo cisteína C-terminal está presente en la región bisagra. Los dímeros dAb pueden estar PEGilados en sitios interiores (véase la Figura 7-5) en uno o ambos monómeros dAb. Alternativamente, los dímeros dAb pueden estar formados por la unión de polímeros PEG ramificados, bifurcados o multi-brazos enlazados con cisteínas C-terminales en cada monómero dAb (Figura 7-7), o unidos a residuos aminoácidos interiores de cada monómero dAb (Figura 7-11).
La Figura 8 muestra diversas realizaciones de homo- o heterodímeros dAb en las que los monómeros dAb están unidos para formar un dímero por medio de un péptido de enlace tal como un enlazador (Gly_{4}Ser)_{n}, donde n = 1 a aproximadamente 10. Una vez que los monómeros dAb están unidos para formar dímeros, se pueden conjugar polímero(s) PEG derivatizado(s) de manera aleatoria con los dímeros, ya sea en residuos cisteína o lisina, o se les puede dianizar específicamente a residuos cisteína en el extremo C-terminal, o a residuos internos de uno o ambos monómeros dAb, utilizando cualquiera de los restos enlazadores de PEG descritos en este documento (por ejemplo, MAL, NHS, SPA, VS, o tiol). De manera alternativa, el polímero PEG se puede unir a residuos reactivos con tiol presentes en el péptido de enlace que se emplea para unir los monómeros dAb (Figura 8-15). Además, tal como muestra la Figura 8-17, dos o más dímeros dAb, cada uno de ellos formados usando péptidos de enlace, se pueden acoplar a través de enlaces disulfuro C-terminales. La Figura 9 muestra específicamente varias realizaciones de unión de PEG a residuos cisteína específicos, que están presentes en sitios internos, en el péptido de enlace, o en el extremo C-terminal de uno o ambos monómeros dAb.
Como se puede ver en la Figura 10, se pueden formar dAbs homo- o heterotriméricos mediante la unión de tres monómeros dAb entre sí, ya sea usando una serie de péptidos de enlace (por ejemplo, un enlazador Gly Ser; Figura 10-25, 26 ó 27), o usando un polímero PEG multi-brazos (Figura 10-23, 24), de modo que cada polímero PEG del polímero multi-brazos se una (a través de un residuo cisteína, lisina u otro residuo accesible al disolvente) con el extremo C-terminal de cada uno de los monómeros dAb. Cuando los monómeros dAb están unidos entre sí por medio de un péptido de enlace, los polímeros PEG pueden estar unidos al dAb trimérico en una cisteína C-terminal o, como se ha descrito más arriba, puede estar unido a través de restos MAL, NETS, SPA, VS o tiol a cualquiera de los residuos accesibles al disolvente en uno, dos o en los tres monómeros dAb. La Figura 10-27 muestra una realización según la invención que comprende un trímero dAb con doble especificidad. En esta realización, uno o más (pero no todos) de los monómeros dAb tiene especificidad de unión por un antígeno diferente del de los restantes monómeros dAb. Los monómeros dAb en esta realización de doble especificidad pueden estar unidos a través de un péptido de enlace, como se muestra en la Figura 10-27, o alternativamente pueden estar unidos a través de un PEG ramificado o multi-brazos en el que cada monómero del trímero está fijado a un resto PEG. Cuando los monómeros del trímero de doble especificidad que se muestra en la Figura 10-27 se unen entre sí por medio de un péptido de enlace, el trímero puede estar unido a uno o más polímeros PEG por cualquiera de los mecanismos descritos anteriormente. Es decir, el PEG puede estar unido a un residuo cisteína o lisina en uno o más de los monómeros, o presente en el extremo C-terminal de uno o más de los monómeros o, también, insertados por ingeniería en uno o más de los monómeros dAb que componen el trímero. En cualquiera de los dAbs monoméricos, diméricos o triméricos descritos más arriba, y que se muestran en las Figuras 6 a 11, un polímero PEG puede estar unido a un residuo cisteína o lisina existente, o puede estarlo a un residuo cisteína o lisina que ha sido introducido por ingeniería en uno o más de los monómeros dAb.
La Figura 11 muestra diversas realizaciones para la PEGilación de un hetero- u homotetrámero dAb. Los monómeros dAb pueden estar unidos a través de uno o múltiples péptidos de enlace (Figura 11-29) o, alternativamente, pueden estar unidos para formar un tetrámero usando un polímero PEG multi-brazos o ramificado (Figura 11-28, 30). De manera alternativa, dos o más dímeros dAb, formados por la unión de dos monómeros con un péptido de enlace, se pueden unir subsiguientemente entre sí para formar un tetrámero mediante un polímero PEG ramificado o multi-brazos (Figura 11-29, 31), donde el polímero PEG está unido a un residuo lisina o cisteína presente en el monómero dAb, en el extremo C-terminal del monómero dAb (Figura 11-29). Tal como se ha descrito anteriormente para monómeros, dímeros y trímeros dAb, uno o más polímeros PEG pueden estar unidos a cualquier posición marco deseada en un tetrámero dAb según la invención. Por ejemplo, un polímero PEG puede estar unido con una cisteína C-terminal, u otro residuo, o también puede estar unido a cualquier residuo cisteína o lisina presente o insertado por ingeniería en los monómeros dAb que forman el tetrámero.
La Figura 12 muestra ejemplos de multímeros dAb de orden superior, conjugados con PEG, que se pueden generar según la presente invención. Por ejemplo, una pluralidad de dímeros dAb, unidos entre sí por un péptido de enlace (como se muestra en la Figura 12-31) o, alternativamente, unidos mediante enlaces disulfuro entre los monómeros de cada dímero, está unida para formar un tetrámero de dímeros mediante un polímero PEG multi-brazos, donde cada PEG del polímero PEG multi-brazos está unido a un residuo cisteína C-terminal presente en uno de los monómeros de cada par de dímeros. Los medios para la formación de dímeros, trímeros y tetrámeros (por ejemplo, usando péptidos de enlace o enlaces disulfuro), así como la localización y medios para la conjugación de PEG como se han descrito anteriormente, pueden variar según la invención para generar grandes multímeros dAb conjugados con PEG, tales como octámeros, decámeros, etc. Por ejemplo, de manera similar a la estrategia que se muestra en la Figura 12 para generar grandes multímeros dAb conjugados con PEG, los trímeros o tetrámeros de dAbs pueden estar unidos entre sí mediante, por ejemplo, un PEG multi-brazos, un péptido de enlace o enlaces disulfuro, para generar un multímero dAb grande unido con PEG. Cuando una pluralidad de dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. de dAb está unida entre sí por medio de péptidos de enlace o enlaces disulfuro (por ejemplo, en lugar de usar un PEG multi-brazos, como se muestra en la Figura 12), los polímeros PEG pueden estar unidos, entonces, al multímero resultante por cualquiera de los medios descritos más arriba. Por ejemplo, el polímero PEG puede estar unido a un residuo cisteína o lisina en la superficie de uno o más de los monómeros dAb que componen el multímero, el polímero PEG puede estar unido a una cisteína C-terminal presente en uno o más de los monómeros dAb que forman el multímero.
En cada una de las realizaciones anteriores, los polímeros PEG pueden estar unidos a cualquier residuo marco adecuado presente en los péptidos dAb o, preferentemente, uno o más residuos del dAb puede ser modificado o mutado en un residuo cisteína o lisina que, a continuación, se puede usar como punto de unión para el polímero PEG. Preferentemente, un residuo que se modifica de esta manera es un residuo accesible al disolvente; es decir, un residuo que cuando el dAb se encuentra en su configuración plegada natural, es accesible a un entorno acuoso y a un polímero PEG derivatizado. Una vez que uno o más de estos residuos ha mutado a un residuo cisteína según la invención, está disponible para la unión con PEG usando un PEG derivatizado con MAL lineal o ramificado (MAL-PEG).
En una realización, la invención proporciona un polipéptido según se define en la reivindicación 1, en forma de un dominio variable único de anticuerpo conjugado con un polímero PEG, en el que la relación de polímero PEG a dominio variable único de anticuerpo es una relación molar de al menos 0,25:1. En una realización adicional, la relación molar de polímero PEG a dominio variable único de anticuerpo es de 0,33:1 o mayor. En todavía otra realización, la relación molar de polímero PEG a dominio variable único de anticuerpo es de 0,5:1 o mayor.
Aumento de la Semivida
Los monómeros y multímeros dAb PEGilados según la invención ofrecen una clara ventaja con respecto a las moléculas de dAb descritas en la técnica, en el sentido de que las moléculas dAb PEGiladas según la invención tienen una semivida marcadamente aumentada. Sin atenerse a ninguna teoría en particular, se cree que el aumento de la semivida de las moléculas dAb según la invención obedece al incremento del tamaño hidrodinámico del dAb resultante de la unión de polímero(s) PEG. Más específicamente, se cree que dos parámetros juegan un papel importante en la determinación de la semivida en suero de los dAbs y multímeros dAb PEGilados. El primer criterio es la naturaleza y tamaño de la unión de PEG, es decir, si el polímero usado es simplemente una cadena lineal o una cadena ramificada/bifurcada, donde la cadena ramificada/bifurcada da origen a una semivida más larga. El segundo criterio es la localización del dAb en el formato final y el número de brazos "libres" y no modificados de PEG que exhibe la molécula. El tamaño hidrodinámico resultante del dAb PEGilado determinado, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño, refleja la semivida sérica de la molécula. En consecuencia, cuanto mayor es el tamaño hidrodinámico de la molécula PEGilada, más larga es la semivida en suero.
El aumento de la semivida es útil en las aplicaciones in vivo de las inmunoglobulinas, en especial de los anticuerpos y, de forma muy especial, en los fragmentos de anticuerpo de pequeño tamaño. Estos fragmentos (Fvs, Fabs, scFvs, dAbs) experimentan un rápido aclaramiento del organismo; así, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las regiones del organismo rápidamente, son rápidos de producir y más fáciles de manipular, sus aplicaciones in vivo han estado limitadas por su breve persistencia in vivo.
En un aspecto, un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo según se describe en este documento se estabiliza in vivo por la fusión con un resto, tal como PEG, que aumenta el tamaño hidrodinámico del polipéptido dAb. Los expertos en la técnica están familiarizados con los métodos de análisis farmacocinético y determinación de la semivida de dAb. Es posible encontrar información detallada en Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y en Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Se hace referencia, igualmente, a "Pharmacokinetics", de M. Gibaldi y D. Perron, publicado por Marcel Dekker, 2ª Rev., ex edición (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como semividas t-alfa y t-beta y el área bajo la curva (AUC).
Típicamente, la semivida de un monómero o multímero dAb PEGilado según la invención aumenta en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más en relación con un dAb no PEGilado (en donde el dAb del dAb PEGilado y del dAb no PEGilado son idénticos). Son posibles incrementos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 7x, 10x, 20x, 30x, 40 x y de hasta 50x o más de la semivida. Alternativa o adicionalmente, son posibles incrementos dentro del intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la semivida.
Las semividas (t1/2 alfa y t1/2 beta) y la AUC se pueden determinar a partir de una curva de concentración sérica de ligando frente al tiempo. El paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, EE.UU.) se puede utilizar, por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa), el ligando está sometido principalmente a distribución en el paciente, con una cierta eliminación. Una segunda fase (la fase beta) es la fase terminal, cuando el ligando ha sido distribuido y la concentración sérica está descendiendo a medida que el paciente elimina el ligando. La semivida t\alpha es la semivida de la primera fase, y la semivida t\beta es la semivida de la segunda fase. "Semivida", como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, se refiere a la semivida global de un dominio variable único de anticuerpo según la invención, determinada por modelamiento no compartimental (en contraste, por ejemplo, con el modelamiento bifásico). La semivida t\beta es una medición del tiempo que tarda el mamífero en eliminar la cantidad de monómero o multímero dAb que le ha sido administrada. Así, de manera conveniente, la presente invención ofrece una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de dAb-grupo efector, con una semivida t\alpha dentro del intervalo de 0,25 horas a 6 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es de 30 min, 45 min, 1 hora, 1,3 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Adicional o alternativamente, una composición que contenga dAb tendrá una semivida t\alpha dentro del intervalo de hasta, e incluidas, 12 horas. En una realización, el límite superior del intervalo es de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de intervalo adecuado es de 1,3 a 6 horas, 2 a 5 horas o
3 a 4 horas.
De forma conveniente, la presente invención proporciona una composición que contiene dAb que comprende un ligando según la invención, dotado de una semivida t\beta dentro del intervalo de 1-170 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es de 2,5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Adicional o alternativamente, una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de dAb-grupo efector, tiene una semivida t\beta dentro del intervalo de hasta, e incluidos, 21 días. En una realización, el límite superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. De manera conveniente, una composición que contenga dAb según la invención tendrá una semivida t\beta en el intervalo de 2-100 horas, 4-80 horas y 10-40 horas. En una realización adicional, estará dentro del intervalo de 12-48 horas. En todavía otra realización adicional, estará dentro del intervalo de 12-26 horas. La presente invención ofrece una composición que contiene dAb que comprende un ligando según la invención, con una semivida dentro del intervalo de 1-170 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es de 1,3 horas, 2,5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Adicional o alternativamente, una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de dAb-grupo efector, tiene una semivida dentro del intervalo de hasta, e incluidos, 21 días. En una
realización, el límite superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días.
Adicional o alternativamente a los criterios citados, la presente invención proporciona una composición que contiene dAb que comprende un ligando según la invención, según se define en la reivindicación 1, con un valor de AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es de 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg.min/ml. Adicional o alternativamente, el ligando o composición según la invención tiene una AUC dentro del intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una realización, el límite superior del intervalo es de 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg.min/ml. De manera ventajosa, un ligando según la invención tendrá una AUC dentro del intervalo seleccionado del grupo consistente en lo siguiente: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml, y 15 a 50 mg.min/ml.
Aumento de la Estabilidad ante la Proteasa
Una ventaja adicional de la presente invención es que los dAbs y multímeros dAb5 PEGilados descritos en este documento poseen una estabilidad aumentada ante la acción de las proteasas. En presencia de pepsina, sin embargo, muchos dAbs resultan totalmente degradados a pH 2, porque la proteína se despliega bajo las condiciones ácidas, haciendo así la proteína más accesible a la enzima proteasa. La presente invención ofrece moléculas de dAb PEGiladas, incluidos multímeros de dAb, en los que se cree que el polímero PEG ofrece protección de la estructura central polipeptídica debido a la cobertura física de la misma con el polímero PEG, previniendo de este modo que la proteasa pueda acceder a la estructura central del polipéptido y la escinda. En una realización preferida, se genera un dAb PEGilado dotado de un tamaño hidrodinámico más elevado (por ejemplo, 200 a 500 kDa), según la invención, porque el mayor tamaño hidrodinámico confirmará un nivel mayor de protección contra la degradación por proteasas que un dAb PEGilado con un tamaño hidrodinámico menor. En una realización, un monómero o multímero de dominios variables únicos de anticuerpo conjugado con PEG u otro polímero resulta degradado en no más de 10% cuando es expuesto a una o más de las proteasas pepsina, tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxi-peptidasa, donde si la proteasa es pepsina, entonces la exposición se lleva a cabo a pH 2,0 durante 30 minutos, y si la proteasa es una o más de tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa, entonces la exposición se efectúa a pH 8,0 durante 30 minutos. En una realización preferida, un monómero o multímero dAb conjugado con PEG u otro polímero no se degrada en más de 10% cuando se le expone a pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos, preferentemente en no más de 5% y, preferentemente, no se degrada en absoluto. En una realización adicional preferida, un multímero dAb (por ejemplo, hetero- u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) conjugado con PEG u otro polímero según la invención se degrada en menos de 5% y, preferentemente, no se degrada en absoluto en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos. En una realización preferida, un monómero o multímero dAb conjugado con PEG u otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se le expone a tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos, preferentemente no lo hace en más de 5% y, preferentemente, no se degrada en absoluto. En una realización adicional preferida, un multímero dAb (por ejemplo, hetero- u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) conjugado con PEG u otro polímero según la invención se degrada en menos de 5% y, preferentemente, no se degrada en absoluto en presencia de tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos.
Las relaciones relativas de proteasa: polipéptido de dominio variable único de anticuerpo se pueden alterar de acuerdo con la invención, para proporcionar el nivel deseado de degradación, según se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la relación de proteasa a dominio variable único de anticuerpo puede ser de aproximadamente 1:30 hasta aproximadamente 10:40, hasta aproximadamente 20:50, hasta aproximadamente 30:50, aproximadamente 40:50, aproximadamente 50:50, aproximadamente 50:40, aproximadamente 50:30, aproximadamente 50:20, aproximadamente 50:10, aproximadamente 40:1 y aproximadamente 30:1.
La degradación de monómeros y multímeros dAb según la invención se puede medir con métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, tras la incubación de un dAb conjugado con PEG con pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos, o con tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos, las muestras de dAb se pueden analizar por filtración sobre gel, donde la degradación del monómero o multímero dAb se pone de manifiesto por una banda de gel de menor peso molecular que un dAb no degradado (es decir, dAb de control no tratado con pepsina, tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa). El peso molecular de las bandas de dAb en el gel se puede determinar comparando la migración de la banda con la migración de una escala de peso molecular (véase la Figura 5). En la técnica, se conocen otros métodos para medir la degradación de proteínas, y se les puede adaptar para evaluar los monómeros y multímeros dAb conjugados con PEG según la invención.
Usos de los Polipéptidos de Dominio Variable Único de Inmunoglobulina
Los polipéptidos de dominios variables únicos de anticuerpo PEGilados descritos en este documento son útiles en una variedad de aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y profilácticas in vivo e in vitro. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden incorporar en inmunoensayos (por ejemplo, ELISA, RIA, etc.) para la detección de sus antígenos diana en muestras biológicas. Los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina pueden ser utilizados también, por ejemplo, en aplicaciones de transferencia de Western y en métodos de cromatografía de afinidad. Estás técnicas son bien conocidas por el experto.
Un campo de uso muy importante de los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina es el tratamiento o la profilaxis de enfermedades o trastornos relacionados con el antígeno diana.
Básicamente, cualquier enfermedad o trastorno que sea candidato al tratamiento o a la profilaxis con una preparación de anticuerpo es susceptible de tratamiento o profilaxis con un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina según se describe en este documento. La elevada afinidad de fijación, el origen humano de las secuencias, el pequeño tamaño y la alta solubilidad de los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina descritos en este documento los hace superiores a, por ejemplo, los anticuerpos de longitud completa o, incluso, por ejemplo, al scFv para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad humana.
Entre las enfermedades o trastornos que se pueden tratar o prevenir usando los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina descritos en este documento se encuentran, por ejemplo, la inflamación, sepsis (incluido, por ejemplo, el choque séptico, choque endotóxico, sepsis Gram-negativa y el síndrome de choque tóxico), hipersensibilidad alérgica, cáncer u otros trastornos hiperproliferativos, trastornos autoinmunes (incluidos, por ejemplo, diabetes, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso, miastenia grave, escleroderma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Graves, síndrome de Sjögren, insuficiencia poliendocrina, vitíligo, neuropatía periférica, enfermedad injerto contra huésped, síndrome poliglandular autoinmune de tipo 1, glomerulonefritis aguda, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo idiopático de instauración adulta (AOIH), alopecia total, esclerosis lateral amiotrófica, espondilitis anquilosante, anemia aplástica autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, hepatitis activa crónica, síndrome CREST, dermatomiositis, cardiomiopatía dilatada, síndrome de eosinofilia-mialgia, epidermólisis ampollosa adquirida (EBA), arteritis de células gigantes, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barré, hemocromatosis, púrpura de Schönlein-Henoch, nefropatía por IgA idiopática, diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM), artritis reumatoide juvenil, síndrome de Lambert-Eaton, dermatosis IgA lineal, miocarditis, narcolepsia, vasculitis necrotizante, síndrome de lupus neonatal (NLE), síndrome nefrótico, penfigoide, pénfigo, polimiositis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, glomerulonefritis de progreso rápido (RPGN), síndrome de Reiter, síndrome del hombre rígido y tiroiditis), efectos de enfermedades infecciosas (por ejemplo, por inflamación limitante, daño tisular mediado por caquexia o citoquinas), rechazo de trasplante y enfermedad injerto contra huésped, trastornos pulmonares (por ejemplo, síndrome de distrés respiratorio, choque pulmonar, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis pulmonar y silicosis), trastornos cardiacos (por ejemplo, isquemia cardiaca, insuficiencia cardiaca), trastornos óseos inflamatorios y enfermedad de resorción ósea, hepatitis (incluida la hepatitis alcohólica y hepatitis vírica), alteraciones de la coagulación, lesión por reperfusión, formación de queloides, formación de tejido cicatricial y pirexia.
Los cánceres se pueden tratar, por ejemplo, dianizando una o más moléculas, por ejemplo, citoquinas o factores de crecimiento, receptores de la superficie celular o antígenos, o enzimas, necesarios para el crecimiento y/o la actividad metabólica del tumor o, por ejemplo, usando un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina específico para un antígeno específico del tumor o enriquecido en el tumor, para dianizar un agente citotóxico o inductor de apoptosis hacia las células tumorales. Otras enfermedades o trastornos, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunes, se pueden tratar de forma similar, dianizando uno o más mediadores de la patología con un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina neutralizante, según se describe en este documento. Muy frecuentemente, tales mediadores serán, por ejemplo, citoquinas endógenas (por ejemplo, TNF-\alpha) o sus receptores que median la inflamación u otros daños de los tejidos.
Composiciones Farmacéuticas, Dosificación y Administración
Los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina según la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para ser administradas a un sujeto.
Típicamente, la composición farmacéutica comprende un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo" incluye cualquier y todos los disolventes, medios dispersantes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, que son fisiológicamente compatibles. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" excluye los medios de cultivo tisular que comprenden suero bovino o equino. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes: agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o eficacia del polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina.
Las composiciones descritas en este documento pueden adoptar muy diversas formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas tales como soluciones (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o de infusión tales como las composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular).
Las composiciones farmacéuticas deben ser, típicamente, estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y conservación. La composición se puede formular como solución, microemulsión, dispersión, liposoma o cualquier otra estructura ordenada apta para una concentración elevada del fármaco. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida a un disolvente apropiado, con uno o una combinación de los ingredientes mencionados más arriba, según sea preciso, seguida de esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el o los otros ingredientes necesarios, seleccionados de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son los de secado al vacío y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Se puede mantener la fluidez apropiada de una solución, usando, por ejemplo, un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Los polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina descritos en este documento se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía / modo de administración preferido es la inyección o infusión intravenosa. El polipéptido se puede administrar también por inyección intramuscular o subcutánea. Los polipéptidos de dominios variables únicos de inmunoglobulina PEGilados según la invención se pueden administrar, adicional o alternativamente a lo anterior, mediante un mecanismo de liberación retardada. El mecanismo de liberación retardada puede incluir polímeros celulósicos adecuados conocidos por los expertos en la técnica y, además, pueden incluir bombas osmóticas que se pueden implantar en un mamífero individual y que liberarán el polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina lentamente en el tiempo. Las velocidades de liberación para las bombas osmóticas según la invención incluyen desde aproximadamente 0,5 ml durante un período de 6 semanas, hasta 0,1 ml durante un período de 2 semanas. Las velocidades de liberación son, preferentemente, de aproximadamente 0,2 ml durante un período de 4 semanas. El experto en la técnica entenderá que la velocidad de liberación específica se puede variar en función del resultado particular deseado, o del polipéptido de región variable PEGilado usado. Las preparaciones según la invención incluyen soluciones concentradas del dominio variable único de anticuerpo PEGilado (o multímero PEGilado), por ejemplo, soluciones de al menos 5 mg/ml (\sim417 \muM) en solución acuosa (por ejemplo, PBS) y, preferentemente, de al menos 10 mg/ml (\sim833 \muM), 20 mg/ml (\sim1,7 mM), 25 mg/ml (\sim2,1 mM), 30 mg/ml (\sim2,5 mM), 35 mg/ml (\sim2,9 mM), 40 mg/ml (\sim3,3 mM), 45 mg/ml (\sim3,75 mM), 50 mg/ml (\sim4,2 mM), 55 mg/ml (\sim4,6 mM), 60 mg/ml (\sim5,0 mM), 65 mg/ml (\sim5,4 mM), 70 mg/ml (\sim5,8 mM), 75 mg/ml (\sim6,3 mM), 100 mg/ml (\sim8,33 mM), 150 mg/ml (\sim12,5 mM), 200 mg/ml (\sim16,7 mM), o mayores. En algunas realizaciones, las preparaciones pueden ser de, por ejemplo, 250 mg/ml (\sim20,8 mM), 300 mg/ml (\sim25 mM), 350 mg/ml (29,2 mM) o, incluso, mayores, pero diluidas a 200 mg/ml o menos antes de su uso.
Como podrá apreciar el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que proteja el compuesto contra una liberación rápida, tal como en una formulación de liberación controlada, incluidos los implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Los dominios variables únicos de inmunoglobulina son aptos para formulaciones en preparaciones de liberación extendida, debido, en parte, a su reducido tamaño - el número de moles por dosis puede ser significativamente mayor que la dosificación de, por ejemplo, anticuerpos de tamaño total. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilen-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede alcanzar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Se han patentado o los expertos en la técnica conocen, en general, muchos métodos para la preparación de estas formulaciones. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Se describen métodos adicionales aplicables a la liberación controlada o extendida de agentes polipeptídicos tales como los polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina descritos en este documento, por ejemplo, en la patentes de EE.UU. Nos. 6.306.406 y 6.346.274, así como, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de EE.UU. Nos. US20020182254 y US200200511808, todas las cuales se incorporan por referencia a este documento.
En ciertas realizaciones, se puede administrar un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina por vía oral, por ejemplo, con un disolvente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) puede estar incluido en una cápsula de gelatina dura o blanda, comprimido para formar un comprimido, o estar directamente incorporado a la dieta del individuo. Para la administración terapéutica oral, el compuesto se puede incorporar con excipientes, y ser usado en forma de comprimidos, comprimidos bucales, sellos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares que se administran por vía oral. Para administrar el compuesto según la invención de una forma diferente de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrarlo junto con un material que prevenga su inactivación.
La invención podría ser de utilidad en un método para suministrar el polipéptido, agente o antígeno terapéutico a través de una barrera natural, uniéndolo de forma covalente con una construcción polipeptídica que comprende al menos un anticuerpo de un único dominio dirigido contra un receptor celular internalizador, donde dicha construcción se internaliza tras la fijación a dicho receptor. Una barrera natural incluye, sin estar limitada a ellas, las barreras hemato-encefálica, hemato-pulmonar, hemato-intestinal, hemato-vaginal, hemato-rectal y hemato-nasal. Por ejemplo, una construcción peptídica suministrada a través de las vías respiratorias superiores y el pulmón se puede usar para transportar polipéptidos o agentes terapéuticos desde la luz pulmonar a la sangre. La construcción se fija específicamente a un receptor presente en la superficie mucosa (células epiteliales del bronquio), lo que da como resultado el transporte, a través de la internalización celular, de los polipéptidos o agentes terapéuticos específicos para dianas del torrente circulatorio desde la luz pulmonar a la sangre. En otro ejemplo, se une un polipéptido o agente terapéutico con una construcción polipeptídica que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra un receptor celular de internalización presente en la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo. Dicha construcción induce una transferencia a través de la pared, y mediante internalización celular, de dicho polipéptido o agente terapéutico.
En la técnica se conocen métodos para el suministro y administración de compuestos tales como los dominios variables únicos de anticuerpo de la presente invención, y se les puede encontrar, por ejemplo, en las descripciones del documento WO 04/041867, cuyo contenido se incorpora en su totalidad a este documento.
La presente invención podría ser de utilidad también en un método para determinar qué polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo (por ejemplo, dAbs; VHH) cruzan una barrera natural hacia el torrente sanguíneo tras la administración, usando, por ejemplo, las vías oral, nasal, pulmonar o cutánea. En un ejemplo, el método comprende administrar una biblioteca de fagos de dominios variables únicos de anticuerpo virgen, sintético o inmune a un animal pequeña tal como un ratón. En diferentes momentos después de la administración, se extrae sangre para rescatar los fagos que han sido transferidos de forma activa al torrente sanguíneo. Adicionalmente, después de la administración, se pueden aislar órganos y retirar los fagos fijados. Un ejemplo de receptor para el transporte activo desde la luz pulmonar hacia el torrente sanguíneo es el receptor Fc N (FcRn). El método identifica, de este modo, anticuerpos de dominio único que no sólo son transportados activamente a la sangre, sino que son capaces también de dianizar órganos específicos. El método puede identificar qué polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo son transportados a través del intestino y hacia la sangre; a través de la lengua (o bajo ella) y hacia la sangre; a través de la piel y hacia la sangre, etc. Los métodos para determinar que polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo pueden ser los más apropiados para la administración en una formulación farmacéutica según la invención se describen en el documento WO 04/041867, cuyo contenido se incorpora en su totalidad a este documento.
En las composiciones se pueden incorporar también compuestos activos adicionales. En ciertas realizaciones, se co-formula un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina con y/o se co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, se puede co-formular un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina y/o co-administrarlo con uno o múltiples anticuerpos adicionales, que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que fijan otras citoquinas, o que se unen a moléculas de la superficie de la célula), o, por ejemplo, una o más citoquinas. Estas terapias de combinación pueden utilizar bajas dosificaciones de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad profilácticamente efectiva" de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, así como la capacidad del polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción del anticuerpo queda superado por los efectos beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que la dosis profiláctica se usa en los sujetos antes de o en una fase precoz de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosificación se puede ajustar para obtener la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, según lo indiquen los requisitos de la situación terapéutica. Resulta conveniente formulas las composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para facilitar la administración y unificar la dosificación. La forma de dosificación unitaria se refiere, en este documento, a unidades físicas discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto mamífero a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
Un intervalo no limitante para la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina es de 0,1-20 mg/kg. Se debe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se debe aliviar. Adicionalmente, debe entenderse que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar durante el tiempo, en función de las necesidades del individuo y el juicio profesional del médico responsable de la administración.
El médico experto evalúa la eficacia del tratamiento con un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina según la presente descripción, basándose en la mejoría de uno o múltiples síntomas o indicadores del estado patológico o trastorno tratado. La mejoría en al menos 10% (aumento o disminución, dependiendo del indicador medido) en uno o más indicadores clínicos se considera "tratamiento eficaz", aun cuando se prefieren mejorías mayores tales como de 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90% o, incluso, de 100% o, dependiendo del indicador medido, de más de 100% (por ejemplo, dos veces, tres veces, diez veces hasta obtener un estado libre de enfermedad). Los indicadores pueden ser mediciones físicas, por ejemplo, niveles de enzima, citoquina, factor de crecimiento o metabolitos, ritmo de crecimiento celular o lisis celular, o la presencia o cantidad de células anormales. También se pueden medir, por ejemplo, diferencias en el tiempo transcurrido entre brotes de síntomas de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, en el caso de enfermedades de remisión/recidiva tales como esclerosis múltiple). De manera alternativa, se pueden valorar mediciones no físicas tales como informes de reducción del dolor o de las molestias u otros indicadores del estado de la enfermedad para calibrar la eficacia del tratamiento. Cuando se realizan mediciones no físicas, se pueden usar diferentes escalas o índices aceptables en clínica como, por ejemplo, el Índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn o CDAI (Best et al, 1976, Gastroenterology 70: 439), que combina indicadores tanto físicos tales como hematocrito y número de deposiciones líquidas o heces muy blandas, entre otros, con factores comunicados por el paciente, tales como la intensidad del dolor o calambres abdominales y bienestar general para asignar una puntuación patológica.
Tal como se usa el término en este documento, la "profilaxis" realizada usando una composición como la descrita es "efectiva" si se retrasa o reduce en al menos 10%, o se elimina la aparición o gravedad de uno o más síntomas con respecto a dichos síntomas en un individuo similar (modelo humano o animal) no tratado con la composición.
Se pueden usar modelos animales aceptados de enfermedades humanas para evaluar la eficacia de un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina como los descritos en este documento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o trastorno. Ejemplos de tales modelos patológicos incluyen, por ejemplo: un modelo de cobaya para el asma alérgica, descrito por Savoie et al., 1995, Am. J. Respir. Cell Biol. 13: 133-143; un modelo animal de esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), que se puede inducir en una serie de especies, por ejemplo, la cobaya (Suckling et al., 1984, Lab. Anim. 18: 36-39), rata Lewis (Feurer et al., 1985, J. Neuroimmunol. 10: 159-166), conejos (Brenner et al., 1985, Isr. J. Med. Sci. 21: 945-949) y ratón (Zamvil et al., 1985, Nature 317: 355-358); modelos animales conocidos en la técnica para diabetes, incluidos modelos de diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM) y diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM) - los ejemplos incluyen el ratón diabético no obeso (NOD) (por ejemplo, Li et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11128-11132), la rata BB/DP (Okwueze et al., 1994, Am. J. Physiol. 266: R572-R577), la rata Wistar gorda (Jiao et al., 1991, Int. J. Obesity 15: 487-495), y la rata Zucker diabética gorda (Lee et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 10878-10882); modelos animales para la enfermedad prostática (Loweth et al., 1990, Vet. Pathol. 27: 347-353), modelos de aterosclerosis (numerosos modelos, incluidos los descritos por Chao et al., 1994, J. Lipid Res. 35: 71-83; Yoshida et al., 1990, Lab. Anim. Sci. 40: 486-489; y Hara et al., 1990, Jpn. J. Exp. Med. 60: 315-318); síndrome nefrótico (Ogura et al., 1989, Lab. Anim. 23: 169-174); tiroiditis autoinmune (Dietrich et al., 1989, Lab. Anim. 23: 345-352); hiperuricemia (Wu et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 742-746); gastritis (Engstrand et al., 1990, Infect. Immunity 58: 1763-1768); proteinuria/enfermedad glomerular del riñón (Hyun et al., 1991, Lab. Anim. Sci. 41: 442-446); alergia alimentaria (por ejemplo, Ernel et al., 1997, Lab. Anim. Sci. 47: 40-49; Knippels et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 368-375; Adel-Patient et al., 2000, J. Immunol. Meth. 235: 21-32; Kitagawa et al., 1995, Am. J. Med. Sci. 310: 183-187; Panush et al., 1990, J. Rheumatol. 17: 285-290); enfermedad reumatoide (Mauri et al., 1997, J. Immunol. 159: 5032-5041; Saegusa et al., 1997, J. Vet. Med. Sci. 59: 897-903; Takeshita et al., 1995, Arthritis Rheum. 38: 420-425); lupus (Walker et al., 1983, Vet. Immunol. Immunopathol. 15: 97-104; Walker et al., 1978, J. Lab. Clin. Med. 92: 932-943); y enfermedad de Crohn (Dielemann et al., 1997, Scand. J. Gastroenterol. Supp. 223: 99-104; Anthony et al., 1995, Int. J. Exp. Pathol. 76: 215-224; Osborne et al., 1993, Br. J. Surg. 80: 226-229). Los expertos en la técnica conocen otros modelos animales.
En tanto que los polipéptido de dominios variables únicos de inmunoglobulina descritos en este documento deben fijar un antígeno humano con alta afinidad, cuando se debe evaluar su efecto en un sistema de modelo animal, el polipéptido debe efectuar una reacción cruzada con uno más antígenos en el sistema de modelo animal, preferentemente con alta afinidad. El experto en la técnica podrá determinar fácilmente si se satisface esta condición para un sistema de modelo animal determinado y un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina determinado. Si se satisface esta condición, se puede examinar la eficacia del polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina administrándolo en un modelo animal bajo condiciones que simulan un estado patológico y controlando uno o más indicadores de dicho estado patológico para una mejoría de al menos 10%.
Ejemplos
Todas las patentes, solicitudes de patente y bibliografía publicada citadas en este documento se incorporan en su totalidad como referencia a este documento. Aunque la presente invención ha sido demostrada y descrita particularmente, haciendo referencia a realizaciones preferidas de la misma, el experto en la técnica entenderá que es posible realizar diversos cambios de forma y detalles en la misma, sin desviarse del alcance de la invención, comprendido por las reivindicaciones anexas.
Sumario
La PEGilación sitio-específica con maleimida de dAbs VH y VK requiere la existencia de una cisteína accesible al disolvente en la superficie de la proteína, en este ejemplo, en el extremo C-terminal. El residuo cisteína, una vez reducido para dar el tiol libre, se puede usar entonces para acoplar específicamente la proteína al dAb conjugado con maleimida o tiol-PEG. Hay disponible una extensa gama de PEGs modificados químicamente, de diferentes tamaños y formatos ramificados, en Nektar (formalmente conocida como Shearwater Corp.). Esto permite formatear el monómero básico de dAb-cys en una variedad de formas, por ejemplo, como un monómero, dímero, trímero, tetrámero, etc. PEGilado. El tamaño de los PEGs se expresa en kDa, pero también se puede indicar como K (es decir, "40K PEG" = PEG de 40 kDa).
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1.0 Ejemplo 1
PEGilación de un dAb VK TAR1-5-19 1.1 Construcción por PCR de TAR1-5-19 cys
Se usará TAR1-5-19 como ejemplo que comprende el procedimiento de inserción por ingeniería de una Cys C-terminal en un cLAb Vk (Figura 6-3). El sitio de unión para el PEG puede estar situado en cualquier punto de la superficie del dAb, con la condición de que el aminoácido dianizado sea accesible al disolvente y la proteína PEGilada resultante conserve su capacidad de fijación de antígeno. Por lo tanto, es posible insertar la Cys en cualquiera de las regiones marco 1-4 del dAb para la PEGilación y conservar aún cierta fijación de antígeno. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para llevar a cabo la PCR específica de TAR1-5-19 con sitios SalI y BamHI para la clonación y, también, para la introducción de un residuo cisteína C-terminal. La secuencia siguiente es la secuencia de ADN de TAR1-5-19 cys y de los cebadores de PCR usados para amplificar el dAb tratado por ingeniería.
13 
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Cebador directo (SEC. ID Nº: 10)
130
Cebador inverso (SEC. ID Nº: 11)
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La reacción de PCR (volumen de 50 \mul) se llevó a cabo de la forma siguiente: dNTP's 200 \muM, 0,4 \muM de cada cebador, 5 \mul de 10x tampón PfuTurbo (Stratagene), 100 ng de plásmido molde (TAR1-5-19), 1 \mul de enzima PfuTurbo (Stratagene), y ajuste del volumen a 50 \mul usando agua estéril. Se aplicaron las siguientes condiciones de PCR: etapa inicial de desnaturalización 94ºC durante 2 min, a continuación, 25 ciclos de 94ºC durante 30 seg, 64ºC durante 30 seg y 72ºC durante 30 seg. Se incluyó también una etapa final de extensión de 72ºC durante 5 min. El producto de la PCR se purificó y digirió con SalI y BamHI, y se ligó en el vector que había sido cortado también con las mismas enzimas de restricción. Los clones correctos se verificaron por secuenciación de ADN.
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1.2 Expresión y purificación de TAR1-5-19 cys
El vector TAR1-5-19 cys se transformó en células BL21 (DE3) pLysS químicamente competentes (Novagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se seleccionaron las células portadoras del plásmido dAb, usando 100 \mug/ml de carbenicilina y 37 \mug/ml de cloranfenicol. Los cultivos se establecieron en matraces "baffled" (dotados de lengüeta) de 2 l que contuvieron 500 ml de "terrific broth" (Sigma-Aldrich), 100 \mug/ml de carbenicilina y 37 \mug/ml de cloranfenicol. Los cultivos se efectuaron a 30ºC a 200 rpm hasta una D.O 600 de 1-1,5 y, entonces, se indujeron con IPTG (isopropil-beta-D-tio-galactopiranósido, de Melford Laboratories) 1 mM. Se permitió que continuara la expresión del dAb durante 12-16 horas a 30ºC. Se encontró que la mayor parte del dAb estaba presente en el medio de cultivo. Por lo tanto, las células se separaron del medio por centrifugación (8.000xg durante 30 min) y se usó el sobrenadante para purificar el dAb. Por litro de sobrenadante se agregaron 30 ml de agarosa de Proteína L (Affitech), y se dejó que el dAb se uniera de forma continua, con agitación durante 2 horas. A continuación, se dejó asentar la resina con la gravedad durante una hora más, antes de extraer el sobrenadante por sifonación. La agarosa se empaquetó entonces en una columna XK 50 (Amershan Pharmacia) y se lavó con 10 volúmenes de columna de 2xPBS. El dAb unido se eluyó con glicina 100 mM a pH 2,0 y las fracciones que contuvieron proteína se neutralizaron por la adición de 1/5 de volumen de Tris 1 M a pH 8,0. Por litro de sobrenadante de cultivo, se aislaron 20-30 mg de proteína pura, que contuvo una relación 50:50 de monómero a dímero disulfuro TAR1-5-19 [Figura 7-4].
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1.3 PEGilación de TAR1-5-19 cys usando PEG activado con MAL 1.3.1 PEGilación del monómero
El residuo cisteína incorporado por ingeniería a la superficie del dAb VH o VK se puede modificar específicamente con un PEG-MAL lineal o ramificado único, para dar una proteína modificada por monómero. Se muestran a continuación dos formatos de PEG-MAL que se pueden utilizar en la PEGilación de un dAb VH o Vk monomérico. Los PEGs pueden tener un tamaño en PM de entre 500 y 60.000 (por ejemplo, desde 2.000 a 40.000).
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Se redujeron 2,5 ml de TAR1-5-19 500 \muM con ditiotreitol 5 mM y se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, la muestra se sometió a un intercambio de tampón usando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia). La columna había sido pre-equilibrada con EDTA 5 mM, fosfato sódico 20 mM a pH 6,5, 10% de glicerol, y la mezcla se aplicó y eluyó siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra (3,5 ml de dAb \sim360 \muM) se conservó en hielo hasta su utilización. Se pesó un exceso molar cuádruple de 40K PEG-MAL (\sim200 mg) y se solubilizó en 100% de metanol antes de mezclarlo con la solución reducida de dAb. La reacción se dejó proseguir a temperatura ambiente durante 3 horas.
1.3.2 Purificación del monómero TAR1-5-19 cys PEGilado
En este ejemplo, el dAb de Vk se purificó usando cromatografía de intercambio catiónico, dado que el punto isoeléctrico (pI) de la proteína es \sim8,8. Si el pI de la proteína fuera bajo, por ejemplo, 4,0, entonces se usaría cromatografía de intercambio aniónico. Se agregaron 40 \mul de ácido acético glacial al 40% por ml de la reacción de TAR1-5-19 cys-PEG 40K para reducir el pH a \sim4. La muestra se aplicó entonces a una columna de intercambio catiónico Resource 5 de 1 ml (Amersham Pharmacia), que había sido pre-equilibrada con acetato sódico 50 mM a pH 4,0. El material PEGilado se separó del dAb no modificado haciéndolo recorrer un gradiente lineal de cloruro sódico desde 0 hasta 500 mM sobre 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contuvieron dAb PEGilado se identificaron usando SDS-PAGE y, a continuación, se combinaron y se aumentó el pH a 8 por la adición de 1/5 de volumen de Tris 1M a pH 8,0.
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1.3.3 Multimerización de TAR1-5-19 cys usando mPEG-MALs
La multimerización de dAbs se puede lograr usando una extensa gama de PEGs bifurcados/ramificados, que han sido modificados con múltiples grupos reactivos a los que el dAb se puede unir de forma covalente [véanse, por ejemplo, las Figuras 7 y 10]. Se ha demostrado que para dianas con múltiples subunidades tal como TNF, la multimerización del dAb (a dímeros, trímeros y tetrámeros) determina un incremento significativo de la avidez por su antígeno (véase la Tabla 1).
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Las estructuras anteriores muestra formatos de mPEG-MAL que se pueden utilizar para multimerizar dAbs de VH y Vk. El PM de mPEG fluctúa en tamaño desde 500 hasta 60.000 (por ejemplo, desde 2.000 hasta 40.000). Los dímeros dAb se producen usando mPEG(MAL) 2 o mPEG2(MAL)2; los trímeros y tetrámeros, utilizando PEGs de 3 ó 4 brazos, respectivamente. El PEG multi-brazos mostrado requeriría ser modificado con MAL para permitir la conjugación con los dAbs.
Para producir los formatos de dAb multimerizados, la metodología experimental fue idéntica a la empleada para producir el monómero, con la excepción de que la relación molar de PEG-MAL:dAb varió en función del formato del PEG-AML usado. Por ejemplo, para producir el dímero TAR1-5-19 [que se muestra en la Figura 7-7] utilizando mPEG2-(MAL)2, la relación molar de PEG-MAL:dAb utilizada fue de 0,5:1. Para purificar el dímero PEGilado, se usó nuevamente cromatografía de intercambio catiónico, como se ha descrito para el monómero PEGilado, con las siguientes modificaciones. El gradiente de cloruro sódico usado fue una sal de 0 a 250 mM sobre 30 volúmenes de columna. Para producir el trímero TAR1-5-19 [que se muestra en la Figura 10-23] usando PEG-MAL de 3 brazos, la relación molar de PEG-MAL:dAb usada fue de 0,33:1. Para purificar el trímero PEGilado, se utilizó nuevamente cromatografía de intercambio catiónico de la forma descrita para el monómero PEGilado, con los cambios siguientes. El gradiente de cloruro sódico empleado fue una sal de 0 a 250 mM sobre 30 volúmenes de columna. Para producir el tetrámero TAR1-5-19 [que se muestra en la Figura 11-28] usando PEG-MAL de 4 brazos, la relación molar de PEG-MAL:dAb aplicada fue de 0,25:1. Para purificar el tetrámero PEGilado, se usó nuevamente cromatografía de intercambio catiónico según se ha descrito para el monómero PEGilado, con los cambios siguientes. El gradiente de cloruro sódico usado fue la sal de 0 a 250 mM sobre 30 volúmenes de columna. Para el trímero y tetrámero TAR1-5-19 PEGilados, si es necesario, las muestras se purificaron adicionalmente usando cromatografía de exclusión de tamaño. Se equilibró una columna Superose 6HR (Amersham Pharmacia) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de cargar la muestra. La columna se hizo funcionar a 0,5 ml/min y la elución de la proteína se monitorizó siguiendo la absorción a 280 nm. Las fracciones que contuvieron dAb PEGilado se identificaron únicamente usando SDS-PAGE y, a continuación, se combinaron.
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2.0 Ejemplo 2
MAL-PEGilación de un dAb de VH Tar2-10-27 2.1 Construcción por PCR de TAR2-10-27 cys
Se usará TAR2-10-27 como ejemplo de la inserción de un cys C-terminal por ingeniería en un dAb de VH. Como en el caso de los dAbs de Vk, el sitio de fijación para el PEG puede estar situado en cualquier parte de la superficie del dAb, con la condición de que el aminoácido dianizado sea accesible al disolvente, y que la proteína PEGilada resultante conserve todavía su fijación de antígeno. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para llevar a cabo la PCR específica de TAR1-5-19 con sitios SalI y BamHI para la clonación y, también, para la introducción de un residuo cisteína C-terminal. Las condiciones de la reacción de PCR y la clonación se efectúan como se ha descrito en la Sección1.1, con el único cambio de que el molde usado fue ADN de plásmido que contiene TAR2-10-27.
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Cebador directo (SEC. ID Nº: 15)
180 
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Cebador inverso (SEC. ID Nº: 16)
181
Fig. 2.1: Secuencia de ADN de TAR2-10-27 cys y los cebadores de PCR usados para amplificar el dAb tratado con ingeniería
2.2 Expresión y purificación de TAR2-10-27 cys
La expresión y purificación de DOM1h-10-27 cys fue como se ha descrito en la Sección 1.2, pero con las modificaciones siguientes. Dado que el dAb es un VH, se usó Proteína A Streamline para purificar la proteína del sobrenadante del cultivo. La proteína se eluyó también de la resina usando glicina 100 mM a pH 3,0 en lugar de tampón a pH 2,0.
2.3 PEGilación de TAR2-10-27 cys
La PEGilación del monómero TAR2-1027 cys fue como se ha descrito en la Sección 1.3.1. Una vez más, los dAbs de VH se pueden multimerizar usando PEG como se ha señalado en la Sección 1.3.3. La purificación de TAR2-10-27 cys PEGilado se efectuó usando cromatografía de intercambio catiónico a pH 4,0 (como se ha descrito en la Sección 1.3.2), dado que el pH de la proteína es \sim8,5.
3.0 PEGilación de dAbs de CH y Vk usando mPEG modificado con NHS y SPA
Así como se utiliza un método sitio-específico de PEGilación, se empleó un método más aleatorio para modificar covalentemente la proteína. Esto implicó usar PEGs modificados con NHS o SPA, que reaccionan con residuos lisina expuestos al disolvente en el dAb [Figura 6-2]. Este sistema tiene la ventaja de que no es necesario procesar el dAb con ingeniería de la proteína, ya que existen diversas lisinas de superficie ya presentes en la superficie de los dAbs de VH y Vk. Asimismo, es posible PEGilar cualquier formato de dAb sin ninguna modificación previa, por ejemplo dímero de TAR1-5-19 disulfuro [Figura 7-5, 6] o dímeros de ultra-afinidad [Figura 8-13, 8-14, 8-15] (véanse las Secciones 3.3 y 5.0). Al igual que los MAL-PEGs, se dispone de una variedad de formatos lineales/bifurcados y ramificados de PEG modificados con SPA y NHS, tal como se muestra a continuación.
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Ejemplo 3 NHS y SPA-PEGilación del dAb de Vk TAR1-5-19 3.1 Construcción por PCR de TAR1-5-19
Se usará TAR1-5-19 como ejemplo de un dAb de Vk que ha sido PEGilado usando NHS y SPA-PEGs. TAR1-5-19 se amplificó por PCR y se clonó usando los cebadores que se muestran más adelante, y de la forma descrita en la Sección 1.1.
20
Cebador directo (SEC. ID Nº: 20)
200 
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Cebador inverso (SEC. ID Nº: 21)
201
3.2 Expresión y purificación de TAR1-5-19
La expresión y purificación de TAR1-5-19 fue como se ha descrito en la Sección 1.2. La única modificación fue que, una vez purificada, la proteína se dializó contra PBS o sometida a intercambio de tampón (PD10) para eliminar el tampón de tris/glicina presente.
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3.3 PEGilación del monómero y dímero de TAR1-5-19 disulfuro con NHS o SPA-PEG
Las reacciones de PEGilación se llevaron a cabo en tampón PBS o fosfato sódico 50 mM a pH 7,0. Se mezclaron 400 \muM de monómero TAR1-5-19 con un exceso molar de 5 a 10 veces de PEG activado (con NHS o SPA disueltos en metanol al 100%). Se dejó continuar la reacción a temperatura ambiente durante 2-4 horas, y, a continuación, se detuvo con la adición de glicina 1M a pH 3,0 a una concentración final de 20 mM. Se observó que el dímero de TAR1-5-19 disulfuro producido durante la expresión (Sección 1.2) se podía PEGilar usando también la metodología anterior. Esto permitió PEGilar el dímero de disulfuro sin necesidad de reducir con DTT, seguido de modificación con el PEG2-(MAL)2. La única modificación del protocolo fue la adición de glicerol al 10% al dímero de dAb para evitar la precipitación durante cualquier etapa de concentración.
3.4 Purificación de los dAbs PEGilados de Vk
El monómero y dímero disulfuro del dAb PEGilado se purificaron usando cromatografía de intercambio catiónico, según se ha descrito en la Sección 1.3.3.
Ejemplo 4 NHS y SPA-PEGilación de un dAb HEL4 de VH 4.1 Construcción por PCR de HEL4
Se usará HEL4 como ejemplo de un dAb de VH que ha sido PEGilado usando NHS y SPA-PEGs. HEL4 se amplificó por PCR y se clonó usando los cebadores siguientes, y bajo las condiciones señaladas en la Sección 1.1, con la única modificación de que el ADN molde fue un vector plasmídico que contuvo la secuencia de ADN de HEL4.
21 
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Cebador directo (SEC. ID Nº: 25)
210 
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Cebador inverso (SEC. ID Nº: 26)
211
4.2 Expresión y purificación de HEL4
El dAb de VH se expresó y purificó según se ha descrito en la Sección 2.2.
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4.3 NHS y SPA-PEGilación de HEL4
La metodología para la modificación de los residuos superficiales de lisina usando PEGs activados con NHS y SPA fue como se ha descrito en la Sección 3.3. La única modificación del protocolo fue que la reacción se finalizó con la adición de tampón Tris 1M a pH 8,0 hasta una concentración final de 20 mM.
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4.4 Purificación de HEL4 NHS o SPA-PEGilado
La purificación de la proteína PEGilada se llevó a cabo usando cromatografía de intercambio aniónico, dado que el pI de HEL4 es \sim4. La columna empleada fue una columna Resource Q de 1 ml (Amersham Pharmacia), que había sido equilibrada con Tris 50 mM a pH 8,0. El pH de la muestra se cambió a 8 antes de cargarla en la columna. Se utilizó un gradiente lineal de cloruro sódico 0 a 500 mM en Tris 50 mM a pH 8,0 para separar la proteína PEGilada del dAb no modificado.
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4.5 Fijación por afinidad de HEL4 PEGilado
Se produjo una resina basada en la afinidad por HEL4 (basada en el antígeno, lisozima de la clara de huevo de gallina) para estudiar la funcionalidad del dAb PEGilado. La lisozima se acopló con resina Sefarose 4B activada con NETS (Amersham Pharmacia), siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, las muestras PEGiladas (5 \mug) se mezclaron con la resina de afinidad (100 \mul) y se les permitió unirse en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. La resina se lavó, entonces, exhaustivamente con PBS (3x 1 ml) para eliminar la proteína no fijada. Se hizo pasar a continuación la resina de afinidad por SDS-PAGE para determinar si HEL4 PEGilado se había unido a la matriz (véase la Sección 8.3).
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Ejemplo 5 PEGilación de dímeros de ultra-afinidad usando PEGs activados con SPA y NHS
Es posible multimerizar dAbs de VH y Vk usando un enlazador (Gly_{4}Ser)_{n} (n = 0-7) para formar una única cadena polipeptídica (por ejemplo, dos dAbs para dar un dímero de ultra-afinidad; Figura 8-12). Por lo tanto, es posible formar apareamientos homodiméricos (VH_{1}-VH_{1} y VL_{1}-VL_{1}) o heterodiméricos (VH_{1}-VH_{2} y VL_{1}-VL_{2}) con dobles especificidades. Al igual que se forman dímeros, se pueden agregar dAbs adicionales para generar proteínas más grandes tales como trímeros [Figura 10-27] o tetrámeros [Figura 11-32]. Una vez más, dado que se puede usar una combinación de dAbs de VH y Vk para crear estos formatos de mayor tamaño, resulta posible preparar moléculas doblemente específicas. Por ejemplo, un trímero de dAb con la capacidad de tener una semivida sérica extendida y fijar TNF-\alpha; un dAb con la capacidad de fijarse a la albúmina sérica unido a dos dAbs TAR1-5-19 que fijan TNF como un dímero. Los dímeros de ultra-afinidad se han PEGilado usando NHS y SPA-PEGs [Figura 8-13, 8-14 y 8-15], y han sido tratados específicamente por ingeniería para aceptar MAL-PEGs en el extremo C-terminal de la proteína (Ejemplos 6a y 6b) [Figura 8-16]. En este ejemplo, el dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19-Dímero 4 se modificó con SPA 20 K o NHS 40 K. La secuencia de ADN del dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19-Dímero 4 se muestra a continuación.
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5.1 Expresión y purificación del dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19 Dímero 4
La expresión del dímero fue como se ha descrito en la Sección 1.2, con la única modificación del protocolo de que la construcción se transformó en células TOP10 F' (Invitrogen), y que se usó carbenicilina a una concentración de
100 \mug/ml.
5.2 20K SPA y 40K NHS-PEGilación y purificación del dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19 Dímero 4
El dímero se PEGiló como se ha descrito en la Sección 3.3 con 20K SPA-PEG o 40K NHS-PEG. Ambos dímeros PEGilados con 20K SPA y 40K NHS se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico, según se ha descrito en la Sección 1.3.3, Ejemplo 1a.
Ejemplo 6 PEGilación sitio-específica de dímeros de ultra-afinidad usando PEGs activados con MAL
Al igual que con los dAbs tratados por ingeniería con Cys C-terminales, los dímeros dAb de ultra-afinidad se pueden modificar también, de forma similar [Figura 8-16]. Nuevamente se puede usar el dímero cys como el bloque básico de construcción para crear formatos multi-dAb PEGilados [Figura 8-17 y 11-29, 11-31]. Se usará el homodímero TAR1-5-19 con un cys enlazador (Gly4Ser)5 (véase la Figura 8-16) como ejemplo. Tal como ocurre con el monómero TAR1-5-19 cys, se producirán un formato monomérico (es decir, dímero; Figura 8-16) y dimérico (es decir, tetrámero, Figura 8-17) en solución durante la expresión. La secuencia de ADN del dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19 homodímero cys se muestra a continuación.
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6.1 Expresión y purificación del dímero de ultra-afinidad TAR1-5-19 homodímero cys
La expresión del dímero fue como se ha descrito en la Sección 1.2, con la única modificación del protocolo de que la construcción se transformó en células TOP10 F' (Invitrogen), y que se usó carbenicilina en una concentración de 100 \mug/ml.
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6.2 Dimerización y purificación de TAR1-5-19 homodímero cys con 40K PEG2-(MAL)2
TAR1-5-19 homodímero cys se PEGiló con 40 K PEG2-(MAL)2 para formar un dímero (es decir, 2 x dímeros enlazadores con un total de 4 dAbs; Figura 11-29). Las condiciones de reacción y purificación fueron como las que se han descrito en la Sección 1.3.1 y modificadas según se señala en el Ejemplo 1a.
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Ejemplo 6b
Tetramerización y purificación de TAR1-5-19 homodímero cys con 40K PEG2-(MAL)2
TAR1-5-19 homodímero cys se PEGiló con 20K PEG-MAL de 4 brazos para formar el tetrámero de dímeros (es decir, 4x dímeros enlazadores con un total de 8 dAbs; Figura 11-31). Las condiciones de reacción y purificación fueron como las que se han descrito en la Sección 1.3.1 y modificadas según se señala en el Ejemplo 1c.
Ejemplo 7 Multimerización de un dAb de baja afinidad de unión (VH o Vk) para crear formatos de mayor afinidad
Se usará TAR1-5 como ejemplo de un dAb de Vk que exhibe una afinidad de unión relativamente baja como monómero por TNF, pero el dAb se puede formatear para aumentar su afinidad por medio de multimerización. Una vez más, se usó cisteína C-terminal para multimerizar el dAb por medio de 20K PEG-MAL de 4 brazos.
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7.1 Construcción por PCR de TAR1-5 cys
Se usaron los siguientes oligonucleótidos para lleva a cabo una PCR específica de TAR1-5 con sitios SalI y BamHI para la clonación y, también, para introducir un residuo cisteína C-terminal. La secuencia de ADN de TAR1-5 cys y los cebadores de PCR usados para amplificar el dAb tratado por ingeniería se muestran a continuación.
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Cebador directo (SEC. ID Nº: 36)
270 
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Cebador inverso (SEC. ID Nº: 37)
271
7.2 Expresión y purificación de TAR1-5 cys
La expresión y purificación del dAb se efectuó como se ah descrito en la Sección 1.2. También aquí se formó una mezcla 50:50 de monómero y dímero TRA1-5 disulfuro.
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7.3 Multimerización por PEGilación y purificación de 20K PEG-MAL de 4 brazos-TAR1-5
Las condiciones de PEGilación y purificación fueron como se ha descrito en la Sección 1.3.3, Ejemplo 1c. Los resultados de los ensayos de citotoxicidad celular se muestran en la Tabla 1.
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Ejemplo 8 Ensayo de unión funcional in vitro: Ensayo del receptor de TNF y ensayo celular 8.1 Datos de ensayo para el monómero TAR1-5-19 PEGilado y TAR1-5-19 cys
Se determinó la afinidad del dAb PEGilado por el TNF-\alpha humano usando el ensayo de unión del receptor de TNF (RBA) y el ensayo de citotoxicidad celular (resumidos en la Tabla 1). La Figura 1 muestra los resultados del ensayo RBA de algunos dAbs de Vk PEGilados seleccionados; a partir de los gráficos se determinó la CI 50 y se resumió en la Tabla 1. Se puede observar que existe una escasa diferencia entre las formas PEGilada y no modificada del monómero y dímero en el RBA. Incluso con el PEG-MAL 40 K mayor, la CI 50 no se ve afectada. Se observa un ligero descenso con NHS 40 K, pero puede ser debido a que el sitio de PEGilación es más próximo a las CDRs, mientras que con MAL 40K está localizada en el extremo C-terminal del dAb. Esto demuestra que la PEGilación tiene un efecto insignificante sobre la fijación de antígeno, siempre que esté situada lejos de las CDRs. También se puede ver que los formatos PEGilados de 3 y 4 brazos, usando el dAb monomérico, muestran una afinidad mejorada por TNF en el RBA. La Figura 2 se refiere a las mismas muestras en el ensayo de citotoxicidad celular. También aquí hay poca diferencia entre las muestras PEGiladas y no modificadas, demostrando que se conserva la potencia del dAb. La diferencia más significativa se produce con las muestras de PEG de 3 y 4 brazos, que exhiben una reducción de la DN 50 de \sim10 \muM en el ensayo celular. Tras la dimerización, la afinidad se reduce a \sim3 \muM y, cuando se tetrameriza usando el PEG de 4 brazos, se reduce a una DN 50 de 200 nM. Por lo tanto, incluso un dAb de baja afinidad puede someterse a multimerización, empleando PEG multi-brazos, para crear formatos con mayor avidez por su antígeno.
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8.2 Datos de ensayo para los dímeros TAR1-5-19 Dímero 4 y TAR1-5-19 homodímero cys de ultra-afinidad PEGilados
La SPA y NHS PEGilación de TAR1-5-19 Dímero 4 mostró nuevamente que la modificación aleatoria de la superficie afectó sólo de manera ligera a la potencia del dímero (véase la Tabla 1). Con TAR1-5-19 homodímero cys se observó que la dimerización del dímero para formar el tetrámero conservó la DN 50 de \sim3 nM. Se registró un descenso significativo de la DN 50 cuando el dímero se multimerizó adicionalmente usando MAL-PEG de 4 brazos para producir el octámero, desplazando la DN 50 a \sim100 pM.
Esto refleja el hecho de que la sensibilidad del ensayo RBA es relativamente alta, y que los formatos con alta afinidad aparecerán en su totalidad con \sim100 pM.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Resumen de los resultados de los ensayos de receptor y citotoxicidad celular de formatos de dAb basados en TAR1-5-19
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8.3 Unión de HEL4 PEGilado a la matriz de afinidad de lisozima
Se analizaron diversos formatos de HEL4 PEGilados para ver si conservaban la capacidad de fijar antígeno después de haber sido modificados. Específicamente, se analizaron los geles de SDS-PAGE que exhibieron unión de afinidad con lisozima; las pistas son las siguientes: 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 muestran la permanencia de proteína en el sobrenadante después de la unión continua durante 30 min; las pistas 2, 5, 8, 11, 14, 17 y 20 muestran proteínas que pudieron ser eluidas durante la etapa de lavado con PBS; y las pistas 3, 6, 9, 12, 15, 18 y 21 muestran proteínas que se fijaron a la resina de afinidad de lisozima.
A partir de los geles, es posible ver claramente que la proteína PEGilada se retira eficazmente del sobrenadante y se mantiene unida a la resina, incluso después de varios lavados con PBS. Así, se demuestra que el dAb PEGilado conservó la especificidad por su antígeno, independientemente de si fue PEGilado con Tiol o MAL-PEG, o a través de residuos superficiales de lisina, usando SPA o NHS-PEGs.
8.4 PEGilación de TAR2-10-27
Se puede determinar la potencia de unión de TAR2-10-27 usando un ensayo de fijación del receptor de TNF. El monómero no modificado tuvo una CI 50 de \sim3 nM en el ensayo y, tal como se puede ver en la Figura 4, el monómero PEGilado con 40K tiene una CI 50 de \sim20 nM.
Ejemplo 9 Correlación del tamaño hidrodinámico con la semivida sérica in vivo de los dAbs de VH y Vk PEGilados
La PEGilación de proteínas se ha utilizado para aumentar su semivida sérica in vivo. El tamaño de corte de filtración renal es de aproximadamente 70 kDa, lo que significa para una proteína con el tamaño de un dAb no modificado (VH \sim13-14 kDa y Vk \sim12 kDa), la semivida sérica será relativamente baja (t1/2 beta de \sim10-30 min). El trabajo llevado a cabo con la PEGilación de dAbs ha demostrado que la semivida sérica de un dAb (VH o Vk) se puede modular por medio del tamaño y la naturaleza ramificada del PEG usado. Esto tiene aplicaciones importantes, por ejemplo, en terapias farmacológicas en las que es deseable disponer de una semivida prolongada de decenas de horas (por ejemplo, >30 horas); en tanto que se requiere un tiempo de permanencia significativamente menor, de unas pocas horas (3-6 horas) si el dAb debe ser marcado y usado como reactivo in vivo con fines de diagnóstico por imagen.
Los presentes inventores han demostrado que dos parámetros juegan un papel importante en la determinación de las semividas séricas de los dAbs PEGilados. El primero de ellos es la naturaleza y el tamaño de anexo PEG, es decir, si la naturaleza del polímero usado es simplemente una cadena lineal o de forma ramificada/bifurcada. El segundo parámetro es la localización del dAb en el formato final y el número de brazos PEG no modificados y "libres" que tiene la molécula. El tamaño hidrodinámico resultante del formato PEGilado, calculado por cromatografía de exclusión de tamaño, refleja la semivida sérica de la molécula. Así, cuanto mayor es el tamaño hidrodinámico de la molécula PEGilada, mayor es la semivida en suero, tal como se muestra en la Tabla 2.
Las matrices de filtración sobre gel usadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de diversas proteínas PEGiladas se basaron en agarosa altamente reticulada. El intervalo de fraccionamiento de las dos columnas para proteínas globulares es: Superose 12 HR 1000-3x105 Mr, y Superose 6 HR 5000-5x106 Mr. Los límites de exclusión de tamaño de la proteína globular son \sim2x106 para Superose 12 HR y \sim4x07 Mr para Superose 6 HR.
TABLA 2
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De esta forma, se puede desprender de la Tabla 2 que incluso aunque el formato PEG de 4 brazos de TAR1-5-19 consiste en 20K de PEG y que su masa molecular es mayor que la del dímero 20K SPA TAR1-5-19 disulfuro (95 kDa comparado con 60 kDa), y tienen semividas similares, si se considera que el corte renal es de 70 kDa. Eso puede deberse al hecho de que en el formato de 4 brazos, los dAbs están unidos en el extremo de cada molécula de PEG y así, en términos globales, la molécula es más compacta (menor tamaño hidrodinámico); es decir, en este formato hay una muy alta densidad de PEG en el núcleo de la molécula, comparado con la presencia de una sola cadena lineal de 20K. La ventaja de usar el formato de 4 brazos es el aumento significativo de afinidad con TNF, comparado con las moléculas diméricas (30 pM comparadas con 3 nM, respectivamente). Por lo tanto, en algunas aplicaciones en las que se requiere un enlace de alta afinidad, pero con una semivida sérica corta, la molécula se podría diseñar para mostrar ambas características deseadas, mediante la variación del número de dAbs presentes y del tamaño de PEG usado.
Ejemplo 10 Estabilidad ante las proteasas de los dAbs PEGilados
Otra característica clave de los dAbs PEGilados es su mayor estabilidad contra la acción de las proteasas. De manera intrínseca, los dAbs son relativamente estables a la acción de las proteasas, dependiendo de las condiciones de ensayo. Por ejemplo, la tripsina no degrada TAR1-5-19, ni siquiera en presencia de urea 5M. Esto se debe a que el dAb no se despliega en presencia del degradante, en tanto que resulta totalmente degradado por pepsina a pH 2 si la proteína se despliega bajo condiciones ácidas. La PEGilación tiene la ventaja de que la cadena polímera cubre muy probablemente la superficie del dAb, evitando así que la proteasa acceda a la estructura polipeptídica central y la escinda. Incluso cuando la proteína está parcialmente desnaturalizada a pH bajo, la presencia de PEG en el dAb aumenta de forma significativa su resistencia a la acción de la pepsina (Figura 5).
La Figura 5 muestra los resultados de la degradación con pepsina de TAR1-5-19 y otras variantes PEGiladas. Las reacciones se llevaron a cabo a pH 2,0, a 37ºC durante hasta 30 min, en presencia de 250 \mug de pepsina. Las designaciones de las pistas son las siguientes: 1: escala de peso molecular; 2: monómero (0 min); 3: monómero (15 min); 4: monómero (30 min); 5: dímero 40K MAL2 (0 min); 6: dímero 40K MAL2 (15 min); 7: dímero 40K MAL2 (30 min); 8: monómero 20K MAL (0 min); 9: monómero 20K MAL (15 min); 10: monómero 20K MAL (30 min). El gel demuestra que el dAb no modificado resulta degradado muy rápidamente a pH bajo. La Figura 5 muestra también que el tipo de PEG presente en la superficie del dAb puede tener un efecto significativo sobre su resistencia a la acción de la proteasa. El PEG lineal de 20K no protege el dAb en cierta medida, sino que incluso después de 30 min se observa alguna degradación (bandas de 3 kDa, degradación de \sim15-20% estimada del gel). Por el contrario, con el dímero PEG MAL2 de 40K, se registra una muy escasa degradación incluso después de 30 min (degradación máxima de <5% en el gel). Esto se debe, muy probablemente, al formato 2x20K del PEG, que ofrece una mayor protección contra la acción de la pepsina. Esto permitiría sugerir que el dAb PEGilado también sería resistente a la acción de una extensa gama de proteasas halladas en el tracto digestivo del ser humano, manteniendo igualmente su funcionalidad en el entorno de pH bajo del estómago. Por lo tanto, se podría administrar un dAb PEGilado por vía oral como fármaco terapéutico, sin necesidad de complejas formulaciones destinadas a prevenir la degradación o pérdida de funcionalidad. Un dAb PEGilado ofrece una clara ventaja sobre otros formatos tales como IgG, scFv o Fabs, que pueden ser más susceptibles a la acción de las proteasas y a la desnaturalización (con la consiguiente pérdida potencial de funcionalidad) a los pHs extremos encontrados durante la digestión.
Ejemplo 11 PEGilación sitio-específica de dAbs de VH o Vk, usando PEGs activados con NHS o SPA
Debido a la presencia de varios residuos lisina en la superficie de un dAb (VH o Vk), es relativamente inútil intentar acoplar un único NHS/SPA-PEG a la proteína, puesto que sólo se utilizan relaciones bajas de PEGs:dAb. Aunque se puede producir una única especie PEGilada, habitualmente sólo se PEGilará entre \sim10-20% de la proteína total. El aumento de la relación de PEG activado da como resultado, invariablemente, una sobre-PEGilación. Potencialmente, ésta podría conducir a la pérdida de la fijación de antígeno, debido a que las CDRs quedan cubiertas por el PEG. La solución de este problema podría consistir en sustituir estas lisinas superficiales con aminoácidos que se encuentran presentes también en otros marcos de anticuerpos humanos. Por ejemplo, VkI (DPK9) tiene 3 residuos lisina en el marco 2. Estos residuos se podrían cambiar por los hallados en VkII (DPK18) (residuos arginina y glutamina). La sustitución de residuos con otros que están presentes ya en un marco humano reduciría también los efectos potenciales de la inmunogenicidad. Los dAbs de Vk tienen también un residuo lisina C-terminal, que estaría conservado para la PEGilación sitio-específica. También se podría realizar un tratamiento de ingeniería específico para la lisina en los dAbs de VH. Las lisinas superficiales también se pueden sustituir con residuos hallados en los correspondientes marcos VH humanos, pero en este caso, la serina C-terminal también exigiría ser sustituida por lisina. Esto permitiría, entonces, un tratamiento de ingeniería sitio-específico de una sola lisina en el dAb (de forma idéntica a lo efectuado ya con la cisteína). El único requisito es que la lisina tendría que ser accesible al disolvente y estar situada, tras la PEGilación, de manera que no reduzca significativamente la fijación de antígeno.
Ejemplo 12 Identificación de los sitios potenciales de PEGilación en el dAb de VH y Vk
Para incorporar específicamente un residuo cisteína, por ingeniería, en el marco de dAbs de VH o Vk para la PEGilación, se deben considerar varios factores, que incluyen:
\bullet
accesibilidad al disolvente del residuo introducido, que exige que esté situado en la superficie de la proteína;
\bullet
proximidad del sitio introducido a las CDRs, y cómo afectará esto a la fijación de antígeno tras la PEGilación;
\bullet
eliminación de interacciones nativas favorables (tales como la formación de enlaces de hidrógeno) que, tras la sustitución a cisteína, pueden desestabilizar la proteína o afectar a la vía de plegado, por lo que el dAb resultante no es capaz de expresarse con eficacia.
Por lo tanto, para investigar el sitio más apropiado para la cisteína superficial, se llevó a cabo una comparación directa de expresión de proteína, PEGilación y ensayos de unión por afinidad. Esto permitiría determinar si un residuo cisteína C-terminal (Ser120cys) es verdaderamente mejor que un sitio de acoplamiento interno para la expresión de proteína, conservando la afinidad por el antígeno.
Se utilizó el sistema PDBViewer suizo para calcular la accesibilidad al disolvente de los residuos aminoácidos superficiales, identificando así los sitios potenciales para introducir, por ingeniería, un residuo cisteína. Todos estos residuos fueron seleccionados por su distancia desde las CDRs. La introducción de una molécula grande de PEG próxima a las CDRs tendría evidentemente un efecto sobre la fijación de antígenos. La Tabla 3 muestra los sitios más apropiados, identificados usando las estructuras de HEL4 y Vk "dummy" (las secuencias se muestran más adelante). Se puede ver que los sitios potenciales de PEGilación están agrupados en zonas de la superficie del dAb. Por consiguiente, se seleccionó solamente un mutante (excepto para el Grupo V) para la expresión (se muestra en negrita). Estos sitios son muy probablemente capaces de acomodar el residuo cisteína introducido por ingeniería, sin que se produzca una pérdida significativa de fijación de antígenos.
TABLA 3 Los sitios se identificaron usando las coordenadas de la estructura cristalina de HEL4, y la estructura modelada de Vk "dummy". La numeración de aminoácidos usada refleja la secuencia primaria de aminoácidos de cada dAb (se muestra más adelante)
32
Secuencia primaria de aminoácidos del dAb de VH HEL4 (SEC. ID Nº: 5)
102 
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Secuencia primaria de aminoácidos de Vk "dummy" (SEC. ID Nº: 6)
104
12.1 Mutagénesis "Quick-Change" de TAR2-10-27 para introducir cisteínas superficiales para la PEGilación sitio-específica
Se utilizó mutagénesis "Quick-Change" (Stratagene) para sustituir un residuo superficial con una única cisteína para la PEGilación sitio-específica. La mutagénesis "Quick-Change" se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante, usando ADN de TAR2-10-27 natural como molde y los pares de cebadores adecuados (Tabla 4). Los clones positivos se identificaron por secuenciación de ADN, y cada dAb mutante se expresó y purificó de la forma descrita en la Sección 2.2. La PEGilación y purificación de las proteínas formateadas se llevaron a cabo como se ha descrito en la Sección 2.3.
TABLA 4 Pares de oligonucleótidos usados por la mutagénesis "Quick-change" de TAR2-10-27
33 
\newpage
Cada uno de los mutantes de TAR2-10-27 cys se expresó y purificó, y el rendimiento total de proteína se muestra en la Tabla 5.
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TABLA 5 Rendimientos finales de la purificación de mutantes cys superficial de TAR2-10-27
35 
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Por la Tabla 5 se puede ver que los niveles de expresión de cada dAb mutante varía significativamente, dependiendo de la posición de la cisteína en la superficie de la proteína. Por ejemplo, el mutante Leu115cys tiene un nivel de expresión \sim5,3 veces mayor que Ser120cys. Por lo tanto, la posición del sitio de PEGilación puede tener un efecto importante sobre los niveles de expresión in vivo. Para comprobar si la posición del sitio de PEGilación había afectado a la afinidad del dAb por su antígeno, cada mutante se sometió a PEGilación con 30K MAL-PEG y se purificó por cromatografía de intercambio iónico. Como control, se bloqueó la cisteína superficial de cada mutante con N-etilmaleimida para producir proteínas monómeras. Todas las proteínas se sometieron a un ensayo de fijación de receptor DOM1 (RBA), así como a un ensayo con células MRC-5, y los resultados se muestran en la Tabla 6.
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TABLA 6 Resumen de los datos de RBA y del ensayo celular para los mutantes de TAR2-10-27 cys superficial. Las proteínas bloqueadas se generaron usando N-etilmaleimida
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37
Se puede ver claramente que la localización del sitio de PEGilación efectivamente tiene un efecto significativo sobre la afinidad del dAb por su antígeno. El mejor sitio para la PEGilación parece ser en la posición Gln13, Pro41 o Leu115 (DN 50 de \sim200-300 nM). Todas estas construcciones parecen conservar una afinidad relativamente elevada por el antígeno, en comparación con la PEGilación C-terminal directa en Ser120cys (DN 50 de 600 nM). Por lo tanto, puede ser más favorable seleccionar un sitio interno de PEGilación en lugar de uno C-terminal sobre la base de que: (i) la expresión de proteína es significativamente mayor y (ii) la fijación del antígeno se ve menos afectada.
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Ejemplo 13 Correlación del tamaño hidrodinámico con la semivida sérica in vivo de dAbs de VH y Vk PEGilados
Se determinó la masa molecular nativa de los diversos dAbs de VH y VL PEGilados usando cromatografía de filtración sobre gel. Se equilibró una columna Superose 6HR (Amersham Biosciences) con 5 volúmenes de columna de PBS, empleando un sistema AKTA 100 (Amersham Biosciences). La columna se calibró usando kits de calibración de proteínas de alto y bajo peso molecular (Amersham Biosciences), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aplicaron 100 \mul de proteína PEGilada (1,5 mg/ml) en la columna, con un caudal de flujo de 0,5 ml/min. El volumen de elución de la proteína se determinó siguiendo la absorción a 280 nm. El proceso se repitió para cada dAb PEGilado, para establecer sus volúmenes de elución individuales. Se generó una curva de calibración para la columna, trazando el registro de la masa molecular con respecto a K_{AV}, donde K_{AV} es:
K_{AV} = (V_{e} - V_{0}) / (V_{t} - V_{0})
V_{e} = volumen de elución de la proteína (ml)
V_{0} = volumen vacío (volumen de elución de azul dextrano [7,7 ml])
V_{t} = volumen total de columna (volumen de elución de acetona 22 ml)
La masa molecular nativa de cada dAb PEGilado se determinó convirtiendo el volumen de elución en una K_{AV}. La curva de calibración de las K_{AV} con respecto al registro de los estándares de peso molecular se usó para extrapolar la masa de las proteínas PEGiladas.
A partir de la curva de calibración de la columna de filtración sobre gel, se calculó el tamaño estimado de los diversos dAbs PEGilados, que se muestra en la Tabla 7. También se determinó la semivida sérica in vivo de todos los formatos en el ratón.
TABLA 7 Cálculos del tamaño hidrodinámico y de las semividas séricas in vivo de dAbs de Vk. Observaciones: ^{a} tamaño estimado, determinado por SDS-PAGE; ^{b} tamaños hidrodinámicos determinados por cromatografía de exclusión de tamaño en Superose 6HR (Amersham Biosciences)
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De la Tabla 7 se puede deducir claramente que el tamaño hidrodinámico del dAb se puede aumentar significativamente por medio de la adición de PEG. Igualmente, no sólo el tamaño del PEG, sino también la estructura del polímero puede afectar en gran medida al tamaño hidrodinámico. Por ejemplo, las estructuras 2x20K y 4x10K tienen el mismo contenido en PEG, pero la de 2x20K tiene un tamaño hidrodinámico \sim3 veces mayor que el de 4x10K. Esto se puede atribuir al hecho de que el PEG en el formato 4x10K está más densamente empaquetado en el núcleo de la molécula, comparado con el PEG 2x20K, reduciendo de este modo su tamaño hidrodinámico de forma significativa. Resulta también evidente que existe una relación entre la masa hidrodinámica nativa de la proteína y la semivida sérica in vivo (véase la Figura 15). Así, el tamaño hidrodinámico, determinado por cromatografía de filtración sobre gel, se puede utilizar para proporcionar una semivida sérica estimada. Independientemente del formato y tamaño del PEG usado para modificar el dAb (es decir, lineal frente a ramificado), se puede observar que el tamaño hidrodinámico es un mejor indicador de la semivida sérica que la masa total de polímero usada para modificar la proteína.
Por consiguiente, el tamaño hidrodinámico, según se determina por cromatografía de filtración sobre gel, se puede utilizar para conferir una semivida sérica estimada, usando la Figura 15.
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Ejemplo 14 Estabilidad ante las proteasas de los dAbs PEGilados
La estabilidad ante las proteasas de proteínas no modificadas y PEGiladas se analizó estudiando la fijación de antígeno por ELISA. Debido a la menor señal generada por la proteína PEGilada en ELISA, fue necesario utilizar una concentración significativamente mayor de dAb. Se digirieron 0,4 \muM (5 \mug/ml) de monómero y 25 \muM (300 \mug/ml) de TAR1-5-19 40K PEGilado con 250 \mug/ml de proteasa, en un volumen final de 100 \mul para todas las proteasas. Las proteasas usadas fueron pepsina porcina, peptidasa de la mucosa bovina bruta, elastasa pancreática porcina, proteasa pancreática bovina bruta (tipo I) y polvo de intestino de rata (Sigma). Todas las digestiones se llevaron a cabo en tampón Tris 50 mM a pH 8,0, excepto en el caso de pepsina, que se efectuó en HCl 20 mM a pH 2,0. Cada producto de la digestión se incubó a 37ºC durante 30 min y, a continuación, se finalizó la reacción por la adición de 10 \mul de una solución 10x madre de Inhibidores de Proteasa Completos (Roche). Seguidamente, las muestras se mantuvieron sobre hielo hasta su uso. Una placa Maxisorb, que había sido recubierta previamente durante la noche a 4ºC con 1 \mug/ml de TNF en PBS, se bloqueó con 2% de Tween-20 en PBS (2%TPBS) durante una hora a temperatura ambiente. Se diluyeron 20 \mul de cada muestra de ensayo de proteasa a 200 \mul usando 2% TPBS. Las muestras se transfirieron, entonces, a la placa recubierta con antígeno y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Luego, la placa se lavó con 0,1% TPBS, antes de agregar 100 \mul por pocillo de solución de Proteína L-HRP (diluida 1:2000 en 2% TPBS), y se incubó durante una hora. La placa se lavó nuevamente con 0,1% TPBS y, seguidamente, PBS antes de revelar la placa. Se agregaron 100 \mul de solución TMB por pocillo, y se dejó proseguir el revelado antes de la adición de 100 \mul de HCl 1M que finalizó la reacción. El nivel de dAb fijado presente se determinó de forma indirecta midiendo la absorbancia a 450 nm con un lector de placa Versamax (Molecular devices). El porcentaje de proteína funcional que permaneció después del tratamiento con proteasa se determinó de la medición a 450 nm en relación con el control exento de proteasa.
La estabilidad ante la proteasa de TAR1-5-19 monómero y conjugado con 40K PEG frente a las diversas proteasas se muestra en la Figura 16. Se puede observar que, incluso, el dAb monómero no modificado exhibe un cierto grado de resistencia a la proteasa, mostrando sólo una pérdida de \sim50-70% de fijación de antígeno con peptidasa, elastasa y polvo de intestino de rata, una pérdida de 90% con CBP y pérdida total de actividad con pepsina y CBP. La resistencia a las proteasas puede deberse al pliegue compacto de la proteína del dAb que, por su parte, puede reducir la capacidad de las proteasas para acceder a la estructura central peptídica. Comparado con el dAb no modificado, el TAR1-5-19 40K PEGilado muestra un mayor grado de estabilidad frente a todas las proteasas, excepto pepsina. El aumento de la estabilidad se puede deber a la modificación superficial del dAb con un polímero móvil tan grande. El PEG superficial puede "recubrir" la proteína, evitando que las proteasas se fijen y escindan la estructura central peptídica, potenciando de esta forma la estabilidad de los dAbs frente a estas enzimas.
La razón de la degradación total de ambos formatos con pepsina puede atribuirse a las condiciones de desnaturalización a pH bajo a las que se exponen los dAbs durante el ensayo. El pH bajo determinaría el despliegue de la proteína, lo que permitiría un mayor acceso de la pepsina a su estructura central y su correspondiente escisión.
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Ejemplo 15 Análisis de los índices k_{d} y k_{a} de TAR2-10-27 usando Biacore
Se investigó el efecto de la PEGilación sobre la afinidad de fijación de TAR2-10-27 por su antígeno, usando Biacore. Todos los formatos PEGilados se generaron usando TAR2-10-27cys (véase el Ejemplo 2). Se utilizó la siguiente metodología para determinar las tasas on y off de cada formato de dAb PEGilado para el antígeno. Se recubrió con TNFR1 humano biotinilado (aproximadamente 1 biotina por molécula) una células de flujo simple de un chip sensor de estreptavidina Biacore, con una densidad de aproximadamente 400 RU. Se inyectó secuencialmente una serie de concentración de cada dAb o dAb PEGilado (2,6 \muM, 770 nM, 260 nM, 77 nM y 2,6 nM) (inyecciones de 45 \mul con una velocidad de flujo de 30 \mul/min) sobre la célula de flujo recubierta con TNFR1 como sobre la célula de flujo no recubierta (estreptavidina) (se generó una curva de sustracción restando la curva de la célula de flujo no recubierta de la curva de célula de flujo de TNFR1). Se analizó la tasa off durante cinco minutos después de la inyección de cada muestra, tras lo cual se regeneró la superficie por inyección de glicina 10 mM a pH 3.
Los datos generados por Biacore se ajustaron usando el software de ajuste de curvas (Biaevaluation 3.2) y se determinaron las constantes de asociación (k_{a}) y de disociación (k_{d}) (Tabla 8).
TABLA 8 Análisis de las tasas on y off de TAR2-10-27 en diversos formatos PEGilados. TAR2-10-27 bloqueado se generó usando N-etilmaleimida
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De la Tabla 8 se puede ver que a medida que aumenta el tamaño de la cadena de PEG, la K_{D} se reduce. Esta variación de K_{D} se debe principalmente a un descenso de ka, manteniéndose la kd relativamente inalterada a medida que aumenta el tamaño del PEG.
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Ejemplo 16 Estudio de eficacia de TAR1-5-19 PEGilado en un modelo de profilaxis de la artritis
El ratón Tg197 es transgénico para el gen híbrido humano TNF-globina, y sus heterocigotos desarrollan a las 4-7 semanas de edad una poliartritis crónica progresiva con características histológicas comunes con la artritis reumatoide [Keffer, J., Probert, L., Cazlaris, H., Georgopoulus, S., Kaslaris, E., Kioussis, D., Kollias, G. (1991). Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J., Vol. 10, págs. 4025-4031].
Para analizar la eficacia de un dAb PEGilado (en donde el formato de PEG es ramificado de 2x20K, con 2 sitios de fijación del dAb [es decir, 40K PEG2 MAL2], y donde el dAb es TAR1-5-19cys), en la prevención de la artritis en el modelo Tg197, ratones heterocigotos transgénicos se distribuyeron en grupos de 10 animales, con idéntico número de machos y hembras. El tratamiento se inició a las 3 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales semanales de los artículos de ensayo. La expresión y PEGilación del monómero TAR1-5-19cys se ha descrito en la Sección 1.3.3, Ejemplo 1. Todas las preparaciones de proteína se llevaron a cabo en solución salina tamponada con fosfato y se analizaron los niveles aceptables de endotoxinas.
El estudio se realizó bajo condiciones ciegas. Cada semana, los animales fueron pesados y se puntuaron los signos macro-fenotípicos de artritis de acuerdo con el sistema siguiente: 0 = ausencia de artritis (aspecto y flexión normales), 1 = artritis leve (distorsión articular); 2 = artritis moderada (inflamación, deformación articular); 3 = artritis intensa (grave impedimento del movimiento).
El resultado del estudio demostró claramente que 10 mg/kg de TAR1-5-19 PEGilado inhibieron el desarrollo de la artritis, con una diferencia significativa de la puntuación de artritis entre el control de solución salina y el grupo tratado. La dosis de 1 mg/kg de TAR1-5-19 PEGilado dio lugar también a una puntuación de artritis mediana significativamente menor que el grupo de control de solución salina (P<0,05%, usando la aproximación normal al test de Wilcoxon).
Ejemplo 18 Estudio de eficacia de TAR1-5-19 PEGilado en el modelo terapéutico de artritis
Para analizar la eficacia de un dAb PEGilado en el modelo terapéutico de artritis en el modelo Tg197, se distribuyeron ratones heterocigotos transgénicos en grupos de 10 animales, con el mismo número de machos y hembras. El tratamiento se inició a las 6 semanas de edad, cuando los animales mostraban ya fenotipos artríticos significativos. El tratamiento se llevó a cabo dos veces a la semana, con inyecciones intraperitoneales de 4,6 mg/kg de los artículos de ensayo. La preparación de muestra y la puntuación de la enfermedad son como se ha descrito anteriormente, en el Ejemplo 17.
La puntuación de artritis demostró claramente que el TAR1-5-19 PEGilado inhibió la progresión de la enfermedad en el modelo terapéutico. La dosis de 4,6 mg/kg de TAR1-5-19 PEGilado produjo una puntuación de artritis mediana significativamente menor que en el grupo de control de solución salina en la semana 9 (P<0,01%, usando la aproximación normal al Test de Wilcoxon).
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Ejemplo 19 Eficacia de dAb en un Formato de Liberación Lenta
Para analizar la eficacia de un dAb en formato de liberación lenta, se cargó en una bomba osmótica de 0,2 ml un dAb con una molécula pequeña de PEG (en donde el PEG es 4x5K, con cuatro sitios de unión con el dAb con un residuo cys C-terminal, donde el dAb es TAR1-5-19 [es decir, 20K PEG 4-brazos MAL]). La bomba tuvo una velocidad de liberación de 0,2 ml durante un período de 4 semanas, y se implantó de forma subcutánea en el ratón en la semana 6, usando el modelo terapéutico Tg197 descrito anteriormente. Las puntuaciones de artritis de estos animales aumentaron de forma claramente más lenta, en comparación con los animales en los que se implantaron bombas cargadas con solución salina. Esto demuestra que los dAbs son eficaces cuando se administran en un formato de liberación lenta.
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Ejemplo 20 PEGilación de dAbs de VH y VL usando TCEP como agente reductor
Los métodos descritos en el Ejemplo 13 utilizan ditiotreitol (DTT) para reducir el tiol de superficie en el dAb antes de la MAL-PEGilación. Este método exige la eliminación del agente reductor por filtración sobre gel o diálisis antes de la PEGilación, puesto que DTT reaccionará rápidamente con maleimida-PEG, incluso a pH bajo, impidiendo la formación del conjugado polímero-dAb.
Un método alternativo consiste en usar un agente reductor tal como TCEP. TCEP se puede utilizar a concentraciones menores, debido a su potencial de reducción, y reacciona también de manera relativamente lenta con la maleimida libre, reduciendo preferentemente los tioles. De este modo, el tiol de superficie presente en el dAb puede ser reducido con TCEP y se puede agregar directamente el MAL-PEG a la mezcla de reacción. No existe la necesidad de retirar el TCEP por filtración sobre gel antes de la PEGilación. También resulta posible llevar a cabo ciclos repetidos de reducción con TCEP, seguidos de adiciones de MAL-PEG para aumentar significativamente los rendimientos de dAb PEGilado.
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Ejemplo 21 PEGilación N-terminal de dAbs de VH y VL
Un método alternativo de PEGilación de dAbs de VH y VL es la PEGilación N-terminal. Se puede llevar a cabo de dos formas, usando, en primer lugar, un aldehído de PEG que, bajo las condiciones de reacción correctas, se puede usar para modificar selectivamente la amina N-terminal de una proteína. Esto es posible debido al hecho de que la amina N-terminal tiene una pK_{a} relativamente baja de \sim6,5. En segundo lugar, se puede insertar por ingeniería un residuo cisteína en el extremo N-terminal de la proteína para una PEGilación sitio-específica usando MAL-PEG. También en este caso, la proteína se reduciría usando TCEP o DTT (véase el Ejemplo 1.3) antes de acoplarla con el PEG-MAL del tamaño deseado.

Claims (39)

1. Un polipéptido unido con PEG que comprende uno o dos dominios variables únicos de anticuerpo, en el que el polipéptido tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kDa y un tamaño total de PEG de 20 a 60 kDa, en el que el tamaño hidrodinámico se determina usando una columna de cromatografía sobre gel Superose 6 HR o 12 HR, una concentración de polipéptido de 1,5 mg/ml, y una velocidad de flujo de 0,5 ml/min; y en el que cada dominio variable comprende una región marco y tiene un sitio de fijación de antígeno, y cada dominio variable fija el antígeno como un dominio variable único de anticuerpo en el polipéptido y, adicionalmente, en el que dicho PEG se encuentra presente como una o múltiples moléculas unidas al polipéptido a través de un residuo aminoácido en las regiones marco de dichos uno o dos dominios variables únicos de anticuerpo.
2. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 1, que comprende un multímero de dominios variables únicos de anticuerpo, y en el que el tamaño total de PEG es de 20 a 60 kDa.
3. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 1 ó 2, en el que cada uno de dichos dominios variables únicos de anticuerpo comprende un marco universal.
4. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 3, en el que cada dominio variable comprende un marco V_{H} seleccionado del grupo consistente en DP47, DP45 y DP38; o un marco V_{L} que es DPK9.
5. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido presenta especificidad por TNF-\alpha.
6. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho PEG está unido con el dominio variable único de anticuerpo por un residuo cisteína o lisina de dicho dominio variable único de anticuerpo.
7. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho residuo cisteína o lisina está presente en el extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
8. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho PEG está unido con dicho dominio variable único de anticuerpo por un residuo cisteína o lisina presente en la región marco del dominio variable diferente del extremo C-terminal o N-terminal de dicho dominio variable único de anticuerpo.
9. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho PEG está unido a dicho dominio variable único de anticuerpo en una posición 22 ó 65 de un residuo cisteína o un residuo lisina, a una distancia de al menos dos residuos del extremo C- o N-terminal.
10. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido comprende un marco V_{H} DP47 unido a PEG por un residuo cisteína en la posición 22 ó 65, o un residuo lisina en una o más posiciones seleccionadas del grupo consistente en: 43, 65, 76 y 98.
11. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido comprende un marco de V_{\kappa} DPK9 unido con PEG por un residuo cisteína en posición 23 u 88, o un residuo lisina en una o más posiciones seleccionadas del grupo consistente en: 39, 42, 45, 103 y 107.
12. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, que comprende un dAb de V_{H} que tiene el PEG unido a un residuo cisteína o lisina en una o más posiciones, seleccionadas del grupo consistente en: 13, 14, 15, 41, 42, 43, 62, 65, 87, 88, 89, 112, 115, 117, 119 y 120.
13. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, que comprende un dAb de V\kappa que tiene el PEG unido a un residuo cisteína o lisina en una o más posiciones, seleccionadas del grupo consistente en: 15, 40, 41, 56, 57, 60, 80, 81, 100, 107 y 108.
14. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 6, en el que dicho PEG está unido a un dominio variable de cadena pesada, que comprende un residuo cisteína o lisina sustituido en una posición seleccionada del grupo consistente en Gln13, Pro41 o Leu115.
15. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 1, que tiene una semivida de entre 1,3 y 170 horas.
16. Un multímero unido con PEG según la reivindicación 2, en el que dicho multímero es un dímero, trímero o tetrámero de dominios variables únicos de anticuerpo.
17. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 2, que comprende un homomultímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
\newpage
18. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 17, en el que dicho homomultímero comprende solamente un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, en el que dicho primer dominio variable único de anticuerpo de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y en el que dicho segundo dominio variable único de anticuerpo de dicho homodímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
19. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 2, que comprende un heteromultímero de dominios variables únicos de anticuerpo.
20. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 19, en el que dicho heteromultímero comprende solamente un primer y un segundo dominio variable único de anticuerpo, en el que dicho primer dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena pesada (CH1), y en el que dicho segundo dominio variable único de anticuerpo de dicho heteromultímero comprende un dominio variable único de anticuerpo y una región constante de cadena ligera (CL).
21. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho resto PEG es un PEG ramificado.
22. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se fija específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 80 nM a 30 pM.
23. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se fija específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 3 nM a 30 pM.
24. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se fija específicamente con un antígeno diana con una K_{d} de 100 pM a 30 pM.
25. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se disocia del TNF-\alpha humano con una constante de disociación (K_{d}) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad K_{off} de 5x10^{-1} a 1x10^{-7} s^{-1}, según se determina por resonancia de plasmón de superficie.
26. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 25, en el que dicha unión se mide como la capacidad de dicho polipéptido unido con PEG para neutralizar el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional.
27. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido unido con PEG neutraliza el TNF-\alpha humano o el receptor 1 de TNF en un ensayo celular convencional, con una DN50 de 500 nM a 50 pM.
28. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho PEG está unido a una lisina accesible al disolvente en forma de un éster activo de N-hidroxil-succinimida unido con PEG.
29. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 28, en el que el éster activo de N-hidroxil-succinimida se selecciona del grupo consistente en PEG-O-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}-NHS; PEG-O-CH_{2}CH_{2}-NHS; PEG-S-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; PEG-O_{2}CNH-CH(R)-CO_{2}-NHS; PEG-NHCO-CH_{2}CH_{2}-CO-NHS; y PEG-O-CH_{2}CO_{2}-NHS; en el que R es (CH_{2})_{4})NHCO_{2}(mPEG).
30. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicho PEG está unido a una cisteína accesible al disolvente por un reactivo selectivo para sulfhidrilo, seleccionado del grupo consistente en maleimida, vinil-sulfona y tiol.
31. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido tiene un tamaño total de PEG de 20 a 40 kDa.
32. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 31, en el que el polipéptido tiene un tamaño total de PEG de 20 ó 40 kDa.
33. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 31 ó 32, en el que el PEG se suministra como un polímero único.
34. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta especificidad de unión por uno de los siguientes elementos:
ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF ácido, FGF básico, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-\gamma, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Inhibina \alpha, Inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos, KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibitoria Mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína de atracción de monocitos, M-CSF, MDC, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-Ia, MIP-I\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor 1 inhibidor del progenitor mieloide, \beta-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre, TARC, sitio de reconocimiento TACE, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGA-\beta2, TGF-\beta3, TNF, TNF-\alpha, TNF-\beta, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP2, GRO/MGSA, GRRO-\beta, GRO-\gamma, HCC1, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, IL-1R, IL-6R, IL-10R e IL-18R.
35. Un polipéptido unido con PEG según la reivindicación 19, en el que el polipéptido tiene doble especificidad y se une a una diana seleccionada del grupo consistente en los pares siguientes:
41
36. Un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en el que el o cada dAb muestra un sitio de unión con especificidad por TNF-\alpha.
37. Una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido unido con PEG según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y un vehículo.
38. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 37, en la que dicha formulación farmacéutica es adecuada para ser administrada por vía oral, o es adecuada para ser administrada parenteralmente a través de una vía seleccionada del grupo consistente en inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, implante, administración rectal o transdérmica.
39. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 37, en el que dicha formulación farmacéutica es una formulación parenteral de liberación extendida o una formulación de dosificación oral.
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